1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
RENALDA JUODŽENTYTĖ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS IR STAPHYLOCOCCUS
PSEUDINTERMEDIUS IŠSKYRIMAS IŠ GYVŪNŲ AUGINTINIŲ
IR JŲ SAVININKŲ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND STAPHYLOCOCCUS
PSEUDINTERMEDIUS ISOLATION FROM PETS AND THEIR
OWNERS
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. dr. Jūratė Šiugždaitė
Kaunas 2014
2
DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Koaguliazei teigiamų stafilokokų išskyrimas iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų“.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
3
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
4 TURINYS TURINYS ... 4 SANTRUMPOS... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY... 7 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Koaguliazei teigiami stafilokokai ... 11
1.2. Koaguliazei teigiamų stafilokokų paplitimas tarp gyvūnų augintinių ir jų savininkų ... 13
1.3. Koaguliazei teigiamų stafilokokų perdavimo mechanizmas tarp žmonių ir gyvūnų... 14
1.4. Mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms... 16
1.5. Veiksniai, turintys įtakos koaguliazei teigiamų stafilokokų tarprūšiniam perdavimui... 20
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 21
3. REZULTATAI ... 27
3.1.Mikroorganizmų išskyrimas iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų ... 27
3.2. Šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos mikrofloros tyrimas ... 27
3.3. Įvairių veiksnių įtaka šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos vyraujančios mikrofloros pasireiškimui ... 28
3.4. Gyvūnų augintinių savininkų nosies ertmės gleivinės mikrofloros tyrimas ... 30
3.5. Gyvūnų augintinių ir jų savininkų mikrofloros palyginimas ... 30
3.6. Įvairių veiksnių įtaka žmonių nosies ertmės vyraujančios mikrofloros pasireiškimui ... 31
3.7. Patogeninių stafilokokų nustatymas multiplex PGR metodu... 34
3.8. Mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas ... 35
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 39
IŠVADOS ... 42
5
SANTRUMPOS
MRSA – meticilinui atsparios Staphylococcus aureus padermės
MRSP – meticilinui atsparios Staphylococcus pseudintermedius padermės pav. – paveikslas
proc. – procentai
S. aureus - Staphylococcus aureus S. delphini - Staphylococcus delphini S. hyicus - Staphylococcus hyicus
S. intermedius - Staphylococcus intermedius S. lutrae - Staphylococcus lutrae
S. pseudintermedius – Staphylococcus pseudintermedius
6
SANTRAUKA
Darbo tema: „Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pseudintermedius išskyrimas iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų“. Tyrimai buvo atlikti 2012 – 2013 metais. Mėginiai buvo imami iš gyvūnų augintinių nosies ertmės ir tiesiosios žarnos bei jų savininkų nosies ertmės, tirti laboratorijoje. Darbo apimtis 47 puslapiai, jame pateikta 8 lentelės ir 12 paveikslų.
Šio darbo tikslas - Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pseudintermedius išskyrimas iš gyvūnų augintinių, jų savininkų ir antimikrobinių medžiagų atsparumo nustatymas.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti stafilokokus iš gyvūnų augintinių.
2. Išskirti stafilokokus iš gyvūnų augintinių savininkų. 3. Identifikuoti koaguliazei teigiamus stafilokokus.
4. Įvertinti įvairių veiksnių įtaka šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos mikroflorai. 5. Įvertinti įvairių veiksnių įtaka gyvūnų augintinių savininkų nosies ertmės mikroflorai. 6. Nustatyti atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Iš viso paimti 123 mėginiai, iš jų 82 mėginiai paimti iš šunų laikomų namuose ir lauke, ir 41 mėginys iš jų savininkų. Mėginiai mikrobiologiniam tyrimui buvo imami į transportines terpes TRANSWAB® (naudojama pernešimo terpė aerobams ir anaerobams išskirti (Amies, Liofilchem, Italija)).
Mikroorganizmų išskirta iš 37 (30,1 proc.) mėginių. Po vieną mikroorganizmų rūšį nustatyta 33 (89,1 proc.) mėginiuose. Po dvi mikroorganizmų rūšis (mišri infekcija), nustatyta 4 (10,9 proc.) mėginiuose.
Iš šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos paimto 41 mėginio mikroorganizmai buvo išskirti iš 27 (59,3 proc.). Staphylococcus pseudintermedius sudarė 32,4 proc. išskirtų mikroorganizmų,
Staphylococcus aureus – 12,2 proc., Bacillus spp. – 14,7 proc.
Iš šunų savinikų nosies ertmės paimto 41 mėginio mikroorganizmai buvo išskirti iš 16 (55,9 proc.) mėginių. Staphylococcus aureus sudarė 36,5 proc. išskirtų mikroorganizmų, Staphylococcus
7 Iš šunų dažniausiai buvo išskirta Staphylococcus pseudintermedius (32,4 proc.), o iš jų savininkų Staphylococcus aureus (36,5 proc.) ir Bacillus spp. – 17,0 proc.
Nustatyta, kad šunų nosies ir tiesiosios žarnos mikroflorai: Staphylococcus aureus bei
Staphylococcus pseudintermedius išskyrimui, įtakos turėjo – šunų veislė (53,7 proc. p<0,05) ir
sezonas (21,4 proc. p<0,05). Amžiaus įtaką, nustatėme tik Staphylococcus pseudintermedius (39,02 proc. p<0,05) išskyrimui.
Staphylococcus aureus išskyrimui, iš gyvūnų augintinių savininkų nosies ertmės, įtakos turėjo
– sezonas (70,0 proc. p<0,05) bei namuose laikomų šunų skaičius (41,5 proc. p<0,05).
Atsparumas antibiotikams buvo nustatytas pagal Kirby – Bauer metodą. Ištyrus išskirtų mikroorganizmų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, nustatyta, kad Staphylococcus aureus padermės, išskirtos iš šunų ir jų savininkų, atspariausios buvo ampicilinui (40,0 proc.), penicilinui (35,0 proc.). Staphylococcus pseudintermedius padermės, atspariausios buvo ampicilinui (82,4 proc.), penicilinui (82,4 proc.).
SUMMARY
The topic: „Staphylococcus aureus and Staphylococcus pseudintermedius isolation from pets and their owners“. Researches were carried out in 2012 - 2013 years. Samples were collected from dogs and their owners. Paper volume 47 pages, it contains 8 tables and 12 images.
The objective of the research: Staphylococcus aureus and Staphylococcus pseudintermedius isolation from a pet and their owners, and determine the resistance of isolates to antimicrobial agent.
Tasks of the research:
1. To isolate staphylococci from pet.
2. To isolate staphylococci from pet owners. 3. To identify coagulase-positive staphylococci.
4. Evaluate the influence of canine nasal and rectal flora. 5. Evaluate the influence of the pet owners nasal cavity flora. 6. To determine the resistance of isolates to antimicrobial agent.
41 samples of dogs and 41 from humans were investigated. Total take 123 samples, including 82 samples were taken from dogs kept in the home and outdoors, and 41 samples of their owners.
8 Samples for microbiological analysis were collected in transport medium TRANSWAB ® (used to transport medium for aerobes and anaerobes release (Amies, Liofilchem, Italy)).
Microorganisms were identified in 37 (30.1 percent.) samples. Single type of microorganisms were identified in 33 (89.1 percent) samples. Two types of microorganisms (mixed infection) were identified in 4 (10.9 percent) samples.
In dogs, nasal and rectal were taken 41 samples. Microorganisms were identified in 27 (59.3 percent) samples. Staphylococcus pseudintermedius accounted 32.4 percent of identified microorganisms, Staphylococcus aureus – 12.2 percent, Bacillus spp. – 14.7 percent.
Dogs owners nasal were taken 41 samples. Microorganisms were identified in 16 (55.9 percent) samples. Staphylococcus aureus accounted 36.5 percent of identified microorganisms,
Staphylococcus pseudintermedius – 2.4 percent, Bacillus spp. – 17.0 percent.
From dogs Staphylococcus pseudintermedius (32.4 percent), are identified mostly. From the owners Staphylococcus aureus (36.5 percent) and Bacillus spp. – 17.0 percent.
Researches showed that of dog nasal and rectal flora: Staphylococcus aureus and
Staphylococcus pseudintermedius excretion was influenced by - a breed of dog (53.7 percent.
p<0.05) and season (21.4 percent. p<0.05). Age influence found only in Staphylococcus
pseudintermedius (39.02 percent. p<0.05) excretion.
Staphylococcus aureus, the excretion from the nasal cavity of humans was influenced season
(70.0 percent. p<0.05) and the number of pet dogs (41.5 percent. p<0.05).
The antibiotic resistance tests were carried out according to the Kirby–Bauer method. Examination of isolates for antimicrobial resistance showed that the Staphylococcus aureus resistant to ampicillin (40.0 percent), penicillin (35.0 percent). Staphylococcus pseudintermedius padermės, atspariausios buvo ampicillin (82.4 percent.), penicillin (82.4 percent.).
9
ĮVADAS
Stafilokokai - vieni iš geriausiai žinomų ir dažniausiai aplinkoje sutinkamų bakterijų. Bakterijos gyvendamos ant odos, nosies gleivinės dažnai tėra normalios mikrofloros dalis ir nedaro jokios žalos. Tačiau tam tikrose situacijose jos gali sukelti įvairiausias infekcijas - nuo lengvų odos iki sudėtingų ir gyvybei pavojingų infekcijų. Literatūroje yra pateikiama, kad patogeninių stafilokokų padermės išskirtos iš šunų yra identiškos ar artimos išskirtoms padermėms pas žmones. Todėl stafilokokų išskyrimas yra aktualus tiek gyvūnams augintiniams, tiek ir jų savininkams (Blouin, 2008).
Artimas žmogaus ir gyvūnų bendravimas, gyvenimas vienose patalpose kelia pavojų plisti tarp augintinių ir jų savininkų įvairiems mikroorganizmams, ypač tokiems, kurie veisiasi ant šunų odos ar ant jų paviršinių gleivinių. Toks kontaktas tik dar labiau padidina šių mikroorganizmų plitimą tarp žmonių ir gyvūnų (Wieler et al., 2011).
Iš išskiriamų mikroorganizmų reikšmingi koaguliazei teigiami stafilokokai, svarbiausi iš jų
Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pseudintermedius. Juos galima vadinti zoonoziniais
sukėlėjais, kadangi yra nustatyta, kad S. aureus užsikrečia tiek žmonės, tiek gyvūnai. O S.
pseudintermedius dažniau aptinkamas pas smulkius gyvūnus, pvz.: pas šunis, kates ir rečiau pas
žmogų. Todėl galima teigti, kad jį žmogui perduoda gyvūnai arba laikinai gali platinti sveiki žmonės ir gyvūnai (Ruscher et al., 2009).
Dauguma atliktų tyrimų parodė, kad S. pseudintermedius yra labiausiai paplitusi koaguliazei teigiamų stafilokokų rūšis tarp šunų. Laiku nepastebėti užsikrėtę gyvūnai kelia grėsmę apkrėsti žmones ir taip didina tarprūšinį perdavimą (Rich, Roberts, 2004). S. aureus dažnai apsigyvena sveikų šunų kailyje. Tačiau teigiama, kad žmonės dažniau būna šio mikroorganizmo nešiotojai ir gali užkrėsti savo augintinius (Leonard, Markey, 2007).
S. aureus pirmiausia užteršia ar kolonizuoja rankas, o per rankas – patenka ant gleivinių.
Tokiu būdu medikai, veterinarijos gydytojai, gali tapti ilgalaikiais S. aureus nešiotojais. Pagrindinis smulkių gyvūnų, meticilinui atsparaus S. aureus (MRSA) infekcijos šaltinis – kontaktas su infekuotais žmonėmis ar nešiotojais. Šios infekcijos susijusios su odos ir minkštųjų audinių infekcija po chirurginių operacijų (Lloyd et al., 2007). Nustatyta, jog skirtingai negu S. aureus atveju, S. pseudintermedius žmonės užsikrečia gyvūnams įkandus ar bendraujant su jais. Dažniausiai S. pseudintermedius nustatytas žmonėms, kurie turėjo kontaktą su giliu pūliuotu odos uždegimu sergančiais šunimis (Devriese et al., 2009).
10 Platus ir dažnai nepagrįstas antibiotikų vartojimas sudaro antibiotikams atsparių mikroorganizmų padermių atsiradimą, kurios išplinta ne tik tarp žmonių, bet ir tarp mūsų augintinių (Woodford, 2005). Neracionaliai vartojant antibiotikus, stafilokokų padermės tampa atsparios antimikrobinėms medžiagoms, o ypač tada, kai antibiotikų dozė ar gydymo trukmė būna netinkamai parenkama (Loeffler et al., 2005).
Todėl prieš pasirenkant gydymui antibiotiką, pirmiausia reikia identifikuoti infekciją sukėlusį mikroorganizmą ir nustatyti jo jautrumą antimikrobinėms medžiagoms (Slatter, 2001).
Šio darbo tikslas - Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pseudintermedius išskyrimas iš gyvūnų augintinių, jų savininkų ir antimikrobinių medžiagų atsparumo nustatymas.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti stafilokokus iš gyvūnų augintinių.
2. Išskirti stafilokokus iš gyvūnų augintinių savininkų. 3. Identifikuoti koaguliazei teigiamus stafilokokus.
4. Įvertinti įvairių veiksnių įtaka šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos mikroflorai. 5. Įvertinti įvairių veiksnių įtaka gyvūnų augintinių savininkų nosies ertmės mikroflorai. 6. Nustatyti atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Koaguliazei teigiami stafilokokai
Stafilokokai – yra vieni iš plačiausiai paplitusių oportunistinių patogenų tarp žmonių ir gyvūnų. Skirtingos stafilokokų rūšys sukelia įvairius susirgimus tiek žmonėms, tiek gyvūnams.
Koaguliazei teigiami stafilokokai skirstomi į 6 grupes: S. aureus, S. delphini, S. hyicus, S.
intermedius, S. lutrae, S. pseudintermedius ir S. schleiferi subsp. coagulans (Craig, Greene, 2006).
Svarbiausi koaguliazei teigiami stafilokokai - Staphylococcus aureus ir Staphylococcus
pseudintermedius.
S. aureus yra pripažintas kaip reikšmingas patogenas žmonių ir gyvūnų medicinoje. Ši
padermė gali sukelti didelių sveikatos sutrikimų, nuo švelnių odos pažeidimų iki gyvybei pavojingų infekcijų. Daugiau kaip 80 proc. izoliatų gamina penicilazę ir yra atsparūs penicilinams, todėl stafilokokinių infekcijų gydymui buvo panaudoti penicilazei atsparūs beta laktaminiai antibiotikai, tokie kaip meticilinas. Šis antibiotikas pirmą kartą buvo panaudotas 1950 metais žmonių medicinoje norint įveikti stafilokokų sukeltas infekcijas (Woodford, Livermore, 2009).
S. aureus plačiai paplitęs, jo randama beveik visur: tiek aplinkoje, tiek pas gyvūnus ant jų
odos, tiek ir pas žmones (Methanraj et al., 2009). Nustatyta, kad ši padermė priklauso normaliai žmogaus mikroflorai, kurios ekologinė niša - nosies šnervės, tačiau ilgą laiką gali išlikti ir ant odos (Zorgani et al., 2009). Dalis visuomenės – apie 60 proc. yra nepastovūs S. aureus nešiotojai, nes minėti stafilokokai dažnai keičiasi išnykdami ir vėl atsirasdami šnervėse. Literatūroje nurodoma, kad 25-30 proc. žmonių šnervėse turi S. aureus, kurių apie 2 proc. yra meticilinui atsparūs ir jie vadinami pastoviaisiais nešiotojais (Zorgani et al., 2009). Pastaraisiais metais didelė problema tapo šios padermės atsparumas daugumai antibiotikų, kurie naudojami visuomenėje, o ypač ligoninėse (Ahmed et al., 2010; Palavecino, 2007).
Sergamumas žmonių MRSA daugelyje pasaulio šalių vis auga. Be to, ši kolonizacija per pastaruosius keletą metų labai išaugo ir augintiniams (Duquette, Nuttall, 2004). Nuo 1990 m. gaunama vis daugiau pranešimų, kad gyvūnai gali perduoti meticilinui atsparias S. aureus padermes savo šeimininkams. Nagrinėjant šiuos atvejus buvo tik įtariama apie tarprūšinį perdavimą (Islam et al., 2013).
Mann (1959) padarė prielaidą, kad šunys ir katės gali būti stafilokokinių infekcijų šaltiniai žmonėms. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad iš tiesų gyvūnai augintiniai yra MRSA infekcijos šaltinis žmonėms (Faires et al., 2010; Manian, 2003; O’Mahony et al., 2005).
12 2005 m. pirmą kartą sistemiškai išskirta nauja stafilokokų rūšis – S. pseudintermedius. Naujoji rūšis buvo perklasifikuota, remiantis genetiniais požymiais. Rūšis atsirado pakeitus pavadinimą anksčiau gerai žinomos stafilokokų rūšies – S. intermedius (Devriese et al., 2005). S.
intermedius pirmą kartą aprašytas 1976 m. ir iki šių dienų buvo žinomas kaip kačių ir šunų
infekcinių ligų sukėlėjas, tačiau 2007 m. Bannoehr ir Sasaki atlikti du nepriklausomi molekuliniai tyrimai parodė, kad S. intermedius sukelia infekcijas paukščiams (dažniausiai balandžiams), todėl S.
intermedius buvo padalintas į tris klasterius: S. intermedius, S. pseudintermedius ir S. delphini
(Sasaki et al., 2007).
Dažniausiai šunų ir kačių infekcinių ligų sukėlėjas yra S. pseudintermedius (Ball, Rubin et al., 2008; Griffeth, Morris et al., 2008).
S. pseudintermedius žinomas kaip sveikų šunų ir kačių natūralios mikrofloros dalis ir
išskiriamas iš įvairių gleivinių: nosies, burnos, ryklės, kirkšnies ir išangės (Abraham et al., 2007). Weese ir van Duijkeren (2010) atlikę tyrimus nustatė, kad S. pseudintermedius dažniausiai kolonizuoja nosies gleivinę, o ypač gausiai – išangės ir dažniau nustatomas pas šunis negu kates (Weese, van Duijkeren, 2010). Šios bakterijos yra žinomos kaip dažnos įvairių infekcijų sukėlėjos: odos, ausų taip pat susiję su pūliniais ar chirurgine intervencija bei burnos, kvėpavimo organų, smegenų ar kitų sistemų pažeidimais (Morris et al., 2006). S. pseudintermedius buvo nustatytas 58,5 – 81 proc. šunims, kurie sirgo pioderma ir ausies uždegimu, ir apie 68 proc. sveikiems šunims (Griffeth, Morris et al., 2008), taip pat 16,5 proc. šunims su šlapimo takų infekcija (Ball, Rubin et al., 2008).
Daugiau negu 50 proc. sveikų šunų yra šios bakterijos nešiotojai, taip pat S.
pseudintermedius yra randamas sveikų žmonių nosies ermėje, tai sudaro apie 4 proc. išskiriamų
mikroorganizmų. S. pseudintermedius turėtų būti laikomas kaip zoonotinis sukėlėjas, nes yra nustatyta, kad sukelia infekcijas ne tik augintiniams, bet ir jų savininkams. Tyrimų duomenimis S.
pseudintermedius nėra tos bakterijos, kurios dažnai kolonizuotų žmogaus organizmą. Tačiau
stafilokokai dažniausiai išskiriami iš tų žmonių, kurie turėjo glaudų kontaktą su gyvūnais nešiotojais (ypač su giliu pūliuotu odos uždegimu sergančiais šunimis), taip pat gyvūnams įkandus, dažniausiai tokių šunų šeimininkai (Prieiga per internetą: <http://www. wormsandgermsblog.com> [žiūrėta 2012 11 19]).
Pastaraisiais metais vis daugėja pranešimų apie išaugusį meticilinui atsparaus S.
pseudintermedius paplitimą tarp gyvūnų augintinių Šiaurės Amerikoje (Hanselman et al., 2008) ir
Europoje (Loeffler et al., 2007). Europoje vyraujanti padermė ST 71 yra atspari visoms antibiotinėms medžiagoms, kurios yra naudojamos smulkių gyvūnų praktikoje (Perreten et al., 2010). Pirmas pranešimas Europoje apie S. pseudintermedius padermės perdavimą nuo gyvūno
13 žmogui buvo paskelbtas 2007 m., 2010 m. tokie pranešimai paskelbti Italijoje, Šveicarijoje, Jungtinėse Amerikos valstijose, bei Japonijoje. Gyvūnai augintiniai buvo nurodyti kaip potencialūs šios padermės rezervuarai, kadangi dauguma šunų buvo kolonizuoti S. pseudintermedius (Stegman et al., 2010).
Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans yra viena iš patogeniškų koaguliazei teigiamų
stafilokokų rūšių, kuri gali sukelti rimtus susirgimus žmonėms ir šunims. Frank ir kiti atliko tyrimus (2003) su 40 šunų, iš kurių 12 sirgo pioderma. Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans padermė buvo išskirta iš 10 šunų sergančių pioderma ir iš 3 sveikų šunų. Atlikti tyrimai rodo, kad ši padermė vis dažniau yra iškiriama iš šunų, kuriems nustatyta pioderma bei dauguma išskiriamų izoliatų yra atsparūs meticilinui. Ši padermė turi gebėjimą išvystyti aukštą rezistentiškumą antimikrobinėms medžiagoms, naudojant panašius mechanizmus kaip ir Staphylococcus aureus (Frank et al., 2003).
1.2. Koaguliazei teigiamų stafilokokų paplitimas tarp gyvūnų augintinių ir jų savininkų
Skirtingos stafilokokų rūšys sukelia įvairius susirgimus tiek gyvūnams, tiek ir žmonėms. Daugelyje pasaulio šalių buvo atlikti tyrimai norint nustatyti koaguliazei teigiamų stafilokokų paplitimą tarp gyvūnų augintinių ir jų šeimininkų (Weese, van Duijkeren, 2010).
Kruth, Rousseau 2006 m. atlikto tyrimo metu mėginiai buvo imami iš 132 šunų ir 242 jų savininkų. Išskirtos šios bakterijos: koaguliazei teigiamos Staphylococcus aureus buvo išskirta iš 67 (28,0 proc.) žmonių, iš 19 (14,0 proc.) šunų, kurie laikomi namuose ir lauke. Meticilinui atsparių S.
aureus padermių išskirta iš 8 (3,3 proc.) žmonių ir 2 (1,5 proc.) šunų. S. aureus išskirta iš 13 (68,4
proc.) šunų nosies ertmės ir 5 (26,0 proc.) šunų išangės. Taip pat iš šunų ir žmonių buvo išskirta S.
pseudintermedius ir S. shleiferi subsp., coagulans, kurie sukelia dažniausiai piodermą bei ausies
uždegimą. Staphylococcus pseudintermedius išskirta iš 8 (4,1 proc.) žmonių ir 61 (46,0 proc.) šuns. Meticilinui atsparus S. pseudintermedius išskirtas iš 1 (0,4 proc.) žmogaus ir 6 (4,5 proc.) šunų. S.
pseudintermedius išskirtas iš 14 (23,0 proc.) šunų nosies ertmės, 37 (60,7 proc.) išangės. Staphylococcus schleiferi subsp., coagulans išskirtas iš 1 (0,8 proc.) šuns išangės. S. pseudintermedius paplitimas tarp šunų yra žymiai didesnis negu S. aureus.
Išanalizavus gautus duomenis buvo nustatyta, kad 50 proc. žmonių iš kurių išskirta S. aureus, laikė namuose šunį, kuris taip pat buvo kolonizuotas šios padermės. Todėl galima daryti prielaidą, kad tarprūšinis perdavimas įvyko. Taip pat panašūs rezultatai buvo gauti ir su S. pseudintermedius, kuris nėra laikomas normaliu žmogaus mikrofloros mikroorganizmu. Jis buvo išskirtas iš 44 proc. tirtų šunų ir žmonių, kurie gyvena tuose pačiuose namuose.
14 Taip pat atlikto tyrimo metu nustatyta, kad S. pseudintermedius paplitimas tarp žmonių yra 4,1 proc. didesnis nei tikėtasi, kadangi toji rūšis retai būdavo nustatyta sveikiems žmonėms kaip natūrali jų mikrobiotos dalis. Ši padermė buvo dažniau išskirta iš tų žmonių, kurie laikė šunį, sergantį pioderma. Nustatyta, kad reguliarus rankų plovimas turėjus kontaktą su gyvūnais gali sumažinti S. pseudintermedius kolonizacijos riziką žmogaus, nes tyrimų duomenimis žmonės, kurie turėjo glaudų kontaktą su savo augintiniais ir nesilaikė higienos, buvo kur kas dažnesni bakterijos nešiotojai negu tie, kurie plovėsi rankas. S. aureus paplitimas tarp žmonių buvo didesnis 3,3 proc. nei tikėtasi ir dažniausiai išskiriamas iš tų, kurie dirbo ar turėjo ryšių su veterinarijos klinikomis (Kruth, Rousseau, 2006).
Hanselman (2009) pranešė, kad S. aureus, S. pseudintermedius ir S. schleiferi ssp. cougulans padermės (įskaitant ir meticilinui atsparias) buvo išskirtos iš namuose laikomų šunų bei jų savininkų. Šio tyrimo tikslas - išskirti koaguliazei teigiamus stafilokokus iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų nosies ertmės. Tyrime dalyvavo 108 skirtingų veislių sveiki šunys ir 108 jų savininkai. S.
aureus buvo išskirtas iš 20 (18,5 proc.) šunų savininkų ir iš dviejų šunų (1,8 proc.). S.
pseudintermedius išskirtas iš 6 (5,6 proc.) savininkų ir 50
(13,9 proc.) šunų. S. schleiferi ssp. cougulans išskirtas iš vieno šuns (0,8 proc.) (Hanselman et al., 2009).
2010 metais Brazilijoje, Maluta ir Stella atliko tyrimą su 50 šunų bei 50 žmonių. Tyrimo tikslas - nustatyti koaguliazei teigiamų stafilokokų paplitimą tarp gyvūnų augintinių bei jų savininkų. S. aureus išskirta iš dviejų šunų mėginių (4,0 proc.) ir iš 18 žmonių (36,0 proc.) mėginių. Ir tik iš vieno šuns mėginio buvo išskirta S. pseudintermedius (2,0 proc.) (Maluta et al., 2010).
2009 metais Kanadoje ir Jungtinėse valstijose Meredith atliko tyrimą. Buvo tiriami 22 namų gyventojai bei jų augintiniai. Koaguliazei teigiami stafilokokai buvo išskirti iš 6 namų gyventojų bei jų augintinių (27,3 proc.). Mikroorganizmai išskirti iš 10 (17,9 proc.) žmonių ir 2 (8,3 proc.) šunų mėginių. Iš kitų 8 namuose gyvenančių žmonių bei jų auginamų šunų mikroorganizmų buvo išskirta iš 2 šunų (9,5 proc.) ir 1 žmogaus (6,3 proc.) mėginių (Meredith et al., 2009).
1.3. Koaguliazei teigiamų stafilokokų perdavimo mechanizmas tarp žmonių ir gyvūnų
Pastaraisiais metais vis didėja skaičius pranešimų apie stafilokokines infekcijas, plintančias tiek tarp visuomenės, tiek ir tarp gyvūnų augintinių. Tai reiškia, kad galimas tarprūšinis perdavimas. Stafilokokinės infekcijos šunims dažniausiai susijusios su odos ir minkštųjų audinių infekcijomis arba operacinėmis žaizdomis (Baptiste et al., 2005).
15 Pirmą kartą apie MRSA perdavimą buvo užsiminta 1988 metais, kai pernešimas buvo susijęs su pasikartojančiomis MRSA infekcijomis tarp katės ir jos savininko, kuris gulėjo logoninėje ir glaudžiai kontaktavo su savo augintiniu (Scott et al., 1988). Pirmas pranešimas apie MRSA infekciją tarp šunų buvo praneštas 1994 metais (Petersen et al., 2002).
Apie pirmąjį MRSA perdavimo mechanizmą 2004 metais Olandijoje nuo žmogaus šuniui pranešė Duijkeren, Wolfhagen. Dar vienas pranešimas buvo ir Jungtinėse Amerikos Valstijose (2004). Šiuo atveju buvo ištirti augintinio savininkai – vyras, sergantis diabetu ir su pasikartojančia kojos infekcija, ir moteris bei jų augintinis. Pas juos visus buvo rąsta S. aureus padermių su tokiu pat antimikrobiniu atsparumu. Atlikus tyrimus buvo padaryta išvada, kad augintiniai gyvenantys kartu su savo šeimininkais ar kitaip kontaktuojantys tarpusavyje, gali perduoti S. aureus padermes vieni kitiems (van Duijkeren et al., 2004). Taip pat yra ir ankstesnių pranešimų apie S. aureus tarprūšinį perdavimą - viename tyrime buvo kolonizuotas šuo, kuris pernešė infekciją iš naujo šaltinio savo šeimininkui (Cefai et al., 1994). Kitame tyrime vis pasikartojanti šios padermės kolonizacija buvo rasta dviem žmonėms ir buvo pašalinta tik identifikavus ir išgydžius jų šunį (Manian, 2003). Taip pat Olandijoje buvo kolonizuotas šuo, kuris manoma užsikrėtė nuo slaugytojos (van Duijkeren et al., 2004).
Dr. Andrew Waller (2005) pastebėjo, jog MRSA dažnumas tarp gyvūnų yra palyginti žemesnis negu tarp žmonių. MRSA galėjo sukelti rimtas ligas, nes jie buvo identifikuoti daugelyje gyvūnų rūšių. Mokslininkas manė, kad labiausiai tikėtina, jog atsparumas meticilinui pasklido nuo žmonių gyvūnams (Waller, 2005). Tačiau keletas tyrimų parodė, kad ši padermė gali būti perduota nuo gyvūnų augintinių jų savininkams ir atvirkščiai (Simoons - Smit et al., 2000; Bradshaw, 2003).
Kiti tyrimai parodė, kad daug MRSA padermių buvo identiškos rąstoms pas žmones. Žmonės dažniau būna nešiotojai nei užkrėstieji taip sudaro galimybę užkrėsti savo augintinius. Nepastebėti užkrėsti gyvūnai kelia grėsmę žmonėms. Keletas tyrimų parodė gana nemenką S. aureus paplitimą tarp gyvūnų pastaraisiais metais (Boag et al., 2004). Šių infekcijų dauguma yra susijusi su pooperacinėmis infekcijomis ir atviromis žaizdomis (Rich ir Roberts, 2004).
Dauguma tyrimų rodo, kad S. pseudintermedius yra labiausiai paplitusi koaguliazei teigiama stafilokokų rūšis, izoliuota nuo šunų (Rich, Roberts, 2004). Tai svarbiausias šunų patogenas sukeliantis odos susirgimus. Šis mikroorganizmas skiriasi nuo žmonių patogeno – S. aureus, tai paaiškina, kodėl žmonės su normaliai funkcionuojančia imunine sistema nėra dažni šios infekcijos nešiotojai (Greene, 2006). Anksčiau buvo manyta, kad šios padermės perdavimas nuo gyvūnų augintinių žmonėms yra neįmanomas. Atliktame tyrime tik 1 iš 144 veterinarijos klinikos personalo darbuotojų turėjo kolonizuotą nosies ertmę S. pseudintermedius paderme (Tomlin et al., 1999).
16 Hoekstra ir kiti 2002 metais analizavo keletą atvejų, susijusių su tarprūšiniu perdavimu, pirmu atveju išskirta S. pseudintermedius iš žmogaus, kurio šuo sirgo ausų uždegimu, kitu atveju - po šuniui atliktos chirurginės intervencijos. Pas šunį ir jo šeimininką buvo rastos genetiškai vienodos S.
pseudintermedius padermės (Hoekstra et al., 2002).
2004 metais Guardabassi su mokslininkų komanda atliko tyrimus su 13 šunų, sergančių pioderma, ir tiek pat jų šeimininkų. 7 savininkams ir vienam neturėjusiam kontakto nei su vienu šunimi, buvo nustatyta S. pseudintermedius padermė. Atlikus genetinius tyrimus 6 savininkams ir jų augintiniams buvo nustatytos genetiškai identiškos padermės. Taip pat nustatytas atsparumas 5 antibiotikų grupėms. Išanalizavus gautus rezultatus nustatytas galimas tarprūšinis perdavimas tarp šunų ir jų savininkų (Guardabassi et al., 2004).
2007 metais Japonijoje, Tokijo mieste, buvo nustatyta S. pseudintermidius padermė, kuri buvo išskirta iš šuns ir jo savininko nosies ertmės (Sasaki et al., 2007).
1.4. Mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Stengiantis apsaugoti gyvūnus nuo ligų arba bandant juos išgydyti, jų gydymo terapijai pradėti naudoti antibiotikai. Šis gydymo metodas leido atsirasti antibiotikams atsparių stafilokokų padermių. Atlikti antimikrobinio atsparumo tyrimai gyvūnams parodė, kad stafilokokai išskirti iš šunų ir žmonių turi panašų atsparumo modelį, kuris vystėsi naudojant tam tikrus antibiotikus.
Staphylococcus aureus yra labai patogeniškas ir sugeba greitai išvystyti atsparumą daugeliui
antimikrobinių medžiagų (1 pav.). Penicilinui atsparios S. aureus padermės atsirado jau 1940 m., tačiau daugelį metų jie liko imlūs beta-laktaminiams penicilinams (oksacilinui, meticilinui, nafcilinui) (Grossman, 2008). Nuo 1959 m. buvo pradėta naudoti antibiotiko penicilino atmaina – meticilinas. Iš pradžių naujas antibiotikas efektyviai naikino S. aureus padermę, tačiau ir šio antibiotiko efektyvumas sumažėjo greičiau nei per metus (Pantosti, Venditti, 2009). Pirmas pranešimas, kad Staphylococcus aureus yra atsparus meticilinui dėl mecA geno ir beta-laktamazės fermento gamybos, buvo paskelbtas 1961 m (Woodford, Livermore, 2009). Dauguma S. aureus padermių gamina beta – laktamazę ir yra tokiu būdu atsparūs penicilinui (Sridhar, 2009). Pirmieji pranešimai pasirodė Anglijoje, paskui ir kitose Europos šalyse, Jungtinėse Amerikos valstijose ir Australijoje (Enright et al., 2002).
Daugelyje pasaulio šalių buvo nustatyta, kad sparčiai auga Staphylococcus aureus atsparumas antistafilokokiniams penicilinams (meticilinas, oksacilinas, flukloksacilinas ir kt.) ir tuo pačiu visiems beta laktaminiams antibiotikams (cefalosporinai) (Lee, 2003). Skirtingose pasaulio
17 šalyse apie 30-60 proc. S. aureus padermių sukėlusių pūlines infekcijas yra atsparios meticilinui (oksacilinui). Pagal meticiliną, kaip atsparumo žymenį, tokie stafilokokai vadinami meticilinui atspariais auksiniais stafilokokais (angl. methicillin resistant Staphylococcus aureus - MRSA). Šių bakterijų sukeltų ligų negalima gydyti jokiais beta laktaminiais antibiotikais, jos gydomos vankomicinu, daug brangesniu ir toksiškesniu vaistu. Tačiau ilgai vartojant vankomiciną, 1997 m. Japonijoje ir po to kitose šalyse užregistruoti pirmi vidutiniškai atsparaus vankomicinui
Staphylococcus aureus izoliatai, 2002 metais Mičigane amerikiečių mokslininkai nustatė S. aureus
atsparumą vankomicinui (Finks, Wells et al., 2009).
Penicilinas Meticilinas 1940 1970 Vankomicinas 1997 1990 , 2002
1 pav. Staphylococcus aureus antimikrobinio atsparumo vystymasis (prieiga prie interneto:
http://www.slideshare.net/doctorrao/vancomycin-resistant-staphylococcus [žiūrėta 2013 09 10])
Kinijoje 2006 m. mokslininkai Boost, O’Donoghue ir James tyrė S. aureus perdavimą nuo žmonių savo gyvūnams augintiniams, jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms bei siekė nustatyti ar išskirti izoliatai yra vienodi tiek gyvūnų, tiek savininkų. Tyrimai buvo atlikti Kinijos universitete, 736 žmonėms ir jų 830 skirtingų veislių šunims. S. aureus išskirtas iš 174 (24 proc.) žmonių ir 73 (8,8 proc.) šunų. Beveik 90 proc. visų izoliatų buvo atsparūs vienam antibiotikui. Iš
S. aureus Penicilinui atsparus S. aureus
Meticilinui atsparus S. aureus Vankomicinui atsparūs enterokokai. Vankomicinui atsparus S. aureus (tarpinė grandis) Vankomicinui atsparus S. aureus.
18 šunų išskirtas S. aureus padermės buvo didesnio atsparumo meticilinui, oksacilinui, linkomicinui, gentamicinui, tetraciklinui ir fuzidino rūgščiai negu išskirtos iš žmonių. Iš vieno žmogaus išskirta padermė buvo atspari sulfonamidui – trimetoprimui bei iš vieno šuns atspari – rifampicinui (Guardabassi et al., 2004). Atsparumas dviem ir daugiau antibiotikų buvo nustatytas 54 proc. šunų ir 44 proc. žmonių. Tyrimo duomenimis nei vienas S. aureus izoliatas nebuvo perduotas nuo augintinių savo šeimininkams, visi buvo perduoti nuo šeimininkų savo augintiniams (Boost et al., 2006).
Kanadoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad 67 proc. šunų yra atsparūs dviem ir daugiau antibiotikų (Rich, Roberts, 2004). mecA genas buvo išskirtas iš 4 žmonių ir iš 6 šunų, tai patvirtino padermės atsparumą meticilinui. Nustatytas didelis atsparumas tetraciklinams bei fuzidino rūgščiai. Fuzidino rūgštis dažniausiai buvo naudojama odos ir akių infekcijoms gydyti, o tetraciklinai - kvėpavimo takų infekcijoms (Guardabassi et al., 2004).
Klindamicinas buvo svarbus infekcijų gydyme, kurias sukelia S. aureus ir S.
pseudintermedius padermės (Lewis, Jorgensen, 2005). Tačiau laikui bėgant išaugo šių bakterijų
atsparumas naudojamam antibiotikui, S. aureus atsparumas buvo didesnis nei S. pseudintermedius. Faires (2009) atlikto tyrimo metu S. aureus atsparumas klindamicinui rastas 17,7 proc. mėginių, o
S. pseudintermedius atsparumo šiam antibiotikui nebuvo (Faires, Gard et al., 2009; Rubin, Ball et
al., 2011). Kitų mokslininkų atliktuose tyrimose atsparumas klindamicinui buvo kur kas didesnis: S.
aureus 14,8 proc. - 68,0 proc.,o S. pseudintermedius 4,8 proc. - 24,4 proc. mėginių (Levin, Suh et
al., 2005).
2005 metais pirmą kartą sistemiškai išskirta nauja stafilokokų rūšis – S. pseudintermedius, o nuo 2006 m. skirtingose Europos šalyse pradėti skelbti straipsniai apie nustatytas meticilinui atsparias S. pseudintermidius padermes (angl. methicillin resistant Staphylococcus pseudintermidius- MRSP). 2006 metais Švedijoje buvo išskirta 13 MRSP padermių, o 2007 – 2008
metais - 180 MRSP padermių iš šunų (Windahl et al., 2012). 2010 m. S. pseudintermidius pripažintas svarbiu patogenu tarp gyvūnų augintinių ir jų savininkų (Weese, van Duijkeren, 2010). Nustatyta, kad infekcijas žmonėms, gali sukelti kliniškai sveiki šunys, persirgę MRSP sukeltomis ligomis, kadangi kurį laiką jie būna jų nešiotojai. Tokių nešiotojų kiekis skirtingose šalyse yra nevienodas ir siekia nuo 0 iki 30 proc. (van Duijkeren et al., 2008).
MRSP padermės yra pavojingos tuo, kad jos yra atsparios visiems penicilinų grupės antibiotikams, o labai dažnai ir kitų grupių antibiotikams. Europoje ir Šiaurės Amerikoje nustatyta, kad MRSP padermės yra atsparios visiems oraliai vartojamiems antibiotikams, kurie yra registruoti gyvūnams gydyti. Žmonių medicinoje naudojami antbiotikai dar išlieka efektyvus, todėl dažnai jie būna vartojami gyvūnų gydymui. Nelegaliai naudojant tik žmonių gydymui skirtus antibiotikus
19 gyvūnams, ateityje tokie antibiotikai gali tapti neefektyvūs gydant ir žmonių infekcijas (Perreten et al., 2010).
Westerno Veterinarinės medicinos koledže 2008 m. buvo atliekamas S. pseudintermidius, išskirto iš sveikų šunų ir jų savininkų, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas. Tyrimams medžiaga buvo imama šunims iš nosies ertmės ir tiesiosios žarnos, žmonėms – nosies ertmės. Tyrime dalyvavo 175 šunys ir 168 žmonės. S. pseudintermidius buvo išskirtas iš 153 (87,4 proc.) šunų ir 148 (88,6 proc.) žmonių. Rubin ir Chirino – Trejo duomenimis iš šunų išskirti 39,9 proc. izoliatų yra atsparūs penicilinams, 23,5 proc. tetraciklinams, 3,3 proc. atsparūs eritromicinui, 3,6 proc. makrolidams ir 2,4 proc. klindamicinui. Iš žmonių išskirtos S. pseudintermidius padermės mažiau atsparios penicilinams 26,6 proc., tačiau didelis atsparumas yra ampicilinams 97,2 proc. ir taip pat tetraciklinams 81,5 proc., eritromicinui 66,3 proc. ir amoksicilinui 60,7 proc., atsparumo nebuvo nustatyta klindamicinui bei makrolidams (Rubin et al., 2008).
Perreten ir Ruscher 2010 metais, išanalizavę ankstesnius kitų mokslininkų tyrimus, teigia, kad Kanadoje, Vokietijoje, Prancūzijoje, Italijoje bei Nyderlanduose S. pseudintermedius padermė labiausiai atspari beta – laktaminiams antibiotikams ir penicilinams, o Europoje ir Šiaurės Amerikoje – chloramfenikoliui, tetraciklinui bei gentamicinui (Perreten et al., 2010).
Christina ir Degi 2013 metų gegužės mėn. atlikę iš šunų ir jų savininkų nosių ertmių, išskirtų mikroorganizmų padermių atsparumą antibiotinėms medžiagoms, nustatė, kad S. pseudintermedius, kuris buvo išskirtas iš šunų, yra atsparus polimiksinui B (100 proc.), eritromicinui (66,6 proc.), kanamicinui (50 proc.), tetraciklinui ir linkomicinui (45,8 proc.), gentamicinui ir amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (37,5 proc.), o išskirto iš žmonių atsparumas yra didesnis – polimiksinui B (100 proc.), kanamicinui (72,7 proc.), amoksicilinui su klavulanine rūgštimi ir tetraciklinams (45,4 proc.) (Christina et al., 2013).
Griffeth duomenimis < 5 proc. izoliatų yra atsparūs pirmos kartos cefalasporinams, kaip cefaleksinui ar cefadroksilui, taip pat penicilinams (oksacilinui, dikloksacilinui, amoksicilinui su klavulanine rūgštimi), gentamicinui, enrofloksacinui bei polimiksinui B (Giffeth et al., 2008). Taip pat nustatytas mažesnis atsparumas sulfonamidams, chloramfenikoliui ir tilozinui (nuo 6 iki 19 proc. izoliatų), didesnis atsparumas yra linkomicinui, klindamicinui ir eritromicinui (20-37 proc. izoliatų) tiek tarp šunų, tiek tarp jų savininkų (Guardabassi et al., 2004).
20
1.5. Veiksniai, turintys įtakos koaguliazei teigiamų stafilokokų tarprūšiniam perdavimui
Pasak Boost, S. aureus kolonizacija pas žmogų yra susijusi su sveikatos priežiūra. Atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad 42 proc. žmonių, turinčių S. aureus padermes, turi sveikatos problemų, taip pat tai siejama su paukščių ir kačių laikymu namuose, nes valant paukščių narvus ar kačių išmatas S. aureus gali patekti į žmogaus organizmą per kvėpavimo sistemą. Žmonių skaičius namuose bei lytis nėra rizikos veiksnys, dėl ko galėtų būti didesnė S. aureus kolonizacijai pas žmogų (Boost., 2004).
Koaguliazei teigiamų stafilokokų paplitimas tarp šunų žymiai didesnis pas pateles (12 proc.) negu patinus (6 proc.), manoma, kad tam įtakos gali turėti hormoniniai pokyčiai (Hoekstra, 2002). Taip pat įtakos turi ir šunų amžius, pas vyresnius šunis paplitimas didesnis (10 proc.) negu pas jaunesnio amžiaus šunis (8 proc.) (<12 mėn., amžiaus). Tyrimų duomenimis, šuns dydis bei jo šeimininko lytis neturi reikšmės stafilokokų paplitimui ir perdavimui. Vyresnio amžiaus šeimininkų šunys buvo rečiau kolonizuojami nei jaunesnio amžiaus.
Wertheim atlikto tyrimo metu paaiškėjo, kad koaguliazei teigiami stafilokokai dažniau išskiriami iš mišrūnų (91,7 proc.), negu iš veislinių šunų (71,8 proc.), kadangi veisliniai šunys yra labiau prižiūrimi kas ir gali sumažinti stafilokokų kolonizaciją (Wertheim et al., 2005).
Paplitimui turi įtakos taip pat ir namuose gyvenančių žmonių skaičius. Namuose, kuriuose yra laikomas šuo ir gyvena trys ar mažiau asmenų, S. aureus paplitimas yra mažesnis negu tuose namuose, kur gyvena trys ar daugiau asmenų (Shopsin et al., 2000). Taip pat svarbus yra laikomų šunų skaičius: namuose kur laikoma nuo vieno iki trijų šunų stafilokokų paplitimas yra mažesnis negu tuose namuose kur laikomas didesnis skaičius šunų (Boost., 2004).
Pasak Rich, kokia mikroflora vyrauja ir jos kiekis (dažnumas, paplitimas) gali priklausyti nuo metų laiko tiek pas šunis, tiek pas jų savininkus. Mėginių, kuriuose buvo nustatyti mikroorganizmai, skaičius buvo žymiai didesnis vasario – rugsėjo mėn., nei rugsėjo – vasario mėnesiais (Rich, Rubin et all., 2006).
Didelis kontaktas su šunimis (glostymas, nešiojimas, bučiavimas, veido laižymas bei miegojimas lovoje) yra reikšmingas veiksnys, kuris padidina stafilokokų kolonizaciją tarp žmonių ir gyvūnų. Todėl žmonėms yra patariama vengti tokio glaudaus kontakto su savo augintiniais ir laikytis higienos, ypač patariama plauti rankas po kontakto su augintiniais (Shopsin et al., 2000).
21
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
Tyrimai buvo atliekami nuo 2012 m. rugsėjo mėn. iki 2013 m. gruodžio mėn. Mėginiai buvo imami iš šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos ir jų savininkų nosies ertmės ir tirti mikrobiologijos laboratorijoje.
Ištirta 41 šuns nosies ertmės ir tiesiosios žarnos mikroflora ir 41 žmogaus nosies ertmės mikroflora. Gyvūnai buvo suskirstyti į grupes: pagal lytį – patelės ir patinai; pagal amžių – jaunesni ir 5 metų amžiaus bei vyresni nei 5 metų amžiaus gyvūnai (1 lentelė). 24 šunų nosies ir išangės mikroflora ištirta rudenį, 3 – žiemą, 7 – pavasarį, 7 – vasarą.
Gyvūnų augintinių savininkai buvo grupuojami: pagal lytį – moterys ir vyrai; pagal laikomų šunų skaičių namuose, bei gyvenančių žmonių skaičių (2 lentelė). 21 žmogaus nosies mikroflora ištirta rudenį, 5 – žiemą, 8 – pavasarį, 7 – vasarą.
Mėginiai tyrimui buvo imti iš įvairių veislių šunų (3 lentelė).
1 lentelė. Duomenys apie tirtus šunis
Gyvūnas Ištirtų
gyvūnų ♀ ♂ ≤5 m. amžiaus >5 m. amžiaus
Šuo 41 22 19 24 17
2 lentelė. Duomenys apie tirtus gyvūnų augintinių savininkus
Šunų savininkai
Ištirtų
žmonių ♀ ♂
Laikomų namuose šunų skaičius Namuose gyvenančių žmonių skaičius 1 2 ≥3 ≤ 3 >3 Žmonės 41 32 9 31 5 5 16 25
22 3 lentelė. Tirtų šunų veislės
Mėginiai mikrobiologiniam tyrimui buvo imami į transportines terpes TRANSWAB® (naudojama pernešimo terpė aerobams ir anaerobams išskirti (Amies, Liofilchem, Italija)). Tiriamoji medžiaga buvo imama iš gyvūnų augintinių nosies ertmės ir tiesiosios žarnos ir jų savininkų nosies ertmės. Žmonėms sterilus vatos tamponėlis įvedamas į nosies landą 1-2 cm gylyje, neliečiant išorinės nosies landos sienelių, švelniai sukamas, išimamas ir dedamas į transportinę terpę. Gyvūnams augintiniams mėginiai imami iš: tiesiosios žarnos (įvedus sterilų tamponėlį apie 1 cm į tiesiąją žarną) ir nosies (įvedus sterilų tamponėlį apie 0,5 – 1 cm į šnerves arba kai šnervės spindis mažas, steriliu vatos tamponėliu patrinamas nosies paviršius).
Visi paimti mėginiai buvo sėjami į mėsos peptono sultinį (MPS), mikroorganizmų pagausinimui, kultivuojame aerobinėmis sąlygomis 37ºC temperatūroje 24 val.
Po to, tiriamieji mėginiai buvo persėti ant maitinamojo agaro (MA) (Nutrition agar, Oxoid, Anglija). Užsėtos lėkštelės kultivuojamos termostate 37ºC temperatūroje 24 – 48 val. Išaugusių kultūrų morfologija įvertinama mikroskopuojant, prieš tai tepinėlius nudažius Gramo metodu
Veislė Gyvūnų skaičius
Mišrūnas 10 Pekinas 5 Jorkšyro terjeras 5 Anglų buldogas 3 Vokiečių aviganis 3 Sibiro haskis 3
Juodieji rusų terjerai 2
Stafordšyras 2
Mopsas 2
Džeko Raselo terjeras 1
Rusų ilgaplaukis toterjeras 1
Biglis 1
Kaukazo aviganis 1
Šarpėjus 1
Samojedas 1
23 („Diagnostica Merck“, Vokietija). Tiriamuosiuose mėginiuose nustačius gramteigiamus kokus, išsidėsčiusius netaisyklingomis krūvelėmis, persėjome ant specialios terpės - Kraujo agaro, diferencinės - diagnostinės Manitolio druskos agaro (Oxoid, Anglija) ir selektyvinio Baird-Parker (Liofilchem, Italija) agaro.
Augdamas Staphylococcus aureus ant Manito druskos agaro fermentuoja manitą dėl to keičiasi terpės pH. Staphylococcus pseudintermedius nefermentuoja manito, todėl terpės spalva nesikeičia.
Kraujo agare stebima patogeninių stafilokokų visiška (β) arba dalinė (α) hemolizė. Virulentiški kamienai apie kolonijas sudaro visišką hemolizės zoną. Staphylococcus aureus sudaro β – hemolizę, Staphylococcus pseudintermedius sudaro β – hemolizę, bei dalinę α – hemolizę.
Baird-Parker (Liofilchem, Italija) agare Staphylococcus aureus, skaidydamas teluritą, sudaro juodos spalvos kolonijas su opalescencinėmis zonomis, jos susidaro dėl lecitinazės ir lipazės aktyvumo.
Streptococcus nuo Staphylococcus genties bakterijų atskirti atliekamas katalazės testas.
Naudojamas 3 proc. vandenilio peroksido tirpalas (H2O2). Ant objektinio stiklelio kilpele uždedama tiriamoji kolonija ir užlašinamas 1 lašas vandenilio peroksido tirpalo. Jeigu sumaišius pradeda skirtis burbuliukai (mikroorganizmas gamina katalazę, kuri skaido vandenilio peroksidą į vandenį ir dujinį deguonį), reakcija yra teigiama. Teigiamą reakciją rodo stafilokokai, neigiamą – streptokokai. Koaguliazės testu („Coagulase Plasma EDTA“ liofilizuota triušio plazma (Biolife, Italija)) nustatyti koaguliazei teigiami – patogeniniai stafilokokai. Laisvoji koaguliazė yra sekretuojama ląstelės paviršiuje ir nustatoma mėgintuvėlyje. Surištoji koaguliazė, dar kitaip vadinama agliutinacijos - klampumo faktoriumi, nustatoma ant objektinio stiklelio.
Patogeninių stafilokokų A baltymo nustatymui atliekamas „Staphytest Plus“ (Oxoid, Anglija) testas. „Staphytest Plus“ – tai lateksagliutinacijos reakcija, kuriai atlikti gaminamos specialios standartinės sistemos iš latekso dalelių, turinčių absorbuotus ant jų paviršiaus specifiškus polikloninius antikūnus, kiaulių fibrinogeną ir triušio IgG. Ant „Staphytest Plus“ testo sektoriaus užlašinus specialaus reagento ir pridėjus tiriamąją stafilokokų kultūrą, jei yra mikroorganizmo antigenų - matoma latekso dalelių agliutinacija.
Ar patogeninių stafilokokų padermės gamina DNR-zė nustatėme ant DNR – azės agaro (Oxoid, Anglija). Pasėtos lėkštelės kultivuotos + 37 oC temperatūros termostate 18-24 val. inkubuojamos. Ant išaugusių kolonijų užpilamas 1 mol/l vandenilio chlorido tirpalas ir palaikoma 7 min. DNazei teigiamos stafilokokų padermės sudarė 3–5 mm pločio skaidrią zoną.
Išskirtoms koaguliazei teigiamoms stafilokokų padermėms identifikuoti iki rūšies naudota dauginė polimerazės grandininė reakcija (multiplex PGR).
24 Koaguliazei teigiamų stafilokokų DNR išskyrimui buvo naudotas 5 proc. „Chelex-100“ tirpalas (Sigma, USA). Į ependorfinius mėgintuvėlius su 500 μl „Chelex-100“ tirpalu buvo perkeltos 3–5 stafilokokų kultūros kolonijos. Vėliau mėgintuvėliai inkubuoti 56°C temperatūroje 30 min. ir 95°C temperatūroje 10 min. Pakaitintas tirpalas centrifuguotas 2,5 min. 10000 aps./min. greičiu. Po centrifugavimo 300 μl viršutinio tirpalo sluoksnio, buvo perkeltas į naujus mėgintuvėlius ir dar kartą centrifuguota 2,5 min. 10 000 aps./min. greičiu. Viršutinis tirpalo sluoksnis (su stafilokokų DNR) perkeltas į naujus mėgintuvėlius. DNR buvo naudojama multiplex PGR produkto gamybai.
Tyrimui pasirinkti oligonukleotidų pradmenys (4 lentelė), specifiški S. aureus ir S.
pseudintermedius padermėms.
Multiplex PGR produktų elektroforezė buvo atliekama TAE buferyje (40 mM Tris, 20 mM acto rūgštis 1 mM EDTA), naudojant 11 μl PGR produkto, leidžiant 100 V elektros srovę 60 min. PGR amplifikacijos produktai buvo analizuojami 1,2 proc. „Top Vision LE GQ“ agarozės gelyje (MBI, Fermentas) su 1,3 proc. etidžio bromidu UV lempos spinduliuose. Tyrimo metu buvo naudojamas „GeneRuler TM 1000 bp DNA Ladder“ (MBI, Fermentas) markeris.
4 lentelė. Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius identifikavimui naudojami
oligonukleotidiniai pradmenys Specifiniai Pradmenys Oligonukleotidų pradmenų pavadinimai Oligonukleotidų pradmenų seka 5‘ → 3‘ PGR produkto ilgis S. aureus au-F3 au-nucR TCGCTTGCTATGATTGTG G GCCAATGTTCTACCATA GC 359 bp S. pseudintermedius psc-F2 psc-R5 5‘TRGGCAGTAGGATTCG TTAA3‘ 5‘CTTTTGTGCTYCMTTTT GG3‘ 926 bp
Paaiškinimas: bp – bazių pora.
Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms nustatytas pagal modifikuotą Kirby-Bauer metodą (indikatorinių diskų metodas), sėjant bakterijas į specialią „Mueller Hinton II Agar“ terpę (Oxoid, Anglija).
Tiriamosios mikroorganizmų kultūros buvo pasėtos ant MA. Po 24 – 48 val. su vienkartine kilpele atrenkamos 3–5 vienodos morfologijos, gerai izoliuotos kolonijos ir perkeliamos į mėgintuvėlį su steriliu fiziologiniu tirpalu. Suspensijos drumstumas prilyginamas 0,5 McFarlando
25 standartui. Bakterijų ląstelių drumstumas nustatytas aparatu - Mac Farland Densitometer 1 („Biosan“, Olandija). Po to į suspensiją įmerkiamas sterilus tamponas ir paskleidžiama ant Mueller - Hinton agaro paviršiaus. Po to, ant agaro paviršiaus dedami antimikrobinių medžiagų diskai (Oxoid, Anglija). Pasėtos Petri lėkštelės sudedamos į termostatą 3 – 37oC temperatūroje, 18 – 24 valandoms. Po to, liniuote išmatuojamos visų diskų sritys (skersmuo mm), kuriose slopintas mikroorganizmų augimas (NCNational Committee for Clinical Standards, 2013) (5 lentelė).
5 lentelė. Antimikrobinės medžiagos, kurioms tyrimo metu bus nustatomas stafilokokų
atsparumas (angl. „Susceptibility Testing“ Liofilchem, Italy (prieiga prie interneto:
http://www2.bc.cc.ca.us/bio16/10_Antimicrobials.htm [žiūrėta 2013 06 09])) Antimikrobinė medžiaga Antimikrobinės medžiagos koncentracija viename diske Jautru (mm) Vidutiniškai jautru (mm) Atsparu (mm) Oksacilinas (OX) 1 µg 13 11-12 10 Amoksicilinas su klav. r. (AMC) 30 µg 20 - 19 Amoksicilinas (AML) 30 µg 21 14-20 14 Gentamicinas (CN) 10 µg 15 13-14 12 Neomicinas (N) 30 µg 17 13-16 12 Tylozinas (TY) 0,1 µg 23 14-22 13 Klaritromicinas (CLR) 2 µg 18 14-17 13 Fuzidino rūgštis (FC) 10 µg 23 15-22 14 Cefaleksinas (CL) 30 µg 18 15-17 14 Ampicilinas (AMP) 10 µg 29 - 28 Cefaclor (CEC) 30 µg 18 15-17 14 Cefovecinas (CVN) 2 µg 18 15-17 14 Klindamicinas (CD) 2 µg 19 18-15 15 Doxycycline (DXT) 30 µg 16 13-15 12 Penicilinas G (P) 10 µg 29 - 28 Linkomicinas (MY) 2 µg 21 15-20 14 Enrofloksacinas (ENF) 2,5 µg 17 13-16 12
26 Atliekant statistinę analizę buvo siekiama nustatyti šunų amžiaus, lyties, veislės bei sezono įtaką šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos vyraujančios mikrofloros pasireiškimui.
Taip pat analizuota ar bakterijų išskyrimo dažnumui pas žmogų turėjo įtakos žmonių amžius, lytis, namuose gyvenančių žmonių bei auginamų šunų skaičius ir sezonas.
Tam tikslui buvo sudaryti statistiniai modeliai. Apskaičiuota amžiaus, lyties, veislės, namuose gyvenančių žmonių bei auginamų šunų skaičiaus ir sezono įtaka (proc.) mikrobiologiniams rodikliams ir įvertintas jų statistinis patikimumas. Tyrimo duomenys patikimi kai p < 0,05, p <0,01, ir p < 0,001, nepatikimi – kai p > 0,05. Tyrimų rezultatai ir jų statistiniai duomenys apskaičiuoti kompiuterinėmis programomis „Microsoft Exel'2007“ ir SPSS 17.
27
3. REZULTATAI
3.1. Mikroorganizmų išskyrimas iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų
Iš paimtų 123 mėginių, mikroorganizmų išskirta iš 37 (30,1 proc.) mėginių. Po vieną mikroorganizmų rūšį išskirta iš 33 (89,1 proc.) mėginių. Po dvi mikroorganizmų rūšis (mišri infekcija), nustatyta 4 (10,9 proc.) mėginiuose.
Dažniausiai išskiriama buvo Staphylococcus aureus iš - 20 mėginių, Staphylococcus
pseudintermedius- iš 17 mėginių, Bacillus spp., - iš 4 mėginių (2 pav.).
2 pav. Mikroorganizmai išskirti iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų
3.2. Šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos mikrofloros tyrimas
Iš 41 šuns mėginio, kurie imti iš nosies ertmės bei tiesiosios žarnos, mikroorganizmai buvo išskirti iš 27 (65,9 proc.).
Kai kuriuose mėginiuose buvo nustatyta mišri mikroflora. Po vieną mikroorganizmų rūšį nustatyta 24 (88,9 proc.) mėginiuose, po dvi mikroorganizmų rūšis išskirta iš 3 mėginių (11,1 proc.).
Iš šunų daugiausia išskirta Staphylococcus genties mikroorganizmų – iš 21 (44,8 proc.). Iš kurių patogeninės Staphylococcus aureus padermės nustatytos 5 (12,2 proc.) šunų nosies ertmėje ir 1 (0,2 proc.) šuns tiesiojoje žarnoje. Patogeninės – Staphylococcus pseudintermedius padermės
48,7 34,8 16,5 0 10 20 30 40 50 60 P r o c e n ta i Mikroorganizmai Staphylococcus aureus Staphylococcus pseudintermedius Bacillus spp.,
28 buvo nustatytos 13 (31,7 proc.) šunų nosies ertmėje ir 3 (0,7 proc.) tiesiojoje žarnoje. Iš 6 (14,6 proc.) mėginių išskirta Bacillus spp.
3.3. Įvairių veiksnių įtaka šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos vyraujančios mikrofloros pasireiškimui
Analizuota ar bakterijų išskyrimo dažnumui turėjo įtakos šunų amžius, lytis, veislė bei sezonas.
3.3.1. Amžiaus įtaka
Visus ištirtus šunis suskirstėme į 2 grupes pagal jų amžių:
1 grupė – jaunesni ir 5 metų amžiaus šunys, ištirti 24 šunys.
2 grupė – vyresni nei 5 metų amžiaus šunys, ištirta 17 šunų.
Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad šunų amžius neturėjo įtakos Staphylococcus aureus (p>0,05) išskyrimui, tačiau turėjo įtakos Staphylococcus pseudintermedius (39,02 proc. p<0,05) išskyrimui.
Ištirta, kad iš 41 tirto šuns, pas jaunesnius ir 5 metų amžiaus šunis 17,1 proc. dažniau buvo išskirti koaguliazei teigiami stafilokokai nei pas vyresnius negu 5 metų šunis (3 pav.) .
Šunų amžius
58,54% 41,46%
<5 >5
3 pav. Mikroorganizmai išskirti iš šunų, priklausomai nuo amžiaus
3.3.2. Lyties įtaka
Iš 22 mėginių imtų iš patelių, koaguliazei teigiami stafilokokai išskirti iš 13 (29,5 proc.). Iš 19 mėginių imtų iš patinų, mikroorganizmai išskirti iš 9 (25,0 proc.).
29 Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad šunų lytis neturėjo įtakos Staphylococcus aureus (p>0,05) ir Staphylococcus pseudintermedius (p>0,05) išskyrimui. Tačiau ištirta, kad iš 41 šuns, pas pateles mikroorganizmai buvo išskirti 7,3 proc. dažniau nei pas patinus (4 pav.).
Šunų lytis :
53,66% 46,34%
Patelė Patinas
4 pav. Mikroorganizmai išskirti iš šunų, priklausomai nuo lyties
3.3.3. Veislės įtaka
Iš visų tirtų šunų, dažniausiai mikroorganizmai buvo išskirti iš mišrūnų, 6 (14,63 proc.) mėginių (5 pav.). Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad šunų veislė turėjo įtakos mikroorganizmų paplitimui šunų tarpe (53,7 proc. p < 0,05).
0 10 20 14,63 4,97,3 7,3 0 7,3 2,4 2,4 2,4 2,4 0 0 2,4 0 2,4 Iš sk irtų m ik ro or ga niz m ų sk aičiu s, pr oc . Šunų veislės
5 pav. Mikroorganizmai išskirti iš skirtingų veislių šunų
3.3.4. Sezono įtaka
30
rugsėjo – vasario mėn. – ištirti 27 mėginiai.
vasario - rugsėjo mėn. – ištirta 14 mėginių.
Per šiuos du laikotarpius išskirtų mikroorganizmų procentinė išraiška pateikta (6 lentelėje).
6 lentelė. Laikotarpiu nuo rugsėjo – vasario mėn. ir nuo vasario - rugsėjo mėn. išskirti
mikroorganizmai
Mikroorganizmai išskirti
rugsėjo – vasario mėn. Procentai
Mikroorganizmai išskirti
vasario - rugsėjo mėn. Procentai
S. aureus 7,4 S. aureus 21,4
S. pseudintermedius 22,2 S. pseudintermedius 35,7
Iš viso stafilokokų: 29,6 Iš viso stafilokokų: 57,1
Atlikus statistinę analizę ištirta, kad iš 25 tirtų šunų, sezonas (nuo vasario iki rugsėjo mėn.) turėjo įtakos Staphylococcus aureus (21,4 proc. p<0,05) ir Staphylococcus pseudintermedius ( 35,7 proc. p<0,05) išskyrimui.
3.4. Gyvūnų augintinių savininkų nosies ertmės gleivinės mikrofloros tyrimas
Iš 41 žmogaus mėginių imtų iš nosies ertmės gleivinės po vieną mikroorganizmų rūšį nustatyta 21 (93,3 proc.) mėginyje, po dvi mikroorganizmų rūšis išskirta iš 2 (8,7 proc.) mėginių.
Staphylococcus genties mikroorganizmų buvo išskirta iš 16 (39,02 proc.). Iš kurių patogeninės Staphylococcus aureus padermės išskirtos iš 15 (36,5 proc.) mėginių. Staphylococcus pseudintermedius padermės buvo nustatytos tik 1 (2,4 proc.) mėginyje. Iš 7 (17,0 proc.) mėginių
išskirta Bacillus spp.
3.5. Gyvūnų augintinių ir jų savininkų mikrofloros palyginimas
Palyginus gautus rezultatus nustatėme, kad vyraujanti mikroflora yra panaši. Iš šunų dažniausiai buvo išskirtos Staphylococcus pseudintermedius (32,4 proc.), o pas šunų savininkų
31
Iš 5 šunų bei jų savininkų nosies ertmės buvo išskirta tos pačios rūšies S. aureus padermė, tai
sudarė 13,5 proc. visų išskirtų mikroorganizmų. Tos pačios rūšies S. pseudintermedius padermė buvo išskirta pas vieną šunį ir jo savininką, tai sudarė 2,7 proc.
Atlikus statistinę analizę ištirta, kad gyvūnų augintinių ir jų savininkų glaudus kontaktas turėjo įtakos S. aureus išskyrimui (p<0,05), o S. pseudintermedius išskyrimui įtakos neturėjo (p>0,05). 0 10 20 30 40 50 60 70
Staphylococcus aureus Staphylococcus pseudintermedius
Žmonės Šunys
6 pav.Mikroorganizmai išskirti iš gyvūnų augintinių ir jų savininkų
3.6. Įvairių veiksnių įtaka žmonių nosies ertmės vyraujančios mikrofloros pasireiškimui
Analizuota ar bakterijų išskyrimo dažnumui turėjo įtakos žmonių amžius, lytis, namuose gyvenančių žmonių bei auginamų šunų skaičius ir metų laikas.
3.6.1 Amžiaus įtaka
Žmonės pagal amžių buvo suskirstyti į dvi grupes:
1 grupė - < 50 metų – ištirta 32 žmonės.
2 grupė - > 50 metų – ištirta 9 žmonės.
Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad žmonių amžius neturėjo įtakos Staphylococcus aureus (p>0,05) ir Staphylococcus pseudintermedius (p>0,05) išskyrimui. Tyrimo metu ištirta, kad antroje grupėje mikroorganizmų buvo išskirta 42,9 proc. daugiau nei pirmoje (7 pav.).
32 Žmonių amžius 71,43% 28,57% <50 >50 7 pav. Mikroorganizmai išskirti iš žmonių priklausomai nuo jų amžiaus
3.6.2. Lyties įtaka
Koaguliazei teigiami stafilokokai pas moteris išskirti iš 11 (34,4 proc.) mėginių, o pas vyrus iš 5 (44,4 proc.) mėginių.
Vertinant lyties įtaka mikroorganizmų išskyrimui, gavome statistiškai nepatikimus rezultatus,
Staphylococcus aureus (p>0,05) ir Staphylococcus pseudintermedius (p>0,05).
3.6.3. Namuose auginamų šunų skaičiaus įtaka
Žmonės pagal laikomų namuose šunų skaičių buvo suskirstyti į tris grupes:
1 grupė - kurie laiko tik 1 šunį – ištirtas 31 žmogus.
2 grupė – kurie laiko po 2 šunis – ištirti 2 žmonės.
3 grupė – kurie laiko po 3 šunis ir daugiau – ištirti 5 šunys.
Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad namuose laikomų šunų skaičius, 15 atvejų turėjo įtakos Staphylococcus aureus (41,5 proc. p<0,05), tačiau neturėjo įtakos Staphylococcus
pseudintermedius (p>0,05) išskyrimui.
Ištirta, kad 1 grupėje daugiau buvo išskirta koaguliazei teigiamų stafilokokų nei kituose grupėse (8 pav.).
33 Šunų skaičius 47,06% 23,53% 29,41% 1 2 >3
8 pav. Mikroorganizmai išskirti iš žmonių priklausomai nuo namuose laikomų šunų skaičiaus
3.6.4. Namuose gyvenančių žmonių skaičiaus įtaka
Žmonės pagal gyvenančių namuose žmonių skaičių buvo suskirstyti į dvi grupes:
1 grupė – gyvena < 3 žmonės – ištirta 16 žmonių.
2 grupė – gyvena > 3 žmonės – ištirti 25 žmonės.
Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad namuose gyvenančių žmonių skaičius neturėjo įtakos
Staphylococcus aureus (p>0,05) ir Staphylococcus pseudintermedius (p>0,05) išskyrimui. Tačiau
pastebėta, kad iš abiejų tiriamų grupių, 1 grupėje mikroorganizmų buvo išskirta 21,9 proc. daugiau nei antroje grupėje (9 pav.).
Žmonių skaičius 39,02%
60,98%
<3 >3
9 pav. Mikroorganizmai išskirti iš žmonių, priklausomai nuo namuose gyvenančių
žmonių skaičiaus
3.6.5. Sezono įtaka
Keturis metų laikus suskirstėme į du laikotarpius:
rugsėjo – vasario mėn. – ištirti 26 mėginiai.
34 Atlikus statistinę analizę ištirta, kad laikotarpis nuo vasario iki rugsėjo mėn. turėjo įtakos 7 atvejams Staphylococcus aureus (70,0 proc. p<0,05) išskyrimui, tačiau įtakos Staphylococcus
pseudintermedius (p>0,05) išskyrimui nebuvo.
Mikroorganizmų buvo išskirta daugiau vasario – rugsėjo mėn., nei rugsėjo – vasario mėn (10 pav.). Metų laikas 30,00% 70,00% rugsėjis -vasaris vasaris -rugsėjis 10 pav. Sezono įtaka, mikroorganizmų išskyrimui, išreikšta procentais
3.7. Patogeninių stafilokokų nustatymas multiplex PGR metodu
Multiplex PGR metodas buvo naudojamas siekiant identifikuoti šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos bei jų savininkų nosies ertmės mėginiuose vyraujančias koaguliazei teigiamas
Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pseudintermedius padermes remiantis būdingu bazių porų
skaičiumi.
Tyrimas buvo atliktas multiplex PGR metodu, panaudojant specifinius pradmenis. Buvo atrinktas 21 koaguliazei teigiamas mėginys su galima S. aureus ar S. pseudintermedius paderme. Mėginiai imti iš šuns nosies ertmės ir tiesiosios žarnos. Pagal gautas bazių poras, remiantis Sasaki (2010) duomenimis, multiplex PGR metodu buvo identifikuotos 4 (19,0 proc.) koaguliazei teigiamos S. aureus padermės, turinčios 359 bazių poras (bp) ir 9 (42,9 proc.) S. pseudintermedius padermės, turinčios 926 bazių poras (bp) (11 pav.).
Iš žmonių nosies ertmės paimtų mėginių buvo atrinkta 16 koaguliazei teigiamų. Pagal gautas bazių poras, multiplex PGR metodu buvo identifikuota 10 (62,5 proc.) koaguliazei teigiamų S.
aureus padermių, turinčių 359 bazių porų (bp) ir 1 (6,3 proc.) S. pseudintermedius padermė, turinti
926 bazių porą (bp).
Multiplex PGR metodu patvirtintos S. aureus ir S. pseudintermedius padermės, aptiktos tiek šunų tiek ir jų savininkų mėginiuose. 35,1 (proc.) padermių sudarė mėginiai paimti iš šunų nosies
35 ertmės ir tiesiosios žarnos, 4,2 (proc.) padermių sudarė mėginiai paimti iš žmonių nosies ertmės. Kitos ankščiau rezultatuose minėtos Staphylococcus spp. padermės buvo identifikuotas remiantis biocheminėmis savybėmis ir komerciniu „Staphytest Plius“ (Oxoid, Anglija) testu.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
M
500bp 926bp
359bp
11 pav. DNR elektroforezė 1 proc. agarozės gelyje, naudojant multiplex PGR, S. aureus ir S.
pseudintermedius identifikavimui. 1 ir 10 – „GeneRuler TM“ 1000 bp DNR Markeris (MBI,
Fermentas). Teigiama kontrolė: 1 – Staphylococcus aureus (ATCC 9144). 2 - Staphylococcus
pseudintermedius (ATCC 49051). 5 – 8 - Staphylococcus aureus; 3; 9 - Staphylococcus
pseudintermedius. Neigiama kontrolė: 4. (nuotr. J. Šleiniūtės).
3.8. Mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas
2012 – 2013 metų laikotarpiu, buvo išskirtos mikroorganizmų padermės iš 21 šuns nosies ir tiesiosios žarnos, bei jų 16 savininkų nosies ertmės ir tiriamas atsparumas įvairioms antimikrobinėms medžiagoms.
Mikroorganizmų, išskirtų iš sveikų šunų nosies ertmės ir tiesiosios žarnos, bei jų savininkų nosies ertmės, atsparumas antimikrobinėms medžiagoms nurodytas 7 ir 8 lentelėje.
Atlikus išskirtų mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimą, nustatyta, kad Staphylococcus genties bakterijos atspariausios amoksicilinui, ampicilinui, penicilinui, gentamicinui, neomicinui (12 pav).
36 AML CN N AMP P 52,4 42,9 52,4 76,2 66,7 31,2 6,3 6,3 43,7 43,7 Šunys Žmonės
12 pav. Mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. AML –
