MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
JULIJA BAJER
FLAVONOIDŲ IR FENOLINIŲ JUNGINIŲ PASISKIRSTYMO TYRIMAS
ERŠKĖTINIŲ (ROSACEAE JUSS.) ŠEIMOS AUGALŲ: ŽEMUOGIŲ (FRAGARIA
VESCA L.), AVIEČIŲ (RUBUS IDAEUS L.) IR GUDOBELIŲ (CRATAEGUS
MONOGYNA JACQ.) LAPUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof., dr. V. Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof., dr. Vitalis Briedis 2014 m. birželio
FLAVONOIDŲ IR FENOLINIŲ JUNGINIŲ PASISKIRSTYMO TYRIMAS
ERŠKĖTINIŲ (ROSACEAE JUSS.) ŠEIMOS AUGALŲ: ŽEMUOGIŲ (FRAGARIA
VESCA L.), AVIEČIŲ (RUBUS IDAEUS L.) IR GUDOBELIŲ (CRATAEGUS
MONOGYNA JACQ.) LAPUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
prof., dr. Valdas Jakštas 2014 m.
Recenzentas
prof., dr. Daiva Majienė 2014 m.
Darbą atliko
magistrantė Julija Bajer 2014 m.
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeima... 9
1.1.1. Paprastoji žemuogė - Fragaria vesca L. ... 10
1.1.2. Paprastoji avietė - Rubus idaeus L. ... 11
1.1.3. Vienapiestė gudobelė - Crataegus monogyna Jacq... 12
1.2. Fenoliniai junginiai – flavonoidai, chlorogeno rūgštis ... 14
1.3. Fenoliniai junginiai Rosaceae Juss. šeimos augaluose... 17
2. TYRIMO METODIKA... 18
2.1. Tyrimo objektas ... 18
2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra ... 19
2.3. Duomenų statistinis vertinimas ... 19
2.4. Tyrimo metodai ... 20
3. TYRIMO REZULTATAI ... 27
3.1. Ekstrakcijos sąlygų nustatymas ... 27
3.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 28
3.3. Fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 31
3.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 34
3.5. Chlorogeno rūgšties ir flavonoidų nustatymas ... 40
REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 46
IŠVADOS... 47
SANTRAUKA
J. Bajer magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof.dr. V. Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas.
Pavadinimas: Flavonoidų ir fenolinių junginių pasiskirstymo tyrimas erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimos augalų: žemuogių (Fragaria vesca L.), aviečių (Rubus idaeus L.) ir gudobelių (Crataegus
monogyna Jacq.) lapuose.
Raktiniai žodžiai: Fragaria vesca L., Rubus idaeus L., Crataegus monogyna Jacq., flavonoidai, fenoliniai junginiai.
Tyrimo metodai: Spektrofotometrinis flavonoidų nustatymas naudojant aliuminio chloridą, fenolinių junginių nustatymas Folin-Ciocalteu metodu, antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS ir DPPH metodais, chlorogeno rūgšties nustatymas efektyviąja skysčių chromatografija.
Tyrimo tikslas: palyginti flavonoidų, fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo skirtumus kelių Rosaceae Juss. šeimos rūšių lapų žaliavose.
Tyrimo uždaviniai: spektrofotometriškai nustatyti flavonoidų ir fenolinių junginių kiekį, chromatografiškai - chlorogeno rūgšties kiekį kelių Rosaceae Juss. augalų šeimos rūšių lapuose iš skirtingų Kauno apskr. augaviečių; spektrofotometriškai DPPH ir ABTS metodais nustatyti tirtų žaliavų antioksidantines savybes; palyginti kelių aviečių lapų arbatų iš vaistinės ėminių sudėtį ir antioksidantines savybes.
Išvados: kiekybiškai turtinga sudėtimi pasižymėjo žemuogių lapai, nustatyta stipri bendro flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo koreliacija. Vidutiniškai fenolinių junginių gudobelių lapų žaliavose nustatyta 1,18 karto daugiau, nei žemuogių lapų žaliavose ir 3,18 karto daugiau, nei aviečių lapų žaliavose. Nustatyti antioksidantinio aktyvumo skirtumai: žemuogių lapų DPPH laisvųjų radikalų surišimo geba buvo 1,81 karto didesnė nei aviečių lapų ir 1,67 karto didesnis, nei gudobelių lapų. Aviečių lapų ABTS trolokso ekvivalentas buvo 1,01 karto didesnis nei žemuogių ir gudobelių lapų. Didžiausias vidutinis chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas gudobelių lapų žaliavose ir buvo 3 kartus didesnis nei aviečių lapų ir 12,5 karto didesnis, nei žemuogių lapų. Lyginant skirtingų aviečių lapų arbatų, įsigytų vaistinėje, ėminius, ėminys ,,A“ pasižymėjo didžiausiu fenolinių junginių kiekiu, chlorogeno rūgšties kiekiu ir DPPH laisvųjų radikalų surišimo geba. Ėminyje ,,B“ nustatytas didžiausias flavonoidų kiekis ir ABTS trolokso ekvivalentas.
SUMMARY
Title: Investigation of flavonoids and phenolic compounds distribution in Rosaceae Juss. family plants: strawberry (Fragaria vesca L.), raspberry (Rubus idaeus L.) and hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) leaves.
Keywords: Fragaria vesca L., Rubus idaeus L., Crataegus monogyna Jacq., flavonoids, phenolic compounds.
Research methods: spectrophotometric determination of flavonoids using aluminum chloride, determination of phenolic compounds using Folin - Ciocalteu method, determination of antioxidant activity using ABTS and DPPH tests, determination of chlorogenic acid using high performance liquid chromatography.
The aim: to compare flavonoids, phenolic compounds, chlorogenic acid contents and antioxidant activity in raw leaf materials of some Rosaceae Juss. family species.
Objectives of the study: to determine flavonoids, phenolic compounds and chlorogenic acid content in leaves of some Rosaceae Juss. plant species from different locations of Kaunas county; to determine antioxidant properties of tested raw leaf materials with DPPH and ABTS methods; to compare a composition and antioxidant properties of some different raspberry leaf teas from the drugstore.
Conclusions: The highest total flavonoid content average was measured in strawberry leaves, with strong correlation between total flavonoid content and antioxidant activity. The phenolic compounds content average of hawthorn leaves was 1.18 times higher than average of strawberry leaves and 3.18 times higher than average of raspberry leaves. The antioxidant activity differences depended on the method: DPPH free radical scavenging ability of strawberry leaves was 1.81 times higher than ability of raspberry leaves and 1.67 times higher than ability of hawthorn leaves. The ABTS trolox equivalent average of raspberry leaves was 1.01 times higher than average of hawthorn and strawberry leaves. The highest chlorogenic acid content average determined in hawthorn leaves; it was 3 times higher than average of raspberry leaves and 12.5 times higher than average of strawberry leaves. Comparing raspberry leaf teas from the drugstore, sample ,A’ had the highest values of phenolic compounds, chlorogenic acid content and DPPH free radical scavening ability. Sample ,B’ had the highest total flavonoid content and ABTS trolox equivalent.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
ESC (HPLC) – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high performance liquid chromatography) FRAP - geležies redukcijos geba (angl. ferric reducing ability of plasma)
IR – infraraudonųjų spindulių spektroskopija
PECAM-1 - trombocitų endotelinių ląstelių adhezijos molekulė-1 SAA – suminis antioksidantinis aktyvumas
SSN(%) – santykinis procentinis standartinis nuokrypis UV-Vis – ultravioletinės ir regimosios šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimos augalai yra plačiai paplitę Lietuvoje. Jie yra vartojami farmacijoje įvairių ligų, susijusių su širdies ir kraujagyslių sistema bei oksidacinio streso poveikiu, gydymui ir profilaktikai. Ypač didelis dėmesys yra skiriamas šių augalų flavonoidams tirti, nes šie junginiai turi platų farmakologinio poveikio spektrą ir atveria naujas galimybes kai kurių vėžio formų prevencijai, taip pat galimi vartoti kaip vertingi maisto priedai, papildantys mitybos racioną. Flavonoidai vartojimo atžvilgiu yra perspektyvūs junginiai, kadangi nėra toksiški ir gana lengvai pasišalina iš organizmo. Dėl šios priežasties skirtingose augalų šeimose ir rūšyse tiriamas ir palyginamas flavonoidų kiekis, nustatomi konkretūs junginiai ir jų kiekio skirtumai, tiriamas farmakologinis poveikis.
Rosaceae Juss. šeimos augalų fitocheminė sudėtis gali kisti gana plačiose ribose. Variacija gali
būti nulemta įvairių veiksnių, tarp jų priskiriama geografinė padėtis, kuri yra veikiama agroklimatinių sąlygų ir genetinių veiksnių. Norint palyginti geografinio veiksnio įtaką fitocheminei augalo sudėčiai, atliekami augalo žaliavų, rinktų skirtingose augavietėse, fitocheminiai tyrimai. Flavonoidai yra nustatomi įvairiose augalų rūšyse, tačiau svarbių duomenų apie tarprūšinį flavonoidų pasiskirstymą, tiriant skirtingose augavietėse, ir išvadų apie atskirų augaviečių įtaką flavonoidų pasiskirstymui Rosaceae Juss. šeimos augaluose nėra.
Darbo naujumas. Pirmą kartą kelių skirtingų Rosaceae Juss. šeimos augalų rūšių lapų žaliavose, rinktose geografiškai skirtingose Kauno apskrities augavietėse, tiriant tais pačiais metodais, palyginti flavonoidų, fenolinių junginių ir chlorogeno rūgšties kiekių skirtumai bei įvertintas antioksidantinis aktyvumas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: palyginti flavonoidų, fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo skirtumus kelių Rosaceae Juss. šeimos augalų rūšių lapų žaliavose.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį skirtingose Kauno apskrities augavietėse rinktų kelių erškėtinių šeimos augalų rūšių lapuose ir palyginti jo skirtumus.
2. Nustatyti fenolinių junginių kiekį kelių erškėtinių šeimos augalų rūšių lapuose. 3. DPPH ir ABTS metodais įvertinti tirtų augalų rūšių lapų antioksidantines savybes. 4. Chromatografiškai nustatyti chlorogeno rūgšties kiekio pasiskirstymą tirtuose ėminiuose. 5. Palyginti skirtingų aviečių lapų arbatų, įsigytų vaistinėje, ėminių sudėtį.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeima
Erškėtinių (Rosaceae Juss.) augalų šeimą sudaro daugiau nei 100 genčių ir 3000 rūšių, ji tradiciškai yra skirstoma į keturis pošeimes, sugrupuotas pagal vaisių tipą. Tai apima: Rosoideae (Rosa,
Fragaria, Potentilla ir Rubus), Prunoideae (Prunus), Spiraeoideae (Spirea) and Maloideae (Malus, Pyrus,
and Cotoneaster, Potter). Paskutinė filogenetinė analizė Rosaceae Juss. augalų šeimą padalijo į tris pošeimes: Dryadoideae (Cercocarpus, Dryas ir Purshia), Rosoideae (Fragaria, Potentilla, Rosa, Rubus ir kt.) ir Spiraeoideae (Kerria, Spiraea ir kt.). Kiekviena iš pošeimių toliau skirstoma į gentis ir pogentis. Erškėtinių augalų šeima apima svarbias vaisių, riešutų, dekoratyvinių ir miško kultūras ir yra trečia pagal ekonominį svarbumą vidutinio klimato regionuose. Nuo 4000-5000 m. pr. Kr. dauguma Rosaceae Juss. šeimos augalų buvo tobulinami genetiškai ir turi ekonominį poveikį pasaulio rinkose, produktai turi didelę paklausą dėl jų mitybinės ir estetinės vertės [41].
Biologiškai aktyvios medžiagos. Rosaceae Juss. šeimos augalai yra svarbus šaltinis augalinių junginių, tokių kaip flavonoidai ir kiti fenoliniai junginiai, cianogeniniai glikozidai, fitoestrogenai ir fenoliai, kurie padeda išlaikyti sveikatą, kovoti su įvairiais susirgimais ir yra gerai žinomi antioksidantai arba vėžio vystymąsi slopinantys junginiai [41].
Farmakologinis poveikis. Remiantis atliktais tyrimais in vitro ir in vivo, galima teigti, kad daugelio Rosaceae Juss. šeimos rūšių vaisių ir lapų ekstraktai slopina kai kurias vėžio formas arba pasižymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis. Pvz., elago rūgštis, randama Fragaria L. genties augalų žaliavose, paprastojoje avietėje (Rubus idaeus L.), šiaurinėje katuogėje (Rubus arcticus L.), paprastojoje tekšėje (Rubus chamaemorus L.) ir daugelyje kitų erškėtinių šeimos augalų žaliavų, turi įtakos ląstelių proliferacijai ir apoptozei bei galimą priešvėžinį poveikį. Kai kurie kiti fenoliniai junginiai, išskirti iš Rosaceae Juss. šeimos augalų, taip pat yra potencialūs antioksidantai ar priešvėžiniai junginiai. Paskutiniu metu atliekama daug tyrimų nustatant atskirus flavonoidus, turinčius farmakologinių savybių. Pasitelkiant genetikos ir bioinformatikos mokslus atsiveria naujos galimybės siekiant nustatyti naudingus junginius ir genų, atsakingais už jų gamybą, valdymui [13; 41].
1.1.1. Paprastoji žemuogė - Fragaria vesca L.
Paprastoji žemuogė (Fragaria vesca L.) priklauso Fragaria L. genčiai, Rosaceae Juss. šeimai, ir yra labiausiai paplitęs iš visų šiuo metu priskaičiuojamų iki 20 - 24 Fragaria L. genties rūšių [29; 38].
Morfologiniai požymiai. F. vesca L. - daugiametis žolinis augalas, iki 5 - 20 cm aukščio. Stiebas status, plaukuotas. Iš pamatinių lapų pažastų išauga šliaužiantys ūgliai, įsišaknijantys bamblių vietose. Lapai – trilapiai, dantytais kraštais su ilgais plaukuotais koteliais. Žiedai balti, susitelkę į skėtinius žiedynus, dažniausiai dvilyčiai. Uogos kiaušinio ar rutulio formos, tamsiai raudonos spalvos, malonaus kvapo. Vaisiai – labai smulkios sėklos, išsidėsčiusios uogos paviršiuje. Augalas žydi gegužės – birželio mėnesiais. Uogas nokina birželio – liepos mėnesiais [13]. Šio augalo veislės remontantinė forma (F. vesca var. semperflorens Ser.) žydi ir veda uogas iki šalnų. F. vesca L. genotipas paplitęs Europoje, Vakarų Uralo Azijoje, Šiaurės Amerikoje [29].
Biologiškai aktyvios medžiagos. Lapų žaliavoje nustatomi flavonoidai, askorbo ir folio rūgštys, salicilo rūgštis, karotinoidai, kumarinai, rauginės medžiagos, nedidelis kiekis eterinio aliejaus, glikozidai, alkaloidai, B grupės vitaminai, vitaminas C, fosforo druskos. Žemuogių lapų etanoliniuose ekstraktuose identifikuojami tokie fenoliniai junginiai, kaip: hiperozidas, izokvercitrinas ir kiti kvercetino dariniai, rutinas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas, elago rūgštis, epigalokatechino galatas [6; 39]. Epigalokatechino galatas ir kvercetino dariniai pasižymi aktyviu antioksidantiniu veikimu. Žemuogių lapuose yra daugiau fenolinių junginių nei uogose, dėl to jie pasižymi stipresnėmis antioksidantinėmis savybėmis [39].
Farmakologinis poveikis. F. vesca L. žaliavų preparatams būdingas antioksidantinis poveikis. Farmakologiniu poveikiu pasižymi fenoliniai junginiai, kurie stiprina organizmą, gerina medžiagų apykaitą, lemia sutraukiantį, kraujavimą stabdantį, priešuždegiminį, prakaitavimą skatintantį, diuretinį poveikį. Taip pat būdingas antihiperlipideminis, bendro cholesterolio ir mažo tankio cholesterolio kiekį mažinantis bei aterosklerozės biožymenis (adhezijos ir malondialdehido molekules) mažinantis poveikis [18; 39].
Vartojimas. Lapai vartojami sergant astma, peršalimo ligomis, ateroskleroze, hipertenzija [36], esant skrandžio ir žarnyno uždegimams, viduriuojant, esant podagrai, mažakraujystei, hemorojiniams mazgams ir gimdos kraujavimui, hipertoninei ligai [4]. Dėl salicilo rūgšties vartojami kai kuriems inkstų ir kepenų veiklos sutrikimams, sergant inkstų, tulžies pūslės, šlapimo pūslės akmenlige, mineralinių medžiagų apykaitai pagerinti [4; 39]. Liaudies medicinoje žinomi tokie lapų užpilo poveikiai, kaip lėtinantys širdies ritmą, didinantys širdies susitraukimų dažnį, plečiantys kraujagysles, mažinantys cukraus, šlapimo rūgšties ir šlapimo rūgšties druskų kiekį organizme [13].
1.1.2. Paprastoji avietė - Rubus idaeus L.
Paprastoji avietė (Rubus idaeus L.) priklauso Rosaceae Juss. šeimai, Rubus genčiai. Paskutiniu metu pasaulyje yra sukurta apie 600 aviečių veislių, 30 iš jų efektyviai auginama verslui. Pagal aviečių išauginimą antrą vietą pasaulyje užima Lenkija. Lietuvoje versliniai avietynai sudaro apie 280 hektarų [1]. Augalas plačiai geografiškai paplitęs Europoje, Azijoje ir kt. Aviečių derlius yra vartojamas mitybiniais tikslais, taip pat liaudies medicinoje [30]. Paskutinius du dešimtmečius mokslininkai tyrė avietėje esančių junginių biologinį poveikį ir nustatė aviečių lapų produktų saugumą ir veiksmingumą [45].
Morfologiniai požymiai. Iki 1 - 2 m aukščio dvimetis krūmas. Stiebai statūs, šiek tiek palinkusiomis viršūnėmis, dygliuoti. Viršūninių ir žydinčių šakelių lapai trilapiai, žemutinių šakelių lapai su nelygiai dantytais krašteliais, plunksniški, iš 5 - 7 kiaušiniškų nusmailėjusių lapelių. Lapų viršutinė dalis apaugusi retais plaukeliais arba plika, apatinė dalis veltiniška, su baltais plaukeliais. Viršūninis lapelis stambiausias, 10 – 20 cm ilgio ir 10 – 12 cm pločio, gali būti skiautėtas ir kotuotas, šoniniai lapeliai mažesni, stambiau ar smulkiau dvigubai dantyti. Lapkočiai gali būti truputį dygliuoti arba pliki, su priaugusiais siūliškais prielapiais. Žiedai balti, smulkūs, žydi gegužės – birželio mėnesiais. Krūmas dažnas visoje Lietuvos teritorijoje [13; 14; 15].
Biologiškai aktyvios medžiagos. Paprastosios avietės (R. idaeus L.) augalinėje žaliavoje aptinkami flavonoidai, sacharidai, pektinai, organinės rūgštys, rauginės medžiagos, B grupės vitaminai, vitaminas C, mineralinės medžiagos, folio rūgštis, karotinas, fitosterinai, eterinis aliejus [6]. Fitocheminių tyrimų metu pagrindinės nustatinėjamos cheminių junginių grupės yra fenolinai junginiai, antocianidinai, flavonai, elago rūgštis, kvercetinas, floridzinas, R-naringinas, S-naringinas, kemferolis, ursolo rūgščių analogai, (-)-epikatechinas, (+)-katechinas, procianidinas B1, ketonas. Gana gausiai nustatoma elago rūgšties ir kvercetino [21; 30; 35].
Farmakologinis poveikis. Paprastosios avietės lapų žaliava pasižymi švelniu, teigiamu poveikiu organizmui. Farmakologiniai tyrimai parodė, kad aviečių preparatai pasižymi antioksidantiniu, priešvėžiniu, antibakteriniu, hipoglikeminiu, svorį mažinančiu, antiproliferaciniu, antioksidantiniu, priešuždegiminiu, antialerginiu poveikiu; mažina karščiavimą ir skausmą, skatina prakaitavimą ir skatina diurezę, veikia sutraukiančiai, mažina cukraus kiekį kraujyje [4; 30; 40].
Vartojimas. Lapai vartojami esant reumatui, sąnarių uždegimui, podagrai, karštinei, sergant peršalimo ligomis (gripu, angina), esant viduiravimui ir dizenterijai, skydliaukės hiperfunkcijai, kapiliarų sienelių stiprinimui, žaizdų gijimo skatinimui. Liaudies medicinoje - vaikų peršalimo ligoms, slogai, bronchitui, gripui gydyti, karščiuojant, aterosklerozei, hipertonijai, anemijai, gydant odos bėrimus ir
žaizdas, esant žarnyno skausmams, viduriavimui, kepenų bei inkstų ligoms, organizmui valyti kaip detoksikuojanti ir diuretinė priemonė [4; 13; 30].
1.1.3. Vienapiestė gudobelė - Crataegus monogyna Jacq.
Vienapiestė gudobelė (C. monogyna Jacq.) priklauso Rosaceae Juss. augalų šeimai, Maloideae pošeimiui, Crataegus genčiai. Crataegus pavadinimas kilęs iš graikiško žodžio Kratos, reiškiančio medienos kietumą [31]. Tai vienas iš pagrindinių augalų, kurių žaliavos ir žaliavų preparatai vartojami širdies ligų profilaktikai ir gydymui, iš gudobelių rūšių žaliavų pagaminti vaistiniai preparatai yra plačiai vartojami Europoje, Azijoje, Šiaurės Amerikoje. Iš žiedų su lapais ir uogomis gaminamos tinktūros, ekstraktai, arbatos, vientisos ir įvairios sudėties tabletės ir kapsulės [24].
Morfologiniai požymiai. C. monogyna Jacq. yra daugiametis 2 - 6 metrų aukščio dygliuotas arba be dyglių krūmas arba medelis. Dygliai 0,5 – 1 cm ilgio, ploni, negausūs. Lapai dažniausiai plačiai kiaušiniški, 2 - 4 cm ilgio, 1,5 - 3 cm pločio, bukai nusmailėję, sudaryti iš 3 – 7 skilčių, lygiakraščiai, stambiai dantytomis viršūnėlėmis, pliki. Lapų pamatas paprastai pleištiškas arba tiesus. Viršutinė lapų pusė ryškiai žalia, šiek tiek tamsesnė, nei apatinė. Lapkotis 1 – 2 cm ilgio, plikas arba šiek tiek plaukuotas, prielapiai inkstiški, stambūs. Lapai ant bežiedžių šakų gali turėti 5 - 8 skiltis. Ilgųjų ir trumpųjų ūglių lapų dydis, forma ir lapkočių ilgis gali būti labai skirtingi. Žiedai balti, susiskirstę į šakotus skėčius, turi 5 trikampius taurėlapius, 5 baltus žiedlapius ir 15 – 20 kuokelių. Žydi gegužės – birželio mėnesį. C.
monogyna Jacq. ir kiti Crataegus genties atstovai auga rytinėse Šiaurės Amerikos dalyse, Pietų
Amerikoje, Rytų Azijoje ir Europoje. Vienapiestė gudobelė yra dažnas augalas visoje Lietuvos teritorijoje [14; 44].
Biologiškai aktyvios medžiagos. Gudobelių žaliavose nustatomi flavonoidai, fenolinės rūgštys (chlorogeno, kofeino), organinės rūgštys, steroliai, biologinai aminai, kumarinai, terpenoidai, riebalų rūgštys, rauginės medžiagos. Iš pagrindinių identifikuojamų gudobelės fenolinių junginių yra flavonolio tipo junginiai (−)-epikatechinas, viteksino 2“-O-ramnozidas, acetilviteksino 2“-O-ramnozidas, hiperozidas ir rutinas, kurie yra svarbūs metabolitai širdies ligų gydyme (1 pav.). Taip pat aptinkama chlorogeno rūgštis, viteksinas, izoviteksinas, orientinas, kvercitrinas, oligomeriniai procianidinai [10; 16; 33; 34; 44]. Chlorogeno rūgštis ir hiperozidas yra laikomi antioksidantinio aktyvumo žymenimis [16]. Gudobelės lapų ir žiedų kokybė yra vertinama pagal juose esančių flavonoidų kiekį [9], žaliava laikoma kokybiška, jei joje
nustatoma ne mažiau kaip 1,5 proc. flavonoidų, perskaičiuotų hiperozidu ir ne mažiau 0,6 proc. flavono C-glikozidų, perskaičiuotų viteksinu [44].
1 pav. Veiklieji junginiai C. monogyna Jacq. lapuose [44]
(World Health Organization. WHO m onographs on medicinal plants commonly used in the Newly Independent States (NIS); World Health Organization; France: 2010. p.95)
Farmakologinis poveikis. Gudobelių preparatai pasižymi kardioprotekciniu, kardiotoniniu, hipotenziniu, antiaritminiu, tonizuojančiu, antiangininiu, oksidacinį stresą kardiomiocituose mažinančiu, antioksidantiniu, kraujagyslių degeneraciją stabdančiu, gastroprotekciniu, spazmolitiniu, raminamuoju, diuretiniu, antibakteriniu poveikiais, tinka vartoti persirgus sunkiomis širdies ligomis. Gudobelės flavonoidai didina vainikinių kraujagyslų spindį, slopina trombų formavimąsi, mažina mažo tankio lipoproteinų choletsterolio koncentraciją kraujo plazmoje [16; 19; 24; 31].
Vartojimas. Iš gudobelės žaliavos gaminami preparatai vartojami lėtiniam širdies nepakankamumui, sustiprinti širdies raumeniui, mažinti padidėjusį kraujospūdį, aterosklerozės profilaktikai ir gydymui, esant tachikardijai, nemigai dėl širdies ligų [16; 31]. Liaudies medicinoje – širdies sutrikimams, virškinimo sutrikimams, dusuliui, esant inkstų akmenligei, Meksikos liaudies medicinoje - kvėpavimo problemoms gydyti (kosuliui, gripui, bronchitui, astmai) [24; 31]. Vartojant per dideles gudobelių preparatų dozes gali pasireikšti nepageidaujamas poveikis – vaistinio preparato sukelta hipotenzija ir sedacija. Ūminio toksiškumo bendrieji simptomai yra bradikardija ir kvėpavimo slopinimas, dėl kurio gali sustoti širdis ir ištikti kvėpavimo paralyžius. Dažniausiai pasireiškiantys nepageidaujami poveikiai yra galvos svaigimas ir sukimasis, galvos skausmas, migrena, virškinimo trakto sutrikimai, pykinimas ir širdies plakimas. Gudobelės preparatų netinka vartoti vaikams iki 2 metų amžiaus ir nėščiosioms dėl akivaizdaus jų poveikio gimdai (sumažėjęs tonusas ir judrumas). Taip pat vartojami šio
augalo preparatai gali turėti silpną saveiką su kai kuriais širdies ir krajagyslių sistemai vartojamais vaistais, pvz., rusmenės preparatai ir ß-adrenoblokatoriais [31].
1.2. Fenoliniai junginiai – flavonoidai, chlorogeno rūgštis
Fenoliniai junginiai yra viena gausiausių augalinių junginių grupių. Fenolinių junginių grupėje išskiriamos penkios junginių klasės - flavonoidai, fenolinės rūgštys, stilbenai, kumarinai ir taninai. Geriausiai susipažinta su flavonoidų ir fenolinių rūgščių klasėmis.
Flavonoidų klasė. Flavonoidai (lot. flavus - geltonas) – didžiausia augalinių polifenolinių junginių klasė, sudaranti daugiau nei pusę fenolinių junginių. Flavonoidai yra antriniai augalų metabolitai, kurie aglikonų arba glikozidų pavidalu gausiai randami vaisiuose, pumpuruose, žieduose ir lapuose. Flavonoidai yra natūralūs augalų junginiai ir geltoną, raudoną bei mėlyną spalvas suteikiantys augalų pigmentai [43], aglikonų pavidalu kaupiasi epidermio ląstelėse ir apsaugo parenchimą nuo žalingo ultravioletinės spinduliuotės poveikio 280-315 nm diapazone [19]. Jie atlieka svarbų fiziologinį vaidmenį augaluose ir yra labai svarbus žmogaus mitybos komponentas.
Struktūra ir klasifikacija. Flavonoidams yra būdinga C6-C3-C6 konfigūracija, jie yra sudaryti iš 15 anglies atomų ir priskiriami prie mažos molekulinės masės junginių [16; 42]. Flavonoidų aglikono pagrindą sudaro du aromatiniai žiedai A ir B, kuriuos tilteliu jungia trys anglies atomai, su deguonies atomu įeinantys į heterociklinį žiedą. Flavonoidai, remiantis C žiedo išsidėstymo modifikacijomis, yra skirstomi į 6 poklasius:
1. Flavonoliai (kvercetinas, kempferolis, miricetinas, izoramnetinas ir kt.).
2. Flavonai (flavonas, luteolinas, apigeninas, viteksinas, orientinas, izoviteksinas, izoorientinas ir kt.).
3. Flavanoliai (katechinai - flavonolis, kvercetinas, kemferolis, rutinas, kvercitrinas, hiperozidas ir kt.).
4. Flavanonai (flavanonas, likviritigeninas, likviritinas, eriodiktinas, hesperidinas ir kt.). 5. Antocianidinai (pelargonidinas, cianidinas, delfinidinas, peoninas, malvidinas ir kt.). 6. Izoflavonoidai (genisteinas, formononetinas, biochaninas, daidzeinas ir kt.) [27; 43].
Didžiausi flavonoidų poklasiai yra flavonoliai ir flavonai. Poklasio junginiai skiriasi metilintais, sulfatuotais, glikozilintais ir kitais hidorksilo grupės pakaitais, dažnaiusiai O-glikozidų arba C-glikozidų
forma, kurią sudaro su monosacharidais (gliukoze, galaktoze, ramnoze, ksiloze, arabinoze ir kt.), disacharidais (rutinoze, neohesperidoze), trisacharidu soforotrioze [16].
Farmakologinė reikšmė. Flavonoidai turi platų farmakologinio povekio spektrą žmogaus organizmui - tai spazmolitinis, šlapimą ir tulžį varantis, kraujavimą stabdantis, vazodilatacinis, antivirusinis, priešuždegiminis, antialerginis, antibakterinis, antiaritminis, antiišeminis, antiopinis, estrogeninis, antikancerogeninis, antioksidantinis poveikiai [2; 12; 19; 39]. Flavonoidai geba slopinti riebalų peroksidaciją ir trombocitų agregaciją bei pagerina kapiliarų laidumą; kai kuriems flavonoidams būdingas P vitamininis aktyvumas [2; 39]. Žvelgiant farmakologiniu požiūriu, į aglikonus ir glikozidus reikėtų žiūrėti kaip skirtingu poveikiu pasižyminčius junginius - paprastai aglikonai pasižymi didesniu aktyvumu už glikozidus [39].
Flavonoidai yra tyrinėjami įvairiais aspektais. Tai, kad flavonoidams vaistinėse augalinėse žaliavose tirti yra skiriamas didelis dėmesys, lemia ir šių junginių netoksiškumas bei greitas pasišalinimas iš organizmo [17]. Paskutiniu metu ypač plačiai tyrinėjamos flavonoidų antioksidantinės savybės. Epidemiologinės studijos atskleidė, kad flavonoidais turtinga dieta yra susijusi su ilgaamžiškumo didėjimu ir kardiovaskulinių ligų dažnio mažėjimu [25; 39]. Flavonoidus rekomenduojama vartoti kaip dalį kasdieninio maisto raciono, o flavonoidų junginiais praturintus ekstraktus (pvz., iš žemuogių, aviečių lapų) būtų galima tiesiogiai vartoti kaip vertingus priedus, papildančius maistingąja vertę įvairiuose maisto produktuose ir gėrimuose [21; 27].
Antioksidantinis aktyvumas. Antioksidantas – tai junginys ar medžiaga, kuri pristabdo, pašalina ar pristabdo ląstelinių komponentų oksidacinę žalą, atsiradusią dėl laisvųjų radikalų cheminių reakcijų pasekmių [26]. Antioksidanto fiziologinė reikšmė yra išvengti ląstelinių komponentų pažaidos, atsiradusios dėl cheminių reakcijų, kuriose dalyvauja laisvieji radikalai, pasekmės. Oksidacinis stresas yra susijęs su degeneracinėmis nervų ligomis, širdies ir kraujagyslių ligomis, vėžiu, nerimu ir depersija [20]. Flavonoidai vadinami augaliniais antioksidantais, nes gali padėti išvengti laisvųjų radikalų sukeliamos pažaidos veikdami įvairiais mechanizmais - prisijungdami laisvuosius radikalus, aktyvindami antioksidantinius fermentus, sudarydami chelatinius junginius su metalais, redukuodami α-tokoferolio radikalus, slopindami oksidazes, mažindami azoto oksidų sukeltą oksidacinį stresą, padidindami šlapimo rūgšties kiekį ir kt. [39] Flavonoliai, ypač jų atstovas kvercetinas, gali būti laikomi antioksidantinio poveikio modeliu neutralizuojant laisvuosius radikalus [19; 39]. Flavonoidų antioksidantinės ir prooksidantinės savybės priklauso nuo jų struktūrinių bruožų, antioksidantinį poveikį lemia hidroksilinės grupės. Pastebėtame ,,prancūzų paradokse“ išskirtinio dėmesio veiksniais tapo raudonųjų vynuogių sudėtyje esantys flavonoidai. Pietinėje Prancūzijos dalyje užfiksuotas labai mažas koronarinių širdies ligų dažnis, nepaisant suvartojamo gana didelio riebalų kiekio, mažo fizinio aktyvumo ir rūkymo įpročių [28;
39]. Nustatyta, kad polifenolinis raudonųjų vynuogių ekstraktas slopino receptorius PECAM-1 (trombocitų endotelinių ląstelių adhezijos molekulę-1) ir taip sumažino trombocitų aktyvaciją. Pastebėta atvirkštinė flavonolių vartojimo ir mirtingumo nuo koronarinių širdies ligų priklausomybė. Flavonolių vartojimas taip pat turėjo įtaką mažesniam pagyvenusių žmonių pirmojo miokardo infarkto prognozės dažniui [28]. Antioksidantai yra žinomi kaip perspektyvūs apsauginiai ir gydomieji junginiai. Kai buvo nustatyta, kad polifenoliai yra stiprūs antioksidantai, polifenolių, kaip antioksidantinių junginių vertinimas tapo labai svarbus įvairių ligų gydyme, profilaktikoje ir naujų preparatų kūrime [25].
Instrumentiniai tyrimai. Flavonoidai kokybiškai nustatomi spektroskopiniais ir chromatografiniais metodais; tai – ultravioletinių spindulių (UV), infraraudonųjų spindulių (IR), masių, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, plonasluoksne, efektyviąja skysčių (ESC), dujų chromatografijomis. Kiekybiškai flavonoidai nustatomi UV-Vis spektroskopija, plonasluoksne, ESC ir dujų chromatografijomis, kapiliarine elektroforeze [5; 11; 42]. Spektrofotometru nustatomas bendras flavonoidų, fenolinių junginių kiekis, atliekami DPPH, ABTS radikalo ir FRAP metodais paremti antioksidantinio poveikio tyrimai [30]. Prieš atliekant analizę, kokybinė vaistinė žaliava yra tinkamai paruošiama, atsižvelgiant į tai, kokie augaliniai junginiai bus tiriami. Atliekama analizė su augalinių žaliavų milteliais, ištraukomis, skystais, sausais ar tirštais ekstraktais. Flavonoidų skystai ekstrakcijai dažniausiai naudojami įvairių koncentracijų etanolio arba metanolio ir vandens mišiniai [11].
Fenolinių rūgščių klasė. Fenolinių rūgščių klasę sudaro dvi grupės:
1. Hidroksibenzoinės rūgštys (hidroksibenzoinė, protokatechino, galo, p-hidroksibenzoinė ir kt.). 2. Hidrocinaminės rūgštys (hidroksicinaminė, kavos, chlorogeno, p-kumarino, ferulo ir kt.) [32]. Didžiąją dalį fenolinių rūgščių sudaro hidroksicinaminės rūgštys, kurioms priklauso chlorogeno rūgštis.
Chlorogeno rūgštis (3-O-kafeoil-D-kvinino rūgštis) ir jos izomerai yra kavos rūgšties ir kvinino rūgšties esterio dariniai (2 pav.).
2 pav. Chlorogeno rūgšties struktūra
Chlorogeno rūgšties labai gausiai randama termiškai neapdorotose kavos pupelėse, tabako lapuose, obuoliuose ir kt. [37]. Chlorogeno rūgščiai būdingas antioksidantinis, periferinius kraujo granuliocitus nuo oksidacinio streso apsaugantis, nerimą mažinantis [20], priešuždegiminis, plazmos ir kepenų lipidų metabolizmą skatinantis poveikiai [23]. Chlorogeno rūgštis gali būti nustatoma IR spektrofotometrija, kapiliarine elektroforeze, efektyviąja skysčių chromatografija ir įvairiais ESC deriniais bei įvairiais kitais elektrocheminiais metodais [22].
1.3. Fenoliniai junginiai Rosaceae Juss. šeimos augaluose
Dėl savo cheminės sudėties ir patrauklaus skonio didelė dalis erškėtinių šeimos augalinių žaliavų yra vartojamos įvairių susirgimų ir negalavimų gydymui bei profilaktikai. Paprastoji žemuogė (Fragaria
vesca L.), paprastoji avietė (Rubus idaeus L.) ir vienapiestė gudobelė (Crataegus monogyna Jacq.) -
erškėtinių šeimos atstovai. Su žemuogių, aviečių ir gudobelių farmakologiniu poveikiu yra siejami fenoliniai junginiai ir flavonoidai, todėl jie dažnai pasirenkami kaip analitiniai žymenys žaliavų ir fitopreparatų kokybės kontrolei. Dėl šios priežasties yra tiriamos šiuos junginius kaupiančių augalų vaistinės žaliavos, stebint įvairius jų kiekio kitimus, tiriant priklausomybę nuo chemotaksonominių veiksnių, augaviečių ir kitų galimų junginių kiekį nulemiančių veiksnių. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, įvertinama augalinių žaliavų kokybė, augimo sezono, augalo vegetacijos laikotarpio, augalo geografinės padėties ir kitų veiksnių įtaka gautiems rezultatams.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimui atrinktos Rosaceae Juss. šeimos kelių rūšių augalinės žaliavos – žemuogių (Fragaria
vesca L.), aviečių (Rubus idaeus L.) ir gudobelių (Crataegus monogyna Jacq.) lapų žaliava. Pasirinkta ši
augalo dalis, kadangi lapai dėl didesnio kiekio bioaktyvių junginių turi stipresnes antioksidantines savybes nei vaisiai [16], o žiedai ne visose rūšyse yra gausūs ir perspektyvūs rinkti.Visų tirtų augalų rūšių lapai rinkti trijose vietovėse: Kauno miesto Kleboniškio miške, Kauno raj. sodų bendrijoje, ir Kauno miesto gyvenamame mikrorajone. Dviejų augalų rūšių (F. vesca L. ir R. idaeus L.) lapai rinkti Jonavos raj. Krėslynų kaime ir Kauno raj. Sausinės miške. Žaliavos buvo renkamos ir iš atskirų teritorinių taškų: F.
vesca L. lapai – Kaišiadorių raj. miške; R. idaeus L. lapai – Jonavos raj. Užusalių kaime; C. monogyna
Jacq. lapai – Kauno raj. Raudondvario ir Šilelio kaimuose (3 pav.). Augalų lapai rikti gegužės – rugpjūčio mėnesiais.
Ž - žemuogių lapai; A - aviečių lapai; G - gudobelių lapai 3 pav. Teritorinis augaviečių pasiskirstymas
Šalia surinktų žaliavų, vaistinėje įsigytos trijų skirtingų augalinių žaliavų ruošėjų R. idaeus L. lapų arbatos: UAB ,,Acorus calamus‘‘ (toliau - ėminys ,,A“), UAB ,,Švenčionių vaistažolių fabrikas‘‘ (toliau – ėminys ,,B“) ir P. Karvelio terapijos - fitoterapijos įmonės ,,Dr. Karvelis‘‘ (toliau – ėminys ,,C“).
2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra
Reagentai. Aliuminio chlorido heksahidratas ir DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) įsigyti iš ,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH‘‘ (Steinheim, Vokietija), troloksas iš ,,Fluka“ (Seelze, Vokietija), ABTS (2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis) iš ,,Sigma-Aldrich‘‘ (St. Louis, Kanada), Folin & Ciocalteu reagentas iš ,,Sigma-Aldrich‘‘ (Buchs, Šveicarija), heksametilentatraminas iš ,,Lachema“ (Neratovice, Čekija), galo rūgšties monohidratas iš ,,Sigma-Aldrich‘‘ (Hong Kong, Kinija), 96,3 proc. V/V etanolis iš AB ,,Stumbras‘‘ (Kaunas, Lietuva), ledinė acto rūgštis iš ,,ЗАО Купавнареактив‘‘ (Staraja Kupavna, Rusija), naudotas vanduo, išgrynintas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.
Aparatūra. Augalinė žaliava sverta elektroninėmis svarstyklėmis ,,Sartorius AG“ (Götingen, Vokietija), ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje Bandelin SONOREX™ Digital 10 P (Berlin, Vokietija). Bendras flavonoidų kiekis, fenolinių junginių kiekis ir radikalų surišimo geba buvo nustatomi spektrofotometru BECKMAN DU®-70 (California, JAV). Naudota efektyviosios skysčių chromatografijos sistema „Waters 2695“ su diodų matricos detektoriumi „Waters 996 PDA“ (Waters, Milford, JAV), kolonėle ,,SunFire“ C18 3,5 μm, 3,0×150 mm (Waters, Dublin, Ireland), prieškolonėle ,,SunFire“ C18 3,5 μm 4,6×20 mm (Waters, Dublin, Ireland) ir termostatu (Waters, Milford, JAV). ESC duomenys buvo fiksuoti ir apdoroti kompiuterine programa „Empower 2 Chromatography Data Software“ (Waters, Milford, JAV).
2.3. Duomenų statistinis vertinimas
Kiekvienas vykdytas eksperimentas pakartotas tris kartus, iš kiekvieno mėginio tyrimo pakartojimų išvestas vidurkis, apskaičiuotas standartinis nuokrypis ir procentinis variacijos koeficientas. Eksperimento duomenys įvertinti statistiniu paketu MS Exel (Microsoft, JAV). Euklidiniu atstumu paremtos
dendrogramos sudarytos ir Spirmeno koreliacijos koeficientai apskaičiuoti statistiniu paketu SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV).
2.4. Tyrimo metodai
Tiriamųjų mėginių paruošimas. F. vesca L., R. idaeus L. ir C. monogyna Jacq. lapai džiovinti kambario temperatūroje, nuo saulės šviesos apsaugotoje vietoje. Sausi lapai susmulkinti elektriniu smulkintuvu iki 1 - 3 mm dydžio dalelių. Ekstraktai ruošti sveriant 0,1 g (0,0001 g tikslumu) susmulkintos augalinės žaliavos ir užpilant 6 ml ekstrakcijos tirpiklio. Ekstrakcija vykdyta 45 min 40°C temperatūroje. Bandymų būdu kiekvienos rūšies žaliavai atskirai parinkta ekstrakcijos tirpiklio koncentracija. Gautas ekstraktas filtruojamas per vatą į 10 ml matavimo kolbutę, žaliava piltuvėlyje perplaunama du kartus po 2 ml ekstrakcijos tirpiklio, kolbutę pripildant iki matavimo brūkšnio. Gauti ekstraktai buvo laikomi tamsaus stiklo buteliukuose, nuo tiesioginio šviesos poveikio apsaugotoje vietoje.
Bendro flavonoidų kiekio nustatymas. Paruoštuose Rosaceae Juss. šeimos kelių augalų rūšių lapų ekstraktuose buvo nustatomas bendras flavonoidų kiekis, perskaičiuotas rutino ekvivalentu. Įvertinti flavonoidų kiekio skirtumai tarp skirtingų augaviečių ėminių.
Tiriamasis tirpalas buvo ruošiamas į 10 ml tūrio matavimo kolbutę pilant 4 ml 96 proc. etanolio,
0,2 ml 33 proc. ledinės acto rūgšties, 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo, 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo, 0,4 ml tiriamo ekstrakto ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės. Gautas tirpalas sumaišomas ir po 30 min matuojamas absorbcijos dydis prie 407 nm bangos ilgio [10].
Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 10 ml matavimo kolbutę pilant 4 ml 96 proc. etanolio, 0,2 ml
33 proc. ledinės acto rūgšties, 0,4 ml tiriamo ekstrakto ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės.
Etaloninio rutino tiriamasis ir palyginamasis tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis, tik
vietoj 0,4 ml ekstrakto pilama 0,4 ml etaloninio rutino tirpalo.
Etaloninis rutino tirpalas buvo ruošiamas 0,0125 g rutino tirpinant 65 proc., 70 proc. arba 75 proc. etanolyje (V/V) 25 ml matavimo kolbutėje.
Flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu, apskaičiuojamas pagal formulę:
Čia:
m (rut.) – rutino masė etaloniniam tirpalui, g V – paruošto ekstrakto tūris, ml
D – tiriamo ekstrakto absorbcijos dydis m – ekstrakto žaliavos svėrinio masė, g
D (rut.) - rutino tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis
Fenolinių junginių kiekio nustatymas. Augalų lapų ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas Folin-Ciocalteu metodu, rezultatus apdorojant remiantis galo rūgšties kalibracijos grafikais.
Tiriamajam tirpalui ruošti buvo imama 0,2 ml atitinkamu santykiu praskiesto ekstrakto, pilama
2,5 ml distiliuoto vandens ir 0,1 ml Folin-Ciocalteu reagento. Gautas tirpalas buvo sumaišomas ir laikomas 6 min. Po to pilama 0,5 ml 20 proc. natrio karbonato tirpalo ir 30 min laikoma tamsioje vietoje. Absorbcijos reikšmė matuojama prie 760 nm bangos ilgio. Palyginamasis tirpalas buvo ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis, tik vietoje 0,2 ml skiesto ekstrakto pilama 0,2 ml atitinkamos koncentracijos etanolio.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai buvo ruošiami tomis pačiomis sąlygomis, tik vietoje 0,2 ml
ekstrakto imama 5-ių žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalų. Motininis galo rūgšties tirpalas, (atitinkantis 0,25 mg/ml koncentraciją) buvo ruošiamas sveriant 0,00568 g galo rūgšties (arba 0,00628 g galo rūgšties monohidrato) ir tirpinant ją 65 proc., 70 proc. ir 75 proc. koncentracijos etanolyje 25 ml kolbutėse ir laikant ultragarso vonelėje nustatytomis ekstrakcijos sąlygomis. Iš jo ruošti šeši koncentracijų tirpalai koncentracijų intervale 0 - 0,25 mg/ml [24].
Pagal galo rūgšties kalibracijos lygtis apskaičiuotas procentinis fenolinių junginių kiekis, atsižvelgiant į ekstraktų skiedimą (4 pav.).
4 pav. Galo rūgšties kalibracijos grafikai skirtingų koncentracijų ekstrakcijos tirpikliams (n=3) F. vesca L. lapų ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis buvo tiriamas aukščiau
nustatytomis sąlygomis. Tiriamajam tirpalui ruošti imta 0,2 ml penkis kartus skiesto žemuogių lapų ekstrakto (40 µl ekstrakto ir 0,16 ml ekstrakcijos tirpiklio). Palyginamasis tirpalas ruoštas vietoje 0,2 ml skiesto ekstrakto pilant 0,2 ml 65 proc. etanolio.
R. idaeus L. lapų ekstraktams tirti, motininis galo rūgšties tirpalas ruoštas galo rūgštį tirpinant 75
proc. etanolyje. Tiriamasis tirpalas buvo ruošiamas imant 0,2 ml du kartus skiesto aviečių lapų ekstrakto (0,1 ml tiriamojo ekstrakto ir 0,1 ml ekstrakcijos tirpiklio). Ruošiant palyginamąjį tirpalą, vietoje 0,2 ml skiesto ekstrakto pilama 0,2 ml 75 proc. etanolio.
C. monogyna Jacq. lapų ekstraktams tirti, motininis galo rūgšties tirpalas ruoštas galo rūgštį
tirpinant 70 proc. etanolyje. Tiriamasis tirpalas ruoštas imant 0,2 ml dešimt kartų skiesto tiriamojo ekstrakto (20 µl ekstrakto ir 0,18 ml ekstrakcijos tirpiklio). Palyginamajam tirpalui vietoj 0,2 ml ekstrakto buvo imama 0,2 ml 70 proc. etanolio.
DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas. Etaloninis DPPH tirpalas ruošiamas sveriant 0,0024 g DPPH radikalo (0,0001 g tikslumu), ultragarso pagalba ištirpinant reikalingos koncentracijos etanolyje, 100 ml tūrio matavimo kolbutėje [3]. Palaukiama, kol nusistovės stabili DPPH tirpalo absorbcijos reikšmė, matuojama esant 515 nm bangos ilgiui, kaip palyginamasis tirpalas
naudojamas atitinkamos koncentracijos etanolis. Tiriamasis tirpalas ruošiamas imant 60 µl tiriamojo ekstrakto ir įpilant 3 ml darbinio DPPH tirpalo, sumaišoma. Palyginamajam tirpalui imama 60 µl 65 proc., 70 proc. ar 75 proc. etanolio ir 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Gauti mišiniai laikomi tamsoje ir po 30 min išmatuojamas absorbcijos pokytis esant 515 nm bangos ilgiui. Apskaičiuojamas tiriamųjų mėginių suminis antioksidantinis aktyvumas proc.:
SAA = x 100%
Čia:
A(tir.) – tiriamojo tirpalo absorbcijos reikšmė A(pal.) – palyginamojo tirpalo absorbcijos reikšmė
ABTS trolokso ekvivalento nustatymas. Motininis ABTS tirpalas ruošiamas ABTS radikalą ištirpinant distiliuotame vandenyje tamsaus stiklo buteliuke. Į gautą tirpalą įdedama kalio persulfato, sumaišoma ir paliekama tamsoje 16 val. Darbinis tirpalas ruošiamas motininį ABTS tirpalą skiedžiant iki 0,80 absorbcijos vienetų, nustatant 734 nm bangos ilgį. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas
distiliuotas vanduo. Imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir įpilama 20 µg tiriamojo ekstrakto. Gautas mišinys laikomas tamsoje, po 1 val spektrofotometru išmatuojamas jo absorbcijos pokytis, nustačius 734 nm bangos ilgį. Pagal trolokso kalibracijos lygtis apskaičiuojama gautus absorbcijos dydžius atitinkančios trolokso koncentracijos (mg/ml). Apskaičiuojama tirtų mėginių laisvųjų radikalų surišimo geba (mg/g) išreikšta trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos:
TE(ABT S) = c x V/m Čia:
c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (mg/ml) V – paruošto ekstrakto tūris, ml
m – atsvertas žaliavos kiekis, g
Standartinio antioksidanto trolokso kalibracija sudaroma ruošiant penkių skirtingų koncentracijų trolokso tirpalus. Motininis trolokso tirpalas ruošiamas sveriant tris tikslius 25 mg trolokso svėrinius ir ištirpinant 25 ml 65 proc. (V/V), 70 proc. (V/V) ir 75 proc. (V/V) etanolio matavimo kolbutėse. Iš motininio tirpalo ruošiami 0-0,5 mg/ml koncentracijų tirpalai, su kuriais atliekamas ABTS tyrimas.
Išmatuojamos skirtingų koncentracijų trolokso tirpalų absorbcijos reikšmės, sudaromi trolokso kalibracijos grafikai (5 pav.).
5 pav. Trolokso standartinių tirpalų kalibracinės kreivės (n=3)
Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygų optimizavimas. Tiriamų augalų lapų ekstraktai prieš ESC analizę buvo papildomai nufiltruoti per dvigubą popieriaus filtrą. ESC analizė atlikta taikant tiesinį gradiento kitimą. Analizės laikas, tėkmės greitis ir komponentų kiekio kitimas nurodyti 1 lentelėje. Eliucijos gradiento komponentas A – fosforo rūgštis vandenyje, komponentas B – fosforo rūgštis
acetonitrile. Flavonoidų identifikavimas vienapiestės gudobelės lapų ekstraktuose atliktas nuo 0 iki 7 min - prie 277 nm ir nuo 7 min - prie 360 nm spektro srities. Chlorogeno rūgštis žemuogių, aviečių ir
gudobelių lapų ekstraktuose identifikuota prie 324 nm. Augaliniai junginiai identifikuoti lyginant su etaloniniais UV absorbcijos spektrais 210 - 600 nm srityje. Kiekybinis junginų nustatymas atliktas naudojantis kalibracinėmis junginių kreivėmis išorinio standarto metodu.
1 lentelė. Judrių fazių gradiento kitimas Laikas, min Tėkmės greitis, ml Komponentas A, proc. V/V Komponentas B, proc. V/V 0 - 12 0,6 84 16 12 - 18 0,6 47 53 18 - 18,10 0,6 3 97 18,10 - 19 0,6 3 97 19 - 21 0,8 3 97 21 - 23 0,8 84 16
Žemuogių, aviečių ir gudobelių lapų ekstraktuose nustatytos chlorogeno rūgšties bei gudobelių lapų ekstraktuose nustatytų penkių flavonoidų sulaikymo trukmės, regresijos lygtys ir regresijos koeficientai nurodyti 2 lentelėje. Visos koreliacijos koeficientų R2 reikšmės yra artimos 1 ir rodo didelę tiesinę priklausomybę.
2 lentelė. Regresijos lygtys ir koeficientai
Junginys Sulaikymo
trukmė, min
Regresijos lygtis Regresijos koeficientas (R2) Chlorogeno rūgštis 3,14 – 3,52 y=3,05·104x + 4,43·103 0,999998
Hiperozidas 11,52 – 11,80 y=5,28·104x 0,999769
Izokvercitrinas 12,36 – 12,66 y=4,46·104x 0,999657
Epikatechinas 4,41 – 4,67 y=1,08·104x 0,999931
Viteksino 2-O“ramnozidas 8,33 – 8,60 y=2,01·104x 0,999966
Rutinas 9,80 – 9,87 y=2,74·104x 0,999889
6 - 7 pav. pateiktos vienapiestės gudobelės lapų ėminiuose nustatytų flavonoidų chromatogramos, 23 – 25 pav. pateiktos žemuogių, aviečių ir gudobelių lapų ekstraktuose nustatytos chlorogeno rūgšties
6 pav. Crataegus monogyna Jacq. lapų ėminio chromatograma
7 pav. Crataegus monogyna Jacq. lapų ėminio chromatograma
Žemuogių ir aviečių lapų ekstraktuose tos pačios ESC analizės metu buvo nustatyta tiktai
chlorogeno rūgštis. Šių augalų lapų ekstraktams reikėtų parinkti atskirą filtravimo metodą ir augalų rūšims būdingų individualių junginių ESC analizę.
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Ekstrakcijos sąlygų nustatymas
Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos nustatymas. Augalinei žaliavai ekstrahuoti buvo naudojami etanolio ir vandens mišiniai. Ekstrakcijos sąlygų nustatymas buvo vykdomas ekstraktus veikiant aliuminio chloridu ir gautus rezultatus perskaičiuojant rutino ekvivalentu. Lyginant gautus rezultatus, didžiausias flavonoidų kiekis buvo išekstrahuotas 65 proc. etanoliu (V/V) iš F. vesca L. lapų, 75 proc. etanoliu (V/V) iš R. idaeus L. lapų ir 70 proc. etanoliu (V/V) - iš C. monogyna Jacq. lapų. Parinkus didžiausias reikšmes, toliau buvo gaminami atitinkamos koncentracijos ekstraktai kiekvienos augalo rūšies žaliavai (8 pav.).
8 pav. Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos nustatymas (n=3)
Ekstrakcijos laiko nustatymas. Ekstrahuojant aviečių, žemuogių ir gudobelių lapų žaliavą ultragarso vonelėje buvo pastebėta, kad iš aviečių ir žemuogių lapų išekstrahuotų flavonoidų kiekis didėjo, ilgėjant ekstrahavimo laikui. Pasirinktas 45 min ekstrakcijos laikas, nes ilgiau ekstrahuojant 40°C temperatūroje, galimi nepageidaujami flavonoidų struktūros pokyčiai. Gudobelių lapų ekstrakto gamybai pasirinktas 45 min ekstrakcijos laikas (9 pav.).
9 pav. Ekstrakcijos laiko nustatymas (n=3)
3.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas
F. vesca L. lapų žaliavos. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis buvo nustatytas lapuose,
rinktuose gegužės mėn. pabaigoje Kauno mieste, žemuogių žydėjimo metu - 2,66 proc. (SSN(%) = 3,78), mažiausias - lapų žaliavose, rinktose Kauno miesto Kleboniškio miško teritorijoje - 1,48 proc. (SSN(%) = 3,76) ir Kauno raj. Sausinės miške - 1,40 proc. (SSN(%) = 4,34). Nemažas flavonoidų kiekis apskaičiuotas ir žaliavoje, rinktoje Turžėnų kaime, taip pat rinktoje gegužės pabaigoje Kaišiadorių apskrities pamiškėje ir liepos pabaigoje Kauno raj. kolektyvinio sodo teritorijoje (10 pav.).
R. idaeus L. lapų žaliavos. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas aviečių lapuose, rinktuose
birželio pradžioje Kauno raj. kolektyviniame sode - 2,71 proc. (SSN(%) = 2,10), gegužės mėn. pabaigoje rinktuose lapuose Jonavos raj. Užusalių kaime ir Kauno mieste. Mažiausias kiekis - žaliavai, rinktai Kauno raj. Sausinės miške – 0,5 proc. (SSN(%) = 4,00) (10 pav.).
C. monogyna Jacq. lapų žaliavos. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Kauno raj. Šilelio
kaime rinktuose gudobelių lapuose – 2,34 proc. (SSN(%) = 6,03) ir Kauno mieste rinktoje žaliavoje. Mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas žaliavose, rinktose Kauno Kleboniškio miške – 0,47 proc. (SSN(%) = 2,93) (10 pav.). Lyginant su 2001 metais skirtingose Lietuvos augavietėse rinktų gudobelių
lapų ir žiedų bendro flavonoidų kiekio duomenimis (1,30 – 2,77 proc.) [8], Kauno apskrities augavietėse rinktų gudobelės lapų bendro flavonoidų kiekis buvo šiek tiek mažesnis (0,47 – 2,34 proc.), šį skirtumą galėjo įtakoti didesnis žaliavų rinkimo laiko intervalas 2013 metais.
Tirtų augalų rūšių lapų rezultatų palyginimas. Vidutinis bendras flavonoidų kiekis sudarė 1,97 proc. F. vesca L. lapų žaliavose, 1,62 proc. R. idaeus L. lapų žaliavose ir 1,55 proc. C. monogyna Jacq. lapų žaliavose. Didžiausias flavonoidų kiekio vidurkis nustatytas žaliavose, rinktose Kauno miesto gyvenamajame mikrorajone – 2,25 proc. ir Kauno raj. sodų bendrijoje – 2,06 proc. (10 pav.). Lyginant augalų lapų žaliavų iš visų augaviečių duomenis, nustatyta statistiškai reikšminga (p<0,05) stipri flavonoidų ir antioksidantinio aktyvumo koreliacija.
10 pav. Bendro flavonoidų kiekio skirtumai tirtų Rosaceae Juss. rūšių augalų lapuose (n=3)
Lyginant trijų augalinių žaliavų ruošėjų aviečių lapų arbatas iš vaistinės, didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas arbatos ,,B“ ėminyje - 1,82 proc. (SSN(%) = 3,32), mažiausias - arbatos ,,C“ ėminyje - 0,94 proc. (SSN(%) = 1,62) (11 pav.). Bendro flavonoidų kiekio vidurkis tirtuose ėminiuose iš vaistinės – 1,45 proc., tuo tarpu rinktuose aviečių lapų ėminiuose vidurkis sudarė 1,62 proc.
11 pav. Flavonoidų kiekio pasiskirstymas aviečių lapų arbatų ėminiuose iš vaistinės (n=3)
Euklidinio atstumo dendrograma. Sudaryta bendro flavonoidų kiekio pasiskirstymo pagal augavietes klasterinės analizės dendrograma (12 pav.), kuri vietoves, kuriose buvo rinktos žaliavos, padalija į dvi grupes. Pirmajai grupei priklauso augalų žaliavos, rinktos Kauno mieste ir Kauno raj. sodų bendrijoje. Jose apskaičiuotas didžiausias flavonoidų kiekis, nepriklausomai nuo rūšies. Antroji grupė yra padalyta į du pogrupius. Pirmajam pogrupiui priklauso mėginiai žaliavų, rinktų Kauno miesto Kleboniškio miške ir Kauno raj. Sausinės miške, šiuose mėginiuose apskaičiuotas pats mažiausias bendras flavonoidų kiekis. Antrajam pogrupiui priklauso mėginiai žaliavų, rinktų Jonavos raj. Krėslynų kaime, šiuose mėginiuose apskaičiuotas didesnis bendras flavonoidų kiekis, nei pirmojo pogrupio mėginiuose, bet nėra pakankamas, kad patektų į pirmąją grupę.
12 pav. Bendro flavonoidų kiekio pasiskirstymo pagal augavietes dendrograma
Nustačius bendrą flavonoidų kiekį tirtose žaliavose, pastebėta, kad didesnis flavonoidų kiekis yra būdingas žaliavoms, rinktoms iš asmeninių ūkių, pvz., sodo, daržo kaime, mieste ar kolektyviniame sode, nei iš miškų ir pamiškių; iš žaliavų, rinktų labiau išpuoselėtuose miškuose, nei iš didesnės priežiūros reikalaujančiuose miškuose ar pamiškėse; iš lapų, rinktų augalo žydėjimo metu, nei kitu vegetacijos laikotarpiu. Palyginus aviečių lapų arbatų iš vaistinės ėminių ir Kauno apkr. skirtingose augavietėse rinktų aviečių lapų ėminių reikšmių vidurkius, nustatyta, kad augavietėse rinktų žaliavų ėminių bendro flavonoidų kiekio vidurkis didesnis už vaistinėje įsigytų žaliavų ėminių vidurkį.
3.3. Fenolinių junginių kiekio nustatymas
F. vesca L. lapų žaliavos. Iš pateikto grafiko matyti, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis
nustatytas Kauno mieste rinktuose žemuogių lapuose – 13,64 proc. (SSN(%) = 3,84), mažiausias - Kauno raj. Sausinės miške 7,34 proc. (SSN(%) = 3,71) (13 pav.).
R. idaeus L. lapų žaliavos. Didžiausias fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas aviečių lapų
(SSN(%) = 0,79) ir Jonavos raj. Krėslynų kaime – 4,24 proc. (SSN(%) = 1,90). Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas aviečių lapų žaliavose, rinktose Kauno raj. Sausinės miške – 1,54 proc. (SSN(%) = 3,18) (13 pav.).
C. monogyna Jacq. lapų žaliavos. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas gudobelių
lapuose, rinktuose Kauno mieste – 13,08 proc. (SSN(%) = 1,49), mažiausias – gudobelių lapuose, rinktuose Kauno raj. Šilelio kaime – 9,08 proc. (SSN(%) = 3,18) (13 pav.).
Tirtų augalų rūšių lapų rezultatų palyginimas. Vidutinis fenolinių junginių kiekis sudarė 9,46 proc. F. vesca L. lapų žaliavose, 3,25 proc. R. idaeus L. lapų žaliavose ir 11,14 proc. C. monogyna Jacq. lapuose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas lapų žaliavose, rinktose Kauno miesto gyvenamajame mikrorajone - 10,38 proc.
13 pav. Fenolinių junginių kiekio pasiskirstymas tirtų Rosaceae Juss. šeimos augalų rūšių lapuose (n=3)
Euklidinio atstumo dendrograma. Sudaryta fenolinių junginių kiekio pasiskirstymo pagal vietoves klasterinės analizės dendrograma, nepriklausomai nuo augalo rūšies (14 pav.). Pirmajai grupei priklauso mėginiai žaliavų, rinktų Kauno mieste ir Kauno raj. sodų bendrijoje. Jai priklauso mėginiai su didžiausiu fenolinių junginių kiekiu. Antroji grupė padalyta į du pogrupius, kuriems priklauso mėginiai žaliavų, rinktų kitose vietovėse, tik šįkart į pirmąjį pogrupį pateko mažiausią fenolinių junginių kiekį
turintis mėginys iš žaliavų, rinktų Kauno raj. Sausinės miške, o antrajam pogrupiui priklauso mėginiai žaliavų, rinktų Kauno miesto Kleboniškio miške ir Kauno bei Jonavos raj kaimuose. Pastariesiems ėminiams apskaičiuotas didesnis fenolinių junginių kiekis nei pirmojo pogrupio mėginiams, bet yra nepakankamas, kad patektų į pirmąją grupę.
14 pav. Fenolinių junginių kiekio pasiskirstymo pagal augavietes dendrograma
Lyginant tris skirtingų augalinių žaliavų ruošėjų aviečių lapų arbatas iš vaistinės, didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas arbatos ,,A‘‘ ėminyje - 3,04 proc. (SSN(%) = 0,47), mažiausias kiekis - arbatos ,,C“ ėminyje - 1,93 proc. (SSN(%) = 4,64) (15 pav.). Fenolinių junginių kiekio vidurkis ėminiuose iš vaistinės sudarė 2,62 proc., tuo tarpu skirtingose Kauno apskr. augavietėse rinktų aviečių lapų fenolinių junginių kiekio vidurkis – 3,52 proc.
15 pav. Fenolinių junginių kiekio palyginimas aviečių lapų arbatų ėminiuose iš vaistinės (n=3)
Nustačius bendrą fenolinių junginių kiekį tirtose žaliavose, pastebėta, kad aviečių lapams būdingas mažesnis fenolinių junginių kiekis nei žemuogių ir gudobelių lapams. Kauno mieste žydėjimo metu rinktoje žemuogių lapų žaliavoje nustatytas didžiausias ne tik flavonoidų, bet ir fenolinių junginių kiekis. Palyginus aviečių lapų arbatų iš vaistinės ėminių ir Kauno apkr. skirtingose augavietėse rinktų aviečių lapų ėminių reikšmių vidurkius, nustatyta, kad savarankiškai rinktų žaliavų ėminių fenolinių junginių kiekio vidurkis didesnis už vaistinėje įsigytų žaliavų ėminių vidurkį.
3.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas
DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas. Nustatyta vidutinė laisvųjų radikalų surišimo geba sudarė 82,62 proc. F. vesca L. lapų žaliavose, 42,73 proc. R. idaeus L. lapų žaliavose ir 49,60 proc. C. monogyna Jacq. lapų žaliavose. Didžiausia antioksidantinė geba nustatyta Kauno raj. sodų bendrijoje rinktose augalų žaliavose – 84,76 proc. (16 pav.).
F. vesca L. lapų žaliavos. Didžiausias antioksidantinis slopinimas nustatytas žemuogių lapų
žaliavose, rinktose Kauno mieste – 84,76 proc. (SSN(%)=2,98) ir Kaišiadorių raj. miške - 84,50 proc. (SSN(%) = 1,19), mažiausias – žaliavose, rinktose Kauno miesto Kleboniškio miške - 80,66 proc. (SSN(%) = 4,83) (16 pav.).
R. idaeus L. lapų žaliavos. Didžiausias antioksidantinis slopinimas nustatytas žaliavose, rinktose
Kauno raj. sodų bendrijoje – 79,19 proc. (SSN(%) = 2,60), mažiausias – žaliavose, rinktose Jonavos raj. Užuslių kaime – 25,52 proc. (SSN(%) = 4,91).
C. monogyna Jacq. lapų žaliavos. Didžiausias antioksidantinis slopinimas nustatytas žaliavose,
rinktose Kauno mieste - 76,35 proc (SSN(%) = 3,18), mažiausias – žaliavose, rinktose Kauno raj. Kauno raj. Šilelio kaime – 35,16 proc. (SSN(%) = 1,27).
16 pav. Tirtų Rosaceae Juss. šeimos augalų rūšių lapų DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos palyginimas (n=3)
Euklidinio atstumo dendrograma. Sudaryta DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos pasiskirstymo pagal augavietes nepriklausomai nuo rūšies, klasterinės analizės dendrograma (16 pav.). Ji padalyta į analogiškas grupes ir pogrupius, kaip ir fenolinių junginių kiekio pasiskirstymo atveju (14
16 pav. DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos pasiskirstymo pagal augavietes dendrograma
Lyginant trijų augalinių žaliavų ruošėjų aviečių lapų arbatas, didžiausia DPPH laisvųjų radikalų surišimo geba nustatyta arbatos ,,A” ėminyje – 45,95 proc. (SSN(%) = 4,10), mažiausia – arbatos ,,C” ėminyje: 26,81 proc. (SSN(%) = 4,73) (18 pav.). Laisvųjų radikalų surišimo gebos vidurkis tirtuose ėminiuose iš vaistinės sudarė 38,30 proc., tuo tarpu skirtingose Kauno apskr. augavietėse rinktų aviečių lapų laisvųjų radikalų surišimo gebos vidurkis – 45,64 proc.
18 pav. Aviečių lapų arbatų iš vaistinės ėminių DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos palyginimas (n=3)
Trolokso ekvivalento nustatymas ABTS metodu. Apskaičiuotas vidutinis trolokso ekvivalentas tirtose augalų rūšyse buvo panašus ir sudarė 85,65 mg/g (TEABT S). Didžiausias trolokso ekvivalentas apskaičiuotas Kauno raj. sodų bendrijoje rinktose augalų žaliavose - 90,64 mg/g TEABT S. Didžiausias trolokso ekvivalentas nustatytas vienai aviečių žaliavai - 98,19 mg/g., tačiau didesniu trolokso ekvivalento vidurkiu pasižymėjo žemuogių lapų žaliavos - 83,05 – 86,87 mg/g (19 pav.).
F. vesca L. lapų žaliavos. Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas žaliavose, rinktose
Kauno raj. sodų bendrijoje - 86,87 mg/g (SSN(%) = 0,44) ir Kaišiadorių raj. miške - 86,13 mg/g (SSN(%) = 0,42), mažiausias antioksidantinis aktyvumas - žaliavoje, rinktoje Kauno raj. Sausinės miške - 83,05 mg/g (SSN(%) = 4,11) (19 pav.).
R. idaeus L. lapų žaliavos. Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas Kauno raj. sodų
bendrijos žaliavoje - 98,19 mg/g (SSN(%) = 0,15), mažiausias – žaliavoje, rinktoje Kauno raj. Sausinės miške – 58,97 mg/g (SSN(%) = 1,39).
C. monogyna Jacq. lapų žaliavos. Didžausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas žaliavoje,
rinktoje Kauno raj. Šilelio kaime - 87,44 mg/g (SSN(%) = 0,32), mažiausias – lapų žaliavose, rinktose Kauno miesto gyvenamajame mikrorajone – 79,39 mg/g (SSN(%) = 1,66).
19 pav. Trolokso ekvivalento pasiskirstymas tirtų Rosaceae Juss. šeimos augalų rūšių lapuose (n=3)
Euklidinio atstumo dendrograma. Sudaryta antioksidantinio aktyvumo pasiskirstymo augaluose klasterinės analizės dendrograma, kurios klasterizacija priklauso nuo vietovės, bet ne nuo rūšies (20 pav.). Pirmajai grupei priklauso mėginiai žaliavų, rinktų Kauno raj. Sausinės miške. Šios augavietės žaliavose nustatytas pats mažiausias trolokso ekvivalento vidurkis. Antroji grupė padalyta į du pogrupius: pirmajam pogrupiui priklauso žaliavos iš Kauno raj. sodų bendrijos ir Jonavos raj. Krėslynų kaimo, šiose žaliavose nustatytas pats didžiausias antioksidantinis aktyvumas. Antrojo pogrupio mėginių žaliavoms, rinktoms Kauno miesto gyvenamame mikrorajone ir Kleboniškio miške, būdingas mažesnis trolokso ekvivalento vidurkis, bet didesnis už pirmosios grupės žaliavų vidurkį.
20 pav. ABTS trolokso ekvivalento pasiskirstymo pagal augavietes dendrograma
Lyginant skirtingas aviečių lapų arbatas iš vaistinės, didžiausias trolokso ekvivalento vidurkis nustatytas arbatos ,,A” ėminyje - 81,34 mg/g. (SSN(%) = 6,43), mažiausias – arbatos ,,C” ėminyje – 75,73 mg/g (SSN(%) = 7,92) (21 pav.). Trolokso ekvivalento vidurkis ėminiuose iš vaistinės sudarė 84,31 mg/g, tuo tarpu skirtingose Kauno apskr. augavietėse rinktų aviečių lapų trolokso ekvivalento vidurkis sudarė 86,32 mg/g.
21 pav. Aviečių lapų arbatų iš vaistinės ėminių ABTS trolokso ekvivalento palyginimas (n=3)
Nustačius antioksidantinį aktyvumą tirtose augalinėse žaliavose, pastebėti reikšmių skirtumai, priklausantys nuo taikytos metodikos. Nustačius DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebą, didžiausiu antioksidantiniu aktyvu išsiskyrė žemuogių lapų žaliavos, tuo tarpu trolokso ekvivalento reikšmės tarp skirtingų rūšių žaliavų skyrėsi labai mažai (šiek tiek didesnėmis reikšmėmis pasižymėjo aviečių lapų žaliavos). Palyginus aviečių lapų arbatų iš vaistinės ėminių ir Kauno apkr. skirtingose augavietėse rinktų aviečių lapų ėminių reikšmių vidurkius, nustatyta, kad savarankiškai rinktų žaliavų ėminių antioksidantinio aktyvumo vidurkiai didesni už vaistinėje įsigytų žaliavų ėminių antioksidantinio aktyvumo vidurkius.
3.5. Chlorogeno rūgšties ir flavonoidų nustatymas
Chlorogeno rūgšties nustatymas. Chlorogeno rūgštis yra polifenolinis junginys - antioksidantinis žymuo. Chlorogeno rūgšties gana gausiai nustatoma žemuogių, aviečių ir gudobelių lapuose (22 pav.). Šios fenolinės rūgšties kiekio vidurkis F. vesca L. lapų žaliavose sudarė 649 µg/g, R.
idaeus L. lapų žaliavose – 2702 µg/g, C. monogyna Jacq. lapuose – 8130 µg/g, jos kiekio vidurkis gudobelių lapuose buvo 3 kartus didesnis už aviečių lapų vidurkį ir 12,5 karto didesnis už žemuogių lapų vidurkį (santykiai atsispindi ir chromatogramose 22 - 25 pav.). Ypač dideliu kiekiu išsiskyrė Kauno mieste rinktos gudobelių lapų žaliavos (13050 µg/g), mažiausias chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas toje pačioje augavietėje rinktuose žemuogių lapuose (149 µg/g), nepaisant to, kad pastaruosiuose buvo
