Helianthus tuberosus L. šaknų ir antžeminės dalies panaudojimo galimybės silpnų fermentuotų gėrimų ir natūralių beicų gamyboje

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Ieva Rinkūnaitė

Helianthus tuberosus L. šaknų ir antžeminės dalies panaudojimo

galimybės silpnų fermentuotų gėrimų ir natūralių beicų gamyboje

The use of Helianthus tuberosus L. roots and overground part for fermented

beverages and natural stains production

Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: prof. dr. Elena Bartkienė

DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Helianthus tuberosus L. šaknų ir antžeminės dalies panaudojimo galimybės silpnų fermentuotų gėrimų ir natūralių beicų gamyboje“. 1. Yra atliktas mano pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE

(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

ĮVADAS ... 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1. Helianthus tuberosus L. cheminė sudėtis ir panaudojimo perspektyvos... 9

1.2. H. tuberosus L. biologiškai aktyvūs komponentai ... 10

1.3. H. tuberosus L. perdirbimas taikant fermentacijos technologiją ... 11

1.4. Aukštesnieji alkoholiai ir kiti fuzelio junginiai, jų įtaka sveikatai ... 12

1.5. Sėklai skirtų grūdų laikymo problemos ... 13

1.5.1. Mielių anti- grybinis aktyvumas ... 14

1.6. Pieno rūgšties bakterijų panaudojimas maisto pramonėje ... 15

1.6.1. Anti- bakterinis ir anti- grybinis pieno rūgšties bakterijų aktyvumas ... 16

1.6.2. Pieno rūgšties bakterijų gaminami bakteriocinai, jų klasifikacija ... 17

1.6.3. Pieno rūgšties L (+) ir D (-) izomerai ... 17

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 19

2.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas ... 19

2.2. Tyrimų objektai ir metodai ... 21

2.2.1. Tyrimui naudotos žaliavos ... 21

2.2.2. Silpnų fermentuotų gėrimų gamyba iš topinambų šaknų laboratorinėmis sąlygomis ... 22

2.2.3. Silpnų fermentuotų gėrimų juslinio vertinimo metodika ... 23

2.2.4. Topinambų antžeminės dalies fermentacija laboratorinėmis sąlygomis ... 23

2.2.5. Raugalo pH ir sausųjų medžiagų nustatymas mėginiuose ... 23

2.2.6. Etanolio koncentracijos nustatymo metodika ... 24

2.2.7. L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų nustatymas ... 24

2.2.8. Grūdų apdorojimas fermentuotu antžeminės H. tuberosus L. dalies bio- produktu ... 24

2.2.9. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių nustatymas dujų chromatografu ... 25

2.3. Matematinė statistinė duomenų analizė ... 25

3. REZULTATAI ... 26

3.1. H. tuberosus L. šaknų tiriamosios dalies rezultatai ... 26

3.1.1. Raugalo (H. tuberosus L. šaknų) parametrų ir etanolio kiekio rezultatai ... 26

3.1.2. Gautų silpnų fermentuotų gėrimų juslinio įvertinimo rezultatai ... 27

3.1.3. Acetaldehido palyginamasis įvertinimas ... 28

3.1.5. Etilacetato palyginamasis įvertinimas ... 30

3.1.6. Metanolio palyginamasis įvertinimas ... 30

3.1.7. Propanolio palyginamasis įvertinimas ... 31

3.1.8. Izobutanolio palyginamasis įvertinimas ... 32

3.1.9. Izoamilo alkoholio palyginamasis įvertinimas ... 32

3.1.10. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių bendro kiekio įvertinimas ... 33

3.1.11. H. tuberosus šaknų L(+) ir D(-) pieno rūgšties izomerų palyginamasis įvertinimas .... 35

3.2. H. tuberosus L. antžeminės dalies (stiebų ir lapų) rezultatai... 36

3.2.1. Raugalo (H. tuberosus L. antžeminės dalies) fizikiniai cheminiai rodikliai ... 36

3.2.2. H. tuberosus L. anžeminės dalies sėklinių grūdų apdorojimo laiko optimizavimas ... 38

3.2.3. H. tuberosus L. antžeminės dalies antimikrobinio aktyvumo rezultatai ... 38

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 40

IŠVADOS ... 42

SANTRAUKA

Autorė: Ieva Rinkūnaitė.

Pavadinimas: „Helianthus tuberosus L. šaknų ir antžeminės dalies panaudojimo galimybės silpnų fermentuotų gėrimų ir natūralių beicų gamyboje“.

Darbo vadovė: prof. dr. Elena Bartkienė.

Darbo atlikimo vieta ir laikas: magistrinis darbas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, 2012-2015 metais.

Darbo apimtis: 48 puslapiai, 14 paveikslų, 6 lentelės, 3 priedai, 50 literatūros šaltinių.

Darbo tikslas: panaudojus fermentacijos schemas įvairiais mikroorganizmais, pagaminti saugius silpnus fermentuotus gėrimus iš Helianthus tuberosus L. šaknų, o antžeminę jų dalį panaudoti natūralių beicų gamybai.

Darbas sudarytas iš dviejų dalių: atlikta H. tuberosus L. šaknų fermentacija naudojant skirtingus K. marxianus mielių porūšius ir pieno rūgšties bakterijas; atliktas kviečių grūdų apdorojimas fermentuotu antžeminės H. tuberosus L. dalies produktu.

Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad žaliavos fermentacijai naudojant pieno rūgšties bakterijas gaunami jusliškai priimtini silpni fermentuoti gėrimai, susidaro daugiau aromatinių junginių nei aukštesnės eilės alkoholių. Su mielėmis K. marxianus var. marxianus gautas mažiausias aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekis, o metanolio, propanolio, izobutanolio – nenustatyta. Parenkant atitinkamą K. marxianus mielių padermę galima reguliuoti L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų kiekį.

K. marxianus mielių padermė etanolio koncentracijai įtakos neturėjo. Nuo pH reikšmės nežymiai priklauso acetaldehido kiekis. Žaliavos fermentacijai naudojant biokatalizatorių kompleksą ir mieles gaunami mažesni nesufermentuotų angliavandenių kiekiai nei fermentaciją atliekant tik su mielėmis.

Fermentuotus H. tuberosus L. antžeminės dalies bio- produktus galima rekomenduoti sėklinių grūdų saugos užtikrinimui, nes pastarieji pasižymi anti- grybiniu aktyvumu.

Raktažodžiai: Helianthus tuberosus L., Kluyveromyces marxianus, pieno rūgšties bakterijos, aukštesnieji alkoholiai, anti- grybinis aktyvumas.

SUMMARY

Author: Ieva Rinkunaite.

Topic: „The use of Helianthus tuberosus L. roots and overground part for fermented beverages and natural stains production“.

Tutor: prof. dr. Elena Bartkiene.

Place of accomplishment: the master‘s thesis was prepared at the Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, in the laboratory of Department of Food Safety and Quality during the period of the year 2012-2015.

Work size: 48 pages, 14 pictures, 6 tables, 3 affixes and 50 references.

The aim of the work: was to produce safe weak fermented beverages from Helianthus tuberosus L. roots and to adapt overground part of Helianthus tuberosus L. for cereal preservation.

In the first stage of work H. tuberosus L. roots fermentation was performed by using different K. marxianus yeast and lactic acid bacteria; in the secound stage biotreated H. tuberosus L. overground part was used for cereal preservation.

Results showed that H. tuberosus L. roots are suitable for weak fermented beverages producing. By using the lactic acid bacteria we obtain sensory acceptable with more aromatic compounds than higher order alcohols beverages. By using K. marxianus var. marxianus yeast for beverages production we obtain the lowest amount of higher alcohols and other fusel oils (methanol, propanol and isobutanol were not detected). In experiment used K. marxianus yeast strains produced different amount of L (+) and D (-) lactates.

K. marxianus yeast strain did not affect the concentration of ethanol, and pH value correlate with acetaldehyde content in ethanol. We find that by using enzymes for raw material treatment before fermentation could be increased process efficiency (we obtain less not fermented carbohydrates than during fermentation in witch we use only yeast).

Also, biotreated H. tuberosus L. overground part could be used for cereal preservation, because they shown antifungal activity.

Keywords: Helianthus tuberosus L., Kluyveromyces marxianus, lactic acid bacteria, higher alcohols, antifungal activity.

ĮVADAS

Topinambai (Helianthus tuberosus L.) yra vertinami kaip netradicinė augalinė kultūra, turinti įvairiapusišką pritaikomumą tiek maisto, pašarų, vaistų, technikos pramonėje, tiek sprendžiant ekologines problemas, dėl turimų maistinių, funkcionaliųjų, sveikatą stiprinančių ar technologinių savybių (Rakhimov et al., 2014; Brkljača et al., 2014; Hafez, 2013). Be to, topinambai pasižymi geromis vegetacinėmis savybėmis ir gebėjimu augti esant nepalankioms aplinkos sąlygoms (Juan et al., 2013).

Šių dienų vartotojai stipriai susirūpinę dėl sintetinių cheminių priedų, naudojamų kaip maisto konservantai, keliamo pavojaus sveikatai. Tad renkasi mažiau perdirbtus produktus, tačiau šie, gali būti pavojingų patogenų šaltinis. Todėl mikroorganizmai, gebantys gaminti antimikrobinius junginius, galėtų būti panaudojami, kaip alternatyvus ir efektyvus būdas šių problemų išsprendimui (Soomro et al., 2002).

Pieno rūgšties bakterijos naudojamos maisto biotechnologijoje, kadangi laikomos saugiomis, t. y. nekenksmingos žmogui ir net turinčios naudingą poveikį sveikatai. Tokios bakterijos, kaip bifido-, lakto- slopinančiai veikia patogenines bakterijas, geba sumažinti cholesterolio kiekį kraujyje, pagerina imuninį atsaką ir gamina vitaminus. Be to, pieno rūgšties bakterijos teigiamai įtakoja maistines ir organolaptines produktų savybes, tad sėkmingai naudojamos maisto produktų ir gėrimų gamyboje (Zamfir et al., 2014; Ramnani et al., 2010).

Šiuo metu ieškoma būdu, kaip išspręsti vis aktualėjančią problemą, dėl maisto ir žemės ūkio kultūrų užkrėstumo pelėsiniais grybais. Nepriklausomai nuo to, kad jau ilgą laiką atliekami tyrimai šia tema, vis tiek problema dėl pelėsinių grybų išlikusi viena sudėtingiausių. Pagal Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio organizacijos duomenis apie 25 proc. visų pasaulio augalinių kultūrų užteršiama pelėsiniais grybais, kas įtakoja mikotoksinų susidarymą ir tai siejama su didžiuliais piniginiais nuostoliais žemės ūkiu besiverčiantiems asmenims. Mikroskopinių grybų augimas maiste yra viena pagrindinių duonos gaminių ir pieno produktų gedimo problemų, ir tai sudaro daugiau nei 10 proc. maisto gedimą lemiančių veiksnių visame pasaulyje. Be to, grybinėmis kultūromis užkrėsti maisto produktai, gali būti priežastimi rimtų sveikatos sutrikimų. Dėl šių priežasčių, bet koks mikroskopinių grybų sumažinimas yra neatsiejamai naudingas.

Siekiant užkirsti kelią užsikrėtimui pelėsiniais grybais plačiai naudojami įvairūs cheminiai fumigantai ar kiti cheminiu gamybos būdu paruošti junginiai. Tačiau, cheminiai preparatai kelia nerimą ir vartotojai labiau teikia pirmenybę saugos ir kokybiškumo aspektams. Buvo nustatyta, kad tokie cheminiai fumigantai kaip etileno dioksidas ir metilo bromidas yra toksiški, nors buvo dažnai naudojami nuimto derliaus konservavimo tikslais. Kai kurios iš šių cheminių medžiagų tam tikrose šalyse yra uždraustos arba tikėtina, kad bus uždraustos. Dėl šių priežasčių, pereinama prie natūralių

produktų, kurie siejami su saugumo rodikliu. Todėl, gebėjimas konservuoti natūraliai maiste egzistuojančiomis bakterijomis tapo vienas svarbiausių aspektų maisto ir pašarų pramonėje. Natūralių konservantų panaudojimas siekiant išvengti maisto ir pašarų gedimo, sukeliamo mikroskopinių grybų, vartotojų priimamas ir pateisinamas vis labiau. Plačiausiai ištirtas pieno rūgšties bakterijų antimikrobinis poveikis, dėl jų gebėjimo gaminti organines rūgštis, vandenilio peroksidą ir bakteriocinus. Naujausi tyrimai atliekami su šių bakterijų turimu prieš- grybeliniu poveikiu, siejamo su gebėjimu gaminti tokius junginius, kaip fenilaktinė rūgštis, cikliniai dipeptidai, 3-hidroksi riebalų rūgštys ir peptidai (Ndagano et al., 2011; Bhat et al., 2010).

Atsirado poreikis pasauliniu mastu, skatinantis ūkininkus rinktis ekologinę žemdirbyste bei vartotojus rinktis ekologinius produktus. Ekologiniame ūkyje svarbūs aspektai yra ekologinių pasėlių naudojimas ir atsisakymas cheminių trąšų, siekiant ekologinės gamybos sertifikavimo. Viena iš ekologinio ūkininkavimo sąlygų, kad sėklos taip pat būtų ruošiamos pagal ekologinius ūkininkavimo aspektus. Tačiau ekologiškų sėklų gamyba yra brangesnė už tradicinę, ko pasekoje keliamos ekologiškų produktų kainos.

Efektyvus natūralių būdų parinkimas siekiant išvengti cheminių fungicidų naudojimo yra neatsiejama efektyvaus ūkininkavimo dalis, tiek saugumo, tiek skiriamų lėšų prasme (Groot et al., 2004).

Darbo tikslas: panaudojus fermentacijos schemas įvairiais mikroorganizmais, pagaminti saugius silpnus fermentuotus gėrimus iš Helianthus tuberosus L. šaknų, o antžeminę jų dalį panaudoti natūralių beicų gamybai.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti Helianthus tuberosus L. šaknų fermentaciją ir įvertinti gauto produkto juslines savybes bei saugą aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių bei L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų aspektu.

2. Įvertinti fermentuotuose gėrimuose etanolio kiekį bei aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kitimo tendencijas priklausomai nuo raugalo parametrų.

3. Atlikti Helianthus tuberosus L. antžeminės dalies fermentaciją ir įvertinti gauto produkto fizikines chemines savybes.

4. Atlikti sėklai skirtų kviečių grūdų apdorojimą fermentuotu antžeminės Helianthus tuberosus L. dalies produktu bei įvertinti optimaliausią grūdų apdorojimo laiką.

5. Vizualiai įvertinti antimikrobinį alternatyvaus beico poveikį sėklai skirtiems grūdams, siekiant nesumažinti daigumo.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Helianthus tuberosus L. cheminė sudėtis ir panaudojimo perspektyvos

Topinambai (Helianthus tuberosus L.) priklauso Helianthus genčiai, Asteraceae šeimai, plačiai paplitę visose klimato zonose (Yuan et al., 2012).

Topinambai augdami gali pasiekti 2-4 metrų aukštį, turi didelius lapus (3-20 cm ilgio ir 5-8 cm pločio), ryškiai geltonus žiedus (panašius į saulėgrąžų), o po žeme užaugina gumbus (panašius į bulvių) (Pan et al., 2009; Kim et al., 2013). Topinambai panašūs į imbierą, pasižymi riešutams būdingu skoniu, gali būti valgomi, tiek žali, tiek termiškai apdoroti (Gedrovica, Karklina, 2013).

Auginant topinambus ir sudarant jiems nepalankias sąlygas, derliaus galima gauti 10-20 t/ha, sudarant derlingas sąlygas 25-40 t/ha, o intensyvaus auginimo metu – net 45-80 t/ha derliaus. Gumbuose angliavandeniai sudaro 10 % – 22 %, iš kurių 80 % – 90 % yra inulinas, 7 % – 14 % sacharozė ir 3 % – 6 % redukuojantys sacharidai (Izsaki, Kadi, 2013). Sausojoje gumbų masėje 15-16 % sudaro baltymai, 13 % ląsteliena ir 5 % pelenai. Be to, gumbų sudėtyje yra didelis kiekis svarbių mineralinių medžiagų, tokių kaip K, Ca, P, Fe, Zn, Mg, Na, Cu ir Mn.

Topinambų gumbuose nėra krakmolo, o pagrindinis kaupiamas angliavandenis yra inulinas. Inulinas – polimeras, sudarytas iš 80 % fruktozės ir 20 % gliukozės. Fruktozės vienetai sujungti β (2→1) ryšiais, sudaro linijinį fruktaną, kurio žmogaus virškinimo sistemos fermentai nesugeba suskaidyti, nes yra specifiški skaidyti tik krakmolo α-glikozidinį ryšį. Topinambų gumbai kaupia ne tik inuliną, bet ir oligofruktozę. Šie junginiai yra nesuvirškinami, tačiau tinkami fermentacijai, 90 % šių junginių storąją žarną pasiekia nepakitę, taip sudarydami palankią terpę virškinamojo trakto mikroorganizmų augimui. Nustatyta, kad inulinas skatina endogeninės pieno rūgšties ir bifidobakterijų augimą. Tuo remiantis, inulinas laikomas prebiotiku.

Yra pranešimų, apie topinambų vidurius laisvinantį, šlapimą varantį, tonizuojantį, skatinantį virškinimą, spermatogenetinį poveikį bei apie jų panaudojimą liaudies medicinoje diabeto ir reumato gydymui (Pan et al., 2009; Kim et al., 2013; Zalan et al., 2011). Nustatyta, kad lapai gali būti panaudojami kaip natūralus vaistas po kaulų lūžių, odos žaizdų, patinimų gydymui, skausmo malšinimui (Yuan et al., 2012).

Topinambai, turintys didelį kiekį polisacharido inulino, gali būti naudojami saldiklių, mažo kaloringumo maisto produktų, bioetanolio, gėrimų gamyboje (Radulovic et al., 2014).

Šiuo metu plačiai naudojami topinambų milteliai, kurie gaunami išdžiovinus ir sumalus topinambų gumbus. Šių miltelių sudėtyje yra didelis kiekis skaidulinių medžiagų (ląstelienos – 14 %, ir inulino – 59 %), taip pat mineralinių medžiagų, vitaminų. Milteliai turi šiek tiek saldų skonį. Šie milteliai gali būti naudojami įvairių patiekalų ir maisto produktų gamyboje. Rusijoje atlikti

tyrimai parodė, kad topinambų milteliai gali būti sėkmingai naudojami gaminant dešreles, kadangi padidėja jų funkcionalioji vertė ir pagerėja tekstūros savybės. Pakeitus 5 % mechaniškai atskirtos mėsos į 5 % topinambų miltelių, pagerėjo baltymų – riebalų santykis, padidėjo vandens kiekio išlaikymas bei galutinio produkto masė. Topinambų milteliai gali padidinti mineralinių medžiagų ir aminorūgščių kiekį dešrelėse, gali būti naudingi prevencijai prieš patogeninius mikroorganizmus bei panaudojami siekiant prailginti produkto vartoti tinkamumo terminą (Gedrovica, Karklina, 2013). Be to, topinambų antžeminė dalis bei gumbai gali būti naudojami gyvulių pašarui (Radulovic et al., 2014). Rudenį lapuoti stiebai turi blogesnę pašarinę vertę, tačiau gali būti naudojami kaip kraikas, žaliava popieriaus pramonėje ar bio- dujų, bio- kuro gamybai.

Topinambų stiebų ir gumbų derlius bei cheminė sudėtis priklauso nuo ekologinių sąlygų, veislės savybių bei auginimo technologijos (Izsaki, Kadi, 2013). Topinambai pasižymi derlingumu, atsparumu šalčiui, sausrai, vėjui, ligoms bei kenkėjams, gali augti smėlingoje ar druskingoje dirvoje (Chi et al., 2011).

1.2. H. tuberosus L. biologiškai aktyvūs komponentai

Nustatyta, kad stiebuose ir lapuose esančių junginių dėka topinambai pasižymi antioksidacinėmis, antibakterinėmis, antifungicidinėmis ir antikancerogeninėmis savybėmis. Šios savybės, priklauso nuo tokių junginių, kaip kumarinai, nesočiosios riebalų rūgštys, poliacetilenai, fenoliai, seskviterpenai. Topinambų antioksidacinės savybės siejamos su juose esančiais fenoliniais junginiais. Pagrindinė topinambų lapuose nustatyta fenolinė rūgštis yra chlorogeninė. Fenolinės rūgštys plačiai naudojamos augalų kenkėjų, patogenų ir piktžolių kontrolei (Pan et al., 2009; Chen et al., 2013). Nustatyta, kad chlorogeninė rūgštis turi slopinamąjį poveikį karcinomos ląstelėms (Jin et al., 2005).

1980 metų pradžioje atlikta daug tyrimų, aiškinantis Helianthus antibakterinį poveikį. Iš augalo Helianthus annuus L. paviršinių dalių buvo išskirti seskviterpeno junginiai. Manoma, kad jie gali turėti antibakterinį ir antifungicidinį poveikį. Vieni fenoliniai junginiai (įskaitant chlorogeninę rūgštį) buvo veiksmingi slopinant Xylella fastidiosa augimą, kiti turėjo antipelėsinį poveikį prieš Sclerotinia sclerotiorum (Chen et al., 2013).

Ankstesniais tyrimais įrodyta, kad topinambų lapuose didelis kiekis fenolinių junginių. Šių junginių nustatyta ir topinambų gumbuose (Tchon´e et al., 2006; Yuax et al., 2008). Fenolinių junginių antipelėsinis poveikis siejamas su jų chemine struktūra. Nustatyta, kad iš topinambų lapų ekstrakto išgauti fenoliniai junginiai pasižymėjo antipelėsiniu poveikiu (Chen et al., 2013). Tačiau apie topinambų lapuose esančius fenolinius junginius tyrimų atlikta nedaug ir tik keletas fenolinių junginių (chlorogeninė ir izohlorogeninė rūgštys) buvo įvertinti kokybiškai (Chen et al., 2013).

1.3. H. tuberosus L. perdirbimas taikant fermentacijos technologiją

Topinambų perdirbimui plačiai taikomos fermentacijos technologijos. Dėl didelio inulino kiekio šioje žaliavoje, pirmiausiai turi būti vykdoma rūgštinė arba fermentinė hidrolizė, kurios tikslas suskaidyti inuliną į prieinamus cukrus, fermentacijos schemose dalyvaujantiems mikroorganizmams.

Rūgštinė hidrolizė yra dažniausiai naudojamas metodas, konvertuojantis topinambų žaliavą į fermentuojamus sacharidus (taikant, didelę rūgšties koncentraciją žemoje temperatūroje, arba žemą rūgšties koncentraciją aukštoje temperatūroje). Mokslininkai nustatė, kad rūgštinės inulino hidrolizės metu susidaro tokie spalvoti junginiai kaip difruktozės anhidridai. Įrodyta, kad atliekant inulino rūgštinę hidrolizę aukštesnėje temperatūroje per ilgesnį laiką padidėja fruktano degradacija į fruktozę, tačiau tai nulėmia ir padidėjusią 5-hidroksimetilfurfurolo koncetraciją, kuris, atliekant etanolio gamybą, slopinana Saccharomyces cerevisiae veiklą.

Fermentinė hidrolizė (panaudojant inulinazes) yra alternatyvesnis metodas išgauti fruktozes, be nepageidaujamų šalutinių produktų (Li et al., 2013). Inulinazės ties β (2→1) ryšiu hidrolizuoja inuliną į fruktozę ir gliukozę. Jas galima suskirstyti į egzo- ir endo- inulinazes (Chi et al., 2011). Egzoinulinazė katalizuodama inulino molekulę pašalina galinę fruktozės liekaną, taip gaunama gliukozė ir fruktozė. Endoinulinazės hidrolizuoja vidines inulino jungtis, taip susidarant fruktooligosacharidams. Norint gauti didesnės koncentracijos etanolį, inulinas yra geresnė žaliava nei krakmolas, celiuliozė ar ksilanai.

Naudojant Kluyveromyces marxianus, inulinas gali būti biokonvertuojamas į etanolį tiesiogiai fermentacijos metu, kadangi šios mielės išskiria, tiek endogeninę, tiek egzogeninę inulinazę. Etanolio gamybai iš topinambų sulčių buvo panaudotos K. marxianus mielių ląstelės. Mielių ląstelės buvo gausinamos topinambų sultyse, kuriose cukraus koncentracija sudarė 20 %, didžiausia etanolio koncentracija 92 g/l buvo nustatyta po 7 valandų fermentacijos. Tačiau K. marxianus netoleruoja didelės etanolio koncentracijos, lyginant su S. cerevisiae, ir gamina daug mažiau etanolio nei S. cerevisiae. Todėl K. marxianus nėra populiarus mikroorganizmas etanolio gamyboje iš inulino turinčios žaliavos.

Saccharomyces diastaticus galėtų fermentuoti inulino sacharozę ir mažus polimerus, tačiau būtų nepajėgi sufermentuoti didelius inulino polimerinius junginius. Atliekant fermentaciją iš topinambų gumbų ekstrakto, panaudojant šias mieles, buvo gauta 62,5 g/l etanolio ir 75 g/l cukrų, iš kurių 94 % sudarė fruktozė. Šio eksperimento metu pasiektas maksimalus etanolio produktyvumas 3,9 g/l per valandą.

Atliekant topinambų ekstrakto fermentaciją, panaudojant S. cerevisiae buvo gauta 5 g/l etanolio ir 48 g/l cukrų, iš kurių 99 % sudarė fruktozė.

Žinoma, kad mielės S. cerevisiae kartu su bakterija Zymomonas mobilis gali aktyviai fermentuoti gliukozę ir fruktozę į etanolį, tačiau nefermentuoja inulino. Kluyveromyces fragilis gali gaminti inulinazę. Buvo atliktas tyrimas, panaudojant K. fragilis kartu su S. cerevisiae ir Z. mobilis inulino fermentacijai iš smulkintų topinambų gumbų, nustatyta etanolio koncentracija 0,48 g/g, o panaudojus tik K. fragilis - 0,46 g/g (Chi et al., 2011; Singh, Singh, 2010).

Pastaraisiais dešimtmečiais kaip inulinazės gamintojai buvo naudojamos bakterijos (Clostridium sp., Xanthomonas sp., Bifidobacterium sp., Geobacillus sp., Bacillus sp., Thermotoga sp. ir Pseudomonas sp.), mielės (Kluyveromyces sp., Cryptococcus sp. ir Pichia sp.) ir siūliniai grybai (Penicillium sp., Fusarium sp. ir Aspergillus sp.). Komerciniais tikslais buvo naudotos tokios mikroorganizmų padermės kaip K. fragilis, K. marxianus, Cryptococcus aureus ir Pichia guilliermondii (Li et al., 2013). Paprastai, grybelinės kultūros pasižymi egzo- inulinaziniu aktyvumu, tačiau kai kurios padermės, tokios kaip Aspergillus ficuum, Chrysosporium pannorum ir Penicillium rugulosum, gali gaminti, tiek egzo-, tiek endo- inulinazes. Nustatyta, kad dauguma Aspergillus niger padermių gamina tik endo- inulinazę, tačiau A. niger padermė 12 gamina abi inulinazes (Singh, Singh, 2010).

Nustatyta, kad apdorojant topinambų gumbus prieš fermentaciją sieros rūgštimi ir inulinaze, atitinkamai, gauta 178,8 g/kg ir 68,8 g/kg redukuojamų cukrų. Ankstesniais tyrimais nustatyta, kad rūgštinės hidrolizės būdu išgaunama didesnė etanolio koncentracija (Li et al., 2013).

1.4. Aukštesnieji alkoholiai ir kiti fuzelio junginiai, jų įtaka sveikatai

Aukštesnieji alkoholiai, dar vadinami fuzeliais, susidaro alkoholinės fermentacijos metu, kaip lakūs šalutiniai produktai. Tai cheminių junginių grupė, turinti daugiau negu du anglies atomus ir didesnę virimo temperatūrą negu etanolis. Šie junginiai turi įtakos alkoholinių gėrimų juslinėms savybėms. Fuzeliai, tai bendrinis lakiųjų junginių, įskaitant metanolį ir esterius, pavadinimas. Fuzeliams priklauso tokie aukštesnieji alkoholiai, kaip propanolis (C3), izobutanolis (C4) ir izoamilo alkoholis. Alkoholiniuose gėrimuose randami dar tokie fuzelio junginiai, kaip 1-propanolis, 1-butanolis, izobutanolis, 2-metil-1-butanolis, 3-metil-1-butanolis, 1-heksanolis ir feniletanolis. Aukštesniuosius alkoholius sintetina mielės alkoholinės fermentacijos metu iš aminorūgščių ir paprastųjų cukrų. Fuzelių koncentracijai įtakos turi mielių padermė, temperatūra, pH, aeravimas, terpės sudėtis (Kłosowski et al., 2014; Hori et al., 2003).

Fuzeliai žinomi, kaip sukeliantys neigiamą poveikį sveikatai, tokį kaip pagirios. Pagal atliktus tyrimus, siejant fuzelių ir pagirių santykį, nustatyta, kad gėrimai, kurių sudėtyje buvo daugiau gryno etanolio (džinas, degtinė) sukėlė mažesnį pagirių pojūtį nei gėrimai, kurių sudėtyje buvo didesnis kiekis giminingų aromatinių junginių (viskis, brendis, raudonas vynas). Buvo atliktas 56 savaičių

toksiškumo tyrimas su žiurkėmis, kurio metu nustatyta, kad fuzeliai nėra tokie toksiški, esant tokioms jų koncentracijos, kokios randamos alkoholiniuose gėrimuose. Pagirios sukelia nemalonius fizinius ir psichologinius simptomus, kurie atsiranda pavartojus alkoholio. Fiziniai simptomai tokie kaip, nuovargis, galvos, pilvo skausmas, pykinimas, vėmimas, padidėjęs jautrumas šviesai ir garsui, akių paraudimas, raumenų skausmai ir troškulys. Pagirios dar gali pasireikšti padidėjusiu kraujospūdžiu, greitesniu širdies plakimu, prakaitavimu, depresija, nemiga, dirglumu (Hori et al., 2003).

Metanolis sukelia žalingą poveikį sveikatai, tokį kaip galvos skausmas, nuovargis, pykinimas, sutrikęs regėjimas ar net pilnas aklumas, ir jo buvimas gėrimuose yra griežtai kontroliuojamas. Metanolis yra fermentinės hidrolizės produktas, susidarantis iš pektino, vykstant alkoholinei fermentacijai (Zhang et al., 2011). Metanolis yra metabolizuojamas kepenyse, veikiant fermentui dehidrogenazei per formaldehidą į skruzdžių rūgštį, pastaroji yra atsakinga už neigiamą poveikį, pasireiškiantį metanolio apsinuodijimu (Paasma et al., 2009).

Acetaldehidas yra etanolio metabolitas, susidarantis žmogaus organizme suvartojus alkoholinių gėrimų, be to, jo yra ir maisto produktuose, gėrimuose, pramonėje bei aplinkoje. Acetaldehidas yra labai toksiškas, mutageninis ir kancerogeninis. Pagal naujausius duomenis, acetaldehidas, esantis alkoholiniuose gėrimuose, žalingesnis nei pats etanolis. Acetaldehido, kuris susidaro etanolio metabolizmo, taip pat rūkymo, maisto gamybos metu, poveikis sveikatai buvo ištirtas jau 1950 metais. Acetaldehidas sutrikdo DNR sintezę ir gali lemti auglių vystymąsi (Seitz, Stickel, 2010; Lachenmeier et al., 2009).

1.5. Sėklai skirtų grūdų laikymo problemos

Kartu su sėklomis gali būti transportuojama daugelis augalų patogenų. Nustatyta, kad sėklomis plintančios ligos neigiamai įtakoja pasėlių augimą bei derliaus produktyvumą. Patogenais užterštos sėklos, tiek viduje, tiek išorėje, gali sukelti sėklų puvimą, nekrozę, daigumo sumažinimą ar net panaikinimą, daigų sužalojimą augimo metu. Be to, pelėsiniai grybai, kurie auga ant sėklų substrato gamina mikotoksinus, kurie yra pavojingi žmogui ir gyvūnams. Mikroskopiniai grybai sunaikina didelę dali vaisių, daržovių bei grūdų derliaus (sudaro 10-30 % nuostolių kasmet).

Kviečiai laikomi vienais iš pagrindinių maisto produktų, auginamų visame pasaulyje. Nustatyta, kad kviečių sėklų mikroflorai priklauso: Alternaria alternata, Drechslera sorokiniana, Fusarium moniliforme, F. avenaceum, F. graminearum, F. nivale, F. culmorum, F. equiseti, F. sporotirchioides, Cladosporium herbarum, Stemphylium botryosum (Fakhrunnisa, Ghaffar, 2006; Fredlund et al., 2002).

Siekiant užkirsti kelią grybelių sukeliamoms infekcijoms naudojami fungicidai, tiek prieš augalų sodinimą, tiek po derliaus nuėmimo. Kaip viena iš alternatyvų vaisių bei grūdų saugojimo būdų, buvo įvertintas konservavimas tam tikromis mielių bei bakterijų rūšimis. Grūdai paprastai yra nuimami gana didelio drėgmės kiekio (20-22 %, tai atitinka 0,92-0,95 aw), todėl yra palanki terpė augti pelėsiniams grybams. Siekiant išsaugoti grūdus laikymo metu, naudojamas džiovinimas aukštoje temperatūroje, tačiau tai energijos reikalaujantis procesas. Saugomi grūdai iki kito derliaus yra labai dažnai pažeidžiami pelėsinių grybų. Penicillium roqueforti yra vienas labiausiai pasitaikančių gedimą sukeliančių pelėsių randamų hermetiškai, vidutinėje temperatūroje laikomuose grūduose (Druvefors, Schnurer, 2005; Fredlund et al., 2002).

1.5.1. Mielių anti- grybinis aktyvumas

Mikrobinių biokontrolės agentų panaudojimas tapo vienas efektyviausių būdų siekiant kontroliuoti augalų patogenus ir kenkėjus žemės ūkio ir sodininkystės augalų kultūrose. Mielės gali veikti kaip antagonistai, tokiu būdu sumažindamos siūlinių grybų augimą laikymo metu. Vis dėlto, kai kurios mielių padermės gali turėti atvirkštinį poveikį, t.y., padidinti mikotoksino aflatoksino gamybą. Todėl norint pasirinkti perspektyvų biokontrolės agentą būtina mikrooganizmą izoliuoti iš panašios ekologinės nišos ir atsižvelgti į mikrooganizmų tarpusavio sąveiką ir aplinkos veiksnius (Penna et al., 2004).

Mielės, kaip biokontrolės agentai gali būti naudojamos, nes dauguma jų yra nepatogeninės ir negamina mikotoksinų ar alergiją sukeliančių sporų; gali augti esant žemam vandens aktyvumui ir deguonies kiekiui (Fredlund et al., 2002).

Tam tikros mielių ar bakterijų rūšys gali įtakoti mikotoksinų gamybą. Buvo įrodytas antagonistinis Pichia anomala ir S. cerevisiae veikimas, kaip sumažinantis ochratoksino A kaupimąsi in vitro dviejuose Penicillium verrucosum izoliatuose (Penna et al., 2004).

Penna ir kt. (2004) atlikę tyrimą nustatė, kad tam tikri Kluyveromyces izoliatai turėjo antipelėsinį veikimą prieš Aspergillus bei slopino aflatoksino B1 kaupimąsi.

Nustatyta, kad mielių Pichia (Hansenula) anomala, kamienas J121, sumažina P. roqueforti pelėsių augimą. P. anomala taip pat geba užkirsti kelią Botrytis cinerea augimui ant laikomų obuolių ir vynuoginių augalų. Nustatyta, kad tam tikros mielės išskiria toksinus, kurie žudančiai veikia siūlinius grybus. Tokioms mielėms priklauso P. anomala, P. farinosa ir P. membranifaciens. K. marxianus ir S. cerevisiae taip pat geba gaminti toksinus, žudančiai veikiančius pelėsinius grybus (Fredlund et al., 2002; Druvefor, Schnurer, 2005). Daugiausiai buvo analizuojami iš S. cerevisiae ir K. lactis išskirti junginiai, nors pastaruoju metu atkreipiamas dėmesys į tokias mieles, kaip

Zygosaccharomyces bailii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranifaciens, Debaryomyces hansenii, K. phaffi, Schwanniomyces occidentalis (Santos, Marquina, 2004).

Šių mielių, gaminančių toksinus, panaudojimas grūdų saugojimo metu gali būti labai perspektyvus mikroskopinių grybų kontrolei (Druvefors, Schnurer, 2005).

1.6. Pieno rūgšties bakterijų panaudojimas maisto pramonėje

Pieno rūgšties bakterijoms priklauso tokios gentys, kaip Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus ir Streptococcus. Tai gram teigiamos, sporų nesudarančios, rutulėlių ar lazdelės formos, gaminančios pieno rūgštį, kaip pagrindinį metabolizmo produktą, bakterijos. Pieno rūgšties bakterijų augimui reikalingi angliavandeniai, aminorūgštys, peptidai, nukleino rūgštys ir vitaminai.

Pagal naujausius tyrimus, pieno rūgštį gamina visos šios bakterijos: Aerococcus,

Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ir Weissella. Pieno rūgšties bakterijos į skirtingas rūšis klasifikuojamos pagal jų morfologines savybes, gliukozės fermentacijos ypatumus, augimą, esant skirtingoms temperatūroms, išskiriamos pieno rūgšties kiekį, gebėjimą augti didelėje druskos koncentracijoje, toleranciją rūgštims ir šarmams.

Pagal galutinį gliukozės fermentacijos produktą pieno rūgšties bakterijos skirstomis į dvi grupes. Homofermentinės pieno rūgšties bakterijos (Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus ir kai kurios Lactobacilli) pieno rūgštį gamina kaip pagrindinį arba vienintelį galutinį metabolitą gliukozės fermentacijos metu. Heterofermentinės pieno rūgšties bakterijos (Weissella ir Leuconostoc ir kai kurios Lactobacilli) gliukozės molekulę paverčia į laktatą, etanolį ir anglies dioksidą.

Pieno rūgšties bakterijos pramonėje pripažįstamos dėl jų fermentacinio gebėjimo bei teigiamo poveikio sveikatai. Maisto fermentacijoje naudojamos pieno rūgšties bakterijų rūšys, priklausančios gentims: Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, ir naujai pripažintos Carnobacterium. Šie mikroorganizmai buvo išskirti iš grūdų, žaliųjų augalų, pieno ir mėsos produktų, fermentuotų daržovių ir gyvūnų gleivinės. Šios bakterijos naudojamos pieno, mėsos, grūdinių kepinių, daržovių ir alkoholinių gėrimų pramonėje kaip pradinė kultūra, gebanti sulėtinti gedimą arba apsaugoti produktus natūralios fermentacijos metu. Šios bakterijos produkuoja įvarius junginius, tokius kaip, organinės rūgštys, diacetilas, bakteriocinai ar baktericidiniai baltymai. Šie junginiai suteikia maistui savitą skonį, kvapą, spalvą, tekstūrą bei slopina nepageidaujamos mikrofloros augimą. Taigi, pieno rūgšties bakterijos ir jų metabolizmo produktai suteikia fermentuotiems produktams savitą skonį, tekstūrą ir kvapą, apsaugo nuo gedimo, prailgina

produkto galiojimo terminą bei slopina patogeninius mikroorganizmus (Rattanachaikunsopon, Phumkhachorn, 2010).

1.6.1. Anti- bakterinis ir anti- grybinis pieno rūgšties bakterijų aktyvumas

Maistą ir pašarus gadinantys pelėsiai ir mielės sukelia didelius nuostolius visame pasaulyje. Pelėsių gaminami mikotoksinai kelia rimtą pavojų žmonių sveikatai. Pelėsių, mielių prevencija maisto ir pašarų gamybos, sandėliavimo procesų metu tapo vienas svarbiausių ir reikšmingiausių etapų, siekiant išvengti šių mikroorganizmų sukeliamų problemų. Pastaraisiais metais susidomėta vieno organizmo pritaikymu kito kontrolei. Pieno rūgšties bakterijos svarbios maisto ir pašarų išsaugojimui dėl jų gebėjimo gaminti antimikrobinius junginius. Pieno rūgšties bakterijos kaip maistą ir pašarus apsaugantys mikroorganizmai naudojami jau ilgą laiką ir pripažinti „saugiu mikroorganizmu“. Jų išsaugomasis poveikis pagrinde susijęs su gaminamomis organinėmis rūgštimis, tokiomis kaip pieno ir acto rūgštis bei kai kurių padermių išskiriamais bakteriocinais.

Atlikta daug tyrimų apie antibakterinį pieno rūgšties bakterijų poveikį, o apie antipelėsinį poveikį tyrimų publikuota nedaug, tačiau iš nedaugelio mokslininkų atliktų tyrimų nustatyta, kad Lactobacillus plantarum gaminami fenil pieno rūgšties ir 4-hidroksifenil pieno rūgšties junginiai pasižymi antipelėsiniu poveikiu. Be to, buvo pranešta apie antipelėsinį poveikį turinčius junginius, kuriuos gamina pieno rūgšties bakterijos, tai bakteriocinai bei mažos molekulinės masės junginiai. Nustatyta, kad Lactobacillus coryniformis padermė SI3 gali gaminti baltyminį junginį, o L. plantarum ciklinius dipeptidus, pasižyminčius antipelėsiniu aktyvumu.

Mielės ir pelėsiai sukelia maisto ir pašarų gedimą. Pelėsiai, tokie kaip P.roqueforti ir P.commune dažniausi kietojo sūrio, o įvairios Fusarium rūšys kviečių ir rugių gedimo sukėlėjai, gaminantys mikotoksinus. Todėl būtina rasti veiksmingą būdą, užkertantį kelią mikroskopinių grybų augimui žaliavoje ir maisto produktuose (Magnusson et al., 2003).

Mikroskopinių grybų sukelti gedimai sudaro 5-10 % visų maisto gedimų. Pastarieji padaro ne tik ekonominę žalą, bet ir kelia rimtą pavojų vartotojų sveikatai. Kadangi maisto produktuose augdami mikroskopiniai grybai gali gaminti mikotoksinus, kurie žinomi kaip toksiški žmonėms ir gyvūnams. Jų augimas maiste ir pašaruose priklauso nuo įvarių veiksnių, tokių kaip pH, vandens aktyvumo, maistinių medžiagų kiekio substrate bei laikymo sąlygų. Fusarium gamina tokius mikotoksinus kaip zearalenonas ir trichotecenai (deoksinivalenolis). Tai antriniai metabolitai, žinomi kaip imuninės sistemos slopintojai ir kancerogenai. Po derliaus nuėmimo saugomi grūdai užteršiami Aspergillus ir Penicillium. Tai pelėsiai, gaminantys mikotoksinus, kurie gali patekti ir į gatavą produkciją. Iš pieno rūgšties bakterijų buvo išskirti mažos molekulinės masės junginiai, tai organinės rūgštys, reuterinas, riebalų rūgštys, baltyminiai junginiai ir cikliniai dipeptidai, kaip

gebantys slopinti pelėsių augimą, tiek vieni, tiek sąveikoje su kitais parinktais junginiais (Rouse et al., 2008).

1.6.2. Pieno rūgšties bakterijų gaminami bakteriocinai, jų klasifikacija

Daugelis bakterijų gamina antibakterines medžiagas, kurios slopina kitų bakterijų veiklą. Tiek gram teigiamos, tiek gram neigiamos bakterijos gamina bakteriocinus. Bakteriocinai yra baltyminiai antimikrobiniai junginiai, kurie sudaro ribosomas sintezuojančius heterologinius pogrupius. Paprastai, šios medžiagos yra katijoniniai peptidai, kurie pasižymi hidrofobinėmis ir amfifilinėmis savybėmis ir daugeliu atveju, jų veiklos tikslas yra bakterijų membranos.

Priklausomai nuo organizmo, kuris gamina ir klasifikavimo kriterijų, bakteriocinai skirstomi į keletą grupių. I klasei priklauso lantibiotikai, kuriuos sudaro grupė mažų peptidų, termiškai stabilių, turinčių lantioniną; II klasės bakteriocinai yra maži, nekintami, karščiui atsparūs peptidai, lantionino neturintys; III klasei priklauso dideli, karščiui neatsparūs proteinai. Ketvirtoji bakteriocinų klasė yra sudaryta iš nenustatyto baltymų, lipidų, angliavandenių mišinio (Aly et al., 2006; Grosu-Tudor et al., 2014).

Daugelis bakteriocinų aktyviai slopina maistu plintančius patogenus. Dauguma bakteriocinų buvo išskirti iš pieno rūgšties bakterijų ir tapo svarbiu antibakteriniu veiksniu bei naudojami kaip maisto konservantai ir antagonistai prieš patogenus. Svarbiausi iš jų yra nizinas, diplokokinas, acidofilinas, bulgarikanas, helveticinai, laktacinai, plantaricinai. Lantibiotikas nizinas, kuris produkuojamas skirtingų Lactococcus lactis spp. kaip maisto bakteriocinas pritaikomas visame pasaulyje. Nizinas yra aktyvus prieš daugelį gram teigiamų bakterijų, tokių kaip Listeria spp, slopina psichrotrofinių bakterijų augimą varškės sūriuose, apsaugo nuo Clostridium ir Bacillus sporų susidarymo konservuotuose maisto produktuose.

Bakteriocinai gaminami pieno rūgšties bakterijų yra nedideli peptidai maždaug 3-6 kDa dydžio, nors pasitaiko ir išimčių. Dauguma gram teigiamų bakteriocinų didina membranos pralaidumą. Jie dažnai rodo didesnį spektrą antibiotikams nei gram neigiami bakteriocinai, kuriuos produkuoja Esherichia coli (Aly et al., 2006).

1.6.3. Pieno rūgšties L (+) ir D (-) izomerai

Pieno rūgštis – paprasčiausia hidroksi- rūgštis su asimetrišku anglies atomu, egzistuojanti dviejomis aktyviomis konfiguracijomis. L (+) izomeras gaminamas žmogaus ir kitų žinduolių. Abu izomerus L (+) ir D (-) gamina bakteriniai organizmai. 1833 metais išskirta gryna pieno rūgštis ir

nustatyta jos cheminė formulė. 1869 metais pateikta išvada, kad pieno rūgštis egzistuoja dviejų optinių izomerų ir kad L (+) izomeras pasižymi biologiniu aktyvumu.

Pieno rūgšties bakterijos, tokios kaip Lactobacilli amylophilus, L. bavaricus, L. casei, L. maltaromicus ir L. salivarius, priskiriamos L (+) pieno rūgšties izomerus gaminančioms. Tokios padermės kaip L. delbrueckii, L. jensenii ir L. acidophilus gamina D (-) izomerus arba L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų mišinį (Garlotta, 2001; Robergs et al., 2004).

Susirūpinimą kelia tai, kad naudojant D (-) pieno rūgštį gaminančias bakterijas kaip probiotikus, pastarosios gali pakenkti vartotojų sveikatai, kadangi šis izomeras padidina pieno rūgšties kiekį kraujyje, nors sveikam žmogui šis neigiamas poveikis mažai tyrinėtas (Connolly et al., 2005).

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

2.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas

Eksperimentas sudarytas iš dviejų dalių. Pirmoji eksperimento dalis vykdyta pagal 1 paveiksle pateiktą schemą. Atlikta Helianthus tuberosus L. šaknų fermentacija naudojant skirtingus K. marxianus mielių porūšius ir pieno rūgšties bakterijas (PRB), įvertintos gautų fermentuotų gėrimų juslinės savybės, sauga aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių bei L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų aspektu.

1 pav. Tyrimo schema, atliekant H. tuberosus L. šaknų fermentaciją Žaliavų paruošimas Topinambų šaknų fermentacija naudojant skirtingus K. marxianus mielių porūšius Fermentacija Lactobacillus sakei Raugalo pH ir sausųjų medžiagų kiekio nustatymas L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų nustatymas Mėginių paruošimas chromatografinei analizei Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių palyginamasis įvertinimas

Etanolio koncentracijos nustatymas mėginiuose

Gautų silpnų fermentuotų gėrimų juslinis įvertinimas Aukštesniųjų alkoholių ir

kitų fuzelio junginių nustatymas dujų chromatografijos metodu

Atlikta H. tuberosus L. antžeminės dalies (stiebų, lapų) fermentacija, panaudojant skirtingus

K. marxianus mielių porūšius ir fermentų Ceremix Plus Mg, Depol TM 680P, Depol TM 692L,

Ecopulp kompoziciją bei PRB.

Gautu bio- produktu buvo apdoroti sėklai skirti kviečių grūdai, įvertintas optimaliausias gūdų apdorojimo laikas bei bio- produkto antimikrobinis poveikis. Tyrimo schema pateikta 2 paveiksle.

2 pav. Tyrimo schema, atliekant H. tuberosus L. antžeminės dalies fermentaciją Žaliavų paruošimas

Topinambų antžeminės dalies fermentacija naudojant skirtingus K. marxianus mielių porūšius

ir biokatalizatorių kompoziciją Fermentacija Lactobacillus sakei Raugalo pH ir sausųjų medžiagų kiekio nustatymas Grūdų apdorojimas fermentuotu produktu Antimikrobinio aktyvumo įvertinimas mėginiuose Optimaliausio grūdų apdorojimo laiko įvertinimas

2.2. Tyrimų objektai ir metodai 2.2.1. Tyrimui naudotos žaliavos

Eksperimente naudotų biokatalizatorių, Kluyveromyces mielių porūšių, pieno rūgšties bakterijų aprašymas pateiktas 1 lentelėje.

Tyrimui naudoti švieži topinambai (šaknys, antžeminė dalis – stiebai, lapai), užauginti Vilniaus rajone, gauti iš ūkininko, užsiimančio topinambų auginimu (2013 metų derliaus).

Mielės gautos iš Vilniaus universiteto kolekcijos. Tyrimui naudoti pramoninei gamybai skirti biokatalizatoriai. PRB gautos iš Kauno technologijos universiteto Maisto mokslo ir technologijos katedros. Grūdai ir grūdų produktai – mokslininkų grupės kolekcijos.

1 lentelė. Eksperimente naudotos mielės, biokatalizatoriai, pieno rūgšties bakterijos

Pavadinimas Aprašymas

Mielės K.marxianus var.

dobzhenski

Fermentacijos metu gali tiesiogiai konvertuoti inuliną į etanolį. Netoleruoja didelės etanolio koncentracijos. Priskiriamos laktozę skaidančioms mielėms. K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Biokatalizatoriai Optimalus veikimo pH Rekomenduojama norma 100 g žaliavos

Aktyvumo vienetai (AV/ml ar g) Ceremix Plus Mg 5,0-7,0 25-100 mg Β-gliukazinas 380; ksilazinis 130; α-amilazinis 115; proteazinis 0,3. Depol TM 680P 4,5-5,5 0,4-0,5 g/100 g Ksilanolitinis 750; α-amilolitinis 115; amilogliukozidazinis 225. Depol TM 692L 4-6 0,5 ml/100 g Celiulazinis 800; pektinazinis 535. Ecopulp 4,5-8,5 0,4-0,1 mg Ksilanolitinis 2500. Bakterijos Lactobacillus sakei

Gramteigiamos, anaerobinės, sporų nesudarančios, lazdelės formos. Priskiriamos pieno rūgšties bakterijoms, produkuojančioms

Topinambų šaknų fermentacijai naudoti K. marxianus mielių porūšių kiekiai, 100 g produkto fermentuoti, pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. Mielių kiekis, naudotas topinambų šaknų fermentacijai

Pavadinimas Aprašymas

Mielių kiekis/100 g žaliavos fermentacijai K.marxianus var. dobzhenski

(koncentracija106 KSV/ml) 10 ml K. marxianus var. bulgaricus

K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis

K. marxianus var. marxianus

Topinambų antžeminės dalies sucukrinimui naudoti biokatalizatorių ir mielių kiekiai, pateikti 3 lentelėje.

3 lentelė. Mielių, biokatalizatorių kiekis topinambų antžeminės dalies fermentacijai

Pavadinimas Aprašymas

Mielių kiekis/100 g žaliavos fermentacijai K.marxianus var. dobzhenski

(koncentracija106 _{KSV/ml) 10 ml} K. marxianus var. bulgaricus

K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis

K. marxianus var. marxianus

Biokatalizatorių kiekis/100 g žaliavos sucukrinimui

Ceremix Plus Mg 25 mg

Depol TM 680P 25 mg

Depol TM 692L 0,25 ml

Ecopulp 0,1 ml

Pienarūgštės fermentacijos atlikimui naudota po 0,5 ml L. sakei PRB (koncentracija107 KSV/ml).

2.2.2. Silpnų fermentuotų gėrimų gamyba iš topinambų šaknų laboratorinėmis sąlygomis

Topinambų šaknys buvo nuplautos ir susmulkintos buitine trintuve su žievele. Fermentavimui imta 50 g topinambų šaknų masės, įpilta 100 ml distiliuoto vandens, į kiekvieną mėginį įdėta po 10 ml atitinkamo K. marxianus mielių porūšio (2 lentelė) bei palikta fermentuoti 48 val. 30 ºC temperatūroje aerobinėmis sąlygomis.

Atlikus fermentaciją, masė perfiltruota pro marlės filtrą ir atskirtos susidariusios nuosėdos. Į gautą raugalą dėta po 0,5 ml L. sakei. Atlikta pienarūgštė fermentacija 24 val. 35 ºC temperatūroje anaerobinėmis sąlygomis.

Gauto raugalo paimta 100 ml ir distiliuota iki 50 ml distiliato.

Distiliatas praskiestas iki 100 ml distiliuotu vandeniu ir panaudotas tolimesniems tyrimo etapams.

2.2.3. Silpnų fermentuotų gėrimų juslinio vertinimo metodika

Bendras sukurtų fermentuotų gėrimų priimtinumas buvo įvertintas taikant juslinio vertinimo hedoninėje skalėje metodiką (pagal standartą ISO, metodas 1993 ISO 8586-1).

Vertinime dalyvavo 10 apmokytų vertintojų, skaitinės rezultatų reikšmės buvo žymimos 5 balų sistemoje, kur 0 balų – mažiausias priimtinumas; 5 balai - didžiausias priimtinumas.

2.2.4. Topinambų antžeminės dalies fermentacija laboratorinėmis sąlygomis

Topinambų antžeminė dalis (lapai, stiebai) susmulkinti panaudojant buitinį smulkintuvą iki tyrelės konsistencijos.

Fermentavimui imta 50 g topinambų antžeminės dalies tyrelės, įpilta 200 ml distiliuoto vandens, įdėta biokatalizatorių (3 lentelė) ir laikyta termostate 60 minučių 60 ºC temperatūroje, kad masė susicukrintų. Prieš dedant biokatalizatorius pamatuotas tyrelės pH, kuris atitiko fermentų veikimui optimalų pH (nustatytas 4,6), todėl papildomai rūgštinti ar šarminti terpės nereikėjo.

Sucukrinta masė ataušinta iki 30 ºC temperatūros ir rauginta 48 val. 30 ºC temperatūroje aerobinėmis sąlygomis įdėjus po 10 ml atitinkamų K. marxianus mielių (3 lentelė).

Atlikus fermentaciją, masė perfiltruota pro marlės filtrą. Į gautą raugalą įdėta po 0,5 ml L. sakei. Atlikta pienarūgštė fermentacija 24 val. 35 ºC temperatūroje anaerobinėmis sąlygomis.

Gautas raugalas panaudotas tolimesniems tyrimams.

2.2.5. Raugalo pH ir sausųjų medžiagų nustatymas mėginiuose

Raugalo pH nustatytas naudojant elektroninį pH-metrą „Sartorius Professional Meter PP-15“, gamintojas Vokietija, matuoja pH nuo 0 iki 14.

Į kiekvieną raugalo mėginį buvo įmerkiamas pH-metro elektrodas ir pažymima prietaiso ekrane atsiradusi pH reikšmė. Matuojant sekančio mėginio pH, elektrodas buvo nuplaunamas distiliuotu vandeniu.

Taikant refraktometrinį metodą (AACC-68-62, 1999) buvo nustatytas tirpiųjų sausųjų medžiagų kiekis raugale. Gautas tirpiųjų sausųjų medžiagų kiekis buvo išreikštas gramais šimte gramų (g/100 g) tiriamojo raugalo. Duomenys gauti esant 20 °C temperatūrai.

2.2.6. Etanolio koncentracijos nustatymo metodika

Etanolio koncentracija (tūrio proc.) mėginiuose nustatyta naudojant areometrų rinkinį. Distiliatas buvo įpiltas į skaidraus stiklo cilindro formos indą. Išmatavus mėginių temperatūras nustatyta 20 °C (+/- 1 º C).

Pirmiausiai buvo imamas mažiausiam tankiui skirtas areometras ir dedamas į cilindrą su skysčiu, toliau imamas kitas, kol galiausiai paimto tinkamo areometro tankių reikšmių skalė buvo ties įpilto distiliato paviršiumi. Areometrui nustojus judėti pažymimas skalės rodmuo ties kuriuo liečiasi skysčio paviršius. Gavus rodmenį etanolio koncentracija įvertinta pagal žinynuose pateiktas lenteles.

2.2.7. L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų nustatymas

Buvo atsverti 2 g sufermentuotų H. tuberosus L. šaknų ir įpilta distiliuoto vandens iki 50 ml kiekio bei maišyta 10 minučių. Sumaišius produktas perfitruotas per popierinį filtrą. Gautas filtratas matavimo kolboje praskiestas distiliuotu vandeniu iki 100 ml. Paruošti mėginiai panaudoti L (+) ir D (-) pieno rūgšties izomerų nustatymui.

D (-) pieno rūgšties izomerai nustatyti spektrofotometriniu būdu, įvertinus spalvų pokyčius inicijuotus veikiant dviems fermentams, naudojant fermentinį testą K-DLATE 08/11 (Megazyme International Ireland Limited). Pirmoji reakcija katalizuojama D-laktato dehidrogenazės (D-LDH), kurios metu D- izomeras oksiduojasi iki piruvato, susidarant nikotinamido – adenino dinukleotidą ((NAD+). Antroji reakcija yra piruvato konversijos į D-alaniną ir 2-oksoglutaratą, ji vyksta veikiant fermentui D-glutamato-piruvato transaminazei (D-GPT). NADH kiekis, susidaręs šių reakcijų metu koreliuoja su D (-) pieno rūgšties izomerų kiekiu. NADH kiekis įvertinamas spektrofotometriškai esant 340 nm bangos ilgiui.

L (+) pieno rūgšties izomero kiekis nustatytas vykdant oksidaciją iki piruvato su L-laktato dehidrogenaze (L-LDH), kurios metu susidaro nikotinamido-adenino dinukleotidas (NAD+). Toliau veikiama D-GPT ir matuojama absorbcija esant 340 nm bangos ilgiui.

2.2.8. Grūdų apdorojimas fermentuotu antžeminės H. tuberosus L. dalies bio- produktu

Sėklai skirti kviečių grūdai po 5 vienetus buvo išdėti ant Petri lėkštelėje paruošto agaro. Kiekviena Petri lėkštelė su grūdais išpurkšta fermentuotu antžeminės H. tuberosus L. dalies, su skirtingais K. marxianus mielių porūšiais, bio- produktu. Paruošti mėginiai inkubuoti 48 val. 30 ºC temperatūroje bei stebimas jų daigumas.

Po inkubacijos mėginiai vizualiai įvertinti priklausomai nuo mikroskopinių grybų kolonijų susiformavimo aplink grūdus.

2.2.9. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių nustatymas dujų chromatografu

Kokybinė ir kiekybinė aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių (metanolio, acetaldehido, metilacetato, etilacetato, propanolio, izobutanolio ir izoamilo alkoholio) analizė tirtuose mėginiuose buvo atlikta dujų chromatografijos metodu. Naudota kolonėlė Zebron ZB – WAX; 30m x 0,25 x 0,25 µm; 100 % polietilenglikolio; Phenomenex. Tiriamųjų junginių koncentracija (mg/l) apskaičiuota, palyginus smailių plotus su žinomos koncentracijos etaloninių medžiagų smailių plotais (4 lentelė).

Taikyta programa, pagal kurią nuo 60 °C kolonėlės temperatūra iki 120 °C pakelta per 10 minučių, keliant po 4 °C per minutę.

4 lentelė. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių koncentracijos standartiniame tirpale Standartas, mg/l Acetal-dehidas Metil-acetatas Etil-acetatas Metanolis Propa-nolis Izobuta- nolis Izoamilo-alkoholis 62,8 18,64 180,4 79,1 32,16 161,6 330

2.3. Matematinė statistinė duomenų analizė

Naudojant Prism 3.0 programą, atlikta statistinė eksperimento duomenų analizė. Statistiškai įvertinta vidutinė vertė, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida, patikimumas, variacijos ir koreliacijos koeficientas.

3. REZULTATAI

3.1. H. tuberosus L. šaknų tiriamosios dalies rezultatai

Atlikus H. tuberosus L. šaknų fermentaciją panaudojant atitinkamus K. marxianus mielių porūšius, gauti skirtingi raugalo rodikliai, o distiliate skirtingi aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekiai.

3.1.1. Raugalo (H. tuberosus L. šaknų) parametrų ir etanolio kiekio rezultatai

Atlikus raugalo (H. tuberosus L. šaknų) parametrų analizę, nustatytas skirtingas sausųjų medžiagų kiekis bei pH (3 pav.).

Sausųjų medžiagų daugiausiai nustatyta mėginyje, kurio žaliavos fermentacijai naudotos K. marxianus var. marxianus – 4,9 proc., šiek tiek mažiau – mėginyje fermentuotame K. marxianus var. dobzhenski – 4,5 proc. Mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. bulgaricus ir K. marxianus var. lactis sausųjų medžiagų nustatyta, atitinkamai, 4,0 proc. ir 4,2 proc. Mažiausias sausųjų medžiagų kiekis, lyginant su kitais mėginiais, nustatytas mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. arosophbarum – 3,5 proc.

Mažiausias pH nustatytas mėginių fementuotų K. marxianus var. arosophbarum – 4,12, šiek tiek didesnis pH nustatytas mėginių fermentuotų K. marxianus var. marxianus – 4,18. Nereikšmingai didesnis pH nustatytas mėginių, kurių fermentacijai naudotos mielės K. marxianus var. lactis (4,38). Mėginių fermentuotų K. marxianus var. dobzhenski ir K. marxianus var. bulgaricus pH, atitinkamai, nustatytas 4,28 ir 4,24.

Etanolio kiekis visuose tirtuose mėginiuose, nepriklausomai nuo žaliavos fermentacijai naudotų mielių porūšių, nustatytas vienodas – 2 tūrio proc. (1 priedas).

0 1 2 3 4 5 6 K .m a rx ia n u s v a r. d o b z h e n s k i K . m a rx ia n u s v a r. b u lg a ri c u s K . m a rx ia n u s v a r. a ro s o p h b a ru m K . m a rx ia n u s v a r. l a c ti s K . m a rx ia n u s v a r. m a rx ia n u s Mėginiai S au so si os m ed ži ag os , pr oc . Sausosios medžiagos, proc. pH

3 pav. Raugalo (H. tuberosus šaknų) sausųjų medžiagų ir pH kiekis mėginiuose (P – 0,0002)

Pagal gautus H. tuberosus L. šaknų raugalo parametrų analizės rezultatus galima teigti, kad K. marxianus var. arosophbarum mielių pajėgumas metabolizuoti sacharidus parinktame substrate yra didžiausias, kadangi liko mažiausias sausųjų medžiagų kiekis, lyginant su kitais mėginiais. Atliekant žaliavos fermentaciją mažiausiai efektyvios buvo mielės K. marxianus var. marxianus, kadangi sausųjų medžiagų kiekis buvo didesnis nei kituose mėginiuose.

Mėginiuose pH kito paklaidų ribose, tad mielių parinkimas pH reikšmingos įtakos neturėjo. Mielių porūšio parinkimas etanolio koncentracijai mėginiuose įtakos neturėjo. Alkoholinė fermentacija visuose mėginiuose vyko vienodu intensyvumu. Nedidelę etanolio koncentraciją mėginiuose galėjo lemti naudotas topinambų porūšis bei kiti faktoriai, kadangi žaliavoje susidarančių angliavandenių kiekį gali įtakoti derliaus auginimo, nuėmimo, laikymo sąlygos.

3.1.2. Gautų silpnų fermentuotų gėrimų juslinio įvertinimo rezultatai

Atlikus gautų fermentuotų gėrimų juslinio priimtinumo įvertinimą, naudojant 0-5 balų vertinimo sistemą, visų mėginių juslinis priimtinumas nustatytas panašus, nepriklausomai nuo eksperimente naudotų mielių porūšių (4 pav.).

Visų mėginių juslinis priimtinumas įvertintas 4,5-5 balais. Priimtiniausi mėginiai buvo tie, kurių žaliavos fermentacijai naudotos K. marxianus var. dobzhenski, K. marxianus var. bulgaricus ir K. marxianus var. marxianus – įvertinimo vidurkis gautas po 5 balus. Likusių mėginių, atitinkamai su K. marxianus var. arosophbarum ir K. marxianus var. lactis, bendras priimtinumas įvertintas 4,5 balo.

0 1 2 3 4 5 6 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai P ri im ti n u m a s, b a la is

4 pav. Fermentuotų gėrimų bendras priimtinumas

Pagal gautus tyrimo rezultatus galima teigti, kad mielių parinkimas gautų fermentuotų gėrimų juslinėms savybėms įtakos neturėjo.

H. tuberosus L. šaknis fermentuojant K. marxianus mielėmis ir L. sakei gaunami jusliškai priimtini silpni fermentuoti gėrimai.

3.1.3. Acetaldehido palyginamasis įvertinimas

Atlikus eksperimentą, nustatyta, kad atitinkami K. marxianus mielių porūšiai skirtingai įtakoja acetaldehido formavimąsi mėginiuose (5 pav.). Daugiausia acetaldehido susidarė mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. lactis ir K. marxianus var. dobzhenski (512,2 mg/l ir 443,1 mg/l). Žaliavos fermentacijai naudojant K. marxianus var. arosophbarum ir K. marxianus var. marxianus acetaldehido nustatyta, atitinkamai, 339,9 mg/l ir 289,5 mg/l, mažiausiai mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. bulgaricus – 214,8 mg/l.

0 100 200 300 400 500 600 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai mg/l

Pagal gautus tyrimo rezultatus, galima teigti, kad K. marxianus mielių porūšio parinkimas nežymiai įtakojo acetaldehido formavimąsi, išskyrus mėginius, kurių žaliavos fermentacijai buvo naudotos K. marxianus var. bulgaricus mielės, kurios lėmė mažesnį acetaldehido susidarymą. Todėl, šios mielės galėtų būti panaudojamos ir praktikoje, siekiant gauti produktą su mažesniu acetaldehido kiekiu.

Acetaldehido susidarymą, nepriklausomai nuo gamybai parinktų mielių, galėjo lemti pieno rūgšties bakterijų panaudojimas fermentacijoje, kadangi jos lemia organinių rūgščių susidarymą, ko pasekoje gali padaugėti aromatinių junginių, šiuo atveju acetaldehido.

3.1.4. Metilacetato palyginamasis įvertinimas

Pagal gautus tyrimo rezultatus, matoma skirtinga metilacetato kitimo tendencija, priklausomai nuo žaliavos fermentacijai naudotų K. marxianus mielių (6 pav.). Daugiausiai metilacetato susidarė mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. lactis – 1900,5 mg/l, šiek tiek mažiau mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. arosophbarum – 1465,8 mg/l. Mažiausiai metilacetato susiformavo žaliavą fermentuojant K. marxianus var. bulgaricus – 456,2 mg/l. Mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. dobzhenski ir K. marxianus var. marxianus metilacetato susidarė, atitinkamai, 897,1 mg/l ir 761,8 mg/l.

0 400 800 1200 1600 2000 2400 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai mg/l

6 pav. Metilacetato kiekis mėginiuose (P – 0,0134)

Remiantis gautais tyrimais galima teigti, kad žaliavos fermentacijai parinkus tinkamas mieles, šiuo atveju K. marxianus var. bulgaricus galima pasiekti ženkliai mažesnį metilacetato susiformavimą, lyginant su kitais mėginiais, kurių fermentacijai buvo naudotos atitinkamai K. marxianus var. arosophbarum ir K. marxianus var. lactis mielės.

Atitinkamą poveikį metilacetato formavimuisi mėginiuose galima sieti su mielių ir PRB gebėjimu produkuoti įvairius aromatinius junginius.

3.1.5. Etilacetato palyginamasis įvertinimas

Atlikus analizę nustatyti skirtingi etilacetato kiekiai mėginiuose, priklausomai nuo žaliavos fermentacijai naudotų mielių (7 pav.). Daugiausiai etilacetato susidarė eksperimente naudojant K. marxianus var. arosophbarum ir K. marxianus var. lactis, atitinkamai 1400,2 mg/l ir 1367,8 mg/l. Mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. bulgaricus etilacetato nustatyta 852,6 mg/l, fermentuotuose K. marxianus var. dobzhenski – 652,2 mg/l. Mažiausias etilacetato kiekis susidarė mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. marxianus – 404,2 mg/l.

0 300 600 900 1200 1500 1800 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai mg/l

7 pav. Etilacetato kiekis mėginiuose (P – 0,0089)

Iš pateiktų rezultatų matyti, kad mielių porūšio įtaka etilacetato kiekiui mėginiuose yra nereikšminga, išskyrus K. marxianus var. marxianus, kurių parinkimas žaliavos fermentacijai lėmė daugiau nei tris kartus mažesnį etilacetato kiekį, lyginant su mėginiu, kurio fermentacija buvo atlikta su K. marxianus var. arosophbarum.

3.1.6. Metanolio palyginamasis įvertinimas

Metanolio kiekis mėginiuose kito priklausomai nuo žaliavos fermentacijai naudotų mielių (8 pav.). Mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. bulgaricus ir K. marxianus var. marxianus metanolio nenustatyta. Mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. arosophbarum ir K. marxianus var. lactis metanolio susidarė, atitinkamai, 47,8 mg/l ir 65,2 mg/l. Daugiausiai metanolio nustatyta mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. dobzhenski (113,1 mg/l).

0 20 40 60 80 100 120 140 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai mg/l

8 pav. Metanolio kiekis mėginiuose (P – 0,1014)

Pagal gautus tyrimo rezultatus, galima teigti, kad K. marxianus var. bulgaricus ir K. marxianus var. marxianus mielės gali būti naudojamos žaliavos fermentacijai maisto pramonėje, siekiant išgauti fermentuotus gėrimus be nuodingo organinio junginio – metanolio. Kadangi eksperimente panaudojus šias mieles metanolio neaptikta.

3.1.7. Propanolio palyginamasis įvertinimas

Atlikus analizę nustatyta, kad propanolio formavimasis mėginiuose priklauso nuo tyrimui naudotų mielių (9 pav.). Didžiausias kiekis propanolio, lyginant su kitais mėginiais, gautas žaliavos fermentacijai panaudojus K. marxianus var. arosophbarum ir K. marxianus var. lactis (112,4 mg/l ir 124,1 mg/l). Propanolio nenustatyta mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. marxianus. Žaliavos fermentacijai panaudojus K. marxianus var. bulgaricus propanolio susidarė 50 proc. mažiau – 32,2 mg/l, nei mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. dobzhenski (56,7 mg/l).

0 30 60 90 120 150 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai mg/l

Pagal gautus rezultatus galima teigti, kad K. marxianus var. marxianus mielės gali būti naudojamos, siekiant gauti propanolio aspektu saugų produktą, kadangi panaudojus šias mieles propanolio nesusidarė.

Galima teigti, kad bet kurio K. marxianus mielių porūšio parinkimas gali lemti mažesnį propanolio formavimasį, kadangi visuose mėginiuose propanolio susidarė nedideli kiekiai.

3.1.8. Izobutanolio palyginamasis įvertinimas

Izobutanolio kiekis mėginiuose priklausė nuo tyrime naudotų mielių porūšių (10 pav.). Didžiausias izobutanolio kiekis susidarė mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. lactis (398,6 mg/l) ir K. marxianus var. arosophbarum (287,1 mg/l). Mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var. marxianus izobutanolio nenustatyta. Mėginiuose fermentuotuose mielėmis K. marxianus var. dobzhenski ir K. marxianus var. bulgaricus izobutanolio susidarė, atitinkamai, 68,5 mg/l ir 22,9 mg/l. 0 80 160 240 320 400 480 K.marxianus var. dobzhenski K. marxianus var. bulgaricus K. marxianus var. arosophbarum K. marxianus var. lactis K. marxianus var. marxianus Mėginiai mg/l

10 pav. Izobutanolio kiekis mėginiuose (P – 0,1215)

Pagal gautus tyrimo rezultatus galima teigti, kad K. marxianus var. dobzhenski, K. marxianus var. bulgaricus ir K. marxianus var. marxianus galėtų būti sėkmingai naudojamos žaliavos fermentacijai – izobutanolio formavimosi sumažinimui.

3.1.9. Izoamilo alkoholio palyginamasis įvertinimas

Atlikus eksperimentą gauti skirtingi izoamilo alkoholio kiekiai mėginiuose (11 pav.). Daugiausia izoamilo alkoholio susiformavo mėginiuose fermentuotuose K. marxianus var.