MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
JONAS LEONAVIČIUS
Muscimolio ir laisvųjų aminorūgščių analitinis tyrimas
raudonųjų musmirių (Amanita muscaria L.) grybuose
chromatografiniais metodais
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Doc. dr. Daiva Kazlauskienė
Kaunas 2019
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Prof. Dr. Ramunė Morkūnienė……… (parašas) Data:
Muscimolio ir laisvųjų aminorūgščių analitinis tyrimas raudonųjų
musmirių (Amanita muscaria L.) grybuose chromatografiniais metodais
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Daiva Kazlauskienė………. Data: (parašas)
Recenzentas Darbą atliko Magistrantas ……… Jonas Leonavičius…………. (parašas) (parašas) Data: Data: Kaunas 2019
TURINYS
TURINYS……….………3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 7 SANTRUMPOS ... 8 1. ĮVADAS ... 92. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11 3.1. Nuodų savybės ... 12 3.2. Klinika ... 13 3.3. Veikimo mechanizmas ... 14 3.4. Farmakokinetika ... 15 3.5. Toksiškumas ... 15 3.6. Gydymas... 16
3.7. Terapinės muscimolio savybės... 16
3.8. Tyrimo metodika ... 18
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ... 20
4.1. Įranga ... 20
4.2. Medžiagos ... 21
4.3. Tyrimo metodika ... 21
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 23
5.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas muscimolio kiekybinei ir kokybinei analizei ... 23
5.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas muscimolio kiekybinei ir kokybinei analizei ... 27
5.3. Muscimolio kiekio tyrimas raudonosiose musmirėse, taikant ESC ir EPC metodikas ... 29
5.4. Muscimolio kiekio palyginimas raudonosiose musmirėse, augančiose skirtingose Lietuvos vietovėse ... 30
5.5. Laisvųjų aminorūgščių nustatymas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu .... 31
5.6. Laisvųjų aminorūgščių kiekybinis palyginimas tarp A. muscaria L., pluoštinių kanapių sėklų ir sėjamųjų grikių sėklų, taikant DC-MS metodą ... 34
6. IŠVADOS... 36
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 38
SANTRAUKA
Muscimolio ir laisvųjų aminorūgščių analitinis tyrimas raudonųjų musmirių (Amanita muscaria L.) grybuose chromatografiniais metodais.
Jono Leonavičiaus magistro baigiamojo darbo vadovas doc. dr. Daiva Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas; Farmacijos fakultetas, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas.
Darbo tikslas. Atlikti raudonųjų musmirių (Amanita muscaria L.) biologiškai aktyvių medžiagų analizę: įvertinti muscimolio kiekio varijavimą raudonosios musmirės vaisiakūniuose, surinktuose skirtingose Lietuvos vietovėse, taip pat įvertinti laisvųjų aminorūgščių kiekinę sudėtį ir palyginti su kitų augalų laisvųjų aminorūgščių kiekine sudėtimi.
Darbo uždaviniai. 1. Nustatyti tinkamas iboteno rūgšties dekarboksilinimo ir muscimolio ekstrakcijos iš grybų sąlygas; 2. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos sąlygas muscimoliui identifikuoti raudonosiose musmirėse; 3. Pritaikyti kiekybinį efektyviosios skysčių chromatografijos metodą muscimolio kiekiui įvertinti raudonosiose musmirėse ir jį validuoti. 4. Palyginti muscimolio kiekį raudonosiose musmirėse, surinktose skirtingose Lietuvos vietovėse. 5. Įvertinti laisvųjų aminorūgščių kiekį raudonosiose musmirėse ir palyginti su kitų augalų laisvųjų aminorūgščių kiekine sudėtimi.
Rezultatai ir išvados: Pritaikytos tinkamiausios muscimolio ekstrakcijos iš Amanita muscaria L. sąlygos, naudojant grybų liofilizavimą ir ekstrahuojant 70 proc. metanoliu. Tinkamiausios iboteno rūgšties dekarboksilinimo sąlygos : 75 C. Pritaikytos plonasluoksnės chromatografijos sąlygos muscimoliui identifikuoti Amanita muscaria L. vaisiakūniuose tirpiklių sistema : 1-butanolis: 70 proc. metanolis: acto rūgštis: distiliuotas vanduo (75:25:5:7,5), RF = 0,25 0,01. Validuota muscimolio
kiekybinio nustatymo ESC metodika, pagal kurią nustatomas muscimolio kiekis Amanita muscaria L. kalibracinės kreivės koncentracijos ribos 0,39 – 125 μg/ml. Įvertinus muscimolio kiekį grybuose, surinktuose skirtingose Lietuvos vietovėse, nustatyta, kad didžiausias muscimolio kiekis rastas Druskininkų rajono grybuose - 60 μg/ml, mažiausias – Klaipėdos - 37 μg/ml. Augimvietė statistiškai reikšmingų pokyčių muscimolio kiekio varijacijoje neturi. ESC yra efektyvesnis metodas, vertinant muscimolio kiekio varijavimą paprastosiose musmirėse, lyginant su EPC. Įvertinus ir palyginus aminorūgščių kiekinę sudėtį, esančią raudonųjų musmirių vaisiakūniuose su esančia pluoštinių kanapių ir sėjamųjų grikių sėklose, nustatyta, kad didžiausias kiekis laisvųjų aminorūgščių aptiktas raudonosiose musmirėse.
SUMMARY
Detection of muscimol and free amino acids in Amanita muscaria L. mushrooms using chromatography methods.
Jonas Leonavičius final thesis for Master's degree/ scientific supervisor doc.dr. Daiva Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences; Faculty of Pharmacy, department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas.
Aim of the work. To carry out an analysis of the biologically active substances of death-cup (Amanita muscaria L.): to evaluate the variation of muscimol content in red flesh collected in different places of Lithuania, as well as to evaluate the quantity of amino acids and to compare the aminoacids content of other plants
Tasks of work. 1. Apply the most appropriate conditions for muscimol extraction from Amanita muscaria L. Determine the conditions for decarboxylation of ibotenic acid to produce the maximum amount of muscimol. 2. Apply thin-layer chromatography conditions to the identification of muscimol in Amanita muscaria L. fetuses. 3. Apply a quantitative liquid chromatography method for the evaluation and validation of muscimol levels in Amanita muscaria L. fruit cells. 4. Compare the amount of muscimol in the death-cup collected in different areas of Lithuania. 5. Evaluate the amino acid content of the Amanita muscaria L. in the corpus luteum and compare it with the aminoacid content of other plants.
Conclusions : 1. Suitable conditions for muscimol extraction from Amanita muscaria L. have been applied using lyophilization of mushrooms and extraction by 70 %. methanol. Preferred conditions for decarboxylation of ibotenoic acid: 75 C. 2. Adjusted thin-layer chromatography conditions for muscimol to identify Amanita muscaria L. in the corpus luteum solvent system: 1-butanol: 70 %. methanol: acetic acid: distilled water (75: 25: 5: 7.5), RF = 0.25 250.01. 3. Validated HPLC methodology for quantification of muscimol by measuring the concentration of muscimol in Amanita muscaria L. calibration curve concentration range of 0,39 to 125 μg/ml. 4. Evaluated the amount of muscimol in fungi collected in different areas of Lithuania, it was found that the highest amount of muscimol was found in mushrooms of Druskininkai district - 60 μg/ml, the lowest - in Klaipeda - 37 μg/ml. The plant site does not have statistically significant changes in the variation of muscimol levels. The HPLC is a more effective method for evaluating the variation of muscimol levels in plain monkeys compared to HPTLC. 5. After evaluation and comparison of the amino acid content of Amanita muscaria L. in the honeysuckle and buckwheat seedlings, the highest levels of free aminoacids were found in the red larvae.
PADĖKA
Už suteiktas darbo sąlygas atliekant mokslinį tiriamąjį darbą „Muscimolio ir laisvųjų aminorūgščių analitinis tyrimas raudonųjų musmirių (Amanita muscaria L.) grybuose chromatografiniais metodais“ dėkoju analizinės ir toksikologinės katedros vedėjui, prof. Liudui Ivanauskui. Už konsultacijas ir patarimus ruošiant literatūros apžvalgą ir parenkant tyrimo metodikas, magistrinio darbo vadovei doc.dr. Daivai Kazlauskienei. Taip pat už suteiktas konsultacijas, vykdant eksperimentinę dalį, lekt. Mindaugui Marksai ir doktorantui Ivan Bezruk.
SANTRUMPOS
AR – aminorūgštys
BSTFA – N,O-bis(trimetil-silil)-trifluoroacetamidas CNS – Centrinė nervų sistema
DC-MS – dujų chromatografija – masių spektrometrija EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ESC – efektyvioji skysčių chromatografija GASR – -amino-sviesto rūgštis
LD – lėtali dozė
MBSTFA – N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoracetamidas NMDA – N-metil-D-asparto rūgštis
NO – noradrenalinas
TBDMS – tert-butildimetilsilyl eteris TFA – trifluoracto rūgštis
THF – tetrahidrofuranas THIP – gaboksadolis
1. ĮVADAS
Daugybę amžių visame pasaulyje grybai buvo naudojami kaip maistinė ir kaip medicininė žaliava. Grybai kaupia daug naudingų medžiagų: angliavandenius, baltymus, aminorūgštis ir mineralines medžiagas. Taip pat juose randama biologiškai aktyvių metabolitų, šias savybes labai vertina liaudies mediciną propaguojantys asmenys [1]. Grybai yra baltymų šaltinis ir pasižymi stipriomis maistinėmis ir energetinėmis savybėmis. Neatsiejama grybų karalystės dalis yra nuodingieji grybai, kurie savo sudėtyje kaupia nuodingąsias, haliucinogenines medžiagas. Europoje skaičiuojama 1000 nuodingų grybų rūšių. Lietuvos parkuose, miškuose kol kas žinoma per 100 rūšių, iš kurių apie 30 yra labai pavojingi žmogaus gyvybei.
Vienas gražiausių sutinkamų grybų Lietuvos miškuose yra raudonoji (paprastoji) musmirė
Amanita muscaria L., kuri savo sudėtyje kaupia iboteno rūgštį ir muscimolį. Norint gauti muscimolį,
būtina atlikti iboteno rūgšties dekarboksilinimą. Muscimolis – medžiaga, pasižyminti geru tirpumu vandenyje. Tai yra psichoaktyvus izoksazolas, kurį kaupia raudonoji musmirė. Veikia kaip haliucinogenas,
-
amino-sviesto rūgšties A (GASR A) receptorių agonistas [6].Intoksikacijos metu reikalinga itin greita ir efektyvi analizė, tačiau itin mažai tyrimų, kurie nurodytų tinkamiausią ir efektyviausią muscimolio nustatymo metodiką. Paprastosios musmirės cheminės analizės tyrimai įrodė, kad jos žaliavos sudėtyje yra aminorūgščių, tačiau nėra atliktų aminorūgščių kiekio palyginamųjų tyrimų.
Eksperimentinėje dalyje buvo taikomos efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodikos kiekybiniam ir kokybiniam muscimolio kiekiui nustatyti. Buvo įvertintas muscimolio kiekis žaliavose, surinktose skirtinguose Lietuvos regionuose, taip pat metodikos ir gauti rezultatai buvo lyginami tarpusavyje. Kadangi grybai yra baltymų šaltinis, o pastarieji sudaryti iš aminorūgščių, buvo pritaikyta dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodika (DC-MS) laisvųjų aminorūgščių kiekiui nustatyti. Gauti rezultatai buvo lyginami su laisvųjų aminorūgščių kiekiu, rastu pluoštinių kanapių sėklose (Cannabis sativa L.) ir sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum L.) sėklose. Buvo vertinama, ar raudonoji musmirė būtų energetine verte turtingas augalas, jei sudėtyje nebūtų toksinių medžiagų. Ši žaliava buvo pasirinkta todėl, kad trūksta duomenų apie jų kaupiamas medžiagas.
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Atlikti raudonųjų musmirių (Amanita muscaria L.) biologiškai aktyvių medžiagų analizę: įvertinti muscimolio kiekio varijavimą raudonosios musmirės vaisiakūniuose, surinktuose skirtingose Lietuvos vietovėse, taip pat įvertinti laisvųjų aminorūgščių kiekinę sudėtį ir palyginti su kitų augalų laisvųjų aminorūgščių kiekine sudėtimi.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti tinkamas iboteno rūgšties dekarboksilinimo ir muscimolio ekstrakcijos iš grybų sąlygas;
2. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos sąlygas muscimoliui identifikuoti raudonosiose musmirėse;
3. Pritaikyti kiekybinį efektyviosios skysčių chromatografijos metodą muscimolio kiekiui įvertinti raudonosiose musmirėse ir jį validuoti;
4. Palyginti muscimolio kiekį raudonosiose musmirėse, surinktose skirtingose Lietuvos vietovėse;
5. Įvertinti laisvųjų aminorūgščių kiekį raudonosiose musmirėse ir palyginti su kitų augalų laisvųjų aminorūgščių kiekine sudėtimi.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
Daugybę amžių visame pasaulyje grybai buvo naudojami kaip maistinė ir kaip medicininė žaliava. Grybai kaupia daug naudingų medžiagų: angliavandenius, baltymus, aminorūgštis ir mineralines medžiagas. Taip pat juose randama biologiškai aktyvių metabolitų, šias savybes labai vertina liaudies mediciną propaguojantys asmenys [1]. Grybai paplitę gamtoje, paprastoji musmirė tikriausiai yra vienas lengviausiai atpažįstamų grybų, išsiskiriantis baltais taškeliais ant raudonos kepurėlės. Tai neatskiriama miško dangos dalis, jų gausu parkuose, soduose, vandenyje, ypač daug dirvožemyje. Viename grame žemės grybų ir jų sporų yra šimtai tūkstančių ar net milijonai. Grybų sporos sklando padangėje (aptinkamos net iki 35 km aukštyje), vėjo nunešamos tūkstančius kilometrų. Grybai – tai ne tik mums puikiai žinomi baravykai, raudonviršiai, kazlėkai, žaliuokės ar ūmėdės, bet įvairiausi kempininiai grybai, kurie turi įtakos medienos irimui. Gausybę žalos žemės ūkiui padaro grybų sukeltos rūdys, kūlės, rauplės, miltligės, sunaikindamos didelius kiekius grūdų, vaisių, uogų ir daržovių. Taip pat jie sukelia daugybę žmogaus bei gyvulių ligų – mikozių. Šie augalai griauna namus, ardo tiltus, užtvankas, pūdo šiltnamius ir rūsius, gadina netinkamai laikomus maisto produktus, naikina įvairius pramonės gaminius. Nemažai rūpesčių lakūnams ir aviacijos sferoje dirbantiems asmenims sukelia grybas Cladosporium
resinae L., kuris lengvai auga ir dauginasi aviaciniame kure ir ant metalinių bako sienelių. Kartais
pelėsiniai grybai išauga koncentruotoje acto ir sieros rūgštyse [1].
Valgomuosius grybus atskirti nuo nuodingųjų sunku, nes ypatingų, aiškių požymių, būdingų visiems nuodingiesiems grybams, nėra. Todėl nežinomų arba abejotinų grybų nereikia rinkti ir valgyti. Paprastąją musmirę (Amanita muscaria L.) gerai pažįsta daugelis grybautojų. Nors ji neabejotinai nuodinga, specialiai paruošta tam tikruose kraštuose ji yra delikatesinis patiekalas. Paprastoji musmirė suteikė vardą pirmą kartą joje aptiktam muskarinui, nors jo šiame grybe yra tik pėdsakų [2].
Paprastoji musmirė (Amanita muscaria L.) ryškiai raudona kepurėle išsiskiria ne tik iš musmirių, bet ir iš visų kitų grybų. Kepurėlė 10 – 20 cm skersmens, ryškiai raudona, kartais oranžinė arba gelsva, su baltomis plėvelėmis arba karputėmis (apvalkalo liekanomis), kurios per liūtis kartais nusiplauna, tada šią musmirę galima sumaišyti su ūmėdėmis. Lakšteliai balti, senesnių grybų gelsvi, tankūs, platūs, laisvi. Kotas 8 – 20 cm ilgio, 1 – 3 cm storio, baltas, plaušuotas, su baltu rinkiu, pagrindas su apvaliu sustorėjusiu baltu arba gelsvu gumbu, tvirtai suaugusiu su išnara. Trama balta, po luobele oranžiniai geltona, be ypatingo kvapo ir skonio, minkšta. Sporos baltos. Auga nuo vidurvasario iki lapkričio mėn. įvairiuose miškuose. Didžiausi muscimolio ir iboteninės rūgšties kiekiai kaupiasi kepurėlėje (1, 2 pav.) [2,3].
1 pav. Amanita muscaria L. [2] 2 pav. Amanita muscaria L. [3]
3.1. Nuodų savybės
Medžiagos, kurias kaupia paprastoji musmirė (Amanita muscaria L.), yra iboteno rūgštis ir muscimolis. Šios medžiagos priklauso izoksazolų grupei. Taip pat šios medžiagos aptinkamos ir margojoje musmirėje (Amanita pantherina L.). Duomenų apie apsinuodijimus šiais grybais nerandama daug. Muscimolį ir iboteno rūgštį kaupiančių grybų intoksikacijos atvejų skaičiuojama 0,07 % (45/6421) visų apsinuodijimų grybais atvejų Jungtinių Amerikos Valstijų (JAV) nacionalinės apsinuodijimo sistemos 2016 metų duomenimis [4]. Šiais dviem grybais žmonės labiausiai apsinuodija ir patenka į gydymo įstaigas [5]. Muscimolis yra dekarboksilinta iboteno rūgštis, abi medžiagos pasižymi geru tirpumu vandenyje [6]. Psichoaktyvus izoksazolas, gautas iš paprastosios musmirės (Amanita muscaria L.), veikia kaip haliucinogenas,
-
amino-sviesto rūgšties A (GASR A) receptorių agonistas, daug stipresnis nei iboteno rūgštis. Veikia tris pagrindinius glutamato receptorius ir turi insekticidinių savybių. Paprastai grybuose yra gana nedaug šių medžiagų, todėl norint sukelti toksinį poveikį, turi būti suvartotas nemažas kiekis (haliucinacijų atsiranda, suvalgius 2 – 4 (Amanita muscaria L.) kepurėles. Paprastoje musmirėje iboteno rūgšties aptinkama iki 0,17 – 1,0 %. Muscimolio ir iboteno rūgšties struktūrinės formulės pavaizduotos 3 ir 4 paveiksle.3.2. Klinika
Diskomforto jausmas – vienas iš pirminių požymių, kurį sukelia grybų toksinai. Grybai pasižymi jautrumu bakterijoms ir parazitams, tai paaiškina, kodėl net nenuodingi grybai gali sukelti apsinuodijimų, ypač jei jie buvo vartojami po kelių parų. Grybai yra baltymų šaltinis, kurie gali sukelti alergines reakcijas jautriems asmenims [9]. Iboteno rūgštis ir muscimolis sukelia trijų pagrindinių grupių apsinuodijimus, t.y. virškinamojo trakto sutrikimai, centrinės nervų sistemos (CNS) depresija ir CNS sužadinimas. Simptomų gali atsirasti po kelių minučių ar po 3 valandų. Jie išnyksta per 2 -24 valandas, retai gali tęstis iki 48 val. Simptomai pasireiškia ataksija, koordinacijos sutrikimais, hiporefleksija, todėl iš pradžių įtariamas kraujotakos sutrikimas galvos smegenyse. Vėliau gali prisidėti virškinamojo trakto simptomai: pilvo skausmai, pykinimas, vėmimas ir viduriavimas.
Apsinuodijusieji muscimoliu gali pasijusti lyg patekę į spąstus: dėl neurologinės simptomatikos bei raumenų distonijų (drebėjimo, virpėjimo, trūkčiojimų ir kt.) dar sąmonės nepraradę pacientai nesugeba surinkti telefono numerio, išsikviesti pagalbos ar atrakinti durų.
Stebimi regos sutrikimai: iliuzijos, haliucinacijos, spalvų haliucinacijos, miozė, migla ir dvejinimasis akyse. Regos suvokimo sutrikimai ryškesni nei regos haliucinacijos. Stiprėjant apsinuodijimui, pakinta ir psichika: manijos, ažitacija, euforija, nuo didesnių – akivaizdi psichozė, traukuliai ir koma.
Koma be didesnių komplikacijų. Gyvybinės funkcijos dažniausiai nenukenčia: lėtas reguliarus kvėpavimas, kraujospūdžio ir pulso sutrikimų nepastebima. Šis apsinuodijimas ypatingas kitiems nuodingiems grybams nebūdingu karščiavimu, kuris retai siekia 38,5 C. Jo priežastis yra hiperkinezė ar traukuliai [10].
3.3. Veikimo mechanizmas
Iboteno rūgštis ir muscimolis yra izoksazolų grupės dariniai, kurių veikimo mechanizmas panašus į glutamato neurotransmiterių ir GASR [11]. Centrinėje nervų sistemoje randami du GASR receptorių tipai, kurie skiriasi savo veikimo mechanizmu. Jonotropiniai receptoriai yra GASR chlorido jonų kanalai, o metabotropiniai receptoriai atsakingi už reakcijas, vykstančias per G-baltymą [12]. GASR yra pagrindinis žinduolių CNS neurotransmiterių inhibitorius. Jie gali būti pritaikyti kaip raminamieji, migdomieji ir nuskausminamieji [13]. Jonotropiniai receptoriai gali būti suskirstyti į du poklasius. GASRA receptoriai yra bikulino antagonistai, o GASRC yra TPMPA ((1,2,5,6 –
tetrahidropiridin – 4 – yl)metilfosfininė rūgštis) antagonistai [14]. GASRA receptoriai plačiai paplitę
smegenyse. Pavartojus muscimolio, kinta neuronų aktyvumas keliose smegenų dalyse: smegenų žievėje, hipokampe ir smegenėlėse. Muscimolis yra laikomas selektyviu GASRA agonistu, tačiau taip pat veikia
ir į GASRC receptorius. Muscimolis buvo pirmasis selektyvus konformaciškai apribotas GASR
agonistas dėl savo struktūros aktyvumo ryšio GASRA receptoriams [15]. Antagonistinis muscimolio
poveikis į GASRC yra neblokuoti bikulino, o atlaisvinti pikrotoksiną. Ši medžiaga yra GASR analogas,
kuris hidroksiizoksazolo dalyje pakeičia karboksilo grupę. 3 – hydroksiizoksazolo karboksilo grupė yra tapati GASRA ir GASRC receptoriams, bet ne GASRB. GASR neuronų įsiurbimo sistema atpažįsta 3 –
hydroksiizoksazolo dalį. Šiuo atveju muscimolis yra silpnas GASR inhibitorius, taip pat nėra GASR aminotransferazės substrato inhibitorius [16]. Tai nurodo, kad šis enzimas nesąveikauja su 3– hydroksiizoksazolo dalimi. Muscimolis tapo prototipine medžiaga, rengiant ir vystant izoksazolo kiekio aktyvumą GASR sistemoms. THIP (gaboksadolis) - muscimolio analogas, sukeliantis analgezinį poveikį ir skatinantis mieguistumą [17]. Tai buvo taikoma nemigos gydymui, tačiau buvo atšauktas III fazės klinikiniuose tyrimuose dėl sukeltų didelio kiekio nepageidaujamų poveikių [16]. Muscimolio sąveika su GASR receptoriais pavaizduota 6 paveiksle.
3.4. Farmakokinetika
Muscimolis ir iboteno rūgštis priklauso izoksazolų grupės dariniams. Atliktuose tyrimuose su laboratorinėmis žiurkėmis po grybo pavartojimo buvo pastebėta, kad muscimolis ir iboteno rūgštis pereina smegenų hematoencefalinį barjerą. Iboteno rūgšties dekarboksilinta forma - muscimolis aptinkamas virškinamajame trakte, kepenyse ir smegenyse. Taip pat muscimolis ir iboteno rūgštis aptinkami šlapime [5, 18]. Naudojant muscimolį intraveniniu būdu, medžiaga greitai metabolizuojama, patenka į smegenis, maždaug po 30 min. pasiekia didžiausią koncentraciją (apie 200 nmol/kg po suvartojimo) [19].
3.5. Toksiškumas
Pasaulyje vyrauja kelios rūšys Amanita šeimos grybų, kurios kaupia iboteno rūgštį ir muscimolį: paprastoji (raudonoji) musmirė (Amanita muscaria L.), margoji musmirė (Amanita pantherina L.), geltonoji musmirė (Amanita gemmate L.), kilnioji musmirė (Amanita regalis L.) [20,21]. Paprastoji musmirė įvairiai naudojama skirtingose kultūrose ir religijose [22]. Slovėnijos apsinuodijimų kontrolės centre buvo užfiksuoti 32 apsinuodijimo atvejai, iš kurių 17 sudarė apsinuodijimas musmirinių šeimos grybais [23]. Sąmonės sutrikimai dažniau pasireikšdavo pacientams, kurie apsinuodijo raudonąja musmire, lyginant su geltonąja musmire (81 % prieš 47 %), koma labiau pasireikšdavo pacientams, apsinuodijusiems geltonąja musmire, lyginant su tais, kurie nukentėjo nuo raudonosios musmirės (29 % prieš 6 %). Smarkus vėmimas ir virškinamojo trakto sutrikimai užfiksuoti pusei visų atvejų. Tyrimuose su pelėmis buvo nustatyta, kad vidutinė letali muscimolio dozė LD50, suvartota oraliai, yra 22 mg/kg,
iboteninės rūgšties – 38 mg/kg. Kitas tyrimas buvo atliktas, naudojant laboratorines žiurkes, ir buvo nustatyta, kad žiurkėms vidutinė letali muscimolio dozė LD50 yra 45 mg/kg ir 129 mg/kg iboteno
rūgšties [5]. Didžiausi muscimolio kiekiai, rasti raudonosios musmirės kepurėlėje, 156 mg/kg-1 (vyrauja nuo 46 iki 1203 mg/kg-1 ). Stiebe randama 178 mg/kg-1 (82-1839 mg/kg-1 ). Iboteno rūgšties didžiausios koncentracijos aptinkamos taip pat kepurėlėje – 863 mg/kg-1 (182-1839 mg/kg-1 ), stiebe aptinkama 672-1998 mg/kg-1 [24]. Žmonių organizme letalus LD50 muscimolio slenkstis yra 6 mg/kg, o iboteninės
rūgšties 30-60 mg/kg [18]. Pasvėrus šviežią grybą ir ištyrus jo sudėtį, buvo aptikta, kad muscimolio koncentracija < 3mg/kg, o iboteno rūgšties kiekis buvo nustatytas 100 mg/kg. Tai parodo, jog vidutinio dydžio vaisiakūnyje, kurio svoris yra apie 60-70 g, yra pakankamas kiekis toksinių medžiagų, kad būtų sukeltas pavojus žmogaus organizmui [5]. Vienoje nagrinėtoje klinikinėje situacijoje trejų metų berniukas suvalgė nežinomą kiekį raudonosios musmirės. Jam intoksikacijos simptomai prasidėjo po 30
min. Pasireiškė vėmimas, susijaudinimas ir tachikardija. Nukentėjusiajam buvo skirta benzodiazepinų nerimo sumažinimui. Berniukui reikėjo atlikti endotrachėjinę intubaciją, kad būtų palaikomas pastovus plaučių darbas kvėpuojant. Jis buvo pristatytas į gydymo įstaigą ir po trijų dienų išrašytas [25].
3.6. Gydymas
Specialaus priešnuodžio muscimoliui ir iboteno rūgščiai nėra. Anksčiau buvo manoma, kad apsinuodijimą sukelia muskarinas, todėl gydymui buvo taikomas atropinas, tačiau tai nepasiteisindavo ir paciento būklė nepagerėdavo, o tik pablogėdavo [10]. Taikomas simptominis gydymas. Pirmomis valandomis po apsinuodijimo taikomos nespecifinės detoksikacijos priemonės - pirmiausia virškinamojo kanalo išvalymas. Suleidžiama piridoksino 25 mg/kg, pastatoma lašelinė 30 min. Piridoksinas pasižymi traukulius mažinančiomis savybėmis [26]. Jeigu tai nepadeda, skiriami benzodiazepinai kaip GASR agonistai, tačiau jie gali sustiprinti depresiją. Kuomet vartojamas diazepamas, kuris gali pabloginti emocinę būklę ir kvėpavimo dažnį, reikalinga mechaninė plaučių ventiliacija. Kol ventiliacija išlaikoma tolygiai, tol organizmo atstatymo tikimybė labai didelė. Diazepamas taip pat gali būti skiriamas šunims ir katėms po 0,5 mg/kg/v, galima injekciją kartoti, jeigu reikia, kas dešimt minučių, maksimaliai iki trijų dozių per dieną. Kitas medikamentas, vartojamas traukuliams malšinti, yra fenobarbitalis. Šis medikamentas žmonėms skiriamas 6 mg/kg/v. Gyvūnams skiriama 5-15 mg/kg/v. Tai taip pat yra GASR receptorių agonistai. Vaistas taip pat gali pabloginti depresinę būklę ir sutrikdyti kvėpavimo sistemą. Todėl yra labai svarbus tinkamas monitoravimas vartojimo metu [6]. Sutrumpinta gydymo schema pateikta 7 paveiksle.
7 pav. Apsinuodijus Amanita muscaria gydymo schema.
3.7. Terapinės muscimolio savybės
Stebint muscimolio raminamąsias savybes, buvo pastebėta, kad muscimolis taip pat pasižymi nuskausminamuoju poveikiu. Kuomet muscimolis suleidžiamas į veną, jis sustiprina nuskausminamąjį pilokarpino pelėse ir morfino laboratorinėse žiurkėse efektą. Visi šie poveikiai susiję su GASR generine
sistema. Intraveniniu keliu suleistas muscimolis veikia GASRA receptorius ir blokuoja nociceptinį ryšį.
Taip pat buvo įrodyta, kad muscimolis sustiprina propofolio anestezinį aktyvumą. Tai leido įterpti GASR generinio perdavimo mechanizmą, anestezijoje taikant propofolį.
Intraveninės muscimolio mikroinjekcijos sumažina tremorą pacientams, kurie kenčia nuo nuolatinio drebulio. Daroma prielaida, kad būtų galima taikyti izoksazolo junginius pacientams, kurie turi šį neurologinį sutrikimą.
Muscimolis leidžiamas sistemiškai arba lokaliai į smegenų žievę. Skyrimas praktikoje parodė, kad blokuoja vaistų sukeltus traukulius tyrimuose su gyvūnais. Gydant muscimolio 2,5 mM koncentracija, išvengiama acetilcholino sukeliamų traukulių, tai parodė tyrimai su laboratorinėmis žiurkėmis ir beždžionėmis, jokių sunkių nepageidaujamų poveikių nebuvo nustatyta. Mokslininkai daro išvadas, kad muscimolis galėtų būti taikomas epilepsijos gydyme.
Nepaisant psichoaktyvių muscimolio savybių, mažos dozės buvo taikomos šizofrenijos gydyme, veikimas panašus į anksiolitikų, kurie keičia neuronų aktyvumą ir gerina miego kokybę. Muscimolio injekcijos priklauso nuo koncentracijos, kuri lemia selektyvų antagonistinį poveikį, kuris lemia laboratorinių žiurkių baimę, pažinimą ir atmintį. Ypač GASRA receptorių aktyvacija kartu veikia ir
GASRC antagonistinį poveikį. Tiriant laboratorines peles, buvo nustatytas muscimolio sedacinis
poveikis.
Muscimolio terapinės savybės buvo įrodytos, atliekant tyrimus šizofrenija sergantiems pacientams, kuriems pasireiškia diskinezijos. Atliktame klinikiniame tyrime muscimolis buvo skirtas šešiems pacientams, tyrimas buvo dvigubai aklas placebo kontroliuojamas. Visi tiriamieji sirgo chronine šizofrenija. Pacientai prieš tyrimą penkias dienas nevartojo neuroleptinių vaistų. Muscimolis buvo skiriamas 9 valandą ryte per os, vaisto veikimas buvo pastebėtas, praėjus 4 valandoms. Tyrimo duomenimis, muscimolis mažina traukulius, haliucinacijas, slopina nerimo priepuolius. Nebuvo užfiksuota jokių gyvybinėms funkcijoms pakenkti galinčių nepageidaujamų reakcijų į vaistą [27].
Taikant muscimolio terapiją, nustatyta, kad galima išvengti ląstelių mirties išeminėmis sąlygomis, kuomet atpalaiduojami dideli kiekiai glutamato, kuris parodo citotoksinį aktyvumą. Sukurta heteroreceptorių GASRA sistema, kuri sumažina glutaminerginių neuronų aktyvumą prieš glutamato
receptorius N-metil-D-asparto rūgštis (NMDA), tai apsaugo piramidinius neuronus nuo per didelio aktyvumo [28]. Pirminis tikslus muscimolio apsauginis veikimo mechanizmas nėra žinomas, mokslininkai mano, jog taip veikia NMDA aktyvacija ir azoto oksido sintezė.
In vitro tyrimai atskleidė GASR ir muscimolio įtaką inhibuojant noradrenalino (NO) sintezę
to, kad muscimolis sukelia GASRA aktyvinimą, atlikti tyrimai atskleidė, kad ši medžiaga
nepriklausomai sukelia NO atpalaidavimą [29].
3.8. Tyrimo metodika
Norint atlikti grybinės augalinės žaliavos tyrimą ir identifikuoti norimą medžiagą, prieš taikant tyrimo metodiką, būtina atlikti iboteno rūgšties dekarboksilinimą. Tai atliekama, kaitinant ekstraktus, gautus iš Amanita muscaria L. grybų. Temperatūros poveikyje nuo iboteno rūgšties atskyla karboksi- funkcinė grupė ir susidaro muscimolis. Taikant šį metodą, ekstraktas kaitinamas 60 min. vakuuminėje orkaitėje prie skirtingų temperatūrų [30]. Grybinės kilmės augalai yra baltymų šaltinis, o baltymai sudaryti iš L--aminorūgščių, kurios, susijungusios peptidiniais ryšiais, sudaro apie 50 % sausos ląstelių masės. Baltymai ir aminorūgštys yra atsakingos už daugybę organizmo funkcijų, vykstančių žmogaus organizme, tokių kaip pernašos, hormoninė ir kt. [31]. Aminorūgštys atlieka struktūrinę, receptorinę [32], energetinę ir fermentinę funkcijas [33]. Norint identifikuoti aminorūgštis, reikia pritaikyti derivatizaciją, pvz., prijungti atitinkamą funkcinę grupę, kuri įtakoja papildomas savybes, tokias kaip didesnį aktyvumą, tirpumą, agregatinės būsenos kitimą. Didina ir mažina virimo temperatūrą. Labiausiai paplitęs derivatizacijos metodas yra silininimas. Atliekant derivatizaciją šiuo būdu, būtina užtikrinti, jog tiek mėginys, tiek reagentai būtų miltelių pavidalo, nes silil- grupė pasižymi dideliu jautrumu drėgmei ir lengvai skyla [34].
Chromatografiniai metodai dažniausiai naudojami, norint ištirti kaupiamų medžiagų kiekį įvairiose augalinės kilmės žaliavose. Kuomet naudojamas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas (EPC), norint nustatyti muscimolio tapatybę ir kiekį raudonosiose musmirėse, būtina atlikti iboteno rūgšties dekarboksilinimą kaitinant [30]. Vieno tyrimo metu buvo nustatinėjamas muscimolio kiekis Amanita muscaria L. grybinėje žaliavoje. Nustatinėjant muscimolį, buvo taikoma EPC metodika: pasirinkta celiuliozinė plokštelė su tirpiklių sistema 95 % 1-butanolis: etanolis: acto rūgštis: vanduo (75:25:5:7:5). Kaip ryškiklis buvo naudotas ninhidrinas, kuris reakcijoje su muscimoliu išryškėja kaip geltonas taškas Rf = 0,35 [15]. Alternatyvus tyrimo metodas gali būti
naudojamas dujų chromatografija-masių spektrometrija (DC-MS). Taip pat mokslininkai išbandė ir derivatizacijos metodiką, naudojant densilchloridą [35].
Atliekant tyrimą dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu, analizei naudojama Thermo Trace DSQ sistema (FS, m/z 40-400) kartu su pasirinktu jonų monitoravimu (m/z 115 cikloserinui, m/z 113 muscimoliui ir m/z 257 iboteno rūgščiai). Injekuojama 1 μl, be priemaišų, injekcijos laikas - 30 sekundžių 220 C temp. Perdavimo linijos temperatūra 250 C, jonizacijos šaltinis - sujungtas silikagelio kapiliaras HP-5MS UI 15 m/0,25 mm LD/0,25 μl iš HPST (Praha, Čekijos
Respublika), leidžiamos helio dujos 1,5 ml/min pastoviu srautu. Pradinė kaitinamoji temperatūra 70 C, sulaikyta 1 minutę temperatūra keliama kas 10 C, kol pasiekiama 170 C. Pasiekus reikiamą ribą, paskutinį kartą pakartotinai keliama temp. 30 C iki 300 C, laukiama 5 min. Visas tyrimo laikas - 20 min [36]. Šia metodologija dažniausiai remiamasi, kuomet nustatinėjamos medžiagos džiovintuose grybuose. Taip pat gali būti atliekama derivatizacija ir hidrolizė. Visi grybai yra baltyminės kilmės augalai, todėl jie kaupia nemažą kiekį aminorūgščių, šios gali būti nustatytos taip pat taikant DC-MS.
Atliekant literatūros analizę pastebėta, kad plačiausiai taikomas metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Naudojant ESC, naudojamos RP – ESC kolonėlės, eliuentas naudojamas vandeninis 0,005 M oktilamono o-fosfatas (pH 6,4) su UV detekcija, bangos ilgis 230 nm [37]. Kitas atskyrimo metodas yra naudojant RP – ESC su C-18 kolonėlėm, eliuentais naudojami 2 % vandeninė acto rūgštis ir 30 % metanolio tirpalas 2 % vandeninėje acto rūgštyje. Kaip alternatyva chromatografinei sistemai gali būti naudojamas 1 % tetrahidrofuranas (THF) arba 1 % acetonitrilo (CH3CN) vandeninis
tirpalas. Vykdoma ekstrakcija su etilacetatu (EtOAc), plaunama sodos karbonato tirpalu, chromatografija vykdoma, naudojant C-18 kolonėlę, eliuentu naudojamas H2O, H2O : THF arba H2O :
CH3CN. Taip pat gali būti pritaikomas ir skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos (SC-MS)
metodas [38].
Analizuojant džiovintus grybus. Kolonėlė – Symmetry C18 (15 cm ilgio, 2,1 mm vid. skersmuo, dalelių dydis – 3,5 μm). Mobili fazė: 10 mmol/l amonio acetatas: acetonitrilas. Gradientinis režimas: 70 AA : 30 ACN nuo 1 minutės iki 10:90 25-ąją minutę, paliekant 5-ioms minutėms, po to nuo 31 minutės santykiu 70:30, paliekant 15-ai minučių. Eliuento tekėjimo greitis – 0,2 ml/min. Detektorius – jonų matricos DAD (PDA), absorbcijos maksimumas prie 256 nm. Kiekybinio nustatymo riba – 4,6 μg/l, aptikimo riba – 1,4 μg/l.
Viename iš nagrinėjamų mokslinės literatūros straipsnių, muscimolio ir iboteno rūgšties atskyrimui pasitelktas ESC metodas: mobili fazė buvo jonizuotas vandeninis tirpalas, ortofosfato rūgšties ir salicilo rūgšties tirpalai skirtingomis pH reikšmėmis ( 3, 6,4 ir 8). Buvo lyginami skirtingų alkilaminų (pentilaminų, heksilaminų, nonilaminų ir decilaminų) mėginiai. Paruoštiems tirpalams buvo pridėtas reikiamas kiekis aminų, o-fosfato rūgšties ir salicilo rūgšties, kad būtų sulygintos pH reikšmės. Minimalus chromatagrafavimo laikas yra viena valanda, kol gaunami pirminiai rezultatai, srovės tekėjimo greitis - 1,0 mL/min. Po to kolonėlė perplaunama. Plaunant naudojamas distiliuoto vandens (1,0 mL/min, plaunama 30 min.) ir vandens/acetonitrilo mišinys 50/50 v/v (plaunama vieną valandą, srovės tekėjimo greitis 1,0mL/min). Ši procedūra ypatingai reikalinga, dirbant su tikromis matricomis ir norint išlaikyti lipofilinį sluoksnį, kuris neeliuoja mobilioje fazėje, bet gali paveikti chromatogramą [39].
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA
Paprastosios musmirės Amanita muscaria L. vaisiakūniai buvo surinkti skirtingose Lietuvos vietovėse (Šiauliuose, Druskininkuose, Klaipėdoje ir Utenoje) rugpjūčio – spalio mėnesį 2018 m. Grybai nebuvo auginami namų sąlygomis ar šiltnamiuose, visa tyrimui skirta medžiaga surinkta natūraliose augimvietėse. Iki eksperimentinės dalies grybai buvo užšaldyti, kad neprasidėtų puvimo procesas. Prieš pradedant eksperimentinę dalį, grybų vaisiakūniai buvo liofilizuoti.
4.1. Įranga
• Liofilizatorius (TELSTAR Lyoqest, HT40)
• Vizualizavimo prietaisas ( CAMAG TLC Visualizer) • Programinė įranga „VideoScan“
• Pusiau automatinė nešiklių sistema (CAMAG Linomat 5) • Camag kaitlentė
• Shimadzu chromatografas (NEXERA X2)
• Diodų matricos detektorius Shimadzu SPD-M20A • Chromatografas waters 2695
• Chromatografinės plokštelės (HPTLC Silica gel 60 F254 Merck, Vokietija).
• Kolonėlė ACE C18 ( 250 x 4,6) 5μm • Kolonėlė ACE C18 (150 x 4,6)
• Kolonėlė Hichrospher DIOL A 5μm ( 250 x 4,0 nm) • Kolonėlė ZIC – HILIC ( 150 x 2,1 nm) 3,5 μm
• Chromatografas Shimadzu GC-2010 plius ( shimadzu Coorporation, Japonija) • Kolonėlė ( Rxi-5ms)
• Svarstyklės Shimadzu Auw 120 D ( Duisburgas, Vokietija) • Ultragarso vonelė „WiseClean“
4.2. Medžiagos
• 1-butanolis ( Sigma – Aldrich, Vokietija) • 96% etanolis ( Sigma – Aldrich, Vokietija) • Acto rūgštis ( Sigma – Aldrich, Vokietija) • Ninhidrino etanolinis tirpalas
• Acetonitrilas ( Sigma – Aldrich, Vokietija) • Metanolis 99,9% ( Sigma – Aldrich, Vokietija)
• Išgrynintas vanduo ( Milipore vandens ruošimo sistema Bedford, JAV) • TFA (Sigma – Aldrich, Vokietija)
• Amonio acetato buferis ( Sigma – Aldrich, Vokietija) • AR standartų mišinys ( Sigma-Aldrich,Vokietija) • MBTSTFA darinys ( Sigma-Aldrich, Vokietija) • Helio dujos
4.3. Tyrimo metodika
Taikant EPC: tirpiklių sistema sudaryta iš 1-butanolio: 70 % metanolio: acto rūgšties: distiliuoto vandens (75:25:5:7,5), kaip ryškiklis naudotas 0,02 % ninhidrino etanolinis tirpalas, 10:10 cm chromatografinės plokštelės (HPTLC Silica gel 60 F254 Merck, Vokietija).
Taikant ESC: eliuentai: acetonitrilas, metanolis, trifluoracto rūgštis, amonio acetato buferinis tirpalas (pH 3,2 – 5,0). Kolonėlė ZIC-HILIC (150 x 2,1 nm; 3,5 μm; 45 C), modifikuota chromatografinės kolonėlės laikymo temperatūra (25 – 45 C), vertintas eliuento tėkmės greitis (0,4 – 1,2 ml/m), vertintas eliuento tekėjimo režimas (gradientinis, izokratinis).
Taikant DC-MS: Kolonėlė (Rxi®-5ms), 30 m ilgio ir 0,25 μm skersmens, su 0,25 μm nejudančios fazės sluoksnio storiu. Kolonėlės temperatūra 75 C. Tekėjimo kolonėle greitis: 1,5 ml/min, slėgis 100,0 kPa, bendras tekėjimo greitis: 34,4 ml/min. Metodas atliekamas per 41 min. Temperatūra kolonėlėje buvo užprogramuota: pradinė kolonėlės temperatūra 75 C, išlaikant pastovią 5 min., po to didinant 10C /min. ir keliama iki 290 C, laikoma pastovi 5 min., toliau temperatūra keliama kas 20 C /min iki 320 C ir laikoma pastovi 5 min. Mėginiai injekuoti, taikant srauto dalinimą santykiu 1:10. Injekcijos
tūris 1 μl. Injekavimo temperatūra 260 C. Tyrimai kartoti po 3 kartus, tarp jų paleidžiant metodiką vien su tirpikliu – acetonitrilu, siekiant išvalyti kolonėlę.
Duomenų apdorojimas: Gautiems duomenims analizuoti pasitelktas statistinis tyrimo metodas, kuriuo apdorota ir abibendrinta inforimacija, šio tyrimo metu buvo naudojama SPSS (Statistical Package for Social Science) programa. Grafikų bei lentelių sudarymui naudota Microsoft Office MS Excel 2016.
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
5.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas muscimolio
kiekybinei ir kokybinei analizei
Vienas iš galimų muscimolio įvertinimo būdų yra plonasluoksnės chromatografijos metodas. Šis metodas yra tinkamas kokybinei ir kiekybinei muscimolio analizei. Atlikus literatūros apžvalgą, rasta duomenų, kad grybų vaisiakūnių tyrimams buvo pritaikyta efektyvioji plonasluoksnės chromatografijos metodika (EPC): tirpiklių sistema - 1-butanolis: 70 % metanolis: acto rūgštis: distiliuotas vanduo (75:25:5:7,5). Ryškiklis - 0,02 % ninhidrino etanolinis tirpalas. Chromatografinės plokštelės buvo 10:10 cm (HPTLC Silica gel 60 F254 Merck, Vokietija). Prieš pradedant EPC tyrimus, grybai buvo liofilizuoti
ir susmulkinti laboratoriniu malūnėliu iki miltelių konsistencijos. Pagamintas standartinis muscimolio tirpalas (132,3 μg/ml), su kuriuo buvo atliekami pirminiai kokybiniai tyrimai. Naudojant pusiau automatinę (LINOMAT 5) nešiklių sistemą ant plokštelės užnešame 10 μl muscimolio standartinio tirpalo, dėmei išdžiūvus, plokštelė dedama į kamerą su paruošta tirpiklių sistema. Laukiama, kol pakyla iki 7 cm ribos, tada plokštelė ištraukiama, džiovinama ir nupurškiama ninhidrino tirpalu. Išpurkšta plokštelė dedama ant Camag kaitlentės, kaitinama 10 min., kol muscimolis išryškėja geltonos dėmės pavidalu. Plokštelė nufotografuojama (Camag TLC Visualizer) aparatu ir įvertinamas sulaikymo rodiklis (Rf). Tyrimai kartojami tris kartus, vertinant sulaikymo rodiklio rezultatus Rf = 0,25 0,01. Atlikus
kokybinę analizę ir įvertinus rezultatus, nustatyta, kad pasirinkta metodika yra tinkama muscimolio tapatybės vertinimui.
Iš standartinio muscimolio tirpalo buvo daromi praskiedimai kalibraciniam grafikui sudaryti. Ruošiami penki didėjančių koncentracijų standartiniai tirpalai, su kuriais atliekama anksčiau aprašyta EPC analizė. Atlikus tyrimus, buvo sudaryta kalibracinė kreivė (8 pav.) Gautos muscimolio nustatymo ribos 0,748 – 132,2 μg/ml, matematinė formulė skaičiavimams Y=7.24*103+529*x.
EPC metodika buvo pritaikyta kokybinei ir kiekybinei muscimolio analizei. Gautais rezultatais bus remiamasi tolimesniuose tyrimo etapuose, analizuojant grybinės kilmės augalines žaliavas.
8 pav. Muscimolio standartinio tirpalo kalibracinė kreivė
Pritaikius EPC ir gavus teigiamus analizės rezultatus tyrimuose su muscimolio standartiniu tirpalu, toliau metodika buvo vystoma tyrimuose su grybo vaisiakūniais. Natūraliose augavietėse surinkti grybai buvo liofilizuoti (- 50 C) ir susmulkinti laboratoriniu malūnėliu. Iš susmulkintos grybinės augalinės žaliavos buvo paruošti ekstraktai, kurie buvo tiriami, pritaikant EPC metodiką. Atlikus literatūros šaltinių analizę, nustatyta, kad, prieš pradedant tyrimus su paprastąja musmire, dažniausiai rekomenduojama atlikti dekarboksilinimą. Pirmojo EPC tyrimo metu tiriamasis vaisiakūnis buvo liofilizuotas ir iš jo pagamintas metanolinis ekstraktas be tiriamojo grybo dekarboksilinimo. Atlikus analizę, muscimolis nebuvo nustatytas (9 pav.). Šio tyrimo metu patvirtinome hipotezę, jog dekarboksilinimas yra būtinas veiksmas, identifikuojant muscimolį grybo augalinėje žaliavoje.
9 pav. Grybo vaisiakūnio EPC chromatograma be dekarboksilinimo.
Koncentracija Plotas
Atlikus Amanita muscaria L. analizę, pritaikant EPC, gauti rezultatai netenkino, nes muscimolis nebuvo identifikuotas, chromatogramoje lyginant gautą vaizdą su muscimolio standartu. Atlikus mokslinės literatūros analizę, buvo nustatyta, kad, norint gauti muscimolį, pirmiausia reikia atlikti iboteno rūgšties dekarboksilinimą, naudojant kaitinimą. Šilumos poveikyje nuo iboteno rūgšties atskyla karboksilinė grupė ir susidaro muscimolis [30]. 0,2 g liofilizuotos augalinės žaliavos išbarstoma ant aliuminio plokštelės, plokštelė dedama ant kaitlentės vienai valandai. Temperatūriniai režimai parinkti 75, 95, 110 C. Po temperatūrinio dekarboksilinimo augalinė žaliava perdedama į tikslaus tūrio kolbutę ir užpilama 5 ml 70 % metanolio. Sonifikuojama 10 min. ultragarso vonelėje, po to paliekama 24 val. tamsoje, kartais sumaišant ekstraktą. Po 24 val. gautas ekstraktas centrifūguojamas (4000 rpm ) 5 min. Atliekama EPC analizė. Standartinio tirpalo užlašinama 5 μl, ekstraktų po 10 μl. Tyrimo eigoje muscimolis identifikuotas visuose tiriamuosiuose objektuose (10 pav.).
10 pav. Grybo vaisiakūnio EPC chromatograma po dekarboksilinimo.
Taip pat tyrimai buvo atlikti su 99 % metanoliu, norint įvertinti ekstrahento efektyvumą. Tyrimo eigoje nustatyta, kad naudojant 70 % metanolį, išekstrahuojamas muscimolio kiekis (17,013 μg/ml) yra didesnis, negu naudojant 99 % metanolį (11,023 μg/ml).
Atlikus kiekybinį muscimolio įvertinimą pagal sudarytą kalibracinę kreivę, nustatyta, kad kaitinant ekstraktus prie 75 C, muscimolio kiekis yra didžiausias, o aukštesnėse temperatūrose muscimolio kiekis mažėja, - tai leidžia sudaryti prielaidą, kad didelės temperatūros poveikyje muscimolis skyla. Kokia temperatūra yra tinkamiausia dekarboksilinimui, rezultatai pateikiami 1 lentelėje.
1 lentelė. Gauti muscimolio kiekiai po dekarboksilinimo.
Apibendrinant EPC tyrimo rezultatus po dekarboksilinimo, chromatogramoje gauti duomenys rodo, jog muscimolis buvo aptiktas visuose mėginiuose, naudojant skirtingas kaitinimo temperatūras. Intensyviausia spalva, lyginant su standartiniu tirpalu, matoma ties 75 °C, taip pat muscimolis yra matomas ir ties 95 C, ir 110 C. Ties pastarosiomis temperatūromis kiekis yra mažesnis, nes, keliant temperatūrą, muscimolis pradeda irti. Temperatūros įtaka muscimolio kiekio variacijai pateikta 12 paveiksle.
12 pav. Temperatūros įtaka muscimolio kiekiui.
Temperatūra C Kiekis μg/ml 75 17,0130,51 95 16,9100,50 110 11,4030,57 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 75°C 95°C 110°C Ki ek is μ g/ ml
5.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas muscimolio
kiekybinei ir kokybinei analizei
Norint atlikti muscimolio ESC analizę, pirmiausia buvo apžvelgti moksliniai straipsniai, kuriuose aprašytos ESC metodikos šio junginio kokybinei ir kiekybinei analizei. Pagal anksčiau mokslininkų atliktus tyrimus buvo sumodeliuota mūsų ESC tiriamojo darbo eiga [40.41]. Pirminių ESC tyrimų metu stebėtos įvairios metodikos sąlygos muscimolio įvertinimui. Analitiniai tyrimai atlikti su muscimolio standartiniu tirpalu. Vykdant eksperimentinius tyrimus, buvo vertinamas chromatografinių smailių simetriškumas, rezultatų atsikartojamumas, muscimolio sulaikymo laikas. Tyrimų eigoje buvo naudotos 4 skirtingos kolonėlės : ACE C18 (250 x 4,6) 5μm ; ACE C18 (150 x 4,6) ; Hichrospher DIOL A 5μm (250 x 4,0 nm) ; ZIC – HILIC (150 x 2,1 nm) 3,5 μm, modifikuotos tirpiklių sistemos, sudarytos iš : acetonitrilas, metanolis, vanduo, trifluoracto rūgštis, amonio acetato buferis (pH 3,2 – 5,0), analizuotos eliucijos sąlygos (izokratinės, gradientinės), modifikuota chromatografinės kolonėlės laikymo temperatūra (25 – 45 C), vertintas eliuento tėkmės greitis (0,4 – 1,2 ml/m). Kai kurios analizuotos ESC sąlygos netenkino keliamų reikalavimų, t.y., netinkamas sulaikymo laikas, medžiaga išeidavo su „tuščiu tūriu“, smailės netenkino simetriškumo, metodikų rezultatai neatsikartodavo ir netenkino keliamų validacinių reikalavimų. Atlikus visus numatytus tyrimus, buvo pasirinktos tinkamiausios chromatografavimo sąlygos muscimolio kokybiniam įvertinimui (2 lent.). Muscimolis identifikuojamas pagal sulaikymo laiką (6,48 min 0,03) ir UV spektro sutapimą. ESC chromatograma pateikiama 13 paveiksle.
2 lentelė. Pasirinktos sąlygos tyrimui taikant ESC metodiką.
Ypatybė Sąlygos
Ekstrahentas Amonio acetato buferis (20 %)
Acetonitrilas (80 %)
Eliucijos sąlygos Izokratinės
Kolonėlė ZIC-HILIC (150 x2,1 nm) 3,5μm (45 C)
Pasirinkus chromatografavimo sąlygas, metodika buvo pritaikyta kiekybiniam muscimolio įvertinimui. Sudaryta kalibracinė muscimolio standartinių tirpalų kreivė, kalibracijos ribos 0,39-125 μg/ml. Pritaikius metodika kokybiniam ir kiekybiniam muscimolio nustatymui, atlikta metodikos validacija, įvertinant metodikos atsikartojamumą, tarpinį preciziškumą, aptikimo ir nustatymo ribas, specifiškumą, kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientą. Visi validaciniai reikalavimai tenkino jiems keliamus reikalavimus (3 lent.). Kalibracinė kreivė pateikiama 14 paveiksle.
13 pav. Muscimolio ekstrakto chromatograma.
3 lentelė. ESC metodikos validaciniai reikalavimai
Atsikartojamumas 0,3 %
Tarpinis preciziškumas 0,8 %
Aptikimo riba 0,60 μg/ml
Nustatymo riba 0,98 μg/ml
Koreliacijos koficientas R2 0,993
14 pav. Muscimolio standartinio tirpalo ESC kreivė.
Apibendrinant ESC tyrimų rezultatus iš daugelio taikytų chromatografinių sąlygų, buvo pasirinktos tinkamiausios sąlygos muscimolio kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti. Metodikai atlikta validacija kurios rezultatai tenkino visus validacinius reikalavimus. Pasirinkta metodika bus taikoma tolimesniuose tyrimuose su raudonųjų musmirių vaisiakūnių ekstraktais.
5.3. Muscimolio kiekio tyrimas raudonosiose musmirėse, taikant ESC ir EPC
metodikas
Atlikus A.muscaria L. grybų vaisiakūnių analizę ir pritaikius kiekybiniam nustatymui ESC ir EPC metodikas anksčiau aprašytomis sąlygomis, gauti duomenys (15 pav.).
P
lot
as
15 pav. Gauti muscimolio kiekybiniai (μg/ml) rezultatai, taikant skirtingas tyrimo metodikas ir tiriant
raudonąsias musmires, surinktas skirtingose Lietuvos vietovėse
Diagramoje pateiktuose rezultatuose matosi, jog taikant ESC, muscimolio kiekybiniai duomenys ženkliai didesni, lyginant su EPC. Vertinant dekarboksilinimo sąlygas, abiem metodais nustatyta, kad muscimolio didžiausi kiekiai gaunami prie 75 C temperatūros, kaitinant 1 valandą. Šios sąlygos buvo taikomos tolimesniuose tyrimuose su raudonųjų musmirių augalinėmis žaliavomis, surinktomis skirtingose Lietuvos vietovėse.
5.4 . Muscimolio kiekio palyginimas raudonosiose musmirėse, augančiose
skirtingose Lietuvos vietovėse
16 pav. Muscimolio kiekybinis (μg/ml) įvertinimas skirtingose Lietuvos vietovėse
60.302 46.323 37.29 27.155 17.123 13.357 0 10 20 30 40 50 60 70
Druskininkai Utena Klaipėda
ESC EPC 58.302 56.526 47.001 17.013 16.91 11.4 0 10 20 30 40 50 60 70 75°C 95°C 110°C ESC EPC Ki ek is μg/ ml K iek is μg/ ml
Atlikus ESC ir EPC kiekybinius muscimolio tyrimus nustatyta, kad didžiausi kiekiai muscimolio aptinkami Druskininkų regione, mažiausi - Klaipėdos regione. Lyginant kiekybinius rezultatus tarp metodų, matoma, kad ESC metodas yra jautresnis, efektyvesnis ir tikslesnis muscimolio analizei. Visuose tiriamuosiuose objektuose muscimolio kiekiai yra didesni, taikant ESC metodiką. Muscimolio kiekybiniai rezultatai grybų vaisiakūnių ekstraktuose tarp taikytų metodų skiriasi nuo 2,79 iki 2,22 karto. Atlikus statistinę duomenų analizę, įvertinus kiekybinius muscimolio rezultatus nustatyta, kad tarp taikomų metodų yra statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0,05).
Apibendrinant tyrimų rezultatus nustatyta, kad dekarboksilinimui geriausiai naudoti 75 C temperatūrą ir kaitinti 1 valandą. ESC ir EPC metodai yra tinkami muscimolio kokybinei ir kiekybinei analizei, tačiau ESC metodas yra jautresnis ir efektyvesnis, lyginant jį su EPC metodu, todėl jis turėtų būti pirmo pasirinkimo analitinis metodas.
5.5. Laisvųjų aminorūgščių nustatymas dujų chromatografijos – masių
spektrometrijos metodu
Atliekant eksperimentinę dalį, buvo išsikeltas uždavinys ištirti grybinėje augalinėje žaliavoje laisvųjų aminorūgščių kiekį, nes visi grybai yra baltyminės kilmės augalai, kurie savo sudėtyje kaupia didelį kiekį baltymų, o pastarieji sudaryti iš aminorūgščių (AR). AR atsakingos už daugelį svarbių gyvybinių funkcijų žmogaus organizme, pvz., energetinę, fermentinę. Norint išanalizuoti laisvąsias AR DC-MS metodu, reikia atlikti derivatizaciją. Tai metodas, kuomet prijungiama speciali funkcinė grupė, kuri junginiui suteikia papildomų savybių, tokių kaip lakumas, cheminis aktyvumas. Derivatizatoriais dažniausiai pasirenkami BSTFA ( N,O-bis(trimetil-silil)-trifluoroacetamidas) arba MTBSTFA (N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoracetamidas). Pastarojo derivatizatoriaus pranašumas yra tas, kad MTBSTFA derivatai atsparesni hidrolizei [34]. Mokslinės literatūros duomenimis, vienas iš dažniausių metodų laisvųjų AR nustatymui yra dujų chromatografija – masių spektrometrija (DC-MS). Mūsų analizės metu buvo naudojama dujų chromatografinė sistema Shimadzu GC-2010 plius ( Shimandzu Corporation, Japonija) su masių spektrometrijos detektoriumi. Atskyrimui naudojama silikagelio kolonėlė (Rxi-5ms), 30 m ilgio ir 0,25 mm vidinio skersmens, 0,25 μm nejudančios fazės sluoksnio storio, nešančios dujos – helis. Analitinės svarstyklės Shimadzu Auw 120 D ( Duisburgas, Vokietija), ultragarso vonelė Wise Clean. Tyrime buvo naudojamas distiliuotas vanduo, acetonitrilas (99,99%) (Sigma – Aldrich, Vokietija), aminorūgščių standartų mišinys (2,5 μmol/ml kiekvienos AR) ( Sigma-Aldrich, Vokietija). Ruošiant tiriamąjį tirpalą, 1 g liofilizuota augalinė žaliava užpilama ≥7 pH buferiu, viskas sumaišoma ir dedama į ultragarso vonelę 10 min. Po sonifikacijos ultragarsu gautas ekstraktas
paliekamas 24 val. tamsoje, periodiškai suplakant. Po 24 val. gautas ekstraktas centrifuguojamas (4000 rpm ) 5 min. Iš centrifugato paimamas 1 ml tirpalo ir išgarinamas iki sauso likučio po azoto srove. Gautos nuosėdos užpilamos 100 μl acetonitrilo ir 100 μl MTBSTFA derivatizatoriaus. Tirpalas kaitinamas 100C temp. 2,5 val. glicerolio vonelėje. Po to 1 μl tiriamojo tirpalo injekuojama į dujų chromatografą. Gauti duomenys pavaizduoti 17 paveiksle.
17 pav. DC-MS laisvųjų AR chromatograma raudonųjų musmirių ekstrakte.
Atlikus ekstrakciją, buvo atliekami kokybiniai tyrimai, norint nustatyti laisvųjų AR kiekį raudonosiose musmirėse. Tiriamajame mėginyje buvo nustatyta 12 laisvųjų AR, kurios identifikuotos atsižvelgiant į sulaikymo laiką ir masių spektro duomenis, šie parametrai buvo lyginami su standartinių tirpalų duomenimis. Nustatytos laisvosios AR pavaizduotos 4 lentelėje.
4 lentelė. Raudonųjų musmirių ekstrakte nustatytų laisvųjų AR kiekiai.
Kiekybinis įvertinimas atliktas pagal sudarytas kalibracines kreives, kalibracinių kreivių pavyzdžiai pateikiami 18 paveiksle.
18 pav. L-Alanino ir L-Metionino kalibracinės kreivės.
Smailės Nr. Sulaikymo laikas tR Pavadinimas
1. 14,962 L-Alaninas, 2TBDMS darinys 2. 16,464 L-Valinas, 2TBDMS darinys 3. 16,982 L-Leucinas, 2TBDMS darinys 4. 17,347 Izoleucinas, 2TBDMS darinys 5. 19,955 L-Metioninas, 2TBDMS darinys 6. 20,189 L-Serinas, 2TBDMS darinys 7. 20,514 L-Treoninas, 2TBDMS darinys 8. 21,201 L-Fenilalaninas, 2TBDMS darinys 9. 21,808 L-Asparto r, 2TBDMS darinys 10. 21,896 L-Glutamo r, 2TBDMS darinys 11. 23,839 L-Lizinas, 2TBDMS darinys 12. 26,009 L-Tirozinas, 2TBDMS ddarinys
Atlikus AR kiekybinius tyrimus, buvo nustatyta, kad daugiausia raudonųjų musmirių ekstraktuose yra L-Leucino (147,873 mkg/ml), sąlyginai dideli kiekiai Izoleucino (98,851 mkg/ml), Alanino (81,981 mkg/ml) ir valino (72,203 mkg/ml), mažiausias kiekis L–lizino (7,062 mkg/ml). Kiekybiniai rezultatai pateikiami 19 paveiksle.
19 pav. Nustatyti AR kiekiai raudonųjų musmirių ekstrakte (μg/ml)
5.6. Laisvųjų aminorūgščių kiekybinis palyginimas tarp A. muscaria L., pluoštinių
kanapių sėklų ir sėjamųjų grikių sėklų, taikant DC-MS metodą
Atlikus AR kiekybinę ir kokybinę analizę raudonųjų musmirių grybų augalinėje žaliavoje, gauti tyrimų rezultatai palyginti su AR kiekiu, rastu kitose augalinės kilmės žaliavose. Palyginamasis tyrimas buvo rengiamas pagal Mato Gaivenio magistro baigiamąjį darbą, kuriame nustatinėjo AR kiekį. Tyrimo metu buvo analizuotos pluoštinių kanapių (Cannabis sativa ) sėklos ir sėjamųjų grikių (Fagopyrum
esculentum) sėklos. Atlikus kiekybinę AR analizę raudonųjų musmirių augalinėje žaliavoje, buvo
palyginti bendri laisvųjų AR kiekiai su AR kiekiais, rastais pluoštinių kanapių (Cannabis sativa ) sėklose ir sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum) sėklose (20 pav.).
81.981 72.203 147.873 98.851 19.988 13.599 31.645 15.315 26.919 20.294 7.062 23.086 0 20 40 60 80 100 120 140 160
L-Alaninas L-Valinas L-Leucinas Izoleucinas L-Metioninas L-Serinas L-Treoninas L-Fenilalaninas L-Asparto r. L-Glutamo r. L-Lizinas L-Tirozinas
Ki
ek
is
μg/
20 pav. Laisvųjų AR kiekybiniai (μg/ml) rezultatai augaluose ir grybuose, taikant DC-MS metodą.
Iš diagramoje pateiktų kiekybinių rezultatų nustatyta, kad didžiausią AR kiekį kaupia raudonosios musmirės, nes grybų struktūros pagrindą sudaro baltymai. Mažiausią AR kiekį kaupia sėjamųjų grikių sėklos. Atlikus rezultatų statistinę analizę, galima daryti išvadą, kad raudonosios musmirės kaupia didžiausią kiekį AR, lyginant su AR kiekiu, kaupiamu pluoštinių kanapių ir sėjamųjų grikių sėklose. Šie rezultatai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).
558.826 217.418 20.957 0 100 200 300 400 500 600 700
A. Muscaria Cannabis Sativa Fagopyrum Esculentum A. Muscaria Cannabis Sativa Fagopyrum Esculentum
Ki
ek
is
μg/
6. IŠVADOS
1. Pritaikytos tinkamiausios muscimolio ekstrakcijos iš Amanita muscaria L. sąlygos, naudojant grybų liofilizavimą ir ekstrahuojant 70 proc. metanoliu. Tinkamiausios iboteno rūgšties dekarboksilinimo sąlygos : 75 C.
2. Pritaikytos plonasluoksnės chromatografijos sąlygos muscimoliui identifikuoti Amanita
muscaria L. vaisiakūniuose tirpiklių sistema : 1-butanolis : 70 proc. metanolis : acto rūgštis :
distiliuotas vanduo (75:25:5:7,5), Rf = 0,25 0,01.
3. Validuota muscimolio kiekybinio nustatymo ESC metodika, pagal kurią nustatomas muscimolio kiekis Amanita muscaria L. Kalibracinės kreivės koncentracijos ribos 0,39 – 125 μg/ml.
4. Įvertinus muscimolio kiekį grybuose, surinktuose skirtingose Lietuvos vietovėse, nustatyta, kad didžiausias muscimolio kiekis rastas Druskininkų rajono grybuose - 60 μg/ml, mažiausias – Klaipėdos - 37 μg/ml. Augimvietė statistiškai reikšmingų pokyčių muscimolio kiekio varijacijoje neturi. ESC yra efektyvesnis metodas, vertinant muscimolio kiekio varijavimą paprastosiose musmirėse, lyginant su EPC.
5. Įvertinus ir palyginus aminorūgščių kiekinę sudėtį, esančią raudonųjų musmirių vaisiakūniuose su esančia pluoštinių kanapių ir sėjamųjų grikių sėklose, nustatyta, kad didžiausias kiekis laisvųjų aminorūgščių rastas raudonosiose musmirėse.
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Nustatyta, jog geriausias ir efektyviausias metodas, atlikinėjant muscimolio kiekybinę ir kokybinę analizę yra efektyvioji skysčių chromatografija. Šią metodiką būtų galima pritaikyti, kuomet reikalingas greitas ir efektyvus metodas muscimolio identifikavimui.
2. Atlikus laisvųjų aminorūgščių analizę ir palyginus su kitais augalais, buvo nustatyta, kad raudonoji musmirė kaupia didelį kiekį aminorūgščių. Vystant tyrimus, būtų galima pabandyti išskirti tik laisvąsias aminorūgštis, be toksinių medžiagų, ir raudonųjų musmirių žaliavą vartoti kaip aminorūgščių turtingą žaliavą.
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Urbonas V, Mazelaitis J. Lietuvos grybai. Vilnius: Mokslo ir enciklopedijų leidykla; 1991. 2. Michelot D, Melendez-Howell LM. Amanita muscaria: chemistry, biology, toxicology, and
ethnomycology. Mycological Research. 2003;107(2):131–46.
3. Fly Agaric. Internetinė prieiga:
https://www.fs.fed.us/wildflowers/ethnobotany/Mind_and_Spirit/flyagaric.shtml.
4. Gummin DD, Mowry JB, Spyker DA, et al. 2016 annual report of the American Association of Poison Control Centers' National Poison Data System (NPDS): 34th annual report. Clin Toxicol. 2017;55:1072–1252.
5. Gupta RC. Veterinary toxicology basic and clinical principles. New York: Elsevier; 2007. 6. Stebelska K. Fungal Hallucinogens Psilocin, Ibotenic Acid, and Muscimol. Therapeutic Drug
Monitoring. 2013;35(4):420–42.
7. Ibotenic acid I2765. Sigma. Internetinė prieiga:
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i2765?lang=en®ion=LT[7]
8. Muscimol [Internetas]. Wikipedia. Wikimedia Foundation; 2019. Internetinė prieiga: https://en.wikipedia.org/wiki/Muscimol.
9. Magill AJ, Hunter GW. Hunters tropical medicine and emerging infectious diseases. London: Saunders Elsevier; 2013.
10. Misevicius I, Stonys A, Badaras R, Purvaneckas R, Kuzminskis V, Mačiulaitis R, et al. Klinikinė toksikologija. Vilnius: Mokslas; 1987.
11. Johnston GA, Curtis DR, De Groat WC, et al. Central actions of ibotenic acid and muscimol. Biochem Pharmacol. 1968;17: 2488–2489.
12. Chebib M, Johnston GAR (2000) GABA-activated ligand gated ion channels: medical chemistry and molecular biology. J Med Chem 43:1427–1447.
13. Chandra D, Halonen LM, Linden A-M, Procaccini C, Hellsten K, Homanics GE, et al. Prototypic GABAA Receptor Agonist Muscimol Acts Preferentially Through Forebrain High-Affinity Binding Sites. Neuropsychopharmacology. 2009;35(4):999–1007.
14. Krogsgaard-Larsen P, Johnston GAR (1978) Structure-activity studies on the inhibition of GABA binding to rat brain mem- branes by muscimol and related compounds. J Neurochem 30:1377–1382.
15. Beart PM, Curtis DR, Johnston GAR (1971) 4-Aminotetrolic acid: new conformational-restricted analogue of c-aminobutyric acid. Nature - New Biology 234:80–81.
16. Johnston GAR. Muscimol as an Ionotropic GABA Receptor Agonist. Neurochemical Research. 2014;39(10):1942–7.
17. Johnston G, Chebib M, Duke R, Fernandez S, Hanrahan J, Hinton T, et al. Herbal Products and GABA Receptors. Encyclopedia of Neuroscience. 2009;:1095–101.
18. N. E, P. A, D. W. Pyrethroids and Their Effects on Ion Channels. Pesticides - Advances in Chemical and Botanical Pesticides. 2012.
19. Chandra D, Halonen LM, Linden A-M, Procaccini C, Hellsten K, Homanics GE, et al. Prototypic GABAA Receptor Agonist Muscimol Acts Preferentially Through Forebrain High-Affinity Binding Sites. Neuropsychopharmacology. 2009;35(4):999–1007.
20. Oda T, Tanaka C, Tsuda M. Molecular phylogeny and biogeog- raphy of the widely distributed Amanita species, A. muscaria and A. pant henna. Mycol Res. 2004;108:885–896.
21. Tulloss RE, Lindgren JE. Amanita aprica–a new toxic species from western North America. Mycotaxon 2005;91:193–206.
22. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms =: Berkeley, CA: Ten Speed Press; 2000. 23. Vendramin A, Brvar M. Amanita muscaria and Amanita pantherina poisoning: two syndromes.
Toxicon. 2014;90:269–272.
24. Gilbert EJ, Senyuva EH. Bioactive Compounds in Foods. John Wiley & Sons; 2008.
25. Moss MJ, Hendrickson RG. Toxicity of muscimol and ibotenic acid containing mushrooms reported to a regional poison control center from 2002–2016. Clinical Toxicology. 2018;57(2):99–103.
26. Magill AJ. Hunters tropical medicine and emerging infectious diseases. London: Elsevier Saunders; 2013.
27. Muscimol: GABA agonist therapy in schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 1978;135(6):746–7.
28. Xu J, Liu Y, Zhang G- Y. Neuroprotection of GluR5-containing kainate receptor activation against ischemic brain injury through decreasing tyrosine phosphorylation of N-methyl-d-aspartate receptors mediated by src kinase. J Biol Chem. 2008;283:29355–29366.
29. Kurjak M, Fichna J, Harbarth J, et al. Effect of GABA-ergic mechanisms on synaptosomal NO synthesis and the nitrergic component of NANC relaxation in rat ileum. Neurogastroenterol Motil. 2011;23:e181–e190.
30. Wang M, Wang Y-H, Avula B, Radwan MM, Wanas AS, Antwerp JV, et al. Decarboxylation Study of Acidic Cannabinoids: A Novel Approach Using Ultra-High-Performance Supercritical Fluid Chromatography/Photodiode Array-Mass Spectrometry. Cannabis and Cannabinoid Research. 2016;1(1):262–71.
31. Sarmadi BH, Ismail A. Antioxidative peptides from food proteins: A review. Peptides. 2010;31(10):1949–56.
32. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon M, Feng L, Zhao G, Ryba N et al. An amino-acid taste receptor. Nature. 2002;416(6877):199-202.
33. Yoshimura T, Esak N. Amino acid racemases: Functions and mechanisms. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2003;96(2):103-109.
34. Tu AT. Food poisoning. New York: Dekker; 1992.
35. Tsujikawa K, Kuwayama K, Miyaguchi H, Kanamori T, Iwata Y, Inoue H, et al. Determination of muscimol and ibotenic acid in Amanita mushrooms by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2007;852(1-2):430–5.
36. Stříbrný J, Sokol M, Merová B, Ondra P. GC/MS determination of ibotenic acid and muscimol in the urine of patients intoxicated with Amanita pantherina. International Journal of Legal Medicine. 2011;126(4):519–24.
37. Villas-Bôas S, Smart K, Sivakumaran S, Lane G. Alkylation or Silylation for Analysis of Amino and Non-Amino Organic Acids by GC-MS?. Metabolites. 2011;1(1):3-20.
38. Gökmen V, Acar J. Rapid reversed-phase liquid chromatographic determination of patulin in apple juice. Journal of Chromatography A. 1996;730(1-2):53–8.
39. Gennaro MC, Giacosa D, Gioannini E, Angelino S. Hallucinogenic Species in Amanita Muscaria. Determination of Muscimol and Ibotenic Acid by Ion-Interaction HPLC. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 1997;20(3):413–24.
40. Guest. Foodborne Disease Handbook, Volume 3: Plant Toxicants 2nd Edition - PDF Free Download [Internetas]. epdf.tips. EPDF.TIPS. Internetinė prieiga: https://epdf.tips/foodborne-disease-handbook-volume-3-plant-toxicants-2nd-edition.html.
9. PRIEDAI
1. Pristatytos mokslinės tezės tarptautinėje konferencijoje „BaltPharm Forum 2019” “Determination of muscimol in Amanita muscaria L. by high - performance thin – layer chromatography (HPTLC) method after decarboxylation”.
2. Pristatytos mokslinės tezės tarptautinėje konferencijoje „ Topical issues of new medicines development“, „Determination of amino acids in Amanita muscaria L. by gas – chromatography mass-spectrometry (GC-MS) method after derivatization“.
