LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
DOVILĖ PŪKAITĖ
FOLIO RŪGŠTIES KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS MAISTO
PAPILDUOSE CHROMATOGRAFINIAIS ANALIZĖS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. Asta Kubilienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr. Ramunė Morkūnienė
FOLIO RŪGŠTIES KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS MAISTO
PAPILDUOSE CHROMATOGRAFINIAIS ANALIZĖS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Asta Kubilienė
Recenzentas Darbą atliko: Data Magistrantė Dovilė Pūkaitė Data KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1.Folatai. Folio rūgšties savybės... 11
1.2.Folio rūgšties metabolizmas ... 12
1.3.Biocheminis folatų poveikis ... 13
1.4.Folatų bioprieinamumas ... 13
1.5.Rekomenduojama folio rūgšties paros norma ... 14
1.6.Folio rūgšties šaltiniai ... 15
1.7.Folio rūgšties trūkumas ... 16
1.8.Folatų pokyčiai organizme. Megaloblastinė anemija ... 17
1.9.Folatų pokyčiai organizme. Širdies ir kraujagyslių sistema ... 18
1.10.Folatų pokyčiai organizme. Naujagimių vystymasis ... 18
1.11.Folatų pokyčiai organizme. Nervų sistema ... 20
1.12.Folatų pokyčiai organizme. Onkologiniai sutrikimai ... 20
1.13.Folio rūgšties perteklius ... 21
1.14.Folio rūgšties kiekio maisto papilduose apibendrinimas ir leistini medžiagos nuokrypiai ... 22
1.15.Folio rūgšties preparatų analizė ... 22
1.15.1.Plonasluoksnė chromatografija ... 22
1.15.2.Folio rūgšties analizės PC metodu pavyzdžiai ... 23
1.15.3.Efektyvioji skysčių chromatografija ... 24
1.15.4.Folio rūgšties analizės ESC metodu pavyzdžiai ... 24
2.TYRIMO METODIKA ... 25
2.1.Tyrimo planavimas ... 25
2.2.Tyrimo objektas ... 25
2.3.Aparatūra ir priedai ... 27
2.4.Naudoti reagentai ... 28
2.5.Etaloninių tirpalų paruošimas ... 28
2.6.Tiriamųjų tirpalų paruošimas... 29
2.7.Analizė PC metodu ... 29
2.8.Analizė ESC metodu ... 30
3.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
3.1.Plonasluosnės chromatografijos metodikos optimizavimas ... 32
3.1.1.Ekstrahentų parinkimas ... 32
3.1.2.Ryškiklio parinkimas ... 32
3.1.3.Eliuento parinkimas ... 32
3.2.Plonasluoksnės chromatografijos metodo validacija ... 33
3.2.1.Metodo specifiškumas (selektyvumas) ... 33
3.2.2.Metodo tiesiškumas ... 34
3.3.PC metodu nustatyto folio rūgšties kiekio ir ant pakuotės deklaruojamo kiekio palyginimas .... 35
3.4.Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimas ... 36
3.4.1.Kolonėlės pasirinkimas ... 36
3.4.2.Eliuento pasirinkimas ... 36
3.4.3.Eliuento tėkmės greičio parinkimas ... 37
3.5.Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija ... 37
3.5.1.Metodo specifiškumas ... 37
3.5.2.Metodo tiesiškumas ... 38
3.5.3.Metodo glaudumas (preciziškumas) ... 39
3.5.3.1.Pakartojamumas ... 39
3.5.3.2.Tarpinis preciziškumas ... 40
3.6.Kiekybinis maisto papildų su folio rūgštimi įvertinimas ESC metodu ... 41
3.7.ESC metodu nustatyto folio rūgšties kiekio palyginimas su leistinais nuokrypiais ... 44
4.IŠVADOS ... 46
5.PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47
SANTRAUKA
D. Pūkaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. dr. Asta Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės it toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas. Pavadinimas: Folio rūgšties kiekybinis įvertinimas maisto papilduose chromatografiniais analizės metodais.
Raktiniai žodžiai: folio rūgštis, folatai, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija.
Tyrimo tikslas: Atlikti folio rūgšties kokybinę ir kiekybinę analizę maisto papilduose, taikant plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, bei palyginti su etiketėje deklaruojamu kiekiu.
Tyrimo uždaviniai: parinkti tinkamą plonasluoksnės chromatografijos analizės metodiką, ją validuoti ir pritaikyti folio rūgšties identifikavimui ir kiekybinei analizei maisto papilduose; parinkti tinkamą efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodiką, ją validuoti ir pritaikyti folio rūgšties identifikavimui ir kiekybinei analizei maisto papilduose; palyginti nustatyto folio rūgšties kiekio atitikimą deklaruojamiems ant maisto papildų pakuotės.
Tyrimo objektas ir metodai: objektas – 9 vienkomponenčiai folio rūgšties maisto papildai, 4 kompleksiniai preparatai su folio rūgštimi. Analizei buvo naudojami plonasluoksnės chromatografijos (PC) ir efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodai. PC analizei naudota tirpiklių sistema - etanolis, 25 proc. amonio hidroksidas ir propanolis, dėmių ryškinimui pritaikytas apšvietimas 366 nm UV šviesa. ESC analizei naudotas Waters Alliance e2695 chromatografas su Waters 2998 PDA fotodiodų detektoriumi, medžiagų atskyrimui naudota ACE18 chromatografinė kolonėlė, 150 mm ilgio ir 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 1,7 µm, 190 – 400 nm bangos ilgio spektras. Eliuentai – acetonitrilas ir trifluoracto rūgštis, tėkmės greitis 1 ml/min, termostate palaikoma pastovi 35 ºC temperatūrą.
Tyrimo rezultatai ir išvados: parinkta ir optimizuota PC metodika folio rūgšties, esančios vienkomponenčiuose maisto papilduose, identifikavimui. Tačiau analizės nepavyko tinkamai pritaikyti kiekybiniam medžiagos nustatymui, dėl galimos pagalbinių medžiagų įtakos, bei ši metodika netinkama kompleksinių preparatų analizei. Visuose vienkomponenčiuose maisto papilduose ESC metodu nustatytas vitamino kiekis atitiko leidžiamas nuokrypių ribas (nemažiau nei 20 proc. ir nedaugiau nei 50 proc. medžiagos), o viename kompleksiniame mėginyje nustatytas kiekis buvo mažesnis(48,9 proc.) nei leistina norma, likę mėginiai tenkino leidžiamas nuokrypių ribas. Todėl galima manyti, kad ESC metodu gauti rezultatai yra tikslesni, o ši metodika tinkamesnė rutininei folio rūgšties analizei maisto papilduose.
SUMMARY
D. Pūkaitė Master’s Thesis/scientific supervisor doc. Dr. Asta Kubilienė; Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. – Kaunas.
Title: Quantitative evaluation of folic acid in food supplements by chromatographic analysis methods. Keywords: folic acid, folate, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography. Aim of the study: To quantify the actual amount of folic acid in the selected food supplements and compare to the declared amount on the packaging by applying thin layer chromatography and high performance liquid methods of analysis.
The objectives of the study are as follows: to select the appropriate thin layer chromatographic analysis method, validate and apply it for the identification and quantification of folic acid in food supplements; to select the suitable high performance liquid chromatographic analysis method, validate and apply it for the identification and quantification of folic acid in food supplements; to compare the adequacy of the definite folic acid amount with the declared on the package of food supplements. Object and methods of the study: The object of the study is 9 one-component folic acid supplements and 4 complex preparations with folic acid. The methods of thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) were used for the analysis. The following solvent system was used for the analysis of TLC: ethanol, 25 percent ammonium hydroxide and propanol; the UV light at 366 nm was applied for spot illumination. The Waters Alliance e2695 chromatograph with Waters 2998 Photodiode Array (PDA) detector, ACE18 chromatographic column with the length of 150 mm and 4.6 mm, sorbent in 1,7 µm particle size and 190 – 400 nm wavelength spectrum were used for the HPLC analysis. Eluents – acetonitrile and trifluoroacetic acid, flow rate of 1ml/min, a constant temperature of 35 ºC in the thermostat.
Results and conclusions of the study: TLC methodology for identification of folic acid in one-component food supplements was selected and optimized. However, the analysis has not been properly applied to the quantitative evaluation of the substance due to the probable influence of the excipients and this methodology is not suitable for the analysis of complex preparations. In all one–component food supplements, the amount of vitamin determined by HPLC method coincided with the permissible declination limits (at least 20 % and no more than 50 % of the substance), and the defined amount was lower that the allowable limit in one complex sample (48.9%), though the remaining samples satisfied the declination limits. Therefore, it can be assumed that the results obtained by the HPLC method are more accurate.
SANTRUMPOS
DHF - dihidrofolatai
EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
PC – plonasluoksnė chromatografija RPN –rekomenduojama paros norma THF - tetrahidrofolatas
UESC – ultra efektyvioji skysčių chromatografija UV – ultravioletinės šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Maisto papildas – tai maisto produktas, skirtas papildyti įprastą maisto racioną ir kuris vienas arba derinyje su kitomis medžiagomis yra koncentruotas maistinių ar kitų medžiagų, turinčių mitybinį arba fiziologinį poveikį, šaltinis [3]. Maisto papildai rinkai tiekiami įvairiomis dozuotomis farmacinėmis formomis, dažniausiai tai būna tabletės, kapsulės, įvairios skystos vaistų formos ampulėse, buteliukais su lašintuvais ar kt. Šie preparatai skirti papildyti mitybą reikalingomis maisto medžiagomis, palaikant tinkamą jų kiekį organizme ar koreguojant jų trūkumą. Reikia paminėti, kad maisto papildai nėra skirti ligų gydymui ar prevencijai, fiziologinių organizmo funkcijų modifikavimui ar ligų diagnostikai [93].
Pastaruoju metu Europoje ir visame Pasaulyje maisto papildų suvartojimas didėja. Įvertinus sudėtinius metinius maisto papildų suvartojimo augimo tempus, nustatyta, kad 2018–2023 metų periodu, jų pardavimas turėtų išaugti vidutiniškai 6,4 proc. [98]. 2015 metų statistikos duomenimis nustatyta, kad vien iš trečiųjų šalių į Lietuvą importuojama 200 tonų maisto papildų neskaitant Europos Sąjungos rinkoje įsigyjamų, laisvai prieinamų papildų bei neįvertinant internetinės prekybos mastų [2]. Taip pat nustatyta, kad 2015 metais Lietuvoje parduota įvairių maisto papildų už 45,4 milijonus eurų, teigiama, kad iki 2020 metų ši suma gali išaugti iki 50,6 milijonų eurų [101]. Tačiau didėjant maisto papildų suvartojimui, kyla klausimas ar jie tikrai saugūs ir efektyvūs?
Skirtingai nei vaistinių preparatų registracijai, maisto papildų gamybai ir notifikavimui nėra taikomi griežti reikalavimai. Maisto papildams nėra atliekama privalomoji kiekybinė nei kokybinė analizė. Tačiau 2014 metais atlikus Lietuvos rinkoje esančių maisto papildų patikrinimą, jų sudėtyje nustatyta neleidžiamų sudėtinių dalių, taip pat veikiųjų medžiagų kiekiai - daug mažesni nei deklaruojama ant preparato pakuotės, o 20 maisto papildų buvo nesaugūs vartojimui [2].
Folio rūgšties maisto papildus dažniausiai vartoja tam tikros asmenų grupės siekiant palaikyti tinkamą šios medžiagos kiekį organizme, įvairių ligų prevencijos tikslais. Optimalus folio rūgšties kiekis labai svarbus nėščioms ir žindančioms moterims, siekiant užtikrinti tinkamą motinos būklę bei vaisiaus vystymąsi [90][77]. Senyviems pacientams folio rūgštis mažina tikimybę atsirasti degeneraciniams nervų sistemos pakitimams, kardiovaskulinėms ligoms [83][86]. Taip pat tinkamas folio rūgšties kiekis padeda išvengti megaloblastinės anemijos atsiradimo [34]. Kadangi žmogaus organizme yra sintetinamas labai mažas kiekis folio rūgšties, o su maistu gauti pakanką vitamino kiekį dėl tam tikrų priežasčių gauti gali būti sunku, todėl daugelyje multivitamininių mišinių yra tam tikras šios medžiagos kiekis, kuriuo yra svarbu papildyti kasdienę mitybą [100]. Tai - normalioms organizmo funkcijoms palaikyti reikalinga medžiaga, todėl reikia pritaikyti vienkomponenčių folio rūgšties bei
kompleksinių maisto papildų analizės metodikas, kuriomis būtų galima efektyviai įvertinti faktinį maisto papilduose esantį folio rūgšties kiekį.
Šio darbo tikslas - atlikti folio rūgšties kokybinę ir kiekybinę analizę pasirinktuose maisto papilduose, taikant plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, bei palyginti nustatytus medžiagos kiekius su deklaruojamais etiketėse.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
-
atlikti folio rūgšties kokybinę ir kiekybinę folio rūgšties analizę pasirinktuose maisto papilduose, taikant plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, bei palyginti su etiketėje deklaruojamu kiekiu.Uždaviniai:
1. Parinkti tinkamą plonasluoksnės chromatografijos analizės metodiką, ją validuoti ir pritaikyti folio rūgšties identifikavimui ir kiekybinei analizei maisto papilduose.
2. Parinkti tinkamą efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodiką, ją validuoti ir pritaikyti folio rūgšties identifikavimui ir kiekybinei analizei maisto papilduose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Folatai. Folio rūgšties savybės
Terminas folatai – kilęs nuo lotyniško žodžio folium, reiškiančio lapas. Maždaug prieš 70 metų mokslininkas Lucy Wills nustatė folatų, kaip maisto medžiagų, poreikį nėščiųjų anemijos prevencijoje. 1930-aisiais atlikti tyrimai pademonstravo, kad mielių ekstraktu gali būti gydoma nėščiųjų anemija, o 1941 metais folatai buvo ekstrahuoti iš špinatų lapų ir vėliau pritaikyti medicinos praktikoje [28].
Terminas folatai apibūdina grupę junginių, kurie tirpūs vandenyje bei priklauso B vitaminų grupei [84]. Visų folatų molekulės sudarytos iš trijų pagrindinių dalių: pteridino žiedo, para-aminobenzoinės rūgšties (p-ABA) žiedo ir uodegėlės, susidedančios iš vienos ar kelių L-glutamato liekanų (dažniausiai 4 - 6), sujungtų per γ-karboksilo grupes (1 pav.) [29][35]. Tiek organizme, tiek maisto šaltiniuose folatai yra įvairių formų mišiniai, susidedantys iš skirtingai oksiduotų folatų, besiskiriančių glutamato uodegėlių ilgiais. Tetrahidrofolatas (THF) – labiausiai redukuotas natūralus folatas, vienintelis pasižymintis fermentiniu poveikiu, o visiškai oksiduota forma – folio rūgštis nėra sutinkama natūraliai, tačiau yra stabilesnė nei natūralūs junginiai [8]. THF molekulės yra „paruoštos būti panaudotos“ organizme, tuo tarpu dihidrofolatai (DHF) prieš tai turi būti redukuojami, o folio rūgštis turi būti redukuojama net 2 kartus, kad taptų biologiškai aktyviu junginiu [29].
1 pav. A - tetrahidrofoiato struktūrinė formulė. B – skirtingi tetrahidrofolatų radikalai ir junginių pavadinimai (sudaryta pagal [29][35][52])
Natūralūs folatai - termiškai labilūs junginiai, jų stabilumą stipriai įtakoja aplinkos pH, didžiausiu stabilumu junginiai pasižymi esant pH>8 ir pH<2, tuo tarpu mažiausiai stabilūs būna esant
pH 4-6. Šie junginiai jautrūs oksidaciniams procesams, todėl veikiant deguoniui, šviesai ar šilumai folatų molekulės tampa biologiškai neaktyviomis. Natūralūs folatai – gerai tirpūs vandenyje [8]. Dėl cheminio folatų nestabilumo yra vartojama sintetinė forma – folio rūgštis [21].
Folio rūgštis – sintetinis folatas, priklausantis biologiškai svarbiai junginių grupei. Folio rūgštis dar žinoma kaip pteroilmonoglutamo rūgštis arba vitaminas B9, taip pat vitamino M arba vitamino B11 pavadinimais [41][19]. Tai – gelsvos ar orandžiniai rusvos spalvos smulkūs kristaliniai milteliai, bekvapiai arba pasižymintys labai silpnu specifiniu kvapu. Lydimosi temperatūra siekia 250 ºC. Folio rūgštis iš dalies tirpsta vandenyje, etanolyje, metanolyje ir butanlyje, sunkiai tirpi daugelyje organinių tirpiklių, visiškai netirpi acetone, chloroforme, eteryje ir benzene. Gerai tirpsta hidroksidų ir karbonatų tirpaluose, taip pat praskiestose rūgštyse [68]. Vandeniniai folio rūgšties tirpalai – jautrūs šviesos ir temperatūros pokyčiams [68][94].
1.2. Folio rūgšties metabolizmas
Sintetinė folio rūgštis nepasižymi biologiniu aktyvumu, tačiau ji yra prekursorius kitų aktyvių formų sintezės procesuose. Pagrindiniai organizme vykstantys procesai, kuriems reikalingi folatai - purinų bei pirimidinų sintezė, timidilato gamyba, taip pat folio rūgštis kartu su vitaminu B12 dalyvauja metionino gamyboje. (2 pav.) [25][87].
2 pav. Supaprastinta folio rūgšties metabolizmo schema [25]
Apytiksliai 40 proc. į organizmą patekusių folatų susikaupia ląstelių mitochondrijose, kuriose vyksta pirmasis metabolizmo etapas [79]. Folio rūgštis yra paverčiama redukuota vitamino forma – dihidrofolatu, dalyvaujant fermentui dihidrofolato reduktazei. Pastarasis, to paties fermento pagalba, plonojo žarnyno epitelinėse ląstelėse, paverčiamas į tetrahidrofolatą, kuris patenka į kepenis. Nustatyta, kad kraujyje dalis folio rūgšties lieka nemetabolizuotos formos, kuri patekusi į kepenis tiesiogiai paverčiama į tetrahidrofolatą [25]. Tuomet THF, kondukcijos reakcijų metų, yra sujungiama su formaldehido molekulėmis, kurios susidaro mitochindrijose vykstant amino rūgščių (serino, glicino, dimetilglicino ar sarkozino) katabaolizmo (medžiagų skaidymo) procesamas. Susidaręs 5,10 -
metenilTHF, vykstant oksidacijos procesamas, verčiamas 10-formilTHF, kuris gali būti naudojamas de novo purinų ir pirimidinų sintezėje [79]. Kitas galimas metabolizmo kelias – THF patekimas į citoplazmą, kur pastarasis verčiamas junginiu – 5,10 - metilenTHF, kuris dalyvauja kaip anglies atomų donoras timidino sintezėje. Apie 10 proc. folatų nustatoma ląstelės branduolyje, todėl timidino sintezė vyksta dviem etapais, tiek citoplazmoje, tiek branduolyje. Be to, THF gali dalyvauti metilinimo ciklo reakcijose, vykstančiose citoplazmoje, kaip 5-metilTHF forma, kuri kartu su vitamino B12 aktyvia forma – homocisteinu - dalyvauja reakcijose siekiant užtikrinti pakankamą S-adenozilmetionino kiekį organizme, kuris toliau dalyvauja kitose metilinimo reakcijose [25][27][79].
1.3. Biocheminis folatų poveikis
Folatai pasižymi kofermentiniu aktyvumu, tai yra ypač svarbu daliai organizme vykstančių reakcijų. Folatai dalyvauja dalies amino rūgščių metabolizmo procesuose, kurios yra pagrindinė baltymų struktūrinė dalis [84]. Tokios folatų formos, kaip 10 – formilTHF ir 5,10 – metilenTHF, 5,10 – metenilTHF, dalyvauja purino (adeninas, guaninas) ir pirimidino (timidinas) nukleotidų biosintezėje, kurie yra būtini DNR ir RNR gamybai. 5 – metilTHF kartu su vitaminu B12 dalyvauja metilinimo reakcijose, kurių metu sintezuojam amino rūgštis – metioninas. Metilinimo ciklas taip pat svarbus deoksiribonukleorūgšties ekspresijai, baltymų ir lipidų sintezei, neurotransmiterių metabolizmui [52][28]. Greitai besidauginančioms ląstelėms, tokioms kaip epiteliocitai, karinocitai, kraujo ląstelės, būtinas pakankamas folio rūgšties kiekis, siekiant užtikrinti tinkamą jų dalijimąsi ir diferenciaciją. Nustačius, kad folatai dalyvauja svarbiose gyvybinėse biocheminėse funkcijose, labai svarbu užtikrinti, kad nepasireikštų vitamino stygius, nesukeltų nepageidaujamų reakcijų žmogaus organizmui [28][61].
1.4. Folatų bioprieinamumas
Terminas „folatai“ apibendrina grupę pteroilglutamo rūgšties junginių, tiek poliglutamatų, sutinkamų natūraliai, tiek sintetinių šių junginių formų. Prieš absorbciją pteroilpoliglutamatai pirmiausia yra hidrolizuojami iki monoglutamatų formų, dalyvaujant γ-glutamil-hidrolazei, užtikrinant geresnę šių medžiagų absorbciją. Absorbcija vyksta plonojoje žarnoje, taip pat neintensyviai tuščiojoje žarnoje. Nustatyta, kad čia absorbciją vykdo transporteris, vadinamas žmogaus protonų suporuotų su folatais transporteris (SLC46A1), kuris yra aktyvus tik esant 5 – 6 pH terpei, jai pakitus sumažėja folatų absorbcija iš virškinamojo trakto [4]. Didesnės folio rūgšties dozės absorbuojamos ir pasyviosios difuzijos būdu, tačiau šis procesas yra ribotas, jis ypač aktyvus esant didelėms vitamino
dozėms, o vitamino kiekiui sumažėjus aktyviau veikia palengvintoji difuzija. Nedideli folatų kiekiai absorbuojami storojoje žarnoje, taip pat nustatyta, kad žmonės ir kiaulės geba absorbuoti folatus, kuriuos storojoje žarnoje sintetina tam tikros ten esančios bakterijos [6]. Po absorbcijos, iš virškinamojo trakto monoglutamatai patenka į sisteminę kraujotaką, išnešiojami po skirtingus audinius, kur vėl yra paverčiami poliglutamatais [8]. Patekę į kepenis junginiai ten kaupiami arba grąžinami atgal į sisteminę kraujotaką. Kepenyse aptinkamos didžiausios folatų atsargos, tai siekia 10-20 proc. nuo visų organizme esančių folatų kiekio. Plazmoje folio rūgštis dažniausiai būna susijungusi su albuminais ir taip būna transportuojama į ląsteles per daugelį transportavimo sistemų [8][28][61].
Folatų monoglutaminės formos geriau absorbuojamos nei poliglutamatai. Literatūroje teigiama, kad poliglutamatų bioprieinamumas svyruoja tarp 60-80 proc., lyginant su monoglutamatais. Natūralių folatų, esančių maisto produktuose, bioprieinamumas siekia tik 50 proc. lyginant su sintetine folio rūgštimi [28]. Folio rūgšties biopreinamumui įtakos turi ir maistas, vartojamas kartu su papildais. Pavyzdžiui, 400 µg folio rūgšties pavartojus tuščiu skrandžiu atitinka 470 µg sintetinių folatų, pavartotų kartu su maistu, ir bioekvivalentiškas 800 µg natūralių folatų [33] Be to, folio rūgštis pasižymi geresniu bioprieinamumu ir absorbcija nei natūralios kilmės folatai. Sintetinė folio rūgštis, iš maisto papildų, vidutiniškai 1,7 karto geriau pasisavinama nei natūralios folatų formos iš augalinės ar gyvūninės kilmės šaltinių [28]. Be to, papildai gali būti ne tik folio rūgšies, tačiau ir 5 - metilTHF forma, kurios metabolizmo kelias sutrumpėja ir ši forma gali būti greičiau panaudota biocheminiuose procesuose. Abiejų anksčiau aptartų junginių biologinis prieinamumas yra panašus, nors yra duomenų, kad 5 - metilTHF bioprieinamumas yra net didesnis nei folio rūgšties [99].
Natūralių folatų bioprieinamumui įtakos turi maisto produktų apdorojimas. Natūralūs folatai nėra stabilūs – jie skyla apdorojant maistą, esant temperatūros pokyčiams, skyla laikymo metu šviesos poveikyje [16]. Anksčiau atliktų tyrimų duomenimis nustatyta, kad gyvuliniuose šaltiniuose, tokiuose kaip jautiena, yra stabilesnės folatų formos, jie išlieka aktyvūs net po terminio produkto apdorojimo, kai tuo tarpu augalinės kilmės produktuose, terminis apdorojimas ir jo atlikimo trukmė stipriai įtakoja folatų koncentraciją [28][80].
1.5. Rekomenduojama folio rūgšties paros norma
Folatų kiekis organizme gali būti vertinamas nustatant folatų kiekį eritrocituose, homocisteino kiekį kraujo plazmoje ir folatų kiekį kraujyje. Vertinant folatų kiekį kraujo plazmoje, optimali koncentracija – 3 ng/ml, tačiau šis dydis atspindi neseniai suvartoto elemento kiekį, bet neparodo ilgalaikio statuso. Ilgalaikį folatų vartojimą atspindi kitas tyrimas – folatų kiekio eritrocituose nustatymas, kurio optimali konentracija turėtų siekti virš 140 ng/ml, kai kuriais šaltiniais ne mažiau
151 ng/ml [103][99]. Nors plazmos homocisteino kiekio matavimas yra dažniausias funkcinis folatų tyrimas, parodantis 5 - metilTHF trūkumą, dėl kurio negali būti pagamintas pakankamas metionino kiekis. Šis tyrimas nėra labai specifinis folatų atžvilgiu, nes homocisteino stygių gali įtakoti ir kiti veiksniai, tokie kaip inkstų disfunkcija ar vitamino B12 bei kitų mikroelementų trūkumas. Rekomenduojama, kad šio dydžio vertė neviršytų 16 µmol/l, tačiau kai kuriose populiacijose jis sumažintas iki 12-14 µmol/l [55][99]. Remiantis šiais tyrimų duomenimis yra nustatoma folatų rekomenduojama paros norma (RPN), kuri atspindi reikiamą vitamino B9 kiekį. RPN gali varijuoti priklausomai nuo paciento amžiaus, lyties, sveikatos būklės, esamų ligų ar kitų metabolinių organizmo pokyčių [28]. Rekomenduojama paros norma, kuri siūloma 97-98 proc. sveikų žmonių, ir didžiausia toleruojama folio rūgšties norma, nustatytos remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos bei „Food and Nutrition Board“ duomenimis, pateikiama 1 lentelėje [99][103][58].
1 lentelė. Rekomenduojama ir didžiausia toleruojama folio rūgšties dienos norma skirtingoms asmenų grupėms (sudaryta pagal [103][99])
Kategorija Folio rūgšties RPN Didžiausia toleruojama folio
rūgšties dozė
Vyrai Moterys Abi lytys
Naujagimiai iki 6 mėn. 65 µg/ dienai 65 µg/ dienai - 7 – 12 mėn. kūdikiai 80 µg/ dienai 80 µg/ dienai -
1 – 3 metų vaikai 150 µg/ dienai 150 µg/ dienai 300 µg/ dienai 4 - 8 metų vaikai 200 µg/ dienai 200 µg/ dienai 400 µg/ dienai 9 – 13 metų vaikai 300 µg/ dienai 300 µg/ dienai 600 µg/ dienai 14 – 18 metų vaikai 400 µg/ dienai 400 µg/ dienai 800 µg/ dienai Saugusieji 400 µg/ dienai 400 µg/ dienai 1000 µg/ dienai
Nėščiosios - 600 µg/ dienai -
Maitinančios moterys - 500 µg/ dienai -
1.6. Folio rūgšties šaltiniai
Folatai - svarbios maistinės medžiagos kasdienėje žmogaus mityboje. Didžioji dalis žinduolių savo organizme negali susintetinti biologiškai aktyvių folatų formų de novo (t.y. nuo pradžios), tačiau tam tikri labiau išsivystę žinduoliai, kuriems priklauso ir žmogus, geba susintetinti folatus, veikiant
žarnyne esančioms bakterijoms, iš jų prekursorių - pteridino ir p-aminobenzilglutamato. Tačiau sintetinami vitamino kiekiai yra labai maži, todėl organizmą jais būtina papildyti iš kitų šaltinių [28].
Folatai aptinkami daugelyje įvairių maisto produktų, tačiau labai mažais kiekiais, išskyrus kepenis, kuriose nustatoma gana didelė vitamino B9 koncentracija [28][25]. Vartojant pakankamą kiekį žalių daržovių ar grūdinių kultūrų dažniausiai gali būti patenkinamas folio rūgšties paros normos kiekis. Nors folatai ir yra nustatomi įvairiuose gyvūninės kilmės produktuose, tačiau pagrindiniai, daugiausia folio rūgšties turintys šaltiniai - įvairios rūšies javai, kviečių gemalai, mielės, ankštiniai augalai, pupelės ir žalios lapinės daržovės, špinatai, briuselio kopūstai, ropės ar bulvės, taip pat vaisiai, ypač citrusiniai [28][60][99]. Pagrindiniai folio rūgšties šaltiniai ir vidutinis folatų kiekis juose pateikiami 2 lentelėje.
2 lentelė. Skirtingi maisto šaltiniai, atsižvelgiant į folatų kiekį, esantį juose (sudaryta pagal [28][60][99])
Folatų kiekis (µg/ 100g) Maisto šaltiniai
„Turtingi“ šaltiniai (100-350) Vištų kiaušiniai, kiaušinių tryniai, ožkų ir jaučių kepenys, termiškai apdoroti špinatai, šviežios sojų pupelės, avinžirniai, spindulinės pupuolės, braškės
Geri šaltiniai (56-83) Švieži brokoliai, virti šparagai, švieži avokadai, virtos sojų pupelės, švieži lęšiai, bulvės, bananai, lapinės salotos, švieži špinatai
Vidutiniai šaltiniai (15-30) Balta duona, svogūnai, pomidorai, kepiniai su mielėmis, apelsinai, pienas
1.7. Folio rūgšties trūkumas
Folatų trūkumas organizme gali atsirasti dėl netinkamos mitybos – vartojant maisto produktus, turinčius nedaug vitamino B9, taip pat sergant sunkiu alkoholizmu ar vitaminui sąveikaujant su tam tikrais vaistais. Ligos, keičiančios virškinamojo trakto pH reikšmę ar pažeidžiančios plonosios ir storosios žarnos gleivinę, tokios kaip, celiakija, neretai sukelia vitamino B9 deficitą. Be to, vitamino trūkumas dažnai pasireiškia padidėjus jo poreikiui – nėštumo metu ar sergant onkologinėmis ligomis [66][17]. Kitos priežastys, galinčios daryti įtaką folio rūgšties deficito atsiradimui pateikiamos 3 lentelėje.
Esant folio rūgšties trūkumui, pirmiausia tai pasireiškia folatų koncentracijos sumažėjimu kraujo serume. Vėliau pakinta ir koncentracija eritrocituose, dėl šios priežasties padidėja homocisteino
kiekis ir pasireiškia megaloblastiniai pokyčiai kaulų čiulpuose, taip pat pastebėti skirtumai kituose greitai besidauginančiuose audiniuose. Pirmiausia kliniškai pasireiškiantys folio rūgšties trūkumo simptomai paveikia greitai besidauginančias ląsteles [103][17].
3 lentelė. Galimos folatų deficito priežastys (sudaryta pagal [66][17][95])
Priežastis Etiologija
Nepakankamas RPN Mažai vartojama produktų su vitaminu B9, lėtinis alkoholizmas, parenteralinė mityba ir kt.
Sumažėjusi absorbcija Įgimtas folatų malabsorbcijos sutrikimas ar įgytas malabsorbcijos sindromas: celiakija, uždegiminės žarnų ligos, Krono liga, opinis kolitas, padidėjęs plonojo žarnyno bakterijų kiekis, tam tikrų genų polimorfizmas, absorbcija dėl fiziologinių pokyčių sumažėja senyviems asmenims.
Netinkamas panaudojimas
Įgimtas ar įgytas fermentų deficitas, alkoholizmas, kai kurių vaistų poveikis (folatų antagonistai: metotreksatas, triamterenas, trimetoprimas - sulfametoksazolas, kai kurie antiepileptiniai preparatai – fenitoinas ir kiti vaistai: sulfasalazinas)
Padidėjęs poreikis Nėštumas, žindymas, didesnis kiekis reikalingas kūdikiams, dėl įvairių priežasčių padidėjęs metabolizmas.
Padidėjęs šalinimas Inkstų dializės (peritoninė dializė arba hemodializė)
1.8. Folatų pokyčiai organizme. Megaloblastinė anemija
Megaloblastinės anemijos atvejų pastaraisiais dešimtmečiais ženkliai padaugėjo [11]. Kitaip dar vadinama makrocitinė anemija pasireiškia sumažėjusiu raudonųjų kraujo ląstelių kiekiu, taip pat neišsivysčiusių eritrocitų (megaloblastų) cirkuliacija kraujyje bei leukocitų kiekio pokyčiais. Pagrindiniai šią būklę įtakojantys faktoriai – vitaminų B9 ir B12 stygius bei padidėjęs homocisteino kiekis [62][34]. Nustatyta, kad auglių baltymas p53 gausiai ekspresuojamas kaulų čiulpuose, esant megaloblastinei anemijai, sukeltai vitaminų B9 ir B12 trūkumo. Teigiama, kad p53 baltymas gali būti dar vienas faktorius, nustatant megaloblastinę anemiją. Progresuojant anemijai gali būti ne tik jaučiamas nuovargis, silpnumas, tačiau ilgainiui tai gali įtakoti atminties, regos sutrikimus, paskatinti aterosklerozės, demencijos, Alzheimerio ligos progresavimą [34].
1.9. Folatų pokyčiai organizme. Širdies ir kraujagyslių sistema
Padidėjęs plazmos homocisteino kiekis, atsirandantis dėl sumažėjusio folio rūgšties kiekio organizme, buvo siejamas su padidėjusia kardiovaskulinių ligų atsiradimo rizika. Tyrimais, atliktais su pelėmis įrodyta, kad folio rūgšties trūkumas kraujyje tiesiogiai susijęs su padidėjusia išeminio insulto atsiradimo rizika [86]. Dėl folio rūgšties stygiaus, padidėjus homocisteino kiekiui ne tik padidėja insulto atsiradimo rizika, bet atsiranda tiesioginė smegenų pažaida dėl perfuzijos sutrikimų [86][23]. Taip pat manoma, kad folio rūgšties preparatai gali prisidėti prie nervinių ląstelių atstatymo po pažaidos, atsiradusios dėl išeminės reperfuzijos, Zhao Yaqian ir bendraautorių atlikti tyrimai įrodė, kad pakankamas folio rūgšties kiekis kraujyje, po pasireiškusio išeminio insulto, žiurkių smegenyse indukuoja autofagų poveikį ir taip apsaugo nuo tolesnės ląstelių pažaidos [86]. Įrodyta, kad kasdienis folio rūgšties vartojimas homocisteino koncentraciją kraujyje sumažina iki 25 proc., o tai padeda išvengti pirminio insulto širdies ir kraujagyslių ligomis sergantiems pacientams [83].
Hiperhomocisteinemija - būsena, kuri įvardijama kaip rizikos faktorius kardiovaskulinių ligų, tokių kaip aterosklerozė, koronarinė liga ir venų tromboembolija, išsivystymui. Michal Pravenec ir kolegų tyrimo rezultatai rodo, kad apytiksliai 3 kartus padidėjusi homocisteino plazmos koncentracija susijusi su sistolinio kraujo spaudimo padidėjimu vidutiniškai 15 mm/Hg [67]. Nustatyta, kad kiekvienas 5 µmol/l virš normos padidėjęs homocisteino kiekis net 32 proc. padidina išeminės širdies ligos atsiradimo galimybę ir net 59 proc. padidina insulto riziką, nors tiksli priežastis dar nėra aiški [89][47]. Nustatyta tiesioginė sąsaja tarp didelės homocisteino koncentracijos bei mažo folio rūgšties ir vitamino B12 kiekio plazmoje, manoma, jog tai daro įtaką stabilios krūtinės anginos, nestabilios krūtinės anginos bei staigaus miokardo infarkto atsiradimu [54].
1.10. Folatų pokyčiai organizme. Naujagimių vystymasis
Esant folio rūgšties deficitui sulėtėja kūdikių augimas ir vystymasis pirmuosius 3 gyvenimo metus [90]. Folio rūgšties sumažėjimas organizme gali pakenkti naujagimiams, ypač dažnai pasireiškia nervinio vamzdelio defektai – netinkamas smegenų ir stuburo vystymasis, galintis sukelti visišką paralyžių, spina bifida pasireiškia įvairaus laipsnio kojų paralyžiumi, anencefalija – naujagimis gimsta su ne iki galo išsivysčiusiomis smegenimis ir kaukole, galima galvos smegenų vandenė [90][64]. Atliktais epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad kasdienis 0,4 mg folio rūgšties suvartojimas nėštumo metu sumažina riziką išsivystyti įgimtiems nervinio vamzdelio defektams [43]. Kaip svarbiausias folio rūgšties vartojimo laikotarpis, įvardinamas vitamino vartojimas 4 savaites iki ir 8 savaites po pastojimo [70][77]. Folio rūgšties vartojimas įvardintuoju nėštumo periodu tiesiogiai
siejamas su teigiamais neurologinio vystymosi aspektais. Nustatyta, kad nėščių moterų folio rūgšties vartojimas sumažina palikuonių kalbos defektų atsiradimo iki 3 metų dažnį [70][85]. O per mažas folatų kiekis plazmoje nėštumo metu, arba per vėlai pradėtas vitamino vartojimas siejamas su didesne emocinių sutrikimų pasireiškimo rizika vaikams [77]. Kiti mokslininkai teigia, kad naudingas ne tik trumpalaikis folio rūgšties vartojimas, patartina ją vartoti ir viso nėštumo metu. 2018 metais atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad moterų, kurios visą nėštumo laikotarpį vartojo folio rūgšties papildus, vaikai vertinant emocinį intelektą surinko reikšmingai daugiau balų, nei moterų, vartojusių folio rūgštį tik pirmojo nėštumo trimestro metu, vaikai. Emocinis intelektas pasireiškė didesniu empatiškumu, geresniu emocijų valdymu bei streso kontrole, buvo didesnės savivertės bei jiems nustatyta ženkliai mažiau elgesio problemų [30]. Bukowski ir bendraautorių atlikta analizė parodė, kad folio rūgšties vartojimas 1 metus ir ilgiau prieš pastojant 70 proc. sumažina spontaninių gimdymų riziką iki 20 - 28 savaitės ir 50 proc. iki 28 - 32 savaitės, lyginant su folio rūgšties nevartojusia moterų grupe [9].
Kai kurios genetinės mutacijos gali įtakoti sumažėjusią folio rūgšties koncentraciją organizme [77][15]. Dauno sindromo pasireiškimas vaikams siejamas su metil - THF reduktazės (MTHFR) 677 C > T, MTHFR 1298 A > C, redukuotų folatų pernešimo genų (RFC-1) 80 G > A arba metionino sintazės reduktazės (MTRR) 66 A > G mutacijomis motinos organizme. Šie genetiniai pokyčiai siejami su padidėjusiu homocisteino kiekiu, o tai su dažnesniu Dauno sindromo pasireiškimu kūdikiams [15]. Nustatyta, kad homozigotinis MTHFR 677C > T polimorfizmas, skirtingais duomenimis, susijęs su 2,6 ar 3,51 karto dažnesniu Dauno sindromo atsiradimu kūdikiams, lyginant su kontroline grupe [36][15]. Taip pat MTRR 66 A > G polimorfizmas padidina Dauno sindromo atsiradimo tikimybę 3,16 karto [48]. Genetiniai polimorfizmai motinos organizme siejami su padidėjusia homocisteino koncentracija, kaip ir anksčiau aptartos mutacijos, siejamos su padidėjusia šizofrenijos pasireiškimo galimybe palikuonims [87][88][46].
Vaikams per didelis folio rūgšties kiekis ar per didelė koncentracija nėščiųjų kraujyje yra susijusi su vaikų 2 tipo cukrinio diabeto (CD) išsivystymu. Ikiklinikinio tyrimo metu su pelėmis
nustatyta, kad nėštumo metu skiriamos didelės folio rūgšties dozės sukelia paveldimus metabolinius sutrikimus palikuonims, ypač patelėms. Tiriamosios grupės palikuonys, lyginat su kontroline, pasižymėjo didesne kūno mase, blogiau toleravo gliukozę, nustatytas padidėjęs insulino kiekis bei mažesnis adiponektino kiekis kraujo plazmoje. Sumažėjęs adiponektino kiekis kraujo plazmoje siejamas su ląstelių rezistentiškumu insulinui, 2 tipo CD išsivystymu, taip pat nustatyta, kad sumažėjęs adiponektino kiekis – rizikos veiksnys, dvigubai padidinantis makroangiografinių ir širdies koronarinių kraujagyslių ligų išsivystymą [91][42].
1.11. Folatų pokyčiai organizme. Nervų sistema
Padidėjęs homocisteino kiekis yra rizikos faktorius atsirasti senatvinei demensijai ir Alzheimerio ligai. Tai patvirtina Lenkijoje atlikta 1 metų trukmės studija [75]. Huan Liu ir kolegų 2016 metais atliktas tyrimas su pelėmis parodė, kad folio rūgšties trūkumas sukelia DNR oksidacinį stresą, o tai inicijuoja nervinių ląstelių žūtį, už Alzheimerio ligą atsakingose smegenų srityse. Folio rūgšties koncentracijos sumažėjimas – tiesiogiai susijęs su amiloido-β 42 koncentracijos pokyčiu smegenyse, o tai su padidėjusia Alzheimerio ligos galimybe [51]. Yra manoma, kad folio rūgštis padeda apsaugoti neuronus nuo toksiško amiloido-β poveikio bei gali sumažinti jo sintezę, tačiau rezultatams patvirtinti reikia tolimesnių tyrimų [50].
Pacientai, kuriems nustatytas depresinis sutrikimas, neretai nustatomas mažesnis folio rūgšties bei padidėjęs homocisteino kiekis organizme nei normalios būsenos žmonėms [59]. Tačiau sumažinus homocisteino kiekį, vartojant vitaminų B9 ir B12 preparatus, tai depresijos eigai reikšmės neturi [18]. Mažesnis nei rekomenduojama, folatų kiekis organizme siejamas su rezistentiškumu antidepresiniam gydymui. Studija, kurios metu didžiąja depresija sergantys pacientai buvo gydomi jiems paskirtais antidepresantais, kartu skiriant ir folio rūgšties preparatus, parodė, kad tai turi teigiamos įtakos gydymo eigai [59].
1.12. Folatų pokyčiai organizme. Onkologiniai sutrikimai
Dėl folio rūgšties koncentracijos organizme sąsajos su skirtingų onkologinių surikimų išsivystymu, literatūroje yra pateikiami skirtingi rezultatai. Mažas folio rūgšties bei didelis homocisteino kiekis organizme vis dažniau siejami su padidėjusia onkologinių ligų atsiradimo rizika. D.Tastekin ir bendraautorių 2015 metais atliktame nedidelės apimties tyrime nustatytas statistiškai reikšmingai didesnis homocisteino bei mažesnis folio rūgšties kiekis pacientų, kuriems nustatyta plaučių vėžio diagnozė, organizme, lyginant su kontroline sveikų žmonių grupe [82]. Per mažas folio rūgšties kiekis organizme gali būti vertinamas kaip plaučių vėžio rizikos faktorius, o šių preparatų vartojimas siejamas su mažesne plaučių karcinogenezės atsiradimo rizika, net praeityje ilgą laiko tarpą rūkiusiems bei esamiems rūkoriams [20][74][39]. Kitų autorių atliktais tyrimais nustatyta, kad folio rūgšties koncentracija organizme neturi įtakos plaučių vėžio išsivystymui [69][76].
Tyrimų, dėl folio rūgšties įtakos kolonorektalinio bei kasos vėžio atsiradimui, rezultatai išsiskiria. Kai kurie atlikti tyrimai rodo, kad didelis kiekis tiek natūralių folatų, tiek folio rūgšties papildų, siejamas su mažesne kolonorektalinio vėžio išsivystymo rizika, o ilgalaikis folio rūgšties vartojimas padeda išvengti kolonorektalinių adenomų pakartotinio išsivystymo [78][37]. Kitų tyrimų
duomenimis, folio rūgštis neturi jokios sąsajos su kolonorektalinio vėžio atsiradimu ar net galimai padidina kolonorektalinių adenokarcinomų išsivystymo riziką [10][14][31]. Kasos vėžiu sergantiems pacientams nustatytas statistiškai reikšmingai mažesnis folatų kiekis eritrocituose, lyginant su sveikais asmenimis [13][71]. Tačiau tyrimų rezultatai nėra vienareikšmiški, kitos studijos nepatvirtina šio teiginio, nenustatyta jokios sąsajos tarp folatų kiekio organizme bei kasos vėžio atsiradimo rizikos [44]. Reikalingi tolesni tyrimai tiksliam folio rūgšties poveikiui įvertinti.
Manoma, kad per didelis folio rūgšties kiekis organizme gali sutrikdyti DNR metilinimo procesus, tai ilgainiui gali paskatinti karcinogenezės atsiradimą [26]. Jane C. Figueiredo ir kolegų atliktas 10 metų randomizuotas dvigubai aklas klinikinis tyrimas, parodė, kad kasdienis 1 mg folio rūgšties suvartojimas susijęs su padidėjusia prostatos vėžio atsiradimo rizika. Folio rūgšties grupės 9,7 proc., o placebo grupės tik 3,3 proc. dalyvių tirtuoju laikotarpiu nustatytas prostatos vėžys [26]. Krūties vėžio atsiradimo ir folio rūgšties kieko organizme sąsajai įvertinti atliktų tyrimų rezultatai skiriasi. Sonia S Maruti bei bendraautorių atlikto tyrimo duomenimis nustatyta, kad vidutiniškai 10 metų vartojamos didelės folatų dozės neturi įtakos krūties vėžio išsivystymui, net pasižymi silpnu apsaugančiu, nuo ER-krūties vėžio, poveikiu [56]. Kito, Jennifer Lin ir kolegų atlikto tyrimo duomenimis nenustatyta reikšminga sąsaja tarp krūties vėžio pasireiškimo bei vitaminų B6, B9 ir B12 kiekio kraujyje. Tačiau pastebėta, kad dideli folio rūgšties kiekiai susiję su padidėjusiu ikimenopauzinio krūties vėžio išsivystymu ir ER+ (turintis estrogenų receptorius) arba PR+ (turintis progesterono receptorius) naviko atsiradimu [49]. Taip pat atliktas ikiklinikinis tyrimas su pelėmis parodė, kad nėštumo bei žindymo laikotarpiu vartoti folio rūgšties papildai, susiję su didesne krūties adenokarcinomos atsiradimo rizika palikuonims, nei placebo grupėje, prielaidai patvirtinti reikalingi detalesni tyrimai [53].
1.13. Folio rūgšties perteklius
Nuolatinis ir ženkliai per didelis folio rūgšties vartojimas gali sukelti nepageidaujamus poveikius. Nors atliktos epidemiologinės studijos parodė, kad pastaruoju metu folio rūgšties rekomenduojama paros norma padidėjo vidutiniškai du kartus. Nerimą kelia įvairūs maisto papildai, nėščiosioms skirti preparatai ar įvairūs energiniai gėrimai, papildyti multivitaminų mišiniais [66].
Vitaminas B9 – vandenyje tirpus junginys, kurio perdozuoti yra gana sunku, nes jo perteklius šalinamas per inkstus su šlapimu. Tačiau pagrindiniai, greitai pasireiškiantys folio rūgšties perdozavimo požymiai gali būti blogas kvapas iš burnos, glositas, pykinimas, apetito praradimas, padidėjęs irzlumas, miego sutrikimai. Rečiau gali pasireikšti alerginės reakcijos: odos bėrimas, niežulys, odos paraudimas, sunkesniais atvejais apsunkęs kvėpavimas dėl angioedemos [7][81][97].
1.14. Folio rūgšties kiekio maisto papilduose apibendrinimas ir leistini
medžiagos nuokrypiai
Didžiojoje dalyje folio rūgšties maisto papildų ir kompleksinių preparatų su folio rūgštimi, vitaminas B9 pateikiamas pteroilglutamato rūgšties forma. Vienkomponenčiai folio rūgšties preparatai išleidžiami tablečių, kietųjų ar minkštųjų kapsulių formomis. Vis daugiau rinkoje atsiranda ekstraktų su folio rūgštimi, vartojamų lašelių forma. Daugiakomponenčiai preparatai gali būti kapsulių ar tablečių forma, taip pat tiesiai burnoje ar prieš vartojimą vandenyje disperguojamų granulių pavidalu. Preparatuose vartojami įvairūs folio rūgšties kiekiai. Preparatuose, kuriuose yra vien folio rūgštis, šio vitamino kiekiai varijuoja dažniausiai nuo 400 µg iki 1000 µg, tai atitinkamai sudaro 200 proc. ir 500 proc. RPN. Šie preparatai dažniausiai skiriami esant hipovitaminozei arba padidėjus folio rūgšties poreikiui. Daugiakomponenčiuose preparatuose, folio rūgšties kiekis dažniausiai būna 200 µg arba 400 µg, kurie skirti papildyti kasdienę mitybą vitaminu B9.
Remiantis Europos Komisijos 2012 metais parengtu dokumentus, kuriame pateikiami rekomenduojami maisto produktų ir maisto papildų sudėtyje esančių medžiagų nuokrypiai. Leistini nuokrypiai maisto papilduose nuo deklaruojamų pakuotės ženklinime kiekių skiriasi.. Vitaminams leidžiamas nuokrypis +50 proc. ir -20 proc. nuo deklaruojamo kiekio, o tuo tarpu mineralinėms medžiagoms +45 proc. ir -20 proc. nuo pakuotės ženklinime nurodyto kiekio [1].
1.15. Folio rūgšties preparatų analizė
Tiek vienkomponenčiai folio rūgšties preparatai, tiek kompleksiniai multivitaminų su folio rūgštimi maisto papildai, kaip ir daugelis kitų vandenyje tirpių junginių gali būti tiriami daugeliu skirtingų analizės metodų [5]. Vandenyje tirpaus vitamino - folio rūgšties analizei gali būti pritaikomi įvairūs metodai: titrimetriniai analizės metodai, mikrobiologinė analizė, taip pat spektrofotometrija, kapiliarų elektroforezė bei, bene dažniausiai naudojami metodai, efektyvioji ar paprastoji plonasluoksnė chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija su skirtingomis šio metodo manipuliacijomis [9][90][38].
1.15.1.Plonasluoksnė chromatografija
Kiekybinei folio rūgšties analizei plonasluoksnė chromatografija (PC), yra naudojama vis rečiau. PC – metodas naudojamas dėl nedidelės kainos, paprastos atlikimo metodikos, gana didelio jautrumo bei atkartojamumo. Šis metodas puikiai gali būti pritaikomas įvairių medžiagų
identifikavimui tiek vaisto formose, tiek biologiniuose skysčiuose, cheminių ar biologinių vaistinių preparatų sudėties vertinimui, taip pat pesticidų, kitų priemaišų ar vaistinių medžiagų irimo produktų nustatymui. Šis metodas plačiai gali būti pritaikomas kokybinei analizei, tačiau sunkesnis jo pritaikomumas atliekant kiekybinę analizę [72].
PC – skysčių chromatografijos atmaina, kurioje mobili fazė – skystis, o stacionari fazė – plonas sorbento sluoksnis, padengtas ant plokštelės (aliuminio, stiklo ar kt.) Tirpiklis, kildamas plokštele perneša analites. Mobilios fazės judėjimo greitis priklauso nuo fazės lakumo, analičių tirpumo jame bei nuo to, kaip stipriai stacionari fazė pritraukia medžiagas. PC, pagal atskyrimo mechanizmą gali būti skirstoma (absorbcijos, skirstymo, jonų mainų, dydžio sklaidos). Absorbcijos metodas praktikoje naudojamas bene dažniausiai, nes pasižymi didžiausiu jautrumu. Tačiau net ir ši metodo variacija nėra efektyvi, lyginant su ESC. Pavyzdžiui, ESC kolonėlėje galima išskirti 10000-20000 teorinių plokštelių, kai tuo tarpu PC vidutiniškai išskiriama tik 5000 teorinių plokštelių [72].
1.15.2.Folio rūgšties analizės PC metodu pavyzdžiai
Plonasluoksnės chromatografijos metodas folio rūgšties kokybinei analizei pateikiamas Europos farmakopėjoje (Eur. Ph. 2.2.27). Tiriamieji tirpalai ruošiami 50 mg tiriamosios medžiagos ištirpinant 100 ml amonio ir metanolio mišinio (2:9 V/V). Palyginamasis tirpalas gaminamas lygiai taip pat, panaudojant 50 mg folio rūgšties CRS standartą. Plokštelė – PC silikagelio G plokštelė. Mobili fazė – koncentruotas amonio hidroksido tirpalas, propanolis, 96 proc. etanolis (20:20:60 V/V/V). Užnešamasis mėginio tūris - 2µl, judančios fazės kelias – ¾ plokštelės, džiovinimas atliekamas ore. Analizė atliekama panaudojant 365 nm ilgio UV šviesą. Lyginamos tiriamųjų ir standartinio tirpalo dėmių fluorescencija, dydis. [24].
2015 metais Sempombe J. ir kiti mokslininkai pritaikė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodiką su densitometrine analize folio rūgšties kiekio nustatymui tabletėse. Darbiniams ir standartiniams tirpalams ruošti buvo naudojamas amonio 13,5 M ir metanolio mišinys (2:9 V/V), paruošti 0,125 mg/ml tirpalai. Mobili fazė - etilo acetato, metanolio ir amonio tirpalas (15:15:0,5 V/V/V). Analizei buvo naudotos EPC chromatografinės plokštelės, dengtos silicio geliu. Ant plokštelės užnešamas mėginio tūris – 5 µl, plokštelė chromatografinėje kameroje laikoma 25 min., išdžiovinta karšto oro srove, plokštelė analizuojama panaudojant 280 nm bangos ilgio šviesą. Metodas tinkamas kokybinei ir kiekybinei folio rūgšties analizei, kurį nesunkiai galima pritaikyti rutininei medžiagos analizei [73].
1.15.3.Efektyvioji skysčių chromatografija
Bene dažniausiai folio rūgšties analizei šiuo metu yra naudojamas skysčių chromatografijos metodas, įvairios jo variacijos, panaudojant skirtingus detektorius. Be to, ESC aprašytas kaip oficialus analizės metodas tiek Europos, tiek JAV farmakopėjose [24][38]. ESC metodas dažniausiai naudojamas kaip analitinė atskyrimo technika, dėl geriausio pritaikymo nelakių ar termolabilių junginių analizei. Šis metodas yra gana jautrus, selektyvus ir efektyvus, labai plačios jo pritaikymo galimybės, todėl dažnai naudojamas analizės praktikoje [5].
ESC – kolonėlinis skirstymo metodas, kurio metu judančioji fazė – skystis, neša analitę per kolonėlę, pripildytą stacionarios fazės. Pastaroji pasižymi skirtingu giminingumu analitėms, dėl šios priežasties skiriasi analičių sulaikymo laikas, tai padeda identifikuoti skirtingas mėginyje esančias medžiagas. Atsižvelgiant į stacionarios ir mobilios fazės savybes, išskiriami du ESC metodai – normalių fazių (stacionari fazė labiau polinė nei judančioji fazė) ir atvirkštinių fazių (judančioji fazė labiau polinė nei stacionari) [40]. Analičių identifikavimas ir kiekybinės analizės tikslumas priklauso nuo tyrime naudojamų kolonėlių matmenų bei jas pripildančio sorbento, mobilios fazės tipo ir fizikinių – cheminių analizuojamų medžiagų savybių [45].
1.15.4.Folio rūgšties analizės ESC metodu pavyzdžiai
Folio rūgšties analizei buvo pritaikyta ir validuota ESC metodika. Mobili fazė - 0,1 proc. trifluoracto rūgšties ir acetonitrilo mišinys (80:20 V/V), kurio tėkmės greitis - 1,5 ml/min, palaikoma pastovi 25 ºC temperatūra. Detekcijai naudotas UV detektorius, esant 290 nm bangos ilgiui. Šis metodas gali būti puikiai pritaikytas net mažoms folio rūgšties koncentracijoms (0,1 µg/ml), todėl jis tinkamas folio rūgšties analizės metodas skirtingose farmacinėse formose [22].
Dar viena, E. Deconinck ir tyrimo bendraautorių pritaikyta ir validuota ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika folio rūgšties nustatymui farmaciniuose preparatuose. Mobilioji fazė - 0,1 proc. metano rūgšties ir acetonitrilo (80:20 V/V) mišinys, tėkmės greitis – 0,3 ml/min. Folio rūgšties nustatymas atliktas prie 285 nm bangos ilgio. Šį metodą palyginus su ESC metodu, net 50 proc. sutrumpėjo analizės laikas bei analizei reikalingo tirpiklio kiekis, pritaikyti lengviau pagaminami vandeninės fazės tirpalai [19].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo planavimas
Remiantis moksliniais literatūros šaltiniais folio rūgšties identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui pasirinkti du chromatografiniai metodai. Tyrimas buvo atliekamas plonasluoksnės chromatografijos bei efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimui pasirinkti 9 vienkomponenčiai (6 įsigyti Lietuvos vaistinėse, 3 JAV vaistinėse) bei 4 kompleksiniai maisto papildai, kurių sudėtyje yra folio rūgšties.
Tiriami preparatai:
Vienkomponentis maisto papildas (Jamieson Laboratories Ltd., Kanada), 1 tabletėje 1000 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojančios medžiagos dikalcio fosfatas, riebalų rūgščių magnio druskos, mikrokristalinė celiuliozė, stabilizatorius skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė.
Vienkomponentis maisto papildas („PHARMACY Laboratories s.c.“, Lenkija), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: emulsiklis mikrokristalinė celiuliozė, bulvių krakmolas, lipnumą reguliuojančios medžiagos: riebalų rūgščių magnio druskos ir silicio dioksidas.
Vienkomponentis maisto papildas (Vitabalans Oy, Suomija), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: stabilizatoriai difosfatas ir polivinilpirolidonas, lipnumą reguliuojančios medžiagos: celiuliozė, riebalų rūgščių magnio druskos ir silicio dioksidas.
Vienkomponentis maisto papildas ( „Healthilife Limited“, Jungtinė Karalystė), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: užpildai - dikalcio fosfatas, mikrokristalinė celiuliozė, stabilizatorius karboksimetilceliuliozė, magnio stearatas.
Vienkomponentis maisto papildas, (pagaminta ES pagal UAB „EDV Baltija“ (Vilnius) užsakymą), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojanti medžiaga kalcio fosfatas, emulsiklis mikrokristalinė celiuliozė, stabilizatorius natrio karboksimetilceliuliozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos: riebalų rūgščių magnio druskos, silicio dioksidas.
Vienkomponentis maisto papildas (UAB Valentis, Lietuva), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojanti medžiaga dikalcio fosfatas, emulsiklis mikrokristalinė celiuliozė, stabilizatorius skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos: riebalų rūgščių magnio druskos, silicio dioksidas.
Vienkomponentis maisto papildas (REXALL SUNDOWN, INC., JAV, Boca Raton), 1 tabletėje 800 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: celiuliozė, dikalcio fosfatas, silicio dioksidas, magnio stearatas.
Vienkomponentis maisto papildas (NEW FOODS, JAV, Bloomingdale), 1 tabletėje 800 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas.
Vienkomponentis maisto papildas (Continental Vitamin Company, JAV, Los Angeles, pagal SuperiorSource užsakymą), 1 tabletėje 1200 µg folio rūgšties. Pagalbinės medžiagos: laktozė, akacijos derva.
Kompleksinis maisto papildas (Swanson Health Products Inc.,JAV), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Sudėtyje yra: vitaminas A (1720 µg) vitaminas C (90 mg), vitaminas D (10 µg), vitaminas E (22 mg), vitaminas K (25 µg), vitaminas B1 (2,25 mg), vitaminas B2 (2,6 mg), niacinas (20 mg), vitaminas B6 (3 mg), vitaminas B12 (9 µg), biotinas (25 µg), pantoteno rūgštis (10 mg), geležis (27 mg), jodas (150 µg), magnis (100 mg), cinkas (15 mg), selenas (25 µg), varis (2 µg), manganas (5 mg), chromas (25 µg), molibdenas (25 µg), kalis (57,2 mg). Pagalbinės medžiagos: stabilizatorius skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, magnio stearatas, išgrynintas vanduo, glajinė medžiaga, hidroksipropilmetilceliuliozė, akacijų sakai, maltodekstrinas
Kompleksinis maisto papildas (UAB „Aconitum“, Lietuva), 1 tabletėje 500 µg folio rūgšties. Sudėtyje yra vitaminas C (100 mg), magnis (56,25 mg), L-karnitinas (30 mg), vitaminas E (20 mg), juodojo eleuterokoko ekstraktas (20 mg), L-argininas (20 mg), niacinas (20 mg), cinkas (15 mg), geležis (14 mg), pantoteno rūgštis (10mg), vitaminas B6 (1,54 mg), vitaminas B2 (1,54 mg), vitaminas B1 (1,21 mg), varis (1000 µg), vitaminas A (800 µg), jodas (150 µg), selenas (55 µg), biotinas (50 µg), chromas (40 µg), vitaminas D3, (5 µg), vitaminas B12 (3 µg) Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojančios medžiagos: kalcio fosfatas, mikrokristalinė celiuliozė, tabletės apvalkalas: lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgštys, (emulsiklis hidroksipropilceliuliozė, lipnumą reguliuojanti medžiaga celiuliozė, emulsiklis hidroksipropilmetilceliuliozė, lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgštys, dažikliai geležies dioksidas ir indigo karminas).
Kompleksinis maisto papildas (VITABIOTICS LTD., Jungtinė Karalystė), 1 tabletėje 200 µg folio rūgšties. Sudėtyje yra magnis (75 mg), vitaminas C (40 mg), linų sėmenų aliejus (114 mg), vitaminas E (10 mg), vitaminas B3 (9 mg), cinkas (7,5 mg), geležis (7 mg), pantoteno rūgštis (4 mg), vitaminas B1 (0,9 mg), vitaminas B2 (0,8 mg), vitaminas B6 (0,7 mg), vitaminas A (400 µg),
jodas (75 µg), biotinas (25 µg), manganas (0,3 mg), varis (200 µg), selenas (20 µg), chromas (10 µg), vitaminas D (10 µg), vitaminas B12 (3 µg). Pagalbinės medžiagos: saldikliai ksilitolis ir sukralozė, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis, dažiklis burokėlių raudonasis, lipnumą reguliuojačios medžiagos: silicio dioksidas, stearino rūgštis, riebalų rūgščių magnio druskos.
Kompleksinis maisto papildas (UAB New Nordic Healtbrands AB, Švedija), 1 tabletėje 400 µg folio rūgšties. Sudėtyje yra karčiavaisių citrinvyčių vaisių ekstraktas (11,7 mg), pilkųjų malpigijų vaisių ekstraktas (6 mg), kalcis (26,7 mg), magnis (83 mg), vitaminas C (30 mg), vitaminas E (10 mg), cinkas (7,5 mg), vitaminas B3 (6 mg), vitaminas B5 (2 mg), vitaminas B6 (1 mg), vitaminas B2 (0,87 mg), manganas (0,83 mg), vitaminas B1(0,75 mg), vitaminas A (400 µg), varis (33,33 µg), jodas (75 µg), biotinas (50 µg), molibdenas (50 µg), selenas (42 µg), vitaminas K1 (23,33 µg), chromas (8,33 µg), vitaminas D3(3.33 µg), vitaminas B12 (3 µg). Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė celiuliozė, kietiklis trikalcio fosfatas, stabilizatorius riebalų rūgščių magnio druskos, tirštikliai bulvių krakmolas, hidroksipropilmetilceliuliozė, lipnumą reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas, glajinė medžiaga karnaubo vaškas.
2.3. Aparatūra ir priedai
Grūstuvė ir piestelė;
Analitinės svarstyklės Shimadzu AUW12D (Duisburg, Vokietija);
Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Ohio, JAV);
Chomafil membraninis filtras (PTFE 25 mm diametro, 0,45 µm dydžio poros, Macherey-Nagel, Vokietija);
20 cm aukščio ir 20 cm pločio stiklinės chromatografinės plokštelės (TLC PLATE, MERCK, Silica 60F-254 ON GLAS, SIGMA-ALDRICG, Vokietija);
Stiklinė plonasluoksnės chromatografijos kamera su metaliniu dangčiu CAMAG Twin Trough Chamber 20x20 cm (Camag, Muttenz, Šveicarija);
Pusiau automatinis mėginių užnešėjas Camag Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija);
Mikrošvirkštas 100 µl, (Camag Linomat Syringe, Muttenz, Šveicarija);
Plonasluoksnės chromatografijos vizualizatorius CAMAG TLC Vilualizer kartu su kompiuterine programine įranga VideoScan (Camag, Muttenz, Šveicarija);
Centrifuga Centurion Scientific C2 Series (Anglija);
Skysčių chromatografas „Waters Alliance e2695“ (Waters Corporation, Milford, JAV);
Fotodiodų matricos detektorius „Waters 2998 PDA“ (Waters Corporation, Milford, JAV);
ACE18 chromatografinė kolonėlė 150 × 4,6 mm, 1,7 µm (Advanced Chromatography Technologies, Scotland).
2.4. Naudoti reagentai
Metanolis (grynumas ≥ 99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
Amonio hidroksidas 25 proc. (grynumas ≥ 99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
1 – propanolis (grynumas ≥ 99.0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
Etanolis 96 proc. ( AB „Stumbras“, Lietuva);
Natrio šarmas (grynumas ≥ 98 proc., Sigma - Aldrich Corporation, Vokietija);
Išgrynintas vanduo(LSMU laboratorija);
Folio rūgštis (grynumas ≥ 97 proc., Sigma - Aldrich Corporation, Vokietija);
Acetonitrilas ( grynumas ≥ 99,9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
Trifluoracto rūgštis (grynumas ≥ 99.0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
Dejonizuotas vanduo, paruoštas išgryninto vandens paruošimo sistema „Millipore“ (JAV, Bedford, MA).
2.5. Etaloninių tirpalų paruošimas
Etaloniniai tiriamųjų medžiagų tirpalai buvo ruošiami naudojant standartinį folio rūgšties mėginį. Analitinėmis svarstyklėmis atsvertas tikslus 0,001 g folio rūgšties standarto kiekis, perkeliamas į 10 ml talpos matavimo kolbą ir tirpinamas ~ 9 ml metanolio ir 25 proc. amonio hidroksido (9:2 V/V) mišinio – PC analizei ir 0,1 M NaOH tirpalo – ESC analizei. Pilnam medžiagos ištirpinimui buvo panaudota ultragarso vonelė BioSonic UC100, kurioje tirpalas veikiamas ultragarsu 10 min., esant kambario temperatūrai. Gautas tirpalas tiksliai praskiedžiamas tuo pačiu tirpikliu iki 10 ml žymos, sumaišoma. Vėliau tirpalas filtruojamas per 0,45 µm filtrą į buteliuką. Paruoštas mėginys, tamsioje vietoje, kambario temperatūroje, paliekamas tolimesnei analizei.
2.6. Tiriamųjų tirpalų paruošimas
Darbiniai preparatų tirpalai paruošti iš vienkomponenčių bei daugiakomponenčių maisto papildų. Tiek PC, tiek ESC metodais atliekamai analizei tirpalai buvo ruošiami panašiai, skyrėsi tik naudoti tirpikliai.
Nedengtos vienkomponentės folio rūgšties tabletės susmulkinamos grūstuvėje iki homogeniškų miltelių, kurie pasveriami analitinėmis svarstyklėmis ir kiekybiškai perkeliami į 10 ml talpos tikslaus matavimo kolbą. Iš tablečių gauti milteliai tirpinami ~9 ml tirpiklio: PC metodui – metanolio ir 25 proc. amonio hidroksido (9:2 V/V) mišinys; ESC metodui – 0,1M NaOH tirpalas. Gautas tirpalas patalpinamas į ultragarso vonelę BioSonic UC100, kurioje veikiamas ultragarsu 10 min., esant kambario temperatūrai. Išėmus iš ultragarso vonelės tirpalas praskiedžiamas anksčiau naudotu tirpikliu tiksliai iki 10 ml žymos, sumaišoma. Tirpalas filtruojamas per 0,45 µm PTFE (politetrafluoroetileno) filtrą į buteliuką, gautas ekstraktas paliekamas tolimesnei analizei.
Nedengtos ir dengtos kompleksinių mišinių su folio rūgštimi tabletės, ESC analizei, susmulkinamos grūstuvėje iki homogeniškų miltelių pavidalo, kurie pasveriami analitinėmis svarstyklėmis. Milteliai kiekybiškai perkeliami į 10 ml tikslaus matavimo kolbą, kurioje tirpinami ~9 ml 0,1M NaOH tirpalo. Kolbutė su tirpalu dedama į ultragarso vonelę BioSonic UC100 ir tirpalas veikiamas ultragarsu 10 min, esant kambario temperatūrai. Gautas tirpalas praskiedžiamas 0,1M NaOH tirpalu tiksliai iki 10 ml žymos, sumaišoma. Praskiestas tirpalas perkeliamas į centrifugavimo mėgintuvėlį ir dedamas į centrifugą 5 minutėms, esant 2500 rmp apsisukimų dažniui. Centrifugatas nupilamas nuo atsiskyrusių nuosėdų ir skystis dar filtruojamas per 0,45 µm PTFE membraninį mikrofiltrą į buteliukus, gautas ekstraktas paliekamas tolimesnei analizei.
2.7. Analizė PC metodu
Naudojant paruoštus etaloninius ir tiriamuosius tirpalus, pirmiausia nustatomos tinkamos folio rūgšties analizės atlikimo sąlygos. Panaudojant pusiau automatinį mėginių užnešiklį CAMAG Linomat 5 ir mikrošvirkštą, ant stiklinės silikageliu dengtos chromatografinės plokštelės užnešami pagaminti etaloniniai ir tiriamieji tirpalai. Užnešamas mėginių tūris - 15 µl. Mėginiai ant plokštelės išpurškiami dideliu azoto slėgiu, suformuojant pailgą brūkšnio formos dėmę. Plokštelė su užneštais ir išdžiuvusiais mėginiais perkeliama į chromatografavimo kamerą, pripildytą tirpiklių sistema (96 proc. etanolis, 25 proc. amonio hidroksidas ir propanolis, 6:2:2 V/V/V). Tirpiklių sistemai pakilus plokštele iki nustatyto aukščio, ji išimama ir išdžiovinama ore. Išdžiuvusi plokštelė dedama į vizualizatorių, kuriame
apšviečiama UV spinduliuotės 366 nm bangos ilgio šviesa. Apskaičiuotas sulaikymo faktoriaus (Rf) dydis, kuris naudojamas medžiagų kokybei nustatyti. Šis faktorius apskaičiuojamas įvertinant santykį tarp kelio, kurį plokštele nukeliavo tiriamasis junginys (L1) (matuojamas atstumas iki plokštele pakilusios dėmės vidurio) ir viso tirpalo nukeliauto atstumo plokštele, t.y. 10 cm (L2).
Kiekybinis nustatymas atliekamas įvertinant identifikuotų analičių smailių plotą po kreive, kuris priklauso nuo medžiagos koncentracijos užneštame tirpale. Kiekybiniam medžiagos nustatymui buvo sudaryta tiesinės regresijos kalibracinė kreivė. Kalibracinių kreivių sudarymui, PC metodu buvo pagamintas 0,4 mg/ml koncentracijos tirpalas, kuris skiedžiamas metanolio ir 25 proc. amonio hidroksido (9:2 V/V) mišiniu. Atliekami 4 skiedimai, kurių metu gaunami 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml ir 0,025 mg/ml koncentracijų tirpalai. Ant chromatografinės plokštelės užpurškiama po 15 µl kiekvieno tirpalo. Chromatografinė plokštelė su mėginiais įdėta į chromatografavimo kamerą, prisipildžiusią tirpiklių sistemos garų. Tirpikliui pakilus, plokštelė išimama, išdžiovinama ore ir įdėjus į vizualizatorių apšviečiama UV spinduliuotės 366 nm bangos ilgio šviesa. Panaudojant programinę įrangą VideoScan įvertinti skirtingos koncentracijos etaloninių tirpalų chromatogramos smailių plotai po kreive, sudarytas kalibracinis grafikas.
2.8. Analizė ESC metodu
Folio rūgštis tiriamuosiuose mėginiuose identifikuota pagal UV šviesos absorbcijos spektrus, esant didžiausiai šviesos sugerčiai bei pagal standartinio mėginio ir tirtuosiuose mėginiuose nustatytas medžiagos sulaikymo trukmes. ESC kokybinės ir kiekybinės analizės atlikimui naudotas skysčių chromatografas „Waters Alliance e2695“ kartu su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“. Medžiagų atskyrimui naudota ACE18 chromatografinė kolonėlė, pripildyta sorbento, kurio dalelių dydis 1,7 µm, kolonėlės matmenys: 150 mm ilgio ir 4,6 mm skersmens. Visos analizės metu termostate buvo palaikoma pastovi 35º C temperatūra. Tirpalo injekcijos tūris, naudotas analizei – 10 µl. Judrios fazės tėkmės greitis – 1,0 ml/min. Šios analizės sąlygos pasirinktos remiantis mokslininkų jau atliktais tyrimais [92]. Atliekamai analizei pritaikyta dviejų eliuentų gradientinė sistema: 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalas (A) ir acetonitrilas (B), pasirinkti atsižvelgiant į anksčiau atliktų tyrimų metodikas [32][12]. Eliuento sudėties kitimas priklausomai nuo chromatografavimo laiko pateikiamas 4 lentelėje. Bendra chromatografavimo trukmė - 24 minutės.
4 lentelė. Eliuento sudėties kitimas priklausomai nuo chromatografavimo laiko
Chromatografavimo laikas (min) 0,1 proc. trifluoracto rūgštis (A) Acetonitrilas (B) 00:00 98,0 2,0 00:01 98,0 2,0 00:20 2,0 98,0 00:23 2,0 98,0 00:24 98,0 2,0
Chromatogramose aptiktų smailių identifikavimas atliktas lyginant tirtųjų analičių ir standartinių mėginių sulaikymo trukmes bei UV absorbcijos spektrų 190 – 400 nm ribose sutapimus. Analizuojamų mėginių detekcija atlikta esant 288 nm šviesos bangos ilgiui. Nustatytų duomenų analizei panaudota programinė įranga Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, USA).
Kiekybiniam folio rūgšties įvertinimui sudaryta kalibracinė kreivė, naudojant 5 skirtingų koncentracijų tirpalus, kuriems gauti buvo pagamintas 100 µg/ml standartinis tirpalas, atliekami skiedimai 0,1M NaOH tirpalu. Pagaminti ir kalibracinio grafiko sudarymui naudoti 100 µg/ml, 50 µg/ml, 12,5 µg/ml, 3,125 µg/ml, 1,5625 µg/ml tirpalai. Kalibracinis grafikas buvo sudarytas tiriamos medžiagos smailės ploto priklausomybės nuo tiriamos medžiagos koncentracijos mėginyje būdu.
2.9. Duomenų apdorojimas
Nustatytiems duomenims analizuoti buvo naudotos Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV), SPSS 22.0 (IBM, JAV), Camag VisionCATS v2.0 (Camag, Muttenz, Šveicarija), Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) kompiuterinės programos.
