LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Laura Ribokaitė
GLIOBLASTOMOS U-87 MG LĄSTELIŲ NAVIKŲ RAIDOS ANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS MEMBRANOS PAVEIKUS NATRIO DICHLOROACETATO IR NATRIO VALPROATO DERINIU HISTOLOGINIS IR
IMUNOHISTOCHEMINIS TYRIMAS Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Ingrida Balnytė Konsultantas Prof. habil. dr. Donatas Stakišaitis
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 ABSTRACT ... 5 PADĖKA ... 6 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 11DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
1.1. Glioblastoma ir jos savybės ... 14
1.2. Priešvėžinio NaVP poveikio tyrimai ... 14
1.3. Glioblastomos gydymo DCA veiksmingumo tyrimai ... 16
1.4. CAM modelis: CAM formavimasis ir funkcijos ... 19
1.5. CAM modelio taikymas ... 20
1.6. CAM modelio panaudojimas navikų tyrimams ... 21
1.7. E-kadherino raiška navikinėse ląstelėse ... 22
1.8. Vimentino raiška navikinėse ląstelėse ... 23
1.9. Proliferuojančio ląstelės branduolio antigeno raiška navikinėse ląstelėse ... 24
1.10. Kraujagyslių endotelio augimo veiksnio raiška navikinėse ląstelėse ... 25
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 27
2.1. Reagentai ir medžiagos ... 27
2.2. Kiaušinių inkubavimas ... 28
2.3. U87 MG ląstelių kultivavimas ir paruošimas tyrimui ... 28
2.4. Chorioalantojinės membranos nuėmimas, įliejimas ir histologinių preparatų paruošimas ... 31
2.5. Chorioalantojinės membranos dažymas hematoksilinu ir eozinu ... 32
2.6. CAM dažymas imunohistocheminiu metodu ... 33
2.7. Histomorfometrinis imunohistocheminių žymenų raiškos tyrimas ... 34
2.8. CAM storio vertinimas ... 35
2.9. Statistinė duomenų analizė ... 35
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 37
3.1. In vivo biomikroskopija ... 37
3.2. Histologinio tyrimo vertinimas ... 41
3.3. Imunohistocheminė tyrimo analizė ... 45
3 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 54 PRIEDAI ... 68 1. 1 priedas ... 68
4
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius: Laura Ribokaitė
Magistro darbo pavadinimas: GLIOBLASTOMOS U87 MG LĄSTELIŲ NAVIKŲ RAIDOS ANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS MEMBRANOS PAVEIKUS NATRIO
DICHLOROACETATO IR NATRIO VALPROATO DERINIU HISTOLOGINIS IR
IMUNOHISTOCHEMINIS TYRIMAS
Glioblastoma yra labiausiai paplitusi, agresyviausia difuzinė gliomos forma, atspari įprastiems gydymo būdams. Tyrimo tikslas – ištirti natrio dichloroacetato (DCA) ir natrio valproato (NaVP) derinio (DCA–NaVP) poveikį U87 MG naviko raidai, invazijai į viščiuko chorioalantojinę membraną (CAM), taikant histologinio ir imunohistocheminio tyrimo metodus. Buvo tiriamas dviejų DCA–NaVP dozių poveikis glioblastomos navikams. Tyrimo metu naudoti apvaisinti Cobb500 vištos kiaušiniai. Taikant CAM modelį buvo tirtos trys navikų grupės – 1) U87 MG (negydytų navikų kontrolinė grupė), 2) U87 MG gydytų 2 mM NaVP–5 mM DCA doze ir 3) U87 MG gydytų 4 mM NaVP–5 mM DCA doze grupės. 9–12 viščiuko embriono vystymosi paromis buvo vertinamas ant CAM užsodinto naviko raida (naviko augimas, invazija į CAM ir angiogenezė). U87 MG navikai pasižymėjo išreikšta angiogeneze, kraujagyslėms suformuojant „stipininį ratelį“. Angiogenezės reikšmingas slopinimas nustatytas tik ląsteles paveikus 4 mM NaVP–5 mM DCA deriniu. Lyginant naviko invazijos dažnį į CAM tirtose grupėse, nustatyta, kad U87 MG ląsteles paveikus NaVP–DCA dviem skirtingomis dozėmis, invazija sumažėjo daugiau nei 5 kartus, lyginant su U87 MG kontroline grupe (p < 0,0001). Reikšmingo invazijos į CAM dažnio skirtumo, lyginant gydytų skirtingais deriniais grupes, nenustatyta (p > 0,05). Nustatyti gydymo poveikio CAM storiui pokyčiai: U87 MG grupėje CAM pastorėjo 5 kartus lyginant su apvaisinto kiaušinio CAM kontrolineje grupeje (p < 0,0001). U87 MG ląsteles paveikus 4 mM NaVP–5 mM DCA doze CAM storis sumažėjo 2 kartus, lyginant su U87 MG kontroline grupe (p = 0,03). Imunohistocheminė PLBA raiškos analizė parodė, kad U87 MG naviko grupėje būdinga stipresnė PLBA raiška nei gydytų DCA–NAVP deriniais (p > 0,05). Visų grupių CAM buvo tirta vimentino ir E-kadherino raiška, tikslu nustatyti mezenchiminiam ir epiteliniam fenotipui, vertintas vimentino-teigiamų ląstelių užimamas plotas navike. Ryškiausia vimentino raiška ir didžiausias vimentino-teigiamų ląstelių užimamas plotas nustatytas U87 MG navikų grupėje. Paveikus DCA–NAVP, vimentino raiška sumažėjo, lyginant su U87 MG kontroline grupe, o paveikus 2 mM NaVP–5 mM DCA ir 4 mM NaVP–5 mM DCA, vimentino teigiamų ląstelių užimamas plotas sumažėjo statistiškai patikimai (p < 0,0001). E-kadherino raiška 4 mM NaVP–5 mM DCA grupėje buvo didesnė nei gydytų 2 mM NaVP–5 mM DCA grupėje.
5
ABSTRACT
Author of Master Thesis: Laura Ribokaitė
Full Title of Master Thesis: HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL INVESTIGATION OF SODIUM VALPROATE AND SODIUM DICHLOROACETATE COMBINATION EFFECT ON U87 MG GLIOBLASTOMA CELL TUMOR DEVELOPMENT ON CHICKEN CHORIOALLANTOIC MEMBRANE
Glioblastoma is the most common and most aggressive of all diffuse gliomas and is resistant to current treatment methods. The aim of the study was to evaluate the effect of sodium valproate (NaVP) and sodium dichloroacetate (DCA) combination (DCA–NaVP) on U87 MG glioblastoma cell tumor development and its invasion into chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) using histological and immunohistochemical methods. Two doses of DCA–NaVP effects were tested on glioblastoma tumors. Fertilized Cobb500 chicken eggs were used for the study. Three groups were studied: 1) U87 MG tumor (non-treated control), 2) U87 MG treated with 2 mM NaVP–5 mM DCA dose and 3) U87 MG treated with 4 mM NaVP–5 mM DCA dose. The growth of the tumor on CAM was assessed on days 9–12 of chicken embryo development (the progression and neoangiogenesis of the tumor and its invasion into CAM). In U87 MG tumor group neoangiogenesis with the “spoked-wheel“ patterns was present. The 4 mM NaVP–5 mM DCA dose inhibited tumor angiogenesis. Compared with the U87 MG tumor control group, in both treated groups frequency of tumor invasion into CAM decreased more than five times (p < 0.0001). When both treated groups were compared, no statistical significance of invasion frequency into CAM was discovered (p > 0.05). The changes of CAM thickness were assessed when treated with different doses of NaVP–DCA: compared with control (CAM without tumor), CAM thickness was 5 times higher in the U87 MG group (p < 0.0001). Comparing the U87 MG group and 4 mM NaVP–5 mM DCA group, the thickness of CAM decreased twice in the treated group (p = 0.03). A higher expression of PCNA protein was found in U87 MG tumors than in both treated groups (p > 0.05). Immunohistochemical analysis of vimentin and E-cadherin was performed on CAM of all three test groups in order to assess the mesenchymal or epithelial phenotype of the tumor. The area of all vimentin-positive cells was measured. The highest vimentin protein expression and the biggest area of vimentin-positive cells were determined in the U87 MG tumors. When U87 MG cells were treated with DCA–NaVP, the expression of vimentin was found to be decreased, compared with the U87 MG control group. The area of vimentin-positive cells was decreased significantly when treated with 2 mM NaVP–5 mM DCA (p = 0.045), compared with the U87 MG control group. The expression of E-cadherin in 4 mM NaVP–5 mM DCA tumors was higher than in 2 mM NaVP–5 mM DCA group.
6
PADĖKA
Didžiausias ačiū baigiamojo magistro darbo vadovei prof. dr. Ingridai Balnytei, konsultantui prof. habil. dr. Donatui Stakišaičiui ir prof. habil. dr. Angelijai Valančiūtei už visą įdėtą darbą,
pagalbą, patarimus ir didelę kantrybę.
Taip pat esu dėkinga dr. Linai Šlekienei už mokymus ir patarimus gilinantis į tyrimo metodiką.
Ačiū dr. Arūnui Kazlauskui už tiriamosios medžiagos – U87 MG glioblastomos navikinių ląstelių suteikimą ir rekomendacijas.
Ir taip pat nuoširdus ačiū kolegėms Rūtai Curkūnavičiūtei ir Mildai Juknevičienei už kartu atliktą darbą, pastangas ir palaikymą.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS
8
SANTRUMPOS
AKT1 Serino/treonino kinazė (angl. Serine/threonine-protein kinase)
ATF4 Aktyvuojantis transkripcijos faktorius 4 (angl. Activating trancription factor 4) BBB Kraujo–smegenų barjeras (angl. Blood–brain barrier)
CAM Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana (angl. Chicken embryo chorioallantoic membrane)
CNS Centrinė nervų sistema (angl. Central nervous system) DCA Natrio dichloroacetatas (angl. Dichloroacetate)
DCA-NaVP Natrio dichloroacetato–natrio valproato derinys (angl. Dichloroacetate-sodium valproate)
DNMT1 DNR metiltransferazė 1 (angl. DNA methyltransferase 1) DNR Dezoksiribonukleino rūgštis (angl. Deoxyribonucleic acid)
EGFR Epidermio augimo veiksnio receptorius (angl. Epidermal growth factor receptor) EMT Epitelinė-mezenchiminė tranzicija (angl. Epithelial–mesenchymal transition)
ERK Ekstraląstelinio signalo reguliuojama kinazė (angl. Extracellular signal–regulated kinases)
ETC Elektronų transporto grandinė (angl. Electron transport chain) FADH Flavino adenino dinukleotidas (angl. Flavin adenine dinucleotide) FGF Fibroblastų augimo veiksnys (angl. Fibroblast growth factor) GABA Gama-aminosviesto rūgštis (angl. Gamma-Aminobutyric acid) GO Gliukozės oksidacija (angl. Oxidation of glucose)
GPER G baltymo estrogeno receptorius (angl. G protein-coupled estrogen receptor) HAT Histono acetiltransferazė (angl. Histone acetyletransferase)
HDAC Histono deacetilazės (angl. Histone deacetylases)
HGF Hepatocitų augimo veiksnys (angl. Hepatocyte growth factor) HIF-1 Hipoksijos indukuotas faktorius (angl. Hypoxia-Inducible Factor) HSP Šiluminio šoko baltymai (ang. Heat shock proteins)
hTERT Telomerazės atvirkštinė transkriptazė (angl. Telomerase reverse transcriptase) H3 Histonas 3 (angl. Histone 3)
H4 Histonas 4 (angl. Histone 4)
IDCL Tarpdomeninė jungiamoji kilpa (angl. Interdomain-connecting loop) IDH 1/2 Izocitrato dehidrogenazė 1/2 (angl. Isocitrate dehydrogenase 1/2) IGF1 Insulinui panašus augimo veiksnys (angl. Insulin-like growth factor)
9 Kv kanalas Nuo įtampos priklausomi K+ jonų kanalai (Kv) kanalai (angl. Voltage-gated K+
channel)
MAP Mitogeno aktyvuotas baltymas (angl. A mitogen-activated protein)
MET Mezenchiminė–epitelinė tranzicija (angl. Mesenchymal – epithelial transition)
MGMT Genas, dalyvaujantis DNR pažaidų atitaisymo procese (angl. O6 - methylguanine DNA methyltransferase)
MTs Mikrovamzdeliai (angl. Microtubules)
MV-Edm Tymų viruso Edmonstono padermė (angl. Measles virus Edmonston strain) MVP Mikrosvaskulinė proliferacija (angl. Microvascular proliferation)
NADH Nikotinamido adenino dinukleotidas (angl. Nicotinamide adenine dinucleotide) NaVP–DCA Natrio valproato–dichloroacetato derinys (angl. Sodium valproate-dichloroacetate) NFAT Aktyvuotų T ląstelių branduolio transkripcijos veiksnys (angl. Nuclear factor of
activated T-cells)
NF1 Neurofibromin1 genas (angl. Neurofibromin 1)
NKCC Na-K-Cl kotransporteris (angl. Na-K-Cl cotransporter)
pErk Ekstraląstelinio signalo reguliuojama kinazė (angl. Extracellular-signal-regulated kinase)
PLBA Proliferuojantis ląstelės branduolio antigenas (angl. Proliferating cell nuclear antigen)
PIP Baltymas sąveikaujantis su PLBA (angl. PCNA-interacting protein) PDH Piruvato dehidrogenazė (angl. Pyruvate dehydrogenase)
PDK Piruvato dehidrogenazės kinazė (angl. pyruvate dehydrogenase kinase) PDGF Trombocitų kilmės augimo veiksnys (angl. Platelet-derived growth factor) PDH Piruvatdehidrogenazė (angl. Pyruvate dehydrogenase)
PHD Prolino hidroksilazės (angl. Prolyl hydroxylases)
PIGF Placentos augimo veiksnys (angl. Placental growth factor)
PSO Pasaulio sveikatos organizacija (angl. WHO – World Health Organization) PTEN Fosfatazės ir tenzino homologas (angl. Phosphatase and tensin homolog)
p21 Nuo ciklinų priklausomos kinazės inhibitorius (angl. cyclin-dependent kinase inhibitor 1)
p53 Naviko slopinimo genas (angl. Tumor suppressor gene)
ROS Reaktyvūs aktyvuoto deguonies radikalai (angl. Reactive Oxygen Species) TP53 Naviko baltymas 53 (angl. Tumor protein 53)
VEGF Kraujagyslių endotelio augimo veiksnys (angl. Vascular endothelial growth factor) VGSC Nuo įtampos priklausomi natrio kanalas (angl. "voltage-dependent" sodium channel)
10 VPA Valproinė rūgštis (angl. Valproic acid)
11
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, 2015 m. nuo vėžio mirė beveik 8,8 milijonai žmonių. Nepaisant milijardų, investuotų į vėžio tyrimus, gydytojams pavyksta išgydyti 7,3 proc. daugiau navikinių susirgimų nei 1950 metais. Prognozuojama, kad 2030 m. dvigubai daugiau žmonių mirs nuo vėžinių susirgimų [1].
Glioblastoma yra piktybiškiausias ir labiausiai paplitęs pirminis smegenų navikas [2,3]. Nors daugeliui pacientų iš pradžių įprasti gydymo būdai (chemoterapija ir spindulinis gydymas) yra efektyvūs, tačiau glioblastomai būdinga dažnas recidyvavimas, o recidyvai yra mažiau jautrūs gydymui. Po ligos recidyvo pacientai išgyvena mažiau nei 6 mėnesius [4].
Sergant glioblastoma, smegenų apsauginis kraujo–smegenų barjeras yra nepralaidus daugeliui vaistinių preparatų, todėl smegenų navike nesusidaro reikiama jo koncentracija ir gydymas nepakankamai veiksmingas [5].
Genų raiška yra reguliuojama baltymų kompleksais, kurie suriša chromatiną, modifikuoja ir reguliuoja jo transkripciją. Histono acetilazės (HAT) ir deacetilazės (HDAC) svarbios susidarant transkripciškai aktyviam ar neaktyviam chomatinui, didinant HAT ar mažinant HDAC acetilo grupių skaičių histonuose [6]. HDAC inhibitoriai kaip imunomoduliatoriai terapiniais tikslais taikomi ikiklinikiniuose vaistinių preparatų tyrimuose, slopinant neoplastinių ląstelių augimą smegenyse [5]. HDAC inhibitoriai sukelia epigenetinius pokyčius glioblastomos ląstelėse, slopina naviko augimą [7]. Tyrimai parodė, kad valproinė rūgštis yra stiprus HDAC inhibitorius. [8]. Valproinės rūgšties druskų preparatai jau kelis dešimtmečius naudojamai epilepsijai gydyti. Nustačius galimą priešvėžinį valproinės rūgšties poveikį, pradėti ikiklinikiniai ir klinikiniai navikų terapijos tyrimai, kurie patvirtino priešnavikinį valproinės rūgšties poveikį, kai gydymas valproinės rūgšties preparatais taikomas kaip papildomas preparatas gydant chemoterapija ar spinduliniu gydymu [5].
Dichloroacetatas (DCA) – slopina piruvato dehidrogenazės kinazę (PDK). Pastaraisiais dešimtmečiais DCA buvo naudojamas gydant įgimtą pieno rūgšties acidozę (laktatacidozę) ar įgytą laktatacidozę hipercholesterolemijos, stazinio širdies nepakankamumo atvejais. Laktatacidozė yra nepalankus veiksnys gydant onkologinius susirgimus, susijęs su rezistentiškumu chemoterapijai. Todėl pradėti DCA ikiklinikiniai tyrimai onkologijoje in vitro ir in vivo. Nustatyta, kad DCA gali praeiti per kraujo-smegenų barjerą ir tai rodo galimą DCA taikymą glioblastomos gydymui [9]. DCA poveikis tirtas eksperimentinių tyrimų metu gydant kolorektalinį, endometriumo vėžį, burnos plokščiųjų ląstelių karcinomą, krūties navikus, glioblastomą [10]. J. Stanevičiūtė ir kt. nustatė, kad DCA veikia kaip NKCC pernešėjo inhibitorius, todėl tikslingi tolimesni DCA tyrimai, nustatant jo poveikį NKCC ekspresuojančių navikų raidai [11].
12 Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelis yra plačiai taikomas ikiklinikinių žmogaus navikų tyrimams. CAM modelis naudojamas įvairios lokalizacijos navikų (Burkitt limfomos, kiaušidžių vėžio, glioblastomos, galvos ir kaklos plokščialąstelinių ląstelių karcinomos) tyrimams, modelis tinka vertinant naviko augimą, neoangiogenezę. Modelio privalumas – natūrali imunodeficito būsena, kuri tęsiasi iki 18 viščiuko embriono vystymosi paros. CAM modelis tinka tyrinėti naviko biologijos, navikinių ląstelių plitimo, vaistų nuo vėžio veiksmingumo, inazijos į CAM, neoangiogenezės ypatumus [12].
Magistro darbas skirtas natrio valproato ir natrio dichloroacetato (NaVP–DCA) derinio poveikio U87 MG ląstelių naviko augimui, naviko invazijos į CAM ir neoangiogenezės tyrimams.
13
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
IštirtiNaVP–DCA derinio poveikį U87 MG glioblastomos ląstelių suformuoto naviko raidai, jo invazijai į CAM, taikant histologinio ir imunohistocheminio tyrimo metodus.
Uždaviniai
1. Nustatyti NaVP–DCA poveikį suformuoto naviko augimui ir jo invazijai į CAM.
2. Įvertinti U87 MG glioblastomos ląstelių navikų ant CAM sukeltą neoangiogenezę ir NaVP–DCA poveikį jai.
3. Imunohistochemiškai įvertinti kraujagyslių endotelio veiksnio (VEGF) ir proliferuojančių naviko ląstelių branduolio antigeno (PLBA) raišką navike.
4. Nustatyti vimentino ir E-kadherino raišką navike, jų pokyčių ryšį su naviko augimu, NaVP–DCA gydymu.
14
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Glioblastoma ir jos savybės
Glioblastoma yra labiausiai paplitusi ir agresyviausia difuzinė glioma. Ji išsiskiria savo morfologija, genetika bei genų raiškos heterogeniškumu. Nepaisant per paskutiniuosius dešimtmečius pasiektos glioblastomos raidos tyrimų pažangos, efektyvaus gydymo nėra, o vidutinis ligonių išgyvenamumo laikas trumpesnis nei 14 mėnesių [13]. Pacientų, sergančių glioblastoma, mirtingumas siekia 88 proc. [14]. Dėl naviko heterogeniškumo, liga dažnai yra atspari gydymui ir dažnai recidyvuoja [15]. Vidutiniškai liga pasikartoja po 6,9 mėnesio po sėkmingos pradinės terapijos [16]. Įrodyta, kad didelę įtaką ligos raidai daro įvairūs onkogenai, naviko supresoriai bei molekuliniai pokyčiai [17].
Morfologiškai glioblastoma skirtoma į du tipus – pirminę ir antrinę glioblastomą. Pirminė glioblastoma atsiranda de novo, ja serga apie 90 proc. pacientų, ji yra paplitusi tarp vyresnių žmonių (50 metų amžiaus ir vyresnių). Antrinė glioblastoma išsivysto iš žemesnio laipsnio astrocitomos dažniausiai per 5 metų laikotarpį [15]. Glioblastoma pasižymi aktyvia ląstelių proliferacija, difuziniu plitimu (metastazavimu) ir išreikšta angiogeneze [18]. Lyginant su kitomis difuzinėmis gliomomis, glioblastoma pasižymi greitu infiltraciniu augimu (invazyvumu). Histologiškai navikas sudarytas iš pasižyminčių mitoziniu aktyvumu pleomorfinių ląstelių, intravaskuliniais mikrotrombais, nekroziniais židiniais ir mikrovaskuline proliferacija (MVP) [15].
Pagrindiniai genetiniai ir epigenetiniai pokyčiai glioblastomoje susiję su – IDH1/2, EGFR, PDGFRA ir NF1 genų mutacijomis, MGMT geno promotoriaus metiliniminu ir hTERT promotoriaus mutacijomis [19]. Pirminė glioblastoma būdinga EGFR amplifikacija, PTEN mutacija, IDH mutacijų nebuvimas. Antrinė glioblastoma apibūdinama TP53, IDH mutacijomis, nesant EGFR amplifikacijos [20]. Taip pat uždegiminiai citokinai, chemokinai ir augimo veiksniai turi įtakos naviko proliferacijai, augimui, infiltracijai ir angiogenezei [15].
1.2. Priešvėžinio NaVP poveikio tyrimai
Pagrindinis Natrio valproato (NaVP) farmakologinio priešvėžinio veikimo mechanizmas – histono deacetilazės (HDAC) inhibicija. NaVP yra HDAC inhibitorius bei imunomoduliatorius, jo poveikis slopinant naviko progresavimą yra DNR ir histonų hipermetilinimas [21].
Valproinė (VPA) rūgštis yra trumposios grandinės riebioji rūgštis [22]. 1963 m. Eymard atrado šio vaisto poveikį epilepsijai gydyti [23]. Vėliau NaVP pradėtas skirti bipolinių sutrikimų, migrenos gydymui. Valproinė rūgštis turi teratogeninį poveikį [24]. Ji gerai tirpsta organiniuose
15 tirpikliuose. Valproinės rūgšties vaistinė forma yra natrio ir magnio druskų preparatai. Šios druskos lengvai disocijuoja ir valproinė rūgštis lengvai praeina per ląstelių membraną. In vitro ir in vivo eksperimentiniai tyrimai parodė, kad NaVP turi priešvėžinį poveikį, slopina navikinių ląstelių apoptozę, diferenciaciją, metastazes ir angiogenezę [23].
NaVP slopina HDAC, sukeliant hiperacetilinimą [25]. Nustatyta, kad NaVP aktyvuoja ERK/Akt, slopina GKS3β, sukelia jų fosforilinimą ir taip lemia U87 gliomos ląstelių apoptozę per mitochondrijų reguliaciją [26]. VPA priešvėžinis poveikis: blokuoja kalcio kanalus, VGSC (Na+
kanalus), yra histono deacetilazės inhibitorius, didina GABA aktyvumą, dalyvauja MAP kinazės (kuri aktyvina ERK) ir β katenino-Wnt reguliacijoje. NaVP priešvėžinis aktyvumas daugiausiai susijęs su histono deacetilazės (HDAC) inhibicija [27].
Histono acetilinimas yra reguliuojamas histono acetiltransferazės (HAT) ir HDAC [28]. Normoje HDAC ir HAT pasižymi pusiausvyra. HAT fermentai ir HDAC fermentai veikia kartu reguliuojant genų transkripciją. HAT sukelia chromatino struktūrų atsipalaidavimą (skatina genų transkripciją), o HDAC veikimas veikia priešingai – sukelia chromatino kondensaciją (skatina genų slopinimą) [5]. HATs acetilina lizino histono likučius, o HDAC deacetilina juos [28]. Šis pusiausvyros sutrikimas lemia patologines būsenas [5]. Padidėjęs HAT aktyvumas lemia padidėjusią genų transkripciją, o HDAC padidėjęs aktyvumas turi priešingą poveikį [28] (4 pav.).
Gydymas HDAC inhibitoriais yra ypač aktualus neurologinių navikų terapijai, nes HDAC inhibitoriai gali praeiti per kraujo–smegenų barjerą [29]. HDAC inhibitoriai veikia navikus per apoptozinius mechanizmus, stabdo ląstelių ciklą, sukelia mitozinę, autofaginę ląstelių mirtį, skatina
4 pav. Histono deacetilazių (HDAC) ir histono acetiltransferazių (HAT) veikimo schema genų reguliacijoje (modifikuota pagal Caleb J. Yelton ir kt., 2018) [5]
16 reaktyvių deguonies radikalų (ROS) produkciją, slopina angiogenezę, mažina VEGF ir hipoksiją-indukuojančio veiksnio 1a raišką [21,30].
HDACs deacetilina ne tik chromatino baltymus, kurie gali pakeisti genų transkripcijos reguliaciją, bet taip pat ir nehistoninius baltymus, reguliuojančius ląstelinės homeostazės procesus (ląstelės ciklo progresavimas, ląstelių diferenciacija, apoptozė). Mottet ir kt. nustatė žmogaus glioblastomos ląstelių augimo slopinimą in vivo, veikiant HDAC4 inhibitoriumi p21 geną [21]. A. Duenas-Gonzalez ir kt. nustatė, kad 0,4 mM VPA slopina HDAC1 HeLa ląstelių augimą in vitro. VPA sukeltas H4 ir ne histoninių baltymų, tokių kaip p53 hiperacetilinimas, buvo lemtas 1–2 mM VPA koncentracijomis [23]. VPA antiproliferacinis veikimas susijęs su deacetilazės aktyvumo slopinimu, nustatytas įvairiuose piktybiniuose navikuose, kaip žmogaus choriokarcinoma, skydliaukės, kepenų, kasos, krūties vėžys [28]. Buvo tirtas ROS kiekis glioblastomos U87 MG ląstelėse. ROS kiekis buvo žymiai padidėjęs U87 MG ląstelėse gydant 10 mM VPA koncentracija. ROS kiekis ląstelėse yra svarbus veiksnys naviko progresavimui. VPA lemia sumažėjusią navikinių ląstelių invaziją ir ląstelių migraciją, sumažėjusį histono H3 acetilinimą [31]. Ph. Lee ir kt. nustatė, kad glioblastomos pacientų, vartojančių valproatą, išgyvenamumas buvo vidutiniškai ilgesnis, nei pacientų, negydytų valproato preparatais (15.1 ir 23,9 mėnesių, atitinkamai) [21, 31].
Šiuo metu yra atiekami 34 klinikiniai tyrimai, kai NaVP yra skiriamas kaip pagalbinis gydymas gydant chemoterapija ar spinduliniu gydymu įvairios lokalizacijos navikus (žr. duomenų bazė: ClinTiral.gov; https://clinicaltrials.gov/). D. Kavaliauskaitės ir kt. glioblastomos ant CAM tyrimai parodė, kad NaVP slopina U87 MG glioblastomos raidą bei angiogenezę ant CAM [32]. Gliomos ląstelės pasižymi Na-K-2Cl pernešėjo (NKCC1) padidėjusiu funkciniu aktyvumu ir padidėjusia pernešėjo baltymo raiška [33]. J. Stanevičiūtė ir kt. pirmą kartą nustatė, kad NaVP slopina NKCC inkstuose ir šio pernešėjo raišką žiurkių tymocituose [11]. M. Juknevičienės ir kt. tyrimai parodė, kad NKCC1 RNR raiškos slopinimo poveikis NaVP žiurkių tymocituose priklauso nuo lyties [34]. NKCC1 pernešėjas yra išreikštas daugelyje audinių, jis transportuoja Na+, K+ ir Cl- jonus. Navikinėse ląstelėse NKCC1 baltymas dalyvauja ląstelės ciklo progresavime veikiant ląstelės tūrį, atsakingas už navikinių ląstelių proliferaciją, apoptozę, invazivumą [33].
1.3. Glioblastomos gydymo DCA veiksmingumo tyrimai
Natrio dichloroacetatas (DCA) yra maža 150 Da molekulė, turinti didelį biologinį prieinamumą [35]. DCA jau naudojamas laktatacidozės ir paveldėtų mitochondrinių ligų gydymui [36]. Atlikti tyrimai parodė, kad DCA turi priešnavikinį poveikį [37]. DCA yra piruvato dehidrogenazės kinazės (PDK) inhibitorius [38]. Jis slopina Varburgo efektą, naviko augimą in vivo
17 [39]. DCA sukeliama apoptozė vyksta dviem būdais: pirmasis – mitochondrijose vykdoma depoliarizacija, kuri aktyvuoja nuo mitochondrijų priklausomą apoptozę, ir antrasis – plazminiame lygmenyje aktyvinant Kv1,5 kanalus, aktyvuojant kaspazes [36]. DCA slopina mitochondrijų fermentą PDK. PDK yra tiesioginis PDH inhibitorius [40]. DCA sukelta PDH aktyvacija didina gliukozės oksidaciją, skatinant acetil-CoA patekimą į mitochondrijas ir Krebso ciklą [36].
DCA sukelia nesmulkialąstelinių plaučių, glioblastomos ląstelių, taip pat endometriumo ir prostatos vėžio ląstelių apoptozę [37]. Nustatytas DCA slopinamasis poveikis naviko augimui kelių krūties vėžinių ląstelių linijų ląstelėms [37,41]. DCA sukelia glioblastoma sergančių pacientų navikinių ląstelių apoptozę [42]. DCA poveikis U87 MG ląstelėms parodė, kad padidėjęs oksidacinis stresas (daugiau piruvato patenkant į mitochondriją, taip gaminant daugiau ROS) skatina navikinių ląstelių apoptozę. DCA skatina nuslopintą mitochondrinį aktyvumą [39].
J. Stanevičiūtės ir kt. tyrimo rezultatai pirmą kartą parodė, kad DCA slopina NKCC pernešėją žiurkių inkstuose; DCA diuretinis poveikis susijęs su padidėjusiu Na+
, K+, ir Cl- , Mg2+ ir Ca2+ jonų išsiskyrimu su šlapimu, kuris susijęs su NKCC2 slopinimu inkstų kanalėliuose. Ilgalaikis gydymas DCA slopina NKCC1 RNR raišką žiurkių užkrūčio liaukoje [11]. NKCC1 pernešėjas yra svarbus navikinių ląstelių proliferacijai, naviko progresavimui – yra vienas iš priešvėžinės chemoterapijos takinių [33].
Atlikti eksperimentiniai in vivo tyrimai parodė, kad, skiriant papildomą gydymą DCA kartu su jau žinomais priešvėžinais preparatais, yra nustatytas didesnis tokios chemoterapijos veiksmingumas. Atliktų eksperimentinių gyvūnų tyrimų in vivo, skiriant įvairių vaistų derinius su DCA ,duomenys yra pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Skirtingų vaistinių preparatų derinių su DCA poveikis glioblastomos navikui in vivo tyrimai
Tirti gyvūnai, amžius sav.
Navikas Navikinės
lątelės
Derinys Autorius, metai,
šaltinis
1. Pelės glioma P7CSC DCA–etopozidas M. Morfouace ir kt., 2012 [43].
2. Pelės BALB/c
nude, 6-8
glioma U87 MV-Edm–DCA Ch. Li ir kt., 2015 [44].
3. Pelės BALB/c
nude 8
18 4. Pelės nu/nu glioma GSC
transdukuotos su lentaviruso vektoriumi, ekspresuojančiu Fluc DCA–phenforminas W. Jiang ir kt., 2016 [46]. 5. Žiurkės Wistar; 10–12
glioma C6 DCA–2DG O.N. Pyaskovskaya., 2016 [47].
M. Morfouace ir kt. buvo tirtas etopozido ir DCA poveikis pelių P7 CBC ląstelių naviko dydžiui. Nustatyta, kad etopozidas naviko augimui didelės įtakos neturėjo, lyginant su negydytais navikais (653 ± 79.1mm3; 681 ± 70.6 mm3, atitinkamai), o gydymas DCA naviko dydį reikšmingai
sumažino (iki 322± 54.8 mm3). Veikiant šių vaistų deriniu (DCA–etopozidas) naviko augimas buvo
reikšmingai slopinamas (1 lentelė) [43].
Ch. Li ir kt. tyrimo metu nustatė, kad MV-Edm statistiškai reikšmingai sumažino naviko tūrį, lyginant su negydytų grupe. Sumažinus MV-Edm dozę ir veikinat kartu su DCA (MV-Edm–DCA) statistiškai reikšmingai sumažėjo naviko naviko tūris, o monoterapija DCA arba MV-Edm nerodė reikšmingo poveikio naviko augimui, lyginant su kontroline naviko grupe (1 lentelė) [44].
H. Sheni ir kt. nustatytė, kad gydant DCA U87 naviką, pelių išgyvenamumas reikšmingai pailgėjo, lyginant su kontrole. Gydymas radioterapija išgyvenamumą statistiškai reikšmingai padidino. Gydant DCA-radioterapijos deriniu išgyvenamumas dar labaiau patikimai pailgėjo ir tai statistiškai reikšmingi duomenys, lyginant su gydymu monoterapija ar tik spinduliniu gydymu. Tyrimo metu nustatytas statistiškai reikšmingas proliferacijos sumažėjimas gydant U87 ląsteles radioterapija: proliferacija sumažėjusi 2 kartus lyginat su kontroline navikų grupe, DCA statistiškai patikimo poveikio navikinių ląstelių proliferacijai neturėjo. Gydant DCA–radioterapijos deriniu, nustatyta statistiškai reikšminga 4 kartus sumažėjusi U87 ląstelių proliferacija (1 lentelė) [45].
Tyrimo metu buvo nustatyta, kad gydant phenforminu GSC ląstelių naviką, pelių išgyvenamumas reikšmingai pailgėjo apie 10 parų lyginant su kontroline grupe. Panašūs rezultatai buvo gauti gydant DCA. Gydant DCA–phenformino deriniu pelių išgyvenamumas žymiai padidėjo lyginant su preparatų poveikiu atskirai (1 lentelė) [46].
O.N. Pyaskovskaya ir kt. tyrimo metu buvo stebimas DCA–2DG derinio poveikis ROS kiekiui LLC/R9 pelių navikuose; ROS reikšmingai padidėjo (120 proc.), lyginant su kontroline grupe. Taip pat derinys turėjo statistiškai patikimą priešnavikinį aktyvumą, o tiriamuosius preparatus skiriant atskirai, statistiškai reikšmingo naviko tūrio sumažėjimo, lyginant su kontroline naviko grupe,
19 nenustatyta. Gydant DCA–2DG ir lyginant su kontroline grupe, naviko tūris reikšmingai (70 proc.) sumažėjo (1 lentelė) [47].
1.4. CAM modelis: CAM formavimasis ir funkcijos
Viščiuko chorioalantojinė membrana (CAM) apvaisintame kiaušinyje susiformuoja 4–5 embriono vystymosi dieną, kai išorinis choriono mezoderminis sluoksnis susijungia su alantojaus mezoderminiu sluoksniu ir tarp jų palaipsniui formuojasi platus kraujagyslių tinklas [48] (1 pav.).
Histologiškai CAM yra sudaryta iš 3 pagrindinių sluoksnių (gemalinių lapelių): ektodermos, mezodermos ir endodermos. Ektoderma yra prisijungusi prie lukšto membranos, kuri išraizgyta kapiliarų tinklu; ji pradeda formuotis 5–6 embriono vystymosi dieną, angiogenezės metu. Kapiliarinis tinklas, besiformuojantis ektodermos sluoksnyje, yra labai tankus, smulkūs kapiliarai, išsišakojantys iš pagrindinio kapiliaro, primena bičių korį. Mezoderma yra kolagenu turtingas jungiamasis audinys, su išsidėsčiusiomis kraujagyslėmis (arteriolių ir venulių sistemos). Po mezoderma išsidėsto plonas endodermos sluoksnis, atskiriantis chorioalantojinę membraną nuo alantojaus ertmės.
CAM vystosi labai greitai. Nesubrendusios kraujagyslės, išsidėsčiusios mezodermoje, greitai proliferuoja ir diferencijuojasi iki 8-osios embriono vystymosi dienos ir sudaro kapiliarų tinklą, kuris išsidėsto po choriono epitelio ląstelėmis. Greita kapiliarų proliferacija vyksta iki 11-osios vystymosi dienos, po to jų mitozinis indeksas greitai mažėja ir kraujagyslių sistema pilnai susiformuoja 18 dieną, prieš pat viščiukui išsiritant [49]. Centrinė CAM dalis pilnai susiformuoja jau 8–10 dienomis, jos kraštai vystosi ir plečiasi iki 12-osios inkubacijos dienos, kuomet chorioalantojinė membrana jau pilnai apgaubia embrioną [50].
1 pav. Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana.
20 Chorioalantojinė membrana, besiribojanti su poringu lukštu, atlieka dujų mainų funkciją per kraujagysles, iki 6 viščiuko embriono vystymosi paros. Alantojus atlieka saugyklos vaidmenį, jame kaupiasi atliekų produktai, kuriuos išskiria embrionas, tai – šlapalas, šlapimo rūgštis. CAM dalyvauja natrio ir chlorido jonų pernešime iš alantojinės ertmės, kur susikaupia galutiniai šlapimo produktai, taip pat svarbi pernešant kalcio jonus iš kiaušinio lukšto į embriono kraujagysles [48].
Trynio maiše ir blužnyje gaminami T ir B limfocitai [51]. T limfocitai 11-tą dieną jau yra randami užkrūčio liaukoje, o B limfocitai – 12 dieną aptinkami Fabricijaus maišelyje [52]. 12-tą dieną mononukleariniai fagocitai yra randami trynio maiše, blužnyje, Fabricijaus maišelyje, žarnyne, užkrūčio liaukoje ir kepenyse [53]. Iki 12 vystymosi dienos, viščiuko embrionas yra imunodeficitinis. Tačiau nespecifinis imuninis atsakas gali vykti tada, kai 10–15 vystymosi dienomis embrionuose galima aptikti monocitų ir heterofilų (atitinka žinduolių imunines ląsteles – neutrofilus) [51].
1.5. CAM modelio taikymas
Chorioalantojinės membranos modelis eksperimentų metu in vivo naudojamas jau daugiau kaip 50 metų [54]. Tai pigus, patogus, paprastas ir jautrus metodas [55]. Iki 17-osios paros viščiuko embriono smegenų centras, susijęs su skausmo suvokimu, nėra išsivystęs, todėl daugelyje šalių šis modelis nereikalauja etikos komiteto leidimo eksperimentiniams tyrimams su gyvūnais. Svarbiausias CAM modelio privalumas yra prieinamumas prie tiriamosios medžiagos ir spartus CAM augimas. [54]. CAM modelis leidžia tyrinėti navikų augimą, jų metastazes, analizuoti vaistų, hormonų, citokinų poveikį, augimo veiksnių, antibiotikų toksikologiją, taip pat įvertinti proangiogeninį ir antiangiogeninį poveikį, naudojant kiekybinius ir kokybinius metodus, pagrįstus kraujagyslių morfologijos įvertinimu ir tankumu [49,54].
Per pastaruosius 3 dešimtmečius atlikta nemažai tyrimų, parodančių tikslingą CAM modelio panaudojimą tiriant navikų biologiją ir angiogenezę [54]. CAM modelis leidžia tirti ksenograftų navikų augimą, kartu vertinant naviko neovaskuliarizacijos ir išplitimo kiekybinius pokyčius [56]. Pirmasis tyrimas apie CAM modelio panaudojimą tiriant angiogenetinį atsaką į naviką, naudojant Jensen žiurkės sarkomą, aprašytas Murphy 1913 m.
Navikas yra užsodinamas ant chorioalantojinės membranos ir stebimi visi naviko progresavimo etapai: naviko augimas, angiogenezė, invazija ir metastazavimas (2 pav.). Navikinės ląstelės invazivuoja į kraujagysles, metastazuoja – tai suteikia naudingos informacijos tiriant naviko progresavimą [54].
21 Svarbiausi CAM modelio privalumai:
a) viščiuko embrionai iki 12-os paros tarnauja kaip natūralūs imunodeficitiniai šeimininkai, gebantys priimti navikinių ląstelių ksenotransplantus be imuninio atsako;
b) modelis leidžia stebėti ir analizuoti navikinių ląstelių morfologinius pasikeitimus CAM mikrocirkuliacijoje naudojant in vivo biomikroskopiją [29];
c) po 2–5 dienų po naviko užsodinimo ant CAM, jis jau aiškiai matomas susiformavęs ir vaskuliarizuotas;
d) mažos išlaidos ir sąlyginai nesudėtingas metodo taikymas [57].
1.6. CAM modelio panaudojimas navikų tyrimams
Chorioalantojinė membrana yra tinkama ir patogi platforma auglio formavimuisi ir metastazių plitimui įvertinti [58]. Eksperimentai, kurių metu navikų tyrimui ir analizei yra naudojami graužikai, trunka 3–6 savaites, tuo tarpu tyrimai su CAM vyksta daug greičiau [49]. Didelį kraujagyslių tinklą turinti CAM ypač tinkama navikų tyrimams [59]. Navikas, užsodintas ant CAM, išlieka nevaskuliarizuotas keletą dienų, po to jis gali penetruoti kraujagysles ir pradėti greitai augti [49]. Užsodinus ant CAM 20–30 μl navikinių ląstelių, priklausomai nuo jų kilmės, proliferacinio pajėgumo, pirminiai navikai gali užaugti iki 500–600 mg svorio per 6–7 paras po užsodinimo [51]. Kraujagyslių atsakas matomas jau po 72–96 valandų po naviko užsodinimo. Tai pasireiškia padidėjusiu kraujagyslių tankumu aplink užsodintą naviką, kraujagyslės išsidėsto radialiai aplink naviką ir atrodo kaip „stipininis ratelis“ [49]. Navikui progresuojant, naujai suformuotos kraujagyslės maitina naviką, jis auga ir plinta nuo pirminės užsodinimo vietos [50]. Tyrimų metu nustatyta, kad navikinės ląstelės prasiskverbia per choriono epitelį ir jo kraujagysles. Naviko ląstelės prasiskverbia pro mezenchiminį
2 pav. Navikas, užsodintas ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos. Rodyklė apvaliu galu žymi naviką. Skalė 2 mm
22 audinį, turintį kraujagyslių tinklą, esantį po epiteliu, migruoja per mezenchimą ir prisitvirtina prie arteriolių ir toliau keliauja į kitas kraujagysles (3 pav.). Užsodinus naviką ant CAM, po kelių dienų navikinių ląstelių sankaupos gali būti identifikuojamos nutolusios nuo pirminės užsodinto naviko vietos ir taip pat embriono vidaus organuose [49]. Ikiklinikiniai tyrimai, skirti metastazių gydymui/slopinimui yra aktualūs, nes navikų metastazės yra pagrindinė vėžiu sergančių pacientų mirties priežastis [60].
CAM modelis yra plačiai naudojamas ikiklinikinių onkologinių tyrimų metu. Tiriami įvairūs navikai – Burkitt limfoma, kiaušidžių vėžys, glioblastoma, galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma, sarkoma, kepenų, krūties vėžys, melanoma ir neuroblastoma, daugybinė mieloma [12,52,61,62].
Durupt ir kt. tyrė užsodintas žmogaus glioblastomos ląsteles ant CAM paviršiaus, histologiškai susiformavęs navikas išliko labai panašus į žmogaus glioblastomą, kuri pasižymi difuzinėmis pleomorfinėmis fibrilinėmis žvaigždės formos ląstelėmis su neoangiogeneze, edema bei nekrozės sritimis [63].
1.7. E-kadherino raiška navikinėse ląstelėse
Kadherinai yra ląstelės paviršiaus glikoproteinų šeima, svarbi ląstelių adhezijai. Klasikiniai kadherinai – pagrindiniai ląstelių susilietimo plotų komponentai. Jie sujungia ekstraląstelinę aplinką su citoskeletu ir dalyvauja ląstelės signalo perdavime per citoplazminių domenų ir kateninų (ypač p120-, α- ir β-keteninais) sąveiką. Navikui progresuojant vyksta kadherino tranzicija – procesas, kurio metu epitelinis fenotipas pasikeičia į mezenchiminį ir tai yra vadinama epiteline-mezenchimine tranzicija
3 pav. Naviko, užsodinto ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelis (modifikuota pagal J. Kim ir kt., 1998)[123]
23 (EMT). EMT apibūdinama E-kadherino raiškos mažėjimu ir mezenchiminio kadherino raiškos didėjimu [64,65]. Taigi, EMT svarbi naviko metastazavimui, jos metu navikinės ląstelės įgyja didesnę invazyvumo gebą ir pasižymi didesniu atsparumu chemoterapijai [66]. Kadherinai, sąveikaudami su kateninais, reguliuoja ląstelių adheziją ir jų migraciją. Kadherino–katenino kompleksas svarbus biologiniams procesams kaip aktino citoskeleto pertvarkymas ir genų transkripcija, kuri atsakinga už audinio morfogenezės kontroliavimą [67]. Chromatino remodeliavimas (struktūros pokyčiai) transkripcijos metu veikia E-kadherino geno raišką. Transkripcijos veiksnio Snail šeimos nariai, veikiantys kaip transkripcijos slopintojai, yra susiję su histono deacetilinimu [68]. Histono acetilinimo ir deacetilinimo būsena DNR grandinėje priklauso nuo histono acetiltransferazės (HAT) ar histono deacetilazės (HDAC) reguliavimo [69].
E-kadherino kaip naviko slopinimo veiksnio reikšmė tyrinėjama sergantiems krūties vėžiu, kuriam būdinga heterozigotiškumo praradimas chromosomos 16q22.1 srityje, koduojančioje E-kadheriną (CDH1) [70]. CDH1 raiška yra panaikinama per mutacijas, delecijas ar promotoriaus hipermetilinimą, o tai būdinga daugeliui epitelinių navikų, kiaušidžių, plaučių, hepatoceliulinei karcinomai, skradžio ir lobuliniam krūties vėžiui [71]. Nustatyta, kad E-kadherino raiškos sumažėjimas yra susijęs su gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos progresavimu, pagreitėjusiu ląstelių augimu ir metastazėmis, prostatos vėžio metastazėmis kauluose [72,73]. Lewis-Tuffin ir kt. tyrimo metu nustatė, kad E-kadherino raiška yra susijusi su glioblastomos naviko augimu, invazyvumu ir migracija. E-kadherino baltymo raiška yra retai nustatoma smegenų audinyje (pvz., N-kadherinas pasireiškia didele raiška) [74].
1.8. Vimentino raiška navikinėse ląstelėse
Vimentinas – tai 53 kDa polipeptidas, sudarytas iš 466 amino rūgščių ir yra vienas iš III IF tipo baltymų šeimos narių. Vimentinas išreiškiamas daugelyje ląstelių – nesubrendusiose kasos ląstelėse, neuronuose, Sertoli ląstelėse, fibroblastocituose, kraujagyslių endotelyje, inkstų kanalėlių ląstelėse, leukocituose, inkstų stromos ląstelėse [75]. Vimentinas yra svarbus ląstelių ir audinių vientisumui palaikyti. Jis sąveikauja su ląstelių migracijoje dalyvaujančiais polimerais – aktinu ir mikrotubulėmis (MTs) – ir yra svarbus ląstelių migracijai [76]. Vimentinas sąveikauja su fosforilinta Erk (pErk), MAP kinaze ir slopina jų nuo fosforilinimo procesus. Taip pat jis sąveikauja su Scrib baltymu, atsakingu už ląstelių migraciją. AKT1 kinazė suriša fosforilintą vimentiną ir slopina kaspazių poveikį jam, didina ląstelių judrumą ir navikinių ląstelių invaziją. Taip pat fosforilintas vimentinas sąveikauja su 14-3-3 baltymu (baltymas, svarbus ląstelės ciklo procesų ir signalo perdavimo kelių patofiziologijai) ir slopina 14-3-3 Raf komplekso formavimąsi, taip reguliuodamas intraląstelinius
24 procesus. Ląstelės branduolyje esantis vimentinas reguliuoja p21 raišką ir, sudarydamas kompleksą su ATF4 (aktyvintas transkripcijos veiksnys 4), reguliuoja transkripcijos aktyvinimą [75].
Epitelinė-mezenchiminė tranzicija (EMT) – tai ląstelinis procesas, kuriame epitelinės ląstelės įgyja mezenchiminį fenotipą [75]. EMT proceso metu ląstelės praranda tarpląstelinį kontaktą (E-kadherino raiška pakinta), į matricą patenka proteazės (padidėjusi vimentinoraiška), tuo yra skatinamas navikinių ląstelių plitimas iš pirminio židinio [77]. Ilgainiui, navikinės ląstelės metastaziniame židinyje per atvirkštinį EMT procesą – mezenchiminę–epitelinę tranziciją (MET) vėl įgyja epitelinį fenotipą – vimentino raiška sumažėja [78]. EMT procesas yra reguliuojamas ZEB-, TWIST- ir SNAI- šeimos transkripcijos moduliatorių ir veikia mezenchiminių žymenų – N-kadherino ir vimentino, raišką Tyrimais nustatyta, kad EMT tranzicija yra susijusi su naviko progresavimu, invazija ir atsparumu gydant glioblastomą [79]. Padidėjusi vimentino raiška taip pat būdinga prostatos vėžio, CNS, krūties, piktybinės melanomos, plaučių navikų atvejais. Vimentino raiška taip pat rasta padidėjusi gimdos kaklelio vėžio, inkstų ląstelių karcinomos, papiliarinės skydliaukės karcinomos audiny, kai kurių limfomų tipų, skrandžio ir storosios žarnos vėžio atvejais [75,80]. J. Zhao ir kt. tyrimai parodė, kad glioblastoma sergančių pacientų, su didele vimentino raiška, bendras išgyvenamumas buvo daug trumpesnis, nei pacientų su nedidele vimentino raiška [81].
1.9. Proliferuojančio ląstelės branduolio antigeno raiška navikinėse ląstelėse
Proliferuojantis ląstelės branduolio antigenas (PLBA) buvo atrastas daugiau kaip prieš 30 metų, kaip antigenas sistemine raudonąja vilklige sergančių pacientų organizme [82]. PLBA svarbus daugeliui ląstelėje vykstančių procesų. Žmogaus ląstelių PLBA monomerai yra 36-kDa baltymai, sudaryti iš 261 amino rūgšties liekanų [83]. PLBA monomeras yra sudarytas iš N- ir C- galo domenų, sujungtų tarpdomenine jungiamąja kilpa (IDCL). Monomerai per topologiškai panašius domenus yra sujungiami ir suformuoja žiedo formos struktūrą [83,84]. Dauguma baltymų su PLBA sąveikauja trumpa amino rūgščių seka, vadinama PIP-dėžute [83]. PIP dėžutė įprastai susideda iš C- ir N- galo sričių ir 310-tos spiralės [85]. Pastaraisiais dešimtmečiais daugelis baltymų, dalyvaujančių DNR replikacijoje, reparacijoje, epigenetinėje reguliacijoje, ląstelės išgyvenamumo ir metabolizmo reguliavime, pasižymėjo sąveika su PLBA per PIP dėžutę.
DNR replikacijos metu PLBA homotrimeras yra įkeliamas į chromatiną per replikacijos faktoriaus C (RFC) kompleksą [84]. PLBA apsupa DNR grandinę ir slankioja ja, didinant polimerazių δ ir ε efektyvumą, reikalingą DNR replikacijai [86]. Taip pat PLBA sąveikauja su DNMT1, HDAC1 ir p300 taip skatinant chromatino pertvarkymą ir genų reguliaciją. Tyrimų metu nustatyta, kad PLBA gali būti modifikuojamas fosforilinimo, acetilinimo, ubikvitino perkėlimo būdais. Šios modifikacijos
25 veikia PLBA, kaip aktyvumo reguliatoriai normaliems ląstelių procesams užtikrinti. Svarbiausia PLBA funkcija yra reguliuoti DNR polimerazes per PIP dėžutės sąveiką, replikacijos metu [83]. Taip pat PLBA yra svarbi seserinių chromatidžių sukibimui, ląstelės ciklo kontrolei bei DNR reparacijai [82]. DNR yra taisoma bazės ar nukleotido iškirpimo būdu [87]. Naujausių tyrimų duomenimis nustatyta, kad PLBA gali veikti ne tik branduolyje, bet ir citoplazmoje. Navikinėms ląstelėms būdinga padidėjusi PLBA raiška, kuri susijusi su nekontroliuojama replikacija [84]. Navikinėms ląstelėms būdinga padidėjusi PLBA raiška, kuri susijusi su nekontroliuojama replikacija [88]. Imunohistocheminio dažymo metu, didesnė PLBA raiška matoma krūties naviko audinyje lyginant su normaliu epiteliniu audiniu. Padidėjusi PLBA raiška yra trumpesnio išgyvenamumo rodiklis [83]. PLBA raiška krūties naviko ląstelėse yra susijusi su rūgščios PLBA izoforma, išreikšta tik piktybinėse ląstelėse, tačiau neaptinkama normaliose ląstelėse [89]. PLBA raiška būdingas prostatos vėžio žymuo [83], jo padidėjusi raiška aptinkama gimdos kaklelio navike, gliomoje [90]. Kayaselcuk ir kt. tyrimo metu buvo nustatomi PLBA ir Ki-67 LI padidėję kiekiai navikinėse ląstelėse: didžiausi jų kiekiai aptikti meduloblastomos, piktybinės meningiomos ir glioblastomos navikuose [91]. Kutwin ir kt. nustatė raišką PLBA U87 ir U-118 gliomos ląstelėse [92].
1.10. Kraujagyslių endotelio augimo veiksnio raiška navikinėse ląstelėse
Kraujagyslių endotelio augimo veiksnio (VEGF) yra 45 kDA glikoproteinas [93]. Jis yra pagrindinis reguliatorius, atsakingas už kraujagyslių formavimąsi audiniuose. Anksčiau VEGF buvo vadinamas kraujagyslių pralaidumo veiksniu (VPF), dėl gebėjimo didinti kraujagyslių pralaidumą [94]. VEGF baltymų šeima sudaryta iš VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, placentos augimo veiksnio (PIGF) izoformų [95]. Jos dalyvauja kraujagyslių ir limfagyslių tinklo formavimęsi, svarbios aktyvinant tirozino kinazės VEGF receptorius (VEGF-R) [96]. VEGF-A ligandai jungiasi su VEGFR-1 ir VEGFR-2, bet pirmiausiai perduoda signalą per VEGFR-2 – tai skatina endotelio ląstelių proliferaciją, jų išgyvenamumą, kraujagyslių sienelės laidumą. VEGF-A randamas plaučiuose, kepenyse, širdyje, antinksčiuose, endotelinių ląstelių, fibroblastocitų, lygiųjų raumenų ląstelių, trombocitų, neutrofilų, makrofagocitų ir apie 60 proc. visų navikų ląstelėse [94,97].
L. Liang ir kt. duomenimis be naujai susiformavusių kraujagyslių, kuriomis transportuojamas deguonis ir maisto medžiagos navikinėms ląstelėms, navikas negalėtų augti [98]. Naviko mikroaplinkoje VEGF raiška yra reguliuojama hipoksijos indukuojamo veiksnio-1 (HIF-1), kurio sekreciją skatina mažas deguonies kiekis, hormonai, citokinai. Insulino augimo veiksnys 1 (IGF1) svarbus naviko augimui ir skatina naviko angiogenezę aktyvinant HIF-1α/VEGF. De Francesco EM ir kt. nustatė, kad G baltymo estrogeno receptorius (GPER) yra susijęs su VEGF reguliacija hipoksinėje
26 krūties naviko mikroaplinkoje. Taip pat padidėjusi GPER raiška yra blogos prognozės rodiklis sergant endometriumo ir kiaušidžių vėžiu [99]. VEGF-A raiška koreliuoja su virškinimo trakto navikų invazija [100]. Glioblastomos kraujotaka yra funkciškai ir struktūriškai nenormali – kraujagyslės turi sustorėjusią pamatinę membraną. Naviko audiniui būdingi hipoksiniai židiniai. Glioblastomos metu VEGF sekreciją skatina HIF-1α. VEGF taip pat skatina navikinių ląstelių invaziją, genetinį nestabilumą, epitelinio fenotipo pasikeitimą į mezenchiminį, pakitusį metabolizmą ir imunosupresinę būklę. Glioblastomoje be VEGF yra reguliuojami ir kiti pro-angiogeniniai veiksniai – hepatocitų augimo veiksnys (HGF), fibroblastocitų augimo veiksnys (FGF), trombocitų kilmės augimo veiksnys (PDGF), angiopoetinai ir interleukinas-8 [101].
27
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Reagentai ir medžiagos
Ksilenas (Merck, Vokietija)
Etilo alkoholis (Stumbras, Lietuva)
Izopropilo alkoholis (2- propanolis) (Merck, Vokietija) Mayer‘io hematoksilins (Sigma-Aldrich, Vokietija) Amoniakas (Termo Fisher Scientific, JAV)
Eozino natrio druska (Amresco, JAV) Ledinė acto rūgštis (Merck, Vokietija) Histologiniai klijai (Roth, Vokietija) DMEM (Sigma-Aldrich, Vokietija)
Penicilinas/streptomicinas (Lonza/BioWhittaker, JAV) FBS (Sigma-Aldrich, Vokietija)
Žiurkės uogegos I tipo kolagenas (Gibco, JAV) Tripsinas (Sigma-Aldrich, Vokietija)
PBS (Sigma-Aldrich, Vokietija)
Tripano mėlis (Lonza/BioWhittaker, JAV)
Natrio dichloroacetatas (Sigma-Aldrich, Vokietija) Antrinis antikūnas linkeris (Dako, JAV)
Antrinis antikūnas HRP (Dako, JAV)
Peroksidazės blokavimo tirpalas (Dako, JAV) pH6 (Dako, JAV)
pH9 (Dako, JAV)
Plovimo buferis (Dako, JAV) DAB chromogenas (Dako, JAV)
Formalino neutralus buferisnis tirpalas (Merck, Vokietija) Chloroformas (Merck, Vokietija)
Fluorescuojantis anioninis dekstranas (Termo Fisher Scientific, JAV) Antikūno skiediklis (Dako, JAV)
DMSO (Sigma-Aldrich, Vokietija)
E-kadherinas (klonas – NCH-38, Thermo Fisher Scientific, JAV) PLBA (klonas – PC10, Termo Fisher Scientific, JAV)
28 VEGF (klonas – MA5-12184, Termo Fisher Scientific, JAV)
2.2. Kiaušinių inkubavimas
Eksperimentui buvo naudojami apvaisinti vištos kiaušiniai (Cobb500) iš Rumšiškių paukštyno. Kiaušiniai sterilizuojami nuvalant juos 70˚ etilo alkoholiu, sudedami į inkubatorių (Maino Enrico, Italija) vertikalioje pozicijoje (5 pav.). Inkubatoriuje palaikoma nuolatinė 37,7 ˚C temperatūra ir 60 proc. santykinė oro drėgmė. Inkubatoriuje kiaušiniai vartomi automatiniu būdu vieną kartą per valandą. Trečią parą nuo inkubacijos pradžios, automatinis vartymas išjungiamas – atidaromi kiaušinių langeliai. Prieš atidarant langelį, kiaušinio paviršius dezinfekuojamas 70˚ etilo alkoholiu. Naujant automatinį gražtą pragrežiama skylė bukamajame kiaušinio gale, steriliu švirkštu nusiurbiama 2 ml baltymo, skylutė užklijuojama. Tuomet atidaromas langelis – švelniai pragręžiamas 1 cm2
dydžio langelis, nuimamas kiaušinio lukštas (5 pav.). Atidarius langelį įvertinamas embriono gyvybingumas. Gyvų embrionų kiaušinių langelis uždengiamas maistine plėvele ir užklijuojamas – sterilumui ir tinkamai drėgmei palaikyti. Kiaušiniai toliau inkubuojami horizontalioje pozicijoje, nevartant.
2.3. U87 MG ląstelių kultivavimas ir paruošimas tyrimui
Tyrimui U87 MG glioblastomos ląstelės buvo gautos iš Neuromokslų instituto, LSMU, Kaunas. Ląstelės yra laikomos šaldiklyje -80 °C temperatūroje. Ląstelės, šaldomos specialiuose mėgintuvėliuose (krio), išėmus iš -80 °C temperatūros šaldiklio, mėgintuvėliai su ląstelėmis laikomi po tekančia vandens srove, kol ląstelės atšyla. Krio mėgintuvėliai sterilizuojami 70° etilo alkoholiu.
29 Ląstelių ir šaldymo terpės suspensija perkeliami į sterilų 15 ml mėgintuvėlį ir centrifuguojama (HERAEUS, Megafuge 8R, Thermo scientific, Vokietija) 1000 rpm greičiu 5 minutes 20 °C temperatūroje. Supernatantas, susidaręs virš ląstelių suspensijos, nusiurbiamas su automatine pipete. Ant ląstelių suspensijos užpilama mitybinė terpė, kad bendras kiekis gautųsi apie 5 ml, viskas labai gerai išpipetuojama, kad ląstelės pasiskirstytų terpėje tolygiai. Tikslus suspensijos tūris pamatuojamas, skaičiuojamos ląstelės (6 pav.).
Ląstelių kiekis skaičiuojamas Neubauer hemocitometro kameroje (Marienfeld, Vokietija). 10 µl ląstelių ir mitybinės terpės suspensijos sumaišoma su 10 µl tripano mėlio (jis naudojamas ląstelių gyvybingumui nustatyti). 10 µl suleidžiama į hemocitometro kamerą, uždengta dengiamuoju stikliuku taip, kad matytųsi Niutono žiedai. Ląstelių kiekis skaičiuojamas Olympus mikroskopu CKX41SF (Olympus corporation, Tokijas, Japonija) 4x padidinimu. Ląstelės skaičiuojamos 4 kvadratuose (vienas kvadratas sudarytas iš 16 langelių). Ląstelės, kurios yra ant kairiosios ir viršutinės langelio kraštinės – skaičiuojamos, esančios ant dešiniosios ir apatinės kraštinių – neskaičiuojamos. Skaičiuojamos tik gyvos, nenusidažiusios ląstelės (negyvos ląstelės nusidažo mėlyna spalva). Ląstelių skaičiavimas: gyvų ląstelių skaičius (sudedamos visos suskaičiuotos ląstelės) dalinama iš suskaičiuotų kvadratų skaičiaus, dauginama iš 2 (praskiedimas su tripano mėliu) dauginama iš 10 000 (kvadrato tūrio dalis mililitre) ir dauginama iš ląstelio suspensijos tūrio (ml). Gaunamas gyvų ląstelių skaičius nustatytame ląstelių suspensijos tūryje (pamatuojamas nucentrifuguotų ląstelių, sumaišytų su mitybine terpe, tūris).
Ląstelės išdalinamos po ~3 mln į flakoną (su 25 ml mitybinės terpės), kultivuojamos 37° C temperatūros inkubatoriuje su 5 proc. CO2 (6 pav.).
U87 MG ląstelės kultivuojamos ir dauginamos steriliuose flakonuose (Thermo Fisher Scientific Inc., JAV) mitybinėje terpėje (14 ml mažesnis flakonas, 25 ml didesnis flakonas), sudarytoje
30 iš Dulbecco‘s modified Eagles medium (DMEM) auginimo terpės, 10 proc. jaučio vaisiaus serumo (FBS), 2 proc. L-glutamino, su penicilinu (100 U/ml), streptomicinu (0,1 mg/ml). Flakonai dedami į 37 °C temperatūros HeraCell Vios 160i inkubatorių (Thermo Fisher Scientific Inc., JAV) su 5 proc. CO2. Ląstelės persėjamos kas 3 dienas. Per vieną parą ląstelių padaugėjo 1,5 karto.
Persėjant ląsteles pirmiausiai nupilama mitybinė terpė, praplaunama su 10 ml PBS, kad neliktų mitybinės terpės likučių. PBS nusiurbiamas ir ant ląstelių pilama priešinga flakono sienelės puse 10 ml tripsino-EDTA tirpalo (1:5) (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Germany), kad nuo dugno būtų pašalintas ląstelių monosluoksnis. Ląstelės su tripsinu laikomos inkubatoriuje 5–10 min, kol ląsteles atkimba nuo dugno. Atkibus ląstelių monosluoksniui, ant ląstelių su tripsino-EDTA tirpalo pilama 10 ml mitybinės terpės tripsinui inaktyvuoti. Viskas supilama į 50 ml mėgintuvėlį, centrifuguojama 1000 rpm greičiu 5 min. 37 °C temperatūroje. Supernatantas nupilamas, dugne lieka nucentrifuguotos ląstelės. Ant jų užpilama 5 ml mitybinės terpės, viskas labai gerai sumaišoma. Skaičiuojamos ląstelės hemocitometro kameroje jau aprašytu būdu.
Septintąją eksperimento dieną ląstelės užsodinamos ant viščiuko chorioalantojinės membranos. Ląstelių paruošimo užsodinimui procedūra iki ląstelių kiekio skaičiavimo hemocitometro kameroje yra identiška ląstelių persėjimui. Suskaičiavus ląsteles, ląstelių suspensija, sumaišyta su mitybine terpe, yra centrifuguojama dar kartą, visas supernatantas nusiurbiamas. Suskaičiuotų ląstelių suspensija sumaišoma su žiurkėsuodegos kolagenu (ant vieno kiaušinio CAM dedama 1 mln ląstelių – paskaičiuojamas ląstelių suspensijos tūris, kuriame 1 mln ląstelių ir toks kiekis kolageno (naudojamas suspensijos tūris 20 µl). Eksperimento metu norint nustatyti NaVP ir DCA derinio poveikį U87 MG ląstelėms, ląstelių suspensija maišoma su tiriamųjų vaistų deriniu (paruošiami du skirtingų dozių deriniai: 1) 2 mM NaVP ir 5 mM DCA ir 2) 4 mM NaVP ir 5 mM DCA; tiriamieji preparatai praskiedžiami DMEM terpe) bei pridedama žiurkės uodegos kolageno, kad bendras suspensijos tūris būtų 20 µl vienam mėginiui. 20 µl suspensija su automatine pipete dedama ant 9 mm3
(3 × 3 × 1 mm) želatininės kempinės (Surgispon, Aegis Lifesciences, India; 7 pav.). Kempinė su ląstelių suspensija dedama ant CAM šalia didžiausios kraujagyslės. Kiaušinio langelis steriliai uždengiamas ir toliau jis inkubuojamas.
31 Ląstelės naudotos navikams suformuoti ant CAM
U87 MG glioblastomos ląstelių linija išvesta iš moters piktybinės gliomos. Adherentinė ląstelių linija yra ektoderminės kilmės, dėl savo piktybiškumo turi mezenchiminių žymenų raišką.(1 priedas).
Tirtos navikų ant CAM grupės
1) U87 MG navikai (negydytų navikų kontrolinė grupė; U87 MG) (n=17),
2) U87 MG gydytų 2 mM NaVP–5 mM DCA deriniu (U87 MG 2 mM NaVP–5 mM DCA) (n=17),
3) U87 MG gydytų 4 mM NaVP–5 mM DCA derinių grupės (U87 MG 4 mM NaVP–5 mM DCA) (n=18).
Vaisto dozių pasirinkimas
NaVP dozės deriniams buvo pasirinktos pagal tyrimui naudotas veiksmingas tiriamojo vaistinio preparato dozes [102]. DCA dozė deriniams buvo pasirinkta 5 mM, nes literatūros duomenimis šiai dozei artima susidariusi DCA koncentracija graužikų kraujo plazmoje (DCA skiriant per os) ir ji buvo veiksminga gydant transplantuotus navikus graužikams in vivo [103,104].
2.4. Chorioalantojinės membranos nuėmimas, įliejimas ir histologinių preparatų
paruošimas
Chorioalantojinė membrana fotografuojama 2, 3, 4, 5 paromis po navikinių ląstelių užsodinimo ant CAM (9, 10, 11, 12 eksperimento dienomis) mikroskopu, kad įvertinti naviko vystymąsi ir angiogenezę. Fotografuojama naudojant OLYMPUS DP72 skaitmeninę fotokamerą (Olympus Corporation, Japonija) ir stereomikroskopą OLYMPUS SZX2-RFA16 (Olympus Corporation, Japonija) 3.2x ir 5x padidinimais. Nufotografavus CAM, į kraujagyslę suleidžiama fluorescuojančio anioninio dekstrano tirpalo (8 pav.). 12 eksperimento dieną nuimama CAM.
32 Po to viščiuko embrionas yra numarinamas 4 proc. formaldehido tirpalu. CAM dalis, kurioje yra prisitvirtinęs navikas, yra iškerpama, dedama į Petri lėkštelę su formaldehido tirpalu. CAM nufotografuojama: naudojant UV šviesos filtrą (X-Cite series 120PC Q, JAV) su žaliai fluorescuojančio proteino filtru.
Chorioalantojinės membranos fiksuojamos 4 proc. formaldehido indelyje vieną parą. CAM sudedamos į biopsines kasetes, plaunamos 6 valandas po tekančio vandens srove, kad išsiplautų formaldehidas. Tada CAM dehidratuojamos 70˚ etilo alkoholyje 12 valandų, tada po valandą laikoma 80˚ etilo alkoholyje, 96˚ alkoholyje. CAM yra apkarpomos ir paruošiamos liejimui. CAM vėl sudedamos į biopsines kasetes ir po 1 valandą laikoma 96˚ etilo alkoholyje sumaišytu su chloroformu (1:1), tada laikoma chloroforme (CAM kietinimui); po to laikoma 1 valandą chloroforme sumaišytu su parafinu (1:1) 64 °C temperatūroje termostate, 1 valandą parafino indelyje ir dar vieną valandą kitame parafino indelyje. Chorioalantojinės membranos užpilamos parafinu, pastačius į liejimo formelę. Įlieti parafino blokai užšaldomi ant -10 °C temperatūtos šaldymo plokštės (Pfm Medical AG, Kiolnas, Vokietija). Blokai mikrotomu (Leica microsystems RM2155, Vokietija) pjaustomi 3 µm storio pjūviais, kurie dedami į 37 °C temperatūros vandens vonelę (Leica microsystems HI 1210, Vokietija); pjūvių tiesinimui, pjūviai dedami ant objektinio stiklelio. Paruošti preparatai dedami ant šildymo plokštės, kad pjūviai gerai prikibtų prie objektinio stiklelio. Tada preparatai dedami į termostatą ir laikomi 37 °C temperatūros (ECOCELL, LSIS-B2V/EC55, Vokietija).
2.5. Chorioalantojinės membranos dažymas hematoksilinu ir eozinu
Hematoksilino ir eozino dažymas yra standartinis metodas histologiniam žmonių ir gyvūnų audinių tyrimui [99]. Šis dažymas yra naudojamas jau daugiau kaip 100 metų ir jis laikomas auksiniu standartu, taikomu navikų diagnozavimui [100]. Dauguma ląstelės organelių ir ekstraląstelinė matrica yra eozinofilinė, o branduolys, endoplazminis tinklas ir ribosomos – bazofilinės [99]. Hematoksilinas dažo tamsiai mėlyna-violetine spalva, eozinas – rausva [101].
Preparatai prieš dažymą laikomi termostate 37 °C temperatūrje. Pirmiausiai yra pašalinamas parafinas – laikomi ksilene per naktį, tada preparatai perkeliami į antrą ir trečią indelį su ksilenu – po 5 minutes. Tada preparatai yra rehidratuojami 2 kartus po 2 min. izopropanolio alkoholiu (Merck, Vokietija) ir 1 kartą 2 min. laikant 96 proc. etilo alkoholyje. Plaunami 3 min po tekančia vandens srove, etilo alkoholiui pašalinti. Tuomet preparatai laikomi 5 min Majerio hematoksiline, hematoksilinas plaunamas tekančia vandens srove 1 minutę, 30 sekundžių laikoma 37 mM amonio vandenyje, hematoksilino dažams užfiksuoti. Plaunama 1 min po tekančia vandens srove. Preparatai perkiami į eozino dažus (etanoliniu pagrindu) 2 minutėms, tada jie vieną minutę plaunami. Galiausiai
33 vyksta histologinės medžiagos dehidratavimas ir skaidrinimas. Dehidratuojama po 5 kartus įmerkiant į izopropilo alkoholį ir į du indelius su 96 proc. etilo alkoholiu. Preparatai skaidrinami ksilenu laikant 2 kartus po 5 minutes. Preparatai yra uždengiami dengiamaisiais stikliukais naudojant histologinius klijus. Preparatai analizuojami ir fotografuojami Olympus šviesiniu mikroskopu BX40F4 (Olympus Corporation, Japonija) su Olympus skaitmenine kamera XC30 (Olympus Corporation, Japonija), naudojant CellSensDimention 1.9 Digital Imaging Software (Olympus Corporation of the Americas, JAV) kompiuterinę programą.
2.6. CAM dažymas imunohistocheminiu metodu
Imunohistocheminis dažymas naudojamas specifiniams antigenams aptikti tiriamajame audinyje su žymėtu specifiniu tam antigenui antikūnu, sudarant antigeno-antikūno sąveiką. Imuninės reakcijos produktai aptinkami markeriu, tai gali būti fluorescenciniai dažai, fermentai, radioaktyvus elementas [102].
Pirmiausiai preparatai yra laikomi 30 minučių 64 °C temperatūroje termostate. Tuomet visa deparafinavimo ir rehidratavimo procedūra vyksta taip pat kaip hematoksilino ir eozino dažymo metu – preparatai ksilene laikomi per naktį, paskui jie perkeliami į 2 ir 3 indelius po 5 minutes. Pašalinus ksileną preparatai rehidratuojami – laikoma 2 kartus po 2 min izopropilo alkoholyje ir dar 2 minutes 96 proc. etilo alkoholyje. Tuomet spiritas yra pašalinamas 3 minutes plaunant preparatus po tekančia vandens srove, 1 minutei perkeliama į distiliuotą vandenį.
Paskui prepatai yra kaitinami gariniame greitpuodyje. Preparatai dedami į indelį su natrio citrato buferiu (50x) (pH 6 – vimentinui, E-kadherinui, VEGF; pH 9 – PLBA) ir 20 minučių kaitinama 95 °C temperatūroje. Po fiksavimo tiriamajame audinyje esantys epitopai gali būti uždengti arba kryžmiškai susijungę ir tai gali trukdyti antikūnams prisijungti prie antigenų. Kaitinant greitpuodyje – epitopai yra atidengiami [102]. Po kaitinimo preparatai atvėsinami, dedami ant specialių IHC dažymui skirtų Shandon Coverplate™ plokštelių (Thermo Scientific, Didžioji Britanija), ant kiekvieno preparato pilama po 2 ml distiliuoto vandens ir stebima ar per 4 minutes tolygiai vanduo nuteka. Tada pilama po 2 ml plovimo buferio 5 minutėms, tada pilama 200 µl peroksidazės blokavimo tirpalo Peroxidase blocking solution (Dako, Danija), tam kad būtų išvengta klaidingai teigiamų rezultatų, foninio dažymo. Peroksidazės blokavimo tirpalas laikomas 10 min ir nuplaunamas 2 ml plovimo buferio, užpylus buferį laikant 5 minutes. Tuomet užpilama 100 µl pirminio antikūno atskiesto su antikūno skiedikliu (1:100) ir laikome 30 min kambario temperatūroje (vimentinas, E-kadherinas, VEGF), o PLBA per naktį šaldytuve. Pirminis antikūnas nuplaunamas 2 ml plovimo buferio ir pilame 100 µl antrinio antikūno ir laikomi 30 minučių. Antrinis antikūnas jungiasi su pirminiu antikūnu. Jis
34 yra plaunamas 2 ml plovimo buferiu 5 minutes ir užpilama 100 µl HRP fermento, kuris taip pat laikomas 30 minučių. Jis jungiasi prie antrinio antikūno ir susidaro tvirtas kompleksas. Jis taip pat nuplaunamas užpilant 2 ml plovimo buferio ir laikant 5 minutes. Po to pilama po 100 µl chromogeno Dab+Chromogen skiesto substratiniu buferiu Substrate buffer Dako (Dako, Danija) (1:100) ir nuplaunama po 1 minutės plovimo buferiu palaikant 5 minutes. Tada pilama po 200 µl Majerio Hematoksilino tirpalo, jis nuplaunamas po 7 minučių užpilant 2 ml plovimo buferio. Galiausiai ant preparatų užpilama po 1 ml distiliuoto vandens ir preparatai nuimami nuo plokštelių. Preparatai sudedami į distiliuotą vandenį ir praplaunami 1 minutę, tuomet dehidratuojami 5 kartus įmerkiant į izopropilo alkoholį ir 2 kartus po 5 kartus pirmame ir antrame indelyje su 96 proc. etilo alkoholiu. Preparatai skaidrinami ksilenu laikant 2 kartus po 5 minutes, uždengiami dengiamaisiais stikliukais naudojant histologinius klijus.
2.7. Histomorfometrinis imunohistocheminių žymenų raiškos tyrimas
Tiriamoji medžiaga analizuojama ir fotografuojama Olympus šviesiniu mikroskopu BX40F4 (Olympus Corporation, Japonija) su Olympus skaitmenine kamera XC30 (Olympus Corporation, Japonija), naudojant CellSensDimention 1.9 Digital Imaging Software (Olympus Corporation of the Americas, JAV) kompiuterinę programą.
Vimentinu dažyti preparatai fotografuojami 4x ir 40x penki regėjimo laukai (3 laukai, kurie ribojasi su CAM – 2 iš kraštų ir vienas per vidurį ir dar 2 laukai – naviko vidurys – virš viduriniojo fotografuojamo lauko, besiribojančio su CAM ir aukščiausias, vidurinis naviko laukas). Matuojami 20 (maždaug 2/3) vimentino-teigiamų ląstelių plotai viename regėjimo lauke. Išvedami 100 (5 regėjimo laukai po 20 ląstelių) vimentino-teigiamų ląstelių ploto vidurkiai iš kiekvieno atvejo lyginamose grupėse (U87 MG, U87 MG 2 mM VPA–5 mM DCA, U87 MG 4 mM VPA–5 mM DCA).
PLBA antikūnu dažyti preparatai fotografuojami 4x ir 40x padidinimais 2 regėjimo laukuose, esančiuose naviko šonuose, arčiausiai CAM. Skaičiuojamas teigiamų ląstelių ir bendras ląstelių skaičius regėjimo lauke, įvertinamas ląstelių ryškumas 3+ balų sistemoje (3+ – didelė raiška, 2+ – vidutiniška raiška, 1+ – silpna raiška) 23863,74 µm² plote. Paskaičiuojamas teigiamų ląstelių skaičius regėjimo lauke procentaliai ir išvedamas teigiamų ląstelių vidurkis lyginamosiose grupėse (U87 MG, U87 MG 2 mM VPA–5 mM DCA, U87 MG 4 mM VPA–5 mM DCA).
VEGF antikūnu dažyti preparatai fotografuojami 10x padidinimu 5 regėjimo laukuose (du šoniniai, du, esantys šalia naviko ir regėjimo laukas, esantis po naviku), skaičiuojamas kraujagyslių skaičius 114611,29 µm² plote, išvedamas bendras kraujagyslių skaičiaus vidurkis iš 5 regėjimo laukų ir išvedamas kraujagyslių, esančiu po naviku (viename regėjimo lauke – 166273,96 µm² plote),
