LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GINTARĖ SIMANAUSKAITĖ
AMINORŪGŠČIŲ PROFILIO TYRIMAS MAISTO PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. Dr. Valdas Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė
Data
AMINORŪGŠČIŲ PROFILIO TYRIMAS MAISTO PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Dr. Valdas Jakštas Data
Recenzentas Darbą atliko: Magistrantė
Gintarė Simanauskaitė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Aminorūgštys... 10
1.2 Aminorūgščių molekulinė struktūra ... 11
1.3 Amino rūgščių klasifikacija ... 12
1.4 Aminorūščių optinė izomerija ... 14
1.5 Aminorūgščių funkcijos organizme... 14
1.6 Baltymų sintezė skeletiniuose raumenyse ... 16
1.7 Aminorūgščių poveikis skeletinei raumenų sistemai ... 17
1.8 Amino rūgščių kokybinio ir kiekybinio įvertinimo metodai ... 19
1.8.1 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 19
1.8.2 Dujų chromatografija . ... 19
1.9 Baltymų hidrolizė. ... 20
1.10 Maisto papildų kokybės kontrolė ir notifikavimas ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1 Tyrimo objektai ... 24
2.2 Naudotos medžiagos ... 24
2.3 Naudota įranga ... 25
2.4 Tiriamųjų tirpalų ir etaloninio tirpalo paruošimas ... 25
2.5 Tyrimo metodika ... 26
2.6 Duomenų analizės metodai ... 27
3.1 Aminorūgščių kokybinis nustatymas ... 28
3.2 Aminorūgščių kiekybinis nustatymas ... 29
3.2.1 Mėginių hidrolizė ... 30
3.2.2 Apskaičiuotų ir deklaruojamų aminorūgščių koncentracijų palyginimas ... 32
3.2.3 Nustatytos suminės aminorūgščių koncentracijos apibendrinimas ... 46
4. IŠVADOS ... 49
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50
SANTRAUKA
G.Simanauskaitės magistro baigiamasis darbas, „Aminorūgščių profilio tyrimas maisto papilduose“, darbo vadovas: prof. dr.Valdas Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019.
Darbo tikslas: ištirti aminorūgščių sudėties profilius maisto papilduose ultra efektyviosios skysčių
chromatografijos-masių spektrometrijos metodu ir įvertinti produktų kokybinės vertės grandinę.
Uždaviniai: 1. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodu įvertinti
maisto papilduose esančių laisvų aminorūgščių kokybinę sudėtį. 2. Nustatyti tiriamų maisto papildų mėginiuose esančių laisvų ir hidrolizės būdu atpalaiduotų aminorūgščių kiekybinius rodiklius.
Tyrimo objektas: maisto papildai, sudėtyje turintys šakotos grandinės aminorūgščių ar pakeičiamų ir
nepakeičiamų aminorūgščių kompleksą.
Tyrimo rezultatai ir išvados: 1 UESC-MS metodu įvertinta kokybinė tirtų maisto papildų mėginių
sudėtis. MPS1-MPS3 mėginiuose identifikuotos šakotos grandinės aminorūgštys: l-leucinas (kartu su l-izoleucinu), l-valinas, nurodytos produktų etiketėse. MPS1-MPS3 mėginiuose nustatytos etiketėse nenurodytos aminorūgštys: alaninas, argininas, prolinas, asparto rūgštis, tirozinas, l-fenilalaninas, l-treoninas, l-lizinas. Glicinas nenustatytas MPS3 mėginyje, l-serinas ir l-glutamo rūgštis nenustatytos MPS1 mėginyje, l-metioninas nenustatytas MPS1 ir MPS2 mėginiuose. MPS4-MPS7 mėginiuose identifikuota keturiolika aminorūgščių: alaninas, serinas, glicinas, argininas, l-metioninas, l-prolinas, l-lizinas, l-treoninas, l-fenilalaninas, l-tirozinas, l-glutamo rūgštis, l-asparto rūgštis, l-valinas ir l-leucinas (su l-izoleucinu), kurios yra nurodytos maisto papildų etiketėse. Maisto papildų MPS4-MPS7 etiketėse nenurodytų aminorūgščių mėginiuose nenustatyta, išskyrus MPS7 mėginį, kuriame identifikuota glutamo rūgštis, nenurodyta produkto ženklinime. 2. UESC-MS metodu, įvertintas tiriamųjų mėginių kiekybinis profilis, laisvų aminorūgščių koncentracijos sulygintos su maisto papildų etiketėse nurodytomis koncentracijomis. Nustatyta, kad MPS6 mėginyje procentinė suminė aminorūgščių koncentracija viršija etiketėje nurodytą koncentraciją 20,230 proc. nuo papildo ženklinime nurodytos koncentracijos. MPS1-MPS5 mėginiuose nustatyta koncentracija atitiko papildų ženklinime nurodytą koncentraciją 61,123 - 83,501 proc. Tiriamajame MPS7 mėginyje nustatyta tik 56,913 proc. aminorūgščių koncentracija, atitinkati ženklinime nurodytą koncentraciją.
SUMMARY
Master thesis of G.Simanauskaitė, Profile analysis of amino acids in dietary supplements, scientific supervisor prof. dr. Valdas Jakštas. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas.
Aim of the work: To determine compositional profiles of amino acids in dietary supplements by
ultra-high-performance liquid chromatography - mass spectrometry method and to evaluate the value of the quality chain .
Tasks: 1. To evaluate the quality value of free amino acids in dietary supplements by using
ultra-high-performance liquid chromatography - mass spectrometry method. 2. To assess the quantity rates of naturally free and released by hydrolisation amino acids in investigated samples of dietary supplements.
Research object: branched-chain amino acid dietary supplements, essential and non-essential amino
acid dietary supplements.
Results and conclusions: 1. In this study compositional quality value of amino acids in dietary supplement samples was determined by using UHPLC-MS method. Branched-chain amino acids (l-leucine (with l-iso(l-leucine) and l-valine were identified in MPS1-MPS3 samples, these amino acids were mentioned on invetigated dietary supplements labels. Samples MPS1-MPS3 also contained amino acids, that were not mentioned on the labels: alanine, arginine, proline, tyrosine, phenylalanine, threonine, lysine, aspartic acid, glycine was not identified in MPS3 sample, l-serine and l-glutamic acid were not indentified in MPS1 sample, l-methionine was not found in MPS1 and MPS2 samples. Fourteen amino acids were identified in samples MPS4-MPS7: l-alanine, l-serine, glycine, l-arginine, l-methionine, l-proline, l-lysine, l-threonine, l-phenylalanine, l-tyrosine, l-glutamic acid, l-aspartic acid, l-valine, l-leucine (with l-isoleucine), which were mentioned on the labels of dietary supplements. In dietary supplements MPS4-MPS7 amino acids that were not indicated on the labels were not identified, except in sample MPS7 glutamic acid was present. 2. Compositional
quantity value of amino acids in the MPS1-MPS7samples of dietary supplements were determined by
using UHPLC-MS method, then measured concentrations of amino acids in the samples were compared to the concentractions of amino acids indicated on the labels. The sum of all quantity results of amino acids showed that total concentration of amino acids in MPS6 sample exceeds concentration indicated on the label by 20,230 percent. In samples MPS1-MPS5 determined amino acid concentractions were in 61,123 - 83,501 percentile range. Measured total amino acid concentration in sample MPS7 matched concentration indicated on supplement label only by 56,913 percent.
SANTRUMPOS
AR – amino rūgštisDC – dujų chromatografija
ES – Europos Sąjunga
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
HILIC – hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografija (angl. Hydrophylic interaction liquid chromatography)
MP – maisto papildas
mTORC1 – žinduolių rapamicino taikinio kompleksas 1
MS – masių spektrometrija
UESC – ultra efektyvioji skysčių chromatografija
VMVT – Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba
ĮVADAS
Vaistinėse, specializuotuose maisto papildų ir internetinėse parduotuvėse siūlomas platus įvairių augalinės ar gyvūninės kilmės, koncentruotų, izoliuotų ar hidrolizuotų baltyminių ir laisvos formos aminorūgščių maisto papildų pasirinkimas. Ypatingai didele paklausa pasižymi baltyminės kilmės ingredientai, kurie dažniausiai vartojami aktyvia fizine veikla užsiimančių profesionalių sportininkų ar sporto mėgėjų, dėl siekiamos naudos skeletinei raumenų sistemai. Teigiama, jog sportininkams skirti maisto papildai, sudėtyje turintys aminorūgščių, stiprina raumenų jėgą ir ištvermę, skatina raumeninės masės atsistatymą ir augimą po fizinio krūvio, sumažina kūno riebalų kiekį ir taip daro teigiamą įtaką sportininkų fizinio tobulėjimo rezultatams [32, 39].
Žmogaus baltymų peptidinėse grandinėse randama 20 skirtingų l-aminorūgščių - organinių monomerų, kuriems būdinga molekulinė struktūra, susidedanti iš trijų pagrindinių funkcinių grupių: amino grupės, rūgštinės grupės ir šoninio radikalo. Šoninis radikalas yra unikali kiekvienos aminorūgšties funkcinė grupė, suteikianti joms skirtingas fizikochemines savybes ir lemianti atliekamas funkcijas organizme: struktūrinę, transportinę, apsauginę, katalitinę, motorinę, hormoninę it kt. Pagal tai, kaip organizmas aprūpinamas aminorūgštimis, jos suskirstytos į pakeičiamas (sintezuojamas organizme) ir nepakeičiamas (gaunamas su maistu) aminorūgštis [5, 42].
Europos Sąjungoje ir Lietuvos Respublikoje reglamentuoti maisto papildų gamybos ir sudėties laboratorinių tyrimų pateikimo reikalavimai yra reikšmingai besiskiriantys nuo nustatytų vaistiniams preparatams. Notifikuojant maisto papildus, gaminamus Lietuvoje ar importuojamos iš Europos Sąjungos valstybių narių, nebūtina pateikti jų kokybinio ir kiekybinio profilio laboratorinių tyrimų protokolų. Už maisto papildų kokybinės ir kiekybinės sudėties vertę bei tinkamą ženklinimą etiketėje yra atsakingas gamintojas [56]. Maisto papildų laboratotinių tyrimų kontrolės reglamentavimui keliami reikalavimai nėra tokie griežti, lyginant su vaistiniais preparatams keliamais reikalavimais. Galima daryti prielaidą, kad tokių produktų sudėties atitikimas etiketėje nurodytai informacijai nėra nuosekliai užtikrinamas.
Siekiant įvertinti Lietuvos rinkoje esančių maisto papildų, turinčių aminorūgščių, sudėties profilį ir kiekybinius rodiklius, parenkama ultra efektyviosios skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodika, pasižyminti dideliu jautrumu, atrankumu analitėms ir rezultatų tikslumu. Aminorūgščių atskyrimui naudojama hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografijos kolonėle, kuri suteikia galimybę analizę atlikti be derivatizacijos.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti aminorūgščių sudėties profilius maisto papilduose ultra efektyviosios
skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodu ir įvertinti produktų kokybinės vertės grandinę.
Darbo uždaviniai:
1. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodu įvertinti maisto papilduose esančių laisvų aminorūgščių kokybinę sudėtį.
2. Nustatyti tiriamų maisto papildų mėginiuose esančių laisvų ir hidrolizės būdu atpalaiduotų aminorūgščių kiekybinius rodiklius.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Aminorūgštys
Aminorūgštys (AR) - baltymų polipeptidines grandines sudarantys organiniai monomerai. Iš visų natūraliai gamtoje randamų AR, išskiriamos pagrindinės 20 α – aminorūgščių, kurios dalyvauja žmogaus baltymų sintezėje, susijungdamos tarpusavyje peptidinėmis jungtimis. Žmogaus ląstelių ribosomose sintetinami baltymai peptidinėje grandinėje turi skirtingą AR kiekį ir išsidėstymo seką, kuri nulemia didelę baltymų įvairovę ir atliekamas funkcijas organizme. Visi žmogaus organizmo baltymai, dalyvaujantys metabolizmo reakcijose, yra sudaryti iš α – AR: fermentai, neurotransmiteriai, neuromoduliatoriai, hormonai, hormonus išskiriančios sistemos. AR struktūroje esantis azoto atomas suteikia molekulei išskirtinę svarbą palaikyti optimalų azoto balansą organizme, todėl jos yra ir daugelio biologiškai aktyvių nebaltyminių medžiagų, turinčių azoto atomą, prekursorius: kreatinino, azoto monoksido, hemo, purino, pirimidino, porfirino ir kt. [5, 36, 50].
Aminorūgštys skirstomos į pakeičiamas ir nepakeičiamas, remiantis tuo, kokiu būdu organizmas jomis aprūpinamas (1 lent.) [4]. Pakeičiamos AR, esant teigiamam azoto balansui organizme, sintetinamos žmogaus organizmo ląstelėse. Nepakeičiamos AR nėra sintezuojamos žmogaus organizme, jų sintezė vykdoma tik tam tikruose augaluose ir bakterijose. Žmogaus mitybos grandinėje turi būti pakankamas nepakeičiamų amino rūgščių kiekis, reikalingas palaikyti jų fiziologinę normą [4,40].
Histidinas ir argininas (1 lent. pažymėtos žvaigždute), laikomos pusiau nepakeičiamomis aminorūgštimis. Normaliomis sąlygomis organizmo ląstelėse sintetinamas pakankamas kiekis šių AR, tačiau sintezės greitis gali būti nepakankamas augančiame vaikų organizme ar esant metaboliniams organizmo sutrikimams, tokiomis aplinkybėmis jos tampa nepakeičiamomis AR [1, 4].
1 lentelė. Pakeičiamos, nepakeičiamos ir iš dalies nepakeičiamos aminorūgštys [4]. Pakeičiamos aminorūgštys Aminorūgščių trumpiniai ir simboliai Nepakeičiamos aminorūgštys Aminorūgščių trumpiniai ir simboliai
Alaninas Ala (A) Leucinas Leu (L)
Asparaginas Asn (N) Izoleucinas Ile (I)
Tirozinas Tyr (Y) Lizinas Lys (K)
Cisteinas Cys (C) Fenilalaninas Phe (F)
Glutaminas Gln (Q) Metioninas Met (M)
Glicinas Gly (G) Treoninas Thr (T)
* - iš dalies nepakeičiamos aminorūgštys [1].
1.2 Aminorūgščių molekulinė struktūra
Kiekviena aminorūgštis turi fundamentalią struktūrą, kuri suteikia molekulei būdingas savybes. Visos AR turi ketvirtinį α-anglies atomą, prie kurio jungiasi keturios skirtingos, asimetriškai išsidėsčiusios funkcinės grupės, suteikiančios molekulei struktūrinį skeletą. Funkcinės grupės: rūgštinė
karboksilo grupė (-COOH), bazinė amino grupė (-NH2), šoninis radikalas (R) ir vandenilio atomas (H)
(1pav). Aminorūgščių molekulėje yra rūgštinių ir bazinių grupių, cheminiu požiūriu jas galima laikyti amfolitais, kuriems būdingos abiejų grupių cheminės savybės [43].
1 paveikslėlis. Bendroji aminorūgščių molekulinė struktūra [43].
Aminorūgščių šoninis radikalas yra viena svarbiausių grupių molekulėje. Kiekviena AR turi skirtingos cheminės struktūros šoninį radikalą, kuris nulemia AR fizikochemines savybes (tirpumą, cheminį aktyvumą, molekulės krūvį, disociacijos konstantą) ir atliekamą funkciją organizme. Aminorūgštys gali būti klasifikuojamos pagal šoninio radikalo struktūrinių ypatybių ir savybių skirtumus [42, 43].
Išskirtine molekuline struktūra pasižymi prolinas ir glicinas. Prolino molekulės struktūroje azoto atomas yra ciklinėje funkcinėje grupėje (pirolidino žiede), todėl vietoj pirminės amino grupės prolinas turi antrinę imino grupę [5, 43]. Glicino molekulėje prie α - anglies atomo yra prisijungusios keturios funkcinės grupės, tačiau šoninis radikalas (R) yra vandenilio atomas, molekulėje yra dvi vienodos grupės, vadinasi anglies atomui nėra būdingas asimetriškumas [42].
Serinas Ser (S) Valinas Val (V)
Glutamo rūgštis Glu (E) Histidinas* His (H)
1.3 Amino rūgščių klasifikacija
Aminorūgštys klasifikuojamos remiantis šoninių radikalų įvairove, struktūra ir savybėmis [5, 55].
1. Remiantis šoninio radikalo poliškumu, AR klasifikuojamos į:
1.1 Hidrofobinės AR: glicinas, alaninas, valinas, leucinas, izoleucinas, fenilalaninas, triptofanas, metioninas, prolinas ir tirozinas (2 pav.) [5, 55].
Glicinas Alaninas Valinas Leucinas
Metioninas Triptofanas Fenilalaninas
Izoleucinas Prolinas Tirozinas
2 paveikslėlis. Hidrofobinės aminorūgštys [55].
1.2 Hidrofilinės AR: serinas, treoninas, asparaginas, glutaminas, cisteinas, asparto rūgštis, glutamo rūgštis, histidinas, lizinas ir argininas (3pav.) [5, 55].
Glutaminas Glutamo rūgštis Asparto rūgštis
Histidinas Lizinas Argininas
3 paveikslėlis. Hidrofilinės aminorūgštys [49].
2. AR klasifikuojamos pagal šoninio radikalo (R) struktūrą ir savybes: 2.1 Rūgštinės AR: asparto rūgštis, glutamo rūgštis.
2.2 Bazinės AR: histidinas, lizinas, argininas.
2.3 Alifatinės AR: glicinas, alaninas, valinas, leucinas, izoleucinas. 2.4 Sieros atomą turinčios AR: cisteinas, metioninas.
2.5 Hidroksilo grupę turinčios AR: serinas, treoninas. 2.6 Aromatinės AR: fenilalaninas, tirozinas, triptofanas.
2.7 Imino rūgštys: prolinas [36, 53]. Kai kuriuose literatūros šaltiniuose prolinas prisikiriamas prie alifatinių AR [43].
Aminorūgščių polinės savybės nulemia jų vietą baltymo galutinėje erdvinėje struktūroje. Hidrofobinės AR baltymų peptidinėje grandinėje išsidėsto vidinėje pusėje ir nedalyvauja jonizacijoje ir vandenilinių ryšių susidaryme. Hidrofilinės AR turi krūvį, sąveikauja su poline išorine aplinka, todėl išsidėsto išorinėje baltymų pusėje sudarydamos vandenilinius ryšius ir druskų tiltelius tarp skirtingų AR [25, 42].
Aminorūgštys yra amfoteriniai junginiai, jos turi bent vieną α - amino grupę, kurios elektrinis krūvis yra teigiamas, kai molekulė yra protonizuota ir bent vieną α - karboksilo grupę, turinčią neigiamą elektrinį krūvį, jei molekulė yra deprotonizuota [52]. Priklausomai nuo tirpalo pH, šarminėje terpėje jos veikia kaip rūgštys, rūgščioje - kaip bazės. Esant fiziologiniam pH (maždaug 7,4), -COOH
ir -NH2 funkcinės grupės AR molekulėje yra jonizuotos tuo pačiu metu (molekulė yra elektriškai
1.4 Aminorūščių optinė izomerija
Aminorūgštyse vienas iš pagrindinių atomų yra ketvirtinis anglies atomas, prie kurio asimetriškai jungiasi keturios skirtingos funkcinės grupės, todėl α - anglies atomas yra molekulės chiralinis centras. Prie anglies atomo prisijungusios funkcinės grupės erdvėje išsidėsto asimetriškai, todėl egzistuoja keletas optinių izomerų – enantiomerų, kurie žymimi D arba L raidėmis (4 pav.). Dėl šios priežasties AR yra chiraliniai junginiai. Chirališkumas apibūdinamas kaip enantiomerų gebėjimas sukti poliarizuotos šviesos plokštumą į dešinę arba kairę pusę. AR enantiomerai nustatomi pagal tai, kurioje molekulinės erdvės pusėje išsidėsto amino grupė, kai karboksi grupė yra molekulės viršuje: jei amino grupė yra kairėje pusėje, aminorūgštis yra L konfigūracijos, jei dešinėje – D konfigūracijos. Optiniai izomerai geba sukti poliarizuotos šviesos plokštumą į skirtingas puses. Visų AR, įeinančių į žmogaus baltymų sudėtį, izomerai yra L erdvinės konfigūracijos ir poliarizuotos šviesios plokštumą jie suka į kairę (+) ir dešinę (-) puses. Glicinas neturi D ir L konfigūracijos izomerų, nes jo molekulės struktūroje yra du vandenilio atomai [43].
4 paveikslėlis. Aminorūgščių D ir L enantiomerai [43].
1.5 Aminorūgščių funkcijos organizme
Aminorūgštys yra baltymų, hormonų, mažos molekulinės masės azotinių medžiagų sudėtyje ir reguliuoja pagrindinius metabolinius kelius, kurie užtikrina organizmo augimą, reprodukciją ir apsauginę funkciją [50].
Aminorūgštys pasižymi insulino sekreciją stimuliuojančiu poveikiu. Literatūroje dažnai minimos šakotos grandinės AR (angl. BCAA: leucinas, izoleucinas ir valinas) efektyvumas, didinant cirkuliuojančio insulino koncentraciją plazmoje. Iš jų ypatingai išskiriamas leucinas, kuris in vivo aktyvuoja glutamato dehidrogenazę kasos langerhanso salelių β – ląstelėse, tiesiogiai skatina insulino sekreciją ir mažina gliukozės koncentraciją kraujyje. Ilgalaikė terapija leucinu potencialiai gali būti panaudojama glikemijos kontrolei, II tipo cukrinio diabeto prevencijai ir gydymui [18, 21] Manoma,
jog vartojant insulino sekreciją skatinančiu poveikiu pasižyminčių AR derinius (leuciną su fenilalaninu) kartu su karbohidratais (gliukoze), pasiekamas efektyvesnis vidutinės insulino koncentracijos padidėjimas, nei vartojant AR derinį ar individualias AR dozes ir gliukozę atskirai [20, 30].
Aminorūgštys yra atsakingos ne tik už organizmo homeostazę ir baltymų sintezę, bet ir už nervinių impulsų perdavimą: tam tikros AR yra prekursoriai neurotransmiterių biozintezėje arba pačios veikia kaip mažos molekulinės masės mediatoriai. Glicinas yra pagrindinis inhibuojantis neuromediatorius nugaros smegenyse, taip pat jis galimai yra NMDA receptorių koagonistas - sustiprina kitų neurotransmiterių stimuliuojantį poveikį šiam receptoriui [47]. Glutamatas, sintetinamas pagrindinai iš AR glutamino, yra inhibuojančio neurotranmiterio γ - amino sviesto rūgšties (GABA) biosintezės prekursorius, tačiau centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje glutamatas veikia kaip mažos molekulinės masės stimuliuojantis neurotransmiteris, atsakingas už 75 proc. nervinių impulsų perdavimų. Antinksčių šerdinėje dalyje sintezuojamų katecholaminų (dopamino, norepinefrino ir epinefrino) pagrindinis prekursorius yra tirozinas. Vykstant hidroksilinimo reakcijai tirozinas verčiamas į 3,4-dihidroksifenilalaniną (DOPA), kuris dekarboksilinamas į dopaminą, iš dopamino sintetinamas norepinefrinas, iš jo – epinefrinas. Kitų biogeninių aminų sintezės prekursoriai taip pat yra AR: serotonino ir melatonino sintezės prekursorius yra triptofanas, histamino prekursorius – histidinas [3, 25]. Neuropeptidų, veikiančių kaip neuromediatoriai, molekulinė struktūra susideda iš AR grandinės: angiotenzino II struktūroje yra 8 amino rūgščių grandinė, medžiaga P susideda iš 11 AR sekos, vazopresinas ir oksitocinas iš 9 AR, enkefalinai - 5 AR, somatostatinas - 14 AR [47]. Azoto monoksidas (NO) - netipinio dujų pavidalo mediatorius, lengvai pereinantis hematoencefalinį barjerą, sintetinamas iš l-arginino [25].
Aminorūgštys pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, apsaugant ląsteles nuo laisvųjų radikalų sukeliamo oksidacinio streso. Laisvieji radikalai sukelia DNR pažaidą, dalyvauja neurodegeneracinių ligų (Parkinsono, Alzheimerio, Hantingtono), lėtinių uždegiminių ligų (astmos, reumatoidinio artrito, pankreatito, cukrinio diabeto), širdies ir kraujagyslių ligų (išemijos) patogenezėje [45]. Iš visų AR stipriausiu antioksidantiniu poveikiu pasižymi merkapto grupę turinčios AR - cisteinas ir metioninas. Tyrimas in vitro parodė, jog cisteino ir metionino liekanos žmogaus serumo albumino molekulėje pasižymi antioksidantiniu aktyvumu prieš chemiškai aktyvias deguonies
ir azoto formas: •OH, O2•−, •NO, (superoksido, hidroksilo, peroksinitrito), taip pat H2O2, HOCl
(vandenilio peroksido, hipochloto rūgšties) [22]. Kitame in vitro tyrime teigiama, kad cisteinas išreiškia stipresnes laisvųjų radikalų surišimo savybes, tuo tarpu metioninas yra efektyvesnis veikdamas kaip metalų jonų chelatorius [7]. Cisteinas yra vieno iš gausiausiai ląstelėse randamo endogeninio antioksidanto – glutationo sudėtyje. Glutationas yra tripeptidas, sudarytas iš cisteino, glicino ir glutamato, apsaugantis ląsteles nuo laisvųjų radikalų ir ksenobiotikų metabolitų sukeliamo
oksidacijos proceso. Taip pat manoma, kad glutationas skatina T ir B limfocitų proliferaciją ir dalyvauja imuniteto stiprinime [2].
Atlikta in vitro ir in vivo tyrimų įrodančių, kad AR dalyvauja organizmo imuninės sistemos valdymo procesuose. Makrofagų fagocitinis aktyvumas ir neutrofilų baktericidinis aktyvumas priklauso nuo glutamino ir arginino. Glutaminas stimuliuoja T limfocitų proliferaciją ir stabdo limfocitų apoptozę, stimuliuoja natūralius kilerius (NK) ląsteles ir limfokinus aktyvuojančius kilerius (LAK) ląsteles, skatina limfocitų ląstelių paviršiuje esančių įvairių CD (angl. Cluster of diferentiation) ekspresiją, moduliuoja citokinų išsiskyrimą. Argininas taip pat išreiškia panašų efektyvumą stimuliuojant imuninę sistemą:reguliuoja normalų T ir B limfocitų vystymąsi ir skatina jų gamybą, padidina cirkuliuojančių imunoglobinų (IgM, IgG) koncentraciją, stimuliuoja NK ir LAK ląsteles. Šakotos struktūros AR teigiamas poveikis imuninės sistemos stiprinimui pastebėtas, kai padidinus šakotos struktūros AR dozę sustiprėjo NK ląstelių aktyvumas, in vitro tyrime padidėjo interleukinų (IL-4) gamyba ir limfocitų proliferacija. Manoma, kad cisteino ir metionino vartojimas padidina cirkuliuojančių antigenų koncentraciją [17].
1.6 Baltymų sintezė skeletiniuose raumenyse
Žmogaus ląstelių augimas ir metabolizmas kontroliuojamas per žinduolių rapamicino taikinį (angl. mTOR). Viena iš mTOR struktūrinių ir funkcinių formų yra žinduolių rapamicino taikinio kompleksas 1 (angl. mTORC1), atsakingas už mRNR transliaciją, baltymų sintezę ir ląstelių autofagiją. Esant anabolinėms sąlygomis ląstelėse, mTORC1 skatina ribosomos S6 baltymo kinazės 1 (S6K1) ir eukariotų iniciacijos faktorių 4E surišančio baltymo 1 (angl.4E-BP1) fosforilinimą. Aktyvinti S6K1 ir 4E-BP1 prisideda prie mRNR transliacijos iniciavimo ir sustiprina transliacijos elongacijos procesą. mTORC1 yra pagrindinis kompleksas, reguliuojantis baltymų sintezę ląstelėse. Esant padidėjusiai laisvų AR koncentracijai skeletiniuose raumenyse, jos veikia kaip stiprus anabolinis mTORC1 stimuliatorius [46]. Mechanizmas, pagrindžiantis ląstelių gebėjimą jausti intraląstelinį AR koncentracijos padidėjimą yra sudėtingas ir iki galo neišaiškintas. Manoma, kad mTORC1 viršutiniai baltymai Sestrin2 ir CASTOR geba jausti padidėjusią viduląstelinę leucino ir arginino koncentraciją. Įvairiuose tyrimuose nagrinėjama kaip pakankama laisvų AR koncentracija organizme susijusi su mTORC1 ir skeletinės raumenų sistemos baltymų sintezės aktyvumu. Atliktame in vivo tyrime raumenų biopsijos mėginiai parodė, kad mTORC1 aktyvumas sustiprėja ir skeletinių raumenų baltymų sintezė padidėja ~60%, suvartojus 10g nepakeičiamų AR. Pastebėta, kad vartojant stiprų mTORC1 inhibitorių rapamiciną, blokuojamas S6K1 ir 4E-BP1 fosforilinimas, baltymų sintezė skeletiniuose raumenyse inhibuojama, net suvartojus 10g nepakeičiamų AR [12]. Kitame in vivo tyrime nustatyta,
kad suvartojus 10g nepakeičiamų AR, mRNR ekspresija padidėjo 22-iems iš 50-ties tirtų genų, susijusių su AR pernešimu, intraląsteliniu AR jutimu ir mTORC1 aktyvumu[16].
1.7 Aminorūgščių poveikis skeletinei raumenų sistemai
Baltymų ir AR maisto papildai dažniausiai vartojami aktyvia fizine veikla užsiimančių asmenų - sportininkų mėgėjų ar profesionalų, siekiančių padidinti raumenų masę, ištvermę ir pajėgumą. Teigiama, kad sportininkams skirti maisto papildai skatina baltymų sintezę (nepriklausomai nuo amžiaus ar lyties) ir sulėtina jų katabolizmą, skatina raumenų glikogeno rezistenciją treniravimosi metu bei stabdo sportinės anemijos atsiradimą (skatina hemoglobino, mioglobino, oksidacinių fermentų ir mitochondrijų sintezę aerobinio treniravimosi metu). Fiziškai aktyviems asmenims rekomenduojama suvartoti 1,4–2,0 g/kg kūno masės baltymų. Sportininkų tarpe ypatingai populiarūs yra šakotos grandinės AR papildai, baltymų išrūgų hidrolizatai ar izoliatai, kolageno ar kiaulienos izoliatų ar hidrolizatų papildai. Pasaulinė antidopingo agentūra nedraudžia šių papildų vartojimo profesionaliems sportininkams, ruošiantis intensyvios jėgos ir ištvermės reikalaujančioms varžyboms [32, 49].
Įvairiuose klinikiniuose tyrimuose pastebimas teigiamas šakotos grandinės AR papildų vartojimo poveikis skeletinei raumenų sistemai, užsiimant intensyvia fizine veikla. Viename iš jų teigiama, kad 3 savaites vartojant 6g/d šakotos grandinės AR papildų sumažėja įtemptų pasipriešinimo treniruočių metu išsiskiriančio kortizolio kiekis (gliukokortikoidas, skatinantis baltymų katabolizmą)ir reikšmingai sumažinamas kreatinkinazės (skeletinės raumenų sistemos pažaidos markeris) kiekis, lyginant su placebu [40]. Kitame tyrime vartojant 5 g/d šakotos grandinės AR tiriamiesiems pasireiškė silpnesnis uždelstos pradžios raumenų skausmas (angl. delayed onset of muscle soreness, DOMS), lyginant su placebu [41]. Šakotos grandinės AR papildų vartojimas stabdo triptofano transportavimą ir įsisavinimą presinapsiniuose neuronuose, sumažėja laisvojo Trp:BCAA santykis, sulėtėja serotonino sintezė ir išsiskyrimas į presinapsinę terminalę, tai manoma, gali sumažinti fizinio krūvio sukeltą centrinį nuovargį (protinį ir fizinį) [10, 30]. Tyrimams su šakotos grandinės AR papildais dažniausiai naudojamos labai mažos tiriamųjų imtys, reikalingi išsamesni tyrimai, norint pagrįsti AR naudą sportuojančių asmenų raumenų sistemai. Remiantis tyrimų rezultatais su mažomis tiriamųjų imtimis, šakotos grandinės AR i gali palengvinti raumenų atsistatymą ir sumažinti jaučiamą nuovargį po intensyvaus fizinio krūvio, tokiu būdu pagerinti sportininkų fizinio pasirengimo rezultatus.
Sportininkų tarpe taip pat populiarūs augalinės (sojos, ryžių, kanapių, žirnių) ar gyvūninės kilmės (pieno išrūgų, kolageno, želatinos, kiaulienos, jautienos) baltymų hidrolizatai, sudėtyje turintys pakeičiamų ir nepakeičiamų AR kompleksą. Baltymų hidrolizatai gaunami paveikus baltymų izoliatus
(apdirbti, išgryninti baltymai, neturintys gliuteno, laktozės, riebalų priemaišų) karščiu, rūgštimis ar proteoliziniais fermentais. Hidrolizatų sudėtyje yra laisvų AR ir dipeptidų ar tripeptidų, kurie virškinamajame trakte absorbuojami į kraujotakos sistemą greičiau, nei ilgesnės grandinės baltymų polipeptidai [28]. Baltymų hidrolizatai gali pagreitinti pažeistų audinių gijimą ir funkcijos atsistatymą. Treniruočių metu didelis fizinis krūvis sukelia raumeninio audinio pažaidą, kuri gali pasireikšti uždegimu, skausmu ir raumeninės jėgos sumažėjimu. Kaip teigiama atliktame tyrime, tiriamiesiems suvartojus 25 g išrūgų baltymų hidrolizato iškarto po ekscentrinių fizinių pratimų, raumenų jėgos sukeltas skeletinių raumenų pajėgumas visiškai atsistatė praėjus 6val., lyginant su placebą ir nehidrolizuotus išrūgų baltymus vartojusiais tiriamaisiais [8]. Kitame tyrime vartojusiems išrūgų baltymų hidrolizatą (turintį 10 g nepakeičiamų AR), nepakeičiamų AR koncentracija kraujyje padidėjo greičiau, nei vartojant tokį patį kiekį nepakeičiamų AR turintį sojos izoliatą ar micelinį kolageną. Išrūgų baltymų hidrolizatas taip pat pasižymėjo greitesne baltymų sintezės stimuliacija raumenyse, po fizinės treniruotės ar raumenų poilsio metu [44]. Atliktame 8 savaičių tyrime, kuriame dalyvavo 24 vyrai, lygintas pieno išrūgų baltymų izoliato ir ryžių baltymų izoliato papildų poveikis kūno fizinei formai ir fiziniam tobulėjimui, vartojant 48 g šių papildų po pasipriešinimo treniruočių. Rezultatai parodė, jog pieno išrūgų baltymų ir ryžių baltymų izoliatai efektyviai didina liesos kūno masės prieaugį, skatina skeletinių raumenų hipertrofiją, didina jėgą ir ištvermę [23].
Paprastai sveikiems suaugusiems asmenims rekomenduojama suvartoti apie 0,8 g/kg (kūno masės) baltymų per dieną, tačiau Europos klinikinės mitybos ir metabolizmo draugija (angl. European Society of Clinical Nutrition and Metabolism (ESPN)) rekomenduoja mažiausiai 1,0–1,2 g /kg (kūno svorio) baltymų sveikiems senyvo amžiaus žmonėms (vyresniems nei 65 m.) ir 1,2–1,5 g/kg (kūno svorio) sergantiems chroniškomis ligomis ar hospitalizuojamiems senyvo amžiaus asmenims. Fiziologinio organizmo senėjimo metuvystosi anabolinis atsparumas, mažėjant raumenų gebėjimui įsisavinti normalias nepakeičiamų AR dozes (~7,5 g per dieną), baltymų sintezei stimuliuoti reikalingos didesnės nepakeičiamų AR koncentracijos (10–15 g/d) [11]. Tyrime su sveikais senyvo amžiaus asmenimis (69 ± 2 m.) pastebėta, kad į mitybą įtraukus papildus, turinčius 1,62 g/kg kūno svorio baltymų (iš jų 600 ± 51 mg/kg kūno svorio nepakeičiamų AR) ir atliekant fizines pasipriešinimo treniruotes, sukeliamas liesos raumenų masės prieaugis [19]. Moksliniame tyrime nustatyta, kad vartojant 20 g/d pieno išrūgų baltymų, sudėtyje turinčių AR kompleksą (iš jų didžiausią leucino kiekį) ir užsiimant fizine veikla, sarkopenija sergantiems tiriamiesiems padidėjo skeletinių raumenų masė, sustiprėjo fizinė jėga, sumažėjo C-reaktyvinio baltymo (indikuojančio uždegimą) koncentracija ir pagerėjo bendra gyvenimo kokybė [37]. Baltyminiai papildai, turintys nepakeičiamų AR tinkami ne tik suaugusiems sportininkams mėgėjams ir profesionalams, jie naudingi ir senyvo amžiaus fiziškai aktyviems asmenims, siekiant sukelti raumenų hipertrofiją ir pagerinti fizinę funkciją.
1.8 Amino rūgščių kokybinio ir kiekybinio įvertinimo metodai
1.8.1 Efektyvioji skysčių chromatografija.
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra dažniausiai taikomas chromatografinis analizės metodas AR identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui. Naudojama skysta judančioji fazė, nešanti medžiagas per nejudančios fazės sorbentą. Galima normaliųjų ir atvirkštinių fazių ESC, priklausomai nuo mechanizmo skirstoma į jonų mainų, giminingumo, absorbcinę, paskirstomąją. Komponentų atskyrimo efektyvumas priklauso nuo tinkamų chromatografinių sąlygų parinkimo – pritaikant tinkamiausią analizuojamai medžiagai atskirti kolonėlę, eliuentą, nustatant temperatūrą ir gradientinį tirpiklių režimą [24, 38]. Dar greitesnis ir efektyvesnis medžiagų atskyrimas gali būti pasiekiamas pritaikius ultra efektyvųjį skysčių chromatografą (UESC), kuriame naudojamos trumpesnės kolonėlės (50-250 mm ilgio), užpildytos labai mažo diametro dalelių (2-3 µm) sorbentu, pritaikyti siurbliai sukuria dvigubai didesnį slėgį (15000 psi), lyginant su ESC naudojamomis kolonėlėmis ir siurbliais. UESC metodu sunaudojamas mažesnis tirpiklių kiekis, sutrumpinamas analizės laikas bei pagerinamas medžiagų identifikavimo detektoriuje efektyvumas [26, 38].
ESC ir UESC metodikoje taikoma prieškolonėlinė arba pokolonėlinė derivatizacijos procedūra, siekiant modifikuoti AR polines savybes ir kuo efektyviau atskirti komponentus mėginyje. Dažniau pasirenkama prieškolonėlinė amino rūgščių derivatizacija, kuriai naudojami derivatizacijos
reagentai: o-ftalaldehidas (angl.OPA), 9-fluorenilmetilchloroformatas (angl.FMOC),
fenilizotiocianatas (angl.PITC), dimetilaminoazobenzensulfonilo chloridas (angl.DABS-Cl), 6-aminoquinolil-Nhidroksisukcinimidil karbamatas (angl.AQC). Tuo tarpu pokolonėlinė derivatizacija dažniausiai atliekama su ninhidrinu, kuris pasižymi cheminiu nestabilumu ir mažesniu jautrumu analitėms. [24, 38, 54].
Nederivatizuotų AR analizė tampa vis populiaresnė, nes mėginių paruošimo laikas analizei tampa trumpesnis, sunaudojama mažiau reagentų, išvengiama galimų pašalinių reakcijų, tuo pačiu pasiekiamas didelis chromatografinis jautrumas, kai parenkamas tinkamas chromatografas, priderinamas detektorius ir kolonėlė [9, 27]. Atliktas tyrimas, kuriame lyginamas prie UESC
chromatografo prijungtų skirtingų detektorių (ultravioletinių spindulių (UV), refrakterinio indekso
detektorius (angl.RI), garinantis šviesos sklaidos detektorius (angl.ELSD), cirkuliarinio dichroizmo (angl.CD), chemiliuminescencinis (angl.CLND), branduolionio magnetinio rezonanso (angl.NMR) ir tandeminės masių spektrometrijos detektorius (angl. MS/MS)) efektyvumas identifikuojant nederivatizuotas amino rūgštis. Palyginus skirtingus detektorius nustatyta, kad MS/MS ir CLND detektoriai pasižymėjo geresniu jautrumu ir specifiškumu identifikuojant nederivatizuotas AR, nei kiti nagrinėti detektoriai [34].
Nederivatizuotos AR pasižymi stipriomis polinėmis savybėmis, jų atskyrimui turi būti pritaikoma tam tikra kolonėlė. Nederivatizuotų AR sulaikymas ir išskyrimas kolonėlėse sudėtingiausias stipriausiu poliškumu pasižyminčioms AR: glicinui, alaninui, serinui, glutamo ir asparto rūgštims. Naudojant standartines normalių ar atvirkštinių fazių kolonėles (C8, C18) nederivatizuotų AR sulaikymas ir atskyrimas gali būti neefektyvus. Hidrofilinių sąveikų skysčių
chromatografijos (angl. HILIC) kolonėlė - viena iš naujausių kolonėlių, užpildyta poline stacionaria
faze, kurios dalelių dydis yra tik 2-3 µm, užtikrinantis efektyvesnį polinių medžiagų sulaikymą ir greitesnę analizę. HILIC kolonėlės tinkamiausios naudojant UESC metodą. HILIC kolonėlės užpildytos silikageliu ar modifikuotu silikageliu (modifikuojamas prijungiant amidines, ciano, hidroksilo grupes ar suteikiant cviterjoninių savybių) geba efektyviai atskirti stipriai polines medžiagas, chromatogramose gaunant simetriškas medžiagų smailes ir tikslius sulaikymo laikus. Mobilios fazės tirpikliu naudojamas organinės kilmės skystis (dažniausiai acetonitrilas), turintis nedidelį kiekį kito vandeninio tirpiklio ar buferio (dažniausiai amonio acetato), pagerinančio medžiagų atskyrimą [9, 33]. Gradientinė medžiagų eliucija įvyksta mažinant organinio tirpiklio procentinį kiekį (acetonitrilo) ir didinant vandeninio tirpalo koncentraciją mobilioje fazėje [13].
1.8.2 Dujų chromatografija.
Dujų chromatografija (DC) yra pažangus ir jautrus instrumentinės analizės metodas individualių AR atskyrimui mišiniuose. DC mobili fazė yra inertiškos dujos (helio, azoto ar vandenilio), kurios atlieka mėginio pernešimo į chromatografinę kolonėlę funkciją. Kolonėlėje (stacionari fazė) sulaikomi ir atskiriami skirtingos struktūros mėginio komponentai. Mažos molekulinės masės, žemos virimo temperatūros komponentų eliucija iš kolonėlės vyksta greičiausiai. Po eliucijos medžiagos elektriškai ir chemiškai jonizuojamos, įgauna krūvį ir gali būti analizuojamos detektoriuje pagal masės – krūvio santykį. Masių spektrometrijos (MS) detektorius fiksuoja iš kolonėlės išeinančių analičių sulaikymo laikus, identifikuoja ir kiekybiškai nustato komponentus, lygindamas rezultatus su masės spektrais duomenų bazėje. MS ypatingai jautrus detektorius, gebantis atskirti labai panašios struktūros AR, išskirstydamas kiekvienos AR molekulę į fragmentus, išmatuodamas fragmentų masę, būdingą tik tam tikrai AR [38,51].
Analizei DC metodu reikalingos tam tikros molekulių fizikocheminės savybės – lakumas ir atsparumas aukštai temperatūrai. Būtina DC analizės sąlyga yra junginių derivatizacija - cheminė molekulių modifikacija, pagerinanti chromatografinio medžiagų atskyrimo efektyvumą. Derivatizacija sustiprina atrankumą ir jautrumą analičių identifikavimui mėginiuose ir padidina chromatografinį efektyvumą. Taikoma prieškolonėlinė arba pokolonėlinė derivatizacija. Priklausomai nuo to, koks
reagentas naudojamas derivatizuoti medžiagas, taikoma sililinimo, alkilinimo ar acilinimo derivatizacija. AR derivatizuoti dažniausiai atliekama prieškolonėlinė sililinimo derivatizacija [24,31]. Pagrindiniai sililinimo reagentų taikinai yra -SH, -OH, -NH ir –COOH grupės AR molekulėje, turinčios laisvą vandenilio atomą, suteikiantį molekulei poliškumo. Sililinimo būdu derivatizuojant AR molekules, vietoj vandenilio atomų prijungiamos sililo grupės (priklausomai nuo
naudojamo sililinimo reagento gali būti: dimetilsililo gr., t-butildimetilsililo gr.,
chlorometildimetilsililo gr.), sumažinančios molekulės poliškumą. AR derivatizuoti gali būti naudojami tokie derivatizacijos reagentai: bis(trimetilsilil)trifluoracetamidas (BSTFA),
N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoracetamidas (MSTFA), heksametildisilzanas (HMDS),
N-metil-N-(t-butildimetilsilil)trifluoracetamidas (MTBSTFA) ir kt. [31]. Derivatizacijos reagentai pakeičia aktyvius vandenilio atomus į trimetilsilil grupes AR molekulėje, sudarydami ypatingai patvarius, atsparius aukštai temperatūrai (200 – 300 °C) ir hidrolizei amino rūgščių derivatus [48]. Reagentai ir derivatai yra jautrūs drėgmei, todėl sililinimo derivatizacijai reikalinga bevandenė aplinka [24].
1.9 Baltymų hidrolizė
Siekiant ištirti AR profilį maisto papilduose, susiduriama su problema, jog AR kompleksai yra baltymų, baltymų izoliatų ar iš dalies hidrolizuotų baltymų formoje. Norint ištirti AR profilio ypatumus chromatografiniais metodais, būtina hidrolizuoti baltymų peptidinius ryšius, susidarant laisvoms AR. Dažniausiai taikoma cheminė hidrolizė rūgštimis, suardanti peptidinius ryšius per 24, 48 ar 72 val. [54] Rūgštinė hidrolizė efektyviai suardo visus peptidinius ryšius, tačiau gali suskaldyti hidrolizei ypatingai jautrių AR struktūrą: cisteinas, triptofanas, tirozinas gali būti visiškai suardomi hidrolizės metu, serinas ir treoninas suardomi iš dalies (hidrolizės metu prarandama apie 10-15 proc. serino ir 5-10 proc. treonino koncentracijos), asparaginas ir glutaminas deamininami atitinkamai į asparto ir glutamo rūgštis, metioninas gali oksiduotis iki metionino sulfoksido ar sulfono, kurie yra jautrūs rūgštinei hidrolizei, argininas jautrus hidrolizei, todėl gali būti verčiamas į l-ornitiną. Vakuumo ar inertiškų dujų naudojimas rūgštinės hidrolizės metu sumažina galimos oksidacijos lygį. Siekiant nustatyti triptofaną (sunaikinamas rūgštinės hidrolizė metu) taikoma šarminė hidrolizė, tačiau sunaikinamas serinas ir argininas, todėl šarminės hidrolizės metodas taikomas išskirtinai triptofano analizei. Hidrolizei jautrių AR kokybinis ir kiekybinis vertinimas po hidrolizės turi būti kritiškas, atsižvelgiant į tai, jog jos galėjo būti visiškai arba dalinai suardytos hidrolizės metu. Peptidiniai ryšiai tarp alifatinių AR yra labai stiprūs, siekiant suardyti Ala–Ala, Ile–Ile, Val–Val, Val–Ile, Ile–Val, Ala– Val ryšius hidrolizė gali būti pratęsiama iki 48 ar 72val. [38].
MP etiketėse nurodytoje sudėtyje dažnai randama informacija, kad baltymas MP formoje jau hidrolizuotas, tačiau maisto papildų gamintojai nenurodo koks procentinis kiekis laisvų AR yra jų sudėtyje. Norint ištirti laisvų AR kokybinį ir kiekybinį profilį, iš dalies hidrolizuotų baltymųmaisto papilduose,reikalinga informacija apie baltymų hidrolizės laipsnį (angl. degree of hydrolysis, DH), kuris parodo procentinį suskaldytų peptidinių ryšių kiekį. Hidrolizuotų baltymų papildai pasižymi aukštu, vidutiniu ar žemu DH, kuris nustatomas pagal AR ir peptidų svorį. Baltymų molekulinis svoris indikuoja koks kiekis laisvų AR ir skirtingų peptidų yra maisto papilde. Molekuliniam svoriui esant iki 175 kDa nustatomos laisvos AR, 175–375 kDa – sudėtyje yra di- ir tri-peptidai, 375–750 kDa – peptidai, sudaryti iš 4-6 AR ir t.t. Atliekant kokybinių MP sudėties tyrimų hidrolizuotose baltymų MP, tikslus laisvų AR nustatymas tampa sunkesnis, dėl nežinomo hidrolizės laipsnio [15].
1.10 Maisto papildų kokybės kontrolė ir notifikavimas
Europos Parlamentas ir Taryba 2002 m. direktyvoje pateikė MP apibrėžimą, naudojamą iki šiol: „maisto papildai — tai maisto produktai, kurie yra skirti papildyti įprastą racioną ir kurie, vieni arba derinyje su kitomis medžiagomis, yra koncentruotas maistinių ar kitų medžiagų šaltinis, turintys mitybinį arba fiziologinį poveikį, ir kuriais prekiaujama dozuota forma, t. y. tokiomis formomis kaip kapsulės, pastilės, piliulės, tabletės ir kitos panašios formos, miltelių maišeliai, ampulės su skysčiu, buteliukai su lašų dozatoriumi bei kitos panašios skysčių ir miltelių, skirtų vartoti mažais dozuotais kiekiais, formos.“ [56]
Maisto papildų rinkoje per pastaruosius du dešimtmečius ypatingai padidėjo papildų, orientuotų į sportininkus, paklausa. Fizinėse ir internetinėse parduotuvėse randamas platus įvairių papildų, skirtų sportininkams profesionalams ar mėgėjams, asortimentas. Dauguma gamintojų teigia, kad jų gaminamų MP poveikis pasižymi panašiu į cheminių ergogeninių preparatų (anabolinių steroidų, žmogaus augimo hormono ir kt.) poveikį: didina sportinį pajėgumą, raumenų ištvermę ir masę, gerina organizmo atsigavimo procesą po fizinio krūvio. Už MP gamybą, produktų grynumą ir kokybę yra atsakingas gamintojas ar platintojas [52, 56]. Maisto papildas laikomas kokybišku, jei sudėtiniai ingredientai ir jų kiekiai sutampa su ženklinimo informacija etiketėje, MP kokybė laikoma abejotina, jei medžiagų kiekiai MP sudėtyje ir etiketėje nesutampa (etiketėje nurodytas mažesnis arba didesnis medžiagų kiekis, nei iš tikrųjų yra papildo formoje). Taip pat jei etiketėje deklaruojamos medžiagos, kurių iš tikrųjų nėra papildo sudėtyje ir atvirkščiai, etiketėje nurodoma daugiau sudėtinių medžiagų ar priemaišų, nei jų yra MP sudėtyje. Sportininams skirtų MP sudėtyje negali būti pasaulinės antidopingo agentūros uždraustų medžiagų: įvairių anabolinių androgeninių steroidų, selektyvių androgeninių receptorių stimuliantų, žmogaus augimo hormono, efedrino ir kt, kurie užteršia produktą
[35]. Maisto papildų sudėtyje esančių AR veiksmingumas įvertinamas remiantis atliktų in vitro ar in vivo mokslinių tyrimų rezultatais, kurie gali patvirtinti arba paneigti jų efektyvumą. Dažniausiai atliekami klinikiniai tyrimai su mažomis sveikų tiriamųjų imtimis (I fazės klinikiniai tyrimai), vertinant pavienių AR veiksmingumą. Rečiau tiriamas įvairių AR derinių efektyvumas [14].
Siekiant užtikrinti Lietuvos rinkai tiekiamų maisto papildų kokybę ir saugumą, visi Lietuvos Respublikoje gaminami, importuojami iš Europos sąjungos (ES) valstybių narių arba ne ES valstybių narių, maisto papildai turi būti notifikuojami Valstybinei maisto ir veterinarijos tarnybai (VMVT). Lietuvos MP rinkoje didelę dalį sudaro skeleto raumenų darbui palaikyti skirti papildai, parduodami miltelių, tablečių, kapsulių ar skysčių forma. VMVT gairėse dėl notifikavimo apie Lietuvos rinkai tiekiamus maisto papildus norodoma: „intensyviam raumenų darbui reikalingiems maisto produktams, įskaitant sportininkams skirtus produktus, kurie rinkai tiekiami milteliais (sufasuoti į dideles talpas, pvz.: 500 g, 1 kg, 2 kg ar kt. ir dozuojami kaušeliais) arba skysčiais, kuriuos prieš vartojimą reikia smarkiai praskiesti <...> , yra skiriami dėl ypatingos fizinės ar fiziologinės būklės kylantiems poreikiams tenkinti <...> notifikavimo aprašas nėra taikomas“. Vadinasi visų miltelių ar skysčio formos, sportininkams skirtų maisto papildų notifikavimo Lietuvos rinkai VMVT nekontroliuoja, notifikuojami tablečių ar kapsulių formos baltyminiai ar AR turintys maisto papildai. Notifikuodami maisto papildų tiekimą Lietuvoje ar ES valstybėse narėse pagamintų maisto papildų gamintojai ar platintojai, neprivalo pateikti laboratorinių tyrimų metodų ir tyrimų protokolų (išskyrus importuojant MP iš trečiųjų šalių), įrodančių papildų kokybinės ir kiekybinės sudėties atitikimą papildo ženklinime nurodytai informacijai [56].
Dabartiniai reglamentuoti notifikavimo patikros reikalavimai maisto papildams, suteikia prielaidą, jog maisto papildų, gaminamų Lietuvoje ar ES šalyse, etiketėse deklaruojamų ingredientų koncentracijos gali neatitikti tikrosios medžiagų koncentracijos papildo sudėtyje, juose gali būti ir etiketėje nepažymėtų komponentų ar priemaišų.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektai
Magistro baigiamojo darbo eksperimentiniam tyrimui atrinkti ir naudoti maisto papildai, sudėtyje turintys šakotos grandinės aminorūgščių arba turintys aminorūgščių kompleksą (pakeičiamas ir nepakeičiamas aminorūgštis).
Maisto papildai, kurių ženklinime deklaruotos šakotos grandinės aminorūgštys:
Optimum nutrition Instantized BCAA, milteliai (gamintojas „Optimum Nutrition“, JAV), laisvos formos šakotos struktūros AR. Real Pharm BCAA, milteliai (gamintojas „Real Pharm“, Lenkija), laisvos formos šakotos struktūros AR. ActivLab BCAA XTRAA, milteliai (gamintojas „Activlab“, Lenkija), laisvos formos šakotos struktūros AR.
Maisto papildai su aminorūgščių kompleksu:
BioTechUSA Mega Amino 3200, tabletės, išrūgų baltymų hidrolizatas (gamintojas „BioTech USA“, Vengrija). Lifeplan aminorūgščių kompleksas, tabletės, didelio tankio hidrolizuotas kolagenas (gamintojas „LIFEPLAN PRODUCTS LTD“, Jungtinė Karalystė). Amino Power Liquid, skystis, kiaulienos želatinos hidrolizatas (gamintojas „NUTREND“, Čekijos Respublika). Scitec Amino 5600, tabletės, išrūgų baltymų hidrolizatas (gamintojas Scitec Nutrition®, Vengrija).
Tirtų maisto papildų farmacinės formos: milteliai, tabletės, skystis. Prieš analizę tabletės yra disperguojamos grūstuvėje. Pagal vartojimo indikacijas, nurodytas ant etikečių, visi atrinkti maisto papildai skirti sportininkams profesionalams ar mėgėjams, siekiantiems pagerinti fizinę būklę ir sportinius rezultatus. Naudoti maisto papildų mėginiai užkoduoti trumpiniu MPS (maisto papildas sportininkams) ir skaičiumi.
2.2 Naudotos medžiagos
Distiliuotas, išgrynintas vanduo (paruoštas naudojant „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistemą), vandenilio chlorido rūgštis (36,5 proc,, Sigma – Aldrich), amonio acetatas (≥ 99,0 proc., Sigma – Aldrich), acetonitrilas (99,99 proc,, Sigma – Aldrich), septyniolikos aminorūgščių standartų mišinys (2,5 mmol/ml kiekvienos AR: argininas, alaninas, asparto r., glutamo r., glicinas, cistinas, histidinas, izoleucinas, leucinas, lizinas, metioninas, fenilalaninas, prolinas, serinas, treoninas, tirozinas ir valinas, Sigma – Aldrich).
2.3 Naudota įranga
Maisto papildų analizė atlikta su ultra efektyviuoju skysčių chromatografu Waters Acquity UPLC H (Waters Corporation, JAV), Waters Xevo TQD (Waters Corporation, JAV) tandeminiu masių spektrometru su trigubu kvadrupoliniu masių analizatoriumi. Analičių atskyrimui naudojama hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografinė (HILIC) kolonėlė (CORTECS® UPLC®90Å, 1,6 µm, 2,1 mm×100 mm). Tirpalų filtravimui naudoti membraniniai švirkštai 0,22 μm porų dydžio filtrus („Carl Roth Gmb H + Co. KG“, Vokietija). Naudotos analitinės svarstyklės Shimadzu AUW120D (Duisburgas, Vokietija), ultragarso bangų vonelė „WiseClean“, centrifuga „Centurion Scientific C2006“ („Centurion Scientific Ltd“, Jungtinė Karalystė).
2.4 Tiriamųjų tirpalų ir etaloninio tirpalo paruošimas
Maisto papildų su laisvomis aminorūgštimis mėginių paruošimas
0,1 g maisto papildo atsveriama analizinėmis svarstyklėmis, suberiama į kolbutes, ištirpinama distiliuotame vandenyje ir praskiedžiama iki 50 ml ribos. Mėginys 10 min įdedamas į ultragarso bangų
vonelę. Gautas tirpalas centrifuguojamas 5min, esant 7×103
r.p.m. apsisukimo greičiui. Po centrifugavimo atskiriama skysta mėginio fazė, iš jos paimama 1 ml mėginio, ir filtruojama per 0,22 μm porų dydžio filtrus. Po filtracijos mėginiai injektuojami į chromatografą.
Maisto papildų su baltymų hidrolizatais mėginių paruošimas
0,1 g maisto papildo atsveriama analizinėmis svarstyklėmis, suberiama į buteliukus ir užpilama 40 ml 6N HCl rūgštimi, buteliukai užsandarinami, kaitinami 110 °C temperatūroje 24 val glicerolio
vonelėje. Gautas tirpalas centrifuguojamas 5 min, esant 7×103
r.p.m. apsisukimo greičiui. Po centrifugavimo atskiriama skysta mėginio fazė, iš jos paimama 1 ml mėginio ir filtruojama per 0,22 μm porų dydžio filtrus. Po filtracijos mėginiai injektuojami į chromatografą.
Etaloninio tirpalo paruošimas
2.5 Tyrimo metodika
Naudota HILIC kolonėlė 100 mm ilgio ir 2,1 mm vidinio skersmens, su 1,6 µm nejudančios fazės dalelių dydžiu. Kolonėlės temperatūra 40 °C, slėgis 15000 psi. Mobilios fazės tekėjimo kolonėle greitis: 0,6 ml/min. Metodas atliekamas per 7 min. Injekcijos tūris 2 µl. Taikoma gradientinė eliucija, naudojant du eliuentus: amonio acetatą (eliuentas A) ir acetonitrilą (eliuentas B). Gradientinio režimo sąlygos pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Gradientinio režimo sąlygos HILIC kolonėlėje.
Laikas Eliuentas A Eliuentas B
0,0 min 15 % 85 % 0,5 min 15 % 85 % 2,0 min 25 % 75 % 3,5 min 35 % 65 % 5,0 min 35 % 65 % 5,1 min 15 % 85 %
Masių spektrometro nustatymai: teigiama elektropurkštuvinė jonizacija, kapiliaro įtampa – 3200 V, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento išgarinimo temperatūra – 600 °C, eliuento išgarinimo dujų tėkmės greitis – 1000 L/val. Aminorūgščių daugialypių reakcijų stebėjimo perėjimas (angl. MRM), kūgio įtampa ir ardymo kameros energija nurodyta 3 lentelėje.
3 lentelė. Aminorūgščių MRM perėjimas, kūgio įtampa ir ardymo kameros energija.
Aminorūgštis MRM perėjimas Kūgio įtampa, V Ardymo kameros
energija, eV Glicinas 76 > 30 12 6 L-Alaninas 90 > 44 16 10 DL-Leucinas 132 > 86 16 10 L-Glutamo r. 148 > 84 12 14 L-Valinas 118 > 72 12 10 L-Prolinas 116 > 70 20 10 L-Metioninas 150 > 104 14 10 L-Serinas 106 > 60 14 8 L-Fenilalaninas 166 > 120 18 14
L-Asparto r. 134 > 88 14 10
L-Lizinas 147 > 84 14 14
L-Argininas 175 > 70 16 14
L-Tirozinas 182 > 136 16 16
L-Treoninas 120 > 74 38 20
2.6 Duomenų analizės metodai
Kiekybinės analizės įvesčiai naudojama Microsoft „Excel“ 2010 (Microsoft, JAV) programa. Statistinis duomenų vertinimas atliktas SPSS Statistics 17.0 (IBM, JAV) programa. Naudoti dviejų nepriklausomų imčių t – testai, įvertinti tyrimo duomenų standartiniai nuokrypiai. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatomas, jei reikšmingumo lygmuo p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Aminorūgščių kokybinis nustatymas
Aminorūgštys identifikuojamos lyginant mėginiuose nustatytų AR sulaikymo laikus su standartinio AR mišinio sulaikymo laikais (AR sulaikymo laikai pateikti 5 lentelėje). Tirtuose MPS1-MPS7 maisto papildų mėginiuose, UESC-MS metodu identifikuotos AR 4 lentelėje pažymėtos pliusu (simbolis „+“), neidentifikuotos AR pažymėtos minusu (simbolis „-“), maisto papildų mėginių etiketėse nenurodytos AR pažymėtos žvaigždute (simbolis „*“).
4 lentelė. MPS1-MPS7 mėginiuose identifikuotos aminorūgštys, pažymėtos „+“.
Aminorūgštis MPS1 MPS2 MPS3 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 Glicinas + * + * * + + + + L-Alaninas + * + * + * + + + + DL-Leucinas + + + + + + + L-Glutamo r. * + * + * + * + + + L-Valinas + + + + + + + L-Prolinas + * + * + * + + + + L-Metioninas - * - * + * + + + + L-Serinas * + * + * + + + + L-Fenilalaninas + * + * + * + + + + L-Asparto r. + * + * + * + + + + L-Lizinas + * + * + * + + + + L-Argininas + * + * + * + + + + L-Tirozinas + * + * + * + + + + L-Treoninas + * + * + * + + + +
*Etiketėje nenurodytos aminorūgštys.
Kaip matoma pateiktoje 4 lentelėje, MPS1-MPS3 mėginių etiketėse deklaruojamos tik šakotos grandinės aminorūgštys (l-leucinas, l-izoleucinas ir l-valinas), tačiau nustatyta daugiau
aminorūgščių, kurios nebuvo nurodytos mėginių etiketėse: MPS1 mėginyje iš viso identifikuota 11
aminorūgščių, MPS2 ir MPS3 mėginiuose – 13 aminorūgščių. Tiriamuosiuose MPS4-MPS7 mėginiuose identifikuota 14 aminorūgščių, kurios buvo nurodytos maisto papildų etiketėse (išskyrus MPS4 mėginyje identifikuota glutamo rūgštis, kuri nebuvo nurodyta maisto papildo sudėtyje).
Tiriamųjų MPS1-MPS7 mėginių etiketėse nurodytas l-izoleucinas, tačiau atliktas metodas pasižymi trūkumu – analizės metu įvyksta l-leucino ir l-izoleucino aminorūgščių koeliucija, chromatogramoje jos pavaizduojamos vienoje smailėje, todėl jų individualus identifikavimas negalimas.
3.2 Aminorūgščių kiekybinis nustatymas
Atlikus chromatografinę analizę, gaunami ne tik AR sulaikymo laikai (AR identifikavimui), bet ir kiekvienos AR smailių plotai, panaudojami koncentracijoms mėginiuose apskaičiuoti. Aminorūgščių kiekybinis profilis nustatomas, remiantis standartinėmis AR kalibracinėmis kreivėmis. Kalibracinės kreivės parodo tiesinę koncentracijos priklausomybę nuo smailės ploto – didėjant smailės plotui, didėja tiriamosios medžiagos koncentracija mėginyje. Aminorūgščių koncentracijos tiriamuosiuose tirpaluose apskaičiuojamos pagal kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtis. Nustatytų AR kalibracinės kreivės funkcijos lygtys, sulaikymo laikai ir determinacijos koeficientai pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. AR kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtys, sulaikymo laikai ir determinacijos koeficientai (R2).
Aminorūgštis Kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtys Sulaikymo
laikas, min Determinacijos koeficientas R2 Glicinas Y= -119718*x2+903535*x+-5961,92 2,88 0,99458 L-Alaninas Y= -164995*x2+1,35233+006*x+16051,1 2,62 0,990836 DL-Leucinas Y= 1,95654+007*x 2,05 0,960573 L-Glutamo r. Y= -129089*x2+1,82018+006*x+-14811 2,58 0,995138 L-Valinas Y=5,82443+006*x+189944 2,35 0,973733 L-Prolinas Y= -1,28901+006*x2+1,23562+007*x+384544 2,32 0,961795 L-Metioninas Y= -106553*x2+1,91544+006*x+10296,3 2,34 0,977205 L-Serinas Y= -153153*x2+1,69342+006*x+-17385,9 3,06 0,997380 L-Fenilalaninas Y= 8,69033+006*x2+1,95954+007*x+79507,6 1,96 0,970048 L-Asparto r. Y= -11218,4*x2+404631*x+-7133,7 3,76 0,991305 L-Lizinas Y= 149992*x2+1,15595+006*x+-79333,6 5,96 0,987883 L-Argininas Y= -184066*x2+4,45894+006*x+-26974,5 6,01 0,997840 L-Tirozinas Y= -453555*x2+4,87728+006*x+-159569 1,91 0,999094
L-Treoninas Y= -1002,17*x2+74954,8*x+-1297,57 3,46 0,996339
Į atitinkamą 5 lentelėje nurodytą kalibracinės kreivės funkcijos lygtį įstačius kiekvienos mėginyje gautos AR smailės ploto reikšmę, apskaičiuojamos koncentracijos (µg/ml) tiriamuosiuose tirpaluose.
Siekiant įvertinti AR kiekį viename grame maisto papildo mėgininio, AR koncentracija apskaičiuojama pagal formulę:
𝐶 = (𝑐 × 𝑉
𝑎 )
C – AR koncentracija žaliavoje (µg/g)
c – AR koncentracija tiriamajame tirpale (µg/ml) V – tirpiklio tūris (ml)
a – atsvertos žaliavos kiekis (g)
Pagal formulę apskaičiuojamos visų tirtų maisto papildų AR koncentracijos (µg/g) tirtuose mėginiuose. Apskaičiuoti AR kiekiai verčiami į mg/g, siekiant sulyginti su etiketėse deklaruojamais AR kiekiais, taip pat išreikštais mg/g.
3.2.1 Mėginių hidrolizė
Atlikus kokybinę analizę pastebėta, jog MPS1-MPS3 papilduose AR yra laisvoje formoje, kaip ir deklaruojama šių maisto papildų etiketėse, mėginiams nereikia taikyti hidrolizės, siekiant įvertinti tikslų kiekybinį AR profilį. Tirtų MPS4-MPS7 papildų etiketėse nurodoma, kad maisto papildai yra pagaminti ir tiekiami hidrolizuotoje formoje, tačiau apskaičiavus laisvų AR kiekį šiuose mėginiuose gautos koncentracijos buvo per mažos, norint įvertinti tikrąjį laisvų AR kiekį maisto papilduose. Siekiant efektyviau įvertinti laisvų aminorūgščių kiekybinę koncentraciją MPS4-MPS7 mėginiuose, atliekame papildomą hidrolizuotų maisto papildų hidrolizę 6N vandenilio chlorido rūgštimi. Visuose mėginiuose pastebėtas reikšmingas skirtumas tarp AR koncentracijos mėginyje prieš hidrolizę ir po jos. Atlikus statistinę analizę, statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp AR koncentracijos prieš hidrolizę ir po jos nustatytas visoms AR. Pavyzdinis l-alanino ir l-treonino koncentracijos maisto papilduose, prieš papildomą hidrolizę ir po jos, palyginimas, pateiktas 5 ir 6 paveikslėliuose.
5 pav. L-alanino koncentracija (mg/g) MPS4-MPS7 mėginiuose prieš hidrolizę ir po hidrolizės.
6 pav. L-treonino koncentracija (mg/g) MPS4-MPS7 mėginiuose prieš hidrolizę ir po hidrolizės.
Apskaičiavus ir palyginus visų AR koncentracijas tiriamuosiuose MPS4-MPS7 mėginiuose prieš ir po hidrolizės, nuspręsta AR kiekybinį profilį įvertinti papildomai hidrolizuotuose mėginiuose, siekiant kuo tiksliau palyginti apskaičiuotas AR koncentracijas su MP etiketėse nurodytomis koncentracijomis. 0,039 0,058 0,046 0,016 10,413 5,968 7,513 21,464 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 K o n ce n tr ac ij a (mg /g )
L-treonino koncentracija
Prieš hidrolizę Po hidrolizės 0,584 1,185 0,214 0,024 7,185 18,159 15,944 10,700 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 K o n ce n tr ac ij a (mg /g )L-alanino koncentracija
Prieš hidrolizę Po hidrolizės3.2.2 Apskaičiuotų ir deklaruojamų aminorūgščių koncentracijų palyginimas
1. Apskaičiuotos l-alanino koncentracijos palyginimas su etiketėje nurodyta l-alanino koncentracija.
7 pav. MPS1-MPS7 mėginiuose apskaičiuotos l-alanino koncentracijos (mg/g) palyginimas su mėginių etiketėse nurodyta l-alanino koncentracija (mg/g).
Apžvelgus gautus kiekybinės analizės rezultatus, pastebima, jog l-alaninas nustatytas MPS1-MPS3 mėginiuose, nors šių maisto papildų sudėtyje, deklaruojamoje ant etiketės, l-alanino kiekybinė vertė nebuvo nurodyta. Lyginant MPS1-MPS3 mėginiuose apskaičiuoto l-alanino koncentracijas, didžiausias kiekis nustatytas MPS3 mėginyje (4,274±0,015 mg/g), 1,5 karto didesnis už MPS1 mėginyje nustatytą kiekį (2,759±0,041 mg/g) ir 3,6 karto didesnis už MPS2 mėginyje nustatytą kiekį (1,157 ± 0,016 mg/g) (7 pav.)
Lyginant MPS4-MPS7 mėginiuose apskaičiuotą l-alanino koncentraciją su etiketėje nurodyta koncentracija, visuose mėginiuose, išskyrus MPS7, pastebimas ženkliai mažesnis apskaičiuoto l-alanino kiekis. Apskaičiuoto l-l-alanino kiekio atitikimas maisto papildo etiketėje deklaruojamam kiekiui išreikštas procentais MPS6 mėginyje siekė didžiausią procentinį kiekį (97,51±0,026 proc.), mažesnis kiekis apskaičiuotas MPS4 mėginyje (43,510±0,057 proc.), MPS5 ir MPS7 mėginiuose apskaičiuotas kiekis atitinkamai yra 32,870±0,025 proc. ir 37,450±0,029 proc. Atlikus statistinę analizę, statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp apskaičiuotos ir etiketėje nurodytos l-alanino koncentracijos nustatytas MPS4, MPS5, MPS7 mėginiuose, išskyrus MPS6, kuriame skirtumas yra statistiškai nereikšminas (p>0,05). 2,759 1,157 4,274 9,185 18,159 15,944 10,700 21,110 55,244 16,350 28,571 0 10 20 30 40 50 60 MPS1 MPS2 MPS3 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 K on cen tr aci ja (m g/ g)
2. Apskaičiuotos l-fenilalanino koncentracijos palyginimas su etiketėje nurodyta l-fenilalanino koncentracija.
8 pav. MPS1-MPS7 mėginiuose apskaičiuotos l-fenilalanino koncentracijos (mg/g) palyginimas su mėginių etiketėse nurodyta l-fenilalanino koncentracija (mg/g).
Apžvelgus apskaičiuoto ir etiketėje deklaruojamo l-fenilalanino kiekybinio profilio rezultatus, pastebima, jog MPS1-MPS3 mėginių etiketėse nurodytoje sudėtyje l-fenilalaninas nėra deklaruotas, tačiau MPS1 mėginyje nustatyta 0,307±0,011 mg/g l-fenilalanino, mažesni kiekiai nustatyti MPS2 ir MPS3 mėginiuose, atitinkamai 0,244±0,031 mg/g ir 0,291±0,005 mg/g (8 pav.).
Apžvelgiant MPS4-MPS7 mėginių kiekybinį profilį, matoma, kad apskaičiuota l-fenilalanino koncentracija visuose mėginiuose yra mažesnė už MP etiketėse nurodytą koncentraciją. Išreiškus procentinį apskaičiuoto l-fenilalanino kiekio atitikimą deklaruojamam kiekiui, didžiausia koncentracija, atitinkanti etiketėje nurodytą koncentraciją, nustatyta MPS6 mėginyje, siekianti 70,723±0,031 proc., mažesnis procentinis kiekis apskaičiuotas MPS7 tiriamajame mėginyje - 69,499±0,022 proc. Tiriamuosiuose MPS4 ir MPS5 mėginiuose apskaičiuota kiek daugiau nei pusė l-fenilalanino koncentracijos, lyginant su etiketėje nurodyta koncentracija (atitinkamai 56,149±0,034 proc. ir 52,002±0,022 proc.). Statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp apskaičiuotos ir etiketėje nurodytos l-fenilalanino koncentracijos nustatytas visuose tiriamuosiuose mėginiuose (MPS4-MPS7).
0,307 0,244 0,291 10,227 6,909 5,375 13,651 18,214 13,286 7,60 19,642 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 MPS1 MPS2 MPS3 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 K on cen tr aci ja (m g/ g)
3. Apskaičiuotos l-prolino koncentracijos palyginimas su etiketėje nurodyta l-prolino koncentracija.
9 pav. MPS1-MPS7 mėginiuose apskaičiuotos l-prolino koncentracijos (mg/g) palyginimas su mėginių etiketėse nurodyta l-prolino koncentracija (mg/g).
Atliktos kiekybinės analizės rezultatai parodė, kad l-prolinas nustatytas MPS1-MPS3 mėginiuose, nors šių papildų etiketėse l-prolinas nebuvo deklaruotas. Tirtuose MPS1 ir MPS2 mėginiuose aptiktas panašus kiekis, atitinkamai: 0,052±0,003 mg/g ir 0,070±0,005 mg/g, didžiausias kiekis apskaičiuotas MPS3 maisto papilde - 0,255±0,008 mg/g. MPS3 mėginyje l-prolino kiekis yra 4,8 karto didesnis, nei MPS1 ir 3,6 karto didesnis, nei MPS2 mėginyje (9 pav).
Apžvelgiant kiekybinės analizės rezultatus 9 pav. diagramose matoma, kad MPS4 ir MPS5 mėginiuose apskaičiuotas l-prolino kiekis yra mažesnis už etiketėje nurodytą kiekį, MPS6 ir MPS7 atvirkščiai – didesnis. Mažiausia apskaičiuota koncentracija, lyginant su etiketėje nurodyta koncentracija, nustatyta MPS4 mėginyje (70,498±0,023 proc.), didesnis kiekis apskaičiuotas MPS5 mėginyje (94,785±0,032 proc.). Apskaičiuota l-prolino koncentracija, lyginant su etiketėje nurodyta koncentracija MPS6 mėginyje procentaliai viršijo nurodytą kiekį 30,912 proc. (iš viso siekia 130,912±0,012 proc.), MPS7 mėginyje nustatyta koncentracija, viršijanti etiketėje nurodytą koncentraciją 17,693 proc. (iš viso siekia 117,693±0,041 proc.). Lyginant apskaičiuotas l-prolino koncentracijas tiriamuosiuose mėginiuose (MPS4-MPS7) su koncentracijomis nurodytomis ant šių MP pakuočių, nustatyti skirtumai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).
0,052 0,070 0,255 22,774 60,145 72 ,002 43,003 24,027 85,314 55,00 36 ,538 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 MPS1 MPS2 MPS3 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 K on cen tr aci ja (m g/ g)
0,038 0,001 8,532 36,358 31,289 5,276 17,638 125,874 38,475 8,391 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 MPS1 MPS2 MPS4 MPS5 MPS6 MPS7 K on cen tr aci ja (m g/ g)
Apskaičiuota konc. Etiketėje nurodyta konc.
4. Apskaičiuotos glicino koncentracijos palyginimas su etiketėje nurodyta glicino koncentracija.
10 pav. MPS1, MPS2, MPS4-MPS7 mėginiuose apskaičiuotos glicino koncentracijos (mg/g) palyginimas su mėginių etiketėse nurodyta glicino koncentracija (mg/g).
Pateiktuose kiekybinės analizės rezultatuose matoma, jog glicino aptikta MPS1 ir MPS2 mėginiuose, kuriuose nustatyta koncentracija atitinkamai yra: 0,038±0,003 mg/g ir 0,001±0,000 mg/g (10 pav.). Tiriamajame MPS3 mėginyje glicinas nenustatytas.
Kaip matoma kiekybinį glicino profilį vaizduojančiose 10 pav. diagramoje, MPS6 mėginyje nustatyta didžiausia glicino koncentracija, lyginant su etiketės sudėtyje nurodyta koncentracija, siekia 81,322±0,032 proc. Lyginant su MPS6 mėginiu, mažesnė glicino koncentracija apskaičiuota tiriamuosiuose MPS4 (48,372±0,013 proc.) ir MPS7 mėginiuose (62,876±0,042 proc.). Mažiausia glicino koncentracija aptikta MPS5 mėginyje, kuriame nustatytas procentinis atitikimas deklaruojamai koncentracijai siekia 28,884±0,026 proc. Atlikus statistinę analizę, lyginant nustatytą glicino kiekį tiriamuosiuose mėginiuose (MPS4-MPS7) su MP etiketėse nurodytu kiekiu, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05).
