MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MIGLĖ BUDREVIČIŪTĖ
LIETUVOJE AUGANČIŲ SIAURALAPIŲ GAUROMEČIŲ
(CHAMERION ANGUSTIFOLIUM (L.) HOLUB) AUGALINĖJĖ
ŽALIAVOJE ESANČIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Rūta Marksienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr., Ramunė Morkūnienė
Data:
LIETUVOJE AUGANČIŲ SIAURALAPIŲ GAUROMEČIŲ
(CHAMERION ANGUSTIFOLIUM (L.) HOLUB) AUGALINĖJĖ
ŽALIAVOJE ESANČIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ
IRANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc., dr. Rūta Marksienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Miglė Budrevičiūtė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) morfologiniai požymiai, paplitimas ... 10
1.2. Vaistinė augalinė žaliava ... 11
1.3. Biologiškai aktyvios medžiagos ... 11
1.4. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) farmakologinės savybės ... 12
1.5.Fenolinių junginių apžvalga ... 13
1.6. Fenolinių junginių išskyrimas ir analizės metodai... 14
1.6.1. Spektrofotometrinis metodas... 15
1.6.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 16
1.7. Laisvieji radikalai, antioksidantai ... 16
1.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 17
1.9. CUPRAC metodo pritaikymas antioksidacinio aktyvumo nustatymui ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Naudoti reagentai ... 20
2.3. Naudota aparatūra ... 21
2.4. Siauralapių gauromečių ekstraktų paruošimas... 21
2.5. Tyrimo metodikos ... 21
2.6. Statistinė duomenų analizė ... 23
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas... 25
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu su Folin – Ciocalteu reagentu ... 26
3.2.1.Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių augalinės žaliavos
ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 26
3.2.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 27
3.2.3. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 28
3.2.4. Suminis fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapio gauromečio lapuose ir visoje augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu ... 29
3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu CUPRAC metodu ... 30
3.3.1. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos antioksidantinis vertinimas ... 30
3.3.2. Siauralapių gauromečių lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas ... 31
3.3.3. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas ... 32
3.3.4. Suminis siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas ... 33
3.4. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 34
3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 34
3.5.1. Specifiškumas... 35
3.5.2. Glaudumas ... 35
3.5.3. Tiesiškumas ... 36
3.5.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 37
3.5. Siauralapio gauromečio fermentuotos arbatos ir visos žaliavos fenolinių junginių kiekybinis įvertinimas ESC metodu ... 38
3.6. Tyrimo rezultatų apibendrinimas ... 39
IŠVADOS ... 41
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
SANTRAUKA
M. Budrevičiūtės magistro baigiamasis darbas „Lietuvoje augančių siauralapių
gauromečių(Chamerion angustifolium (L.) Holub) augalinėje žaliavoje esančių fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimas“, mokslinė vadovė doc. Dr. R. Marksienė, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2018.
Raktiniai žodžiai:Chamerion angustifolium, siauralapis gaurometis, fenoliniai junginiai,
Folin – Ciocalteu, CUPRAC, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), antioksidantai.
Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančių siauralapių gauromečių(Chamerion
angustifolium (L.) Holub ) augalinėje žaliavoje esančius fenolinius junginius ir antioksidantinį aktyvumą.
Uždaviniai:Parinkti tinkamiausias ekstrahavimo sąlygas fenolinių junginių ir antioksidantų
išskyrimui iš gauromečio augalinės žaliavos. Nustatyti ir įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį lapuose ir visoje siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje, taikant spektrofotometrinį Folin– Ciocalteu metodą skirtingose žaliavos rinkimo vietose. Nustatyti ir įvertinti siauralapių gauromečių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą spektrofotometriniu CUPRAC metodu. Pritaikyti ESC metodiką, fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui siauralapių gauromečių augalinėje
žaliavoje, bei atlikti metodikos validaciją. Įvertinti ir palyginti siauralapių gauromečių fermentuotos arbatos ir augalinės žaliavos kiekybinę fenolinių junginių cheminę sudėtį validuotu ESC metodu.
Tyrimo objektas ir metodai: Siauralapių gauromečių(Chamerion angustifolium (L.)
Holub)fenoliniųjunginių kokybinės ir kiekybinės sudėties ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu CUPRAC metodu. ESC metodu kiekybiškai ir kokybiškai nustatyti fenoliniai junginiai ekstraktuose.
Rezultatai ir išvados: Visi tyrimo mėginiai rinkti žydėjimo periodo metu. Buvo nustatytas
geriausias augalinės žaliavosekstrahentas – 70 % (v/v) etanolis. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu, Plateliuose 94,139 ± 0,22 mg/g lapų augalinėje žaliavoje.Didžiausia redukcine geba pasižymėjo Plateliuose
augusiossiauralapių gauromečių žaliavos 9,033 ± 0,01 mg/g.Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse.ESC analize nustatyti fenoliniai junginiai: dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, kvercetinas.
SUMMARY
Master's Thesis by M. Budrevičiūtė "The evaluation of phenolic compounds and antioxidant activity of Chamerion Angustifolium (L.) Holub, growing in Lithuania", Scientific Supervisor Assoc. Dr. R. Marksienė, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas, 2018.
Keywords: Chamerion angustifolium, willow herb, phenolic compounds, Folin - Ciocalteu,
CUPRAC, High-performance liquid chromatography (HPLC), antioxidants.
The aim of the study.To evaluate the phenolic compounds and antioxidant activity in the
raw material of Chamerion angustifolium (L.) Holub growing in Lithuania.
Objectives: To select the most suitable extraction conditions for the extraction of phenolic
compounds and natural antioxidants from willow herb raw material. Determine and evaluate the total amount of phenolic compounds in the leaves and throughout the willow herbplant material using a spectrophotometric Folin-Ciocalteu method in different raw material collection sites. Determine and evaluate the antioxidant activity of the willow herb extracts by spectrophotometric CUPRAC method. To apply ESC methodology for qualitative and quantitative evaluation of phenolic compounds in willow herbraw material, and to validate the methodology. To evaluate and compare the quantitative composition of phenolic compounds of squamous willow herbfermentation tea and vegetable raw material by validated ESC method.
Object and methods of the study: Qualitative and quantitative composition and antioxidant
activity of phenolic compounds of willow herb(Chamerion angustifolium (L.) Holub). The total amount of phenolic compounds was determined by spectrophotometric Folin - Ciocalteu method. Antioxidant activity was determined by spectrophotometric CUPRAC method. ESC method for the quantitative and qualitative determination of phenolic compounds in extracts.
Results and Conclusions: All samples were collected during the flowering period. The best
extraction solvent for raw material was determined - 70% (v / v) ethanol. Maximum total phenolic compounds determined by spectrophotometric Folin - Ciocalteu method, in Plateliai 94,139 ± 0,22 mg / g leaves raw material. The highest reductive ability was observed in the leaves raw material of 9,033 ± 0,01 mg / g. The highest amounts of antioxidants are obtained on plant leaves compared with all the raw material in all plants. ESC analyzed phenolic compounds: dihydrobenzoic acid, neochlorogen, chlorogenic acid, hyperoside, isoquercitin, quercitin, quercetin.
SANTRUMPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. High performance liquid chromatography) ROS - reaktyviosios deguonies formos
RNS - reaktyviosios azoto formos
ABTS - 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (angl. Cupric ion reducing antioxidant capacity)
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
FRAP - geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. Gallic acid equivalents)
TE – trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalents) UV – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Augalinių vaistinių preparatų paklausa, dėl jų didesnio saugumo ir platesnio veikimo lyginant su cheminiais preparatais, pasaulyje didėja. Dėmesys yra skiriamas vaistinių augalinių žaliavų tyrimams, siekiant nustatyti biologiškai aktyvias medžiagas. Svarbus vaistinės augalinės žaliavos racionalus ir tikslingas rinkimas, kad būtų išsaugotas gamtinių sistemų tvarumas ir išteklių gausumas.
Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) žaliava pasižymi įvairialypiu biologiniu aktyvumu ir gali būti naudojama vaistų gamybai. Vaistinė augalinė žaliava – gauromečių lapai arba žolė, kuri yra renkama žydėjimo metu. Vaistinėje augalinėje žaliavoje kaupiasi įvairūs polifenoliniai junginiai, rauginės medžiagos, gleivės, vitaminas C. Siauralapis gaurometis pasižymi antimikrobiniu, antioksidaciniu, priešuždegiminiu, skausmą malšinančiu poveikiu, vartojamas sutrikus prostatos funkcijai.
Darbo naujumas. Apžvelgus mokslinės literatūros duomenis, Lietuvoje augančio siauralapio gauromečio žaliavoje esantys fenoliniai junginiai ir antioksidantai yra mažai ištirti, todėl būtų tikslinga atlikti skirtinguose Lietuvos vietose surinktų siauralapių gauromečių fitocheminę analizę, nustatant fenolinių junginių kiekius ir antiokidacinį aktyvumą bei jų įvairavimą, kuris įtakoja siauralapio gauromečio vaistinės augalinės žaliavos tinkamumą ligų prevencijai ir profilaktikai. Kadangi, kol kas, nėra vaistinių preparatų su gauromečių augaline žaliava, kuriuos būtų galima įsigyti, gauta informacija gali būti panaudota kuriant ir gaminant vaistinius preparatus iš augalinės žaliavos.
Šiame darbe bendras fenolinių junginių kiekis siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub – Epilobium angustifolium (L.) augalinėje žaliavoje buvo nustatytas spektrofotometriniu būdu, naudojant fenolinį Folin – Ciocalteu reagentą. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu CUPRAC metodu, bei atlikta kiekybinė ir kokybinė fenolinių
junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančių siauralapių gauromečių(Chamerion
angustifolium (L.) Holub) augalinėje žaliavoje esančius fenolinius junginius ir jųantioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
2. Nustatyti ir įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį lapuose ir visojesiauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje taikant spektrofotometrinį Folin– Ciocalteu metodą skirtingose žaliavos rinkimo vietose.
3. Nustatyti ir įvertinti siauralapių gauromečių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu CUPRAC metodu.
4. Pritaikyti ESC metodiką, fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje, bei atlikti metodikos validaciją.
5. Įvertinti ir palyginti siauralapių gauromečių fermentuotos arbatos ir augalinės žaliavos kiekybinę fenolinių junginių cheminę sudėtį validuotu ESC metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub)
morfologiniai požymiai, paplitimas
1pav. Siauralapis gaurometis Chamerion angustifolium (L.) Holub
Chamerion angustifolium (L.) Holub – siauralapis gaurometis priklauso nakvišinių
(Onagraceae) šeimai. Tai daugiametis žolinis augalas, kuris užauga 60 – 120 cm aukščio. Stiebas stačias arba kylantis, apvalus arba nežymiai briaunotas, paprastas, rečiau šakotas, plikas arba apaugęs pasišiaušusiais ar prigulusiais plaukeliais, raudono atspalvio; nuo pamato iki žiedyno lapuotas [31, 39, 64].Lapai pražanginiai, lancetiškiviršutinėje pusėje tamsiai žali, apatinėje – melsvai žali, su rusvomis gyslomis, lygiakraščiai arba su liaukiniais danteliais, smailūs, bekočiai ar su mažais koteliais, 5-12 cm ilgio, iki 2 cm pločio. Lapai bekočiai arba su trumpais koteliais (iki 7 mm), pražanginiai arba mentūriniai, pailgi arba linijiškai lancetiški, [31, 64].Šakniastiebis –storas, ilgas, šliaužiantis su daugeliu požeminių ūglių,[4]. Žiedai iki 30 mm skersmens, išorinėje pusėje rausvo atspalvio, plaukuoti, nesuaugę su taurele, netaisyklingi, susitelkę į gana ilgas, viršūnines kekes [39, 40, 49].
Siauralapis gaurometis žydi vasarą: birželį – rugsėjį, o sėklos subręsta rupjūtį – spalį.
Vaisius 4-9 mm ilgio, ankšties pavidalo keturbriaunė dėžutė. Dauginasi šakniastiebio palaipomis ir
Gaurometis paplitęs įvairiuose dirvožemiuose, bet dažniausiai auga pažeistose žemės vietose - miškuose, pamiškėse, ypač miškų aikštelėse, kirtimuose, gaisravietėse (angliškai siauralapis gaurometis vadinamas fireweed (fire – gaisras, weed – piktžolė), sausuose durpynuose, šlaituose, retai smėlio kopose, ant geležinkelio pylimų, pakelėse, vietomis gali sudaryti nemenkussąžalynus [39, 40, 43, 52].Paplitęs visoje Lietuvoje, bet daugiausiai aptinkamas pietinėje ir rytinėje šalies dalyse. Lietuvoje paplitę ir gerai žinomi pavadinimai yra kazokas, siauralapė ožrožė, ožkarožė. Lietuvoje natūraliose Chamerion (Raf.) Raf. genties augavietėse auga viena rūšis – siauralapis gaurometis (Chamerion angustifolium (L.) Holub.) [39].
1.2. Vaistinė augalinė žaliava
Siauralapio gauromečio vaistinė augalinė žaliava yra lapai arba žolė. Žaliavaantžeminė dalis: lapai, žolė ruošiama birželio viduryje – liepą, žydėjimo metu. Nupjauta žydėjimo metu žolė
džiovinama paskleidus plonu sluoksniu nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje ir gerai vėdinamoje patalpoje. Paruošta žaliava laikoma sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje supakuota į daugiasluoksnius popierinius maišus. Taip paruoštą žaliavą tinka vartoti 2 -3 metus [14, 40, 61].
1.3. Biologiškai aktyvios medžiagos
Susisteminus mokslinių tyrimų ir literatūros duomenis, buvo įvertinta siauralapio
gauromečio biologiškai aktyvių junginių sudėtis. Antžeminėje dalyje kaupiasi raugai (10,0 proc.), gleivės (iki 15 proc.), vitaminas C, fitosterinai, flavonoidai [39]. Vienos iš pagrindinių biologiškai aktyvių medžiagų yra fenoliniai junginiai, kurie randami visoje augalo antžeminėje dalyje. Buvo nustatyta, kad Chamerion angustifolium (L.) Holub augalai kaupia šias veikliąsias
medžiagas:flavonoidusiš orasausės vaistinės augalinės žaliavos išskirta apie 1-2 proc. flavonoidų. Randami nedideli kiekiai laisvų flavonolių aglikonų miricetino, kemferolio ir kvercetino, nežymūs kiekiai flavonolių glikozidų kemferolio-3-O-ramnozido, izomiricitrino (miricetino-3-O-gliukozido), kvercetinas, kvercitrinas (kvercetino-3-O-β-D-ramnozidas), izokvercitrinas (kvercetino-3-O-
gliukozido), hiperozidas (kvercetino-3-O-galaktozido), rutinas (kvercetino-3-O-rutinozidas), guaiaverinas (kvercetino-3-O-arabinozidas), ramnetinas (7-metoksi-kvercetinas), izoramnetinas (3-metil-kvercetinas), izoramnetino-3-gliukozidas, kemferolis; flavonai ir jų glikozidai: luteolinas, cinarozidas (luteolino-7-gliukozidas), apigetrinas. Rauginės medžiagos: elagotaninai - oenoteinas
A, oenoteinas B. Fenolinės rūgštys – galo, elago, kofeino, chlorogeno rugštys. Fitosteroliai [1, 5, 9, 16, 20, 24, 25, 29, 37, 58, 60].
1.4. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub)
farmakologinės savybės
Siauralapis gaurometis pasižymi gydomosiomis savybėmis ir nuo seno yra naudojamas kaip vaistažolė liaudies medicinoje. Gauromečio poveikis žmogaus organizmui:
Antimikrobinis, priešgrybelinis ir priešvirusinis poveikis: tyrimai parodė, kad etanolinis
ekstraktas veikia antimikrobiškai. Tiriant gauromečio poveikį etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai pagaminti iš šviežios žydinčios vaistinės augalinės žaliavos – žolės pasižymėjo didžiausiu
aktyvumu ir slopina šių gram teigiamų ir gram neigiamų bakterijų kultūrų, mieliagrybių ir grybelių augimą ir šis poveikis daugeliu atvejų yra baktericidinis[5, 62]:Bacillus subtilis, Candida albicans, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Escherichia coli, Micrococcus luteus
bakterijų,Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus albus ir Staphylococcus aureus [5, 18, 30, 62].
Piešuždegiminis ir antioksidancinis poveikis: Šiuo povekiu siauralapis gaurometis
pasižymi dėl jame randamų miricetino-3-O-gliukuronido ir miricetino-3-O-ramnozido, kvercetino-3-O-gliukuronido, elagotaninų: oenoteino A, oenoteino B. Tyrimų metu nustatyta, kad
hialuronidazę slopina ekstrakte esantis oenoteinas B, taip skatina žaizdų gijimą. Didžiausi oenoteino B kiekiai nustatyti E.angustifolium vaistinės augalinės žaliavos ekstrakte. Taip pat nustatyta, kad iš E. Angustifolium pagaminti vandeniniai ekstraktai slopina ciklooksigenazes (COX-1 ir COX-2). Miricetino-3-gliukuronidas prostaglandinų biosintezę slopina efektyviai kaip ir priešuždegiminis vaistas indometacinas [24, 37, 47, 53].
Vieno tyrimo, kuriame buvo įvertintas UV šviesos sukeltam odos ląstelių senėjimui
antioksidacinis siauralapio gauromečio poveikis,metu nustatytos trys grupės turinčios antioksidacinį poveikį: augale esantys flavonoidai, elagotaninai (oenotinas B) ir fenolinės rūgštys (galo r.).
Ekstraktas iš siauralapio gauromečio senstančioms ląstelėms padidino gyvybingumą, apsaugo odos ląsteles nuo UV šviesos sukeliamo eritemos formavimosi [50].
Imunomoduliacinis poveikis: viena iš siauralapio gauromečio biologiškai aktyvių junginių
grupių yra elagotaninai, kurios atstovas oenotinas B pasižymi antioksidaciniu, priešvėžiniu, antibakteriniu, antivirusiu poveikiu. Jis turi įtakos NADPH oksidazės aktyvumui to pasekoje
aktyvinama citokinų gamyba, chemotaksis, fagocitozė. Manoma, kad siauralapio gauromečio ekstraktų gebėjimas moduliuoti makrofagų funkcijas lemia savybę skatinti žaizdų gijimą ir stabdyti auglių augimą [53, 54].
Gerybinės prostatos hiperplazijos gydymui: Vis dažniausiekiant ištirti ir nustatyti
siauralapio gauromečio poveikį, prostatos ir su šlapinimusi susijusių ligų gydymui, vykdomi tyrimai su Chamerion angustifolium vaistine augaline žaliava. Dažniausiai tyrinėjami etanoliniai ekstraktai, rečiau vandeninės ištraukos. Taip pat ir liaudies medicinoje sauralapio gauromečio vaistinė augalinė žaliava naudojama prostatos negalavimams gydyti, tokiems kaip beprasidedanti gerybinė prostatos hiperplazija (GPH). Tyrimo metu su E.angustifolium etanoliniu ekstraktu nustatyta, kad augalas stiprus prostatos vėžinių ląstelių inhibitorius.Šis povekis siejamas su įvairiais augale esančiais junginiais. Tiriant buvo išsiaiškinta, kad stipriausiai veikia veiklioji medžiaga - oenotinas B, kuris aktyvesnis nei miricetinas, kvercetino-3-O-gliukoronidas bei kemferolis. Siaurapalio gauromečio ekstraktai gali trukdyti 5-α-reduktazės ir aromatazės veikimui, kurios dalyvauja prostatos
hiperplazijos vystime.Oenotino a ir B 5α-reduktazę slopinantis poveikis didesnis už GPH gydyti vartojamo vaisto finasterido gebėjimą inhibuoti fermentą. Be to oenotinas B aktyviausiai mažina prostatos ląstelių proliferaciją, prostatos specifinio antigeno sekreciją bei arginazės veiklą.Tam tikri flavonoidai gali stabdyti hormonams jautrių ir nejautrių ląstelių augimą, todėl manoma, kad
gauromečio ekstraktuose esantys flavonoidai gali tiesiogiai inhibuoti žmogaus prostatos epitelio ląstelių proliferaciją[9, 27, 57, 60]. Dėja, bet dėl nepakankamų klinikinių duomenų gauromečio preparatai nėra parduodami Europoje.
1.5.Fenolinių junginių apžvalga
Fenoliniai junginiai yra viena plačiausių antrinių metabolitų grupė augaluose. Jie užima svarbią vietą augalų augime ir reprodukcijoje, saugo augalą nuo kenkėjų, ligų sukelėjų. Sujungia susiformavusius laisvuosius radikalus taip apsaugodami augalų ląsteles nuo deguonies trūkumo ir oksidacinio streso. In vitro tyrimų metu mokslininkai nustatė, kad šios molekulės pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu. Dauguma fenolių dalyvauja žmogaus organizme neutralizuojant žalingus procesus [7, 45].
Fenoliniai junginiai pasižymi dideliu biologiniu aktyvumu ir yra paplitę augalų
karalystėje.Žinoma daugiau nei 8000 fenolinių junginių. Iš jų apie 4000 priskiriama flavonoidams. Vieni jų yra paprasti, tokie kaip fenolinės rūgštys, o kiti turi labai sudėtingą struktūrą, pavyzdžiui
taninai. Augalams spalvą, kai kurias organoleptines savybes: kartumą, sutraukiantį skonį suteikia fenoliai [17, 48].
Fenolius sieja aromatinis žiedas, prie kurio prijungtos viena ar keletas hidroksilo grupių bei galimos kitos cheminės modifikacijos [7, 33]. Fenoliniai junginiai varijuoja nuo paprastų iki stipriai polimerizuotų darinių dažnai vadinamų – polifenoliais, dėl fenolinių žiedų skaičiaus junginyje [23].Fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami remiantis jų kilme, biologinėmis savybėmis, chemine struktūra [rong]. Fenoliniai junginiai pagal cheminę struktūrą skirtomi į klases (2 pav.). Fenolinės rūgštys ir flavonoidai yra labiausiai ištyrinėtos ir daugiausiai junginų turinčios grupės [33, 44].
2 pav. Fenolinių junginių klasifikacija
1.6. Fenolinių junginių išskyrimas ir analizės metodai
Norint nustatyti fenolinių junginių kiekybinį ir kokybinį įvairavimą pirmiausia reikia juos išekstrahuoti iš augalinės žaliavos. Tiriamosios medžiagos gali būti ekstrahuojamos iš šviežių, šaldytų ir džiovintų mėginių. Po to dažniausiai yra smulkinama arba malama augalinė žaliava, nes manoma, kad tokiu būdu ekstrahentas prasiskverbia geriau ir efektyviau vyksta ekstrakcija [13].
Fenoliniai junginiai Fenolinės rūgštys Hidroksibenze n -karboksirūgšty s Galo; Vanilino; Siringo; Protokatecho rūgštys Hidroksicinam ono rūgštys Chlorogeno; P-kumaro ; Sinapo; Ferulo ; Kavos rūgštys
Ligninai Stilbentai Flavonoidai
Flavonoliai Kvercetinas; Kemferolis; Miricetinas; Galantinas; Gisetinas Flavonai Apigeninas; Chritezinas; Liuteolinas Katechimai Katechimas; Apikatechimas; Epigalokatechimas; Epikatechimo galatas; Epigalokatechimo galatas Flavononai Eriodiktionas; Hesperidinas; Naringeninas Antocianidai Cianidinas; Pelargonidinas ; Delfinidinas; Peonidinas; Malvidinas Izaflavonoid ai Genisteinas; Daidzeinas; Glyciteinas; Formononitina s
Nors metodų kaip išskirti fenolinius junginius yra nemažai, tačiau dažniausiai vykdoma augalinių žaliavų ekstrakcija su tirpikliais. Cheminės ekstrakcijos efektyvumas ir greitis priklauso nuo naudojamo tirpiklio, temperatūros, ekstrakcijos laiko, pH, mėginio fizikocheminių
charakteristikų, auglinės žaliavos kaupiamų aktyvių junginių.Dažniausiai naudojami fenolinių junginių ekstrakcijai iš augalinės vaistinės žaliavos tokie tirpikliai kaip metanolis, etanolis, acetonas, etilo acetatas ir jų kombinacijos, mišiniai šių tirpiklių su vandeniu. Svarbu yra tinkamai parinkti tirpiklį, nes nuo to priklauso išekstrahuojamų junginių kiekis [11]. Augalinių žaliavų ekstrakcijai galima naudoti superkritinius skysčius, ultragarsą, mikrobangas, suslėgtus skysčius, Soksleto aparatą ir maceraciją, pastarieji du metodai yra tradiciniai ir ankščiau dažnai naudojami, tačiau mažai
efektyvūs [3, 34].
Dėl didelės fenolinių junginių įvairovės analizė yra laikoma gana sudėtinga, bet naudojami modernūs skirstymo ir nustatymo metodai tinka polifenoliniams junginiams ir taip palengvina vaistinės augalinės žaliavos analizę. Populiariausi ir dažniausiai naudojami metodai yra
efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC), dujų chromatografija (DC), efektyvioji skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija (ESC-MS), taip pat spektrofotometrija, plonasluoksne chromatografija. Taip pat galima taikyti kapiliarinę elektroforezę ir kapiliarinę zonų elektroforezę. Naudojami Folin – Denis, Folin – Ciocalteu (FC), vanilino, reakcija su 2, 4 – dinitrofenilhidrazinu (DNPH) spektrometriniai metodai, kolorimetrija su geležies druskomis ir UV absorbcija [17, 32].
1.6.1. Spektrofotometrinis metodas
Spektrofotometrinis metodas tai vienas iš paprasčiausių kiekybiniam įvertinimui taikomų metodų. Spektrofotometriniu metodu nustatant fenolinių junginių kiekį augalinių žaliavų ėminiuose gali būti taikomas fenolinių junginių komplekso sudarymas šarminiame tirpale su molibdenu ar volframo fosforo rūgštimis (Folin – Denis ar Folin – Ciocalteu fenoliniu reagentu). Folin – Ciocalteu yra plačiai taikomas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodas. Šios reakcijos metu Folin – Ciocalteu reagento spalva kinta nuo geltonos iki mėlynos. Gautų ekstraktų absorbcija matuojama UV spektrofotometru, esant 760 nm bangos ilgiui. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas pagal galo rūgšties ekvivalentą. Šis metodas nėra specifiškas fenolinių junginių atskirų klasių
identifikavimui. Augalinėje žaliavoje yra kitų redukuojančių medžiagų: askorbo rugšties, aromatinių aminų, cukrų, kurie trukdo analizei [23, 56, 63].
Kitas spektrofotometrinis metodas – tai reakcija su aliuminio (III) chloridu. Šis
spektrofotometrinis metodas tinkamas panašios struktūros flavonoidų rutininei analizei atlikti. Metodas pagrįstas flavonoido ir aliuminio komplekso susidarymu rūgštinėje terpėje. Absorbcija matuojama esant 410 – 423 nm, nes tada absorbcija yra didžiausia. Analizei svarbūs tokie faktoriai: reakcijos laikas, cheminė polifenolių struktūra, reagentų kiekis [35, 56].
Dar vienas spalvinis metodas – tai reakcija su 2, 4 – dinitrofenilhidrazinu (DNPH). Metodas pagrįstas raudonos spalvos 2, 4 - dinitrofenilhidrazono junginių susidarymu, kai DNPH reagentas reaguoja su ketoninėmis ar aldehidinėmis grupėmis. Reakcija vykdoma 50 °C temperatūroje 50 minučių vandens vonelėje. Tirpalui atvėsus iki kambario temperatūros, matuojama absorbcija 486 nm šviesos bangos ilgyje. Flavonoidų kiekis apskaičiuojamas sudarant standartinę kreivę [19].
1.6.2. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija – metodas tinkamas tiek kiekybinei tiek kokybinei fenolinių junginių analizei. Analizė efektyvi, kolonėlių pasirinkimas yra didelis, padidinta skiriamoji geba. Naturalios kilmės fenoliniai junginiai tirpsta poliniuose tirpikliuose, dėl to susidaro galimybės naudoti atvirkštinių fazių ESC sorbentus, reikalingos rūgštinės sąlygos, siekiant išvengti jonizuotų bandinio formų susidarymo ir taip leidžiant gauti ryškesnes smailes, dažniausiai naudojamoC8 ar C18 kolonėlės. Gradientiniam eliuavimui naudojamos dviejų tirpiklių sistemos:
acetonitrilas (ACN) ar metanolis arba jų vandeniniai tirpalai. Kartais naudojami ir kiti tirpikliai, tokie kaip tetrahidrofuranas, izopropanolis, n-propanolis.Efektyvioji skysčių chromatografija
atliekama palaikant pastovią temperatūrą. Taip garantuojamas atkuriamumas analizę atliekant ilgai. ESC analizę galima atlikti kambario temperatūroje, tačiau rekomenduojama kolonėlėje palaikyti apie 30°C – 40°C temperatūrą, tuomet sutrumpinamas analizės laikas [1, 46].
1.7. Laisvieji radikalai, antioksidantai
Laisvieji radikalai – tai molekulės, turinčios neporinį elektroną išorinėje orbitoje, kurios yra nestabilios ir labai reaktyvios. Veikia laisvieji radikalai toje vietoje kur susiformuoja. Jie dažniausiai formuojasikaip metabolizmo produktas įprastų organizmo funkcijų ir reakcijų metu arba veikiant egzogeniniams veiksniams tokiems kaip - rūkymas, ore esantys teršalai, rentgeno spinduliai, ozonas ir dėl fiziologinių veiksnių tokių kaip stresas. Ląstelei normaliai funkcionuoti nedidelė jų
koncentracija reikalinga, tačiau dideli jų kiekiai gali pažeisti ląstelių lipidus, angliavandenius, baltymus ir DNR ir taip slopinti jų normalias funkcijas. Organizmui nespėjant slopinti laisvųjų radikalų reakcijų gali didėti žalojantis poveikis, kuris susijęs su žmogaus organizmo funkcijų sutrikimu ir ligomis: širdies-kraujagyslių sistemos ligos, neurodegeneracinės ligos, odos ligos, autoimuninės ligos, kvėpavimo takų funkcijos pablogėjimas ar ligos [2, 28, 55].
Organizmas, norėdamas apsisaugoti gamina medžiagas, galinčias stabilizuoti arba
deaktyvuoti laisvuosius radikalus – endogeninius antioksidantus. Taip pat galimi ir egzogeniniai antioksidantai, kurie gaunami kartu su maistu ar papildais. Nutraukdami grandininę laisvųjų radikalų susidarymo reakciją antioksidantai kovoja su oksidaciniu stresu, nes stiprus oksidacinis stresas sukelia ląstelės mirtį. Tyrimais įrodyta kad padidėjus oksidaciniam stresui pagreitėja ląstelių senėjimas. Oksidacinį stresą galima kontroliuoti mažinant laisvųjų radikalų kiekį optimalia antioksidantų koncentracija [36].
Antioksidantai – tai medžiagos, kurios geba neutralizuoti laisvuosius radikalusir mažina jų sukeliamą žalingą poveikį. Jie skirstomi į fermentinius ir nefermentinius antioksidantus. Vieni fermentiniai antioksidantai yra normalios organizmo medžiagų apykaitos produktai: superoksido dismutazė, glutationo reduktazė, katalazė. Kiti tokie kaip α-Tokoferolis (vitaminas E), askorbo rūgštis (vitaminas C), B-karotenas gaunami su maistu. Nefermentiniai antioksidantai yra karotenoidai, flavonoidai, kiti polifenoliniai junginiai, α-lipoinė rūgštis glutationas ir t.t. [8].
Antioksidantai dar gali būti klasifikuojami ir į sintetinius ir natūralius. Sintetiniai
antioksidantai naudojami maisto pramonėje siekiant prailginti maisto galiojimo terminą, tam kad produktas ilgenį laiką išliktu šviežus, tačiau buvo nustatyta, kad dėl toksinio poveikio žmogaus organizmui, sintetinių antioksidantų vartojimas turi būti ribojamas, todėl kur kas geresnė ir saugesnė žmogaus organizmui alternatyva naturalūs antioksidantai, kurių gausu vaistiniuose augaluose. Norint išvengti laisvųjų radikalų sukeliamų lėtinių susirgimų bei apsaugoti nuo oksidacinio streso, būtina organizmą aprūpinti antioksidantais. Flavonoidai – gausiai aptinkami augaluose, dėl savo cheminės struktūros veikia kaip stiprūs antioksidantai. Jie didina antioksidantinį aktyvumą kraujo serume, o taip pat gali didinti ir kai kurių antioksidantų, tokių kaip vitamino E, vitamino C, koncentraciją organizme, taigi didėja ir antioksidantinis aktyvumas [26, 28].
Natūraliųantioksidantų moksliniai tyrimai vykdomi vis aktyviau. Antioksidantų gebėjimas neutralizuoti reaktyvias deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formas, taip apsaugant biologines sistemas ir yra antioksidantinis aktyvumas. Norint nustatyti antioksidacinį aktyumą augaluose ar maisto produktuose, svarbus tinkamo tyrimo metodo pasirinkimas. Nuo metodo pasirinkimo priklausys rezultatų patikimumas.
Antioksidantai laisvuosius radikalus veikia dviem mechanizmais [21, 42]: 1) Vandenilio perdavimo reakcijomis (HAT)
AH + X• → XH + A•
2) Elektronų perdavimo reakcijomis (ET) X• + AH → X– + AH•+
AH•+ + H2O ↔ A• + H3O+ X– + H3O+ → XH + H2O M(III) + AH → AH+ + M(II)
Pagal antioksidacinio poveikio mechanizmą metodai skirstomi į dvi grupes: metodai pagrįsti HAT tipo reakcijomis (ORAC, TRAP) ir metodai pagrįsti ET tipo reakcijomis (TEAC, DPPH, FRAP, CUPRAC).
Vandenilio perdavimo (HAT) reakcijų metu vyksta konkurencinės reakcijos tarp antioksidanto ir substrato. Vandenilio atomas perduodamas laisvajam radikalui, kuris neutralizuojamas ir tampa stabilus. ORAC - deguonies radikalų absorbcinė geba. Jo metu antioksidantas absorbuoja deguonies radikalą, taip yra nutraukiama deguonies radikalų sukelta oksidacija, nes prie radikalo prijungiamas vandenilio atomas. Išmatuojant fluorescencijos pokytį yra vertinamas reakcijos greitis ir antioksidacinis aktyvumas. Kitas HAT reakcijomis pagrįstas metodas – TRAP. Tai antioksidanto sugaudytų radikalų suma, metodo metu nustatinėjama antioksidantų reakcijos kinetika. Pagal kinetines kreives apskaičiuojamas antioksidantinis aktyvumas [12, 42].
Elektronų perdavimo (ET) reakcijomis nustatomas antioksidanto gebėjimas prisijungti nesuporuotą laisvojo radikalo elektroną.Metodo principas oksidanto redukavimas iki kitokios spalvos junginio [41].
Prie ET grupės priskiriami metodai: ABTS arba kitaipTEAC Trolokso ekvivalento
antioksidantinės gebos laisvųjų radikalų surišimo metodas – paprastas ir patogus metodas bendram antioksidaciniam aktyvumui nustatyti, šiuo metodu nustatomas antioksidanto gebėjimas blukinti 2,2´-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalo (ABTS˙+) spalvą. Reakcijos metu mėlynai žalios spalvos chromogeninis reagentas praranda savo spalvos intensyvumą [10].DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas – pagrįstas antioksidanto ar bet kurios kitos molekulės, turinčios
silpną vandenilinę jungtį, reakcija su organiniu azoto DPPH radikalu. Tai metodas kuriuo
įvertinamas antioksidanto gebėjimas blukinti 2,2-difenil-1- pikrilhidrazilo radikalo (DFPH˙) spalvą [51 ]. FRAP - ( geležies antioksidacinė redukcijos galia) šis metodas įvertina antioksidantų gebėjimą redukuotis iš juodos spalvos geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino (Fe(III)-TPTZ) komplekso į
intensyviai mėlynos spalvos (Fe(II)-TPTZ) kompleksą, jis atliekamas rūgštinėje terpėje esant pH 3,6. Ir vario jonų redukcijos antioksidantinės galios tyrimas (CUPRAC) [41].
1.9. CUPRAC metodo pritaikymas antioksidacinio aktyvumo nustatymui
CUPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodas pagrįstas redukcija antioksidantu dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) komplekso į chromogeninį Cu(I)-Nc kompleksą.Metodo metu redukuojamas dvivalentis varis (Cu (II)) į
vienvalentį (Cu (I)).Vyksta redukcija antioksidantu į geltonai I oranžinės spalvos junginį. CUPRAC reagentą sudaro vienodomis dalimis sumaišyti CuCl2, neokuproino ir buferio amonio acetato tirpalai, procesas vyksta neutralioje terpėje (pH 7,0). Absorbcija matuojama prie 450 nm bangos ilgio. Pagrindinis šio metodo trūkumas tai, kad reakcija tarp CUPRAC reagento ir antioksidantų tokių, kaip askorbo, šlapimo ir galo rūgštis bei kvercetinas, įvyksta per vieną minutę, o
kompleksinių mišinių reakcija vyksta per 30–60 min., iki tol kol pasiekiama pusiausvyra. Kitą vertus jis yra stabilesnis ir prieinamesnis nei kiti reagentai (pavyzdžiui: ABTS, DPPH). CUPRAC reagento neveikia oras, saulės spinduliai, tirpiklio tipas ir pH. Šis redukcinės galios nustatymo metodas yra paprastas, nebrangus ir sudėtingos aparatūros nereikalaujantis metodas [21, 42].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tirta natūraliose augimvietėse auganti – siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) žolė, rinkta žydėjimo metu įvairiuose Lietuvos miestuose ir kaimuose 2016 metų birželio – liepos mėnesiais. Žaliavos rinkimo vietos: Pakruojis, Šaukotas, Giruliai, Prienai, Radviliškis, Plateliai, Pašušvys. Augalinės žaliavos rinkimo vietos pateiktos paveiksle:
3 Pav. Siauralapio gauromečio rinkimo vietos
2.2. Naudoti reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”), metanolis 99,8% (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), rutino reagentas (97,11%, “HWI ANALYTIK GMBH”), etanolis 96% (Vilniaus degtinė), išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV). CUPRAC reagentui sudaryti buvo naudojamas vario (II) chlorido dihidratas, gautas iš „Alfa Aesar GmbH & Co KG“
(Karlsruhe, Vokietija), neokuproinas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija). Buferinei sistemai sudaryti buvo naudojamas amonio acetatas, įsigytas iš „Sigma -Aldrich“ (Belgija). Buvo naudotas trolokso (98%) referentinis standartas, įsigytas iš „FlukaChemika“ (Buchs, Šveicarija).
2.3. Naudota aparatūra
1. Ekstraktai gaminami ultragarso vonelėje (WiseClean); 2. Vandensgryninimosistema Millipore (Bedford, MA);
3. Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija);
4. Analitinėssvarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija);
5. Automatinėspipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);
6. Chromatografas Waters 2690/5 (Waters Corporation, Milford, 23 JAV); 7. YMC kolonėlė 150×4,6 mm, 3 μm (YMC Europe GmbH, Vokietija);
2.4. Siauralapių gauromečių ekstraktų paruošimas
Siauralapis gaurometis džiovintas kambario temperatūroje, apsaugotoje vietoje nuo
tiesioginių saulės spindulių. Sausa žaliava susmulkinta elektriniu malunėliu, atsverta 0,5 g. augalinės žaliavos ir užpilta 10 ml 70 proc. etanolio, laikoma ultragarso vonelėje 30 min.
2.5. Tyrimo metodikos
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas. Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto
galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu. Tyriamieji tirpalai ruošiami: 1 ml augalinės žaliavos etanolinio ekstrakto, sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7% natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25 ml. Sumaišoma ir paliekama stovėti 90 min. tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po 90 min spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija 760 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai kartojami tris kartus. Lyginamasis tirpalas ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamasis tirpalas, bet vietoje 1 ml ekstrakto yra pilama 1 ml 70 % (v/v) etanolio [63].Galo rūgšties kalibracinė
kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regresijos lygtis (y), kur y absorbcijos dydis,o x bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml pavaizduoti paveiksle.
4pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė
Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu.
CUPRAC metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į chromogeninį vienvalenčio vario ir neokuproino kompleksą [42].CUPRAC reagentas ruošiamas sumaišant vario druską (CuCl2x2H2O), 7,5 % neokuproino ir 1 M amonio acetato (pH= 7) buferio
tirpalus lygiomis dalimis. Sumaišytas tirpalas 1 valandą buvo laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Į kiuvetę įpilama 3 ml sumaišyto reagento tirpalo ir automatinėmis pipetėmis įpilama 10 µl tiriamojo ekstrakto mėginio. Spektrofotometru matuojamas tiriamųjų mėginių šviesos absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Lyginimasis tirpalas ruošiamas tokiomis pačiomis sąlygomis, tik vietoje 10 µl tiriamojo ekstrakto dedama 10 µl 70 % (v/v) etanolio.Redukcinis aktyvumas vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono trolokso kalibracinę kreivę. Trolokso kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regresijos lygtis (y) pateikti žemiau esančiame paveikslėlyje (5 pav.)
5 pav. Trolokso kalibracinė kreivė CUPRAC metodu
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Polifenolinių junginių chromatografiniui
skirstymui siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje buvo naudojama M.Marksos ir kt. optimizuota ir validuota ESC skirstymo metodika skirta fenolinių junginių identifikavimui ir
kiekybiniai analizei atlikti augalinės žaliavos ekstraktuose [38].Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant "Waters Alliance 2695" ("Waters", Milfordas, JAV) atskyrimo modulinė sistema, turinti Waters 996 PDA diodų-matricos detektorius. YMC-Pack ODS-A (3.0 μm, 150 mm × 4.6 mm i.d.) kolonėlė su YMC apsaugine kasete ODS-A (3.0 μ m, 10 mm × 4.0 mm). Injekcijos tūris – 10 µl, mobiliosios fazės greitis – 1,0 ml/min, temperatūra 25 ◦C. Tyrimo metu naudota mobiliosios fazės gradientinė sistema, sudaryta iš tirpalo A - 0,05% trifluoracto rūgštis vandenyje ir tirpalo B acetonitrilo. Junginių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių juginių sulaikymo laikų bei UV absorbcijos spektrų 210 – 550 nm intervalo ribose atitikimus.
2.6. Statistinė duomenų analizė
Gautų duomenų analizė atlikta „Microsof Office Excel 2015” (Microsoft, JAV), „SPSS 20“ (IBM, JAV) programinėmis įrangomis, taip pat duomenų apdorojimui naudota „ Empower 2
Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, suvesti į duomenų bazę, statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį (SN), standartinį santykinį nuokrypį (SSN). Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrahento parinkimas. Norint nustatyti tinkamiausią ekstrahentą ir jo koncentraciją buvo
atliktas tirpiklių pasirinkimas, naudotas metanolis ir etanolis 70 proc., atsverta 0,5g augalinės siauralapių gauromečių žaliavos. Analizuoti 3 pagrindiniai junginiai, nustatyti ESC metodu: neochlorogenas, hiperozidas, izokvercitrinas.
6 pav. Ekstrahento parinkimas
Tyrimų eigoje nustatyta, kad ekstrahuojant siauralapio gauromečio žaliavą etanoliu atsipalaiduoja daugiau analizuotų tiriamųjų junginių, nei ekstrahuojant metanoliu. Pasirinkta metodika tolimesniems tyrimams yra: 0,5 g augalinės žaliavos užpilama 10ml 70 proc. etanolio, gautas ekstraktas laikomas ultragarso vonelėje 30 min.
30.464 48.929 50.043 30.058 38.729 38.527 0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000
Neochlorogenas Hiperozidas Izokvercitrinas
Ko n ce n tr ac ija m µ g/ g Etanolis % Metanolis %
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu su
Folin – Ciocalteu reagentu
Spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami naudojant etanolinius (70%) siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktus. Tiriant ekstraktus buvo nustatytas bendras fenolinių junginių įvairavimas augalinėje žaliavoje.
Tyrime analizuota iš septynių skirtingų Lietuvos vietų surinkta siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) augalinė žaliava, bandymai pakartoti tris kartus (n=3). Buvo statistiškai įvertintas rezultatų reikšmingumas tarpusavyje. Statistiškai reikšmingas skirtumas buvo laikomas, kai p<0,05. Gauti rezultatai pateikiami 7 - 10 paveiksluose.
3.2.1.Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių augalinės žaliavos ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas siauralapių gauromečių augalinės žaliavos etanoliniuose ekstraktuose. Tyrimo rezultatai pateikti 7 pav. Didžiausias fenolinių junginių kiekis visoje žaliavoje nustatytas Plateliuose 82,229± 0,16 mg/g. Mažesnis kiekis nustatytas – Pašušvyje 66,404± 0,22 mg/g. Tarp Radviliškyje, Šaukote, Prienuose ir Giruliuose rinktos augalinės žaliavos gautų rezultatų yra nedidelis fenolinių junginių kiekio skirtumas. Mažiausi rezultatai nustatyti Pakruojyje 49,697± 0,16 mg/g augusiame siauralapyje gaurometyje. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad žaliavose iš skirtingų augaviečių fenolinių junginių kiekių skirtumai yra statistiškai nereikškingi, p>0,05.
7 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) visoje augalinėje žaliavoje, taikant spektrofotometrinį Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.2.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Pagal gautus rezultatus išreikštus galo rūgšties ekvivalentu ir iš jų sudarytą diagramą nustatyta, kad didžiausia fenolinių junginių gausa lapuose pasižymi siauralapio gauromečio augalinė žaliava surinkta Plateliuose 94,139 ±0,22mg/g. Mažiausiai fenolinių junginių siauralapio gauromečio lapų ekstrakte nustatyta Pakruojyje 53,391 ±0,28 mg/g. Nors bendras fenolinių junginių kiekis tarp augalinės lapų žaliavos rintos Plateliuose ir rinktos Pakruojyje skiriasi beveik du kartus, bet statistiškai šis skirtumas nėra reikšmingas, p>0,05.
49.697 57.085 54.880 56.534 59.236 82.229 66.404 0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000 80.000 90.000 100.000
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Fen o lin ių ju n gi n ių ki e ki s G R E m g/ g
8 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapuose, taikant spektrofotometrinį Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.2.3. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su siauralapių gauromečių visa augaline žaliava ir lapų ekstraktais gauti panašūs fenolinių junginių kiekiai. Rezultatai pavaizduoti 8 paveiksle. Ryškiausias skirtumas matomas tarp Radviliškyje surinktų augalinių žaliavų. Lapuose nustatyta 89,259 ± 0,03 mg/g fenolinių junginių, o visoje augalinėje žaliavoje 59,236± 0,55 mg/g. Kituose regionuose nustatyti panašūs fenolinių junginių kiekiai, kurie svyruoja nuo 49,697 GRE mg/g iki 941,387 GRE mg/g. Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad siauralapio gauromečio augalinė žaliava yra vertinga fenolinių junginių išgavimui. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių, p>0,05. 53.391 70.429 72.497 62.268 89.259 94.139 76.908 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Fen o lin ių ju n gi n ių ki e ki s GR E m g/ g
9 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub.) lapuose ir visoje augalinėje žaliavoje, taikant spektrofotometrinį Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.2.4. Suminis fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapio gauromečio lapuose ir visoje augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu
Įvertinus bendrą fenolinių junginių kiekį mg/g visoje augalinėje žaliavoje ir lapuose
nustatyta, kad siauralapio gauromečio lapai kaupia didesnį fenolinių junginių kiekį – 518,8901 GRE mg/g, o visoje augalinėje žaliavoje 426,064 GRE mg/g. Rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle.
49.697 57.085 54.880 56.534 59.236 82.229 66.404 53.391 70.429 72.497 62.268 89.259 94.139 76.908 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Fen o lin ių ju n gi n ių ki e ki s GR E m g/ g
10 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių(Chamerion angustifolium (L.) Holub.) visoje augalinėje žaliavoje ir lapuose, taikant spektrofotometrinį
Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu CUPRAC
metodu
Tyrimo metu buvo nustatynėjamas skirtingose Lietuvos vietose rinktų siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapų ir visos augalinės žaliavos etanolinių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Įvertinta antioksidantinio aktyvumo priklausomybė nuo augimo vietos.
3.3.1. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos antioksidantinis vertinimas
Buvo tirtas ir įvertintas siauralapių gauromečių iš visos augalinės žaliavos pagamintų
ekstraktų antioksidacinis aktyvumas CUPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodu. Duomenys pateikti žemiau esančiame paveikslėlyje (11 pav.). Didžiausiu redukciniu aktyvumu pasižymėjo visos augalinės žaliavos ekstraktai surinkti Plateliuose 6,584 ± 0,06 mg/g, tai 1,78 karto didesnis aktyvumas už Pakruojyje surinktas žaliavas, kurių antioksidantinė geba buvo mažiausia 3,686 ± 0,01 mg/g. Iš pateiktų duomenų matome, kad Plateliuose surinkta siauralapio gauromečio lapų žaliava pasižymėjo didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu, lyginant su kitomis tirtomis Lietuvos vietovėmis. 426.064 518.891 0.000 100.000 200.000 300.000 400.000 500.000 600.000
Visa augalinė žaliava Lapų augalinė žaliava
K o n ce n tr ac ija GR E m g/ g
11 pav. Skirtingose vietovėse surinktos siauralapio gauromečio augalinės žaliavos ekstraktų antioksidacinis aktyvumas
3.3.2. Siauralapių gauromečių lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas
Atlikus tyrimus su siauralapių gauromečių lapų etanoliniais ekstraktais, nustatytas jų redukcinis aktyvumas septyniose Lietuvos vietovėse. Kiekvienos vietovės siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapų augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas buvo nustatytas UV spektrofotometriniu CUPRAC metodu ir apskaičiavus šių mėginių vidurkį, nustatytos vidutinės antioksidantinės reikšmės, kurios svyravo nuo 4,417 ± 0,08 mg/g iki 9,033 ± 0,01 mg/g. Lapų ekstraktai, pasižymėję didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu 9,033 ± 0,01 mg/g ir 8,738 ± 0,06 mg/g, buvo surinkti Plateliuose ir Radviliškyje. Mažesniu antioksidantiniu aktyvumu 6,84 ± 0,21 mg/g; 6,109 ± 0,23 mg/g ir 5,558 ± 0,06 mg/g pasižymėję augalai buvo surinkti Pašušvyje, Giruliuose bei Šaukote. Mažiausias siauralapio gauromečio lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas 4,878± 0,23 mg/g ir 4,417± 0,08 mg/g nustatytas Prienuose ir Pakruojyje.
3.686 4.109 3.993 3.904 5.032 6.584 5.173 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
K o n ce n tr ac ija m g/ g
12 pav. Skirtingose vietovėse surinktos siauralapio gauromečio lapų augalinės žaliavos ekstraktų antioksidacinis aktyvumas.
3.3.3. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas
13 paveiksle pateikti duomenys apie Chamerion angustifolium (L.) Holub lapų ir visos augalinės žaliavos etanolinių ekstraktų antioksidantinį kiekį žaliavoje mg/g. Norint nustatyti antioksidantų kiekį augalo lapuose ir palyginti su visa augaline žaliava, tyrimams buvo paimti Lietuvoje augantys siauralapiai gauromečiai iš skirtingų augaviečių. Tyrimais nustatyta, kad siauralapių gauromečių lapų ir visos augalinės žaliavos etanolinių ekstraktų antioksidantiniai kiekiai žaliavose surinktose skirtingose augavietėse skyrėsi. Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse. Rezultatai svyravo nuo 4,417 ± 0,08 mg/g iki 9,033 ± 0,01 mg/g. Tuo tarpu visos augalinės žaliavos ekstraktuose buvo aptikta nuo3,686 ± 0,01 mg/g iki 6,584 ± 0,06 mg/g.
Iš pateiktų duomenų galime spręsti, kad didesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo Chamerion angustifolium (L.) Holub lapai visose tirtose augavietėse. Plateliuose rinktos augalinės žaliavos antioksidantinis kiekis buvo didžiausias ir lapuose ir visoje augalinėje žaliavoje, o
mažiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas Pakruojyje rinkoje visoje augalinė žaliavoje ir
4.417 5.558 6.109 4.878 8.738 9.033 6.84 0 2 4 6 8 10 12
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
K o n ce n tr ac ija m g/ g Vietovės
lapuose. Atlikus statistinį duomenų apdorojimą, statistiškai reikšmingi skirtumai nėra nustatyti p>0,05.
13 pav. Skirtingose vietovėse surinktos siauralapio gauromečio lapų ir viso augalo žaliavos antioksidacinis aktyvumas
3.3.4. Suminis siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas
Įvertinus suminį anioksidantinį aktyvumą mg/g visoje augalinėje žaliavoje ir lapuose
nustatyta, kad siauralapių gauromečių lapų antioksidantinis aktyvumas didesnis, nei visos augalinės žaliavos. Lapuose 45,573 mg/g, o visoje augalinėje žaliavoje 32,481 mg/g. Iš pateiktų duomenų galime spręsti, kad didesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėję Chamerion angustifolium (L.) Holub lapai yra vertingesni kaip antioksidantų šaltinis, nei visa augalinė žaliava. Rezultatai pateikti 14 paveikslėlyje. 3.686 4.109 3.993 3.904 5.032 6.584 5.173 4.417 5.558 6.109 4.878 8.738 9.033 6.84 0 2 4 6 8 10 12
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
K o n ce n tr ac ija m g/ g
14 pav. Suminis antioksidantinis aktyvumas siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje ir lapuose
3.4. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo analizuota gauromečio išdžiovinta augalinė žaliava, bei fermentuota gauromečio arbata. Šiuo būdu analizuoti fenoliniai junginiai: dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, kvercetinas.
3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Norint taikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą šiame darbe tiriamųjų
siauralapių gauromečių ekstraktų nustatymui, būtina įrodyti metodikos tinkamumą. ESC metodikos validacija vertinama pagal šiuos parametrus:
• specifiškumą; 32.481 45.573 0 10 20 30 40 50 60
Visa augalinė žaliava Lapų augalinė žaliava
K o n ce n tr ac ija m g/ g
• rezultatų glaudumą – rezultatų pakartojamumas ir rezultatų tarpinis preciziškumas;
• tiesiškumą;
• aptikimo ir nustatymo ribas;
Metodo validacija atliekama remiantis ICH (angl. International ConferenceonHarmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis [15].
3.5.1. Specifiškumas
Vertinant metodo specifiškumą buvo lyginamos analizuojamų tirpalų ir standartinių tirpalų chromatogramos ir smailių sulaikymo laikai.
Lyginant siauralapių gauromečių ir standartinių junginių sulaikymo laikus, nustatyta, kad spektriniai duomenys ir sulaikymo laikas sutampa.
3.5.2. Glaudumas
Glaudumas nustatomas vertinant metodikos pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą. Pakartojamumas rodo tyrimo tikslumą tomis pačiomis sąlygomis per trumpą laiko tarpą, dirbant su tuo pačia įranga, tą pačią dieną. Pakartojamumas įrodomas nustatytomis sąlygomis atliekant kelis to pačio mėginio matavimus ir apskaičiavus santykinį standartinį nuokrypį (SSN) (1 lentelė).
1 lentelė. Metodikos rezultatų pakartojamumas
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis
(SSN) % Dihidrobenzoinė rūgštis 0,8 Neochlorogenas 0,5 Chlorogeno rūgštis 0,8 Hiperozidas 2,4 Izokvercitrinas 0,9 Kvercitrinas 1,8 Kvercetinas 0,6
Pagal gautus rezultatus matome, kad santykinis standartinis nuokrypis junginių yra skirtingas, tačiau ne didesnis nei 5%. Galima teigti, kad rezultatų pakartojamumas atitinka reikalavimus ir remiantis šiuo kriterijumi, metodas yra tinkamas kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui.
Tarpinis preciziškumas yra įrodomas nustatytomis sąlygomis naudojant tą patį mėginį ir atliekant analizę dvi dienas iš eilės, tiriamos vienodos tirpalų injekcijos (2 lentelė).
2 lentelė. Metodikos rezultatų tarpinio preciziškumo įvertinimas
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis
(SSN) % Dihidrobenzoinė rūgštis 1,0 Neochlorogenas 0,6 Chlorogeno rūgštis 1,1 Hiperozidas 3,0 Izokvercetinas 1,3 Kvercitrinas 2,3 Kvercetinas 0,8
Įvertinus tarpinio preciziškumo gautus santykinio standartinio nuokrypio rezultatus galima teigti, kad metodas atitinka glaudumo reikalavimus ir yra tinkamas kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui.
3.5.3. Tiesiškumas
Metodo tiesiškumui įrodyti yra sudaromas gradavimo grafikas, kuriam naudojami
standartiniai tirpalai. Gaunama kalibracinė kreivė, kuri įrodo, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška.
Tiesiškumą taip pat įrodo koreliacijos koeficientas (𝑅2), jis privalo būti kuo artimesnis vienetui. Analizuojamų tiriamųjų tirpalų gradavimo grafikų koreliacijos koeficientai 𝑅2= 0.999 (3 lentelė).
Junginys Kalibracinės kreivės lygtis
Koreliacijos
koeficientas 𝑹𝟐
Dihidrobenzoinė rūgštis Y=3.59*107x+1.11*104 0,999
Neochlorogenas Y=2.43*107x-8.96*103 0,999
Chlorogeno rūgštis Y=4.26*107x+1.4*104 0,999
Hiperozidas Y=2.05*107x+1.24*104 0,999
Izokvercetinas Y=6.42*107x+1.13*103 0,999
Kvercitrinas Y=2.02*107x+1.41*104 0,999
Kvercetinas Y=3.45*107x+4.67*104 0,999
Remiantis šiuo rodikliu galima teigti, kad metodas atitinka tiesiškumo parametrus.
3.5.4. Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba yra apibūdinama kaip mažiausias medžiagos kiekis, kuris yra aptinkamas mėginyje, o nustatymo riba – mažiausias medžiagos kiekis, kuris gali būti kiekybiškai įvertintas. ESC metodo validacijos metu nustatytos tiriamųjų junginių aptikimo ir nustatymo ribos pateikiamos 4 lentelėje.
4 lentelė. Tiriamųjų junginių aptikimo ir nustatymo ribos.
Junginys Aptikimo riba µg/ml Nustatymo riba µg/ml
Dihidrobenzoinė rūgštis 0.6 1.0 Neochlorogenas 1.9 3.0 Chlorogeno rūgštis 0.3 1.0 Hiperozidas 0.3 1.0 Izokvercetinas 0.1 0.4 Kvercitrinas 0.3 0.9 Kvercetinas 0.2 1.0
Pagal gautus rezultatus matoma, kad tiriamųjų junginių aptikimo ir nustatymo ribos yra skirtingos. Didžiausios aptikimo ir nustatymo ribos yra neochlorogeno, mažiausios – izokvercetino.
Įvertinus visus pasirinktus metodo validacijos kriterijus ir remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad ESC metodika yra tinkama dihidrobenzoinės rūgšties, neochlorogeno, chlorogeno rūgšties, hiperozido, izokvercetino, kvercitrino ir kvercetino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui. Validuota ESC metodika bus taikoma šių junginių kiekybiniam nustatymui.
3.5. Siauralapio gauromečio fermentuotos arbatos ir visos žaliavos fenolinių
junginių kiekybinis įvertinimas ESC metodu
Siauralapio gauromečio fermentuotoje arbatoje ir augalinėje žaliavoje fenolinių junginių kiekybinė analizė buvo atlikta naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Rezultatai pateikti 15 paveikslėlyje. Buvo identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti fermentuotos arbatos ir augalinės žaliavos fenoliniai junginiai, kurie kaip matyti iš pateikto paveikslėlio ryškiai skiriasi.
Fermentuotoje gauromečio arbatoje nustatytas didžiausias kiekis izokvercitrino, o augalinėje gauromečio žaliavoje neochlorogeno junginio.
Didžiausias kiekis izokvercitrino 52,039 mg/g buvo nustatytas fermentuotoje siauralapio gauromečio arbatoje, kai gauromečio žaliavoje jo kiekis tesiekė 4,8 mg/g. Tačiau gauromečio žaliavoje buvo identifikuotas didelis kiekis 27,118 mg/g neochlorogeno, palyginus su fermentuotoje arbatoje gautu rezultatu 1,104 mg/g. Visų identifikuotų fenolinių junginių kiekiai buvo didesnis fermentuotoje gauromečio arbatoje, lyginant su siauralapio gauromečio augaline žaliava, išskyrus chlorogeno rūgštį, jos fermentuotoje arbatoje buvo 0,469 mg/g, o augalinėje žaliavoje 1,204 mg/g. Siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje nebuvo aptikta dihidro benzoinės rūgšties.
Apibendrinus gautus tyrimų rezultatus galima daryti prielaidą, kad fermentuota siauralapio gauromečio arbata yra vertingesnė fenolinių junginių kiekiu, nei augalinė siauralapio gauromečio žaliava, joje ypač gausu flavonoido izokvercitrino.
15 pav. Fenolinių junginių kiekybinis vertinimas fermentuotoje gauromečio arbatoje ir gauromečio žaliavoje, naudojant ESC metodą
3.6. Tyrimo rezultatų apibendrinimas
Tyrimui naudota augalinė žaliava buvo surinkta 2016 metais iš natūralių siauralapio gauromečio augimo vietų. Visi tyrimo mėginiai rinkti žydėjimo periodo metu. Buvo nustatytas geriausias augalinės žaliavos ekstrahentas – 70 % (v/v) etanolis.
Suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje ir jo lapuose, surinktose iš septynių skirtingų augaviečių. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu, Plateliuose 94,139 ± 0,22 mg/g lapų augalinėje žaliavoje.
Siauralapių gauromečių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas spektrofoto-metriniu CUPRAC metodu. Didžiausia redukcine geba pasižymėjo Plateliuose augusios siauralapių gauromečių žaliavos 9,033 ± 0,01 mg/g. Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse.
0.847 1.104 0.469 4.925 52.039 0.781 0.281 0.000 27.118 1.204 3.530 4.800 0.268 0.085 0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 K o n ce n tr ac ija m g/ g Fenoliniai junginiai
Buvo parinktos geriausios sąlygos ESC analizei atlikti ir nustatyti siauralapių gauromečių augalinės žaliavos ir fermentuotos arbatos ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai: dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, kvercetinas. Didžiausias kiekis izokvercitrino 52,039 mg/g buvo nustatytas fermentuotoje siauralapio gauromečio arbatoje, kai gauromečio žaliavoje jo kiekis tesiekė 4,8 mg/g. Tačiau gauromečio žaliavoje buvo identifikuotas didelis kiekis 27,118 mg/g neochlorogeno, palyginus su fermentuotoje arbatoje gautu rezultatu 1,104 mg/g. Visų identifikuotų fenolinių junginių kiekiai buvo didesnis fermentuotoje gauromečio arbatoje, lyginant su siauralapio gauromečio augaline žaliava, išskyrus chlorogeno rūgštį, jos fermentuotoje arbatoje buvo 0,469 mg/g, o augalinėje
žaliavoje 1,204 mg/g. Siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje nebuvo aptikta dihidro benzoinės rūgšties.
Šiame darbe pateiktų rezultatų negalime lyginti su kitų autorių moksliniais darbais, kadangi nebuvo rasta tyrimų atliktų atitinkamomis sąlygomis bei metodais.
IŠVADOS
1. Tinkamiausios sąlygos siauralapių gauromečių augalinei žaliavai ekstrahuoti yra su 70 % (v/v) etanoliu, laikant ultragarso vonelėje 30 min.
2. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu, Plateliuose 94,139 ± 0,22 mg/g rinktoje lapų augalinėje žaliavoje.Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad siauralapių gauromečių augalinė žaliava yra vertinga fenolinių junginių išgavimui. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių, p>0,05.
3. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, nustatytu CUPRAC metodu, pasižymėjo Plateliuose 9,033 ± 0,01 mg/g augusios siauralapių gauromečių žaliavos. Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse.
4. ESC tyrimams, fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje, buvo pritaikyta skirstymo metodika skirta fenolinių junginių identifikavimui ir kiekybiniai analizei atlikti augalinės žaliavos ekstraktuose. Parinkta tinkamiausia ESC metodika kokybiniam ir kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui buvo validuota.
5. ESC analizės metu nustatyti siauralapių gauromečių augalinės žaliavos ir fermentuotos arbatos ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai: dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, kvercetinas. Didžiausias kiekis buvo nustatytas izokvercitrino fermentuotoje siauralapio gauromečio arbatoje. Tačiau gauromečio žaliavoje buvo identifikuotas didelis kiekis neochlorogeno.Visų identifikuotų fenolinių junginių kiekiai buvo didesnis fermentuotoje gauromečio arbatoje, lyginant su siauralapio gauromečio augaline žaliava, išskyrus chlorogeno rūgštį.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktais spektrofotometriniais tyrimais ir gautais rezultatais nustatyta, kad
siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapų augalinė žaliava yra vertingesnė fenoliniais junginiais ir jos lapų antioksidacinis aktyvumas didesnis lyginant su visa augaline
žaliava. Galima teigti, jog siauralapių gauromečių lapai yra vertingesni preparatų gamyboje Būtų tikslinga atlikti tyrimus su didesniu kiekiu mėginių, surinktų skirtingu laiku ir iš daugiau skirtingų augaviečių; įvertinti rinkimo laiko ir vietos daromą įtaką fenolinių junginių kiekiui augalinėje žaliavoje.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Andersen ØM, Markham KR, editors. Flavonoids: chemistry, biochemistry, and applications. Boca Raton: Taylor & Francis; 2006. p. 13, 30.
2. Agrawal S, Kulkarni GT, Sharma VN. A comparative study on the antioxidant activity of methanolic extracts of Terminalia paniculata and Madhuca longifolia. Free Radic
Antioxid. 2011 October;1(4):62–8
3. Azmir J., Zaidul I.S.M., Rahman M.M., Sharif K.M, Mohamed A., Sahena F., Jahurul M.H.A., Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering. 2013 January: p. 426–436.
4. Balvočiūtė J, Dagytė S, Juknevičienė G. Medingieji augalai. Vilnius: Mokslas; 1987. p. 11-2.
5. Battinelli L, Tita B, Evandri MG, Mazzanti G. Antimicrobial activity of Epilobium spp. extracts. Il Farmaco 2001; 56: 345–348.
6. Bond W., Davies G., Turner R.The biology and non-chemical control of Rosebay Willowherb (Chamerion angustifolium (L.) Holub) October 2007.
https://www.gardenorganic.org.uk/sites/www.gardenorganic.org.uk/files/organic-weeds/chamerion-angustifolium.pdf [prieiga per internetą, žiūrėta 2016-07-20] 7. Dai J, Mumper R. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and
Anticancer Properties. Molecules. [Internet]; 2010 [žiūrėta 2017-04-10];. 15(10):7313-7352. Prieiga per internetą: http://www.mdpi.com/1420-3049/15/10/7313?trendmd-shared=0>
8. TPA Devasagayam, JC Tilak, KK Boloor, Ketaki S Sane, Saroj S Ghaskadbi, RD Lele. Free Radicals and Antioxidants in Human Health:Current Status and Future Prospects. Japi 2004;52:794-804
9. Ducrey B, Marston A, Göhring S, Hartmann RW, Hostettmann K. Inhibition of 5α-Reductase and Aromatase by the Ellagitannins Oenothein A and Oenothein B from Epilobium Species. Planta Medica 1997; 63: 111-114.
10. Fereidoon Shahidi, Ying Zhong. Measurement of antioxidant activity. Journal of Functional Foods. 2015 October: p. 757–781.
