BIOTECHNOLOGINIŲ PRIEMONIŲ PANAUDOJIMO GALIMYBĖS DEOKSINIVALENOLIO DETOKSIKACIJAI KVIEČIUOSE

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA

Vilmos Laivienės

BIOTECHNOLOGINIŲ PRIEMONIŲ PANAUDOJIMO

GALIMYBĖS DEOKSINIVALENOLIO DETOKSIKACIJAI

KVIEČIUOSE

Magistro darbas

Darbo vadovė:

lektorė dr. ELENA BARTKIENĖ

Kaunas 2007

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA

Magistro darbas atliktas 2005-2007 metais Lietuvos veterinarijos akademijos, Gyvulininkystės fakulteto, Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedroje- ELISA metodu (2006m.), o KTU Cheminės technologijos fakultetas, Maisto produktų ir technologijos katedroje, - akustiniu metodu (2006m.).

Magistro darbą paruošė: Vilma Laivienė ________________ (Vardas, pavardė) (parašas)

Magistro darbo vadovas: lektorė dr. Elena Bartkienė _______________

(LVA Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedra) (parašas)

Recenzentas (ai):

______________________________________

_____________

TURINYS

1. ĮVADAS 5 2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Mikotoksinai grūdinėje žaliavoje ir jų detoksikacijos technologiniuose procesuose galimybės

7 7

2.1.1. Fusarium genties pelėsių išplitimas 7

2.1.2. Deoksinivalenolio reguliavimas tarptautinėje praktikoje 7

2.1.3. Trichotecenų nustatymo metodai 10

2.1.4. Galimas mikotoksinų sumažinimas technologinėmis priemonėmis 11

2.1.5. Kovos su mikotoksinų daroma žala strategijos 13

3. DARBO METODIKA 15

3.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas 15

3.2. Tyrimų objektai, medžiagos ir jų paruošimas analizei 3.2.1. Grūdinės žaliavos charakteristika

3.2.2. Kvietinės duonos su raugu gamyba

3.2.3. Bioetanolio gamybos technologinė schema

16 16 18 20

3.3. Tyrimų metodai 22

3.3.1. Metodai fuzarioze užkrėstiems grūdams įvertinti 22

3.3.1.1. Akustinio metodo charaketristika 22

3.3.1.2. Tradicinis imunofermentinis ELISA metodas 24

3.4.1. Metodai taikyti technologiniuose procesuose 3.4.1.1. Kvietinės duonos su raugais gamyba

3.4.1.2. Bioetanolio gamyba

25 25 26

3.5. Matematinis statistinis tyrimų rezultatų įvertinimas 26

4. TYRIMŲ REZULTATAI 28

4.1. Akustinio metodo panaudojimo galimybių tyrimas 28

4.1.1. Optimalaus akustinio signalo dažnio parinkimas 28

4.1.2. Vystomo akustinio ir tradicinio ELISA metodų palyginamasis įvertinimas 31 4.1.2.1. Fuzarioze užkrėstų kviečių kiekio įtaka akustinio signalo parametro vertėms 31 4.1.2.2. Modelinių Fuzarioze užkrėstų kviečių mėginių vertinimas akustine technika 33 4.2. Biotechnologiniai priemonių panaudojimo galimybės mikotoksinams

detoksikuoti

36 36

4.2.1. Duonos gamyboje fermentacinių procesų įtaką DON kiekiui pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose

4.2.2. Fermentacijos įtaka DON kiekiui žlaugtuose bioetanolio gamybos metu IŠVADOS SANTRUMPOS LITERATŪRA SUMMARY PRIEDAI 39 44 45 46 48 50

1. ĮVADAS

Integruojant Lietuvos maisto pramonę į ES rinką, svarbus dėmesys skiriamas pagamintos produkcijos kokybei ir saugai. Grūdų produktai užima 60 procentų žmogaus mitybos racione ir yra viena iš pagrindinių žaliavų tiek žmogaus, tiek ir pašarų gamyboje (Coker R. D., Nagler M. J., Blunden G., Sharkey A. J., Derksen G. B., T. B.Whitaker, 1995). Todėl labai svarbu, kad ji atitiktų ES galiojančius reglamentus. Ypatingas dėmesys skiriamas teršalams - mikotoksinams, susidarantiems grūdų auginimo ir laikymo metu. Grūdų kokybei užtikrinti turi būti kontroliuojama visa grūdų gamybos ir perdirbimo grandinė, pradedant nuo pirminės grūdų gamybos iki grūdų produktų realizavimo vartotojui.

Aukšto žmonių gyvenimo ir sveikatos lygio siekimas yra vienas iš pagrindinių maistui skirtų teisės aktų siekiamų tikslų.Lietuvos Respublikos maisto įstatymas (Žin., 2000, Nr. 32-893; 2002, Nr. 64-2574, 2003, Nr. 92-4139, 2004, Nr. 93-3397) įpareigoja maisto įmones maistui tvarkyti ir jo saugai užtikrinti taikyti rizikos veiksnių analizės ir svarbiųjų valdymo taškų sistemą (RVASVT). Lietuvos higienos norma HN 15:2005 „Maisto higiena“ (Žin., 2005, Nr. 110-4023) nustato esminius maisto saugos užtikrinimo bei RVASVT sistemos reikalavimus. Europos Sąjungos mastu bendrosios maisto produktų higienos taisyklės išdėstytos Tarybos direktyvoje 93/43/EEB „Dėl maisto produktų higienos“ bei Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 178/2002.

Nuo 2006 m. sausio 1 d. įsigaliojusiuose Europos Parlamento ir Tarybos reglamentuose (EB) Nr. 852/2004, dėl maisto produktų higienos bei Nr. 183/2005, apibrėžiančio pašarų higienos reikalavimus, akcentuojamas integruotas požiūris į maisto ir pašarų saugą nuo pirminės jų paruošimo vietos iki pateikimo į rinką ir išdėstyti reikalavimai pirminei gamybai, bei apibrėžta verslo operatorių atsakomybė. Pagal šių reglamentų reikalavimus, visi grūdų augintojai privalės vadovautis geros higienos praktikos taisyklėmis. ES valstybės narės skatinamos perorganizuoti grūdų perdirbimo pramonę, numatant technologines priemones RVASVT principų užtikrinimui tiek maisto, tiek ir pašarų sektoriuose.

Vadovaujantis šiais principais, toksinų, dar vadinamų mikotoksinais, kuriuos gamina pelėsiniai grybai, problemos negalima nepaisyti, nes visuomenės sveikatos, žemės ūkio ir ekonominiu požiūriu ji labai aktuali. Tai rodo ir 2005 m. birželio 6 d. priimtas Europos bendrijų komisijos reglamentas (EB) Nr. 856/2005, dėl Fusarium toksinų, kuris įsigaliojo ES nuo 2006 m. liepos 1 dienos.

Pastaruoju metu atkreiptas dėmesys į greitų metodų mikotoksinų aptikimui vystymo aktualumą ir technologines priemones įtakojančias jų detoksikaciją.

Šio darbo tikslas - nustatyti įvairių biotechnologinių priemonių įtaką deoksinivalenolio (DON) kiekiui fuzarioze užkrėstų kviečių perdirbimo produktuose, panaudojant šio mikotoksino aptikimui grūdinėje žaliavoje greitą akustinį ir ELISA metodą. Spręstini uždaviniai:

• Ištirti greito akustinio metodo panaudojimo galimybes DON kviečiuose aptikti;

• Nustatyti kvietinės duonos fermentacinių procesų įtaką DON kiekiui pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose, naudojant ELISA metodą;

•

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Mikotoksinai grūdinėje žaliavoje ir jų detoksikacijos technologiniuose procesuose galimybės

2.1.1. Fusarium genties pelėsių išplitimas

Mikotoksinus gaminantys pelėsiniai grybai suardo grūdus, keisdami jų struktūrą, o pasigaminę toksinai užkrečia maistą bei gyvulių pašarus. Vien tik augaluose pelėsiniai grybai sukelia apie 10 000 įvairių ligų (J. Miller Jones, 2000). Geriausiu, sukeliamų ligų pavyzdžiu, galėtų būti kviečių, rugių ir miežių “susiraukšlėjimas” (“šašų” liga), atsirandantis Fusarium genties pelėsinių grybų (dar vadinamų “lauko pelėsiais”) veiklos pasekoje. Kviečiai priskiriami prie jautriausių šiam susirgimui javų ir gali būti pavojingu Fusarium genties pelėsių gaminamų mikotoksinų, tame tarpe ir deoksinivalenolio (DON) arba vomitoksino, šaltiniu. Manoma, kad XIII a. Vakarų Europoje smarkų gyventojų sumažėjimą sukėlė būtent rugių pakeitimas fuzariozei neatspariais kviečiais. Deoksinivalenolis pavojingas tiek žmonėms, tiek ir gyvuliams. Jis gali pažeisti žinduolių organus, silpninti imuninę sistemą ir mažinti gyvulių produktyvumą. Su grūdų fuzarioze kovoti sunku, nes tam išimtinai įtakos turi klimatinės sąlygos. Ypač palankios sąlygos Fusarium genties pelėsinių grybų plitimui susidaro tuose regionuose, kuriuose kritulių iškrinta daugiau nei jų išgaruoja (FAO, Food and Nutrition paper, 2001). Lietuva taip pat priskiriama tokiems regionams.

2.1.2. Deoksinivalenolio reguliavimas tarptautinėje praktikoje

Pastaruoju metu atkreiptas dėmesys į Fusarium genties pelėsių gaminamus mikotoksinus ir nuo 2006 m. liepos 01 d. ES pagal priimta Europos bendrijų komisijos reglamentą (EB) Nr. 856/2005, dėl Fusarium toksinų numatoma papildomai reguliuoti pagrindinį jų atstovą – deoksinivalenolį (DON). Šios rūšies mikotoksinų susidarymą pagrinde nulemia klimatinės sąlygos, dėl to labai sunku išvengti šių mikotoksinų pirminėje grūdų gamybos grandinėje.

DON yra labiausiai paplitęs augaliniuose produktuose mikotoksinas (antras po aflatoksino) ir jo acetilo dariniai 3-AcDON ir 15-AcDON bei nivalenolis (NIV) (H. Petterson, L. Aberg, 2003). Todėl akivaizdu, jog šio mikotoksino analizei turėtų būti skirtas pakankamai didelis dėmesys.

Su mikotoksinų veikla siejami dideli ekonominiai nuostoliai, žalingas fuzariozinių grūdų poveikis žmogaus sveikatai, gyvulių produktyvumui ir t.t..

Turint omenyje, kad DON daugiausiai yra grūduose, o pastarieji sudaro apie 60 % žmogaus ir gyvūnų suvartojamo maisto ar pašaro kiekio, galima tik įsivaizduoti problemos mastą. JAV Žemės ūkio mokslo ir technologijos mikotoksinų tarybos (Council for Agriculture Science and Technology (CAST) in the US on Mycotoxins) ataskaitoje pateikta mikotoksinų grūduose problemos piniginė išraiška. Šios ataskaitos 142 puslapyje rašoma: ,,Nustatyta, jog dėl DON grūdų (daugiausia kviečių ir kukurūzų) nuostoliai per metus vidutiniškai sudaro 637 mln dolerių, pašarų nuostoliai – 18 mln dolerių. Gyvulininkystė kasmet patiria 2 mln dolerių nuostolių”. Įvertinant, kad tokie nuostoliai skaičiuojami ypač išsivysčiusioje šalyje – JAV, kur mitybos saugos reguliavimo režimas lyginant su kitomis šalimis gana “švelnus”, ir kad šie duomenys apima tik kviečius ir kukurūzus, o ne visus javus, pavyzdžiui, miežius ir rugius, kuriuos taip pat pažeidžia Fusarium pelėsiniai grybai, galima tik įsivaizduoti, kokie dideli kasmet yra šie nuostoliai visame pasaulyje (bln dolerių!). ES panašūs skaičiavimai kol kas nėra atlikti, tačiau žinant, kad ES reguliavimo politika mikotoksinų srityje daug griežtesnė nei JAV, o taip pat vyrauja skirtingos klimato zonos, kritulių kiekis, perdirbimo (džiovinimo) technologijos ir kad ES padidėjo, prisijungus 10 mažiau išsivysčiusių šalių, nuostolių apimtys fuzariozės protrūkio metu turėtų siekti apie 1 bln eurų per metus. Pagal FAO, žemės ūkio produktų nuostoliai dėl visų mikotoksinų išsivysčiusiose šalyse turėtų sudaryti apie 5 %, mažiau išsivysčiusiose šalyse – nuo 15 iki 20 %, o besivystančiose šalyse – iki 50 %. Kad ir kokie būtų dabartiniai ekonominiai nuostoliai ES, jie, manoma, didės sugriežtinus mikotoksinų reguliavimo politiką. Dabartinis grūdų užkrėstumo mikotoksinais lygis ES ir mirčių atvejai, valgant duoną, pagamintą iš užkrėstų kviečių, praeityje: Tarybų Sąjungoje tuoj po Antrojo pasaulinio karo (mirtingumas sudarė 60 %), Kašmyro slėnyje Indijoje 1989 m. (pakenkta 50000 žmonių sveikatai) ir Raudonajame Slėnyje, tai paskatino ES parengti naują mikotoksinų kiekio reguliavimo reglamentą. Lietuvos, kaip grūdų eksportuotojos, pozicija nėra stabili ir priklauso nuo leistinų DON normų priimtame reglamente, kuris įsigaliojo nuo 2006 m. liepos 1 dienos. Be poveikio žmonėms, net ir santykinai mažas DON kiekis grūduose turi neigiamą poveikį gyvuliams. Kiaulėms jis pasireiškia esant pašaruose DON kiekiui mažesniam nei 350 µg/kg, todėl Europos grūdų pašarų asociacija (EGFA) pasiūlė, kad kiaulių pašarams gaminti skirtuose grūduose DON kiekis neturi viršyti 750 µg/kg.

Dėl šių priežasčių ypatingas dėmesys pradėtas skirti DON kiekio grūduose kontrolei. ES vartojamo maisto tyrimai – Mokslinės bendradarbiavimo programos (Scientific

Co-šalia kitų mikotoksinų. Tyrimai parodė, kad ES nepalankaus klimato metais DON kiekis grūduose gali siekti iki 10000 μg/kg. Todėl reglamento projektas, kuriame patvirtintos didžiausios leistinos DON koncentracijos grūduose ir jų produktuose apie 1250 - 200 µg/kg (kaip parodyta 2.1 lentelėje), gali apsunkinti maisto saugos kontrolę grūdų perdirbimo grandinėje. Yra nemažai pranešimų apie Europoje užaugintuose grūduose randamą DON kiekį, kuris viršija ES reglamente numatytas jo ribas. Neseniai nustatyta, jog ketvirtadalyje Danijoje užauginamų žieminių kviečių DON kiekis viršijo 1250 µg/kg (T. Borjesson, J. Olsson, 2004). Jeigu šis faktas būtų ignoruojamas, kai kurios pramonės šakos tikriausiai patirtų nemažus nuostolius, galinčius susidaryti dėl pašarų netinkamumo, mažesnio gyvulių svorio prieaugio ir prastesnės mėsos kokybės.

Tai skatina grūdų supirkėjus ir perdirbėjus būti suinteresuotais eliminuoti fuzarioze užkrėstus susiraukšlėjusius grūdus (“Scab”) galimai ankstesnėse grūdų perdirbimo grandyje ir užkirsti kelią DON patekimui į grūdų produktus.

2.1 lentelė. Leistinas DON kiekis grūduose ir grūdų produktuose

Nr. DON grūduose ir grūdų produktuose, išskyrus ryžius _{ir ryžių produktus} Maksimali _{koncentracija µg/kg} 1. Neperdirbti grūdai

1_{, išskyrus durum kviečius, avižas ir}

kukurūzus 1250

2. Neperdirbti durum kviečiai, avižos ir kukurūzai2 1750

3.

Grūdų miltai, jų tarpe kukurūzų miltai, kukurūzų kruopos, kukurūzų maistas ir kiti panašūs produktai,

kaip kruopmilčiai 750

4. Duona, tortai, sausainiai, užkandžiai ir grūdų pusryčiai 500

5. Makaronai (sausi) 750

6. Grūdų pagrindu pagamintas kūdikių ir mažų vaikų _maistas3 200 Pastabos:

1 “Neperdirbti grūdai”- tai superkami grūdai, skirti pirmai perdirbimo stadijai 2 Jei iki 2007 liepos 1d. nebus pakeitimų, bus palikta norma 1750 µg/kg 3 Visos maksimalios normų ribos pateiktos sausosiomis medžiagomis

2.1.3. Trichotecenų nustatymo metodai

Pasaulinėje praktikoje mikotoksinų nustatymui iki šiol dažniausiai naudoti daug darbo jėgos ir laiko reikalaujantys cheminiai fizikiniai pamatiniai mikotoksinų analizės metodai, tai yra: plonasluoksnė chromatografija (PLC), skysčių chromatografija (SC) arba dujų chromatografija (DC) su įvairiais detektoriais, įskaitant ir masių spektrometriją (MS), o iš naujesnių metodų – DC su liepsnos jonizacijos detektoriumi (LJD), skirtą kviečiuose esančio DON, išekstrahuoto CH3CN/H2O ir išgryninto pagal Mycosep metodiką nustatymui. Taip pat

ELISA, PCR ir kt. metodai (Task Force Report, 2003).

Mikotoksinų analizės procedūra, kuri pateikta 2.1 paveiksle, yra sudėtingas procesas sudarytas iš trijų etapų:

1. Ėminių iš grūdų partijos paėmimas ir laboratorinio ėminio atskyrimas;

2. Tiriamojo ėminio atskyrimas ir smulkinamas, tiriamosios ėminio dalies atskyrimas; 3. Mikotoksinų iš tiriamosios ėminio dalies ekstrahavimas ir jų kiekio nustatymas

(analizuojama laboratoriniais pamatiniais metodais, pavyzdžiui, PLC, SC/MS, DC-LJD, ELISA, PCR ir t.t.). Šie metodai paprastai apima tokius etapus: ekstrahavimą tirpikliais, centrifugavimą, filtravimą, džiovinimą, praskiedimą ir kiekybinį įvertinimą. Esant daugiapakopei mikotoksinų analizei, pakartotinų tyrimų rezultatai gali tarpusavyje smarkiai skirtis. Be to, šie skirtumai didėja, didėjant mikotoksinų koncentracijai tiriamajame ėminyje. Partija Ėminio paėmimas Tiriamojo ėminio paruošimas Tiriamoji ėminio Struktūrą ardanti procedūra Bekontaktinė procedūra Analizė DON REZULTATAI

Vokiečiai, pirmieji pradėję reguliuoti (prieš ES išleidžiant reglamentą) DON kiekį grūduose (500 µg/kg), nustatė, jog ES galiojančios grūdų ėminių ėmimo procedūros neatspindi tikrojo mikotoksinų kiekio grūduose ir jas reikia keisti, t.y. didinti laboratorinio ėminio kiekį arba ėminių DON analizei skaičių. Šiuo požiūriu ypač išryškėja privalumas greitų ir paprastų metodų, sąlygojančių greitą analizę ir leidžiančių ištirti daugiau grūdų ėminių su mažesnėmis sąnaudomis (laiko, personalo, cheminių medžiagų ir t.t.). Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas greitų ir paprastų metodų kūrimui. ES šioje srityje atsilieka nuo pagrindinių grūdų eksportuotojų: JAV, Kanados ir kt., kur jau įdiegtos reikiamos grūdų kontrolės sistemos. Pavyzdžiui, firma Acurum, remiama Kanados grūdų komisijos (CGC), išvystė vaizdo analizės būdu veikiantį prietaisą su kompiuterinių duomenų apdorojimu defektuotų grūdų įvertinimui ir apibūdinimui. Tačiau pastaroji technika iki šiol neįvertina DON kiekybiškai. Be to, ši technika yra brangi ir naudoja mažą mėginio kiekį, kas neatitinka ES reikalavimų reprezentatyviam mėginiui sudaryti.

Įvertinant tai, kad metodai mikotoksinams tirti sudėtingi ir brangūs, todėl grūdų produktų gamybos procesuose išskirtinis dėmesys turi būti skiriamas technologinėms priemonėms, sąlygojančioms mikotoksinų sumažinimą, o tuo pačiu ir RVASVT sistemos užtikrinimą gamybos procese.

2.1.4. Galimas mikotoksinų sumažinimas technologinėmis priemonėmis

Trichotecenai yra Fusarium, Myrothecium, Trichotehecium, Cephalosporium,

Verticimosporium ir Stachybotrys geno antrinio metabolizmo produktai (Q. K. Beg, M.

Kapoor, L. Mahajan, G. S. Hoondal, 2001). Juos gali pagaminti mikroorganizmai prieš ir po derliaus 0 ir 35 ºC temperatūroje, kai santykinis drėgnis 80 % - 90 %. Užkrėsti javai yra pagrindiniai nemakrociklinių trichotecenų šaltiniai maiste ir gyvulių pašaruose, ypač tokiuose grūdiniuose javuose kaip avižos, kviečiai, kukurūzai ir ryžiai (R. V. Bhat, S. R. Beedu, Y. Ramakrishna, K. L. Munshi, 1989).

Trichotecenai yra palyginti stabilūs apdorojant maisto gaminius, todėl sunkiai pašalinami net iš nelabai užkrėstų grūdų. Tyrinėtojų dažniausiai randami DON ir B grupės trichotecenas. Kitas, T-2 toksinas, yra A grupės trichotecenas. Jis yra labai toksiškas ir dažniausiai randamas maisto produktuose.

Keletas autorių: Smitas (1990), Skotas (1984,1993), Benetas ir Ričardas (1996), studijavo šių mikotoksinų detoksifikaciją. Detoksifikacijai buvo pasitelktos fizikinės, cheminės ir mikrobiologinės procedūros, kurios galėtų sunaikinti, modifikuoti arba absorbuoti

šiuos mikotoksinus ir tokiu būdu redukuoti arba eliminuoti jų toksinį poveikį. Grūdams panaudojant fizikinį procesą galima sumažinti pelėsinių grybų lygį ir jų užkrečiamuosius metabolitus. Tarp šių procesų valymas ir malimas yra pagrindiniai, bet jų rezultatai skiriasi, priklausomai nuo mikotoksinų ir kokia procedūra buvo analizuojama. Fermentacijos metu, gaminant duoną iš kviečių, užkrėstų DON, buvo įrodyta, kad mikotoksinus, ypač DON, galima pašalinti.

Skotas (1992) atliko mini alkoholinės fermentacijos su Saccharomycies cerevisiae eksperimentus, panaudojant salyklą, užkrėstą DON ir zearalenonu, kurių rezultatai po 7-9 dienų trukusios fermentacijos parodė, kad DON buvo sunkiai skaidomas (stabilus). Iš pradinio zearalenono turinio 69% pavirto į ß- zearalenolį (ß-ZEL) ir 8,1% į α- zearalenolį. Daugiausiai zearalenonas metabolizavosi pirmąją ir antrąją fermentacijos dieną, kas parodo šių mikotoksinų nestabilumą vykstant fermentacijai. Mielės Saccharomycies cerevisiae sumažina T-2 toksino ir DON lygius alkoholinės fermentacijos metu.

Kitos mielės Candida lipolytica, panaikina 12% pradinio kiekio T-2 toksino per 23 dienas.

Pagal Benetą ir Richardą (1996), DON nebuvo visiškai panaikintas alkoholinės fermentacijos metu ir jo kiekis buvo pakankamai didelis tiek kietuose radikaluose, tiek ir fermentuotame skystyje. Tas pats taikoma ir zearalenonui, ir fumonisinui. Šie rezultatai parodo, jog kitos procedūros - tankumo skaidymas, veikimas cheminiais reagentais ar tik plovimas vandeniu, turėtų būti taikomos grūdams, vartojamiems kaip žaliava fermentacijai, o taip pat, kad fermentacijos poveikis užkratui pašalinti turėtų būti labiau įvertintas.

Taip pat, literatūroje yra duomenų apie alkoholinės fermentacijos poveikį salyklui, užkrėstam trichotecenais. Salyklas, užkrėstas DON ir T-2 toksinų nuo 0 iki 1000 ng/g, buvo panaudotas fermentacijai pagal laboratorinę skalę nustatyti minėtų toksinų dezaktyvacijai, taikant alkoholinę fermentaciją, naudojant Saccharomyces cerevisiae. Fermentacija buvo atliekama 120 h 14 ºC. Užkrato redukcija buvo įvertinta GC. 41 % pradinio DON ir T-2 toksino užkrato buvo pervesta į galutinę skysčio porciją. 6 % pradinio užkrato buvo nustatyta augaluose, kuriuose buvo 53 % viso DON ir T-2 toksino užkrato, skaičiuojant kartu augaluose ir filtruotame pavyzdyje.

Perdirbimas nėra labai efektyvus būdas mikotoksinams šalinti, tačiau jis yra lemiamas norint kiek galima daugiau užkirsti kelią jų susidarymui.

maisto komponentai ir prieskoniai, pavyzdžiui, pipirai, garstyčios, cinamonas, česnakas, taip pat gali būti mikotoksinų inhibitoriais užterštoje produkcijoje.

Sutelkta daug pastangų, siekiant apsaugoti grūdus nuo užterštumo mikotoksinais. Pasirodė, kad tiek amoniakas, tiek ozonas ardo tuos pačius grūduose esančius mikotoksinų tipus ir nelieka jokio žalingo poveikio ar nuosėdų produkte.

Fusarium graminearum ir Fusarium culmorum grybai pagrindinės priežastys

atsiradimui DON kviečiuose. DON – trichotecenas mikotoksinas, kuris trukdo DNR, RNR baltyminę sintezę, o tai gali sukelti gyvuliams apetito nebuvimo sindromą ir t.t..

2.1.5. Kovos su mikotoksinų daroma žala strategijos

Nuolatiniai žemės ūkio ir maisto gamybos tyrimai, taip pat FDA tyrimai leidžia aptikti pėdsakus užteršto pašaro ir maisto produktų. Užterštų produktų protrūkis, peržengiantis leistinas ribas ir naikinimas užterštų grūdų likučių, padeda išlaikyti mikotoksinų lygį pašaruose ir maisto daviniuose gerokai žemesnį nei problemišką.

Žemės ūkio technika, tokia kaip grūdų džiovinimas oru ar kontroliuojamos saugyklos sąlygos padeda palaikyti drėgmės lygį žemiau kritinio ir tokiu būdu mažėja pelėsių augimas ir galimas užterštumas mikotoksinais. Atitinkama drėgmė grūdų augimo metu (dėl lietaus, melioracijos) ir grūdų sėjomaina leidžia sumažinti užterštumą mikotoksinais.

Kai kurie vitaminai, esantys maiste, veikia prieš žalingą mikotoksinų veikimą. Jei fermeriai nuspręs nedžiovinti grūdų, drėgmė, esanti grūduose gali sukelti pelėsių augimą, tai galimi nuostoliai ekonominiu požiūriu bei susirgimai.

Namuose labai svarbu mažinti supelėjusio maisto patekimo galimybę į maisto racioną. Dauguma žmonių išmeta maistą, kuriame galimi pelėsių požymiai. Pavyzdžiui, sūris yra išimtis, kur supelėję paviršiai gali būti pritaikomi. Kai aflatoksinai įsiskverbia į produktą 4 cm nuo paviršiaus, giliai nupjaudami garantuojame, kad produktas bus saugus. Jei yra apipelėję visi sūrio paviršiai, galime jį apipjaustyti ir apipjaustytas dalis išmesti, nes taip bus saugiau. Maistas, kuris yra skystas, pavyzdžiui, sultys, džemai ir kt., tokiu atveju neturėtu būti vartojami maistui. Dauguma toksinų yra termostabilūs, todėl tolimesnis šildymas nepadaro maisto saugiu. Šaldymas taip pat nesustabdo toksinų veikimo.

Duona, kurioje nėra konservantų, pelėja greičiau. Pagaliau, mes galime rinktis ką pirkti, ar duoną su konservantais ir pasitenkinti nerizikingu mažu kalcio propionato poveikiu arba pirkti duoną be konservantų. Duona be konservantų pelėja greičiau, sukeldama 100 % riziką, dėl natūralaus kancerogeno aflatoksino. Tačiau mes galime sušaldyti duoną, kad sumažintume

pelėsių ir mikotoksinų gamybą, tačiau duona greičiau sužiedėja šaltoje temperatūroje. Jei yra pakankamai vietos šaldytuve, riešutų ir grūdų produktų laikymas šaltai padeda apsaugoti nuo pelėsių augimo ir išlaikyti jų optimalią kokybę.

Taigi, dėl pelėsiais užteršto maisto mes turime keletą rizikos galimybių. Mes galime pasirinkti kokią norime riziką pirkdami atitinkamus produktus turguje arba prisiimdami atsakomybę laikyti produktus saugiai namuose.

Augdami ir vystydamiesi ant grūdų, ypač Fusarium genties pelėsiniai grybai ne tik juos užteršia toksinais, bet ir blogina juslines, technologines savybes, mažina grūdų ir jų produktų maistinę vertę. FAO duomenimis dėl fuzariozės padarytos žalos grūdams, kasmet pasaulis patiria bilijonus dolerių nuostolių. Užkrėsti grūdai turi neigiamą poveikį gyviems organizmams. Be to, net ir mažas DON kiekis grūduose, veikia gyvulius: kiaulės vemia ir joms krenta svoris. Ryšium su tuo iškyla aktuali DON nustatymo ir detoksifikavimo technologiniuose procesuose problema. Šios problemos skatina vystyti pažangias biotechnologines priemones mikotoksinams detoksifikuoti ir bekontakčius metodus, kuriuos būtų galima pritaikyti DON kontrolei maisto grandyje.

3. DARBO METODIKA

3.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas

Sprendžiant mikotoksinų detoksikacijos problemą fuzarioze užkrėstų kviečių perdirbimo procesuose, išbandytos įvairios biotechnologinės priemonės: duonos raugų gamyboje – pienarūgštis rūgimas, o bioetanolio gamyboje – grūdinės žaliavos sucukrinimas ir spiritinis rūgimas. DON aptikimui fuzarioze užkrėstuose kviečiuose išbandytas greitas bekontaktis akustinis metodas. Pagrindiniai tyrimų etapai pateikti 3.1 paveiksle.

Fuzarioze užkrėsti kviečiai su padidintu

DON kiekiu

Greito akustinio metodo DON aptikimui pritaikymas DON detoksikacijos galimybių tyrimai įvairiuose fermentaciniuose procesuose Bioetanolio gamyboje Kvietinės duonos raugų gamyboje Optimalaus akustinio signalo dažnio parinkimas 2005 m. LŽI kviečių kolekcijos tyrimai, įvertinant riklausomybę tarp Ap ir ELISA metodų;

Ap verčių ir susiraukšlėjusių kviečių grūdų kiekio modelinėse sistemose Raugų fermentacija įvairiomis pieno rūgšties balterijomis Grūdinės žaliavos sucukrinimas įvairiais fermentiniais preparatais

3.1 pav. Pagrindiniai tyrimų etapai

Pirmojo darbo etapo metu tirtos akustinio metodo panaudojimo galimybės DON aptikimui fuzarioze užkrėstuose kviečiuose:

• parinktas akustinio signalo (Ap) dažnis, kuris naudotas tolesniuose akustiniuose

tyrimuose;

• atliktas vystomo akustinio metodo palyginamasis įvertinimas su tradiciniu ELISA metodu;

• įvertinta susiraukšlėjusių kviečių grūdų kiekio masėje įtaka akustinio signalo amplitudės vertėms.

Pastaba. Kadangi kviečių grūdų drėgnis, gali turėti įtakos akustinio signalo parametro

vertėms, eksperimento metu jis buvo pastovus (13,0 %). Kiti kviečių kokybės rodikliai, galintys įtakoti akustinių tyrimų tikslumą: priemaišų kiekis grūdinėje žaliavoje, grūdų

stambumas, eksperimento metu buvo eliminuoti tokiu būdu: kviečiai sijoti pro Nr.8 sietą (2 x 20 mm), kad pašalinti šiukšlines priemaišas ir smulkesnius grūdus. Stambioji frakcija,

likusi ant sieto, naudota tolesniam tyrimui.

Antrojo darbo etapo metu išbandytos įvairios biotechnologinės priemonės mikotoksinams detoksikuoti technologinių procesų metu:

• duonos raugų gamyboje – pienarūgštis rūgimas;

• bioetanolio gamyboje – grūdinės žaliavos sucukrinimas ir spiritinis rūgimas. 3.2. Tyrimų objektai, medžiagos ir jų paruošimas analizei

3.2.1. Grūdinės žaliavos charakteristika

Tiriant akustinio metodo panaudojimo galimybes DON aptikimui fuzarioze užkrėstuose grūduose, analizuoti kviečių grūdai, užauginti 2005 metais Lietuvos žemdirbystės instituto bandimąjame ūkyje. Kviečių mėginiai su nustatytais DON kiekiais ELISA metodu pateikti 3.1 lentelėje.

Šie kviečių mėginiai analizuoti tiek akustiniu, tiek ir tradiciniu ELISA metodu. Pagal gautus tyrimų rezultatus parinktas optimalus akustinio signalo dažnis ir atliktas vystomo akustinio bei tradicinio ELISA metodo palyginamasis įvertinimas.

Papildomai fuzarioze užkrėstų grūdų tyrimai atlikti su modelinėmis kviečių sistemomis. Tam į prasijotus per Nr.8 sietą (2 x 20 mm) sveikus kviečių grūdus, gautus iš AB „Kauno grūdai“ (13,0 % drėgnio), buvo įmaišomi fuzariozės pažeisti (susiraukšlėję) kviečiai – iš Olandijos malūno. Jų charakteristikos pateiktos 3.2. lentelėje.

Kviečių mėginiai ruošti tyrimui, susiraukšlėjusius kviečių grūdus (užkrėstus fuzarioze) maišant su sveikais kviečių grūdais. Į kiekvieną sveikų grūdų mėginį pridedama atitinkamai 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ir 50 % susiraukšlėjusių grūdų. Analizės mėginiai: K – sveiki kviečiai, Fmax – maksimalus kiekis susiraukšlėjusių kviečių grūdų ir jų mišiniai: K+10% Fmax,

K+20% Fmax, K+30% Fmax, K+40% Fmax, K+50%. Gauti kviečių mišinių mėginiai, kurių

3.1 lentelė. Kviečių mėginiai

Mėginio Nr. DON kiekis, μg/kg

268 139 270 98 271 69 272 16 273 29 276 119 277 113 280 112 281 28 288 62 306 76 310 56 312 123 334 86 336 83 338 81 389 32 390 105 391 27 392 236 393 97 394 162

3.2 lentelė. Fuzariozės pažeistų (susiraukšlėjusių) kviečių charakteristikos Grūdinė žaliava Drėgnis, % Krakmolo kiekis, % s.m. 1000 grūdų masė, g DON kiekis*, ppm DON, % s.m. DON kviečiai 9,2 64,7 37,6 2,3 0,254

* nustatyta ELISA metodu

Pagal kviečių modelinių sistemų tyrimų rezultatus įvertinta susiraukšlėjusių kviečių grūdų kiekio masėje įtaka akustinio signalo amplitudės vertėms.

Fuzarioze užkrėstų kviečių grūdai (3.2. lentelė) buvo sumalti WZ-1 tipo laboratoriniu malūnu (ZBPP, Lenkija) ir naudoti tolesniame eksperimente, kaip žaliava kvietinei duonai ir bioetanoliui laboratorinėmis sąlygomis gaminti.

3.2.2. Kvietinės duonos su raugu gamyba

Kvietinė duona gaminta tradiciniu būdu su raugais, kurie buvo fermentuoti įvairiomis pieno rūgšties bakterijomis:

1) Lactobacillus bulgaricus kamienų mišinys 148/3; 2) Lactobacillus acidophilus kamienų mišinys 336.

Pastaba: P/r bakterijų suspensija iki naudojimo laikyta 4 oC temperatūroje.

Pieno rūgšties bakterijų kultūros gautos iš KTU Maisto instituto pieno rūgšties bakterijų kolekcijos. Jų charakteristikos pateiktos 3.3 lentelėje.

3.3 lentelė. Pieno rūgšties bakterijų kultūrų charakteristikos Pieno rūgšties bakterijų kultūros Tipas Optimali temperatūra, o_C Metabolizmo produktai Lactobacillus

bulgaricus homofermentinės 45 Acto (2,5-3,5 %), acetaldehidas rūgštis, pieno rūgštis

Lactobacillus acidophilus

homofermentinės 37 Acto rūgštis,

pieno rūgštis (iki 2,2 %) Kepinių receptūra ir technologinio proceso parametrai pateikti 3.4 lentelėje. 3.4 lentelė. Kvietinių kepinių receptūra ir technologinio proceso parametrai

Receptūriniai komponentai: Komponentų kiekis

DON miltai, viso, g: raugui tešlai 400 120 280 Mielės 1,8 Druska 1,5

Pieno rūgšties bakterijų suspensija, ml 5

Vanduo pagal apskaičiavimus

Technologinio proceso parametrai:

raugo drėgnis, % 45

tešlos drėgnis, % 45

tešlos rauginimo temperatūra, oC 32 ±2

tešlos rauginimo trukmė, min. 210

kepimo temperatūra, oC 120

Technologinė kvietinės duonos iš DON užterštų miltų gamybos schema pateikta 3.2 paveiksle. DON miltai Rauginimas 37oC (L. acidophilus), 45oC (L. bulgaricus) Drėgnis 45 %, Trukmė 22 val. Tešlos maišymas Vanduo Mielės Druska Drėgnis 45 % Rauginimas Temperatūra 32±2o_C, trukmė 210 min. Kepimas Temperatūra 120oC, trukmė 60 min. 30 % 70 % + vanduo Raugas

3.2 pav. Technologinė kvietinės duonos su raugu gamybos schema

Bandomiesiems duonos kepimams tešla buvo ruošiama iš 400 g miltų. Kvietinės duonos gamyba buvo vykdoma toliau išvardintomis stadijomis.

Raugo ruošimas. Ruošiamo raugo drėgnis 45 %. Į indą sudedama 30 % DON miltų ir

supilamas apskaičiuotas vandens kiekis. Į gautą masę supilama 5 ml paruoštos pieno rūgšties bakterijų suspensijos. Masė gerai išmaišoma. Rauginimas vykdomas termostate optimalioje pieno rūgšties bakterijų kultūroms temperatūroje: 37 oC (L. acidophilus) ir 45 oC (L.

bulgaricus). Rauginimo trukmė apie 22 val. (išrūgusio raugo pH 3,5).

Tešlos ruošimas. Į maišymo indą supilamas likęs DON miltų kiekis (70 %), supilamas

apskaičiuotas vandens kiekis, sudedamos mielės, druska ir išrūgęs raugas. Tešla išmaišoma iki vienalytės konsistencijos ir rauginama termostate 32 ±2 oC temperatūroje 210 min. Išrūgusios tešlos pH 4,4.

Duonos kepimas. Duona buvo kepama automatinėje duonkepėje BM-2 (Germatic,

Vokietija). Kepimo temperatūra 120 oC, trukmė 60 min.

Kontrolinė tešla buvo ruošiama be pieno rūgšties bakterijų raugo.

DON kiekis (sausosiomis medžiagomis) buvo įvertintas fermentuotuose kvietiniuose pusgaminiuose (išrūgusiame rauge, įmaišytoje tešloje, išrūgusioje tešloje) ir gatavuose

kepiniuose. Kontrolei duona buvo ruošta be raugo. Pusgaminių rūgimo proceso metu tirtas bendras titruojamasis rūgštingumas (LST 1439, 1996).

3.2.3. Bioetanolio gamybos technologinė schema

Šiame tiriamojo darbo etape tirta fermentacijos proceso, perdirbant DON užkrėstus kviečius į techninį etanolį, naudojant karbohidrazių klasės fermentus, įtaka DON kiekiui žlaugtuose.

Grūdinės žaliavos fermentacija bioetanolio gamybai buvo vykdoma laboratorinėmis sąlygomis, pritaikius žemų temperatūrų technologinę schemą (3.3 pav.).

Masės paruošimas

DON miltai + 90ºC vanduo

Masės šutinimas

Temperatūra 90ºC, trukmė 30 min.

Krakmolo suskystinimas

Vilzim SKA, pH 6,0-6,5 Temperatūra 65ºC, trukmė 90 min.

Krakmolo sucukrinimas

Vilzim SKK, Vilzim SKG, pH 5,0-6,0 temperatūra 55-60ºC, trukmė 120 min.

Sucukrintos masės rauginimas

Mielės

Temperatūra 32-34ºC, trukmė 72 h

Raugalo filtravimas ir žliaugtų džiovinimas

Nustačius krakmolo kiekį kviečių grūduose, 100 g sumaltų DON užkrėstų kviečių grūdų (DON miltai) buvo sumaišyta su 90 oC temperatūros vandeniu ir tokios temperatūros vandens vonioje išlaikyta 30 min.

Fermentiniai preparatai. Grūdinės žaliavos hidrolizei bioetanolio gamybai naudoti skysti

fermentiniai preparatai: α–amilazė (Vilzim SKA) ir gliukoamilazė (Vilzim SKG) bei papildomai ksilanazės (Vilzim SKK), kurie buvo pagaminti AB "Biosintezė".

Pažymėtina, kad amilazės ir gliukoamilazės fermentiniai preparatai yra tradiciniai, naudojami grūdinės žaliavos sucukrinimui. Šiame darbe, fermentuojant fuzariozės pažeistus kviečius, be tradiciškai naudojamų amilolitinių fermentų, panaudota ne krakmolo polisacharidus skaldanti grybinė ksilanazė (fermentinis preparatas VILZIM SKK). Šių fermentinių preparatų charakteristikos pateiktos 3.5 lentelėje.

3.5 lentelė. Fermentiniai preparatai ir jų charakteristikos Fermentinis

preparatas fermentas Aktyvus as,AVAktyvum*_/m

l

Mikro-organizmas temperatūra Optimali ºC

pH Kiekis, AV*/1g krakmolo

Vilzim SKA α-amilazė 2350 Bacillus

subtilis

60-70 6,0-6,5

1,5 - 2,0 Vilzim SKG

gliuko-amilazė 2500 Aspergillus awamori 55-65 5,0-6,0 3,5 – 4,5 Vilzim SKK

β-ksilanazė 2540 Trichoderma reesei 50-60 5,0-6,0 - *_{AV – fermentų aktyvumo vienetas, nustatytas pagal AB " Biosintezės " standartinius metodus}

Grūdinės žaliavos fermentacijai buvo naudotos presuotos mielės Saccharomyces

cerevisiae.

Suskystinimo proceso trukmė 90 min. (pH 6,0-6,5). Krakmolo ir ne krakmolo polisacharidų sucukrinimui, suskystinta masė, pridėjus fermentinių preparatų Vilzim SKG (3.6 lentelė) ir skirtingą Vilzim SKK kiekį, buvo išlaikyta 55-60 ºC temperatūroje 120 min. Etanolio gamyboje rekomenduojamos fermentų dozės pateiktos 3.6 lentelėje.

3.6 lentelė. Eksperimente naudoti fermentiniai preparatai ir jų kiekiai

Žaliava Vanduo Vilzim SKA,

AV/100 g Vilzim SKG, AV/100 g Vilzim SKK, AV/100 g DON miltai 1:5 150 300 250-350

Sucukrinta masė buvo atšaldyta iki 32 ±2 oC temperatūros ir, pridėjus 5 g presuotų kepimo mielių (Saccharomyces cerevisiae), vykdyta masės fermentacija uždarame inde, turinčiame išvestą vamzdelį, išsiskyrusioms rauginimo metu CO2 dujoms surinkti.

Fermentacijos trukmė – 72 val.

Fermentuotas raugalas buvo filtruojamas per medžiaginį filtrą. Eksperimentas buvo kartotas du kartus. Vienu atveju gauti žlaugtai buvo išdžiovinti 40 oC temperatūroje, o antru atveju tirti be džiovinimo. Mėginiuose nustačius drėgmės kiekį, jie analizuoti ELISA metodu deoksinivalenolio (DON) kiekio nustatymui.

3.3. Tyrimų metodai

3.3.1. Metodai fuzarioze užkrėstiems grūdams įvertinti 3.3.1.1. Akustinio metodo charaketristika

Fusarium pažeistų grūdų struktūrinių savybių, lyginant su kontroliniais kviečių grūdais,

pokyčiams įvertinti naudotas KTU Maisto produktų technologijos katedroje vystomas akustinis metodas, kuriuo įvertinama perėjusio per tiriamą objektą akustinio signalo amplitudės vertė (Ap).

Akustinis metodas, priskiriamas prie greičiausių ir perspektyviausių metodų, tinkamų fuzariozinių grūdų analizei. Tokie grūdai daugiausiai susiraukšlėję ir lyginant su sveikais grūdais, yra smulkesni bei lengvesni. Paprastai gamybinėje praktikoje susiraukšlėję grūdai gali būti atskiriami sijojant, o likę grūdai perduodami laikymui, užteršiant talpyklas, ar perdirbimui. Tačiau grūdų supirkėjai ir perdirbėjai suinteresuoti, kaip užkirsti kelią Fusarium genties pelėsiniais grybais užkrėstų grūdų patekimui į saugyklas ir įmones, nes tai gali turėti neigiamos įtakos jų produkcijos saugai ir kokybei. Palyginti nebrangus, bekontaktis akustinis grūdų analizės metodas yra puiki priemonė, galinti pakeisti kitus daug brangesnius ir lėtesnius cheminius metodus. Akustinė technika sąlygoja greitą analizę ir leidžia ištirti daugiau grūdų ėminių su mažesnėmis sąnaudomis (laiko, personalo, cheminių medžiagų) (V. Kunigėlis, M. Senulis, 2002).

Akustinis metodas realizuotas akustiniame spektrometre, veikiančiame trumpų impulsų 4,95-35,71 kHz diapazone. Prietaiso schema pateikta 3.4 paveiksle.

1 1 2 3 1 0 4 7 9 5 8 6 1 1 2

2.4 pav. Akustinio spektrometro schema: 1 - personalinis kompiuteris, 2 – sinusinių signalų generatorius, 3- elektrinių videoimpulsų generatorius, 4 – dažnio keitimo šaltinis, 5 – dažnomatis, 6, 8 – siuntimo ir priėmimo akustinė antena, 7, 9 – maitinimo šaltiniai, 10 – oscilografas, 11 – skaitmeninis voltmetras, 12 – mėginio laikiklis

Pagal šią schemą, elektrinių videoimpulsų generatoriaus Г 5-56 (3) skleidžiami impulsai (9 V amplitudė ir 200 μs trukmės) moduliuojami generatoriumi Г 6-28 (2) į nepertraukiamus sinusinius elektrinius signalus. Generatoriaus (2) dažnis keičiamas dažnio keitimo prietaisu (4) ir patikslinamas dažnomačiu (5). Sumoduliuoti elektriniai signalai perduodami į akustinę siuntimo anteną (6). Priimti impulsai išdetektuojami pikiniu detektoriumi, esančiu priėmimo antenoje (8) ir užfiksuojami oscilografu (10). Išdetektuoti impulsai generavimo metu sumažinami moduliuojančiu impulsu iki nulio, po to jų vertė išmatuojama skaitmeniniu voltmetru (11). Išmatuota impulso vertė perduodama į kompiuterį (1). Siunčiamosios akustinės antenos (6) ir priimamosios akustinės antenos (8) stiprintuvams naudojami nuolatinės įtampos (± 20 V) maitinimo šaltiniai (7) ir (9).

Kiti kontrolės ir standartizavimo tikslais taikomi metodai yra daug sudėtingesni ir ilgesni, reikalauja daugiau sąnaudų, be to, tiriamąjį ėminį reikia ne tik smulkinti, bet ir atlikti ekstrahavimą ir t.t.

3.3.1.2. Tradicinis imunofermentinis ELISA metodas

Dėl ypatingo mėginio išgryninimo ir brangios įrangos reikalaujančių cheminių metodų, pastaruoju metu paplito alternatyvūs metodai – imunocheminiai. ELISA metodas naudojamas mikotoksinų analizei. Šis metodas pagrįstas tuo, kad tam tikruose polimerų (imunosorbentų) paviršiuose absorbuojami specifiniai antikūnai, žymėti fermentais (B. Bakutis, V. Baliukonienė, A. Paškevičius, 2005).

Tvirtafazis imunosorbcicinis testas atliekamas keturiais etapais:

Pirmas etapas – savitųjų (žinomų) antikūnų adsorbcija imunosorbentų (tvirtosios fazės)

paviršiuje. Paprastai naudojamos bespalvės skaidrios polichlorvinilinės (silochrominės ar akytojo stiklo) plokštelės su duobutėmis, kurių dugnai plokšti. Antikūnai nekovalentiškai sujungiami su duobučių sienelės paviršiumi, juose lieka laisvi antikūnų aktyvieji centrai (Fab), todėl jie išsaugo gebėjimą specifiškai sąveikauti su atitinkamais antigenais.

Antrasis etapas – pridedama žinomų antikūnų, kurie sąveikauja su antigenu, esančiu

mėginyje (tiriamoje medžiagoje), jei jie specifiški antigeno molekulėms, pirmojo etapo metu adsorbuotoms plokštelės duobelės paviršiuje, ties tvirtosios fazės (plokštelės polimeras) ir skysčio (antigeno tirpiklis) riba. Po to, norint iš sistemos pašalinti kitus, su antikūnais nesujungtus komponentus, duobelės labai gerai perplaunamos tirpalu, kuriame yra silpno nejoninio detergento.

Trečiasis etapas - tvirtoji fazė (plokštelių paviršius su prisitvirtinusiais antikūnų –

antigeno kompleksais) apdorojama homologiniais antikūnais, specifiškais vartotiems antigenams, žymėtaisiais fermentais. Tokie žymėtieji antikūnai jungiasi su antikūnų – antigeno kompleksų, susidariusių antrojo etapo metu, antigenais. Mėginyje esantis jų perteklius plaunant pašalinamas.

Ketvirtasis etapas – testo vertinimas: rezultatai vertinami, atsižvelgiant į žymens

prigimtį.

Antigeno ir antikūnų kompleksas susidaro, jeigu jie yra specifiški vienas kitam. Jei mėginyje yra antigenų, specifiškų pridėtiesiems antikūnams, sorbento paviršiuje prisitvirtina "antikūnų-antigeno-antikūnų" kompleksas. Fermento veikimą lengva nustatyti kolorimetriniu ar fluorometriniu būdu. Naudojami chromogenai, reaguojantys spalvinėmis reakcijomis. Jie turi būti labai jautrūs, stabilūs ir lengvai reaguoti. Pakitusią spalvą kartais pakanka įvertinti

DON radimo riba grūduose ir pašaruose – 18,5 μg/kg. DON išgavimo rodiklis – 85-110 %.

3.4.1. Metodai taikyti technologiniuose procesuose 3.4.1.1. Kvietinės duonos su raugais gamyba

Kvietinės duonos gamybos metu buvo vertinamas pusgaminių titruojamasis rūgštingumas, lakiųjų rūgščių kiekis ir pusgaminių bei gatavų kepinių drėgnis (LST 1492, 1997).

Titruojamo rūgštingumo nustatymas: reagentai: 0,1N NaOH; fenolftaleinas (1 % spiritinis

tirpalas); distiliuotas vanduo; metodika: 5 g raugo/tešlos išmaišoma su 50 ml distiliuoto vandens, įlašinama 3-5 lašai fenolftaleino (1 % spiritinis tirpalas) ir titruojama iki išnyks rausvai rožinė spalva. Rūgštingumas Xp apskaičiuojamas pagal formulę:

Xp = 2 * a* k (o), (3.1)

čia: a – 0,1 N NaOH tirpalo kiekis, sunaudotas mėginio nutitravimui, ml, k – NaOH titro pataisos koeficientas (k = 1).

Pusgaminių ir gatavų kepinių drėgniui tirti naudoti analizės metodai pateikti 3.7 lentelėje. 3.7 lentelė. Pusgaminių ir gatavų kepinių kokybės rodiklių tyrimo metodai

Rodikliai Metodo esmė Informacijos šaltinis

Pusgaminių drėgnis

Tiriamas mėginys džiovinamas (105 ± 1) o_{C temperatūroje iki}

pastovios masės (~2 val.). Masės sumažėjimas apskaičiuojamas masės procentais.

LST 1492:1997 [11]

Duonos minkštimo drėgnis

Susmulkintas tiriamas mėginys 45 min. džiovintas (130 ± 2) oC temperatūroje. Masės sumažėjimas apskaičiuojamas masės procentais.

3.4.1.2. Bioetanolio gamyba

Krakmolo kiekio nustatymas grūduose poliarimetriniu metodu:

Reagentai: 1,124 % HCl; 2,5 % (NH4)MoO4; distiliuotas vanduo.

Metodika: 0,01 g tikslumu pasveriama 5 g sumaltų grūdų į 100 ml matavimo kolbą. Į ją

įpilama 25 ml 1,124 N HCl ir mišinys sukamuoju judesiu maišomas. Po to, įpilama 25 ml 1,124 N HCl ir atsargiai maišoma, kad medžiagos dalelių neliktų ant sienelių. Kolba įdedama į verdančio vandens vonią ir intensyviai virinama 15 min. Po virinimo į kolbą įpilama 25 ml šalto distiliuoto vandens ir tirpalo nuskaidrinimui 6 ml 2,5 % amonio molibdato tirpalo. Kolbos turinys pripilamas distiliuoto vandens iki žymės ir gautas tirpalas filtruojamos pro popierinį filtrą į sausą kolbą. Pirmieji 20 ml atmetami, o likęs filtratas naudojamas poliarizacijos plokštumos sūkio kampo matavimui poliarimetru.

Grūdų krakmolo kiekis X1 masės procentais, perskaičiavus į absoliučiai sausas

medžiagas, apskaičiuojamas pagal 3.2 formulę:

W a K X − × × = 100 100 1 [3.2]

čia: K - perskaičiavimo koeficientas, nustatytas eksperimentiniu budu, naudojant druskos rugšties tirpalą: kviečiams 1,898; kukurūzams 1,879; rugiams 1,885; miežiams -1,912; avižoms -1,914; ryžiams -1,866; soroms -1,818; kvietrugiams -1,894.

Perskaičiavimo koeficientai (K) nustatyti 200 mm ilgio vamzdeliu. Jeigu naudojama 100 mm ilgio kiuvetė, pagal formulę gautas rezultatas dauginamas iš 2.

a - poliarimetro (ar sacharimetro) rodmenys skalės laipsniais; W - malinio drėgnis procentais.

3.5. Matematinis statistinis tyrimų rezultatų įvertinimas

Eksperimento metu tyrimo duomenų patikimumui vertinti, buvo apskaičiuoti jų aritmetiniai vidurkiai, standartinis nuokrypis, dispersija, matavimo paklaida, variacijos koeficientas, koreliacijos bei determinacijos koeficientai, parametrų taškiniai įverčiai, naudojant „Microsoft Excel“ programą.

Aritmetinis vidurkis x apskaičiuotas pagal formulę: _vid.

∑

Reikšmių standartinis nuokrypis S skaičiuotas pagal formulę:

(

)

∑

∑

Tiriant grūdus akustiniu spektrometru matavimai kartoti 10 kartų. Pagal juos atliktas matematinis statistinis duomenų apdorojimas, įvertinant metodo tikslumą.

4. TYRIMŲ REZULTATAI

4.1. Akustinio metodo panaudojimo galimybių tyrimas

Fuzariozės pažeisti kviečių grūdai susiraukšlėja ir lyginant su sveikais kviečių grūdais yra smulkesni bei lengvesni. Vystantis šiam pelėsiui ant grūdų, gaminasi DON toksinas, dėl to pakinta grūdų struktūrinės savybės, kurios blogina juslines ir technologines savybes, mažina grūdų ir jų produktų maistinę vertę. Todėl tikslinga išvystyti greitą akustinį metodą fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų struktūriniams pokyčiams aptikti, pagal kuriuos būtų galima greitai įvertinti DON kiekį grūduose.

Kad galėtume kiekybiškai įvertinti šio toksino kiekį, pirmiausia reikia nustatyti, ar yra koreliacinis ryšys, tarp vystomo akustinio metodo ir DON kiekio, nustatyto tradiciniu ELISA metodu, bei įvertinti, koks šio ryšio stiprumas. Ieškant šios priklausomybės, buvo ištirta kviečių grūdų kolekcija, užauginta 2005 metais Dotnuvos Žemdirbystės instituto bandomąjame ūkyje. Priklausomybės įvertintos KTU Maisto produktų technologijos katedroje esančiu akustiniu spektrometru, matuojant praėjusio per tiriamą kviečių grūdų mėginį (apie 200g) akustinio signalo amplitudės vertes (Ap).

4.1.1. Optimalaus akustinio signalo dažnio parinkimas

Pritaikant akustinį metodą naujam tyrimo objektui - fuzariozės užkrėstiems kviečių grūdams, reikia įvertinti atliktų matavimų tikslumą ir patikimumą. Kaip parodė ankstesni darbai, tam didelę įtaką turi akustinio signalo dažnis, kuriam esant vykdomi matavimai (G. Juodeikienė, V. Kunigėlis, D. Vidmantienė, W. J. de Koe, 2004).

Eksperimentui naudojant akustinį spektrometrą, praėjusio akustinio signalo vertės (Ap)

matuotos 4,95-35,71 kHz dažnių diapazone, padalintame į 64 matavimų taškus, analizės trukmė 5 min.

Fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų tyrimo metu išmatuotos Ap vertės, esant įvairiems šio

4.1 lentelė. Ap priklausomybė nuo dažnio, tiriant kviečių grūdus

Dažnis,

kHz Akustinio signalo amplitudė

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 vid 4.715 1.1634 1.098 1.0653 0.8366 1.0653 1.4209 1.0817 1.3767 1.0653 1.0653 1.4209 1.1509 5.2299 1.0997 1.0831 1.0831 1.133 1.0665 1.318 1.0997 1.2756 1.0831 1.0665 1.3392 1.1498 5.7449 1.1105 1.0473 1.0473 1.158 1.0473 1.4521 1.0631 1.3843 1.2055 1.0473 1.4521 1.1832 6.2599 0.9334 0.9201 0.8802 0.9733 0.9334 1.0871 0.9201 1.0871 0.8935 0.8669 1.1046 0.9636 6.7749 1.0423 1.0002 0.9861 1.0423 0.9861 1.39 0.9861 1.3467 0.9721 0.8974 1.39 1.0945 7.2899 0.9999 0.96 0.9733 1.0796 0.9334 1.3048 0.96 1.2844 0.8935 0.8669 1.3048 1.0510 7.8049 1.1299 1.0432 1.101 1.0721 1.0865 1.332 1.1154 1.2905 0.9998 0.9709 1.332 1.1339 8.3199 1.1386 1.0278 1.1525 1.1386 1.0971 1.332 1.1109 1.2905 1.0555 0.9862 1.332 1.1511 8.8348 1.2021 1.1877 1.2166 1.2021 1.1877 0.8517 1.1877 0.8652 1.1732 1.101 0.8652 1.0946 9.3498 1.0245 1.0245 1.0122 1.0368 1.0245 1.2069 1.0245 1.1881 1.0615 0.9876 1.2069 1.0725 9.8648 0.6948 0.6948 0.6948 0.7195 0.6948 1.0665 0.736 1.0499 0.6865 0.67 1.0333 0.7946 10.3798 0.9032 0.9032 0.8935 0.971 0.845 1.0156 0.8741 1.0156 0.8547 0.8547 1.0156 0.9224 10.8948 0.9177 0.9177 0.8902 0.936 0.936 1.0002 0.9543 0.9847 0.8444 0.8719 1.0002 0.9321 11.4098 0.8143 0.8297 0.822 0.8375 0.8143 0.9143 0.853 0.9143 0.8065 0.8065 0.9143 0.8479 11.9247 0.8159 0.7876 0.7947 0.8442 0.8159 0.8577 0.8301 0.8317 0.7805 0.7734 0.8317 0.8149 12.4397 0.7533 0.7473 0.7293 0.7594 0.7353 0.7744 0.7894 0.7625 0.7413 0.7233 0.7863 0.7547 12.9547 0.7422 0.7207 0.7207 0.7583 0.7261 0.7871 0.7691 0.7759 0.7207 0.71 0.7423 0.7430 13.4697 0.781 0.8023 0.7917 0.7863 0.7863 0.7917 0.8504 0.7259 0.7863 0.7436 0.7698 0.7832 13.9847 0.6429 0.6514 0.6344 0.6641 0.6259 0.7433 0.7109 0.6958 0.6344 0.6684 0.7243 0.6723 14.4997 0.6698 0.6825 0.6867 0.7121 0.6698 0.7201 0.6994 0.7107 0.674 0.7037 0.7201 0.6954 15.0146 0.6916 0.6752 0.6587 0.6793 0.6628 0.6859 0.6793 0.6766 0.6752 0.6875 0.7136 0.6805 15.5296 0.6834 0.6473 0.6473 0.6513 0.6434 0.6996 0.6983 0.7172 0.6434 0.6473 0.6731 0.6683 16.0446 0.6845 0.6667 0.6612 0.6462 0.6267 0.6785 0.6889 0.6446 0.6384 0.6539 0.67 0.6600 16.5596 0.6721 0.6778 0.6717 0.6457 0.6218 0.6255 0.6775 0.6338 0.6457 0.6417 0.6671 0.6528 17.0746 0.6762 0.6898 0.6679 0.6602 0.6238 0.656 0.6966 0.656 0.6481 0.6562 0.656 0.6624 17.5896 0.6866 0.6929 0.6889 0.6822 0.6646 0.6703 0.689 0.6781 0.6922 0.6739 0.6701 0.6808 18.1046 0.6711 0.6777 0.6577 0.6835 0.6669 0.651 0.7044 0.6891 0.6627 0.6794 0.6834 0.6752 18.6195 0.6752 0.6544 0.6461 0.6794 0.6711 0.6275 0.7002 0.6733 0.6544 0.6835 0.6592 0.6658 19.1345 0.6628 0.6506 0.6385 0.6791 0.6466 0.6334 0.6953 0.6444 0.6425 0.6791 0.6334 0.6551 19.6495 0.6595 0.6311 0.6234 0.658 0.6272 0.6217 0.6772 0.6214 0.6195 0.6503 0.6293 0.6381 20.1645 0.6445 0.652 0.6332 0.637 0.6445 0.5976 0.7118 0.5833 0.637 0.6744 0.6048 0.6382 20.6795 0.6016 0.6149 0.585 0.6281 0.6283 0.5539 0.6713 0.5539 0.5983 0.6215 0.5539 0.6010 21.1945 0.5896 0.6084 0.6053 0.6366 0.6021 0.5391 0.6585 0.5427 0.6015 0.6428 0.5553 0.5984 21.7094 0.5601 0.5824 0.5629 0.6019 0.5629 0.5094 0.6269 0.4976 0.5712 0.6074 0.5212 0.5640 22.2244 0.5405 0.5716 0.5405 0.5872 0.5509 0.468 0.6002 0.4571 0.5638 0.5976 0.506 0.5439 22.7394 0.5302 0.5652 0.5527 0.5977 0.5552 0.4593 0.6052 0.4387 0.5702 0.5902 0.5056 0.5427 23.2544 0.5121 0.5405 0.5357 0.5736 0.5215 0.4319 0.5831 0.4123 0.5571 0.576 0.5005 0.5222 23.7694 0.4889 0.5183 0.5206 0.5432 0.5025 0.4229 0.5364 0.418 0.5138 0.5477 0.4859 0.4998 24.2844 0.5132 0.5296 0.5249 0.5579 0.5132 0.4251 0.5673 0.4062 0.5508 0.5673 0.4675 0.5112 24.7993 0.4887 0.5072 0.4979 0.5349 0.4771 0.3887 0.5349 0.3887 0.5372 0.5488 0.4297 0.4849 25.3143 0.4794 0.5049 0.4771 0.491 0.4609 0.3806 0.5164 0.3851 0.528 0.5396 0.4303 0.4721 25.8293 0.4544 0.4796 0.4521 0.4934 0.42 0.3744 0.5071 0.3744 0.5025 0.5048 0.4014 0.4513 26.3443 0.4342 0.4499 0.4208 0.4655 0.3918 0.369 0.4834 0.3646 0.4812 0.4723 0.3821 0.4286 26.8593 0.4055 0.4143 0.3967 0.4386 0.3835 0.3567 0.443 0.3525 0.465 0.443 0.3739 0.4066 27.3743 0.3916 0.4111 0.3785 0.4111 0.3611 0.3423 0.4328 0.3465 0.4567 0.4307 0.3592 0.3929 27.8893 0.3811 0.4024 0.3471 0.3917 0.3513 0.3311 0.4258 0.3353 0.4194 0.4236 0.3518 0.3782 28.4042 0.3707 0.3964 0.36 0.3878 0.3472 0.3098 0.4242 0.3138 0.4264 0.4114 0.3419 0.3718 28.9192 0.3635 0.376 0.3531 0.3739 0.328 0.3013 0.4073 0.2857 0.4115 0.4198 0.3247 0.3586 29.4342 0.3556 0.3832 0.3407 0.362 0.3386 0.2958 0.413 0.2919 0.4109 0.4194 0.2998 0.3555 29.9492 0.3457 0.3585 0.335 0.35 0.3265 0.279 0.4011 0.2712 0.4075 0.4054 0.3025 0.3439 30.4642 0.3139 0.3322 0.3078 0.3363 0.2976 0.2852 0.3546 0.2654 0.3729 0.3689 0.2812 0.3196 30.9792 0.283 0.3003 0.2791 0.308 0.2676 0.2802 0.3253 0.2573 0.3445 0.3445 0.2841 0.2976 31.4941 0.3058 0.3424 0.2895 0.3139 0.2773 0.2667 0.3831 0.2515 0.375 0.3852 0.2705 0.3146 32.0091 0.2466 0.2806 0.2595 0.2855 0.2352 0.2393 0.3146 0.222 0.3049 0.3227 0.2358 0.2679 32.5241 0.2322 0.2562 0.2472 0.2728 0.2291 0.2367 0.2939 0.2141 0.2984 0.2999 0.2302 0.2555 4.1 lentelės tęsinys 30 psl.

4.1 lentelės tęsinys. Ap priklausomybė nuo dažnio, tiriant kviečių grūdus

Dažnis,

kHz Akustinio signalo amplitudė

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 vid 33.0391 0.2202 0.236 0.2268 0.2558 0.211 0.2096 0.2716 0.2065 0.2782 0.2821 0.2186 0.2379 33.5541 0.2014 0.2321 0.2369 0.2428 0.2061 0.2055 0.2795 0.183 0.2818 0.2664 0.1999 0.2305 34.0691 0.2067 0.2284 0.2284 0.2252 0.2023 0.2105 0.2741 0.1706 0.2708 0.2697 0.1892 0.2251 34.584 0.1711 0.1978 0.2079 0.2134 0.1739 0.1663 0.2501 0.1593 0.2336 0.2354 0.1663 0.1977 35.099 0.1697 0.1895 0.1955 0.2041 0.174 0.1634 0.2359 0.1395 0.2256 0.2308 0.1504 0.1889 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 5 10 15 20 25 30 35

Akustinio signalo dažnis, kHz

A kus tini o s ign al o am pl itud ė, s .v . 17,59 kHz

4.1 pav. Akustinio signalo amplitudės (Ap) verčių priklausomybė nuo dažnio, tiriant kviečių grūdus akustiniu spektrometru

Įvertinant tai, kad esant labai žemam 5-9 kHz akustinių bangų dažniui, prietaisas fiksuoja įvairius triukšmus, o esant dažniams, didesniems kaip 30 kHz, signalo sklidimui turi įtakos oro sukūriai, otimalus dažnis buvo ieškotas 10-30 kHz intervale. Esant įvairiems dažniams, gauti rezultatai buvo apdoroti matematiniais ir statistiniais metodais. Optimalus dažnis parinktas taške, kuriame nustatytos minimalios matuojamo parametro (Ap) standartinio

nuokrypio, dispersijos, matavimo paklaidos ir variacijos koeficiento vertės. Optimalaus dažnio parinkimo rezultatai pateikiami 4.2. lentelėje.

4.2. lentelė. Optimalaus dažnio parinkimo rezultatų suvestinė

Optimalus dažnis tokiu pat būdu buvo parinktas kviečiams – 17,59 kHz. Tolesni tyrimai vykdyti, naudojant kviečių grūdams analizuoti nustatytą optimalų akustinio signalo dažnį.

4.1.2. Vystomo akustinio ir tradicinio ELISA metodų palyginamasis įvertinimas 4.1.2.1. Fuzarioze užkrėstų kviečių kiekio įtaka akustinio signalo parametro vertėms

Vystomo akustinio metodo palyginimui su tradiciniu ELISA metodu tirta kviečių kolekcija su žinomu DON kiekiu (3.1 lentelė).

22 kviečių mėginiuose DON koncentracija svyravo ribose nuo 16 μg/kg iki 236 μg/kg. Mėginių pasiskirstymas (kas 20 μg/kg) šiame intervale pateiktas 4.2 paveiksle.

0 1 2 3 4 5 6 <20 41-60 81-100 121-140 161-180 201-220 DO N k o n cent ra ci ja , pp m Mėginių skaičius

4.2 pav. DON kiekio (μg/kg ) pasiskirstymas LŽI bandomajame ūkyje 2005 metais išaugintuose kviečiuose

Įvertinus kviečių mėginių pasiskirstymą intervale 16-236 μg/kg pagal esantį DON kiekį, atliktas matematinis statistinis įvertinimas. Skaičiavimo rezultatai pateikti 4.3 lentelėje.

Atlikus matematinį statistinį įvertinimą, nustatyta, kad daugumai mėginių (šiuo atveju 12 iš 22) buvo nustatytas DON kiekis, kuris svyravo ribose nuo 61 iki 120 μg/kg. Nustatyti tik 2 mėginiai, kuriuose DON kiekis didesnis nei 140. Nei vienas mėginys neviršijo Europos Sąjungoje reglamentuoto DON kiekio (1250 μg/kg).

4.3 lentelė. Kviečių mėginių pasiskirstymo pagal DON kiekį matematinis statistinis įvertinimas Bendras mėginių skaičius Minimali koncentracija (μg/kg) Maksimali koncentracija (μg/kg) Mediana (μg/kg) Vidurkis (μg/kg) 22 16 236 82,5 86,2 koncentracija

(μg/kg) mėginių skaičius procentinis dažnis (%) mėginių skaičiaus augimas augimo dažnis (%) <20 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 >220 1 4 1 3 5 4 2 0 1 0 0 1 4,5 18 4,5 14 23 18 9 0 4,5 0 0 4,5 1 5 5 4 8 9 6 2 1 1 0 1 4,5 23 23 18 36 41 27 9 4,5 4,5 0 4,5 suma 22 100 43 195

Ištyrus juos akustinius spektrometru, pirmiausia buvo ieškoma koreliacinės priklausomybės bendrai visoms kviečių veislėms. Išanalizavus visus kviečių mėginius akustiniu spektrometru, nustatyta atvirkštinė tiesinė priklausomybė tarp DON kiekio ir akustinio signalo Ap (4.3 pav.). Iš 4.3 paveikslo matyti, kad didėjant DON kiekiui akustinio

signalo Ap vertės mažėja.

y = -0.0002x + 0.6944 R2 = 0.7352 0.63 0.64 0.65 0.66 0.67 0.68 0.69 0.70 0.71 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Don kiekis, mg/kg A kus tinio s ign alo a m plit ud ė, s .v .

Ši priklausomybė aprašyta regresine lygtimi: y = a + bx, kurios koeficientai pateikti 4.4 lentelėje. Apskaičiuoti regresinės lygties koeficientai ir R (R2 = 0,7352) rodo, kad analizuojant kviečių grūdų kolekcijos mėginius egzistuoja stiprus koreliacinis ryšys tarp DON kiekio ir Ap.

4.4 lentelė. Priklausomybės tarp Ap ir DON kiekio matematinis statistinis įvertinimas Regresinės lygties koeficientai Kviečių veislė a b Koreliacijos koeficientas

2005 LŽI kviečių mėginiai -0,0002 0,6944 0,7352

Gauti tyrimo rezultatai rodo stiprią koreliaciją tarp vystomo akustinio ir tradicinio ELISA metodų. Išanalizavus įvairius kviečių grūdų mėginius, nustatyta, kad didėjant DON kiekiui grūduose, akustinio signalo amplitudės vertės mažėja.

4.1.2.2. Modelinių fuzarioze užkrėstų kviečių mėginių vertinimas akustine technika

Analizuojant fuzariozės pažeistus grūdus, buvo siekiama nustatyti kokią įtaką turi 10%, 20%, 30%, 40%, 50 % ir maksimalus susiraukšlėjusių kviečių kiekis sveikų kviečių grūdų mėginyje akustinio signalo amplitudės (Ap) vertėms.

Akustinio signalo (Ap), perėjusio per kviečių tiriamuosius mėginius, į kuriuos buvo

įmaišyta 10, 20, 30, 40 ir 50% susiraukšlėjusių grūdų, amplitudės pateiktos 4.4 paveiksle. Iš 4.4 paveikslo matyti, kad visais trimis atvejais, didėjant susiraukšlėjusių grūdų kiekiui kviečių mėginiuose, akustinio signalo amplitudės vertės mažėja. Nustatyta stipri koreliacinė priklausomybė tarp susiraukšlėjusių grūdų kiekio ir akustinio signalo (Ap) verčių, tiriant

akustiniu spektrometru - R2_{= 0,996. Įdėjus į tiriamąjį mėginį 10 % susiraukšlėjusių grūdų,}

akustinio signalo amplitudė pakito 0,036 s.v.

Gauti rezultatai rodo, kad fuzariozinių grūdų kiekis sveikuose kviečiuose gerai koreliuoja su akustinio signalo parametrų vertėmis (R2 = 0,735-0,992). Didėjant susiraukšlėjusių kviečių kiekiui mišiniuose, Ap vertės mažėja.

0.6146 0.5790 0.5282 0.4634 0.4095 0.3539 0.3088 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 K K+ 10% K+20% K+30% K+40% K+50% DON Kviečių mėginiai A kus tini o s ignal o ampl itud ė, s. v.

4.4 pav. Akustinio signalo Ap vertės, tiriant kviečių mišinius akustiniu spektrometru: (K − nepažeisti kviečiai ir mišiniai (proc.) su fazarioze stipriai pažeistais kviečių grūdais Fmax: 1 − K+10% Fmax, 2 − K+20% Fmax, 3 − K+30% Fmax, 4 − K+40% Fmax, 5 − K+50% Fmax)

Nustačius, kad akustinio signalų parametrų vertės priklauso nuo pridėto susiraukšlėjusių grūdų kiekio, kviečių mišiniai papildomai buvo tirti standartiniu ELISA (Ridascreen®) metodu Lietuvos veterinarijos akademijoje, tikslu įvertinti priklausomybę tarp Ap verčių DON

kiekio. Gauti DON tyrimų rezultatai ELISA metodu pateikti 4.5 lentelėje. 4.5 lentelė. DON kiekis kviečių mėginiuose

Kviečių mėginiai DON kiekis, mg/kg

K 0 1 9,1 2 25,8 3 27,0 4 72,0 5 72,7 Fmax 79,2

Nustatyta stipri tiesinė priklausomybė tarp DON užterštų kviečių ir akustinio signalo parametrų (Ap) verčių (4.5 pav.). Paveiksle matyti, kad didėjant DON kiekiui, akustinio

R2 = 0.9261 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5 0.6 0.6 0.7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 DON koncentracija, mg/kg A kus tin io s ign al o am p lit u d ė , s. v.

4.5 pav. Priklausomybė tarp akustinio signalo amplitudės verčių (Ap) ir DON kiekio kviečiuose, nustatyto ELISA metodu

Apskaičiuoti tiesinės regresinės lygties parametrų taškiniai įverčiai ir koreliacijos koeficientas pateikti 4.5 lentelėje.

4.5 lentelė. Priklausomybės tarp akustinių signalų ir ELIZA metodo matematinis statistinis įvertinimas Regresinės lygties koeficientai Signalas a b Koreliacijos koeficientas Akustinis perėjimo (Ap) -0,0033 0,6019 0,926

Atliktas tyrimas su kviečių mišiniais, kuriuose buvo pridėtas atitinkamas (didėjantis kas 10 %) fuzariozinių grūdų kiekis, parodė, kad akustinio signalo Ap vertės mažėja, didėjant

DON kiekiui.

Apibendrinant atliktą eksperimentą su kviečių mišiniais, į kuriuos buvo pridėtas atitinkamas fuzariozinių grūdų kiekis, galima teigti, kad didėjant susiraukšlėjusių grūdų kiekiui ir DON koncentracijai juose, Ap vertės mažėja.

Tai rodo, kad akustinį metodą sėkmingai galima taikyti fuzarioze pažeistų kviečių grūdų aptikimui.

4.2. Biotechnologinių priemonių panaudojimo galimybės mikotoksinams detoksikuoti

Šioje darbo dalyje nagrinėjama fermentacijos procesų įtaka DON detoksikacijai įvairiuose technologiniuose procesuose:

• kvietinės duonos gamybos metu, naudojant raugams gaminti įvairias pieno rūgšties bakterijas (termofilines ir mezofilines);

• bioetanolio gamybos metu gaunamuose žlaugtuose, kai grūdinės žaliavos sucukrinimui naudojami įvairūs fermentiniai preparatai: be tradicinių – amilazių ir gliukoamilazių, įvairūs ksilanazių kiekiai.

Pastaba: abiems atvejais tiek duonos raugų fermentacijos metu, tiek ir bioetanolio gamybos

metu naudoti fuzarioze užkrėsti kviečiai su padidintu DON kiekiu.

4.2.1. Duonos gamyboje fermentacinių procesų įtaka DON kiekiui pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose

Tiriant fermentacijos proceso įtaką deoksinivalenolo (DON) kiekiui kvietinės duonos pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose, kai raugas ir tešla ruošti iš fuzarioze užkrėstų kviečių miltų, atlikti kvietinės duonos su skirtingais grynų p/r bakterijų kultūrų raugais bandomieji kepimai pagal tradicinę technologinę schemą - su tirštu raugu. Pagal literatūroje sutinkamus duomenis tirštuose rauguose (45 % drėgnis) daugiau susidaro acto nei pieno rūgšties (stipresnis rūgšties kvapas) nei skystuose. Tešlos ruošimui buvo naudojamas maksimalus raugo kiekis (30 % nuo miltų masės). Didėjant raugo kiekiui tešloje nuo 12 iki 30 proc., intensyvėja tešlos fermentacijos procesas (L. J. Auerman, 2005).

Šio eksperimento metu buvo siekiama įvertinti fermentacijos įtaką DON kiekiui duonos pusgaminiuose (rauge ir tešloje) ir gatavuose kepiniuose, ruošiant raugus su skirtingomis grynų p/r bakterijų kultūromis. Raugo fermentacijai pasirinktos mezofilinės homofermentinės (L. acidophilus) ir termofilinės homofermentinės (L. bulgaricus) pieno rūgšties bakterijos. Šios pieno rūgšties bakterijų kultūros yra populiarios duonos gamyboje ir pasižymi skirtingu biocheminiu aktyvumu bei organinių rūgščių susidarymo intensyvumu. Jos buvo gautos iš KTU Maisto instituto mikrobiologijos laboratorijoje esančios kolekcijos. Pieno rūgšties

Miltai kvietinės duonos ruošimui pagaminti iš fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų ir jie buvo naudojami tiek raugo, tiek ir tešlos ruošimui. Kontrolei ruošta duona vienfaziu būdu (be raugų).

Eksperimento metu atlikta DON kiekio analizė įvairiuose kvietinės duonos gamybos technologinio proceso stadijose: išrūgusiuose rauguose ir tešlose (po įmaišymo ir rauginimo) bei gatavuose kepiniuose.

Apie rūgimo proceso intensyvumą pusgaminiuose (rauguose ir tešlose) buvo sprendžiama pagal rūgštingumo rodiklį. DON kiekiai, nustatyti kvietiniuose pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose, bei pusgaminių technologiniai rodikliai pateikti 4.6 lentelėje ir 4.6 ir 4.7 paveiksluose.

4.6 lentelė. DON kiekiai kvietiniuose pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose bei pusgaminių (raugų ir tešlos) technologinių rodiklių (drėgnio ir rūgštingumo) vertės

Technologinio proceso etapai Masės drėgnis, % DON mg/kg DON mg/kg s.m. Rūgštingumas o_N Kontrolinė tešla po įmaišymo 45,4 1,8 3,30 4,4 Kontrolinė tešla po rauginimo 45,6 1,7 3,12 7,2

Raugas (I) L. acidophilus 45,2 1,9 3,29 17,2

Raugas (II) L. bulgaricus 45,2 1,9 3,29 17,9

Tešla + (I) po rauginimo 45,4 1,7 3,11 8,2

Tešla + (II) po rauginimo 45,4 1,6 2,93 8,2

Kontrolinė duona (be raugo)

5,5 2,2 2,82 -

Duona su (I) raugu 3,0 2,8 2,88 -

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

K TR RI RII T+RI T+RII

Mėginiai R ūg šti ng um as

4.6 pav. Pusgaminių (raugų ir tešlos) rūgštingumo (N) kitimas pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose technologinio proceso metu: K – tešla iš fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų miltų (be raugo) , TR – tešla po rauginimo, RI – raugas su L. acidophilus, RII – raugas su L. bulgaricus, T+RI – tešla, ruošta su raugu, naudojant L. acidophilus, T+RII – tešla, ruošta su raugu, naudojant L. Bulgaricus

Pusgaminių rūgštingumo tyrimai (4.6 pav.) rodo, kad raugų fermentacijos procesas, lyginant su kontrole, sąlygoja didesnį organinių rūgščių gatavoje tešloje susidarymą.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

K TR RI RII T+RI T+RII D D+RI D+RII Mėginiai D O N , m g/ kg

4.7 pav. DON kiekio kitimas pusgaminiuose (tešlose ir rauguose) ir gatavuose kepiniuose technologinio proceso metu: K– tešla iš fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų miltų (be raugo), TR – tešla po rauginimo, RI – raugas su L. acidophilus, RII – raugas su L. bulgaricus, T+RI – tešla, ruošta su raugu naudojant L. acidophilus, T+RII – tešla, ruošta su raugu naudojant L. Bulgaricus, D – gatava duona (kontrolinis kepimas),

Tiriamų tešlų, kurios buvo ruoštos su raugu naudojant tiek su L. acidophilus, tiek L.

bulgaricus, rūgštingumas nustatytas 8,2 oN, kai kontrolinės tešlos rūgimo metu rūgštingumas pasiekė 7,2 oN. Pastebėta, kad raugo, fermentuoto L. bulgaricus rūgštingumas nustatytas 0,7

o_{N didesnis nei raugo fermentuoto L. acidophilus ir sudarė 17,9} o_{N. Tačiau šis raugų,}

fermentuotų skirtingomis pieno rūgšties bakterijomis, rūgštingumo skirtumas neturėjo įtakos galiniam tešlos rūgštingumui.

DON tyrimų rezultatai rodo, kad raugo fermentacijos proceso įtaka šio mikotoksino sumažėjimui pasireiškė tiek tešlose (po rauginimo), tiek gatavuose kepiniuose. DON kiekis išrūgusioje kontrolinėje tešloje, lyginant su įmaišyta kontroline tešla, sumažėjo 5,45 %, o tiriamosiose tešlose, ruoštose su L. acidophilus ir L. bulgaricus fermentuotais raugais, vidutiniškai 8,48 %. Tiriamuose gatavuose kepiniuose taip pat pastebėta, kad ruošiant tešlą su termofiliniais raugais (L. bulgaricus) ir su mezofiliniais raugais (L. acidophilus) efektyviau sumažėja DON kiekis nei gaminant kontrolinius kepinius (be raugo), atitinkamai 2,12 % ir 4,96 %. Nustatyta, kad efektyvesnę įtaką DON detoksikacijai tešlose, o taip pat kepiniuose turėjo termofilinėmis pieno rūgšties bakterijomis fermentuoti raugai nei mezofilinėmis. Atlikti DON tyrimų rezultatai neišryškino priklausomybės tarp rūgštingumo rodiklio verčių ir DON kiekio sumažėjimo fermentuotuose pusgaminiuose. Matomai DON detoksikacijai įtakos turi ne organinės rūgštys, o kiti mielių ir pieno rūgšties bakterijų metabolizmo produktai. Pažymėtina, kad svaresnių išvadų darymui reikėtų padidinti technologinių eksperimentų ir tuo pačiu DON tyrimų ELISA metodu skaičių.

Iš tyrimų rezultatų matyti, kad raugų gamybos procesas turėjo įtakos DON kiekio sumažėjimui išrūgusioje tešloje. Tiriamuose kvietinės duonos kepiniuose, ruoštuose su L. acidophilus ir L. bulgaricus fermentuotais raugais, lyginant su kontroliniu mėginiu (be raugo), taip pat pastebėtos DON kiekio sumažėjimo tendencijos.

Tokiu būdu gaminant kvietinę duoną tradiciniu būdu naudojant fermentuotus raugus galima deoksinivalenolio (DON) detoksikacija. Tam įtakos turi pieno rūgšties bakterijų kultūros rūšis ir jos parinkimui reikia skirti svarbų dėmesį. Atkreiptinas dėmesys į termofilines pieno rūgšties bakterijas ir jų platesnį taikymą duonos gamybos procesuose.

4.2.2. Fermentacijos įtaka DON kiekiui žlaugtuose bioetanolio gamybos metu

Grūdų ūkis – strateginė žemės ūkio šaka. Nuo jos išsivystymo ir teisingo valstybinio reguliavimo priklauso kitų žemės ūkio šakų efektyvumas. Lietuvoje grūdų derlius sudaro mažiau nei 10 mln. t. (Agro Rinka, 2006).