Astra Vitkauskienė

Astra Vitkauskienė

POTENCIALIŲ HOSPITALINĖS PNEUMONIJOS SUKĖLĖJŲ PSEUDOMONAS AERUGINOSA IR KLEBSIELLA PNEUMONIAE

PATOGENIŠKUMO VEIKSNIAI BEI JŲ ĮTAKA LIGOS EIGAI

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)

Disertacija rengta 2003 - 2007 metais Biomedicininių tyrimų instituto Pulmonologijos laboratorijoje, Kauno medicinos universiteto Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje bei Kauno medicinos universiteto klinikų Mikrobiologijos laboratorijoje.

Mokslinis vadovas:

2003 - 2006 metais m. dr. doc. Brigita Šitkauskienė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B).

2006 – 2007 metais m. dr. prof. Raimundas Sakalauskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B).

Turinys

1. Darbo tikslas ir uţdaviniai……… ……….6

2. Temos aktualumas ir mokslinis naujumas………...……….7 3. Literatūros apţvalga

3.1. Hospitalinės pneumonijos aktualumas……….………... .. 9 3.2. Hospitalinės pneumonijos etiologija ir sukėlėjų nustatymo svarba ...….10 3.3. Potencialių hospitalinės pneumonijos sukėlėjų Pseudomonas aeruginosa

ir Klebsiella pneumoniae patogeniškumo veiksniai………....13 3.4.Potencialių hospitalinės pneumonijos sukėlėjų Pseudomonas aeruginosa

ir Klebsiella pneumoniae atsparumas antibiotikams……...….….….….17 3.5. Hospitalinės pneumonijos etiologijos įtaka ligos eigai. ……….…19 4. Tiriamųjų kontingentas ir darbo metodologija

4.1. Pacientų tyrimo metodika...22 4.2. Laboratoriniai tyrimai...23 4.3. Bakteriologinis tyrimas

4.3.1. Pasėlio metodas………...23 4.3.2. Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae

identifikavimas ...24 4.3.3. Atsparumo antibiotikams įvertinimas ...25 4.3.4. Maţiausios slopinančiosios koncentracijos įvertinimas....26 4.4. Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae patogeniškumo

veiksnių tyrimas

4.4.1. Klebsiella pneumoniae plataus spektro beta laktamazių

tyrimas………..……….….…...…….27 4.4.2. Pseudomonas aeruginosa O serogrupių nustatymas……..27 4.4.3. Serumo baktericidinio poveikio tyrimas………...28 4.4.4. Pseudomonas aeruginosa padermių gebėjimo įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles tyrimas…...30 4.5. Statistinė analizė……….…...…32 5. Darbo rezultatai

5.1. Pseudomonas aeruginosa patogeniškumo veiksnių tyrimo duomenys 5.1.1. Pseudomonas aeruginosa padermių atsparumas serumo

5.1.2. Pseudomonas aeruginosa padermių gebėjimas įsiskverbti į

kvėpavimo takų epitelio ląsteles ……….……35

5.1.3.Pseudomonas aeruginosa padermių O serogrupinė priklausomybė...39

5.1.4.Pseudomonas aeruginosa padermių atsparumas antibiotikams...41

5.1.5. Pseudomonas aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių sąsajos………...43

5.2. Pseudomonas aeruginosa sukelta pneumonija sirgusių ar Pseudomonas aeruginosa padermėmis kolonizuotų pacientų klinikinės charakteristikos...51

5.3. Hospitalinę pneumoniją sukėlusių Pseudomonas aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių įtaka ligos eigai……….……55

5.4. Klebsiella pneumoniae patogeniškumo veiksnių tyrimo duomenys…..58

5.5. Klebsiella pneumoniae sukelta pneumonija sirgusių ar Klebsiella pneumoniae padermėmis kolonizuotų pacientų klinikinės charakteristikos...62

5.6. Hospitalinę pneumoniją sukėlusių Klebsiella pneumoniae padermių patogeniškumo veiksnių įtaka ligos eigai………...64

6. Rezultatų aptarimas………...…..……....67

7. Išvados……….…………..…...……..…...74

8. Darbo praktinė reikšmė ir rekomendacijos……….…75

9. Literatūra……….……….….76

10. Disertacijos tema spausdintų darbų sąrašas……….………...95

Santrumpos

AKT apatiniai kvėpavimo takai

APACHE II ūminės fiziologijos ir lėtinės sveikatos įvertinimo skalė II (angl. acute

physiology and chronic health evaluation II APACHE II)

BAL bronchoalveolinis lavaţas

CAZ ceftazidimas

CIP ciprofloksacinas

CNS centrinė nervų sistema CRB C reaktyvusis baltymas

CTX cefotaksimas

DPV dirbtinė plaučių ventiliacija

ESBL plataus spektro beta laktamazės (angl. extended spectrum beta

lactamases)

FBS fibrobronchoskopija

GKS Glasgow komų skalė

GM gentamicinas

H. influenzae Haemophilus influenzae

HP hospitalinė pneumonija

IMP imipenemas

ITS intensyvios terapijos skyrius

LPS lipopolisacharidas

KSV kolonijas sudarantys vienetai

K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae

LOPL lėtinė obstrukcinė plaučių liga

MEM meropenemas

MSK maţiausioji slopinančioji koncentracija

NCCLS Nacionalinis klinikinių laboratorijų standartų komitetas (angl.

National committee for clinical laboratory standards) S. aureus Staphylococcus aureus

S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

1. Darbo tikslas ir uždaviniai

Ištirti Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae padermių, kolonizavusių apatinius kvėpavimo takus ar sukėlusių hospitalinę pneumoniją, patogeniškumo veiksnius ir jų įtaką hospitalinės pneumonijos eigai.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti hospitalinę pneumoniją sukėlusių ar apatinius kvėpavimo takus kolonizavusių Pseudomonas aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnius - atsparumą serumo baktericidiniam poveikiui, gebėjimą įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles, atsparumą antibiotikams ir O serogrupinę priklausomybę. 2. Įvertinti Pseudomonas aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių tarpusavio

sąsajas.

3. Ištirti Klebsiella pneumoniae padermių, sukėlusių hospitalinę pneumoniją ar kolonizavusių apatinius kvėpavimo takus, gebėjimą gaminti plataus spektro beta laktamazes bei atsparumą antibiotikams.

4. Įvertinti Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae padermių patogeniškumo veiksnių įtaką hospitalinės pneumonijos eigai.

2. Temos aktualumas ir darbo mokslinis naujumas

Sunki hospitalinė pneumonija (HP) yra viena iš daţniausių būklių, lemiančių didelį mirštamumą [1, 2, 3]. Iki šiol nėra duomenų, vienareikšmiškai atsakančių į klausimą, kas būtent turi didţiausią reikšmę pneumonijos baigčiai. Tačiau įrodyta, kad ypač grėsminga mirštamumo poţiūriu HP, sukelta Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), todėl didelis dėmesys skiriamas rizikos veiksniams, lemiantiems šios pneumonijos išsivystymą, išaiškinti [4, 5, 6, 7]. Manoma, kad nemaţą vaidmenį vaidina sukėlėjo savybės – išskiriami toksinai ir agresyvūs metabolitai. Eksperimentiniuose modeliuose su gyvūnais nustatyta, kad P.

aeruginosa padermės skiriasi patogeniškumo veiksniais bei gebėjimu sukelti ligą [8, 9, 10,

11]. Tačiau nėra pakankamai duomenų, įrodančių skirtingus patogeniškumo veiksnius įgijusių P. aeruginosa padermių poveikį HP vystytis.

Nustatyta, kad daţnas antibiotikų naudojimas gali lemti P. aeruginosa padermių pakitimus ir daugiau patogeniškumo veiksnių turinčių padermių paplitimą [12, 13]. Dėka antibiotikų poveikio vyksta daugiau patogeniškumo veiksnių įgijusių P. aeruginosa padermių atranka. Todėl iš įvairiose gydymo įstaigose gydomų pacientų tiriamosios medţiagos išskirtų tos pačios serogrupinės priklausomybės P. aeruginosa padermių patogeniškumo veiksniai gali skirtis, nes skiriasi naudojamų antibiotikų spektras ir kiekis.

Įrodyta, kad P. aeruginosa padermėms, išorinės sienelės lipopolisacharido (LPS) sudėtyje turinčioms O antigeną, daţniau nustatomas patogeniškumo veiksnys - atsparumas serumo baktericidiniam poveikiui [14, 15]. Tačiau trūksta duomenų apie skirtingos O serogrupinės priklausomybės P. aeruginosa padermių gebėjimą slopinti ţmogaus serumo baktericidines savybes ir šio sukėlėjo gebėjimą įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles.

Šio darbo metu tyrėme skirtingos O serogrupinės priklausomybės P. aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių charakteristikas, kas Lietuvoje nebuvo tirta, o kitų šalių mokslininkų skelbiami rezultatai skiriasi. Mūsų darbas yra pirmas Lietuvoje, kurio metu ne tik nustatytas P. aeruginosa patogeniškumo veiksnys – atsparumas serumo baktericidiniam poveikiui, bet ir įvertinta galima šį patogeniškumo veiksnį įgijusių P. aeruginosa padermių įtaka HP vystytis bei ligos eigai.

Yra duomenų, įrodančių, kad kai kurios P. aeruginosa padermės “in vitro” gali įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles [16, 17, 18, 19, 20]. Tačiau mums nepavyko rasti duomenų, kad iki šiol kiti mokslininkai būtų vertinę šio P. aeruginosa patogeniškumo veiksnio reikšmę makroorganizmui. Todėl mūsų darbe vertintas P. aeruginosa padermių

gebėjimas įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles ir galima įtaka HP eigai, yra vertinti pirmą kartą apskritai.

Kita didėjanti problema - plataus spektro beta laktamazes (ESBL, angl. extended

spectrum beta lactamases) gaminančių Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) padermių

paplitimas ligoninėse [21, 22, 23]. Nustatyta, kad ESBL gaminančios K. pneumoniae padermės geba geriau prisitvirtinti prie epitelio ląstelių, yra atsparesnės serumo baktericidiniam poveikiui ir daugumai antibiotikų, todėl patogeniškesnės, palyginti su ESBL negaminančiomis K. pneumoniae padermėmis [24, 25, 26, 27]. Tačiau ESBL gaminančių padermių įtaka pacientų mirštamumui išlieka neaiški.

Šiame darbe pirmą kartą Lietuvoje buvo lyginamas hospitalinę pneumoniją sukėlusių ir pacientų apatinius kvėpavimo takus (AKT) kolonizavusių, K. pneumoniae padermių gebėjimas gaminti plataus spektro beta laktamazes bei šių K. pneumoniae padermių atsparumas antibiotikams.

3. Literatūros apžvalga

3.1. Hospitalinės pneumonijos aktualumas

HP išsivysto nuo 0,5 iki 2 proc. hospitalizuotų ligonių ir uţima antrą vietą tarp visų hospitalinių infekcijų [28]. Tarp hospitalinių infekcijų HP sudaro nuo 13 iki 18 proc., nors, Amerikos Hospitalinių Infekcijų Komiteto duomenimis, HP tarp visų hospitalinių infekcijų uţima 27 proc., iš kurių net 86 proc. atvejų išsivysto pacientams, kuriems taikoma dirbtinė plaučių ventiliacija (DPV) [28, 29].

Nustatyta, jog HP daţniau suserga pacientai, turintys rizikos veiksnių - prieš hospitalizuojant sirgę sunkiomis lėtinėmis ligomis, gydomi kortikosteroidais, esantys komos būklės, gydomi intensyvios terapijos skyriuje (ITS) [4, 30, 31]. Vyresnis paciento amţius taip pat didina HP tikimybę: sergamumas didėja iki 15 atvejų 1000 hospitalizuotų pacientų [32, 33]. Nepaisant darbuotojų pastangų ir naujų dezinfekcijos priemonių, naudojamų ventiliacijos aparatams dezinfekuoti, pacientams taikant DPV, HP daţnumas gali išaugti iki 20 kartų, palyginti su neventiliuojamais pacientais, ir siekia 6 - 52 atvejus 100 pacientų [34, 35, 36]. Intubuotiems pacientams pneumonijos tikimybę per pirmas 48 val. didina buvusi infekcija, ankstesnis antibiotikų naudojimas, komos gylis [37]. Pneumonijos išsivystymo tikimybę didina ir taikomos DPV trukmė. M. Langer duomenimis, HP susirgo 5 proc. pacientų, kuriems DPV truko 1 dieną ir atitinkamai 69 proc. pacientų, jei DPV buvo taikyta ilgiau kaip 30 dienų [38]. Pacientų, sirgusių HP, hospitalizacijos trukmė pailgėja vidutiniškai 7 - 9 dienomis.

Nors pneumonijos diagnostikos metodai tobulėja ir plečiasi antibakterinių vaistų spektras, pneumonija išlieka viena daţniausių infekcinės kilmės mirties prieţasčių [2, 3]. Sergančiųjų HP mirštamumo rodikliai yra nevienareikšmiai ir gali siekti net iki 93 proc. Mokslininkai iki šiol diskutuoja, kokią įtaką pacientų mirštamumui turi sunki pacientų būklė ir kaip tokių pacientų mirštamumą lemia išsivysčiusi HP. Kai kurių autorių duomenimis, mirštamumą didina gretutinės ligos, vyresnis ligonių amţius, sukėlėjų atsparumas antibiotikams, kitų organų paţeidimas, DPV bei gydymo ITS poreikis [31, 33, 39]. Vyresnių nei 65 metų asmenų, sergančių pneumonija, mirštamumas gali siekti iki 55 proc. [40]. Tačiau kitų mokslininkų nuomonė visai kitokia – teigiama, kad į studijas daţnai įtraukiami labai sunkios būklės pacientai, po įvairių chirurginių operacijų ar traumų, todėl pacientų mirštamumą daţniau lemia pagrindinė liga ir nepriklauso nuo pneumonijos išsivystymo [41, 42]. Iki šiol daugelyje pasaulio šalių, siekiant įvertinti galimus veiksnius ir prieţastis,

lemiančius HP eigą, sunkumą ir pacientų mirštamumą, atliekami tyrimai. Tačiau trūksta duomenų, kokią įtaką ligos eigai turi skirtingus patogeniškumo veiksnius įgiję sukėlėjai.

G. M. Matar su bendraautoriais nustatė, kad skirtingo genotipo P.aeruginosa padermės, skiriasi virulentiškumo veiksniais. Virulentiškiausios P.aeruginosa padermės, šio mokslininko duomenimis, priklausė 1 genotipui [43]. V. Denervaud studijos duomenys patvirtina, kad ne visos intubuotus pacientus kolonizuojančios P.aeruginosa padermės yra įgijusios patogeniškumo veiksnių [44].

3.2. Hospitalinės pneumonijos etiologija ir sukėlėjų nustatymo svarba

HP sukėlėjų spektras gali skirtis priklausomai nuo pacientų, gydomų ITS, populiacijos, hospitalizacijos trukmės bei naudojamų specifinių diagnostinių procedūrų. Europos Infekcijų Paplitimo ITS studijos skelbia, kad HP gali sukelti ir gramteigiami, ir gramneigiami sukėlėjai, tačiau svarbu tai, jog nustatyta, kad net 60 proc. šių sukėlėjų atsparūs daţniausiai vartojamiems antibiotikams [45]. Gramneigiamos bakterijos, tarp jų ir P. aeruginosa,

Acinetobacter species. ir Enterobacteriaceae šeimos lazdelės, sukelia nuo 55 iki 85 proc.

visų HP. Gramteigiami kokai (daţniausiai Staphylococcus aureus (S. aureus)) sukelia nuo 20 iki 30 proc. HP, tačiau 40 ar net 60 proc. HP sergančių pacientų nustatoma polimikrobinė pneumonijos etiologija [46, 47, 48, 49]. Norint konkrečiam pacientui nustatyti daţniausią tikėtiną sukėlėją, reikia atsiţvelgti į ligos sunkumą, gydymosi ligoninėje trukmę ir ankstesnį antibiotikų vartojimą.

ITS gydomų pacientų gretutinės ligos gali lemti HP, kurią sukelia tam tikri daţniausi sukėlėjai. Lėtine obstrukcine plaučių liga (LOPL) sergantiems pacientams didesnė tikimybė susirgti Haemophilus influenzae (H. influenzae) ar Moraxella catarrhalis, cistine fibroze sergantiems pacientams – P. aeruginosa ir/ar S. aureus sukelta HP [35, 50]. Pacientai, kurie gydomi ITS dėl traumos, daţniau linkę sirgti H. influenzae ar Streptococcus pneumoniae (S.

pneumoniae) sukelta HP, nors šie sukėlėjai pacientams, gydomiems ITS po transplantacijos,

pilvo organų ar kardiochirurginių operacijų, daţniausiai nesukelia pneumonijos [51].

Labai sunkiai sergantiems ir ITS gydomiems pacientams, tiems, kuriems taikoma ilgalaikė DPV, P. aeruginosa ir Acinetobacter species sukelia nuo 30 iki 50 proc. visų HP, nors šie sukėlėjai retai sukelia pneumoniją kituose skyriuose gydomiems pacientams [52, 53]. D. J. Weber duomenimis, oksacilinui atsparaus S. aureus išskyrimo daţnis nesiskyrė HP sergantiems pacientams, kuriems buvo taikoma ar netaikoma DPV, nors P. aeruginosa ar

Acinetobacter species daţniau buvo išskirtos iš ventiliacine pneumonija sergančių pacientų

AKT sekreto (17,50 proc.; 7,75 proc. ir atitinkamai 9,26 proc.; 1,11 proc.) [54].

Tačiau ne maţiau svarbu, vertinant galimą HP sukėlėją, atsiţvelgti ir į HP išsivystymo laiką. Jei pacientas pneumonija suserga iki penktos hospitalizacijos dienos, tikėtina, kad pneumoniją sukėlė tie patys mikroorganizmai, kurie paciento aplinkoje buvo iki hospitalizacijos ir kolonizavo paciento viršutinius kvėpavimo takus. Todėl jei HP suserga pacientai, kurie buvo gydyti ITS 2 – 4 dienas, daţniausiai nustatomi HP sukėlėjai - H.

influenzae, S. pneumoniae, meticilinui jautrus S. aureus ar antibiotikams jautrios Enterobacteriaceae šeimos bakterijos [36]. Tačiau jei pneumonija išsivystė vėliau, padidėja

tikimybė, kad HP sukėlė ligoninės aplinkoje cirkuliuojantys mikroorganizmai, daţnai atsparūs antibiotikams [55, 56]. Pacientai, kuriems pneumonija išsivysto vėliau kaip po keturių ITS gydymosi dienų (vėlyvoji HP), daţniau nustatomos P. aeruginosa, Acinetobacter

spp., meticilinui atsparus S. aureus ar atsparios daugumai antibiotikų Enterobacteriaceae

šeimos bakterijos [36, 52, 57].

Daug daţniau atsparios antibiotikams sukėlėjų padermės išskiriamos iš sergančių lėtinėmis kvėpavimo organų ligomis, gydytų antibiotikais iki susirgimo ar pneumonijos pradţioje netinkamai gydytų pacientų kvėpavimo takų sekreto. Negydytiems antibiotikais pacientams daţniau išskiriami įprastiniai, antibiotikams jautrūs sukėlėjai, o gydytiems – atsparesni, hospitaliniai mikroorganizmai [58, 59, 60]. Mūsų ankstesnio tyrimo duomenys taip pat parodė, kad reikšmingas H. influenzae kiekis daţniau buvo išskirtas iš antibiotikais iki tyrimo negydytų pacientų bronchoalveolinio (BAL) skysčio, o P. aeruginosa ir Acinetobacter

species kur kas daţniau buvo išskirti iš pacientų, gydytų antibiotikais ilgiau kaip 24 valandas,

BAL skysčio, palyginti su antibiotikais negydytų pacientų grupe [61].

Kadangi ligoninės aplinkoje cirkuliuoja hospitaliniai sukėlėjai, šie mikroorganizmai kolonizuoja ITS gydomų pacientų viršutinius kvėpavimo takus ir, esant virpamojo epitelio veiklos sutrikimui, padidėjus gleivių sekrecijai, sukėlėjai nepasišalina, ima daugintis ir, plisdami alveolėse, sukelia infekcinį plaučių audinio uţdegimą – pneumoniją. Hospitalizuotiems pacientams sukėlėjų patekimo tikimybę didina daugelis veiksnių: gulima padėtis, aspiracija skrandţio turiniu, sąmonės sutrikimas, trauma, chirurginės intervencijos, intubacija [55, 62, 63]. Jei pacientai intubuoti ir taikoma DPV, vamzdelio vidinis paviršius bei stambieji kvėpavimo takai kolonizuojami mikroorganizmų, pasiţyminčių padidėjusiu gebėjimu prisitvirtinti ne tik prie intubacinio vamzdelio, bet ir prie gleivinės epitelio [64, 65].

Tačiau į kvėpavimo takus patekę sukėlėjai sukelia pneumoniją ne visiems pacientams – tai lemia ne tik makroorganizmo savybės ir klinikinė būklė, bet ir sukėlėjo patogeniškumą lemiantys veiksniai [64].

Tirdami 22 ITS gydytų ir dirbtiniai ventiliuotų pacientų, kuriems nebuvo pneumonijos kriterijų, BAL skystį, Rodriguez de Castro su bendraautoriais nustatė, kad 18 proc. pacientų BAL skystyje mikroorganizmų išaugo >105

KSV/ml [66]. Tačiau po 48 val. keturiems iš šešių pacientų, kuriems iš BAL skysčio mikroorganizmų išaugo >103-4 _{KSV/ml, išryškėjo} pneumonija. Pacientai, kuriems mikroorganizmai neaugo ar skaičius (nors išaugo patogeniniai mikroorganizmai) buvo diagnostiškai nereikšmingas, pneumonija nesusirgo. Kai kurie autoriai savo darbuose neišskiria patogeninių ir pacientų kvėpavimo takus kolonizuojančių mikroorganizmų – vertinamas tik išaugintų mikroorganizmų skaičius [67]. Bet, jei norima tiksliau įvertinti pneumonijos etiologiją, tikslinga atsiţvelgti ir į išskiriamų sukėlėjų patogeniškumą.

Sergant pneumonija, sukėlėjų išskyrimas turi didelės reikšmės antibakterinio gydymo parinkimui – M. H. Kollef su bendraautoriais nustatė, kad, atlikus BAL skysčio mikrobiologinį tyrimą ir nustačius sukėlėją, 39,2 proc. pacientų pradinis empirinis gydymas antibiotikais gali keistis [68]. Mokslinių tyrimų duomenys rodo, kad pradinio pneumonijos gydymo neveiksmingumas didina uţsitęsusios pneumonijos eigos tikimybę [69, 70]. Nustatyta, kad netinkama empirinė antibiotikoterapija blogina ligos prognozę [71, 72, 73]. Netinkamais antibiotikais gydytų ligonių mirštamumas statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo tinkamai gydytų ligonių, jis siekė 81,6 proc. Šio tyrimo duomenimis, tinkamas ankstyvas empirinis pneumonijos gydymas buvo pagrindinis palankią ligos baigtį lėmęs veiksnys [74]. Įvairių autorių duomenimis, po invazinių diagnostinių pneumonijos kilmės tyrimų pradinis empirinis gydymas antibiotikais keičiamas nuo 35 proc. iki 71,7 proc. pacientų, o nustačius, kad HP sukėlė atsparios antibiotikams padermės, šių pacientų mirštamumas buvo reikšmingai didesnis [65, 75, 76].

P. Montravers su kolegomis tyrė sergančiuosius pneumonija ir nustatė, kad statistiškai reikšmingai daţniau pasveiko pacientai, kurių PSB (angl. protected specimen brush) pasėliai po 3 dienų buvo sterilūs, ar mikroorganizmų išaugo maţiau nei 103

KSV/ml [77]. V. Dudzevičius taip pat nustatė, kad po 5 - 7 dienų veiksmingo pneumonijos gydymo BAL skystyje mikroorganizmų išauga statistiškai kur kas rečiau nei tada, kai gydymas nesėkmingas [78]. E. H. Ibrahim su kolegomis duomenys parodė, kad neveiksmingas pradinis empirinis gydymas lyginant su pacientais, kuriems buvo skirtas veiksmingas gydymas, ilgina DPV ir

gydymo ITS trukmę (7 dienos ir 11d. atitinkamai, p<0,001 bei 9 dienos ir 13,5 d. atitinkamai, p<0,001) [71].

Didėjantis sukėlėjų atsparumas antibiotikams daţnai susijęs su pradinio empirinio gydymo neveiksmingumu gydant hospitalinę pneumoniją [71, 79]. Plataus veikimo spektro antibiotikų netinkamas vartojimas hospitalizuotiems pacientams didina daugelio hospitalinių sukėlėjų atsparių padermių vystymąsi [80, 81, 82]. Atsparios antibiotikams mikroorganizmų padermės daţniau išskiriamos iš sergančių lėtinėmis kvėpavimo organų ligomis, gydytų antibiotikais iki susirgimo ar pneumonijos pradţioje netinkamai gydytų pacientų kvėpavimo takų sekreto. Kai pneumoniją sukelia antibiotikams atsparios mikroorganizmų padermės, ligos baigtis būna blogesnė. Tačiau kai kurių autorių duomenys rodo, kad tai susiję ne su mikroorganizmo patogeniškumu, o su neadekvataus empirinio gydymo parinkimu [36, 52, 83].

Remiantis atliktų tyrimų duomenimis sudaromos standartinės pneumonijos gydymo rekomendacijos [84, 85, 86, 87], tačiau antibiotikų vartojimo skirtumai įvairiose šalyse gali lemti daţniausių pneumonijos sukėlėjų atsparumo antibiotikams skirtumus [88, 89]. Kadangi nustačius HP antibakterinis gydymas pradedamas empiriškai, jis turi remtis vietinių mikrobiologinių tyrimų ir nustatytų sukėlėjų atsparumo antibiotikams duomenimis. Sėkmingas pradinis empirinis gydymas maţina mikroorganizmų atsparumo vystymąsi ligoninėje bei leidţia sutrumpinti gydymo antibiotikais trukmę [90, 91].

3.3. Potencialių hospitalinės pneumonijos sukėlėjų Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae patogeniškumo veiksniai

Siekdami išgyventi juos supančioje aplinkoje, sukėlėjai genetiškai pakinta ir įgyja savybių, kurios jiems padeda prisitvirtinti (kolonizuoti), apsirūpinti mitybos produktais (fermentai) bei apsisaugoti nuo makroorganizmo imuninio ir neimuninio atsako. Visi šie genetiniai bakterijų apsaugos mechanizmai ir išskiriami augimo produktai yra patogeniškumo veiksniai, kurie padeda bakterijoms sukelti ligą [92, 93, 94].

Nors sunkiai sergančių pacientų kvėpavimo takai tradiciškai laikomi daţniausia P.

aeruginosa paţeidimo vieta, kadangi infekcija kyla tiesiogiai P. aeruginosa padermėms

kolonizavus kvėpavimo takus iš ţarnyno ar hematogeniniu keliu, tačiau ne visiems sukėlėju kolonizuotiems pacientams išsivysto infekcija [64]. Bakterinių infekcijų, taip pat ir HP, patogenezėje svarbų vaidmenį vaidina rizikos veiksniai, lemiantys infekcijos išsivystymą [4, 5, 95]. Ne ką maţiau reikšmingos ir sukėlėjų savybės – išskiriami toksinai ir agresyvūs

metabolitai. Eksperimentinių ir epidemiologinių studijų duomenys įrodo, kad P. aeruginosa padermės geba sintezuoti visą eilę patogeniškumo veiksnių, kurie susiję su sukėlėjo kolonizacija prie įvairių paviršių, dalyvavimu vystantis infekcijoms ir pacientų mirštamumu [96, 97, 98]. A. Roy-Burman su bendraautoriais infekcijų modelyje nustatė P. aeruginosa koreliaciją tarp III tipo sekrecinių baltymų fenotipo, pacientų mirštamumo ir aukšto ląstelinio toksiškumo [98]. T. I. Nicas ir B. H. Iglewski nustatė, kad skirtingi P. aeruginosa padermių tipai infekcijos stadijas veikia skirtingai. Prisitvirtinimas prie epitelio ląstelių, kolonizacija, gebėjimas įsiskverbti į ląsteles, diseminacija ir toksemijos sisteminis efektas priklauso nuo P.

aeruginosa tipo [99].

Įrodyta, kad sukėlėjo patogeniškumo veiksniai gali kisti priklausomai nuo aplinkos, kurioje jis persistuoja. Nustatyta, kad daţnas antibiotikų vartojimas gali sąlygoti P.

aeruginosa padermių transformaciją į labai virulentiškas padermes [12, 13]. Ch. Soscia su

bendraautoriais teigia, kad priklausomai nuo to, kokius patogeniškumo veiksnius įgijusios bakterijos paplitusios aplinkoje, priklauso ar sukėlėjas kolonizuoja ar išsivysto infekcija [100]. Mes taip pat kėlėme uţdavinį - nustatyti HP sukėlusių ir pacientų AKT kolonizavusių P.

aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnius ir palyginti, ar skirsis patogeniškumo

veiksnius įgijusių P. aeruginosa padermių daţnis abiejose grupėse.

P. aeruginosa padermių patogeniškumą lemia gebėjimas prisitvirtinti prie ląstelės

membranos pilėmis, išsidėsčiusiomis bakterijos ląstelės paviršiuje, gaminami ekstraląsteliniai polisacharidai ir toksinai, ląstelės sienelės lipopolisacharidas (endotoksinas) [101, 102]. P.

aeruginosa, taip pat kaip ir kitų gramneigiamų bakterijų, patogeniškumą įrodo dar viena labai

svarbi savybė - atsparumas serumo baktericidiniam poveikiui. Bakterija anksti atpalaiduoja LPS kompleksus, kurie nukenksmina makroorganizmo komplemento suaktyvintus bakterijų sunaikinimo mechanizmus.

Pseudomonų patogeniškumas priklauso ir nuo neutraliosios proteazės, proteazės II (elastazės), proteazės III (šarminės fosfatazės) gamybos. P. aeruginosa padermės daţniau neturi gebėjimo įsiskverbti į epitelio ląsteles, nors atsiţvelgus į aplinką, kurioje jos dauginasi, patogeniškesnės padermės gali įgyti ir šią savybę. Infekcinių ligų patogenezėje svarbūs P.

aeruginosa sintetinami egzotoksinai A (ETA) ir S (ETS) [103, 104, 105]. Nors

eksperimentiniuose tyrimuose ne visada nustatomas padidėjęs P. aeruginosa padermių, gaminančių ETA, virulentiškumas, tačiau ţmonių kraujo infekcijų tyrimai įrodo šio egzotoksino svarbą infekcijų patogenezėje [104]. P. aeruginosa sintetinamas egzotoksinas S paţeidţia audinius ir yra labiau atsparus karščiui. P. aeruginosa padermės, nesintezuojančios šio toksino, yra maţiau virulentiškos [105].

P. aeruginosa sienelės sudėtyje esantis LPS, kaip ir daugumos kitų gramneigiamų

lazdelių, sudarytas iš lipido A, oligosacharido ir O antigeno [92]. LPS virulentiškumas įrodytas įvairiose studijose su gyvūnų modelių sistemomis [106]. “In vitro” atliktų eksperimentų rezultatai rodo, kad P. aeruginosa mutantai, nesintetinantys O antigeno, yra jautrūs ţmogaus serumo baktericidiniam poveikiui, o sintetinantys O antigeną, daţniau atsparūs šiam poveikiui [15, 107]. Dauguma P. aeruginosa padermių, išskirtų iš cistine fibroze sergančių pacientų kvėpavimo takų sekreto, neturi LPS O antigeno ir yra jautrios serumo baktericidiniam poveikiui [107]. Atsparumas serumui susijęs su O antigeno buvimu ant ląstelės paviršiaus ir šis atsparumo laipsnis priklauso nuo O antigeno struktūros, grandinės ilgio ir O antigeno kiekio, esančio ant lipido A [108].

P. aeruginosa padermės gamina dvi O antigeno formas – homopolimerinį ţiedą A ir

heteropolimerinį ţiedą B. Nors kai kai kurių studijų rezultatai parodė, kad P. aeruginosa LPS apsaugo bakteriją nuo serumo baktericidinio poveikio ir sukelia imuninį atsaką, tačiau studijų duomenų, įrodančių skirtingos O serogrupinės priklausomybės P. aeruginosa padermių atsparumą serumo baktericidinio poveikiui, nepakanka [14, 106].

Manoma, kad P. aeruginosa padermių įsiskverbimas į epitelio ląsteles taip pat priklauso nuo LPS variacijų. P. di Martino nustatė, kad P. aeruginosa virulentiškumo savybės (citotoksiškumas ir gebėjimas prisitvirtinti prie kvėpavimo takų epitelio ląstelių) skiriasi priklausomai nuo serogrupinės priklausomybės [109]. Bet P. aeruginosa padermių gebėjimo įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles ir O serogrupinės priklausomybės ryšys dar nėra ištirtas, todėl atsparumo serumo baktericidiniam poveikiui ir serogrupinės priklausomybės sąsajų paieška šiuo metu yra aktuali problema.

K. pneumoniae padermių patogeniškumą lemia polisacharidinė kapsulė [110]. Storas

kapsulės fibrininis pluoštas dengia bakterijos paviršių ir apsaugo K. pneumoniae nuo polimorfonuklearų fagocitozės ir serumo baktericidinio poveikio. “In vitro” įrodyta, kad kapsulės polisacharidai slopina makrofagų gebėjimą atskirti sukėlėją. Tačiau nustatyta, kad kapsulę sintezuojančios K. pneumoniae padermės silpniau geba prisitvirtinti prie epitelio ląstelių [111]. K. pneumoniae virulentiškumas skiriasi dėka kapsulės tipų. Eksperimentiniame modelyje su pelėmis įrodyta, K. pneumoniae padermės, savo struktūroje turinčios kapsulės K1 ir K2 antigenus, yra virulentiškesnės nei kitų serotipų K. pneumoniae padermės [112]. K.

pneumoniae O1 serotipo padermės yra atsparesnės serumui, palyginti su kitomis O serogrupės padermėmis, o tos padermės, kurios priklauso K2 serotipui, rečiau suardomos granuliocitų ir makrofagų [113, 114, 115].

K. pneumoniae padermių patogeniškumas, kaip ir kitų gramneigiamų lazdelių,

priklauso nuo LPS. Tačiau ne visi endotoksinai yra vienodai nuodingi, jų toksiškumas priklauso nuo A lipido struktūros. LPS yra ląstelės sienelėje ir tik jai suirus patenka į aplinką. Maţos dozės nėra pavojingos, o didelės gali sukelti organizme šoką [116].

Infekcijos procese pirmas svarbus ţingsnis – kuo glaudesnis mikroorganizmo sąlytis su makroorganizmo gleivinės paviršiumi. K. pneumoniae pavišiuje esančios manozei jautrios ir manozei atsparios pilės lemia bakterijos prisitvirtinimą prie kvėpavimo takų epitelio ląstelių. Skirtingų pilių tipų įtaka infekcijai išsivystyti nėra pakankamai ištirta. Nustatytas naujas fimbrijų tipas, kuris būdingas daugumai K. pneumoniae padermių, gaminančių CAZ-5/SHV-4 tipo ESBL [25].

Kaip kitų sukėlėjų, taip ir K. pneumoniae, gebėjimas įgyti atsparumą antibiotikams, vertinamas kaip vienas iš patogeniškumo veiksnių [117]. B. R. Panhotra nustatė, kad jei bakteriemiją sukėlė K.pneumoniae padermės, gaminančios ESBL, prailgėjo pacientų hospitalizacijos trukmė ir šios padermės buvo susijusios su didesniu pacientų mirštamumu [118]. Tačiau ESBL gaminančių K. pneumoniae padermių įtaka HP eigai ir baigčiai nėra ištirta.

Sukėlėjai retai įgyja vieną kurį nors izoliuotą patogeniškumo veiksnį. Jei padermė yra įgijusi atsparumą serumo baktericidiniam poveikiui, kartu ji gali gaminti ir įvairius fermentus, padedančius jai išlikti. Šias patogeniškumo veiksnių sąsajas R. Podschun su bendraautoriais nustatė su K. pneumoniae padermėmis [110]. Vienas iš bakterijų patogeniškumo veiksnių – gebėjimas įgyti atsparumą antibiotikams taip pat patvirtina šiuos rezultatus. Įrodyta, kad ESBL gaminančios ir todėl atsparios beta laktaminiams antibiotikams, K. pneumoniae padermės turi daugiau kitų patogeniškumo veiksnių, palyginti su ESBL negaminančiomis K.

pneumoniae padermėmis [110]. H. Sahly su bendraautoriais įrodė, kad K. pneumoniae ESBL

gaminančios padermės yra atsparesnės fagocitozei, taip pat serumo baktericidiniam poveikiui [27, 113]. Nustatyta, kad ESBL gaminančios K. pneumoniae padermės geba geriau prisitvirtinti prie epitelio ląstelių. H. Sahly studijų duomenimis patogeniškas K. pneumoniae K2 serotipas daţniau nustatytas tarp ESBL gaminančių padermių palyginti su ESBL negaminančiomis K. pneumoniae padermėmis [24]. Įrodyta, kad K. pneumoniae rūšys, gaminančios R plazmidţių koduotas ESBL, susijusios su geresniu prisitvirtinimu prie epitelio ląstelių ir gali sukelti HI [25, 26].

Tačiau P. aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių – atsparumo serumo baktericidiniam poveikiui, gebėjimo įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles, atsparumo antibiotikams ir O serogrupinės priklausomybės charakteristikos nėra ištirtos.

3.4. Potencialių hospitalinės pneumonijos sukėlėjų Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae atsparumas antibiotikams

Vieno iš daţniausių vėlyvosios HP sukėlėjų P. aeruginosa sukeltų infekcijų gydymas antibiotikais yra problemiškas dėl šio mikroorganizmo didelio pradinio (įgimto) atsparumo antibiotikams. Įgimtas sukėlėjo atsparumas susijęs su P. aeruginosa gebėjimu apsisaugoti nuo antibiotiko skverbimosi per išorinę membraną dėl menko išorinės membranos laidumo, beta laktamazių sintezės ir dauginių aktyvaus antibiotikų pašalinimo iš ląstelės mechanizmų [119, 120, 121]. Dėl prigimtinių P. aeruginosa atsparumo antibiotikams savybių, kuriami nauji antibiotikai, veikiantys šį sukėlėją. Tačiau P. aeruginosa gebėjimas įgyti atsparumą priešpseudomoninį poveikį turintiems antibiotikams, vis dar kelia problemas daugelyje šalių, taip pat ir Lietuvoje [122, 123].

P. aeruginosa atsparumą beta laktaminiams antibiotikams lemia fermentai beta

laktamazės. Daţniausiai naudojamos Ambler ir Bush beta laktamazių klasifikacijos schemos (I priedas, 1 lentelė) [124, 125]. Beta laktamazės suardo beta laktaminio ţiedo jungtis. C (Ambler) klasės beta laktamazes koduoja ampC genas, esantis chromosomoje. Šios beta laktamazės lemia gamtinių, pusiau sintetinių penicilinų ir I-III cefalosporinų kartos inaktyvinimą. Plazmidėse koduotos A (Ambler) klasės beta laktamazės lemia atsparumą gamtiniams, pusiau sintetiniams penicilinams, I-IV kartos cefalosporinams [126]. P.

aeruginosa ląstelės išorinių struktūrų laidumo pakitimas ir C klasės beta laktamazių gamyba

lemia atsparumą karbapenemų grupės antibiotikams. Daugelio Europos šalių duomenys rodo didėjantį P. aeruginosa padermių atsparumą karbapenemams, susijusį su šiomis laktamazėmis [127, 128, 129, 130]. Šių laktamazių svarbą rodo A. P. Zavascki su bendraautoriais tyrimo duomenys: HP sergančių pacientų mirštamumas buvo didesnis, jei HP sukėlė metalo beta laktamazes gaminančios P. aeruginosa padermės [7].

P. aeruginosa atsparumą imipenemui lemia ir išorinių struktūrų pakitimas dėl mutacijų,

praradus OprD baltymą. Atsparumas meropenemui daţniausiai vystosi dėl MexAB-OprM pašalinimo sistemų [126]. Tai yra P. aeruginosa atsparumo mechanizmas, susijęs su aktyviu antibiotiko pašalinimu. L. Lauretti su bendraautoriais nustatė plataus spektro B klasės fermentą Italijoje VIM-1, kurį koduoja blaVIM genas. Visos blaVIM geną turinčios P. aeruginosa

padermėsbuvo atsparios ne tik karbapenemų grupės antibiotikams, daugumai beta laktaminių antibiotikų, bet ir fluorochinolonams bei kai kuriems aminoglikozidų grupės antibiotikams [131, 132, 133].

Aminoglikozidus neutralizuoja acetiltransferazės, adeniltransferazės/ nukleotidiltransferazės arba fosfotransferazės fermentai. Pakitusios antibiotiko molekulės nesugeba prisijungti prie ribosomų ir slopinti baltymo sintezės. Šių fermentų sintezę koduojantys genai yra plazmidėse. Priklausomai nuo gaminamo fermento, P. aeruginosa padermė atspari vienam aminoglikozidų grupės antibiotikui, gali išlikti jautri kitam aminoglikozidų grupės antibiotikui. P. aeruginosa lipopolisacharidų struktūros mutacijos gali lemti atsparumą visiems aminoglikozidų grupės antibiotikams. Nustatyta, kad P. aeruginosa padermių atsparumas antibiotikams skiriasi priklausomai nuo lipopolisacharidų struktūros ir tuo pačiu nuo O serogrupinės priklausomybės [134, 135].

Tačiau P. aeruginosa padermių atsparumas antibiotikams susijęs ir su antibiotikų politika ligoninėje ar šalyje, todėl, įvairių autorių duomenimis, net tos pačios serogrupinės priklausomybės P.aeruginosa padermių atsparumas antibiotikams skiriasi. J. Patzer duomenimis Lenkijoje aminoglikozidams ir beta laktaminiams antibiotikams atsparios P.

aeruginosa padermės daţniau priklausė O:12 serogrupinei [135]. Tačiau, anot J. J. Farmer,

antibiotikams atsparesnės P.aeruginosa padermės daţniau priklausė O:11 serogrupei [136]. Ciprofloksacinui P. aeruginosa padermės atsparios tampa atsiradus vienai geno parC ar dviem geno gyrA mutacijoms. Rečiau pasitaikantis P. aeruginosa atsparumo fluorochinolonų grupės antibiotikams mechanizmas - aktyvus antibiotiko pašalinimas. Fluorochinolonai išvedami iš ląstelės suaktyvėjus MexA-MexB ar kitoms pašalinimo sistemoms [137].

Parenkant P. aeruginosa sukeltų infekcijų gydymą praktiniame darbe, ieškoma naujų metodų, kuriais galima būtų naudotis skiriant antibiotikus empiriškai, kol P. aeruginosa atsparumas antibiotikams dar nenustatytas įprastais metodais. Kadangi įvairių šalių studijų duomenimis, dauginio atsparumo antibiotikams P. aeruginosa padermės priklauso skirtingoms O serogrupėms, svarbu ištirti ir įvertinti Lietuvoje ar didesnėje gydymo įstaigoje paplitusių P. aeruginosa padermių serogrupinę priklausomybę ir atsparumą antibiotikams. Kadangi šios P. aeruginosa savybės gali skirtis priklausomai netgi nuo infekcinio proceso lokalizacijos, parenkant tinkamą empirinį pneumonijos gydymą, būtina ţinoti ligoninėje vyraujančias P. aeruginosa padermių, išskirtų iš kvėpavimo takų, serogrupes ir jų atsparumą antibiotikams. J. J. Farmer duomenimis tos pačios serogrupinės priklausomybės P.

aeruginosa padermių (O:11) atsparumas gentamicinui, tobromicinui ir karbenicilinui skyrėsi

priklausomai nuo tiriamosios medţiagos, iš kurios jos buvo išskirtos. Iš šlapimo išskirtos O:11 serogrupinės priklausomybės P. aeruginosa padermės daţniau buvo atsparios antibiotikams, palyginti su P. aeruginosa padermėmis, išskirtomis iš kvėpavimo takų [136].

Prieš dešimtmetį K. pneumoniae jautrumas trečios kartos cefalosporinams svyravo nuo 100 proc. Suomijoje iki 84,3 – 86,7 proc. Londone ar Prancūzijoje [138, 139, 140]. Tačiau 1980 m., pirmą kartą nustačius ESBL gaminančias mikroorganizmų padermes, dėl ESBL paplitimo, Enterobacteriaceae šeimos bakterijų atsparumas dabar didėja ir tapo pasauline problema [21, 22, 141]. 2000 m. Rytų Europos šalyse (Rusijoje, Lenkijoje ir Turkijoje) 50 proc. išskiriamų K. pneumoniae padermių gamino ESBL [142, 143]. Nors ESBL molekulinė bazė yra plazmidţių medijuotų SHV-1, TEM-1 ir TEM-2 beta laktamazių mutacija, K.

pneumoniae gaminamos plazmidţių sintezuojamos ESBL ne visos susiję su TEM ar SHV

genais [144]. Šios beta laktamazės yra atsakingos uţ K. pneumoniae atsparumą cefamicinams. Padidėjusi SHV-5 beta laktamazių gamyba lemia ESBL gaminančių padermių atsparumą beta laktaminiams antibiotikams su inhibitoriais [145]. Šios beta laktamazės yra plačiausiai paplitusios pasaulyje ir apsprendţia K. pneumoniae didelį atsparumą ceftazidimui ir sumaţėjusį atsparumą cefotaksimui. Tam, kad būtų įvertintas šis atsparumas, reikia nustatyti K. pneumoniae padermių maţiausias slopinančiąsias koncentracijas (MSK) antibiotikui. TEM beta laktamazės struktūroje, pakitus bent vienai amino rūgščiai, gali pakisti

K. pneumoniae jautrumas cefalosporinams. Plazmidės, turinčios ESBL, daţnai kartu turi ir

aminoglikozidus neutralizuojančių fermentų [146].

K. pneumoniae atsparumą fluorochinolonų grupės antibiotikams lemia gyrA geno

mutacija. Tačiau šio geno mutacijos rečiau nustatomos iš klinikinės medţiagos išskirtoms K.

pneumoniae padermėms. Pastarųjų padermių atsparumą daţniau lemia parC ir parE genų

mutacijos. Galimas kryţminis atsparumas tarp fluorochinolonųir beta laktaminių antibiotikų vyksta dėl išorinių membranos baltymų paţeidimų [147]. Eksperimentiniame modelyje iš K.

pneumoniae padermių perkėlus ramA sritį į Escherichia coli padermes, įrodytas atsparumas

norfloksacinui [148].

K. pneumoniae padermių atsparumas karbapenemų grupės antibiotikams vystosi dėka

hidrolizinių beta laktamazių. ESBL gaminančios K. pneumoniae padermės turi dauginio atsparumo plazmides, kurios gali būti perduodamos vieno mikroorganizmo kitam. Šie sukėlėjai daţnai yra atsparūs ir fluorochinolonams, nors jiems atsparumas vystosi ne dėl plazmidţių, bet dėl topoizomerazės genų gyrA ar parC mutacijų [149].

3.5. Etiologijos įtaka hospitalinės pneumonijos eigai

Sergančiųjų HP mirštamumas priklauso nuo daugelio prieţasčių bei rizikos veiksnių, taikyto empirinio antibakterinio gydymo. Tyrimų duomenys rodo, kad išeitis daţniausiai

lemia pacientų būklė ir gretutinės ligos, bet ne sukėlėjas [150, 151]. J. F. Timsit ir bendraautoriai, tirdami ITS gydytus pacientus, kuriems buvo taikoma DPV, nustatė, kad pirmą dieną nuo DPV pradţios mirė 3 proc. ligonių, trečią dieną – 11 proc., o šeštą dieną – 19 proc. Nustatyta, kad tik pacientų gydymas ITS bei bendros būklės sunkumas, vertintas balais pagal APACHE II skalę, turėjo statistiškai reikšmingą įtaką nepalankiai ligos baigčiai. Sukėlėjo kiekis BAL skystyje bei didelės rizikos patogeno išskyrimas nepadidino mirties tikimybės [151].

Tačiau kitų autorių duomenys rodo, kad pacientų mirštamumas priklauso ir nuo HP sukėlusio etiologinio agento [4, 6]. Pacientų, sergančių HP mirštamumas siekia 30-50 proc., tačiau įrodyta, kad HP išeitys blogesnės, jei infekciją sukelia didelės rizikos patogenai - tokie kaip P. aeruginosa ar Acinetobacter baumannii. Tuomet pacientų mirštamumas gali siekti net iki 70 proc. [4, 6, 58, 152]. Yra duomenų, kad reikšmingo sukėlėjo kiekio išskyrimas, polimikrobinė pneumonijos kilmė, didesnės rizikos patogeno išskyrimas bei antibiotiko pakeitimo poreikis pagal pasėlio rezultatus reikšmingai didina mirties tikimybę [153].

Pacientų, sergančių HP, sukelta antibiotikams atsparių K. pneumoniae ar enterokokų padermių, mirštamumas taip pat gali siekti 46-75 proc. [81]. A. P. Zavascki su bendraautoriais duomenimis pacientų, sergančių P.aeruginosa sukelta HP, kuriems buvo taikyta DPV, vėlyvasis mirštamumas vertinant po 30 dienų, siekė 60 proc. Šio ir ankstesnio tyrimo duomenimis sergančiųjų mirštamumas buvo didesnis, jei pneumoniją ar kitas hospitalines infekcijas sukėlė P.aeruginosa padermės, gaminančios metalo beta laktamazes [7, 154].

P. aeruginosa sukeltos infekcijos sunkiai gydomos dėl sukėlėjo gebėjimo greitai įgyti

atsparumą antibiotikams. Tačiau daugėja įvairių studijų duomenų, kurie įrodo, kad net ir skiriant adekvatų antibakterinį gydymą, P.aeruginosa sukeltos infekcijos susijusios su dideliu pacientų mirštamumu [155, 156, 157, 158]. Todėl vis dar bandoma įvertinti galimą P.

aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių įtaką pneumonijos išsivystymui, eigai ir

pacientų išeitims.

N. Kyobu duomenys parodė, kad uţkrėtus peles P. aeruginosa padermėmis, atspariomis serumo baktericidiniam poveikiui, hemoraginė pneumonija su bakteriemija bei letalia išeitimi išsivystė daţniau nei uţkrėtus P.aeruginosa padermėmis, jautriomis serumo baktericidiniam poveikiui [159].

Kadangi P. aeruginosa padermės pasiţymi dideliu gebėjimu prisitaikyti jas supančioje aplinkoje ir tuo pačiu įgyti įvairius apsaugos veiksnius, šių veiksnių įtaka infekcijos eigai nėra pilnai ištirta. Nepakanka duomenų apie skirtingus patogeniškumo veiksnius įgijusių P.aeruginosa padermių galimą poveikį pacientų mirštamumui. Todėl

šiame darbe mes kėlėme sau uţdavinį ne tik ištirti P. aeruginosa padermių, sukėlusių HP ar kolonizavusių pacientų AKT atsparumą serumo baktericidiniam poveikiui, gebėjimą įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles, O serogrupinę priklausomybę ir atsparumą antibiotikams, bet ir įvertinti šių patogeniškumo veiksnių įtaką HP eigai. Taip pat nuatatyti P. aeruginosa padermių patogeniškumo veiksnių skirtumus HP sukėlusių ir pacientų AKT kolonizavusių P. aeruginosa padermių grupėse.

4. Tiriamųjų kontingentas ir darbo metodologija

4.1. Pacientų tyrimo metodika

Atlikta 240 pacientų, 2001 – 2004 m., gydytų Kauno medicinos universiteto klinikų neurochirurgijos ir centriniame ITS, retrospektyvinė duomenų analizė. Darbo metodika aprobuota Kauno regiono nepriklausomos biomedicininių tyrimų etikos komisijos (protokolo Nr. 174/2004).

Į tyrimą buvo įtraukti 240 pacientų, iš kurių AKT sekreto buvo išskirtos P. aeruginosa ar K. pneumoniae padermės, duomenys. 195 pacientams iš paimtos tiriamosios medţiagos (bronchoalveolinio lavaţo skysčio ar bronchų aspirato) buvo išskirtos P. aeruginosa, 45 pacientams – K. pneumoniae padermės.

Visiems 240 pacientų, pirmą dieną įtarus galimą pneumoniją bei pakilus kūno temperatūrai daugiau kaip 37ºC, buvo atliktas AKT sekreto mikrobiologinis pasėlis, krūtinės ląstos rentgenograma, kraujyje ištirtas leukocitų (x 109

/l), neutrofilų (proc.) ir C reaktyvinio baltymo g/l (CRB) kiekis, kraujo dujų sudėtis.

Išskirtos P. aeruginosa ar K. pneumoniae padermės buvo priskirtos HP sukėlėjams, jeigu mikrobiologiniame pasėlyje augo reikšmingu kiekiu ( 104

KSV/ml BAL skysčio bei trijuose (gausiai) ar keturiuose (labai gausiai) Petri lėkštelės sektoriuose bronchų sekreto) ir mikrobiologinio tyrimo paėmimo dieną buvo nustatyti visuotinai priimti pneumonijos kriterijai [30], kurie pasireiškė ne anksčiau kaip per 48 val. nuo paciento hospitalizavimo:

naujai atsiradę plaučių audinio infiltracijos rentgenologiniai poţymiai ir:

bent vienas iš šių poţymių: kosulys, skrepliavimas, kūno temperatūra ≥38,5ºC ar <35ºC;

arba bent du iš šių poţymių: dusulys, pleurinis skausmas, plaučių konsolidacijos fizikiniai poţymiai, leukocitų daugiau 10 109 _{g/l arba maţiau 1,5 10}9

g/l.

Dirbtinai ventiliuojamiems pacientams hospitalinė pneumonija diagnozuota remiantis visuotinai priimtais pneumonijos kriterijais [30], kurie pasireiškė ne anksčiau kaip per 48 val. nuo paciento hospitalizavimo:

naujai atsiradę plaučių audinio infiltracijos rentgenologiniai poţymiai ir:

bent du iš šių poţymių: kūno temperatūra ≥38,5ºC ar <35ºC, pūlingas tracheobronchinis sekretas, leukocitų daugiau 10 109 _{g/l arba maţiau 1,5 10}9

g/l.

Jei kriterijų patvirtinti HP diagnozę neuţteko, išskirta P. aeruginosa ar K. pneumoniae padermė vertinta kaip kvėpavimo takus kolonizuojantis mikroorganizmas.

DPV trukmė vertinta nuo HP diagnozės nustatymo dienos. Pacientų mirštamumas vertintas po 1 savaitės (ankstyvasis mirštamumas) ir po 1 mėnesio (vėlyvasis mirštamumas).

Kaip svarbūs veiksniai, vertintos daţniausios HP predisponuojančios būklės: galvos smegenų trauma, nervų sistemos ligos (epilepsija, myasthenia gravis), širdies ir kraujagyslių ligos (išeminė širdies liga, hipertenzija), virškinimo trakto ligos (gastritas, pankreatitas), komos gylis HP pradţioje (vertinimas balais pagal Glasgow (GKS) komų skalę), pacientų būklės sunkumas HP pradţioje (vertinimas balais pagal APACHE II skalę) vertintos kaip svarbūs veiksniai [160]. APACHE II skalės rodmenį sudarė amţiaus, lėtinių ligų buvimo, sąmonės būklės, vertinant pagal GKS, ir fiziologinių rodiklių balų suma.

4. 2. Laboratoriniai tyrimai

Pirmą dieną, įtarus galimą pneumoniją, visiems tirtiesiems asmenims buvo atliktas krūtinės ląstos rentgenografinis tyrimas. Per 24 val. po fibrobronchoskopijos (FBS) ar BAL buvo atliekamas periferinio kraujo tyrimas automatiniais analizatoriais „CELL – DYN“ 3500 SL (Abbott Diagnostics, JAV), „Coulter STKS“ (Coulter Corporation, JAV). CRB kiekis kraujyje tirtas naudojant analizatorių “Behring Nephelometer Analyzer II” (Dade Behring, Vokietija). Jei tiriant pulsoksimetru hemoglobino įsotinimas deguonimi buvo maţesnis nei 92 proc., buvo nustatoma arterinio kraujo dujų sudėtis tiriant a. radialis arba a. femoralis punkcijos metu paimtą bandinį. Naudoti “Radiometer ABL 540” (Radiometer, Danija), “IL System 1306” (Instrumentation Laboratory, JAV) analizatoriai.

4.3. Bakteriologinis tyrimas

4.3.1. Pasėlio metodas

Tiriamosios medţiagos bronchų sekreto ar BAL skysčio mikrobiologinis tyrimas atliktas per 1 val. nuo medţiagos paėmimo pagal standartinę metodiką [161]. Prieš mikrobiologinį tyrimą, mikroskopuojant padidinus 100 kartų, įvertinta ėminio kokybė – plokštaus bei cilindrinio epitelio ląstelių ir leukocitų kiekis regėjimo lauke. Padidinus 1000 kartų, įvertinta vyraujančių bakterijų forma ir išsidėstymas, daţymosi pobūdis. Naudojant 0,01 ml kalibruotas kilpeles, necentrifuguotas BAL ar bronchų sekretas inokuliuotas ant 5

proc. kraujo agaro (BBL, JAV), šokolado agaro (BBL, JAV) ir Mac Conkey (Oxoid, Anglija) terpės. BAL skystis paskirstytas kilpele nuo viršutinio Petri lėkštelės sektoriaus iki apatinio štrichais, bronchų sekretas - sektoriais. Su kita sterilia kilpele ant uţsėto 5 proc. kraujo agaro uţdėtas simbiozinio stafilokoko (Staphylococcus olseri) brūkšnys. Uţsėti kraujo ir šokolado agarai inkubuoti 5 proc. CO2 sąlygomis 35 C temperatūroje 24 val. Mac Conkey terpė inkubuota 18 - 24 val. 35 C temperatūroje. Po 24 val. pasėliai perţiūrėti, suskaičiuotas kolonijas fsudarančių vienetų (KSV) skaičius/ml BAL skysčio 100 (skiedimo koeficientas). Suskaičiavus terpėje: < 10 kolonijų 100 = < 103

KSV/ml; nuo 10 iki 100 kolonijų 100 = 103 - 104 KSV/ml; nuo 100 iki 1000 kolonijų 100 = 104 - 105 KSV/ml; > 1000 kolonijų 100 = > 105 KSV/ml. Reikšmingu kiekiu laikėme sukėlėjo koncentraciją 104 KSV/ml BAL skysčio. Bronchų sekreto pasėlis vertintas pusiau kiekybiniu metodu pagal augimo gausumą sektoriuose. Jei mikroorganizmai augo tik pirmame sektoriuje – 1+ (pavienės kolonijos), antrajame sektoriuje – 2+ (vidutiniškai), trijuose sektoriuose – 3+ (gausiai), keturiuose sektoriuose – 4+ (labai gausiai). Reikšmingu laikėme, jei išskirtas sukėlėjas mitybos terpėje augo gausiai ar labai gausiai.

4.3.2. Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae identifikavimas

P. aeruginosa padermės atrinktos naudojant Pseudomonas agarą su cetrimidu

(Liofilchelm, Italija), kuris slopina kitų bakterijų, taip pat ir kitų Pseudomonas rūšių, išskyrus

P. aeruginosa, augimą. P. aeruginosa dėl gaminamo piocianino ir fluoresceino nudaţo šią

terpę mėlynai ţaliu pigmentu. Atrinktos P. aeruginosa padermės galutinai patvirtintos naudojantis Phoenix ID sistema (Becton Dickinson, JAV) ar API 20NE sistema (API bioMerieux, Nürtingen, Vokietija).

K. pneumoniae identifikuotos pagal biochemines savybes [161]. Po 1 - 2 kolonijas,

kurios augo ant Mac Concey terpės, su sterilia kilpele perkelta į mėgintuvėlius su terpėmis, sudarančiomis “margą” eilutę: Kliglerio geleţies agarą (Oxoid, Anglija), Simonso citrato agarą (BBL, JAV), manito ir druskos agarą (Liofilchem, Italija), fenilalanino agarą (Liofilchem, Italija), šlapalo agaro terpę (Liofilchem, Italija), SIM terpę (Oxoid, Anglija). Jei sacharidai suskaidyti iki rūgščių ir CO2, sintezuota katalazė bei lizino dekarboksilazė, suskaidytas simonso citratas ir šlapalo hidrolizė, nesintezuotas indolas, įvertinta K.

pneumoniae padermė. Neaiškiai atvejais kultūra patikslinta naudojantis Crystal ID sistema

4.3.3. Atsparumo antibiotikams įvertinimas

Atsparumo antibiotikams nustatymas diskų difuzijos metodu atliktas remiantis standartine metodika [162]. Nuo kraujo agaro pasirinktos 3 - 5 gerai izoliuotos, tokio pat morfologinio tipo kolonijos. Sterilia kilpele kultūra perkelta į mėgintuvėlį su steriliu fiziologiniu tirpalu. Nustatytas 0,5 MacFarlando drumstumas (atitinkantis 1 – 2 × 10-8 KSV/ml). Steriliu vatos tamponėliu uţsėtas Miulerio - Hintono agaro (Oxoid, Anglija) paviršius, braukiant tamponu per sterilaus agaro paviršių. Ši procedūra pakartota dar du kartus, kiekvieną kartą pasukant Petri lėkštelę maţdaug 60°kampu, kad bakterijų suspencija pasiskirstytų tolygiai. Antibiotikų diskai uţdėti iš karto ant visos lėkštelės naudojant skirstytuvą arba kiekvienas diskas su steriliu pincetu uţdėtas atskirai, gerai prispaudţiant prie Miulerio - Hintono agaro paviršiaus. Petri lėkštelės inkubuotos 35˚C temperatūroje. Po 18-24 val. matuotos mikroorganizmų augimą slopinančios zonos, apvalinant iki pilno milimetro. Slopinimo zonų dydţiai interpretuoti pagal Nacionalinio klinikinių laboratorijų standartų komiteto (NCCLS - angl. National committee for clinical laboratory standards) M2 - A6 lenteles (1, 2 lentelės). Kontrolei naudota standartinė P. aeruginosa ATCC 27853 ir E. coli ATCC 25922 padermės.

1 lentelė. Pseudomonas aeruginosa atsparumo antibiotikams ribos pagal NCCLS standarto M2 - A6 lenteles

Antibiotikas Koncentracija diske Zonos diametras, mm

Atsparu Jautru Piperacilinas Ceftazidimas Imipenemas Meropinemas Gentamicinas Amikacinas Ciprofloksacinas 100 μg 30 μg 10 μg 10 μg 10 μg 30 μg 5 μg < 17 < 14 < 13 < 15 < 12 < 14 < 15 > 18 > 18 > 16 > 20 > 15 > 17 > 21

2 lentelė. Klebsiella pneumoniae atsparumo antibiotikams ribos pagal NCCLS standarto M2 - A6 lenteles

Antibiotikas Koncentracija diske Zonos diametras, mm

Atsparu Jautru Piperacilinas Cefotaksimas Ceftazidimas Imipenemas Meropenemas Gentamicinas Amikacinas Ciprofloksacinas 100 μg 30 μg 30 μg 10 μg 10 μg 10 μg 30 μg 5 μg < 17 < 14 < 14 < 13 < 13 < 12 < 14 < 15 > 21 > 23 > 18 > 16 > 16 > 15 > 17 > 21

4.3.4. Mažiausios slopinančiosios koncentracijos įvertinimas

Bakterijų suspensija paruošta ir Miulerio - Hintono agaras uţsėtas atliktas NCCLS standartu [162]. Ant uţsėto Miulerio - Hintono agaro uţdėtos specialios E testų juostelės, prisotintos antibiotikų skirtingomis koncentracijomis. Petri lėkštelės inkubuotos 35˚C temperatūroje. Po 18 - 24 val. vertintos mikroorganizmų augimą slopinančios koncentracijos. Slopinančiosios koncentracijos interpretuotos pagal NCCLS M2 - A6 lenteles (3 lentelė)

3 lentelė. K. pneumoniae atsparumo antibiotikams ribos pagal NCCLS standarto M2 -

A6 lenteles

Antibiotikas Maţiausios slopinančiosios koncentracijos (µg/ml) Jautru Vidutiniškai atsparu Atsparu Cefotaksimas Ceftazidimas Imipenemas Meropenemas Gentamicinas Amikacinas Ciprofloksacinas <8 <8 <4 <4 <4 <16 <1 16-32 16 8 8 8 32 2 >64 >32 >16 >16 >16 >64 >4

4.4. Pseudomonas aeruginosa ir Klebsiella pneumoniae patogeniškumo veiksnių tyrimas

4.4.1. Klebsiella pneumoniae plataus spektro beta laktamazių tyrimas

Naudojantis dviejų antibiotikų diskų sinergetiniu metodu, atrinktos K. pneumoniae padermės, galimai gaminančios ESBL. Dviejų diskų sinergetinis metodas buvo atliekamas, kaip NCCLS standartinis diskų difuzijos metodas [162]. Nustačius 0,5 MacFarlando K.

pneumoniae suspensijos drumstumą ir uţsėjus Miulerio - Hintono agarą (Oxoid, Anglija),

cefotaksimo (30 µg) ir ceftazidimo (30 µg) diskai bei tarp jų amoksicilino (20 µg) su klavulanine rūgštimi (10 µg) diskas buvo uţdėti ant Miulerio - Hintono agaro 20 mm atstumu tarp diskų centrų. Atsiradus bakterijų augimo slopinimo zonai apie amoksicilino su klavulanine rūgštimi diską, reiškiantį, kad yra sinergizmas tarp klavulano rūgšties ir vieno iš tirtų antibiotikų, buvo laikyta, kad galimai tai susiję su ESBL gamyba. Sinergetinis veikimas tarp klavulanato su ceftazidimu ir cefotaksimu buvo patvirtintas naudojantis specialiomis E testų juostelėmis (AB Biodisk, Solna, Švedija), prisotintomis ceftazidimo ir ceftazidimo su klavulanatu bei cefotaksimo ir cefotaksimo su klavulanatu skirtingomis koncentracijomis. Jeigu klavulanatas kurio nors minėto antibiotiko MSK sumaţino du kartus, buvo patvirtinta ESBL gamyba. Atliekant ESBL patvirtinančius tyrimus, kiekvienąkart buvo naudota K.

pneumoniae ATCC 700603 ir E. coli ATCC 25922 padermės. Atsparumas vartojamiems

antibiotikams buvo lyginamas tarp ESBL gaminančių ir ESBL negaminančių K. pneumoniae padermių.

4.4.2. Pseudomonas aeruginosa O serogrupių nustatymas

P. aeruginosa padermių serogrupėms nustatyti naudoti serumai, turintys specifinių

antikūnų prieš P. aeruginosa O grupės antigenus (Denka Seiken, Tokyo, Japonija). Taikytas raidinis kodavimo pricipas, kurį Japonijos P. aeruginosa serotipavimo komiteto draugija (Serotyping Committee for the Japanese Society) patvirtino kaip atitinkantį Lanyi ir Bergan skaitmeninę schemą [163, 164]. Buvo aprobuotas ţymėjimas arabiškais skaitmenimis nuo O:1 iki O:15. 13 somatinių antigenų priklauso 1-4, 6, 7 ir 9-14 serogrupėms, tarp jų 5 ir 8 laisvos [165]. Ţymėjimas abėcėlės raidėmis, taip pat kaip ir ţymėjimas romėniškais skaitmenimis, buvo pritaikytas šiai schemai, todėl galima lyginti šalių duomenis (II priedas, 2 lentelė).

A-N serogrupės nustatytos agliutinacijos metodu, remiantis Homma metodika [163, 164].

0,01 ml sterilia kilpele paimta P. aeruginosa kolonija ištirpinta steriliame fiziologiniame tirpale ir paruošta bakterijų suspensija. Vienas lašas specifinio O grupės serumo ir viena pilna bakterijų suspensijos kilpelė sumaišyta ant stiklelio ir vertinta agliutinacija. Fiziologinis tirpalas be serumo naudotas kaip neigiama kontrolė. Jei bakterijų suspensijos agliutinacija su specifiniu serumu įvyko per 1 minutę ir nebuvo agliutinacijos ant kontrolinio stiklelio, reakcija vertinta kaip teigiama. Jei agliutinacija įvyko po 1 minutės arba bakterijų suspensija agliutinavo su daugiau nei 1 specifiniu serumu, tyrimas buvo pakartotas prieš tai bakterijų suspensiją pakaitinus 121°C temperatūroje 90 min.

4 lentelė. Agliutinacijos reakcijos rezultatų vertinimas

Fiziologinio tirpalo-antigeno reakcija

Antikūno-antigeno reakcija Rezultatas Spontaniška agliutinacija

(-)

Aiški agliutinacija per 1

minutę Teigiamas (+)

Spontaniška agliutinacija (-)

Nėra agliutinacijos per 1 minutę

Neigiamas (-)

Spontaniška agliutinacija (+)

Agliutinacija nevertinama Abejotinas, kartojama pakaitinus bakterijų suspensiją 121°C temperatūroje 90 min

4.4.3. Serumo baktericidinio poveikio tyrimas

P. aeruginosa padermių gebėjimo slopinti serumo baktericidinį poveikį tyrimas “in

vitro” atliktas remiantis R. Podschun ir H. Sahly aprašytomis metodikomis [113, 166].

Bakterijų paruošimas

Po 3 - 5 P. aeruginosa kolonijas, išaugintas ant kraujo agaro ar Mac Conkey terpės, perkelta į 10 ml mėgintuvėlius su smegenų ir širdies buljonu ir inkubuota 37ºC temperatūroje. Po 12 – 14 val. inkubacijos po 200 µl bakterijų suspensijos perkelta į kitus 10 ml mėgintuvėlius su smegenų ir širdies buljonu ir inkubuota 3 val. 37ºC temperatūros vandens vonelėje kratant. Po inkubacijos mėgintuvėliuose su logaritminėje augimo fazėje esančiomis bakterijomis išmatuotas optinis tankis, naudojant 578 nm bangą. Viršutinis mėgintuvėlių

centrifugavus 1800 ×g 10 minučių. Procedūra, kiekvieną kartą uţpylus ir nupylus fosfatinio buferio tirpalo, kartota 3 kartus. Pagal standartinę kreivę apskaičiuoti reikiami skiedimai ir pridėta 0,9 proc. NaCl tiek, kad susidarytų galutinė bakterijų koncentracija 2 × 106

/ml.

Tyrimo atlikimas

Tyrimas toliau atliktas mikrotitravimo plokštelėje 1 bakterijų kultūrai naudojant 4 šulinėlius (t0, t1, t2, t3). Į kiekvieną šulinėlį įpilta po 75 µl ţmonių serumo. Ţmonių serumas tyrimui sudarytas iš 100 sveikų donorų kraujų mišinio. Po 25 µl paruoštos bakterijų suspensijos, pradedant nuo t3 šulinėlių, supilstyta į visus tyrimui naudojamus plokštelės šulinėlius. Iš t0 šulinėlių po 100 µl ir iš pradinių mėgintuvėlių po 25 µl bakterijų suspensijos iš karto buvo išsėta į Petri lėkšteles su smegenų ir širdies agaru ir padėta inkubacijai į 37°C termostatą. Atlikus iš t0 šulinėlių pasėlius, mikrotitravimo plokštelė tuoj pat buvo įdėta į termostatą ir inkubuota 37°C temperatūroje, kas 1 val. paeiliui išsėjant iš t1, po to iš t2 ir vėliausiai iš t3 šulinėlių bakterijų suspensiją į Petri lėkšteles su smegenų ir širdies agaru. Visos Petri lėkštelės padėtos inkubacijai į 37°C termostatą ir inkubuotos 12 – 14 val.

.

Tyrimo vertinimas

Po inkubacijos suskaičiuotos Petri lėkštelėse išaugusių P. aeruginosa kolonijų skaičius ir įvertintas kolonijų augimo santykis pirminiame pasėlyje, po 1 val., po 2 val. ir po 3 val. serumo poveikio. Bakterijų gebėjimas išlikti gyvybingomis ţmogaus serumo poveikyje vertintos 3 val. bėgyje ir suskirstytos į 6 lygius. P. aeruginosa padermės jautrios serumo baktericidiniam poveikiui priskirtos 1 - 2 lygiui, vidutiniškai atsparios – 3 - 4 lygiui, atsparios 5 - 6 lygiui. Lygiai buvo skirstomi taip: 1 lygis – bakterijų kolonijų skaičius agare po 1 val. ir po 2 val. < 10 proc. nei pradinėje bakterijų suspensijoje, po 3 val. < 0,1 proc.; 2 lygis – bakterijų kolonijų skaičius agare po 1 val. 10 proc. - 100 proc., po 3 val. < 10 proc.; 3 lygis - bakterijų kolonijų skaičius agare po 1 val. > 100 proc., po 2 ir po 3 val. < 100 proc.; 4 lygis – po 1 val. ir po 2 val. > 100 proc., po 3 val. < 100 proc.; 5 lygis - po 1 val., po 2 val. ir po 3 val. > 100 proc., bet sumaţėjo 3 val. laikotarpyje; 6 lygis – po 1 val., po 2 val., po 3 val. 100 proc. ir didėja 3 val. laikotarpyje. Padermės, kurių kolonijų augimas buvo tolygus > 10 ir < 100 po 1 val., po 2 val. ir po 3 val., buvo priskirtos 3 lygiui. Kiekviena P. aeruginosa padermė buvo ištirta 3 kartus. P. aeruginosa padermės jautrumo ar atsparumo serumo baktericidiniam poveikiui lygis buvo nustatytas, jei visų 3 tyrimų rezultatai buvo vienodi. Kiekvieno tyrimo

metu kartu su tiriamomis bakterijų padermėmis tirtos ir kontrolinės serumui jautri (1 lygio) ir serumui atspari (6 lygio) P. aeruginosa bei K. pneumoniae padermės. Kontrolinės padermės buvo patvirtintos ir aprašytos Dr. R. Podschun (Kylio universitetas).

4.4.4. Pseudomonas aeruginosa padermių gebėjimo įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles tyrimas

P. aeruginosa padermių gebėjimo įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles tyrimas

“in vitro” atliktas remiantis H. Sahly aprašyta metodika [111].

Ląstelių kultūrų paruošimas

Į Falcon tipo mėgintuvėlį supiltos ţmogaus alveolių epitelio ląstelės A 549 (JAV ląstelių kultūrų kolekcija), uţpilta 5 ml terpės F 12 K (Biochrom Seromed, Vokietija) ir centrifuguota 12 000 aps. greičiu 10 min. Gauta ląstelių suspensija supilta į plokščią uţsukamą ląstelių auginimo indą, įpilta dar 20 ml terpės F 12 K ir inkubuota 37°C temperatūroje 5 proc. CO2 sąlygomis 48 val. Po 48 val. inkubacijos terpė nupilta, ant dugno nusėdusios ląstelės praplautos uţpylus Dulbeko fosfato tirpalo (Biochrom Seromed, Vokietija), kuris praskalavus nupiltas. Įpilama 4 ml Dulbeko fosfato ir 1 ml tripsino (PAA laboratories, Austrija). Po kelių minučių šis tirpalas nupiltas, uţpilta 20 ml terpės F 12 K ir išpilstyta po 1 ml į plokštelę su šulinėliais. Plokštelė inkubuota 37°C temperatūroje 5 proc. CO2 sąlygomis 72 val.

Bakterijų paruošimas

Po 2-3 P. aeruginosa kolonijas, išaugintas ant kraujo ar Mac Conkey agaro, perkelta į 2 ml mėgintuvėlius su Lurea sultiniu (Difco, JAV) ir inkubuota 37ºC temperatūroje 12–14 val. Kitą dieną po 16 µl bakterijų suspensijos perkelta į kitus 2 ml mėgintuvėlius su Lurea sultiniu ir inkubuota 2 val. 37ºC temperatūros vandens vonelėje kratant. Po inkubacijos mėgintuvėliuose su logaritminėje augimo fazėje esančiomis bakterijomis, išmatuotas optinis tankis, naudojantis 578 nm banga. Viršutinis mėgintuvėlių turinys su terpe nupiltas, o nuosėdos plautos uţpylus fosfatinio buferio tirpalo (pH 7,2) ir centrifugavus 1800 × g 10 minučių. Procedūra, kiekvieną kartą uţpylus ir nupylus fosfatinio buferio tirpalo, kartota 3

kad susidarytų galutinė bakterijų koncentracija 2 × 106

/ml.Iš pradinių mėgintuvėlių po 25 µl bakterijų suspensijos iš karto buvo išsėta į Petri lėkšteles su smegenų ir širdies agaru ir padėta inkubacijai 24 val. į 37°C termostatą.

Tyrimo atlikimas

Į plokštelę, kurios šulinėlių dugnas padengtas ląstelių kultūra, įdedama po 50 µl paruoštos P. aeruginosa suspensijos. Plokštelė inkubuota 37°C temperatūroje 5 proc. CO2 sąlygomis 3 val. Po inkubacijos plokštelės šulinėliuose esanti terpė nupilta, praplauta 3 kartus Dulbeko fosfato tirpalu ir į kiekvieną šulinėlį supilta po 1 ml paruoštos terpės su tobromicinu (tobromicino 200 µl/ml). Plokštelė inkubuota 37°C temperatūroje padidinto CO2 sąlygomis 2 val. Po inkubacijos plokštelės šulinėliuose esanti terpė su antibiotiku nupilta, praplauta 3 kartus Dulbeko fosfato tirpalu ir į kiekvieną šulinėlį supilta po 1 ml 0,2 proc. Deoxycholato (Sigma, JAV). Plokštelė dedama ant kratytuvo 4 min. Iš plokštelės po 100 µl suspencijos išsėta į Petri lėkšteles su smegenų ir širdies agaru. Visos Petri lėkštelės inkubuotos 37°C temperatūroje termostate 12 – 14 val.

Tyrimo vertinimas

Po inkubacijos Petri lėkštelėse išaugusių P. aeruginosa kolonijos suskaičiuotos ir įvertintas kolonijų augimo santykis pradinėje Petri lėkštelėje ir po tyrimo, apskaičiavus P.

aeruginosa gebėjimo įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles procentą:

A

xB proc

x 100 .

x - gebėjusių įsiskverbti į ląsteles procentas, A – kolonijų skaičius prieš tyrimą,

B – kolonijų skaičius po tyrimo.

P. aeruginosa padermių gebėjimas įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles

suskirstytas į 3 lygius :

kai x = 0 - 1 proc., P. aeruginosa padermės vertintos kaip neturinčios gebėjimo įsiskverbti į epitelio ląsteles,

kai x = 1 – 2 proc., P. aeruginosa padermės vertintos kaip vidutiniškai gerai gebančios įsiskverbti į epitelio ląsteles,

kai x = > 2 proc., P. aeruginosa padermės vertintos kaip gerai gebančios įsiskverbti į epitelio ląsteles.

Kiekviena bakterijų padermė buvo ištirta 3 kartus. Padermės gebėjimas įsiskverbti į kvėpavimo takų epitelio ląsteles buvo nustatytas, jei abiejų tyrimų rezultatai gauti vienodi.

4.5. Statistinė duomenų analizė atlikta SPSS Version 10.0 for Windows (Statistical

Package for Social Sciences, Microsoft Inc., USA) statistine programa. Analizuojant daţnių

skirtumą tarp kelių grupių naudotas neparametrinis statistinis kriterijus 2

bei Fisher’io tikslaus tikimybių palyginimo testas. Skirtumai tarp grupių laikyti statistiškai reikšmingais, kai paklaidos tikimybė p<0,05.