SVEIKŲ ŠUNŲ APYVARPĖS MIKROFLOROS IR ANTIMIKROBINIO JAUTRUMO TYRIMAS THE RESEARCH OF HEALTHY MALE DOGS PREPUCE MICROFLORA AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Benas Usonis

SVEIKŲ ŠUNŲ APYVARPĖS MIKROFLOROS IR

ANTIMIKROBINIO JAUTRUMO TYRIMAS

THE RESEARCH OF HEALTHY MALE DOGS PREPUCE

MICROFLORA AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof. dr. Jūratė Šiugždaitė

DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,,Sveikų šunų apyvarpės mikrofloros ir antimikrobinio jautrumo tyrimas“:

1. Yra atliktas mano paties.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo(os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai:

1.______________________________________________________________________ 2.______________________________________________________________________ (vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

TURINYS

1.1. Šunų apyvarpės anatominė - histologinė sandara ...13

1.2. Sveikų šunų apyvarpės natūrali mikroflora ...13

1.3. Šunų natūrali įgimta apsauga nuo mikroorganizmų ...15

1.4. Oportunistiniai mikroorganizmai ...15

1.5. Nevaisingumo problema ...17

1.6. Oportunistinių bakterijų, gyvūnų ir aplinkos sąveika ...17

1.7. Oportunistinių bakterijų antimikrobinis jautrumas ...18

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ...21

2.1. Tyrimo organizavimas ...21

2.2. Tiriamųjų grupių sudarymas ...22

2.3. Mėginių paėmimas iš sveikų šunų apyvarpės ...22

2.4. Bakteriologinio tyrimo eiga ...22

2.5. Bakterijų identifikavimas, remiantis jų biocheminėmis – antigeninėmis savybėmis ...23

2.6. Bakterijų antimikrobinio jautrumo tyrimas ,,Kirby – Bauer” diskų difuzijos metodu ...25

3.1. Iš šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės išskirtos bakterijos ...26

3.2. Iš kastruotų ir nekastruotų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės išskirtos bakterijos ...29

3.3. Šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės bakterijų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes ...33

3.4. Šunų apyvarpės dažniausiai išskiriamų bakterijų jautrumas antibiotikams ...36

4. REZULTATŲ APTARIMAS ...40

IŠVADOS ...42

LITERATŪROS ŠALTINIAI ...43

5

SVEIKŲ ŠUNŲ APYVARPĖS MIKROFLOROS IR ANTIMIKROBINIO JAUTRUMO TYRIMAS

Benas Usonis

Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Sveikų šunų apyvarpėje randamos skirtingų rūšių bakterijos. Nusilpus individo imuninei sistemai, natūrali mikroflora gali virsti patogeniška ir sukelti vietinius ar sisteminius sutrikimus. Oportunistiniai organizmai sudaro kiekvieno šuns natūralią mikroflorą, o neracionaliai naudojant antimikrobines medžiagas, ilgainiui jie mutuoja, tampa atsparūs daugumai antimikrobinių medžiagų. Svarbu išsiaiškinti, kokie mikroorganizmai yra jautrūs ar atsparūs antimikrobinėms medžiagoms, kurios yra naudojamos veterinarinės medicinos praktikoje. Magistrinio darbo tikslas - identifikuoti mikroflorą iš sveikų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.

Tyrimo metodai ir medžiaga. Magistrinis darbas atliktas 2018 - 2019 metų laikotarpiu. Tyrime dalyvavo šešiasdešimt (n=60) sveikų šunų. Pagal laikymo sąlygas šunys buvo suskirstyti į tris grupes: šunys, laikomi ,,X“ veislyne (n=20), šunys, laikomi ,,Y“ gyvūnų prieglaudoje (n=20) ir šunys, laikomi namuose kartu su šeimininkais (n=20). Bakteriologinis tyrimas atliktas LSMU VA Patobiologijos katedroje. Taip pat atliktas dažniausiai išskirtų bakterijų antimikrobinio atsparumo tyrimas.

6 pseudintermedius. Atlikus dažniausiai išskirtų bakterijų antimikrobinio jautrumo tyrimą, nustatyta, kad

7

THE RESEARCH OF HEALTHY MALE DOGS PREPUCE MICROFLORA AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY

Benas Usonis

Master ‘s Thesis

SUMMARY

There is a variety of different bacteria in the prepuce of healthy dogs. Natural microflora can become pathogenic and cause local or systemic changes when the individual’s immunity is weakened. Natural microbiota of every healthy dog consists of the opportunistic microorganisms and can be resistant to many kinds of antimicrobial agents which are used irrationally in the veterinary medicine practice. The aim of this master’s thesis was to investigate the microflora of prepuce from healthy dogs that are kept in different conditions.

Methods and material of the research. Master ‘s thesis is performed during the period of 2018 – 2019. Sixty (n=60) healthy dogs participated in the research. According to keeping conditions dogs were divided in three groups: dogs are kept in the “X” kennel (n=20); dogs are kept in the “Y” animal shelter (n=20); dogs are kept at home with their owners (n=20). The bacteriological examination was performed at Veterinary Academy Microbiology laboratory at the Department of Veterinary Pathobiology of Lithuanian University of Health Sciences. The bacteria antimicrobial resistant test was also practiced for the most common isolated bacteria.

Results. The most identified bacteria from the prepuce of healthy dogs that are kept in the kennel, animal shelter and at home with their owners were Escherichia coli (30.4 %), Staphylococcus

pseudintermedius (22.8 %). Comparing the isolated microflora of prepuce from healthy dogs Pseudomonas aeruginosa (9.4 %) was only identified in dogs that are kept in the animal shelter. The

8

According to different age groups older dogs have more diverse bacteria species than younger dogs. The most identified bacteria of prepuce from dogs up to one year old was Escherichia coli while

Staphylococcus pseudintermedius was more common in older dogs. The antimicrobial susceptibility

testing of the most commonly isolated bacteria revealed that the isolated bacteria were most resistant to penicillin, trimethoprim and oxacillin (p<0.05).

9

SANTRUMPOS

°C – Celsijaus laipsnis

AŠTI - apatinių šlapimo takų infekcija

B. canis – Brucella canis

cm - centimetras

E. coli – Escherichia coli

EUCAST – (angl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) IgA, IgM, IgG – imunoglobulinas A, imunoglobulinas M, imunoglobulinas G JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos

kg - kilogramas lent. – lentelė

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas m. – metai

MASA - meticilinui atsparus Staphylococcus aureus mg – miligramai

min. – minutės mln. - milijonas mm – milimetrai

O.N.P.G. – (angl. o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)

P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa P. multocida – Pasteurella multocida per os – suduoti per burną

pav. - paveikslas

pH - vandenilio potencialas proc. (%) – procentai

S. aureus – Staphylococcus aureus

S. pseudintermedius – Staphylococcus pseudintermedius

10

ŠTI - šlapimo takų infekcija tūkst. – tūkstančiai

VA – Veterinarijos akademija val. – valandos

11

ĮVADAS

Lietuvoje daugelis gyventojų laiko šunis. Vieni juos įsigyja iš veislyno, kiti priglaudžia iš gatvės ar gyvūnų prieglaudos. Remiantis statistiniais duomenimis, Lietuvoje 2018 m. registruojami apytiksliai 550 tūkst. šunų (39). Esant tokiam didžiuliam kiekiui šunų, svarbu suprasti, kad kiekvieną augintinį supa natūrali mikroflora. Yra nustatyta, kad šunys bakterijas gali perduoti tiesioginio kontakto metu tiek kitiems gyvūnams, tiek ir žmonėms (9-11).

Šunų urogenitalinės sistemos infekcijas neretai sukelia oportunistinės bakterijos, randamos šunų apyvarpės gleivinėje. Oportunistiniai mikroorganizmai įeina į šunų apyvarpės natūralios mikrofloros sudėtį. Esant gyvūno imunosupresijai, bakterijos gali virsti patogeninėmis ir sukelti oportunistines infekcijas (3, 4). Veterinarijos gydytojams labai svarbu žinoti, kokie mikroorganizmai dažniausiai sukelia urogenitalinės sistemos problemas. Šlapimo sistemos ir reprodukcinės sistemos mikrobiota yra labai panaši, ir neretai šios bakterijos migruoja iš vienos vietos į kitą (40).

Šunų apyvarpė – puiki terpė daugintis aerobinėms bakterijoms, nes joje dažnai randama organinių medžiagų masė – smegma. Neretai gyvūnų šeimininkai, maudydami šunis, pamiršta profilaktiškai išplauti apyvarpę ir kreipiasi į kliniką dėl balanopostito (6). Veislynuose susiduriama ir su bakterijų sukeltu patinų nevaisingumu, kuris sukelia didelius ekonominius nuostolius. Šie oportunistiniai mikroorganizmai gali būti perduodami kalei kergimosi metu bei sukelti vaginitą, kai bakterijų kolonizacija pagreitėja ir, esant palankiems veiksniams, tampa patogeniška. Tiek patinų, tiek patelių lytinių organų mikrobiota yra panaši. Dažniausiai išskiriami šie mikroorganizmai: koliforminės bakterijos, stafilakokai, streptokokai (30, 41).

12

Magistrinio darbo tikslas: išskirti bakterijas iš sveikų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės ir nustatyti jų antimikrobinį jautrumą.

Magistrinio darbo uždaviniai:

1. Išskirti apyvarpės bakterijas iš sveikų šunų, laikomų veislyne, gyvūnų prieglaudoje bei gyvenančių namuose kartu su šeimininkais.

2. Palyginti šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės mikroflorą.

13

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Šunų apyvarpės anatominė - histologinė sandara

raukšlė, apsauganti nesusijaudinusio patino varpą. Apyvarpę sudaro 2 sluoksniai (1 pav.): išorinis (lamina externa) ir vidinis (lamina

interna). Išorinį sluoksnį iš išorės dengia

plaukuotas odos epitelis, o vidinį sluoksnį beplaukis plokščiasis epitelis. Šie sluoksniai turi bendrą susijungimo vietą – ostium

preputiale, kurioje erekcijos metu atsiveria

penio galvutė (1, 2). Lamina interna sluoksnyje randamas limfoidinis audinys ir modifikuotos riebalinės liaukos, kurių sekretas randamas smegmoje (apyvarpės organinių medžiagų masėje, kurią sudaro negyvos epitelinės ląstelės, bakterijos bei spermos, šlapimo ir lytinių liaukų išskyrų likučiai) (6).

1.2. Sveikų šunų apyvarpės natūrali mikroflora

Šunys pakankamai dažnai susiduria su varpos ir apyvarpės infekcijomis. Natūrali mikroflora, esant jai palankioms sąlygoms, tampa patogeniška. Oportunistiniai mikroorganizmai sukelia apie 20 proc. patinų varpos (penis) ir apyvarpės (preputium) pažeidimų. Atrasta, kad mikoplazmų ir ureaplazmų flora yra gausesnė nevaisingų šunų apyvarpės gleivinėje nei sveikų. Mikoplazmos dažniausiai išskiriamos kaip saprofitinės bakterijos, mintančios negyvomis organizmų organinėmis medžiagomis, išskyromis žemutiniuose lytiniuose organuose (3, 4).

Turkijoje 2012 metais buvo tiriama 100 sveikų šunų apyvarpės mikroflora. Daugiausiai bakterijų buvo išskirta Staphylococcus spp. (36 proc.) ir E. coli (30 proc.). Kiek mažiau - Proteus spp. (16 proc.),

Pseudomonas spp. (6 proc.), Streptococcus spp. (6 proc.), Bacillus spp. (4 proc.), Corynebacterium spp.

(2 proc.), (1 lent.).

1 pav. Apyvarpės anatominė sandara ir lokalizacija (tekstas pažymėtas raudona

14 1 lentelė. Bakterijos išskirtos iš sveikų šunų apyvarpės (4)

Natūrali apyvarpės mikroflora sudaryta iš tų pačių aerobinių bakterijų, kurios gali būti izoliuotos iš šuns spermos, esant bakteriniam prostatitui, orchitui bei antsėklidžio uždegimui. Palyginus su aerobinėmis bakterijomis, anaerobinės bakterijos nebuvo apibūdintos kaip nepatogeninė šunų mikrobiota (4).

Sveikų šunų urogenitalinėje sistemoje išskiriamos šios bakterijos: Pseudomonas spp.,

Corynebacterium spp., E. coli., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. bei Pasteurella spp. 14 proc.

šunų nors kartą per savo gyvenimą suserga šlapimo takų infekcija. Didelis oportunistinių bakterijų padidėjimas šlapimo ir lytiniuose takuose patinų organizme sukelia uždegiminius procesus (7).

Staphylococcus spp. koaguliazės gamyba koreliuoja su bakterijos patogeniškumu, yra pakankamai stabili

aplinkoje, sukelia piogenines, abscesus formuojančias infekcijas (17).

Enterokokai – bakterijos, kurios dažnai sutinkamos kačių ir šunų gastrointestinaliniame trakte. Šie oportunistiniai mikroorganizmai gali sukelti urogenitalinės sistemos infekcijas. Tiek gyvūnas, tiek žmogus gali perduoti šias bakterijas vienas kitam kontakto metu. Šunys prausdamiesi laižo tarpvietę, kuri gali būti užteršta išmatų likučiais, kuriuose yra randama daug enterokokų. Patinai liežuviu gali bakterijas pernešti į apyvarpės sritį ir sukelti urogenitalines problemas. Buvo ištirta 84 šunų ir 16 kačių išmatų mėginių. 83,3 proc. šunų ir 43,8 proc. kačių buvo išskirti Enterococcus spp. Tiriant išmatų mėginius, identifikuotos šios bakterijos: Enterococcus faecalis (64,9 proc.), Enterococcus faecium (18,2 proc.),

Enterococcus durans (6,5 proc.) (44).

Yra nedaug literatūros šaltinių, aprašančių sveikų šunų apyvarpės mikroflorą. Viename moksliniame straipsnyje teigiama, kad šunų apyvarpės mikroflora panaši į odos. Išskiriamos šios bakterijos: koaguliazei teigiami stafilokokai, Pastaurella multocida, β-hemolitiniai streptokokai ir E. coli (33).

Bakterijos N Procentai (proc.)

15

Apyvarpės gleivinės mikrobiota gali patekti į sėklinį skystį kartu su bakterijomis, kurios patenka iš varpos gleivinės ir distalinės šlaplės dalies, ir sperma tampa nesterili. Sėklinio skysčio pH svyruoja tarp 6,3 ir 6,7, kuris atitinka vidutinę preputium pH vertę (8).

Dažniausiai reprodukcinės sistemos ligas sukelia urogenitalinė oportunistinė mikroflora, o sveikų šunų apyvarpėje gali būti aptinkami šie mikroorganizmai: Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,

Corynebacterium spp., Escherichia coli, Pasteurella spp., Proteus spp., Mycoplasma spp., Haemophilus

spp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter spp., Moraxella spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.,

Enterococcus spp., Ureaplasma spp., Flavobacterium spp. (32).

Atlikti tyrimai parodė, kad prieš kiekvieną pilvo srities operaciją būtina atlikti apyvarpės antiseptiką tam, kad išvengtume infekcijos. Mokslininkai rekomenduoja srovele plauti preputium 2 min. 0,05 proc. chlorheksidino tirpalu (33).

1.3. Šunų natūrali įgimta apsauga nuo mikroorganizmų

Anatominė apsauga. Mokslininkai nustatė, kad ilga šlaplė patinams suteikia apsaugą nuo retrogradinių infekcijų.

Hormoninė apsauga. Veikiant lytiniams hormonams, padidėja audinių aprūpinimas krauju. Taip pat padidėja leukocitų, fagocitinių ląstelių myeloperoksidazės aktyvumas.

Imuninė apsauga. Patinų apyvarpėje dažniausiai randamas IgA. Juos išskiria priedinės lytinės liaukos arba vietiniai limfiniai folikulai. Šie imunoglobulinai padeda izoliuoti judrias bakterijas (19-21).

1.4. Oportunistiniai mikroorganizmai

Dauguma mikroorganizmų gali tapti patogeniški, kai šunų organizmas nusilpsta ir išsivysto vietinis imunodeficitas. Nusilpus vietinei gleivinės apsaugai, normalūs komensalai pradeda intensyviai augti. Kai kurios E. coli rūšys gali būti patogeniškesnės nei kitos dėl jų didesnio kiekio ir virulentiškumo (3, 4, 19). E. coli ir kitos bakterijų rūšys gali būti perduodamos tarp skirtingų gyvūnų rūšių: kačių, šunų ir kitų naminių gyvūnų, turinčių kontaktą tarpusavyje. Šiuo kontaktiniu bakterijų perdavimo būdu gali užsikrėsti ir žmogus. Nustatyta, kad nėščios moterys, auginančios šunis ir kates, turi padidėjusį E. coli bakterijų kiekį makštyje, lyginant su nėščiomis moterimis, kurios neaugina gyvūnų. (9-11). Taip pat nustatyta, kad uropatogeninio kamieno E. coli dažnai šunims sukelia cistitą (17).

16

Mokslininkai išnagrinėjo 2 neįprastus šunų prostatito atvejus. Pirmasis klinikinis atvejis buvo prieš 5 metus, kai iškastruotam Bokserių veislės patinui pasireiškė anoreksija, apatija, buvo matomos apyvarpės išskyros, o rektinė temperatūra - 38,7°C. Biocheminiame kraujo tyrime pakitimų nenustatyta, o morfologiniame - pastebėta nežymi neregeneruojanti anemija. Šlapimo tyrimas parodė, jog yra bakteriurija ir piurija. Echoskopuojant šuns pilvo sritį, pastebėta pakitusi prostatos echostruktūra ir buvo paimtas prostatos aspiratas bakteriologiniam tyrimui. Nustatyta, kad prostatos infekciją sukėlė

Streptococcus spp. bakterijos, kurios yra jautrios enrofloksacinui.

Autorių nuomone, iškastruotas šuo susirgo prostatitu, nes kastracija sumažino su cinku susijusių proteinų kiekį, kurie veikia kaip antibakterinis faktorius.

Buvo gydomas prostatitu sirgęs suaugęs 8 metų Labradorų veislės patinas, neturėjęs kontakto su patelėmis. Patinas jautė kaudalinės pilvo srities skausmą ir buvo matoma apyvarpės edema, kirkšnies limfinių mazgų padidėjimas. Šuo 3 mėnesius nesėkmingai gydytas sulfanamidais, NVNU, furozemidu ir kortikosteroidais. Morfologiniame kraujo tyrime pastebėta leukocitozė, o biocheminiame - pakilusi urėja, kreatininas, šarminė fosfatazė. Urinalizė parodė hematuriją, proteinuriją ir piuriją. Rentgeninis ir ultragarsinis tyrimai parodė, jog prostata padidėjusi, pakitusi struktūra. Šuo gydytas enrofloksacinu (10 mg/kg/24 val.) per os ir tamoksifenu (1 mg/kg/24 val.) per os 15 dienų iš eilės. Vėliau tamoksifenas buvo pakeistas finasteridu (5 mg/kg/24 val.) per os, kuriuo dar buvo gydomas 15 dienų iš eilės. Šuo po 30 dienų visiškai pasveiko.

Mokslininkai teigė, kad apyvarpės edemą sukėlė padidėjusių limfinių mazgų sukelta kraujagyslių kompresija, o oportunistinės bakterijos tapo patogeninėmis dėl joms palankių sąlygų, kai šuns apsauginis organizmo barjeras nusilpo. Tyrimas padėjo išsiaiškinti, kad prostatitą, apyvarpės uždegimą sukėlė iš šlaplės patekusios bakterijos. Europoje išskiriami šie mikroorganizmai: Mycoplasma, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Proteus mirabilis ir Pseudomonas spp. Nustatyta, kad

Pseudomonas spp. bakterijos nėra vienodos savo populiacijoje ir skiriasi serotipu (24, 25).

17

Balanopostatitą sukelia oportunistinės bakterijos ir virusai. Šios bakterijos gali būti dalis natūralios apyvarpės mikrofloros. Kitos balanopostatito priežastys: konkurencinis cistitas, uretritas, prostatitas, trauma, bakterinis sepsis, susilpnėjusi gleivinės imuninė apsauga, atopinis dermatitas, savęs žalojimas dėl elgsenos sutrikimo ir, retais atvejais, šunų Herpes virusai, blastomicetai (30, 31). Lengvo laipsnio apyvarpės gleivinės uždegimas gali išsivystyti į patologinį, kai pasireiškia gleivinės eritema, hiperemija su kazeozine plėvele (30).

J. Berezovsky (30) moksliniame tyrime nustatė, kad šunų apyvarpės pH nesusijęs su šunų amžiumi. Dauguma tiriamųjų buvo 4 metų.

1.5. Nevaisingumo problema

Šunų veisimas – svarbus pajamų šaltinis daugelyje pasaulio valstybių. Patinų nevaisingumas gali būti įgimtas ir įgytas. Tik 10 proc. pasveikusių nevaisingų patinų lieka vaisingi (26, 27).

Tyrime buvo išanalizuotas šuns nevaisingumo atvejis. 3,5 metų Kaukazo aviganių veislės patinas tapo nevaisingas dėl E. coli sukeltos lėtinės lytinės sistemos infekcijos. Dėl infekcijos sumažėjo spermatozoidų judrumas, aktyvumas, padidėjo mirusių spermatozoidų ir jų struktūros defektų kiekis. Leukospermija, bakterispermija ir spermatozoidų pakitimai lėmė šuns įgytą nevaisingumą. Šuo visiškai pasveiko ir tapo vaisingas po 4 savaičių ciprofloksacino (15 mg/kg kas 12 h per os 2 kartus per dieną) terapijos kurso (26-29).

A. Fontbonne (27) teigia, kad šunų infekcines ligas ir nevaisingumą dažniausiai sukelia aerobiniai mikroorganizmai: Streptococcus spp., E. coli, Pasteurella multocida, Staphylococcus spp., Proteus spp.,

Corynebacterium spp. Kiek rečiau gali būti išskirtos P. aeruginosa bakterijos iš mikrobiologinio

apyvarpės mėginio.

Pagal J. Berezovsky dažniausiai gydyti lytinės sistemos ligas patinams naudojamos šios antimikrobinės medžiagos: danoflokascinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi, kloksacilinas, amoksicilinas ir ceftiofuras. Autorius teigia, kad patinų ir patelių, gyvenančių toje pačioje aplinkoje, aerobinės bakterijos lytinėje sistemoje yra panašios, lyginant patinų apyvarpės ir patelių lytinės sistemos mikroflorą (30).

1.6. Oportunistinių bakterijų, gyvūnų ir aplinkos sąveika

18

Bakterijų savybės:

1. Mikroorganizmo kategorija, genotipas, virulentiškumas.

2. Gebėjimas išgyventi aplinkoje bei apsisaugoti nuo šeimininko apsaugos mechanizmų. 3. Bakterijos įsiskverbimo kelias į šeimininką.

4. Audinių tropizmas. 5. Infekcinės dozės dydis. 6. Vektorių poreikis.

Aplinkos ir valdymo faktoriai:

1. Gyvenimo kokybė ir tinkamas aplinkos dydis. 2. Ventiliacijos ir drėgnumo lygiai.

3. Higiena.

4. Maisto kokybė.

5. Išoriniai klimato veiksniai.

6. Pasireiškusios arba nepasireiškusios ligos kontrolės programa. Jautraus bakterijoms gyvūno savybės:

1. Gyvūno rūšis, veislė, amžius, lytis bei genotipas. 2. Imuniteto stiprumas.

3. Fiziologinis statusas.

4. Odos ir gleivinės būklė (17).

1.7. Oportunistinių bakterijų antimikrobinis jautrumas

Oportunistinių patogenų antimikrobinis atsparumas – didžiulė pasaulinė problema ir iššūkis žmonių bei veterinarijos medicinoje. Europos ligų prevencijos ir kontrolės centras apskaičiavo, kad apie 4,1 mln. pacientų kiekvienais metais yra gydomi nuo infekcinių ligų (12).

Su visuomenės sveikata susijusios oportunistinės bakterijos yra meticilinui atsparūs

Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pseudintermedius. Taip pat plataus spektro laktamazes

19

Bakterijos atsparios aminoglikozidams, fluorochinolonams, β - laktaminiams antibiotikams ir karbapenemams (34-37).

Mokslininkai nustatė, kad šunų veislynuose padaugėjo meticilinui atsparių, koaguliazei teigiamų

Staphylococcus spp. Tyrimas atliktas 3-uose veislynuose, kurie suskirstyti į 3 grupes pagal

antimikrobinių medžiagų naudojamą kiekį. Buvo paimti makšties ir pieno bakteriologiniai mėginiai iš 87 sveikų kalių pogimdyminiu laikotarpiu ir iš 27 šuniukų, kurie žuvo per pirmąsias dvi savaites, daugelio organų. Bakteriologinio tyrimo metu išskirtos S. pseudintermedius bakterijos. Buvo ištirtas bakterijų jautrumas oksacilinui. Tyrimo rezultatai patvirtino, kad neracionalus, intensyvus antibiotikų naudojimas sukelia riziką atsirasti meticilinui atspariems Staphylococcus spp. Taip pat gauti duomenys parodė, kad sveikų kalių mikroflora veislynuose gali būti kaip atsparaus antibiotikui geno rezervuaras. Taip pat ir patinai gali būti bakterijų rezervuaras ir pernešti bakterinę mikroflorą į patelės lytinę sistemą poravimosi metu (23).

Kitame moksliniame tyrime Ohajuje, JAV, buvo stebimi 435 šunys. MASA kolonizacija buvo identifikuota 5,7 proc. (n=25) iš visų tiriamų šunų. Vienas iš augintinių turėjo aktyvią MASA infekciją (n=1), o kiti šunys buvo sveiki (n=4) arba sirgo ligomis, nesusijusiomis su MASA (n=20) (13). Meticilinui atsparių stafilakokų infekcija gyvūnams, ypatingai šunims, paplitusi daugelyje valstybių. Dažniausiai pasitaiko žaizdų, operacinės vietos ir šlapimo sistemos infekcijos (20).

Mokslininkai, išskyrę Enterococcus spp., nustatė, kad bakterijos yra atpariausios eritromicinui (44,2 proc.), oksitetraciklinui (44,2 proc.), linkomicinui (41,6 proc.), gentamicinui (31,2 proc.) ir kanamicinui (31,2 proc.). Bakterijos jautrios enrofloksacinui ir ampicilinui (44).

In vitro antimikrobinis jautrumas buvo nustatytas bakterijoms, išskirtoms iš šunų apyvarpės.

Antimikrobiniam jautrumui nustatyti buvo pasirinkti šie preparatai: danofloksacinas, rifaksiminas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi, kloksacilinas, amoksicilinas, penicilinas, eritromicinas, streptomicinas, ceftiofuras. Tyrimas atliktas diskų difuzijos metodu ant Mueller Hinton agaro. Antimikrobinio jautrumo testas parodė, kad ceftiofuras, rifaksiminas ir amoksicilinas su klavulano rūgštimi gali būti naudojami esant apyvarpės ir reprodukcijos sistemos infekcijų gydyme, kurias sukelia

Staphylococcus spp., E. coli, Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Bacillus spp. bakterijos (4).

20

(1-oje grupėje – 35, o 2-oje grupėje – 33 šunys) , kurios sirgo nekomplikuota ŠTI. Šunų sveikata buvo įvertinta po 7 dienų antibiotikų naudojimo kurso. Pirmoje grupėje pasveiko 77,1 proc. šunų, o antroje – 81,2 proc. Klinikinių simptomų nerodė 88,6 proc. ir 87,9 proc. (22).

21

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

2.1. Tyrimo organizavimas

Tyrimo mėginiai buvo paimti iš atsitiktinai atrinktų sveikų šunų apyvarpės „X“ veislyne, ,,Y“ gyvūnų prieglaudoje ir iš šunų, gyvenančių kartu su šeimininkais namuose. Paimti mėginiai per 24 val. nuo mėginių paėmimo ištirti LSMU VA Patobiologijos katedroje 2018.09.01 – 2019.10.01 laikotarpiu. Tyrimo eiga pateikta atrame pavyzdyje (2 pav.):

22

2.2. Tiriamųjų grupių sudarymas

Moksliniame tyrime buvo sudarytos 3 sveikų šunų tiriamosios grupės, atsižvelgiant į jų laikymo sąlygas: patinai, laikomi ,,X“ veislyne, patinai, laikomi „Y“ gyvūnų prieglaudoje, patinai, laikomi namuose kartu su šeimininkais. Iš viso per 2018-2019 metus buvo ištirta 60 sveikų šunų, kurie laikomi skirtingomis sąlygomis, po 20 apyvarpės mėginių iš kiekvienos šunų grupės.

Prieš paimant šunų apyvarpės mėginius, apie kiekvieną tiriamąjį buvo pildoma anketa (1 priedas). Informacija buvo renkama apie šuns veislę, amžių, kontaktą su kitais gyvūnais, reprodukcinės sistemos būklę (kastruotas/nekastruotas). Didelis dėmesys buvo kreipiamas į tai, ar gyvūnui per mėnesį buvo naudotos antimikrobinės medžiagos. Taip pat buvo atlikta išsami bendroji klinikinė apžiūra, norint įvertinti gyvūno sveikatos būklę.

2.3. Mėginių paėmimas iš sveikų šunų apyvarpės

Mėginio paėmimui iš šuns apyvarpės buvo naudotos TRANSWAB („Amies“, „Liofilchem“, Italija) transportinės terpės. Patinas buvo paguldomas ant nugaros (ventrodorsalinė padėtis). Šunį fiksavo gyvūnų prieglaudos, veislyno darbuotojai arba gyvūno šeimininkas. Šuns varpa išversta į išorę, ir nuo apyvarpės sukamaisiais švelniais judesiais per 15 sek. paimtas apyvarpės mikrobiologinis mėginys. Visi mėginiai buvo laikomi šaldytuve +4 °C temperatūroje ir ne vėliau kaip per 24 val. pristatomi į LSMU VA Mikrobiologijos laboratoriją. Magistrinio darbo tyrimas atliktas vadovaujantis Lietuvos Respublikos veterinarijos įstatymu (Žin., 2010-12-18, Nr. 148-7563), Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymu (Žin., 1997-11-28, Nr. 108-2728) (42, 43).

2.4. Bakteriologinio tyrimo eiga

23

2.5. Bakterijų identifikavimas, remiantis jų biocheminėmis – antigeninėmis

savybėmis

E. coli identifikacijai šunų apyvarpės mėginys buvo sėjamas ant E.M.B. (eozino – metileno

mėlynojo) Levino agaro („Liofilchem“, Italija) +37 °C temperatūroje 24 val. Šioms bakterijoms būdinga laktozės fermentacija, o Levino agare kolonijoms būdingas metalinis blizgesys. E. coli produkuoja fermentą β-D-gliukoronidazę, todėl, pasėjus bakterijas ant TBX agaro („Biolife“, Italija) +37 °C temperatūroje 24 val., jos išauga mėlynai žalios spalvos kolonijomis. Šioms bakterijoms būdingas judrumas, ir išskiria indolą SIM terpėje („Liofilchem“, Italija). E. coli auga difuziškai nuo pasėjimo zonos. Drumstumas aplink bakterijų pasėjimo zoną parodo, kad judrumo testas - teigiamas. Užlašinus Kovačo reagento, susidaro raudonos spalvos indolo žiedas, kuris parodo, kad bakterijoms būdinga triptofanazės gamyba. E. coli ureazės negamina, todėl ureazės testas („Oxoid“, Italija) 37 °C temperatūroje per 24 val – neigiamas.

Stafilakokai – gramteigiamos kokinės formos bakterijos buvo sėjamos ant manito druskos agaro +37 °C temperatūroje 48 val. Koaguliazei teigiami manitolį fermentuojantys stafilokokai pakeičia agaro spalvą nuo rožinės iki geltonos spalvos dėl pH pasikeitimo. Katalazės testas, panaudojus 3 proc. vandenilio peroksidą, buvo atliktas, siekiant įvertinti, ar gramteigiami kokai yra katalazei teigiami stafilokokai, ar katalazei neigiami streptokokai. Greitasis oksidazės testas juostele - Oxidase Test Stick (Liofilchem, Italy) – buvo naudojamas atskirti oksidazei neigiamus stafilokokus nuo oksidazei teigiamų mikrokokų. Taip pat buvo nustatoma fermento β-galaktozidazės produkcija O.N.P.G. greituoju testu (Liofilchelm, Italy), siekiant atskirti S. aureus nuo S. pseudintermedius. Stafilakokų kultūra, pasėta į terpę su O.N.P.G. (orto-nitrofenyl-β-D-galaktopyranozidas), inkubuojama +37 °C temperatūroje 24 val. Stafilokokai, kurie išskiria β-galaktozidazę, pakeičia terpę į geltoną spalvą dėl O.N.P.G hidrolizės. Jei mikroorganizmai neturi šio fermento, terpė išlieka bespalvė. S. aureus ir S. pseudintermedius išskiria α- ir β- hemolizinus, todėl kraujo agare šios rūšies bakterijoms būdinga „dviguba“ hemolizės zona.

S. pseudintermedius reakcija manito druskos agare („Liofilchem“, Italija) yra silpna, todėl

būdingas nežymus terpės spalvos pasikeitimas į gelsvą. Bakterija gamina β-gakaktozidazę, todėl hidrolizuodamas O.N.P.G. terpės spalvą pakeičia į geltoną.

S. aureus reakcija manito druskos agare teigiama. Manito druskos agaras ryškiai pasikeičia nuo

24

Siekiant atskirti gramteigiamus grandinėle išsidėsčiusius Streptococcus spp. nuo Staphylococcus spp., buvo atliktas katalazės testas, panaudojus 3 proc. vandenilio peroksido tirpalą (H2O2).

Streptokokai - katalazei neigiami mikroorganizmai. Taip pat šios bakterijos ant kraujo agaro sukelia pilną arba dalinę hemolizę. „Streptococcal Grouping Kit“ (Liofilchem, Italija) buvo naudotas D grupės streptokokų nustatymui. Taip pat naudota selektyvinė terpė, Kanamicino eskulino azido agaras („Oxoid“, Anglija), kuriame D grupės streptokokai skaido eskuliną ir auga juodos spalvos kolonijomis. PYR (pirolidonilio aminopeptidazės) testas buvo atliktas identifikuoti D grupės E. faecalis (Liofilchem, Italija). Šis greitasis testas parodo pirolidonilio aminopeptidazės aktyvumą. Teigiamu atveju matoma raudonos spalvos reakcija. Raudonojo fenolio sultinyje mėginys su E. faecalis pakeičia spalvą iš raudonos į geltoną, o mėginyje su E. faecium sultinio spalva nepakinta, nes E. faecalis sorbitolį skaido, o E. faecium neskaido.

Gramneigiamų lazdelių Pseudomonas aeroginosa išskyrimui ir identifikavimui naudojamas

Pseudomonų cetrimido agaras („Oxoid“, Italija). Bakterijos išskiria vandenyje tirpius pigmentus:

piocianiną, pioverdiną, piorubiną, piomelaniną. Pioverdinas jungiasi su piocianinu ir agaro paviršiuje susidaro kolonijoms būdinga mėlynai žalia spalva. Pseudomonas aeroginosa kolonijoms būdingas vaisių kvapas, nes bakterijos išskiria trimetilaminą. Mitybinės terpės paviršius pakinta į melsvai žalią spalvą ir mėsos peptono agare. Bakterijos oksidazei ir katalazei – teigiamos.

Mikroskopuojant jaunas Bacillus spp. kultūras, tepinėliuose, dažytuose Gramo būdu, matomos gramteigiamos, sporas formuojančios didelės lazdelinės bakterijos. Taip pat šiems mikroorganizmams būdingas gramneigiamų bakterijų nusidažymas raudona spalva dėl jų sporų. Bacilos 5 proc. kraujo agare pasižymi plačia hemolizės zona. Daugelis rūšių gerai auga ant mėsos peptono agaro.

Gramneigiamos lazdelinės arba kokobacilinės formos Pasteurella multocida neauga ant MacConkey agaro ir yra oksidazei teigiamos (enterobakterijos neigiamos) ir katalazei teigiamos. Ant kraujo agaro pilkšvos vidutinio dydžio bakterijų kolonijos nesukelia hemolizės ir turi specifinį saldų kvapą. SIM terpėje būdinga indolo gamyba, ir susidaro raudonos spalvos žiedas, užlašinus Kovačo reagento. Tiriamieji mėginiai sėjami ant nuožulnios TSI terpės. Terpė pageltonuoja dėl gliukozės ir sacharozės fermentacijos, tačiau nepajuoduoja, nes neišskiriamas vandenilio sulfidas.

Proteus spp. būdingas šliaužimas ant kraujo agaro. Rūšies identifikavimui naudojama SIM terpė

25 P. mirabilis - judrios bakterijos, kurios SIM terpėje nesudaro indolo žiedo. Išskiria vandenilio

sulfidą, todėl terpė pajuoduoja. Bakterijos ureazei – teigiamos.

P. vulgaris - taip pat judrios bakterijos. Išskiria vandenilio sulfidą ir negamina indolo (SIM terpėje nesusidaro raudonos spalvos indolo žiedas). Bakterijos ureazei teigiamos.

2.6. Bakterijų antimikrobinio jautrumo tyrimas ,,Kirby – Bauer” diskų difuzijos

metodu

Kelios bakterijų kolonijos, išaugusios ant mėsos peptono agaro, pernešamos sterilia kilpele į mėgintuvėlį su 0,9 proc. NaCl tirpalu. Tirpalo optinis tankis su bakterijų kolonijomis turi pasiekti 0,5 McFarland‘o vienetus. Optinis tankis nustatomas prietaisu „DEN-1“ (,,Biosan“, Latvija). Tirpalas su bakterijomis steriliai paskirstomas ant Mueller Hinton II agarų (,,Oxoid“, Anglija) sterilia vienkartine kilpele. Į Petri lėkšteles su paskleistomis bakterijomis dedami skirtingais antibiotikais impregnuoti diskai. Difuziniai diskai dedami ne arčiau kaip 24 mm nuo diskų centrų. Tyrime buvo naudojami šie antimikrobinėmis medžiagomis impregnuoti diskai (,,Oxoid“, Anglija ir ,,Roseto“, Italija): amoksicilinas su klavulano rūgštimi (AMC, 20 μg + 10 μg), gentamicinas (CN, 10 μg), enrofloksacinas (ENR, 5 μg), trimetoprimas (TM, 5 μg), oksacilinas (OX, 5 μg), cefoperazonas (CPP, 30 μg), penicilinas (P, 10 μg), kurie yra dažnai naudojami veterinarinės medicinos praktikoje. Pseudomonas aeruginosa bakterijoms būdingas įgimtas atsparumas penicilinų grupės antibiotikams. Dėl šios priežasties šių bakterijų antimikrobinio jautrumo tyrimas netaikytas amoksicilinui su klavulano rūgštimi, penicilinui ir oksacilinui.

Petri lėkštelės su antimikrobinėmis medžiagomis impregnuotais diskais kultivuojamos termostate aerobinėmis sąlygomis +35,0±1 °C temperatūroje 20 val. Atsparumo zonos matuojamos automatiniu – elektriniu matuokliu. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms įvertinamas pagal bakterijų augimo zonos skersmenį milimetrais, remiantis EUCAST standarto (versija 9.0, 2019-01-01) rekomendacijomis.

26

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Iš šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės išskirtos bakterijos

1 pav. Bendras išskirtų bakterijų procentas

Atlikus tyrimą, nustatyta, jog iš paimtų mėginių daugiausiai išaugo E. coli ir S. pseudintermedius, o mažiausiai - E. faecalis. (1 pav.).

27

Išskyrus bakterijas iš veislyne laikomų šunų apyvarpės, nustatyta, kad vyravo E. coli, S.

pseudintermedius ir P. vulgaris. Taip pat išskirta E. faecalis, P. mirabilis ir P. multocida (2 pav.).

3 pav. Bakterijos, išskirtos iš namuose laikomų šunų apyvarpės

Atlikus tyrimą, nustatyta, jog namuose laikomų šunų apyvarpėje vyravo E. coli ir S.

pseudintermedius. Taip pat išskirta ir P. mirabilis bakterijų (3 pav.).

4 pav. Bakterijos, išskirtos iš gyvūnų prieglaudoje laikomų šunų apyvarpės

Nustatyta, kad iš gyvūnų prieglaudoje laikomų šunų apyvarpės daugiausiai išskirta E. coli, o mažiausiai E. faecalis bakterijų (4 pav.).

28

5 pav. Šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės išskirtų bakterijų palyginimas

Atlikus tyrimą ir palyginus išskirtas bakterijas iš patinų apyvarpės tarp skirtingomis sąlygomis laikomų šunų, nustatyta, jog bakterijų įvairovė skirtingose grupėse yra panaši. Taip pat pastebėta, kad P.

aeruginosa išaugo tik iš gyvūnų prieglaudoje laikomų šunų apyvarpės mėginių ir vyravo E. coli. Iš

namuose laikomų šunų apyvarpės mėginių neišskirtos E. faecalis bakterijos, kurios buvo rastos kitose grupėse, o šioje vyravo E. coli bei S. pseudintermedius. Iš veislyne paimtų apyvarpės mėginių neišaugo

S. aureus, priešingai nei kitose grupėse, tuo tarpu šioje grupėje vyravo E. coli, P. vulgaris ir S. pseudintermedius. Gauti rezultatai yra statistiškai patikimi (p<0,05) (5 pav.).

29

3.2. Iš kastruotų ir nekastruotų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis,

apyvarpės išskirtos bakterijos

6 pav. Kastruotų ir nekastruotų šunų procentinis pasiskirstymas skirtingose grupėse pagal laikymo

sąlygas

Atlikus tyrimą, nustatyta, kad visose trijose grupėse daugiausiai buvo nekastruotų šunų. Didžioji dalis kastruotų patinų buvo laikomi namuose, o veislyne tokių šunų visai nebuvo (6 pav.).

7 pav. Bakterijos, išskirtos iš veislyne laikomų nekastruotų šunų apyvarpės

Nustatyta, jog iš nekastruotų šunų, kurie laikomi veislyne, apyvarpės daugiausiai išskirta E. coli,

S. pseudintermedius ir P. vulgaris. Taip pat buvo aptikta E. faecalis, P. mirabilis ir P. multocida (7 pav.).

10% 40% 100% 90% 60% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

Veislynas Gyvūnų prieglauda Namuose laikomi šunys

30

8 pav. Bakterijos, išskirtos iš namuose laikomų nekastruotų šunų apyvarpės

Ištyrus bakterijas iš nekastruotų šunų, kurie laikomi namuose, apyvarpės, nustatyta, jog vyravo

E. coli ir S. pseudintermedius. Mažiausiai išskirta P. mirabilis (8 pav.).

9 pav. Bakterijos, išskirtos iš gyvūnų prieglaudoje laikomų nekastruotų šunų apyvarpės

Atlikus tyrimą, nustatyta, jog iš nekastruotų šunų, kurie laikomi namuose, apyvarpės vyravo E.

coli, o mažiausias procentas buvo E. faecalis, P. mirabilis, P. multocida ir S. aureus (9 pav.).

31

10 pav. Bakterijos, išskirtos iš namuose laikomų kastruotų šunų apyvarpės

Nustatyta, kad iš namuose laikomų kastruotų šunų apyvarpės, daugiausiai išskirta E. coli ir S.

pseudintermedius bakterijų, o mažiausiai – P. multocida (10 pav.).

11 pav. Bakterijos, išskirtos iš gyvūnų prieglaudoje laikomų kastruotų šunų apyvarpės

Atlikus tyrimą, nustatyta, jog iš gyvūnų prieglaudoje laikomų kastruotų šunų apyvarpės ištirtų mėginių didžioji dalis sudarė E. coli. Mažiausias procentas išskirtas P. aeruginosa, P. mirabilis ir P.

32

12 pav. Nekastruotų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės bakterijų palyginimas Atlikus tyrimą ir palyginus išskirtas bakterijas iš nekastruotų patinų apyvarpės tarp skirtingomis sąlygomis laikomų šunų, nustatyta, jog mikroorganizmų įvairovė yra panaši, skiriasi tik nedidelė dalis bakterijų. Gyvūnų prieglaudoje vyravo E. coli, taip pat šioje vienintelėje grupėje buvo išskirtas P.

aeruginosa ir S. aureus. Iš namuose laikomų šunų apyvarpės mėginių neišaugo Bacillus spp., priešingai

nei kitose grupėse. Taip pat daugiausiai buvo E. coli ir S. pseudintermedius rūšies bakterijų. Iš veislyne laikomų šunų apyvarpės mėginių didžioji dalis išaugo E. coli, P. vulgaris ir S. pseudintermedius. Gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05) (12 pav.).

13 pav. Kastruotų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, bakterijų, palyginimas

Tyrimo metu, palyginus išskirtas bakterijas iš kastruotų patinų apyvarpės tarp skirtingomis sąlygomis laikomų šunų, nustatyta, jog mikroorganizmų įvairovė yra panaši, skiriasi tik nedidelė dalis

10.0% 10.0% 9.1% 15.0% 27.3% 25.0% 40.0% 10.00% 4.5% 5.0% 5.0% 4.5% 10.0% 5.0% 22.7% 10.0% 27.3% 25.0% 20.0% 5.0% 4.5% 5.0% 0% 20% 40% 60% 80% 100% Veislynas Namuose laikomi šunys Gyvūnų prieglauda Proc. La ik ymo v ie ta Bacillus spp. Bakterijos neišaugo E. coli P. aeruginosa P. mirabilis P. multocida P. vulgaris S. pseudintermedius S. aureus 11.1% 16.7% 22.2% 41.7% 8.3% 8.3% 5.6% 8.3% 11.1% 22.2% 16.7% 11.1% 16.7% 0% 20% 40% 60% 80% 100%

33

bakterijų. Kadangi veislyne nebuvo kastruotų šunų, buvo lyginamos dvi grupės. Tik iš gyvūnų prieglaudoje laikomų šunų apyvarpės mėginių išaugo P. aeruginosa, o joje vyravo E. coli. Iš namuose laikomų šunų apyvarpės mėginių išskirta Bacillus spp. ir P. vulgaris bakterijų, priešingai nei kitoje grupėje. Šioje grupėje daugiausiai rasta E. coli ir S. pseudintermedius. Gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05) (13 pav.).

3.3. Šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės bakterijų

pasiskirstymas pagal amžiaus grupes

14 pav. Šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, pasiskirstymas pagal amžiaus grupes

Atlikus tyrimą, išsiaiškinta, jog, suskirsčius tiriamuosius į penkias skirtingas amžiaus grupes, daugiausiai patinų iš veislyno buvo iki metų amžiaus. Namuose laikomi šunys daugiausiai buvo 1-3 metų, o gyvūnų prieglaudoje – 3-6 metų amžiaus (14 pav.).

15 pav. Iki metų amžiaus skirtingomis sąlygomis laikomų šunų apyvarpės bakterijų pasiskirstymas 80% 20% 10% 40% 25% 20% 5% 5% 20% 35% 30% 10% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% ≤1 m. 1-3 m. 3-6 m. 6-9 m. >9 m. P ro c. Amžius Veislynas

34

Nustatyta, jog iš šunų iki metų amžiaus, laikomų gyvūnų prieglaudoje, apyvarpės, daugiausiai išskirta E. coli ir P. mirabilis. Namuose laikomų šunų apyvarpėje vyravo E. coli, o veislyne laikomų šunų iki metų amžiaus apyvarpėje - E. coli ir P. vulgaris. Gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05) (15 pav.).

16 pav. 1-3 metų amžiaus skirtingomis sąlygomis laikomų šunų apyvarpės bakterijų pasiskirstymas Ištyrus apyvarpės bakterijas iš 1-3 metų amžiaus šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, nustatyta, jog veislyne vyravo S. pseudintermedius. Namuose laikomų šunų apyvarpės mėginiuose daugiausiai rasta E. coli ir S. pseudintermedius, o gyvūnų prieglaudoje – E. coli. Gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05) (16 pav.).

17 pav. 3-6 metų amžiaus skirtingomis sąlygomis laikomų šunų apyvarpės bakterijų pasiskirstymas 12.5% 33.3% 25.0% 18.8% 50.0% 12.5% 6.3% 12.5% 66.7% 18.8% 25.0% 6.3% 12.5% 0% 20% 40% 60% 80% 100% Veislynas Namuose laikomi šunys Gyvūnų prieglauda Proc. La ik ymo v ie ta Bacillus spp. Bakterijos neišaugo E. coli P. aeruginosa P. multocida P. vulgaris S. pseudintermedius S. aureus 10.0% 8.3% 10.0% 20.0% 33.3% 8.3% 8.3% 10.0% 16.7% 10.0% 30.0% 16.7% 10.0% 8.3% 0% 20% 40% 60% 80% 100%

35

Nustatyta, jog iš 3-6 metų amžiaus patinų, kurie yra laikomi skirtingomis sąlygomis, apyvarpės mėginių, gyvūnų prieglaudoje daugiausiai išskirta E. coli, o namuose laikomų šunų apyvarpės mėginiuose vyravo S. pseudintermedius. Gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05) (17 pav.).

18 pav. 6-9 metų amžiaus skirtingomis sąlygomis laikomų šunų apyvarpės bakterijų pasiskirstymas Nustatyta, jog iš 6-9 metų amžiaus šunų, laikomų gyvūnų prieglaudoje, apyvarpės mėginių daugiausiai išskirta E. coli, o iš namuose laikomų patinų – S. pseudintermedius. Gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05) (18 pav.).

19 pav. Vyresnių nei 9 metų amžiaus skirtingomis sąlygomis laikomų šunų apyvarpės bakterijų

pasiskirstymas

Ištyrus apyvarpės bakterijas iš vyresnių nei 9 metų šunų, nustatyta, kad gyvūnų prieglaudoje vyravo E. coli ir S. pseudintermedius, o patinų, laikomų namuose – P. multocida ir S. pseudintermedius. Gauti rezultatai statistiškai nepatikimi (p>0,05) (19 pav.).

16.7% 12.5% 16.7% 16.7% 37.5% 12.5% 12.5% 16.7% 33.3% 12.5% 12.5% 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Namuose laikomi šunys Gyvūnų prieglauda Proc. La ik ymo v ie ta Bacillus spp. Bakterijos neišaugo E. coli P. aeruginosa P. mirabilis P. vulgaris S. pseudintermedius S. aureus 50.00% 50.0% 50.0% 50.0% 0% 20% 40% 60% 80% 100%

36

3.4. Šunų apyvarpės dažniausiai išskiriamų bakterijų jautrumas

antibiotikams

20 pav. Pasteurella multocida atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Remiantis gautais tyrimo rezultatais, nustatyta, kad iš sveikų šunų apyvarpės mėginių išskirta P.

mirabilis atspariausia trimetoprimui. Jautriausia cefoperazonui ir gentamicinui, Gauti duomenys yra

statistiškai patikimi (p<0,05) (20 pav.).

21 pav. Escherichia coli atsparumas antimikrobinėms medžiagoms 20.0% 80.0% 100.0% 20.0% 80.0% 100.0% 20.0% 100.0% 100.0% 80.0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Amoksacilinas su klavulano rūgštimi

Enrofloksacinas Oksacilinas Gentamicinas Trimetoprimas Cefoperazonas Penicilinas Proc. A n ti m ik ro b in ė m ed ži aga Atsparu Jautru 35.0% 5.0% 30.0% 25.0% 70.0% 15.0% 50.0% 65.0% 95.0% 70.0% 75.0% 30.0% 85.0% 50.0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Amoksacilinas su klavulano rūgštimi

37

Remiantis gautais tyrimo duomenimis, nustatyta, kad iš šunų apyvarpės išskirtos E. coli atsparumas didžiausias trimetoprimui, penicilinui. Bakterijos jautriausios enrofloksacinui ir cefoperazonui. Tai parodo, kad esant ūmiai oportunistinei E. coli infekcijai, tikslinga skirti šias antimikrobines medžiagas: enrofloksaciną ir cefoperazoną. Gauti duomenys statistiškai patikimi (p<0,05) (21 pav.).

22 pav. Proteus vulgaris atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

22 pavyzdyje matome, jog iš sveikų šunų apyvarpės mėginių išskirtos Proteus vulgaris bakterijos atspariausios penicilinui, trimetoprimui ir amoksicilinui su klavulano rūgštimi. Bakterijos cefoperazonui, gentamicinui ir enrofloksacinui – jautriausios. Duomenys yra statistiškai patikimi (p<0,05) (22 pav.).

23 pav. Proteus mirabilis atsparumas antimikrobinėms medžiagoms 100.0% 25.0% 50.0% 25.0% 100.0% 25.0% 100.0% 75.00% 50.00% 75.00% 75.00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Amoksacilinas su klavulano rūgštimi

Enrofloksacinas Oksacilinas Gentamicinas Trimetoprimas Cefoperazonas Penicilinas Proc. A n ti m ik ro b in ė m ed ži aga Atsparu Jautru 75.0% 25.0% 75.0% 25.0% 75.0% 25.0% 100.0% 75.00% 25.00% 75.00% 75.00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Amoksacilinas su klavulano rūgštimi

38

Remiantis gautais tyrimo duomenimis, nustatyta, kad iš sveikų šunų apyvarpės mėginių išsskirtos

Proteus mirabilis bakterijos atspariausios penicilinui, trimetoprimui, oksacilinui ir amoksicilinui su

klavulano rūgštimi. Jautriausios cefoperazonui, gentamicinui ir enrofloksacinui. Duomenys yra statistiškai patikimi (p<0,05) (23 pav.).

24 pav. Pseudomonas aeruginosa atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Atlikus tyrimą, nustatyta, jog iš šunų apyvarpės išskirtas P. aeruginosa jautriausias cefoperazonui ir enrofloksacinui. Gauti duomenys statistiškai patikimi (p<0,05) (24 pav.).

25 pav. Staphylococcus pseudintermedius atsparumas antimikrobinėms medžiagoms 33.3% 100.0% 100.0% 66.7% 100.0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Enrofloksacinas Gentamicinas Trimetoprimas Cefoperazonas Proc. A n ti m ik ro b in ė m ed ži aga Atsparu Jautru 58.3% 33.3% 66.7% 25.0% 91.7% 8.3% 58.3% 41.7% 66.7% 33.3% 75.0% 91.7% 41.7% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Amoksacilinas su klavulano rūgštimi

39

25 pavyzdyje matome, jog iš sveikų šunų apyvarpės mėginių išskirtos S. pseudintermedius bakterijos atspariausios trimetoprimui. Jautriausios gentamicinui ir cefoperazonui. Gauti duomenys statistiškai patikimi (p<0,05) (25 pav.).

26 pav. Staphylococcus aureus atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Remiantis tyrimo duomenimis, gautais iš sveikų šunų apyvarpės mėginių, nustatyta, jog išskirtos

S. aureus bakterijos atspariausios trimetoprimui ir penicilinų grupės antibiotikams (penicilinui,

oksacilinui bei amoksacilinui su klavulano rūgštimi). Nusilpus gyvūno imunitetui, šios oportunistinės bakterijos gali tapti patogeniškomis, o tyrimo rezultatai parodė, kad S. aureus bakterijos jautriausios cefoperazonui, ir jis yra tinkamas, kovojant prieš šių bakterijų sukeltą infekciją. Gauti duomenys statistiškai patikimi (p<0,05) (26 pav.).

58.3% 33.3% 66.7% 25.0% 91.7% 8.3% 58.3% 41.7% 66.7% 33.3% 75.0% 91.7% 41.7% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Amoksacilinas su klavulano rūgštimi

40

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Atlikto tyrimo metu buvo ištirti kliniškai sveikų šunų apyvarpės mėginiai (n=60). Gauti rezultatai buvo lyginami tarpusavyje, atsižvelgiant į gyvūnų laikymo vietą: šunys, laikomi ,,X“ veislyne (n=20), šunys, laikomi ,,Y“ gyvūnų prieglaudoje ir šunys, gyvenantys namuose kartu su šeimininkais (n=20). Į palyginimą buvo įtraukta informacija apie tai, ar patinas kastruotas, ar nekastruotas. Taip pat atsižvelgta į gyvūnų amžių, pagal kurį gyvūnai buvo suskirstyti į 5 skirtingas grupes.

Panašūs rezultatai buvo gauti 2012 m. atliktame Sarito ir kitų mokslininkų tyrime Turkijoje. Iš 100 sveikų šunų apyvarpės mėginių daugiausiai išauginta Staphylococcus spp. - 36 proc. ir E. coli - 30 proc. (4). Remiantis gautais duomenimis, šios rūšies bakterijų daugiausiai buvo ir atliktame tyrime: E.

coli – 30,4 proc. bei S. pseudintermedius – 22,8 proc. Kitame moksliniame darbe A. Fontbonne teigia,

jog šunų infekcines ligas dažniausiai sukelia aerobiniai mikroorganizmai: Streptococcus spp., E. coli,

Pasteurella multocida, Staphylococcus spp., Proteus spp., Corynebacterium spp. Rečiau iš šunų

apyvarpės mėginių būna išskiriamos P. aeruginosa bakterijos (27). Pagal gautus rezultatus šios rūšies bakterijų identifikuota procentaliai mažai, lyginant su visa išskirta mikroflora (3,3 proc.).

Mikroflora, išskirta iš sveikų šunų apyvarpės, gali skirtis nuo gyvūno laikymo vietos (30). Atlikus tyrimą, paaiškėjo, kad ištirtų mėginių mikroflora yra panaši. Tačiau iš šunų, laikomų gyvūnų prieglaudoje, buvo išskirtos P. aeruginosa bakterijos, priešingai nei kitose grupėse, kuriose šių mikroorganizmų nebuvo. Bacillus spp. bakterijos neišaugo tik iš veislyne laikomų šunų apyvarpės mėginių. Taip pat veislyne gyvenančių šunų apyvarpės mėginiuose nebuvo rasta ir S. aureus bakterijų, kurios buvo aptiktos kitose grupėse. Dėl to galima teigti, kad paplitusių bakterijų įvairovė priklauso nuo gyvūno laikymo vietos, o gyvenant tomis pačiomis sąlygomis, mikroflora reikšmingai nesiskiria.

Viena iš bakterijų, kuri gali tapti patogeniška ir sukelti įvairias ligas – E. coli (9). Remiantis gautais tyrimo rezultatais, buvo pastebėta, kad daugiausiai E. coli (40,6 proc.) bakterijų identifikuota iš gyvūnų prieglaudoje laikomų šunų apyvarpės mėginių.

41

nekastruotas, buvo išsiaiškinta, jog kastracija neturi įtakos skirtingam bakterijų egzistavimui. Tiek kastruotų, tiek nekastruotų šunų apyvarpės mėginiuose vyravo E. coli ir S. pseudintermedius bakterijos. Šunų apyvarpės mikroflora yra panaši, tiek lyginant išskirtas šuns apyvarpės bakterijas pagal skirtingas gyvūnų laikymo sąlygas, tiek įtraukiant ir kastracijos faktorių.

Atlikus tyrimą, nustatyta, kad, kuo gyvūnas vyresnis, tuo labiau procentaliai kiekvienoje, pagal skirtingas laikymo sąlygas ir amžių grupėje, išskirtos Staphylococcus spp. bakterijos. Visose grupėse vyrauja E. coli rūšies bakterijos, ypač iki metų amžiaus šunų, kurie laikomi kambaryje, apyvarpėse. Vyresnių patinų apyvarpės mikroflora yra įvairesnė negu jaunesnių. Iki metų amžiaus šunų apyvarpės mėginiuose daugiausiai identifikuota E. coli, P. mirabilis ir P. vulgaris rūšies bakterijų. Nuo metų amžiaus ir vyresnių šunų apyvarpės mėginiuose daugiausiai nustatyta S. pseudintermedius bakterijų.

42

IŠVADOS

1. Sveikų šunų, kurie yra laikomi namuose kartu su šeimininkais, veislyne ir gyvūnų prieglaudoje, apyvarpėje vyravo Escherichia coli (30,4 proc.) ir Staphylococcus pseudintermedius (22,8 proc.) bakterijos.

2. Palyginus šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, išskirtą apyvarpės mikroflorą, pastebėta, kad

Pseudomonas aeruginosa bakterija vyravo tik gyvūnų prieglaudoje gyvenančių patinų

mėginiuose (9,4 proc.), o Escherichia coli bakterija šioje grupėje buvo paplitusi žymiai dažniau, lyginant su kitomis grupėmis (40,6 proc.).

3. Palyginus išskirtą apyvarpės mikroflorą iš šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, bei atsižvelgiant į skirtingas jų amžiaus grupes, pastebėta, kad vyresni šunys turi įvairesnių bakterijų nei jaunesni šunys. Iki metų amžiaus patinų apyvarpėje, lyginant su kitomis amžiaus grupėmis, daugiausiai identifikuota Escherichia coli rūšies bakterijų, vyresniems – Staphylococcus

pseudintermedius.

4. Palyginus kastruotų ir nekastruotų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, apyvarpės mėginius, nustatyta, jog vyraujanti mikroflora yra panaši.

5. Nustatyta, jog iš sveikų šunų apyvarpės mėginių identifikuotos bakterijos (Pasteurella multocida, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus aureus) buvo atspariausios penicilinui, trimetoprimui,

43

LITERATŪROS ŠALTINIAI

1. Evans HE, De Lahunta A. Miller's anatomy of the dog-E-Book. Elsevier Health Sciences; 2013. P. 385-395.

2. Kumar MS. Clinically oriented anatomy of the dog and cat. Linus Learning; 2015. P. 1994-1998. 3. Noakes DE, Parkinson TJ, England GC. Veterinary reproduction & obstetrics. Elsevier Health

Sciences; 2018. P. 599.

4. Saritas ZK, Konak S, Pamuk K, Korkmaz M, Cevik-Demirkan A, Civelek T. Identification and antimicrobial susceptibility of microorganisms isolated from the preputium of healthy dogs. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2012. 11(4):553-5.

5. Antonov A. Normal and Pathological Vaginal Microflora in the Bitch-A Review. Journal of Advances in Microbiology. 2019. 1-5.

6. Nelson RW, Couto CG. Small Animal Internal Medicine-E-Book. Elsevier Health Sciences; 2014. P. 957-958, 969-970.

7. Vela AI, Falsen E, Simarro I, Rollan E, Collins MD, Domínguez L, Fernandez-Garayzabal JF. Neonatal mortality in puppies due to bacteremia by Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae. Journal of clinical microbiology. 2006. 44(2):666-8.

8. Johnston, S.D., Root Kustritz, M.V., Olson, P.N.S., 2001: Canine and Feline Theriogenology. 1st ed. Saunders. Philadelphia, PA. P. 360-362, 293-296.

9. Stokholm J, Schjørring S, Pedersen L, Bischoff AL, Følsgaard N, Carson CG, Chawes B, Bønnelykke K, Mølgaard A, Krogfelt KA, Bisgaard H. Living with cat and dog increases vaginal colonization with E. coli in pregnant women. PLoS One. 2012. 7(9).

10. Van Duijkeren E, Kamphuis M, Van der Mije IC, Laarhoven LM, Duim B, Wagenaar JA, Houwers DJ. Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius between infected dogs and cats and contact pets, humans and the environment in households and veterinary clinics. Veterinary microbiology. 2011. 150(3-4):338-43.

44

12. Walther B, Tedin K, Lübke-Becker A. Multidrug-resistant opportunistic pathogens challenging veterinary infection control. Veterinary microbiology. 2017. 200:71-8.

13. Schaufler K, Bethe A, Lübke-Becker A, Ewers C, Kohn B, Wieler LH, Günther S. Putative connection between zoonotic multiresistant extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli in dog feces from a veterinary campus and clinical isolates from dogs. Infection ecology & epidemiology. 2015 Jan 1;5(1):25334. P. 4444-4454.

14. Müller S, Janssen T, Wieler LH. Multidrug resistant Acinetobacter baumannii in veterinary medicine–emergence of an underestimated pathogen. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2014. 127(11-12). P. 435-446.

15. Stull JW, Weese JS. Hospital-associated infections in small animal practice. Veterinary Clinics: Small Animal Practice. 2015. 45(2):217-33.

16. Wieler LH, Walther B, Vincze S, Guenther S, Lübke-Becker A. Infections With Multidrug-Resistant Bacteria—Has the Post-Antibiotic Era Arrived in Companion Animals? InZoonoses-Infections Affecting Humans and Animals 2015. Springer, Dordrecht. P. 433-452.

17. Quinn PJ, Markey BK, Leonard FC, Hartigan P, Fanning S, Fitzpatrick EI. Veterinary microbiology and microbial disease. John Wiley & Sons; 2011. P. 16-17, 179, 188, 207, 227, 263, 287, 300, 334, 373.

18. Cornelissen CN, Harvey RA, Fisher BD. Microbiology. Lippincott Williams & Wilkins; 2013. 19. McVey DS, Kennedy M, Chengappa M.M. Veterinary Microbiology 3rd edition. Wiley &

Blackwell. 2013. P. 4, 62, 101, 127, 148, 184, 194, 212, 596.

20. Markey B, Leonard F, Archambault M, Cullinane A, Maguire D. Clinical veterinary microbiology second edition. Elsevier Health Sciences; 2013. P. 105, 121, 135, 195, 239, 275, 423.

21. Bien J, Sokolova O, Bozko P. Role of uropathogenic Escherichia coli virulence factors in development of urinary tract infection and kidney damage. International journal of nephrology. 2012;2012.

22. Westropp JL, Sykes JE, Irom S, Daniels JB, Smith A, Keil D, Settje T, Wang Y, Chew DJ. Evaluation of the efficacy and safety of high dose short duration enrofloxacin treatment regimen for uncomplicated urinary tract infections in dogs. Journal of veterinary internal medicine. 2012. 26(3):506-12.

45

pseudintermedius from breeding dogs. Theriogenology. 2011. 75(1):115-21.

24. Serrano I, De Vos D, Santos JP, Bilocq F, Leitão A, Tavares L, Pirnay JP, Oliveira M. Antimicrobial resistance and genomic rep-PCR fingerprints of Pseudomonas aeruginosa strains from animals on the background of the global population structure. BMC veterinary research. 2016. 13(1):58.

25. Duque J, Macías-García B, Tapia PR, Ferrusola CO, Zaragoza C, Barrera R, et al. Two unusual cases of canine prostatitis: Prostatitis in a castrated dog and preputial oedema in an intact male. Reprod Domest Anim. 2010;45(5):199–200.

26. Oguejiofor CE. Sperm defects and infertility caused by bacterial infection of the reproductive tract in an adult male dog: A case report. Asian Pacific J Reprod. 2018;7(5):236–8

27. Fontbonne A. Infertility in male dogs: Recent advances. Rev Bras Reprod Anim 2011; 35(2): 266-273.

28. England GCW. Dog breeding, whelping and puppy care. West-Sussex, UK: Wiley-Blackwell; 2013.

29. Robert MA, Jayaprakash G, Pawshe M, Tamilmani T, Sathiyabarathi M. Collection and evaluation of canine semen- A review. Int JSci Environ Tech 2016; 5(3): 1586-1595.

30. Berezovsky J. Changes in the preputial pH values in canines and their relation to age, cytology and the occurrence of preputial discharge. 2015;33.

31. England GC, Heimendahl AV. BSAVA manual of canine and feline reproduction and neonatology. British Small Animal Veterinary Association; 2010: 197-198.

32. Graham EM, Taylor DJ. Bacterial Reproductive Pathogens of Cats and Dogs. Vet Clin North Am - Small Anim Pract. 2012;42(3):561–82.

33. Neihaus SA, Hathcock TL, Boothe DM, Goring RL. Presurgical antiseptic efficacy of chlorhexidine diacetate and providone-iodine in the canine preputial cavity. J Am Anim Hosp Assoc. 2011;47(6):406–12.

34. Gupta V, Bansal N, Chander J. Comparative in vitro evaluation of activity of tigecycline against susceptible and multidrug resistant organisms. Indian J Med Microbiol. 2012;30(4):483–5 35. Samanta P, Gautam V, Thapar R, Ray P. Emerging resistance of non-fermenting gram negative

bacilli in a tertiary care centre. Indian J Pathol Microbiol. 2011;54:666-7.

46

Laboratory Standards Institute; 2010.

37. Goel N, Wattal C, Oberoi JK, Raveendran R, Datta S, Prasad KJ. Trend analysis of antimicrobial consumption and development of resistance in non-fermenters in a tertiary care hospital in Delhi, India. J Antimicrob Chemother. 2011;66:1625-30.\

38. Global action plan on antimicrobial resistance. World health organization [Internet]. 2015 [cited: 2019 Nov 2]. Available from:

http://www.wpro.who.int/entity/drug_resistance/resources/global_action_plan_eng.pdf

39. Number of pet dogs in Lithuania from 2010 to 2018 (in 1000s) [Internet]. 2019 Jun. [cited: 2019 Nov 2]. Available from:

https://www.statista.com/statistics/515528/dog-population-europe-lithuania/

40. Burton EN, Cohn LA, Reinero CN, Rindt H, Moore SG, Ericsson AC. Characterization of the urinary microbiome in healthy dogs. Plos one. 2017. 12(5).

41. Bjurstrom L., Linde- Forsberg C. Long- term study of aerobic bacteria of the genital tract in stud dogs. American Journal of Veterinary Research. 1992 (b). Vol 53. P. 670–673.

42. XI-1189 Lietuvos Respublikos veterinarijos įstatymo pakeitimo įstatymas [Internetas]. Valstybės žinios; 2010. [žiūrėta 2019 m. rūgpjūčio 13 d.]. Prieiga per internetą:

https://e-seimas.lrs.lt/portal/legalAct/lt/TAD/TAIS.388228

43. VIII-500 Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymas [Internetas]. Valstybės žinios; 1997. [žiūrėta 2019 m. rūgpjūčio 13 d.]. Prieiga per internetą:

https://e-seimas.lrs.lt/portal/legalAct/lt/TAD/TAIS.46424/YTWcRBgbwM

44. Kataoka Y, Umino Y, Ochi H, Harada K, Sawada T. Antimicrobial susceptibility of enterococcal species isolated from antibiotic-treated dogs and cats. Journal of Veterinary Medical Science. 2014:13-0576.

45. Blair JM, Webber MA, Baylay AJ, Ogbolu DO, Piddock LJ. Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 2015. 32:42-51.

47

PRIEDAI