KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Neringa Balčiūnienė
GLIOBLASTOMOS
MORFOLOGINĖS IŠRAIŠKOS
VIŠČIUKO EMBRIONO
CHORIOALANTOJINĖJE
MEMBRANOJE
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2004–2009 metais Kauno medicinos universitete.
Mokslinis vadovas:
Prof. habil. dr. Dietrich graf von Keyserlingk (Kauno medicinos univer-sitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
Konsultantai:
Prof. habil. dr. Arimantas Tamašauskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
Prof. habil. dr. Angelija Valančiūtė (Kauno medicinos universitetas, bio-medicinos mokslai, medicina – 07 B)
TURINYS
SUTRUMPINIMAI ... 5
ĮVADAS ... 6
Temos aktualumas ... 6
Darbo tikslas ir uždaviniai ... 7
Tikslui pasiekti keliami šie uždaviniai: ... 7
Darbo naujumas ir praktinė reikšmė ... 8
Ginamieji teiginiai: ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Glioblastomos epidemiologija ir rizikos faktoriai ... 10
1.2. Glioblastomos morfologinės ir biologinės savybės ... 12
1.3. Glioblastomos ląstelių žymenys ... 18
1.4. Glioblastomos simptomai, diagnostika ir gydymas ... 19
1.5. Eksperimentiniai glioblastomos tyrimo modeliai ... 21
1.6. Viščiuko embriono vystymasis... 23
1.7. Chorioalantojinės membranos vystymasis ir funkcijos ... 27
1.8. Eksperimentiniai chorioalantojinės membranos modeliai ... 30
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI... 36
2.1. Glioblastomos transplantai ... 37
2.2. Viščiuko embrionai ... 39
2.3. Chorioalantojinės membranos modelis ... 42
2.4. Imunohistocheminis ir histologinis įvertinimas ... 44
3. REZULTATAI ... 46
3.1. Makroskopinis transplantuotų glioblastomų vaizdas ... 46
3.2. Chorioalantojinės membranos pokyčiai... 58
3.3. Morfologinės transplantuotos glioblastomos savybės ... 67
3.4. Transplantuoto naviko elgesys chorioalantojinėje membranoje ... 79
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 89
IŠVADOS...97
DISERTACIJOS TEMA ATSPAUSDINTI DARBAI ... 98
DISERTACIJOS TEMA ATSPAUSDINTOS TEZĖS IR
PRANEŠIMAI ... 99
SUTRUMPINIMAI
CAM – chorioalantojinė membrana CNS – centrinė nervų sistema
EGFR – epidermio augimo veiksnio receptorius GFAP – glijos skaidulinis rūgštusis baltymas MDM2 – daugybinis dvigubas mažasis baltymas MMP – matrikso metalo proteinazės
MR – magnetinis rezonansas
PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija PTEN – fosfatazės ir tenzino homologo genas RB – retinoblastomos baltymas
TIE-2 – tirozino kinazės receptoriai
ĮVADAS
Temos aktualumas
Glioblastoma yra dažniausia smegenų naviko forma ir kartu pats pikty-biškiausias tumoras iš visų smegenų navikų, sukeliantis didžiausią pacientų invalidizaciją ir mirtingumą (Lassman, Holland 2005). Literatūros duomeni-mis, glioblastoma sudaro 45–80 proc. visų gliomų (Abrey, Mason 2005). Vyresnio amžiaus pacientų (nuo 65 metų), kuriems diagnozuojama glioblas-toma, išgyvenimo trukmė siekia vos 3,5 mėnesio, o jaunesni nei 65 metų pacientai išgyvena iki 10 ir daugiau mėnesių (Wrensch, Wiencke ir kt. 2006, Lutterbach, Bartelt ir kt. 2005). Dauguma autorių teigia, kad per pastaruo-sius 30 metų pacientų, kuriems nustatyta glioma, išgyvenimo trukmės ten-dencijos nepasikeitė ir penkerius metus išgyvena vos 4–5 proc. pacientų (Wrensch, Wiencke ir kt. 2006, McLendon, Halperin 2003, Davis, Freels ir kt. 1998). Apibendrinant naujausius tyrimus galima teigti, jog galvos smegenų navikų, tarp jų ir gliomų, diagnozavimo atvejų daugėja, tačiau tai yra sietina su populiacijos senėjimu, geresnėmis diagnostikos galimybėmis ir pažangesne neurochirurgine technika. Vis dėlto, nepaisant naujų diagnostinių tyrimų ir gydymo tendencijų, sergančiųjų išgyvenimo trukmė, daugelio autorių duomenimis, siekia vidutiniškai nuo kelių mėnesių iki vienerių metų (Macarthur, Please ir kt. 2005, Bogler, Mikkelsen 2003, Dai, Holland 2001), nors naujausi duomenys rodo, kad, taikant kombinuotą gy-dymą, pacientas gali išgyventi ir iki 16 mėnesių (Lamers, Stupp ir kt. 2008). Glioblastomos – labai heterogeniški augliai tiek savo morfologinėmis, tiek biologinėmis, tiek genetinėmis savybėmis. Nepaisant didelės pažangos mokslinių tyrimų srityje daug klausimų apie glioblastomas lieka neatsakyta: nėra aišku, kas lemia glioblastomos atsiradimą, kokie etiologiniai ir rizikos faktoriai yra svarbiausi, nenustatyti molekuliniai mechanizmai, dalyvaujan-tys glioblastomos vystymesi, veiksniai, labiausiai lemiandalyvaujan-tys neilgą sergan-čiojo išgyvenimo trukmę ir naviko piktybiškumo laipsnį (Dornfeld, Lawren-ce 2001). Taigi šie augliai ir toliau lieka vieni labiausiai tyrinėjamų navikų: stengiamasi nustatyti jų invazyvumo mechanizmus, genetinius kitimus, ištirti angiogenezės procesus, ieškoti naujų terapijos objektų ir galimybių.
Egzistuoja daugybė eksperimentinių glioblastomos tyrimo modelių, ku-riuos taikant glioblastomos ląstelės, ląstelių kultūros ar audiniai įterpiami į gyvūnų – graužikų ar šunų – smegenis arba transgeniniams gyvūnams sukeliami spontaniniai augliai. Tačiau šie eksperimentiniai glioblastomos tyrimo modeliai vis dažniau kritikuojami dėl jų brangumo, ilgai trunkančio stebėjimo, naviko vystymosi ne jam būdingoje aplinkoje, dažnai komplikuo-tos prieigos prie naviko, sudėtingo pavyzdžių paėmimo ir etinių aspektų
(Hagedorn, Javerzat ir kt. 2005). Svarbu ir tai, kad daugelis modelių tinkami tik tam tikram naviko vystymosi aspektui nagrinėti.
Eksperimentinis viščiuko embriono modelis žinomas gana seniai. Jau 1913 m. J. B. Murphy eksperimentuose su augliais pirmą kartą panaudojo chorioalantojinę viščiuko embriono membraną (Ribatti 2004). Ši gerai vaskuliarizuota membrana, kuri susidaro susiliejus chorionui ir alantojui, yra puiki mitybinė terpė navikų audiniams, ląstelių kultūroms ir virusams. Šiuo metu eksperimentinis viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelis yra sėkmingai naudojamas navikams (plaučių, prostatos, odos, smegenų), virusams auginti, endometriozei tirti, angiogeneziniams procesams tyrinėti, medikamentų efektyvumui įvertinti, priešvėžinių preparatų poveikiui nustatyti (Vargas, Zeisser-Labouebe ir kt. 2007, Nap, Groothuis ir kt. 2003, Gabrielli, Materazzi ir kt. 2001, Kunzi–Rapp, Ruck ir kt. 2001, Malik, Meyhofer-Malik ir kt. 2000, Uchibayashi, Egawa ir kt. 1992).
Šiuo metu pasaulyje ieškoma naujų navikų, ypač glioblastomos, tyrinėji-mo tyrinėji-modelių, kurie tiksliai atskleistų visas glioblastotyrinėji-mos tyrinėji-morfologines ir biologines savybes, leistų greitai įvertinti esminius invazyvumo ir vystymosi etapus, tyrinėti naujų medikamentų poveikį, būtų finansiškai nebrangūs. Būtent šiomis savybėmis ir pasižymi viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelis, kuris dėl savo vystymosi ypatybių (iki vystymosi ciklo pabaigos viščiuko embrionai neturi imuniteto) nesukelia transplantanto atmetimo reakcijos.
Duomenų apie glioblastomos audinio panaudojimą eksperimentiniame viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelyje yra pakankamai reta (Shoin, Yamashita ir kt. 1991). Tik prieš keletą metų pasirodė pirmieji straipsniai, kuriuose aprašomas glioblastomos ląstelių kultūrų panaudojimas šiame modelyje (Hagedorn, Javerzat ir kt. 2005). Vis dėlto aprašyti eksperi-mentai pakankamai neatskleidžia duomenų apie glioblastomos audinio išgy-venamumą, angiogenezės procesus, patohistologines ypatybes ir embriono reakciją į transplantuotą audinį.
Darbo tikslas ir uždaviniai
Disertacijoje aprašomo tyrimo metu siekta įdiegti viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį, įvertinti eksperimentinio viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelio tinkamumą eksperimentiniams glioblastomos tyrimams. Naudojant glioblastomos audinį, gautą operacijos metu, siekta ištirti, ar glioblastoma išlieka gyvybinga chorioalantojinėje membranoje, nustatyti, kokia yra embriono chorioalantojinės membranos reakcija į transplantą, išsiaiškinti, ar transplantuota į chorioalantojinę membraną glioblastoma išlaiko jai
būdingą histologinę sandarą, kaip elgiasi transplantuotas navikas. Šio tyrimo eiga ir yra aprašyta disertacijoje.
Taigi šio darbo tikslas – įdiegti viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį, tinkamą eksperimentiniams glioblastomos tyrimams.
Tikslui pasiekti keliami šie uždaviniai:
1. Įvertinti viščiuko embriono chorioalantojinės membranos pokyčius, atsiradusius implantavus glioblastomos audinį ir užtikrinančius jo išgyvenamumą.
2. Įvertinti implantuotos į chorioalantojinę membraną glioblastomos histologinės sandaros ypatybes ir imunohistocheminių reakcijų raišką.
3. Nustatyti glioblastomos plitimo viščiuko embriono chorioalantoji-nėje membranoje ypatumus.
Darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Glioblastomos savybėms tyrinėti dažniausiai atliekami eksperimentai su graužikais, ląstelių kultūromis, šunimis, tačiau tokie eksperimentiniai mode-liai vis dažniau kritikuojami dėl finansinių ir etinių aspektų. Labai svarbu ir tai, kad dauguma modelių neatitinka natūralios naviko aplinkos, gali sukelti įvairias mutacijas, tinka tik tam tikriems glioblastomos vystymosi aspek-tams analizuoti.
Nors eksperimentinis viščiuko chorioalantojinės membranos modelis yra žinomas gana seniai, navikams auginti jis naudojamas retai. Tik neseniai pasaulinėje literatūroje pasirodė duomenų apie glioblastomos auginimą chorioalantojinėje membranoje. Taigi, nors iki šiol dauguma autorių nau-doja ląstelių kultūras, šiame darbe, skirtingai nuo kitų tyrėjų, yra naunau-dojama naviko medžiaga. Svarbu yra tai, kad išvengiama imuninės sistemos įtakos, nes ankstyvas embriono imuninis atsakas atsiranda tik dvyliktą parą, chorio-alantojinei membranai jau pilnai susiformavus. Taigi galima teigti, kad pagal šį modelį auginama glioblastoma nėra veikiama embriono imuninės sistemos.
Tikimasi, kad gauti rezultatai leis šį eksperimentinį modelį taikyti toli-mesniems glioblastomos tyrinėjimams: genetinių faktorių analizavimui, angiogenezės tyrimams, naujų terapijos objektų paieškai.
Ginamieji teiginiai:
1. Glioblastoma, transplantuota į viščiuko chorioalantojinę membra-ną, išlaiko glioblastomai būdingą histologinę sandarą ir imunohis-tochemines reakcijas.
2. Glioblastomos išgyvenamumas chorioalantojinėje membranoje yra palaikomas smulkių membranos kraujagyslių įaugimo į glioblas-tomą, o taip pat kartu formuojasi ir naujos glioblastomos krauja-gyslės chorioalantojinėje membranoje.
3. Glioblastomos ląstelės skverbiasi į chorioalantojinę membraną pagal viščiuko chorioalantojinės membranos kraujagysles.
4. Eksperimentinis viščiuko chorialantojinės membranos modelis tin-kamas trumpalaikiams eksperimentiniams glioblastomos tyrimams.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Glioblastomos epidemiologija ir rizikos faktoriai
Piktybiniai galvos smegenų navikai diagnozuojami 6,6 iš 100 000 gyven-tojų: vyrams 8,0 iš 100 000, o moterims 5,4 iš 100 000 (Hess, Broglio ir kt. 2004, Barnholtz-Slaon, Sloan ir kt. 2003). Glioblastoma yra dažniausiai pasitaikantis ir piktybiškiausias galvos smegenų navikas, sudarantis daugiau nei 50 proc. glijos navikų.
Dažniausiai glioblastoma diagnozuojama penktame – septintame gyveni-mo amžiaus dešimtmetyje, šiek tiek dažniau vyrams nei gyveni-moterims (1,5:1) (Mourad, Farrell ir kt. 2005, Stark, Nabavi ir kt. 2005, Materljan, Materljan ir kt. 2004, Abrey, Mason 2003). Europoje ir Šiaurės Amerikoje glioblas-toma diagnozuojama 2–3 žmonėms iš 100 000 per metus (Stark, Nabavi ir kt. 2005), o Lietuvoje glioblastoma sudaro apie 60 proc. visų diagnozuo-jamų CNS navikų (Šilkūnas, Deltuva ir kt. 2005, Deltuva, Tamašauskas ir kt. 2003). Tyrimai rodo, kad galvos smegenų navikų, tarp jų ir glioblastomų, diagnozuojama vis daugiau, tačiau tai yra sietina su populiacijos senėjimu, geresnėmis diagnostikos galimybėmis ir pažangesne neurochirurgine technika.
Glioblastoma dažniausiai nustatoma 70–74 metų vyrams ir 75–79 metų moterims. Šio naviko rizika, kai kurių autorių duomenimis, didėja vyres-niems nei 65 metų žmonėms (Chakrabarti, Cockburn ir kt. 2005). Tai aiški-nama įvairių naviko vystymąsi skatinančių faktorių poveikiu.
Nepaisant naujų diagnostikos ir gydymo priemonių, pacientų, kuriems diagnozuojama glioblastoma, išgyvenimo trukmė nustačius šią diagnozę siekia vidutiniškai nuo kelių mėnesių iki vienerių metų (Macarthur, Please ir kt. 2005, Bogler, Mikkelsen 2003, Dai, Holland 2001), tačiau naujausi duo-menys rodo, kad, taikant kombinuotą gydymą, pacientas gali išgyventi iki 16 mėnesių (Lamens, Stupp ir kt. 2008). Pažymima, kad vyresnio amžiaus pacientų (nuo 65 metų) išgyvenimo trukmė siekia vos 3,5 mėnesio, o jaunesnių nei 65 metų pacientų – iki 10 mėnesių ir daugiau (Wrensch, Rice ir kt. 2006), Lutterbach, Bartelt ir bendraautorių (2005) duomenimis, vyresni nei 65 metų pacientai išgyvena šešis mėnesius, o jaunesni – aštuonis mėnesius. Dauguma autorių teigia, kad per pastaruosius 30 metų pacentų, kuriems nustatyta glioblastoma, sergančiųjų išgyvenimo trukmė nepasikeitė ir penkerius metus išgyvena vos 4–5 proc. pacientų (Wrensch, Weinberg ir kt. 2006, Mclendon, Halperin 2003, Davis, Freels ir kt. 1998).
Autoriai, tyrinėjantys glioblastomos vystymąsi, nurodo, kad paciento išgyvenimo trukmę lemia histologinis naviko tipas ir piktybiškumo laipsnis,
amžius, chirurginės rezekcijos apimtis, naviko lokalizacija, taikytas radiaci-nis ir chemoterapiradiaci-nis gydymas (Wrensch, Wiencke ir kt. 2006, Pope, Sayre ir kt. 2005, Barnholtz–Slaon, Sloan ir kt. 2003, Davis, Freels ir kt. 1998). Manoma, jog išgyvenimo trukmei įtakos turi ir fizinė paciento būklė prieš operaciją (Karnofskio indeksas). Multicentrinė studija (EUROCARE), ku-rioje dalyvavo 17 Europos šalių, pateikė duomenis, rodančius, kad moterys, kurioms nustatyta glioblastoma, išgyvena ilgiau nei vyrai (Sant, Van der Sanden ir kt. 1998). Kai kurie tyrimai rodo, kad paciento išgyvenimo trukmė priklauso ir nuo rasės: afroamerikiečiai išgyvena ilgiau nei baltieji (Sant, Van der Sanden ir kt. 1998). Barnholtz–Slaon, Sloan, (2003) nurodo, kad navikai dažniau diagnozuojami Kaukazo gyventojams, tačiau šie duomenys gana prieštaringi. Wrensch ir bendraautoriai (2006), tyrinėdami San Francisko (JAV) gyventojus, kuriems buvo diagnozuoti glijos navikai, 1991–1999 metais nustatė, jog įtakos ilgesnei sergančiųjų gyvenimo trukmei statistiškai patikimai turi šie faktoriai: jaunas amžius, chirurginė naviko rezekcija, radioterapinis ir chemoterapinis gydymas po operacijos bei šeimyninis statusas. Chang ir Barker (2005), atlikę kohortinį populiacijos tyrimą, teigia, kad nevedusiems pacientams buvo diagnozuoti didesnės apimties augliai, kurie sunkiau gydomi, o šių pacientų gyvenimo trukmė buvo trumpesnė. Be abejonės, sergančiųjų gyvenimo trukmei didelę įtaką turi ir genetiniai glioblastomos pokyčiai. McKeever ir bendraautoriai (2001) nurodo, kad jaunų pacientų glioblastomų proliferacijos indeksas buvo gerokai mažesnis nei senyvo amžiaus pacientų. Pasak Barker, Simmons ir kt. (2001), glioblastomos, kurioms imunohistochemiškai nebuvo nustatytas epiderminio augimo veiksnio receptorius (EGFR), sėkmingiau veikiamos radioterapijos nei turinčios EGFR glioblastomos. Vis dėlto dažniausiai yra teigiama, kad glioblastomų piktybiškumą ir pacientų išgyvenimo trukmę lemia glioblastomos biologinės savybės, o kiti faktoriai turi mažiau įtakos.
Pasaulyje dar mažai žinoma apie rizikos faktorius, lemiančius glioblasto-mos vystymąsi. Dauguma glioblastomų, literatūros duomenimis, atsiranda be priežasties, t. y., nenustatyti jokie aiškūs etiologiniai veiksniai, lemiantys glioblastomos atsiradimą. Įvairūs autoriai nurodo skirtingus rizikos veiks-nius, skatinančius glioblastomų vystymąsi. Galvos smegenų navikų paveldi-mumas ir genetiniai pokyčiai sudaro tik 1–10 proc. visų rizikos faktorių (Maluf, DeAngelis ir kt. 2002, Chadduck, Netsky 1982). Jonizuojanti radia-cija, kuri yra vienas iš pagrindinių aplinkos veiksnių, skatinančių glijos navikų vystymąsi, kaip etiologinis veiksnys nurodoma tik kiek daugiau nei 1 proc. pacientų. Nėra įrodyta ir tai, kad pacientams, jau sirgusiems vėžiu, gresia didesnė glijos navikų tikimybė: tyrimai, rodo, kad tik nedidelei daliai pacientų, kuriems buvo diagnozuotas vėžys ir taikyta radioterapija, vėliau išsivystė glijos augliai, tačiau teigiama, jog tai radioterapijos pasekmė
(Maluf, DeAngelis ir kt. 2002). Padidėjusią riziką šiems navikams turi tam tikrų pramonės šakų darbuotojai: gumos, plastmasės, naftos produktų ir kai kurių chemijos šakų darbininkai. Kai kurie tyrimai rodo, kad padidėjusi rizika išlieka žemės ūkio darbuotojams, elektrikams, netgi medicinos darbuotojams (Carozza, Wrensch ir kt. 2000), tačiau šie duomenys nėra visiškai patikimi. Kaip rizikos faktoriai, lemiantys glijos navikų vystymąsi, yra minimi epilepsija, cukrinis diabetas, insultas ir neuroinfekcijos (Schwartzbaum, Jonsson ir kt. 2005, Wrensch, Weinberg ir kt. 2005, Schlehofer, Blettner ir kt. 1999).
Taigi galima teigti, kad glioblastomos paplitimas populiacijoje yra pakankamai didelis, o jos vystymąsi lemiantys rizikos faktoriai nėra tiksliai žinomi. Nurodoma daugybė etiologinių ir rizikos veiksnių, lemiančių naviko atsiradimą ir sergančiųjų gyvenimo trukmę, tačiau nei vienas jų tiksliai nenurodo naviko vystymosi tikimybės. Todėl, nepaisant medicinos pažan-gos, glioblastoma ir toliau lieka vienas iš labiausiai tyrinėjamų navikų.
1.2. Glioblastomos morfologinės ir biologinės savybės
Centrinė nervų sistema yra sudaryta iš dviejų rūšių ląstelių: neuronų ir glijos ląstelių. Neuronai – informaciją apdorojantys vienetai centrinėje ner-vų sistemoje – gali būti skirstomi į motorinius, sensorinius ir tarpinius. Glijos ląstelės, kurių kiekis viršija neuronų kiekį, ir kurios nedalyvauja informacijos ar nervinių impulsų perdavime, nes atlieka apsauginę bei atra-minę funkciją, skirstomos į makrogliją (astrocitai, oligodendrocitai, ependi-minės ląstelės) ir mikrogliją, atliekančią ir fagocitinę funkciją.
Astrocitai yra dažniausiai sutinkamos glijos ląstelės, užpildančios beveik visus tarpus tarp neuronų. Astrocitai, kurie skirstomi į protoplazminius ir skaidulinius, dalyvauja elektrolitų saugojime ir apykaitoje (daugiausia K+) bei neurotransmiterių ir neuromediatorių (serotonino ir γ amino sviesto rūgšties) apykaitoje. Protoplazminiai astrocitai daugiausiai randami pilkojo-je smegenų medžiagopilkojo-je, o skaiduliniai – baltojopilkojo-je. Oligodendrocitai gamina mieliną, kuris supa nervines skaidulas.
Iš astrocitų ir oligodendrocitų vystosi astrocitomos ir oligodendroglio-mos. Pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) klasifikaciją, astrociti-niai galvos smegenų navikai klasifikuojami į piktybiškumo laipsnius nuo vieno iki keturių, remiantis tam tikrais histologiniais požymiais. Glioblasto-ma, kuri atitinka IV piktybiškumo laipsnį, pagal PSO klasifikaciją, turi ir astrocitomos, ir oligodendrogliomos elementų.
Astrocitinių navikų klasifikacija yra pagrįsta jų piktybiškumo laipsnio nustatymu pagal tam tikrus histologinius požymius (nuo I iki IV, kur I
atitinka mažiausiai piktybišką, o IV piktybiškiausią). Piktybiškumo laipsniui apibūdinti naudojamos kelios sistemos: Kernohan, St. Anne/Mayo, PSO ir TESTAST (Karak, Singh ir kt. 2000). Nei viena iš šių sistemų nėra universali. Plačiausiai naudojamasi PSO (patobulinta 2000 metais) klasifi-kacija ir St. Anne/Mayo sistema. Šios sistemos yra pagrįstos histologiniais požymiais: branduolių atipija, mitoziniu aktyvumu, kraujagyslių endotelio proliferacija ir nekroze. Minėti histologiniai požymiai apibūdina naviko piktybiškumą, kurį rodo naviko vystymosi ir invaziškumo greitis.
Taigi pagal histologinius požymius (branduolių atipiją, mitozinį aktyvu-mą, kraujagyslių endotelio proliferaciją ir nekrozę) nustatomi keli glijos navikų piktybiškumo laipsniai:
• I piktybiškumo laipsnis (PSO) – pilocitinė astrocitoma, pleomorfinė ksantoastrocitoma, subependiminė gigantinių ląstelių astrocitoma • II piktybiškumo laipsnis (PSO) – difuzinė astrocitoma
• III piktybiškumo laipsnis (PSO) – anaplastinė astrocitoma • IV piktybiškumo laipsnis (PSO) – glioblastoma.
Navikai, neturintys minėtų histologinių požymių (branduolių atipijos, ląstelių mitozinio aktyvumo, kraujagyslių endotelio proliferacijos ir nekro-zės), yra priskiriami I piktybiškumo laipsniui, o turintys tris ar keturis iš jų priskiriami atitinkamai III ar IV piktybiškumo laipsniui. Mažiausio piktybiš-kumo laipsnio navikai (t. y. I laipsnio) susiję su ilgiausia sergančiųjų gyvenimo trukme, tačiau tie navikai, kurie yra histologiškai stabilūs, bet atei-tyje gali progresuoti, į mažiausio piktybiškumo kategoriją nėra įtraukiami.
Galvos smegenų glijos navikų klasifikacija pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos klasifikaciją parodyta 1.2.1 lentelėje.
1.2.1 lentelė. Galvos smegenų glijos navikų klasifikacija (Kleihues, Cavenee 2000) Eilės Nr. Naviko pavadinimas Porūšis
1. Astrocitiniai navikai 1.1. Astrocitoma: – fibriliarinė – protoplazminė – gemistocitinė – mišri 1.1.2. Anaplastinė astrocitoma 1.1.3. Glioblastoma: – gigantinių ląstelių – gliosarkoma 1.2. Pilocitinė astrocitoma 1.3. Pleomorfinė ksantoastrocitoma
1.4. Subependiminė gigantinių ląstelių astrocitoma 2. Oligodendrocitiniai
navikai
2.1. Oligodendroglioma
2.2. Anaplastinė oligodendroglioma 3. Mišrios gliomos 3.1. Oligoastrocitoma
3.2. Anaplastinė oligoastrocitoma 3.3. Kiti (pvz., ependimo-astrocitoma) 4. Ependiminiai navikai 4.1. Ependimoma:
– ląstelinė – papilinė – šviesių ląstelių – mišri – epitelinė 4.2. Anaplastinė ependimoma 4.3. Miksopapilinė ependimoma 4.4. Subependimoma 5. Neaiškios kilmės glialiniai navikai 5.1. Astroblastoma 5.2. Smegenų gliomatozė
5.3. Trečiojo skilvelio chordoidinė glioma
Glioblastomos vystymasis yra daugiapakopis procesas, kurio tyrimai sukelia daugiau klausimų nei atsakymų. Tačiau aišku tai, kad morfologiniai naviko pokyčiai yra susiję ir su molekuliniais, ir su genetiniais pokyčiais. Todėl glioblastomos vis dar yra vieni labiausiai tyrinėjamų navikų, siekiant nustatyti tikslius juose vykstančius genetinius ir molekulinius mechanizmus (Hilton, Penney ir kt. 2004, Nutt, Mani ir kt. 2003, Ashley, Bigner 1997, Dirks, Rutka 1997, Collins 1995). Klinikiniai galvos smegenų navikų rodik-liai ne visada sutampa su jų histologiniais duomenimis, todėl vis dažniau
ieškoma ir biologinių rodiklių, kurie tiksliau atspindėtų galimą naviko pikty-biškumo laipsnį (Liang, Bollen ir kt. 2005, Mishcel, Nelson ir kt. 2003, Tortosa, Vinolas ir kt. 2003, Lafuente, Alkiza ir kt. 2000).
Kaip ir visoms gliomoms, glioblastomai būdingas infiltracinis augimas. Tai daugialypis procesas, kuriame dalyvauja ne tik glioblastomos ląstelės, bet ir normalios centrinės nervų sistemos ląstelės, tarpląstelinė terpė ir jos komponentai (Hyun Hwang, Smith ir kt. 2008). Be abejo, tai iš dalies ir nulemia pacientų mirtingumą bei neilgą sergančiųjų gyvenimo trukmę. Manoma, kad ilgesnė pacientų išgyvenimo trukmė susijusi su jaunesniu amžiumi, maksimalia chirurgine rezekcija, geresne funkcine būkle prieš operaciją ir nekrozės nebuvimu (Abrey, Mason 2003).
Dauguma glioblastomų vystosi labai greitai: klinikiniai, radiologiniai ar morfologiniai pažeidimai, tokie kaip mažesnio piktybiškumo dariniai, iki tol neaptinkami. Tokios glioblastomos vadinamos pirminėmis glioblastomomis (de novo). Pacientai, kuriems diagnozuota pirminė glioblastoma, jaučia kli-nikinius simptomus mažiau nei tris mėnesius, o kompiuterinės tomografijos ar magnetinio rezonanso tyrimai parodo didžiulius auglius su nekroze ir aplinkinių struktūrų pabrinkimu. Kitos glioblastomos vystosi gana lėtai iš mažesnio laipsnio difuzinės (pagal PSO II laipsnis) ar anaplastinės astrocito-mos (pagal PSO III laipsnis). Dažniausiai žemesnio laipsnio astrocitoastrocito-mos dėl infiltracinio augimo yra linkusios recidyvuoti ir palaipsniui įgyja histolo-gines ir biolohistolo-gines glioblastomos charakteristikas. Tai antrinės glioblasto-mos. Šio porūšio glioblastomoms būdingos įvairios genetinės savybės, jos diagnozuojamos skirtingų amžiaus grupių pacientams (Ohgaki 2005, Klei-hues, Ohgaki 1999). Vis dėlto pirminės glioblastomos ir antrinės
glioblasto-mos terminai yra daugiau abstraktūs nei diagnostiniai, nes abiejų porūšių
glioblastomoms būdingos panašios morfologinės savybės, aiškių histologi-nių skirtumų nėra.
Pirmą kartą glioblastomos terminas paminėtas R. Virchovo darbuose 1863 metais. Fenotipiškai glioblastoma – tai difuziškai infiltruojanti astrocitoma, pagal PSO klasifikaciją atitinkanti IV piktybiškumo laipsnį. Tipiniai glio-blastomos požymiai yra ląstelių polimorfiškumas (tačiau PSO klasifikacijoje tai nėra savarankiškas požymis), branduolių atipija, mitozinis aktyvumas, kraujagyslių endotelio proliferacija ir/arba nekrozė (Stark, Nabavi ir kt. 2005, Bogler, Mikkelsen 2003).
Kraujagyslių proliferacija – tai endotelio, lygiųjų raumenų ir pericitų proliferacija, kuri būdinga didelio piktybiškumo gliomoms (pagal PSO IV piktybiškumo laipsnis) (Candolfi, Curtin ir kt. 2007). Proliferuojančios struktūros gali būti netgi panašios į kraujagyslių sankaupas, kurios būdingos glioblastomai, tačiau tai taip pat gali būti prostatos, krūties vėžio ir melano-mos požymis. Kraujagyslių hiperplaziją sukelia angiogenezės veiksniai,
ku-riuos skatina pseudopalisadinių struktūrų hipoksija. Šis reiškinys skatina neoplastinių struktūrų plėtimąsi į išorę (Brat, Van Meir 2004).
Glioblastomai būdinga dviejų rūšių nekrozė (Lantos, VandenBerg ir kt. 1996). Pirmajai nekrozės rūšiai, laikomai tipiniu glioblastomos požymiu (Lantos, VandenBerg ir kt. 1996), būdingi daugybiniai, maži, netaisyklingos formos, primenančios serpantiną, židiniai, kuriuos supa statmenai į auglį nukreiptos, mažos, gausios glioblastomos ląstelės, panašios į pseudopalisadines struktūras. Pseudopalisadinių struktūrų formavimosi mechanizmas nėra tiksliai žinomas. Buvo manoma, kad pseudopalisadines struktūras sudaro greitai besidalijančios ląstelės, kuriose yra ir uždegiminių ląstelių. Tačiau dabartiniai tyrimai rodo, kad pseudopalisadinės ląstelės nėra greitai besidalijančios, jų apoptotinis indeksas yra didesnis nei kitų naviko ląstelių ir, kad tai yra aktyviai nuo centrinio nekrozės židinio, t. y. hipoksijos, judančios ląstelės. Jų judėjimą galėtų paaiškinti keletas veiksnių: ląstelės juda periferijoje esančių kraujagyslių link, kadangi nėra užtikrinama jų mityba, arba naviko kraujagyslėse susidaro trombai, sukeliantys audinių hipoksiją ir ląstelių judėjimą. Ląstelės, kurios nejuda, žūsta, formuodamos nekrozės apimtus plotus (Brat, Castellano-Sanchez ir kt. 2004, Brat, Van Meir 2004, Zadeh, Guha 2003).
Antrajai nekrozės rūšiai būdingi dideli dažniausiai naviko centre išsidėstę plotai. Tokio židinio periferijoje dažnai matomos gyvybingos glioblastomos ląstelės, supančios kapiliarus. Šio tipo nekrozė, kuri būdinga pirminėms glioblastomoms yra susijusi su nepakankama kraujotaka ir mityba (Lantos, VandenBerg ir kt. 1996).
Nekrozė yra laikoma glioblastomos piktybiškumo padariniu, tačiau tai nepaaiškina tokio greito glioblastomos augimo. Kaip minėta anksčiau, pseudopalisadinės struktūros, kurios supa nekrozės plotus ir kurioms būdinga pastovi hipoksija, sukelia daugybę angiogenezės veiksnių (pvz. VEGF), kurie skatina kraujagyslių proliferaciją ir naviko plitimą. Tikėtina, kad paveikus šį veiksnį, galima sustabdyti ar bent jau sulėtinti naviko vystymąsi. Visuotinai pripažįstama, kad vien tik nekrozės buvimas yra blogą prognozę lemiantis simptomas (Brat, Van Meir 2004).
Glioblastomos yra labai heterogeniški ir nestabilūs navikai, kuriems būdingos labai dažnos įvairių genų mutacijos. Šių mutacijų per pastaruosius penkiolika metų atradimas padėjo suprasti glioblastomų onkogenezę bei įvertinti galimą naviko piktybiškumo laipsnį ir netgi reakciją į gydymą (Houillier, Lejeune ir kt. 2006, Liang, Bollen ir kt. 2006, Wrensch, Wiencke ir kt. 2006, Zhou, Hess ir kt. 2005). Labiausiai paplitusios genetinės mutaci-jos yra (Shiraishi, Tada ir kt. 2002):
• EGFR amplifikacija (~40 proc.), • P53 mutacija (~60 proc.),
• P53 mutacija (10 proc.), • p16 delecija (~36 proc.), • LOH10p ir 10q,
• PTEN mutacija (~30 proc.), • RB pakitimai.
Labiausiai paplitusios naviko supresoriaus geno P53 mutacijos yra daž-niausias įvairių navikų genetinis pakitimas (Gonzalez–Angulo, Sneige ir kt. 2004, Kordone, Masi ir kt. 1998, Bauer, Sesterhenn ir kt. 1995). Ši mutacija, pasireiškianti 30–50 proc. glijos navikų, dažniausiai tyrinėjama ir astrociti-niuose navikuose. Yra duomenų, jog šio geno anomalijos yra reikšmingos glioblastomos vystymuisi (Gomez–Manzano, Fueyo ir kt. 1997). Vis dėlto duomenys apie jo prognostinę vertę ir mutacijos dažnį labai prieštaringi, kadangi jiems nustatyti naudojami skirtingi tyrimo metodai. P53 geno mutacija dažnesnė antrinėse glioblastomose, todėl manoma, kad ji yra susijusi su jaunesniu amžiumi ir ne tokiu dideliu piktybiškumo laipsniu, tačiau kaip savarankiškas faktorius šis genas neturi prognostinės vertės (Shibahara, Fukayama 2005, Gudinavičienė, Pranys ir kt. 2004, Sembritzki, Hagel ir kt. 2002). Pirminėse glioblastomose (de novo) šios mutacijos nėra dažnos ir siekia vos 10 proc. (Sembritzki, Hagel ir kt. 2002, Watanabe, Tachibana ir kt. 1996).
Ilgą laiką vyravo nuomonė, jog smegenyse galima rasti tik keletą imuni-nės sistemos elementų, nes jiems patekti trukdo hematoencefalinis barjeras. Manoma, kad glioblastoma slopina imunitetą, o tai ir palaiko bei skatina labai invazyvų augimą, tačiau imuninės sistemos reakcija į glioblastomos vystymąsi ir jų sąveika dar nėra ištirti (Fecci, Mitchell ir kt. 2006, Nano, Ceroni 2005). Yra duomenų, jog glioblastomos ląstelės slopina citotoksinius T limfocitus ir šie nereaguoja į naviko ląsteles. Be to, manoma, kad naviko ląstelės gali sukelti citotoksinių T limfocitų apoptozę (Hussain, Yang ir kt. 2006, Curtin, King ir kt. 2005, Fossati, Ricevuti ir kt. 1999). Makrofagai gausiai infiltruoja glioblastomą, lokalizuodamiesi parenchimoje ir kraujagyslėse. Manoma, kad naviko išskiriamos aktyvios medžiagos skatina makrofagų judėjimą iš kaulų čiulpų į smegenų ląsteles (Fossati, Ricevuti ir kt. 1999, Curtin, King ir kt. 2006). Ir nors jie atlieka kai kurias savo funkcijas, tačiau nepakankamai, kad aktyvuotų T ląsteles, o tai skatina glioblastomos augimą. Kuo daugiau makrofagų infiltruoja glioblastomą, tuo spartesnis yra jos augimas. Literatūros duomenimis, makrofagų skaičius glioblastomoje gali siekti net iki 30 proc.
Nepaisant didelės mokslo pažangos, vis dėlto imuninės sistemos reikšmė ir jos sąveika su glioblastoma dar nėra pakankamai ištirta (Gomez, Kruse 2006, Walker, Calzascia ir kt. 2002, Dornfeld, Lawrence 2001). Lieka neat-sakyta ir daug kitų klausimų apie glioblastomas: neaišku, kas lemia
glioblas-tomos vystymąsi, neištirti molekuliniai mechanizmai, dalyvaujantys jų vystymesi, nenustatyta, kokie veiksniai labiausiai lemia naviko piktybiš-kumą.
1.3. Glioblastomos ląstelių žymenys
Glijos navikų diagnostikai (taip pat ir glioblastomai) naudojami įvairūs imunohistocheminiai žymenys. Tačiau, deja, specifinio žymens glioblasto-mai nėra. Visi žymenys atspindi tam tikrus navike vykstančius procesus, kurie vyksta ne tik glioblastomoje, bet ir kituose navikuose.
Glioblastomos diagnostikai dažniausiai naudojami tie žymenys, kurie žymi astrocitus – glijos skaidulinis rūgštusis baltymas (kuris yra labiausiai specifinis glijos ląstelėms) ir vimentinas (kuris nėra specifinis glijos ląstelėms). Naudojami įvairūs žymenys gali būti siejami su glijos navikų piktybiškumu ir neilga paciento gyvenimo trukme.
Dažniausiai naudojamas ir specifiškiausias astroglialinių ląstelių žymuo yra GFAP (glijos skaidulinis rūgštusis baltymas), kuris pirmiausia nustatytas pacientų, sergančių išsėtine skleroze, smegenyse (Eng, Vanderhaeghen ir kt. 1971). GFAP yra pagrindinė filamentų sudedamoji dalis astrocituose (Wilhelmsson, Eliason ir kt. 2003) ir skiriamasis supiktybėjusių astrocitų žymuo arba galima sakyti, kad GFAP yra vidutinio dydžio filamentas kartu su kitais proteinais formuojantis astroglijos citoskeletą. Labiau supiktybėję astrocitai GFAP imunohistochemiškai išreiškia stipriau, todėl šis žymuo gali būti naudojamas ir naviko nustatymui (Jung 2007, Reyaz 2005, Chen, Yang ir kt. 1998). GFAP funkcija nėra aiški – manoma, kad GFAP skirtingas išreikštumas gali sulėtinti ląstelių proliferaciją ir ilgesnį gijimą po pvz. galvos traumos (Lumpkins, Bochicchio ir kt. 2008). Kadangi GFAP naudojamas astrocitams identifikuoti, todėl šis baltymas yra labai svarbus glioblastomos ir kitų galvos smegenų navikų diagnostikai.
Vimentinas taip pat yra vidutinio dydžio filamentas, kuris randamas ne tik
fibroblastuose ir kitos kilmės mezenchiminėse ląstelėse, bet ir glijos ląstelėse (Candolfi, Curtin ir kt. 2007, Chiu, Norton ir kt. 1981, Osborn, Ludwig-Festl ir kt. 1981).
Glioblastomos proliferacijos aktyvumui įvertinti naudojama imunohisto-chemija su antikūniais prieš Ki–67 antigeną. Glioblastomose Ki–67 indek-sas susijęs su kitais proliferacijos žymenimis, histologiniu laipsniu ir naviko piktybiškumu (Pierce, Doshi ir kt. 1998, Giangaspero, Doglioni ir kt. 1987, Torp 1997).
Nors daugelį metų buvo manoma, kad į smegenis dėl hematoencefalinio barjero imuninės sistemos ląstelės prasiskverbti negali, tačiau dabar yra
įrodyta priešingai. Imuninės sistemos ląstelės – T limfocitai (CD3),
citotok-siniai T limfocitai (CD8), makrofagai (CD68) patenka į smegenis ir yra
ypač svarbios kovojant su galvos smegenų augliais. Šių ląstelių egzistavi-mas yra įrodytas ir glioblastomoje, tačiau jų funkcija yra iki galo nesuprasta (Nano, Ceroni 2005, Tang, Flomenberg 2005, Fossati, Ricevuti 1999). Glio-blastomą infiltruojančios imuninės ląstelės rodo vykstantį ląstelinį atsaką. Citotoksiniai T limfocitai (CD8) taip pat dalyvauja šiame procese. Tačiau yra duomenų, jog tiek T ląstelių, tiek makrofagų funkcijos gali būti slopina-mos, pačios glioblastomos ląstelių sekretuojamų tam tikrų faktorių (Nano, Ceroni 2005). Literatūroje taip pat nurodoma, kad yra ryšys tarp makrofagų infiltracijos ir naviko piktybiškumo laipsnio (Fossati, Ricevuti 1999).
Metalo matrikso proteinazės (MMP) aktyviai dalyvauja tam tikruose naviko invazijos ir progresavimo etapuose, manoma, kad jos ardo ekstra-ląstelinį matriksą tiek fiziologinėmis, tiek patologinėmis sąlygomis. Jos taip pat dalyvauja naviko sukeltuose angiogenezės procesuose. MMP–9 yra viena iš angiogenezę indukuojančių proteazių, jos randama ten, kur vyksta fiziologinė arba vėžio sukelta angiogenezė. MMP–9 šaltinis yra šalia krauja-gyslių esančios imuninio atsako ląstelės (makrofagai, eozinofilai). Manoma, kad proteazes išskiria ir pačios naviko ląstelės (Švagždys, Lesauskaitė 2007). Svarbu ir tai, jog MMP aktyviai dalyvauja navikų augime ir metasta-zavime. Jos skaldo kolageno skaidulas, ląstelėms skverbiantis per bazinę membraną. MMP buvimas yra siejamas su naviko progresavimu, aktyvia invazija, piktybiškumo laipsniu, netgi prognoze. Kai kurių MMP išskyrimas koreliuoja su vėžio piktybiškumo laipsniu sergant ir glijos navikais. MMP įvairovė yra didesnė piktybiniuose navikuose, o gerybiniuose jų įvairovė mažesnė arba jų neidentifikuojama (Stančiūtė, Didžiapetrienė ir kt. 2004). Manoma, kad metalo matrikso proteinazės dalyvauja glioblastomos inva-zijos procesuose, skatina jos augimą (Zhao, Lyons ir kt. 2008, Du, Petritsch ir kt. 2008).
1.4. Glioblastomos simptomai, diagnostika ir gydymas
Glioblastomos simptomai, priklausantys nuo naviko lokalizacijos, daž-niausiai vystosi lėtai – savaites ar mėnesius – ir yra labai įvairialypiai. Kaip ir kitų centrinės nervų sistemos navikų, glioblastomos simptomus gali sukel-ti padidėjęs intrakranijinis spaudimas, naviko invazija, obstrukcinė hidroce-falija ar antrinė smegenų išemija. Pacientai skundžiasi galvos skausmais, pykinimu/vėmimu, asmenybės ar nuotaikos pasikeitimu, kuris dažnai sumai-šomas su depresija ir yra sunkiai gydomas, atminties praradimu bei įvairiais neurologiniais sutrikimais (traukuliais, kalbos sutrikimu, paralyžiumi).
Glioblastomos lokalizacija nėra aiški. Dauguma autorių nurodo, kad glio-blastoma vystosi smegenų pusrutuliuose. Frontoparietalinės ar temporalinės dalies navikas gali sukelti traukulius, okcipitalinės dalies navikas – regėjimo sutrikimą. Smegenų kamieno glioblastomos yra ganėtinai retos ir gali sukel-ti intensyviai didėjančius galvos skausmus bei sąmonės sutrikimus (Abrey, Mason 2003).
Dažniausiai glioblastoma diagnozuojama kompiuterinės tomografijos ar magnetinio rezonanso pagalba. Tyrimo metu aptinkama heterogeninė masė su arba be nekrozės centre, aplink ją matomas kontrastą kaupiantis žiedas, kuris susidaro dėl aktyvaus naviko augimo ir angiogenezės, bei periferinės masės (Cao, Nagesh ir kt. 2006). Naviko ribos dažniausiai yra labai neryškios, matoma aplinkinių audinių edema. Pope, Sayre ir bendraautorių nuomone (2005), magnetinio rezonanso rodmenys taip pat atspindi glioblas-tomos piktybiškumą. Jie teigia, kad pacientų, kurių magnetinio rezonanso tyrime buvo rasta mažesnė edema, nebuvo daugiažidininių ar pavienių pažeidimų, perspektyvos buvo geresnės. Anot Pope, Sayre ir kt. (2005), jauniems pacientams rečiau diagnozuojama edema, todėl jų išgyvenimo trukmė ilgesnė. Be abejo, tokie duomenys yra susiję su kitų autorių tyrimais, rodančiais, kad jaunų asmenų glioblastomos biologinės savybės yra ne tokios pavojingos. Šie autoriai taip pat patvirtino duomenis, jog glioblasto-mos su didesniu oligodendrogliomų komponentu siejaglioblasto-mos su ilgesne išgy-venimo trukme.
Glioblastomoms taikomas chirurginis gydymas, radioterapija bei chemoterapija. Kombinuotas gydymas, naudojant temozolomidą, pratęsia pacientų gyvenimą iki vidutiniškai metų ar 14–16 mėnesių (Hyun Hwang, Smith ir kt. 2008, Lamens, Stupp ir kt. 2008, Shrestha, Saito ir kt. 2007). Literatūroje minimi ir kiti chemoterapiniai medikamentai: tamoksifenas, irinotekanas (Prados, Lamborn ir kt. 2006, Robins, Won ir kt. 2006). Tačiau dauguma glioblastomų dėl genetinio nestabilumo, heterogeniškumo, infiltra-cinio augimo yra atsparios įprastiniams gydymo būdams (Gomez, Kruse 2006). Kai kurių autorių duomenimis, gydymas temozolamidu sėkmingas tik 6–8 proc. (Brada, Aschley ir kt. 2005). Tačiau lyginant temozolamido ir radioterapijos efektyvumą su vien tik spinduliniu gydymu pacientų išgyve-nimo trukmė pailgėjo vidutiniškai 2,5 mėnesio ir išgyvenamumo vidurkis siekė 14,5 mėn. (Stupp, Masson ir kt. 2005), o naujausiais duomenimis ir 16 mėnesių (Lamers, Stupp ir kt. 2008).
Literatūroje taip pat minima daugybė eksperimentinių gydymo būdų: imunoterapija, medikamentai, slopinantys angiogenezę, ir kiti, vis dar tyri-nėjami gydymo būdai.
1.5. Eksperimentiniai glioblastomos tyrimo modeliai
Galvos smegenų navikai dėl savo didelio paplitimo, piktybiškumo, biolo-ginių ir morfolobiolo-ginių savybių yra dažnai tyrinėjami, tačiau, norint išana-lizuoti jų genetines ypatybes, molekulinius vystymosi mechanizmus, pritai-kyti naujus gydymo būdus ir panaudoti juos medicinoje, reikalingi eksperi-mentiniai tyrimo modeliai. Idealiu atveju navikai, naudojami eksperimen-tiniame tyrime, turėtų augti in vitro ir in vivo, pasižymėti žmogaus glioblas-tomos augimą atitinkančiomis savybėmis ir reakcija į gydymą (Barth 1998). Eksperimentiniai modeliai gali būti skirstomi į kelias grupes, iš kurių pa-grindiniai – ląstelių kultūrų modeliai ir eksperimentiniai gyvūnų modeliai.
Eksperimentiniai ląstelių kultūrų modeliai tinkami naujiems gydymo būdams tirti ir naujų medikamentų poveikiui nustatyti. Tačiau pažymima, jog vis dėlto tokie eksperimentai dažnai duoda klaidingai teigiamus rezulta-tus, nes in vitro sąlygos neatitinka glioblastomos biologinės aplinkos, neat-spindi jų augimo, sukelia papildomas mutacijas ar genetinius pokyčius. Nors tokie modeliai dalinai atspindi naviko ir jį supančios aplinkos sąveiką, ne-įmanoma atspindėti tam tikrų veiksnių, pavyzdžiui augimo faktorių, hormonų, įtakos. Pagrindiniai procesai, tokie kaip angiogenezė, invazyvu-mas, kurie labai svarbūs glioblastomos augimui, taip pat neatsispindi in
vitro sąlygomis (Fomchenko, Holland 2006). Eksperimentuose naudojamos
gliomos ląstelių kultūros C6, U–87, MG, 9L, T9, F98, RG2 (D74), RT–2 ir CNS–1 (Cretu, Fotos ir kt. 2005, Barth 1998, Rewers, Redgate ir kt. 1990).
Eksperimentiniai gyvūnų modeliai labai svarbūs, siekiant ištirti navikų patofiziologiją, genetinius pokyčius, medikamentų poveikį, išbandant naujus terapijos būdus. Egzistuoja daugybė eksperimentinių gyvūnų modelių, kuriems yra naudojamos žmogaus navikų ląstelės, teratogenų sukelti augliai ar transgeniniai pelių modeliai. Mažų graužikų modeliai su spontaniškai atsiran-dančiais navikais, kurie atkartoja žmogaus navikų vystymosi ypatybes, augimą bei molekulines ypatybes, yra be galo svarbūs tolimesniems tyrinėjimams (Inčiūra, Juozaitytė 2003, Wu, Tyler ir kt. 2002, Ding, Nagy ir kt. 2000).
Eksperimentiniai gyvūnų modeliai (dažniausiai glioblastomai naudojami graužikai – pelės arba žiurkės) skirstomi į ksenotransplantacinius ir sponta-niškai atsirandančių navikų modelius. Žiurkių eksperimentiniai modeliai galvos smegenų navikams, taip pat ir glioblastomai, tyrinėti naudojami daugiau kaip tris dešimtmečius (Barth 1998).
Ksenotransplantaciniuose modeliuose gyvūnui implantuojama ar injekuo-jama pirminio naviko ląstelės ar ląstelių kultūra. Šios ląstelės implantuojamos imunodeficitinėms ar imunosupresinėms pelėms po oda arba ortopiškai, t. y. į tipinę naviko augimo vietą. Šiems eksperimentiniams modeliams būdingas geras navikų formavimasis, greitas vystymasis ir invazyvumas. Šių modelių
naudojimas leidžia greitai įvertinti naviką, jo augimą, pradėti gydymą. Deja, šie modeliai neatspindi genetinių pokyčių, kurie atsiranda naviko vystymosi metu. Implantuotose ar injekuotose ląstelėse jau būna pokyčių, atsiradusių jų gavimo procese, todėl gauti navikai retai atitinka pirminio naviko histologines charakteristikas, etiologiją, patobiologiją, molekulines ypatybes. Svarbu ir tai, kad imunosupresinės ar immunodeficitinės pelės neatspindi naviko ir imuninės sistemos sąveikos ir dėl to galimi klaidingai teigiami rezultatai (Grobben, De Deyn ir kt. 2002, Dai, Holland 2001, San-Galli, Vrignaud ir kt. 1989).
Kita eksperimentinių modelių rūšis – tai spontaniškai atsirandantys navikai. Deja, reikia pažymėti, kad nei pelėms, nei žiurkėms, skirtingai nei žmonėms, nebūdingos spontaninės glioblastomos. Gliomos gali būti sukeliamos pavei-kiant gyvūnus DNR alkilinančiais preparatais, tokiais kaip nitroksiurea dari-niais, sukeliančiais taškines mutacijas. Dėl to, kad pokyčiai yra taškinės muta-cijos formos, juos sunku identifikuoti, mutacijų skaičius auglyje, naviko ląstelių kilmė yra sunkiai nustatomi. Taip pat sunku nustatyti, kokia mutacija lemia na-viko formavimąsi. Todėl šie eksperimentiniai modeliai didesnio pritaikymo praktikoje nesulaukia (Fomchenko, Holland 2006). Kadangi glioblastomos for-mavimasis yra procesas, kurį lemia daug veiksnių, čia labai svarbūs ir moleku-liniai mechanizmai, todėl jiems tyrinėti naudojamos transgeninės pelės (Dai, Holland 2001). Navikai, atsirandantys dėl tam tikrų pokyčių pelės ar žiurkės genome, yra tinkami eksperimentams dėl jų nuspėjamo augimo greičio, vietos, pažeidimų pobūdžio. Transgeniniai modeliai kuriami modifikuojant embriono ląsteles (pašalinant geno dalį, atliekant tam tikrų genų deleciją), kurių metu atsi-radę pokyčiai nukreipiami į tam tikras ląstelių grupes, arba somatiškai įterpiant tam tikrus vektorius, nešančius genus, pavyzdžiui, onkogenus (Gutmann, Maher ir kt. 2006). Tokie eksperimentiniai modeliai su spontaniškai besiformuojan-čiais navikais atspindi žmogaus glioblastomos formavimosi ypatybes, geneti-nius pokyčius, angiogenezės ypatumus ir gali suteikti daug informacijos apie naujas terapijos galimybes. Tačiau šių modelių trūkumas yra tas, kad glijos navikai auga lėtai, yra sunkiai pasiekiami ir jiems tirti reikia specialios diag-nostinės aparatūros. Pažymėtina ir tai, kad genetinės mutacijos yra sukeliamos visame gyvūne ar audinyje, o glioblastomos mutacijos kyla iš vienos ląstelės ar mažos jų populiacijos (Fomchenko, Holland 2006). Vystantis spontaninėms glioblastomoms transgeniniuose gyvūnuose, augimo metu gali įvykti papildo-mos genetinės mutacijos, kurios nėra būdingos glioblastomai, o tai gali sunkinti rezultatų analizę ar medikamentų poveikio įvertinimą.
Literatūroje yra aprašomi ir kiti eksperimentiniai glioblastomos modeliai: operacijos metu gauti glioblastomos audiniai yra implantuojami į graužikų smegenis; žmogaus vaisiaus astrocitai genetiškai modifikuojami taip, kad turėtų būdingas glioblastomai mutacijas ir implantavus į pelės smegenis būtų sukeliama glioblastoma, kuri yra identiška žmogaus glioblastomai;
izo-liuotos žmogaus naviko kamieninės ląstelės yra implantuojamos į graužikų smegenis, kad sukeltų glioblastomą (Gutmann, Maher ir kt. 2006).
Eksperimentiniams glioblastomos tyrinėjimams mokslininkai naudoja ir šunis, kurie ypač tinka gydymo galimybėms įvertinti. Kai kurioms šunų veislėms būdingas spontaninių glioblastomų, labai primenančių žmogaus glioblastomas, vystymasis, MR (magnetinio rezonanso) rodmenys taip pat panašūs (Candolfi, Curtin ir kt. 2007).
Taigi literatūroje yra aprašomi įvairūs eksperimentiniai modeliai, tačiau labiausiai paplitę yra transgeniniai graužikų modeliai ir ląstelių kultūrų implantacija į graužikų smegenis. Deja, dėl didelio glioblastomos heteroge-niškumo, jos vystymosi procesų įvairovės nei vienas eksperimentinis mode-lis tiksliai neatspindi žmogaus glioblastomos morfologinių ir biologinių savybių. Pažymėtina, kad vieni modeliai labiau tinka molekuliniams proce-sams (ląstelių kultūros), kiti angiogenezei, terapiniam efektyvumui (grauži-kų modeliai) tyrinėti. Svarbu ir tai, kad visi eksperimentai su gyvūnais rei-kalauja didelio skaičiaus gyvūnų mirčių ir kančių. Taigi idealus eksperimen-tinis modelis dar nėra rastas, todėl galima teigti, jog eksperimentinių mode-lių įvairovė vis didės, ieškant tokio, kuris tiksliai atspindėtų glioblastomos etiologiją, patogenezę ir reakciją į gydymą.
1.6. Viščiuko embriono vystymasis
Viščiuko embrionas – gerai žinomas in vivo modelis embriologijoje bei biologijoje jau nuo XX amžiaus pradžios. Embrionas ir jo vystymosi metu susidaranti chorioalantojinė membrana yra plačiai naudojamas eksperimen-tinis modelis įvairiuose tyrinėjimuose: auginant navikus (plaučių, prostatos, odos, smegenų), virusus, tiriant endometriozę, angiogenezę, nustatant navi-kų metastazines ypatybes, vertinant medikamentų efektyvumą, tyrinėjant priešvėžinių preparatų poveikį (Vargas, Zeisser-Labouebe ir kt. 2007, Nap, Groothuis ir kt. 2003, Gabrielli, Materazzi ir kt. 2001, Kunzi-Rapp, Genze ir kt 2001, Malik, Myhofer-Malik ir kt. 2000, Uchibayashi, Egawa ir kt. 1992). Norint pagrįsti šio modelio tinkamumą, labai svarbu suvokti esminių em-briono vystymosi etapų ypatybes.
Viščiuko embriono vystymasis trunka 21 dieną. Šio ciklo metu jis pilnai susiformuoja. Priklausomai nuo aplinkos sąlygų embriono vystymasis gali sustoti ir vėl atsinaujinti, kai pasiekiamos reikiamos vystymuisi sąlygos – aplinkos temperatūra, drėgmė. Pasaulinėje literatūroje embriono vystymasis dažniausiai aprašomas remiantis 1951 metais Hamburger ir Hamilton nusta-tytomis vystymosi stadijomis (Hamburger, Hamilton 1951), kuriomis apibū-dinami vystymosi ypatumai nuo inkubacijos pradžios iki išsiritimo momen-to. Be abejo, remiamasi ir kitų autorių, pavyzdžiui, Witschi, Carnegie,
vy-stymosi stadijomis, tačiau pastarosios yra universalios ir naudojamos ne tik viščiuko embriono, bet ir žmogaus embriono vystymuisi aprašyti (http://embryology.med.unsw.edu.au/OtherEmb/chick1.htm). Hamburger ir Hamilton aprašė 46 vystymosi stadijas, kurios priklauso nuo embriono ypa-tybių tam tikru metu, atsirandančių naujų organų ir struktūrų. Šioje klasi-fikacijoje susitariama, jog pirmoji inkubacijos diena ir yra pirmoji embriono vystymosi diena (1.6.1 lentelė).
1.6.1 lentelė. Embriono vystymosi stadijos pagal Hamburger ir Hamilton (1951)
Stadija Laikas Kas vystosi 1 ... Pirminis vamzdelis
2 6–7 val. Pradinis pirminis vamzdelis, ilgis 0,3–0,5 mm
3 12–13 val. Pirminis vidutinis vamzdelis
4 18–19 val. Galutinis pirminis vamzdelis, ilgis±1,88 mm
5 19–22 val. Formuojasi chorda
6 23–25 val. Galvos linkis
7 23–26 val. 1 somitas; nervinio vamzdelio linkis
7–8 23–26 val. 1–3 somitai
8 26–29 val. 4 somitai; kraujo salelės
9 29–33 val. 7 somitai; pirminės optinės pūslės
9–10 33 val. 8–9 somitai; priekinis amniono linkis
10 33–38 val. 10 somitų; 3 pirminės smegenų pūslelės
11 40–45 val. 13 somitų
12 45–49 val. 16 somitų; galinių smegenų vystymasis
13 48–52 val. 19 somitų; atrioventrikulinio kanalo vystymasis
13–14 50–52 val. 20–21 somitai; uodegos linkis
14 50–53 val. 22 somitai; liemens linkis
14–15 50–54 val. 23 somitai; formuojasi kaukolės ertmės
15 50–55 val. 24–27 somitai
16 51–56 val. 26–28 somitai; formuojasi sparnų užuomazgos; užpakalinis amniono linkis
17 52–64 val. 29–32 somitai; pasirodo kojų užuomazgos
18 3 dienos 30–36 somitai, tęsiasi toliau kojų užuomazgų, formuojasi alantojus
1.6.1 lentelės tęsinys
Stadija Laikas Kas vystosi
19 3,0–3,5 dienos 37–40 somitai tęsiasi iki uodeginės dalies; formuojasi žandikauliai
20 3,0–3,5 dienos 40–43 somitai; embrionas baigia suktis; matomas akių pigmentas
21 3,5 dienos 43–44 somitai
22 3,5–4,0 dienos Somitai tęsiasi iki uodegos galo
23 4 dienos Susiformuoja lenktas kūno kontūras
24 4,5 dienos Pirštų užuomazgos
25 4,5–5,0 dienos Formuojasi alkūnių ir kelių sąnariai
26 5 dienos Formuojasi pirmi trys pirštai
27 5,0–5,5 dienos Vystosi snapas
28 5,5–6,0 dienos Toliau formuojasi pirštai
29 6,0–6,5 dienos Formuojasi penkto piršto rudimentas
30 6,5–7,0 dienos Plunksnų užuomazgos
31 7,0–7,5 dienos Formuojasi tarppirštinė plėvė
32 7,5 dienos Apatinis žandikaulis pasiekia snapą
33 7,5–8,0 dienos Formuojasi sparnai
34 8 dienos Formuojasi akių plėvelė
35 8,5–9,0 dienos Vystosi pirštų falangos
36 10 diena Trečio piršto ilgis = 5,4±0,3 mm, snapo ilgis = 2,5 mm
37 11 diena Trečio piršto ilgis = 7,4±0,3 mm; snapo ilgis = 3,0 mm
38 12 diena Trečio piršto ilgis = 8,4±0,3 mm; snapo ilgis = 3,1 mm
39 13 diena Trečio piršto ilgis = 9,8±0,3 mm; snapo ilgis = 3,5 mm
40 14 diena Trečio piršto ilgis = 12.,7±0,5 mm; snapo ilgis = 4,0 mm
41 15 diena Trečio piršto ilgis = 14,9±0,8 mm; snapo ilgis = 4,5 mm
42 16 diena Trečio piršto ilgis = 16,7±0,8 mm; snapo ilgis = 4,8 mm
43 17 diena Trečio piršto ilgis = 18,6±0,8 mm; snapo ilgis = 5,0 mm
44 18 diena Trečio piršto ilgis = 20,4±0,8 mm; snapo ilgis = 5,7 mm
45 19–20 diena Trynio maišas pusiau įlindęs į embrioną; CAM ne tokia kraujinga
Kaip ir kiti stuburiniai, viščiuko embrionai yra saugomi imuninės siste-mos, sudarytos iš B limfocitų arba B ląstelių, kurios atsakingos už antikū-nus, ir T limfocitų, kurie kontroliuoja ląstelių imunitetą. B ląstelės gamina-mos embriono kepenyse, trynio maiše ir kaulų čiulpuose. Jų diferenciacija vyksta Fabricijaus maišelyje, o žinduolių organizme – kaulų čiulpuose. T ląstelių diferenciacija vyksta užkrūčio liaukoje. Iki dešimtos vystymosi pa-ros viščiuko embriono imuninė sistema nėra pilnai susiformavusi t. y., nėra nei ląstelinio, nei humoralinio imuniteto. Taigi embrionai ankstyvosiose vystymosi stadijose imuniteto neturi. Pirmosios T ląstelės aptinkamos vie-nuoliktą vystymosi parą, o B ląstelės – dvyliktą. Apie dvyliktą parą trynio maiše, blužnyje, žarnose ir kepenyse yra aptinkami mononukleariniai fago-citai, o retikulinės ląstelės yra randamos blužnyje ir kepenyse. Po penkiolik-tos vystymosi paros B ląstelės pradeda diferencijuotis ir aštuonioliktą vysty-mosi parą pilnai susiformuoja embriono imuninė sistema. Žinotina, jog embrionas turi tik trijų rūšių imunoglobulinus: IgM, IgG, IgA. IgM atsiran-da po 4–5 parų, organizmui susidūrus su antigenu, ir išnyksta 10–12 parą. IgG atsiranda šiek tiek vėliau ir išlieka organizme iki trijų savaičių. IgA randamas po 5 parų nuo antigeno poveikio, tačiau jis atlieka daugiau vietinę audinių apsaugą ir randamas akių, žarnyno ir kvėpavimo sistemos išskyrose. Tačiau ūminės ir lėtinės uždegiminės reakcijos yra panašios į žinduolių (Vargas, Zeisser-Labouebe ir kt. 2007, Davison 2003, Zwadlo-Klarwasser, Gorlitz ir kt. 2001, Funk, Thompson 1996, Janse, Jeurissen 1991). Toks imuninės sistemos vystymasis yra labai svarbus viščiuko embriono, kaip eksperimentinio modelio, panaudojime, kadangi dėl imuninės sistemos vy-stymosi ankstyvose stadijose transplantuojant heterologinius audinius cho-rioalantojinėje membranoje nevyksta transplantanto atmetimo reakcija (Kunzi-Rapp, Kaskel ir kt 2001, Kunzi-Rapp, Ruck ir kt. 1999). Vis dėlto manoma, kad embrionas gali reaguoti į transplantantą monocitų ir uždegi-minių ląstelių, tokių kaip heterofilai, infiltracija (Ribatti 2004).
Apibendrinant galima teigti, jog viščiuko embriono vystymasis yra sudė-tingas procesas, kuris priklauso ir nuo aplinkos sąlygų. Be abejonės, svar-biausia šiame darbe tai, kad embriono imuninė sistema susiformuoja gana vėlai, beveik prieš pat išsiritimą – aštuonioliktą parą. Todėl svetimų audinių transplantacija chorioalantojinėje membranoje nesukelia atmetimo reakcijos ir leidžia išvengti ar sumažinti ,,šeimininko“ bei transplantanto reakcijas. Tai svarbu atliekant eksperimentus su augliais.
1.7. Chorioalantojinės membranos vystymasis ir funkcijos
Viščiuko embriono vystymosi metu susiformuoja trys membranos, kurios saugo embrioną ir dalyvauja jo mityboje. Tai trynio maišo membrana, amnionas ir chorioalantojinė membrana (Vargas, Zeisser-Labouebe ir kt. 2007, Matschke, Da Silva-Azevedo ir kt. 2006). Svarbiausia šiame darbe yra chorioalantojinė membrana, kuri dėl savo struktūros yra gera mitybinė terpė transplantuotiems audiniams.
Chorioalantojinė membrana pradeda vystytis ketvirtą – penktą inkubaci-jos parą ir susidaro susiliejus alantojaus ir choriono mezoderminiams sluoksniams. Alantojus išsivysto trečią vystymosi parą kaip invaginatas iš ventralinės endodermos sienelės. Ketvirtą parą jis nustumia embrioną į ekstraembrioninę ertmę. Jo proksimalinė dalis vadinama alantojaus kojele, o distalinė dalis – alantojaus pūslele. Alantojaus pūslelė greitai didėja iki 4 – 10 inkubacijos paros ir susilieja su choriono mezoderminiu sluoksniu. Kai kurių autorių duomenimis, chorioalantojinė membrana susidaro tik septintą vystymosi parą (Leng, Miller ir kt. 2004). Tai skaidri, gausiai vaskuliarizuo-ta membrana, kurioje gausu arterijų, venų ir kapiliarų. Intensyvus kapiliarų vystymasis trunka iki vienuoliktos inkubacijos paros, vėliau mitozinis akty-vumas sumažėja ir kapiliarai vystosi žymiai lėčiau. Pradžioje nediferenci-juotos kraujagyslės yra išsidėsčiusios chorioalantojinės membranos mezo-derminiame sluoksnyje ir tik nuo aštuntos vystymosi paros pradeda diferen-cijuotis į kapiliarus. Visiškai viščiuko embriono kraujagyslių sistema susi-formuoja tik aštuonioliktą parą. Maksimali vaskuliarizacija yra pasiekiama devintą – dvyliktą parą (Vargas, Zeisser–Labouebe ir kt. 2007, Laurin, Schmitz ir kt. 2004, Burges, Tegtmeier ir kt. 2003, Ribatti, Conconi ir kt. 2003, Ribatti, Nico ir kt. 2001, Schlatter, Konig ir kt. 1997, Wilting, Christ ir kt. 1990). Chorioalantojinė membrana galutinai susiformuoja vienuoliktą parą ir prisitvirtina po vidine lukšto membrana. Gausus kraujagyslių tinklas jau nuo keturioliktos vystymosi paros yra arti paviršiaus (Reizis, Hammel ir kt. 2005, Schlatter, Konig ir kt. 1997, Patan, Haenni ir kt. 1993).
Dėl tankaus kraujagyslių sluoksnio, kuris geba aprūpinti ne tik embrioną, bet ir transplantantą deguonimi ir maisto medžiagomis, viščiuko embriono chorioalantojinė membrana plačiai naudojama įvairių audinių kultivavimui (Katoh, Nakada ir kt. 2001). Be abejo, membranos kraujagyslės yra glaudžiai susijusios su limfagyslėmis. Visos didesnės venos yra apsuptos limfinių rezgi-nių, kurie nuteka į uodeginę embriono dalį (Wilting, Neeff ir kt. 1999).
Chorioalantojinė membrana (pradedant nuo dvyliktos vystymosi paros) gali būti dalinama į tris anatomiškai aiškius sluoksnius: pirminis sluoksnis, kapiliarų rezginys ir plonas sluoksnis, kurį sudaro specializuotos choriono epitelio ląstelės. Virš šio sluoksnio yra vidinė lukšto membrana.
Arčiausiai besivystančio embriono glūdi pirminis sluoksnis. Tai storiau-sia chorioalantojinės membranos dalis (20–100 μm storio), po kuria eina storiausios membranos kraujagyslės. Mažesnio skersmens kraujagyslės yra išsidėsčiusios šio sluoksnio viduje. Į išorinę pusę nuo šio sluoksnio yra kapi-liarų rezginys. Iš karto virš jo esti ploniausias chorioalantojinės membranos sluoksnis (apie 1 μm storio), kuris yra sudarytas iš keturių posluoksnių (pag-rindinės membranos, epitelinių ląstelių sluoksnio, peptidoglikanų sluoksnio ir bazalinės membranos), išsivysčiusių iš choriono. Pagrindinė membrana tiesiogiai liečiasi su kapiliarų sluoksniu. Vystantis embrionui epitelinių ląstelių sluoksnis mažėja, todėl susidaro plonasienės vakuolės. Virš bazali-nės membranos glūdi vidinė lukšto membrana, kurioje yra daug kalcio, peptidoglikanų ir kolageno. Bazalinėje membranoje yra mikrogaureliai, ku-rie penetruoja į vidinę lukšto membraną ir dalyvauja kalcio pernešime (Leng, Miller ir kt. 2004). Kitų autorių duomenimis, chorioalantojinė membrana yra skirstoma į tokius tris sluoksnius: ektoderminį epitelį, kuris yra arčiau-siai lukšto, mezoderminį vidurinį sluoksnį, kuris priklauso tiek chorionui, tiek alantojui, ir endoderminį epitelį, kuris iškloja alantojaus ertmę (Gabriel-li, Materazzi ir kt. 2001).
Vykstant morfogenezei, chorioalantojinė membrana keičiasi morfologiš-kai – kinta tarpląstelinės terpės sudėtis, endotelio ląstelių ir kraujagyslių diferenciacija, keičiasi jungtys tarp endotelinių ląstelių, taip pat kraujagyslių lokalizacija bei kiekis. Tam įtakos turi ir vis didėjantis embriono deguonies poreikis. Todėl labai svarbu eksperimentiniams modeliams naudoti tos pa-čios inkubacijos embrionus. Pagrindinė membranos funkcija – tai dalyvavi-mas embriono kvėpavime ir dujų apykaitoje iki devynioliktos vystymosi paros. Tam padeda gausus kraujagyslių tinklas. Tačiau chorioalantojinė membrana dalyvauja ir daugybėje kitų funkcijų: kalcio pernešime iš lukšto į embrioną (nuo dešimtos paros, nes iki to laiko embrionas aprūpinamas kalciu iš trynio maišo), palaiko šarmų ir rūgščių pusiausvyrą, reguliuoja vandens ir elektrolitų pusiausvyrą (natrio ir chloridų), dalyvauja atliekų (šla-palo, amoniako ir šlapimo rūgšties) saugojime (Vargas, Zeisser-Labouebe ir kt. 2007, Matschke, Da Silva-Azevedo ir kt. 2006, Gabrielli, Materazzi ir kt. 2001, Ribatti, Vacca ir kt. 2001, Schlatter, Konig ir kt. 1997) (1.7.1 pav.).
1.7.1 pav. Scheminis chorioalantojinės membranos ir viščiuko embriono
vaizdas (Patter Bradley 1929).
Ect – ektoderminis chorioalantojinės membranos sluoksnis, Mes – mezoderminis chorioalan-tojinės membranos sluoksnis, Ent – endoderminis chorioalanchorioalan-tojinės membranos sluoksnis, All. C. – alantojaus ertmė, Am – amnionas, Am. C. – amniono ertmė, Chor – chorionas, Y.S. – trynio maišas, Alb. – baltymas, All. S. – alantojaus kraujagyslės, Y. S. S. – trynio maišo kraujagyslės, All. S. – alantojaus maišas.
Apibendrinant galima teigti, jog chorioalantojinė membrana pradeda for-muotis 22-ą embriono vystymosi pagal Hamburger-Hamilton stadiją (trečią-ketvirtą parą nuo inkubacijos pradžios). Ji dalyvauja daugybėje embrionui svarbių fiziologinių procesų (vandens ir elektrolitų apykaitoje, šalinimo pro-cesuose, Ca2+ ir deguonies pernešime). Dėl gausaus kraujagyslių tinklo ji yra puiki mitybinė terpė transplantuotiems audiniams. Svarbu tai, kad vysty-mosi metu keičiasi chorioalantojinės membranos morfologinės savybės, todėl norint gauti tikslius eksperimentų rezultatus, reikia naudoti to paties amžiaus embrionus.
1.8. Eksperimentiniai chorioalantojinės membranos modeliai
Eksperimentinis viščiuko embriono chorioalantojinės membranos mode-lis žinomas jau daugiau kaip 100 metų, kuomet J. B. Murphy (1913 m.) pirmą kartą persodino auglius chorioalantojinėje membranoje (Ribatti 2004).
Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana plačiai naudojama ir šiais laikais. Ji turi keletą privalumų palyginus su įprastiniais modeliais: eksperi-mentą galima stebėti plika akimi, jei tyrinėjama angiogenezė, labai aiškiai matoma chorioalantojinės membranos kraujagyslių sistema, nėra metaboli-nės ar hormonimetaboli-nės įtakos iš išorės. Šis modelis daugiau fiziologinis modelis nei in vitro, nes viščiuko embriono imuninė sistema neįtakoja transplantuotų navikų (Larger, Marre ir kt. 2004). Vertingiausi chorioalantojinės membra-nos privalumai yra tai, kad tai pigus ir paprastas eksperimentinis modelis, galima atlikti daugybinius eksperimentus. Nereikia pamiršti to, kad pati chorioalantojinė membrana patiria sparčius morfologinius pokyčius ir, be abejo, tai turi įtakos endotelinių ląstelių proliferacijos greičiui (Auerbach, Lewis ir kt. 2003). Todėl, vystantis embrionui, kraujagyslės ir struktūros auga lėčiau, o tai turi įtakos eksperimentų rezultatams. Daugelio autorių duomenimis, šis modelis darosi vis reikšmingesnis dėl naujų technologijų atsiradimo, naujų genetinių metodų, kurie leidžia vis plačiau pritaikyti chorioalantojinę membraną eksperimentiniams darbams (Stern 2005, Kulesa 2004, Mozdziak, Petitte 2004).
Chorioalantojinė membrana kaip modelis angiogenezės procesams tyri-nėti. Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana yra plačiai naudojamas
modelis angiogenezei tyrinėti. Angiogenezė arba neovaskuliarizacija yra procesas, kurio metu susidaro naujos kraujagyslės iš jau egzistuojančių. Pagrindinės ląstelės, dalyvaujančios šiame procese, yra endotelio ląstelės, kurios iškloja visas kraujagysles ir kapiliarus. Kad susiformuotų naujos kraujagyslės, endotelio ląstelės turi judėti per bazalinę membraną angioge-nezinio stimulo, kuris gali būti sukeliamas naviko, aktyvuotų limfocitų ar makrofagų, link. Taip pat endotelio ląstelės proliferuoja, kad galėtų susida-ryti naujos kraujagyslės. Visi šie procesai (bazinės membranos pralaidumas, ląstelių judėjimas, proliferacija ir vamzdinių struktūrų formavimasis) gali būti tyrinėjimų objektas (Auerbach, Lewis ir kt. 2003). Tyrinėjama medžia-ga yra paruošiama ant polimerinių skrituliukų, specialių želatininių kempi-nėlių arba išdžiovinama ant plastikinių diskelių, kurie vėliau yra transplantuojami viščiuko chorioalantojinėje membranoje per langelį padarytą kiaušinio lukšte. Kadangi viščiuko embriono imuninė sistema subręsta tik prieš pat išsiritimą, tai leidžia tirti navikų sukeltą angiogenezę. Angiogenezės procesai gali būti tiriami skaičiuojant kraujagyslių kiekį tam tikrame ploto vienete, naudojant stereomikroskopą. Kai kurie autoriai
aprašo ir belukštės chorioalantojinės membranos, kuri yra kultivuojama Petri lėkštelėse, naudojimą angiogenezės tyrinėjimuose: visas kiaušinio lukšto turinys perkeliamas į plastikinę lėkštelę praėjus 72 val. nuo inkubacijos pradžios. Nors techniškai galima manyti, kad tai – in vitro sistema, vis dėlto tai yra eksperimentinis gyvūnų modelis. Po 3–6 inkubacijos dienų, per kurias chorioalantojinė membrana pilnai išsivysto, testuojamos medžiagos yra įterpiamos į chorioalantojinę membraną ir gali būti stebimos visą eksperimento laiką. Keletą dienų galima stebėti aktyvią ir intensyvią angiogenezę (Auerbach, Lewis ir kt. 2003). Ši metodika leidžia kiekybiškai įvertinti kraujagysles žymiai didesniame plote. Taip pat 7–8 vystymosi parą chorioalantojinė membrana gali uždegimine reakcija reaguoti į daugybę dirgiklių, taip pat ir į lukšto dulkes, kurios neišvengiamai atsiranda darant langelį lukšte ir skatina naujų kraujagyslių atsiradimą. Membrana taip pat yra labai jautri deguonies pokyčiams, todėl lukšto langelį būtina steriliai ir saugiai uždengti (Staton, Stribbling ir kt. 2004, Auerbach, Akhtar ir kt. 2000, Nguyen, Shing ir kt. 1994).
Įvairūs autoriai yra aprašę daugybę angiogenezės chorioalantojinėje membranoje tyrinėjimų. Barnhill ir Ryan (1983) tyrinėjo angiogenezę galin-čių sukelti medžiagų poveikį chorioalantojinei membranai. Jie naudojo me-džiagas, kurios galėtų sukelti naujų kraujagyslių proliferaciją odoje ir gavo duomenų, jog dauguma jų iš tikrųjų nesukelia naujų kraujagyslių forma-vimosi. Caunt, Huang ir kt. (2003) tyrinėjo trombino, kuris dalyvauja naviko augime ir metastazavime, poveikį angiogenezei, naudodami belukštės chorioalantojinės membranos techniką. Gauti duomenys patvirtino, jog trombinas skatina angiogenezę per VEGF ir TIE–2 receptorius, sužadindamas tam tikras signalines molekules. Belukštės chorioalantojinės membranos techniką naudojo ir Richardson, Wong ir bendraautoriai (2005), kurie tyrinėjo doksiciklino įtaką angiogenezės slopinimui. Jie įrodė, jog doksiciklinas sumažina choriono kapiliarų skaičių, kas matoma netgi plika akimi. Jų nuomone, chorioalantojinės membranos sistema ypač efektyvi tuo, kad galima greitai stebėti pokyčius, keisti medikamento dozavimo režimą ir įvertinti preparato poveikį greitai augančioms bei jau subrendusioms kraujagyslėms. Larger, Marre ir bendraautoriai (2004) tyrė hiperglikemijos įtaką angiogenezei, tačiau, skirtingai nuo kitų autorių naudojo įprastinį chorioalantojinės membranos paruošimo būdą (t. y., chorioalantojinės membranos stebėjimą per langelį kiaušinio lukšte). Drenkhahn, Gescher ir kt. (2004) taip pat tyrinėjo angiopoetino įtaką angiogenezei chorioalantojinėje membranoje (chorio-alantojinės membranos). Vis dėlto daugiausia straipsnių apie angiogenezės tyrinėjimus yra parengęs Ribatti su bendraautoriais (1996, 2001, 2003, 2004). Jie išsamiai aprašė chorioallantojinės membranos, kaip modelio
