LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Silvija Žigaitė
Pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens tarša antibiotikams
atspariomis bakterijomis
Prevalence of antibiotic-resistant bacteria in industrial
aquaculture water bodies
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: dr. Irena Klimienė
2
DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Pramoninių žuvininkystės tvenkinių
vandens tarša antibiotikams atspariomis bakterijomis“:
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Silvija Žigaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Žydrūnė Klungienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Dr. Irena Klimienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
Dr. Raimundas Mockeliūnas
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Prof. dr. Artūras Stimbirys
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Bakterijų atsparumas antibiotikams ... 10
1.1.1. Genetiniai atsparumo mechanizmai... 10
1.1.2. Biocheminiai atsparumo mechanizmai ... 11
1.1.3. Bakterijų atsparumo antibiotikams paplitimas pasaulyje ... 13
1.2. Vandens užterštumas antibiotikams atspariomis bakterijomis ... 14
1.3. Antibiotikų naudojimas ir bakterijų atsparumas akvakultūroje ... 15
1.3.1. Antibiotikų naudojimas akvakultūroje ... 17
1.3.2. Bakterijų atsparumo antibiotikams tyrimai akvakultūroje ... 18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 22
2.1. Tyrimo vieta ir objektai ... 22
2.2. Medžiagos paėmimas, bakterijų išskyrimas ir identifikacija ... 22
2.3. Išskirtų bakterijų atsparumo antibiotikams nustatymas ... 24
2.4. Tyrimo duomenų statistinis vertinimas ... 25
3. TYRIMO REZULTATAI ... 26
3.1. Iš pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens išskirtų bakterijų rūšinė įvairovė ... 26
3.2. Iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens išskirtų bakterijų atsparumas antibiotikams27 3.2.1. Išskirtų Pseudomonas genties bakterijų atsparumas antibiotikams ... 27
3.2.2. Išskirtų Aeromonas genties bakterijų atsparumas antibiotikams ... 30
3.2.3. Išskirtų Micrococcus genties bakterijų atsparumas antibiotikams ... 31
3.2.4. Kitų išskirtų bakterijų atsparumas antibiotikams ... 31
4
3.2.6. Išskirtų bakterijų atsparumas tetraciklinui ... 32
3.2.7. Išskirtų bakterijų atsparumas ciprofloksacinui ... 32
3.2.8. Išskirtų bakterijų atsparumas chloramfenikoliui ... 32
3.2.9. Išskirtų bakterijų atsparumas gentamicinui ... 33
3.2.10. Išskirtų bakterijų atsparumas cefpodoksimui ... 33
3.2.11. Išskirtų bakterijų atsparumas sulfametoksazolui–trimetoprimui ... 33
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 34
IŠVADOS ... 38
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
5 PRAMONINIŲ ŽUVININKYSTĖS TVENKINIŲ VANDENS TARŠA ANTIBIOTIKAMS
ATSPARIOMIS BAKTERIJOMIS Silvija Žigaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Antimikrobinių medžiagų naudojimas akvakultūroje skatina įvairių rūšių bakterijų atsparumo antibiotikams formavimąsi (41, 43). Šio darbo tikslas – nustatyti pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens taršą antibiotikams atspariomis bakterijomis.
Tyrimo metu ištirti vandens mėginiai iš 5 pramoninių žuvininkystės tvenkinių. Išskirtos 104 bakterijų padermės, iš kurių 47 buvo atsparios bent vienai antimikrobinei medžiagai. Išskirtos bakterijos identifikuotos, stebint jų augimą ant mitybinių ir selektyvių terpių, taikant klasikinius ir biocheminius identifikacijos metodus. Daugiausia išskirta Pseudomonas spp. (68,09 proc.), Aeromonas spp. (10,64 proc.) ir Micrococcus spp. (8,51 proc.) genčių izoliatų.
Kirby–Bauer metodu nustatytas išskirtų bakterijų padermių atsparumas 7 antimikrobinėms medžiagoms. Nustatyta, kad bakterijų izoliatai atsparūs ampicilinui (91,5 proc.) ir cefpodoksimui (78,7 proc.). Išskirtos bakterijos buvo jautrios ciprofloksacinui (91,5 proc.), tetraciklinui (85,1 proc.) ir gentamicinui (80,9 proc.). 78,7 proc. išskirtų bakterijų padermių buvo atsparios 3 ir daugiau antimikrobinių medžiagų klasėms.
Nustatyta, kad atsparumas antimikrobinėms medžiagoms priklausė nuo mikroorganizmų genties ir rūšies. Ampicilinas ir sulfametoksazolas–trimetoprimas geriau veikė Micrococcus spp. bakterijas nei A. veronii (p<0,05). Tetraciklinas buvo veiksmingesnis prieš P. aeruginosa nei prieš A. veronii ir kitas Pseudomonas spp. bakterijas (p<0,05). Taip pat tetraciklinas geriau veikė P. fluorescens nei kitus Pseudomonas spp. izoliatus (p<0,05). Chloramfenikolis buvo veiksmingesnis prieš A. veronii nei prieš Micrococcus spp. ir Pseudomonas spp. bakterijas (p<0,05). Gentamicinas geriau veikė P. aeruginosa nei P. fluorescens bakterijas (p<0,05), o cefpodoksimas buvo veiksmingesnis prieš A. veronii nei prieš Pseudomonas spp. izoliatus (p<0,05).
Atliktu tyrimu nustatyta, kad antibiotikams atsparios bakterijos yra paplitusios Lietuvos žuvininkystės tvenkinių vandenyje.
6 PREVALENCE OF ANTIBIOTIC-RESISTANT BACTERIA IN INDUSTRIAL
AQUACULTURE WATER BODIES Silvija Žigaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
The administration of antimicrobials in aquaculture promotes the development of various antibiotic-resistant bacterial strains (41, 43). The aim of this study was to determine the prevalence of antibiotic-resistant bacteria in industrial aquaculture water bodies.
During this study, 5 water samples were collected from different industrial water bodies in Lithuania. 104 bacterial strains were isolated, 47 of which were resistant to at least one antibiotic. Bacteria were identified by observing the growth on nutrient and selective agar plates and by applying classical and biochemical identification methods. The most common isolated bacterial strains were Pseudomonas spp. (68.09%), Aeromonas spp. (10.64%), Micrococcus spp. (8.51%).
The Kirby Bauer method was used to determine the antimicrobial resistance of the isolated bacteria to seven antibiotics. Bacterial isolates were resistant to ampicillin (91.5%) and cefpodoxime (78.7%). Isolated bacteria were susceptible to ciprofloxacin (91.5%), tetracycline (85.1%) and gentamicin (80.9%). 78.7% of bacterial isolates were multidrug-resistant strains (resistant to at least 3 antibiotic classes).
Statistical analysis showed that antimicrobial resistance depends on the genus and species of the bacteria. Ampicillin and sulfamethoxazole-trimethoprim were more effective against Micrococcus spp. than A. veronii isolates (p<0.05). Tetracycline was more effective against P. aeruginosa than A. veronii and other Pseudomonas spp. isolates (p<0.05). Tetracycline was also more effective against P. fluorescens than other Pseudomonas spp. isolates (p<0.05). Chloramphenicol was more effective against A. veronii than Micrococcus spp. and Pseudomonas spp. isolates (p<0.05). Gentamicin was more effective against P. aeruginosa than P. fluorescens bacteria (p<0.05). Cefpodoxime was more effective against A. veronii than Pseudomonas spp. isolates (p<0.05).
The results of this study showed that antibiotic-resistant bacteria are common in Lithuanian aquaculture water bodies.
7
SANTRUMPOS
AER – Aeromonas agaras (EO Labs, Jungtinė Karalystė) AMP – ampicilinas
C – chloramfenikolis CIP – ciprofloksacinas
CLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas CN – gentamicinas
CPD – cefpodoksimas
DHFR – dihidrofolato reduktazė DHPS – dihidropteroato sintetazė DNR – deoksiribonukleino rūgštis
EUCAST – Europos jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimų komitetas KOH – kalio šarmas
MAC – MacConkey agaras (Liofilchem, Italija) MDR – daugiaatsparios bakterijos
MDR AB – Acinetobacter MDR agaras (EO Labs, Jungtinė Karalystė) MSA – Manito druskos agaras (Liofilchem, Italija)
NDM–1 – naujojo štamo Delio metalo–β–laktamazė 1 PPB – peniciliną prijungiantys baltymai
RNR – ribonukleino rūgštis spp. – rūšys
SXT – sulfametoksazolas–trimetoprimas TE – tetraciklinas
8
ĮVADAS
Antimikrobinės medžiagos yra nepakeičiamos infekcinių ligų gydyme. Tačiau nepalyginamai greitai patogenai išvysto atsparumą medžiagoms, sukurtoms taip vadinamu auksiniu antibiotikų atradimo laikotarpiu, kuris tęsėsi nuo XX amžiaus ketvirtojo iki septintojo dešimtmečio. Šiuo metu daugumai antimikrobinių medžiagų yra atsparūs įvairių patogeninių bakterijų rūšių klinikiniai izoliatai – Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, taip pat kai kurios enterobakterijų, salmonelių bei šigelų rūšys (1, 2).
Pastaraisiais metais antibiotikai tampa vis mažiau efektyvūs prieš įprastas bakterines infekcijas (3). Gausus antimikrobinių medžiagų naudojimas visų šalių ligoninėse, bendruomenėse bei žemės ūkyje skatina atsparių padermių vystymąsi ir brangesnių plataus spektro antibiotikų naudojimą (4, 5).
Atsparumas vystosi mutuojant mikrobams bei vykstant selekcijai dėl antibiotikų naudojimo. Neoptimalios vaistų dozės taip pat skatina selekcinį atsparumo antimikrobinėms medžiagoms didėjimą. Atsparumo genus perneša chromosominės determinantės ir vis dažniau – mobilios nechromosominės determinantės. Taip išsivysčiusios atsparios bakterijų padermės greitai plinta visame pasaulyje. Šį plitimą skatina tarprūšinis bakterijų genų perdavimas, nepakankama ligoninių ir bendruomenių higiena, ligų plitimas bei pasaulinė prekyba (6).
Gausus antibiotikų naudojimas stebimas veterinarinėje medicinoje, žemės ūkyje ir akvakultūroje, nes jie naudojami ligų gydymui bei prevencijai. Remiantis grubiais skaičiavimais, manoma, kad iš kasmet pagaminamų 100 000–200 000 tonų antimikrobinių medžiagų, didžioji dalis naudojama žemdirbystės, sodininkystės bei veterinariniuose sektoriuose. Be to, tyrimų duomenimis, naudojant viso genomo sekvenavimą, įrodytas atsparumo genų perdavimas tarp žmonėms ir gyvūnams būdingų mikroorganizmų (5, 6, 7).
Antimikrobinių medžiagų naudojimas lemia ir kitą svarbią problemą – vandens užterštumą atspariomis bakterijomis. Vandens mikroorganizmai gali būti vietiniai arba egzogeniniai – laikinai ar retkarčiais aptinkami vandenyje, patekę iš gyvūnų, augalų ar dirvos. Tyrimais nustatyta, kad daugiau kaip 90 proc. bakterijų padermių, priklausančių jūros mikrobiotai, yra atsparios vienam ar daugiau antibiotikų ir 20 proc. atsparios mažiausiai 5 antimikrobinėms medžiagoms. Vietinių vandens organizmų atsparumo tyrimai yra svarbūs, nes jie gali parodyti žmogaus veiklos poveikio mastą vandens ekosistemoms (8).
Akvakultūroje esančios antibiotikams atsparios bakterijos taip pat kelia pavojų ir visuomenės sveikatai. Nustatyta, kad 70–80 proc. žuvininkystėje naudojamų antibiotikų patenka į aplinką. Apskaičiuota, kad 15–40 proc. pašarų ir kartu su jais naudojamų antibiotikų nėra suvartojami
9 gyvūnų ir nukrenta tiesiai ant žuvininkystės tvenkinių dugnų. Manoma, kad akvakultūroje naudojamų antibiotikų patekimas į aplinką gali neigiamai paveikti žmonių sveikatą ir ekosistemas, kadangi antimikrobinių medžiagų likučiai tiesiogiai bei netiesiogiai daro įtaką maisto grandinėms (9, 10).
Darbo tikslas: Nustatyti pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens taršą antibiotikams
atspariomis bakterijomis.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti bakterijas iš pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens. 2. Identifikuoti išskirtų bakterijų rūšinę sudėtį.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bakterijų atsparumas antibiotikams
Bet kurio antimikrobinio vaisto sėkmingą taikymą trikdo galimas atsparumo išsivystymas veikliajai medžiagai nuo pirmo jos panaudojimo. Šį rezistentiškumo susidarymą lemia platus spektras biocheminių ir fiziologinių mechanizmų (11). Bakterinis atsparumas glaudžiai susijęs su antimikrobinių medžiagų naudojimu klinikinėje praktikoje. Kai antimikrobinės medžiagos paveikia bakteriją, jautrūs vienaląsčiai žūna, tačiau tie, kuriems būdingas atsparumas, išgyvena. Antibiotikams atsparaus fenotipo išsivystymas priklauso nuo įvairių faktorių: rezistentiškumo išsivystymo laipsnio, mikroorganizmo galimybių toleruoti atsparumo mechanizmą, pradinės infekcijos vietos ir kt. Kai rezistentiškumą lemiantis veiksnys įsiterpia plazmidėje, jis plinta greitai tarp tos pačios rūšies bakterijų ir net tarp kitų rūšių mikroorganizmų. Kai atsparumas antibiotikams susijęs su chromosomų genais, rezistentiški mikroorganizmai plinta lėčiau (12, 13).
Bėgant metams nuolatinis įvairių antimikrobinių medžiagų naudojimas lėmė atsparumo mechanizmų išsivystymą, kurie tapo atsakingi už atsparumą vienai ar daugiau veikliųjų medžiagų. Manoma, kad atsparumo mechanizmai išsivystė iš antibiotikus gaminančių organizmų genų. Dauginis atsparumas nustatytas šiems mikroorganizmams: P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli, išplėsto spektro β–laktamazes gaminantiems K. pneumoniae, vankomicinui atspariems E. faecium ir S. aureus, meticilinui atspariems S. aureus, M. tuberculosis, S. enterica serovarui Typhimurium, S. dysenteriae, H. influenzae, Stenotrophomonas bei Burkholderia. Atsparumas antibiotikams gali būti įgyjamas kaip chromosomų mutacija, tačiau dažniausiai rezistentiškumas siejamas su mobiliomis nechromosominėmis DNR determinantėmis, gautomis iš kitų bakterijų per plazmides, transpozonus ir integronus. Efliukso siurblys yra pagrindinis bakterijų daugiaatsparumo mechanizmas (12–15).
1.1.1. Genetiniai atsparumo mechanizmai
Bakterijų atsparumas antibiotikams gali būti rūšiai būdingas ar įgimtas, kuris priklauso nuo mikroorganizmo biologijos (pavyzdžiui, visos gram–neigiamos bakterijos turi būdingą atsparumą vankomicinui). Atsparumas taip pat gali būti įgytas. Jis pasireiškia dėl:
1) įgytų egzogeninių genų per plazmides, transpozonus, integronus ir bakteriofagus; 2) ląstelės genų mutacijų;
3) šių mechanizmų kombinacijų (12, 15, 16).
Mutacijos. Chromosominės mutacijos yra gana retos (viena 106–108 mikroorganizmų populiacijoje) ir dažnai nulemia atsparumą struktūriškai panašiems junginiams. Šios mutacijos pasireiškia kaip replikacijos klaidos arba kaip klaidinga pažeistos DNR pataisa. Jos vadinamos spontaninėmis mutacijomis ar nuo augimo priklausančiomis mutacijomis. E. coli atsparumas
11 kvinolonams priklauso nuo pokyčių mažiausiai 7 aminorūgštyse, priklausančiose gyrA genui, arba nuo pokyčių 3 aminorūgštyse, priklausančiose parC genui, tačiau vienintelė mutacija rpoB gene lemia visišką atsparumą rifampinui. Kai kurie biocheminiai atsparumo mechanizmai yra mutacijų pasekmės. Mutacijos gali pakeisti antibiotikų pasisavinimą bei efliukso pompas (12, 13).
Horizontalus genų perdavimas. Atsparumo genų perdavimas iš vienos bakterijos kitai yra
vadinamas horizontaliu genų perdavimu. Pagrindiniai šių genų perdavimo mechanizmai yra perdavimas plazmidėmis, perdavimas per virusus bei laisvos DNR perdavimas. Genai gali būti perduodami 3 pagrindiniais būdais: transdukcija (per bakteriofagus ir integronus), konjungacija (per plazmides ir konjunguojančius transpozonus) bei transformacija (per chromosominės DNR ar plazmidžių įterpimą į chromosomą). Tuomet genai įterpiami į recipiento chromosomą rekombinacijos ar transpozicijos būdu ir taip gali įvykti vienas ar keli genų sekos pokyčiai (12–15, 17–19).
Atsparumo genų perdavimas yra efektyvesnis nei chromosomų mutacijos. Plazmidėse užkoduoti genai suteikia atsparumą pagrindinėms antimikrobinių medžiagų klasėms (cefalosporinams, fluorokvinolonams ir aminoglikozidams), toksiškiems sunkiesiems metalams (gyvsidabriui, kadmiui, sidabrui) bei perduoda virulentiškumo determinantes, kurios padeda ląstelei išgyventi mirtinas antibiotikų dozes (12, 14, 17, 18).
1.1.2. Biocheminiai atsparumo mechanizmai
Pagrindiniai biocheminiai mechanizmai, kuriuos naudoja bakterijos yra: mažesnis medžiagų pasisavinimas, fermentų modifikacija ir degradacija, pakitę peniciliną prijungiantys baltymai (PPB), efliukso pompos, pakeisti taikiniai ir taikinių perprodukcija (12, 15, 20).
Antibiotikų inaktyvacija arba modifikacija. 3 pagrindiniai antimikrobines medžiagas
inaktyvuojantys fermentai yra: β–laktamazės, aminoglikozidus modifikuojantys fermentai, chloramfenikolio acetiltransferazės (12).
β–laktamazės yra plačiai paplitę fermentai, kurie modifikuoja antibiotikus juos hidrolizuodami. Žinoma apie 300 skirtingų β–laktamazių. Kliniškai svarbiausias iš jų gamina gram– neigiamos bakterijos, kuriose šie fermentai koduojami chromosomose ir plazmidėse. Genai, koduojantys β–laktamazes, perduodami transpozonais, tačiau jie taip pat gali būti randami integronuose. β–laktamazės hidrolizuoja beveik visus β–laktamus, kurie turi esterines bei amidines jungtis (pvz., penicilinus, cefalosporinus, monobaktamus ir karbapenemus). Serino β–laktamazės– cefalosporinazės randamos Enterobacter spp. ir P. aeruginosa, penicilazės aptinkamos S. aureus, o metalo–β–laktamazės – P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, P. mirabilis, Enterobacter spp. Metalo–β–laktamazės panašios į serino β–laktamazes ir yra atsakingos už atsparumą imipenemui, naujos kartos cefalosporinams bei penicilinams (12, 14–16, 21).
12 Išplėsto spektro β–laktamazės daugiausia koduojamos didelėse plazmidėse. Jos atsparios penicilinams (išskyrus temociliną), trečios kartos oksimino–cefalosporinams (pvz., ceftazidimas, cefotoksimas, ceftriaksonas), aztreonui, cefamandolui, cefoperazonui. Tačiau šie fermentai jautrūs metoksi–cefalosporinams ir gali būti inhibuojami β–laktamazių inhibitorių (pvz., klavulano rūgštis, sulbaktamas, tazobaktamas). Išplėsto spektro β–laktamazes gamina E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis (12, 21, 22).
Antibiotikų hidrolizę gali vykdyti ir kiti fermentai, pavyzdžiui, esterazės. E. coli ir Enterobacteriaceae padermėms būdingas ereB genas koduoja eritromicino esterazę II, kuri atsakinga už atsparumą eritromicinui A bei oleandomicinui (12, 13).
Transferazės – tai grupė fermentų, inaktyvuojančių aminoglikozidus, chloramfenikolį, streptograminą, makrolidus bei rifampiciną. Aminoglikozidus neutralizuoja specifiniai fermentai: fosforiltransferazės, nukleotidiltransferazės ar adenililtransferazės ir acetiltransferazės. Šie fermentai bakterijoms suteikia išplėsto spektro atsparumą aminoglikozidams bei fluorokvinolonams. Aminoglikozidus modifikuojantys fermentai aptinkami S. aureus, E. faecalis ir S. pneumoniae. Dauguma šių fermentų perduodami transpozonais (12, 21, 23).
Taikinių modifikacija. Sąveika tarp antibiotiko ir taikinio molekulės yra labai specifiška,
todėl net maži taikinio pokyčiai gali trukdyti prisijungti antibiotikui (12, 13, 15).
Peptidoglikano struktūros pakeitimas. Ląstelės sienelės sintezės slopinimą vykdo β–laktamai. Esant peniciliną prijungiančių baltymų mutacijai, sumažėja mikroorganizmų giminingumas β– laktamų antibiotikams. Tai lemia E. faecium atsparumą ampicilinui ir S. pneumoniae atsparumą penicilinui (12, 15).
DNR sintezės sutrikdymas. Šis atsparumo mechanizmas yra 2 fermentų modifikacija: DNR girazės (gyrA ir gyrB genai) ir topoizomerazės IV (parC ir parE genai). gyrA ir parC genų mutacijos lemia replikacijos sutrikimus, todėl kvinolonai bei fluorokvinolonai negali prisijungti. Dažniausiai pasireiškianti E. coli gyrA mutacija lemia mažesnį modifikuoto DNR komplekso giminingumą antibiotikams (12, 14).
Efliukso siurbliai ir išorinės membranos pralaidumas. Efliukso pompos – tai membranos
baltymai, iš ląstelės šalinantys antibiotikus ir palaikantys žemą jų viduląstelinę koncentraciją. Visų klasių antibiotikai, išskyrus polimiksinus, yra jautrūs efliukso sistemų aktyvacijai. Efliukso pompos gali būti specifiškos antimikrobinėms medžiagoms. Dauguma jų transportuoja daugiau nei vieną medžiagą ir gali pumpuoti daug kitų antibiotikų (makrolidus, tetraciklinus, fluorokvinolonus), todėl prisideda prie daugiaatsparumo formavimosi. Tetraciklinams atsparios bakterijos dažnai gamina didelius kiekius membranos proteinų, kurie naudojami kaip antibiotikų eksportuotojai ar efliukso siurbliai. P. aeruginosa naudoja daugiau nei 4 galingas MDR (dauginio atsparumo) efliukso pompas, kad pašalintų toksiškus junginius iš citoplazmos ir periplazmos (12–15, 19, 21, 24, 25).
13 Išorinės membranos pralaidumo pokyčiai. Sumažėjęs išorinės membranos pralaidumas lemia mažesnį ląstelės antimikrobinių medžiagų pasisavinimą. Gram–neigiamų bakterijų išorinė membrana turi vidinį sluoksnį su fosfolipidais bei išorinį sluoksnį su lipidu A. Tokia išorinės membranos sudėtis sumažina ląstelės vaistinių medžiagų pasisavinimą ir jų transportą per pačią membraną. P. aeruginosa įgytas atsparumas visoms antibiotikų klasėms priklauso nuo mažo išorinės membranos pralaidumo (12, 15, 16).
Antibiotikų slopinimo išvengimas. Ketvirtas biocheminis bakterijų atsparumo antibiotikams
mechanizmas yra specifiškas. Bakterijos gamina alternatyvų taikinį (paprastai fermentą), atsparų antibiotiko slopinimui (pvz., meticilinui atsparus S. aureus gamina alternatyvų PPB). Tuo pačiu metu, bakterijos gamina ir neigiamą taikinį, jautrų antimikrobinėms medžiagoms. Alternatyvus taikinys leidžia bakterijoms išgyventi, užsimaskuojant kaip vietiniam organizmo baltymui. Atsparumą trimetoprimui ir sulfonamidams lemia pakeistų fermentų dihidropteroato sintetazės (DHPS) ir dihidrofolato reduktazės (DHFR) sumažėjęs jautrumas ir giminingumas šiems antibiotikams (12).
1.1.3. Bakterijų atsparumo antibiotikams paplitimas pasaulyje
Atsparios bakterijų padermės gyvavo dar prieš pradedant naudoti peniciliną. Nuo antibiotikų naudojimo pradžios, per paskutinius 75 metus, sunaudojus milijonus tonų antimikrobinių medžiagų, beveik visos ligas sukeliančios bakterijos įgijo atsparumą joms gydyti naudojamiems vaistams. Itin greita bakterinio rezistentiškumo evoliucija aiškiai matoma β–laktamazių klasės antibiotikų atveju. Nustatyta beveik 1000 su atsparumu susijusių β–laktamazių, o prieš 1990 metus jų buvo 10 kartų mažiau (5).
Atsparumo genų išplitimas, kaip Enterobacteriaceae gaminamos išplėsto spektro β– laktamazė, NDM–1 (naujojo štamo Delio metalo–β–laktamazė 1) ir K. pneumoniae karbapenemazė, rodo, kaip lengvai gali plisti atsparumas. Kvinolonų antibiotikai taip pat yra ryškus šio fenomeno pavyzdys. Šios medžiagos yra sintetinės ir natūraliai gamtoje neaptinkamos, tačiau po 30 jų naudojimo metų atsparumas kvinolonams paplitęs epidemiškai (5, 26).
Enterobacteriaceae atsparumas karbapenemui itin padidėjo per paskutinį dešimtmetį. 2012 m. 4,6 proc. JAV ligoninėse užfiksuota bent 1 infekcija, kurią sukėlė karbapenemui atsparios enterobakterijos. Karbapenemui rezistentiškų Enterobacteriaceae šeimos bakterijų santykis padidėjo nuo 0 proc. 2001 m. iki 1,4 proc. 2010 m., didžiausias augimas pastebėtas tarp Klebsiella spp. (3, 5).
Panašūs pokyčiai matomi visame pasaulyje. Besivystančių šalių ligoninių duomenys rodo, kad naujagimių infekcijas sukeliančių patogenų atsparumas ampicilinui ir gentamicinui nustatomas itin dažnai: 71 proc. Klebsiella spp. ir 50 proc. E. coli izoliatų yra atsparūs gentamicinui. 60–70
14 proc. E. coli ir beveik 100 proc. Klebsiella spp. izoliatų yra atsparūs ampicilinui (27). Labiausiai nerimą kelia visiems antibiotikams atsparių karbapenemui rezistentiškų Enterobacteriaceae ir Acinetobacter spp. neišgydomų infekcijų atsiradimas, susijęs su aukštu naujagimių mirtingumu (5).
Visiškai atsparių bakterijų izoliatų, tokių kaip Acinetobacter spp., ir karbapenemui rezistentiškų enterobakterijų atsiradimas Pakistane sukelia dažnai nepagydomą sepsį, susijusį su sveikatos priežiūros įstaigomis (28). 50–60 proc. šlapimo takų infekcijas sukeliančių gram– neigiamų mikroorganizmų, tokių kaip E. coli, tapo atsparios dažniausiems oraliai vartojamiems antibiotikams (amoksicilinui, cefiksimui, ciprofloksacinui) (5).
Nuo 2010 m. liepos iki 2011 m. rugpjūčio iš Pietų Afrikos gyvenviečių išskirtų 1294 K. pneumoniae izoliatų 72 proc. jų gamino išplėsto spektro β–laktamazes (29). NDM–1 pirmiausia buvo aptikta Pietų Afrikoje 2011 m. rugsėjį (30), o nuo 2013 m. gegužės iki liepos mėn. iš ligoninių išskirtų 70 karbapenemui atsparių enterobakterijų izoliatų, 19 jų buvo NDM–1 teigiami (5, 31).
Didėjantis gram–neigiamų mikroorganizmų atsparumas kolistinui ir polimiksinui B stebimas visame pasaulyje, įskaitant Pietų Korėją, Italiją, Graikiją ir Saudo Arabiją. Be to, nustatytas kryžminis atsparumas kolistinui ir šeimininko antimikrobiniams peptidams, priklausantiems organizmo imuniniam atsakui (5, 32–35).
Sveikatos priežiūros įstaigose pasireiškiančios meticilinui atsparaus S. aureus infekcijos taip pat plačiai paplitusios. Besivystančiose šalyse, kaip Pietų Afrika, iš ligoninių pacientų išskirtų 1147 S. aureus izoliatų, 52 proc. jų buvo meticilinui atsparios padermės. Indijoje atliktuose tyrimuose meticilinui atsparus S. aureus dažnai nustatomas klinikiniuose izoliatuose, vidutiniškai 54,8 proc. Pakistane meticilinui atsparių S. aureus dažnis išliko maždaug pastovus (apie 50 proc.), tačiau bendruomenėse šių patogenų infekcijų skaičius išaugo nuo 5 proc. iki 10 proc. (5, 36).
1.2. Vandens užterštumas antibiotikams atspariomis bakterijomis
Žmonių medicinoje ir veterinarijoje naudojami antibiotikai per išmatas, vandens nuotekas patenka į upes, ežerus ir vandenynus. Jų sankaupa skatina antimikrobinėms medžiagoms atsparių bakterijų plitimą vandenyje. Nors šių antibiotikų koncentracija yra praskiesta ir vandenyne jie suyra, medžiagų likučiai gali palaikyti rezistentiškų bakterijų kiekius vandenyje. Nustatyta, kad antibiotikams atsparūs mikroorganizmai bei jų rezistentiškumo genai gali kauptis natūraliose vandens ekosistemose ir neužterštose vietovėse (37, 38).
Iš žmonių bei gyvūnų šaltinių į vandenį patenka ir atsparumą antibiotikams išvystę mikroorganizmai. Šios bakterijos savo atsparumo genus gali perduoti vietiniams vandens mikrobams. Daug antimikrobinių medžiagų plinta aplinkos vandenyse ir galimai keičia mikroorganizmų ekosistemas (8).
15 Patogeniškos ir galimai patogeniškos žmonių bei gyvūnų bakterijos į vandenį nuolat patenka su vandens nuotekomis. Daug šių mikroorganizmų turi atsparumo antibiotikams genus, kurie perduodami mobiliomis genetinėmis struktūromis (plazmidėmis, transpozonais, integronais) ir gali plisti tarp vietinių vandens bei dirvožemio bakterijų. Vanduo palengvina atsparių mikroorganizmų plitimą tarp žmonių ir gyvūnų populiacijų, nes geriamasis vanduo dažnai išgaunamas iš paviršinio vandens. Šis plitimas taip pat lemia ir atsparumo genų patekimą į natūralias bakterijų ekosistemas. Tokiose sistemose nepatogeninės bakterijos gali tapti atsparumo antibiotikams genų rezervuarais. Taip pat antimikrobinių medžiagų, ploviklių, dezinfekavimo priemonių ir pramonės taršos likučių nuolatinis patekimas bei kaupimasis aplinkoje skatina šioms medžiagoms atsparių organizmų evoliuciją ir plitimą vandens ekosistemose. Itin aktualūs yra ir akvakultūroje profilaktiškai naudojami antibiotikai. Tuo tarpu aplinkos bakterijos yra neribotas šaltinis genų, kurie, patekę į patogeninius mikroorganizmus, gali veikti kaip rezistentiškumo genai. Dauguma šių genų dažniausia nėra atsparumą lemiantys genai, tačiau priklauso grupei, kurie gali būti paversti rezistentiškumo genais (8, 39).
Nustatyta, kad Portugalijos estuarijų vandens Aeromonas padermės (10 proc.) β–laktamazių genus perneša rečiau nei Enterobacteriaceae šeimos bakterijos (78 proc.). Vandens rezervuaruose pusė Aeromonas padermių yra daugiaatsparios. Vandens pseudomonų atsparumas priklauso nuo rūšies ir mėginio paėmimo vietos – daugiau antibiotikams atsparių bakterijų rasta krantuose bei įlankose nei atvirame vandenyje, kas rodo sausumos organizmų bei teršalų įtaką. Vis dėlto tokia išorinių faktorių įtaka aptinkama ir atokesniuose vandenyse – nustatomas įvairus Antarktidos psichotropinių bakterijų atsparumas antibiotikams (8).
Vertinant vandens taršą sausumos organizmais, akivaizdu, kad antibiotikams atsparių bakterijų ir rezistentiškumo genų gėlame vandenyje gausa priklauso nuo atstumo iki sausumos vietovių, kuriose gausiai vartojamos antimikrobinės medžiagos. Taip pat vandens užterštumas didesnis lietingu sezonu (8).
Vandens nuotekų apdorojimo įmonėse esanti tanki bakterijų populiacija skatina genų mainus tarp mikroorganizmų rūšių. Nuotekose dažnai aptinkamos daugiaatsparumo plazmidės iš plataus šeimininkų spektro. Iš mėšlo patekę atsparumo genai daro įtaką lagūnų ir požeminio vandens genų visumai. Akvakultūros vandens sistemų Aeromonas bakterijos yra ypač atsparios antibiotikams ir dažnai horizontaliu būdu perduoda plazmides bei integronus su keliais atsparumo genais kitiems mikroorganizmams (8).
1.3. Antibiotikų naudojimas ir bakterijų atsparumas akvakultūroje
Akvakultūra tampa greičiausiai augančia maisto pramonės šaka pasaulyje per nuolatinę plėtrą, gyvūnų auginimo intensyvumą bei rūšių įvairumą. Veisiant naujas rūšis bei auginant esamas rūšis
16 naujose geografinėse vietovėse, ligų plitimo rizika ir gydymo reikalingumas toliau auga. Ši rizika taip pat kyla dėl globalios klimato kaitos, kuri gali lemti naujų patogenų atsiradimą bei esamų ligų sukėlėjų pokyčius, kartu ir antimikrobinių medžiagų naudojimo pokyčius bei atsparumo joms susidarymą (40).
Naudojant antibiotikus akvakultūroje, didžiausią nerimą kelia galimybė susidaryti atsparumo antibiotikams genų rezervuarams, kurie gali būti perduoti kliniškai svarbioms bakterijoms, be to atsparūs vandens patogenai gali pasiekti žmones tiesiogiai (1 lentelė). Horizontalus genų perdavimas gali pasireikšti akvakultūros aplinkoje, maisto grandinėse ar gyvūnų virškinimo trakte. Iš akvakultūroje naudojamų antimikrobinių medžiagų Pasaulio sveikatos organizacija keletą jų klasifikuoja kaip kritiškai svarbias žmonių medicinoje. Rezistentiškumo susidarymas šioms medžiagoms tarp žmonių patogenų itin susiaurina infekcijų gydymo galimybes (40, 41).
1 lentelė. Akvakultūroje naudojamos antibiotikų klasės, jų svarba žmonių medicinoje ir išskirtų rezistentiškų patogeninių bakterijų pavyzdžiai (42)
Antibiotikų klasė žmonių Svarba medicinoje
Pavyzdys Atsparios bakterijos
Dauginis
atsparumas? Iš kur išskirta Aminoglikozidai Kritiškai svarbūs Streptomicinas Edwardsiella ictulari Taip Nugaišęs dryžuotasis šamas (Pangasianodon hypophthalmus), Vietnamas Amfenikoliai Svarbūs Florfenikolis Enterobacter
spp. ir
Pseudomonas
spp.
Taip Gėlavandenių lašišų fermos, Čilė
β–laktamai Kritiškai
svarbūs Amoksicilinas Vibrio spp., Aeromonas
spp. ir
Edwardsiella tarda
Taip Įvairi akvakultūros aplinka, Australija
Kritiškai svarbūs
Ampicilinas Vibrio harveyi Taip Krevečių fermos ir pakrančių vanduo, Indonezija
Makrolidai Kritiškai
svarbūs Eritromicinas Salmonella spp.
Taip Parduodamos žuvys, Kinija Nitrofuranai Kritiškai
svarbūs Furazolidonas Vibrio anguillarum
Taip Nugaišęs jūros ešerys ir jūrų karšis, Graikija
Svarbūs Nitrofurantoinas Vibrio harveyi Taip Nugaišusios krevetės, Taivanas Kvinolonai Kritiškai
svarbūs
Oksolino rūgštis Aeromonas spp.,
Pseudomonas
spp.
ir Vibrio spp.
Taip Tvenkinių vanduo, sedimentas ir tigrinės krevetės (Penaeus
17 1 lentelės tęsinys
Antibiotikų klasė žmonių Svarba medicinoje
Pavyzdys Atsparios bakterijos
Dauginis
atsparumas? Iš kur išskirta Sulfonamidai Svarbūs Sulfadiazinas Aeromonas
spp.
Taip Nugaišęs indinis karpis (Catla catla), paprastasis karpis (Cirrhinus mrigala) ir puntijai (Puntius spp.), Indija Tetraciklinai Labai
svarbūs Tetraciklinas Aeromonas hydrophila
Taip Vanduo iš kuojų ir tilapijų fermų, Egiptas Labai svarbūs Oksitetraciklinas Aeromonas salmonicida
Taip Atlantinių lašišų (Salmo salar) kultūrų įrenginiai, Kanada
1.3.1. Antibiotikų naudojimas akvakultūroje
Akvakultūroje auginamoms žuvims atliekamos įvairios procedūros (pvz., gaudymas, perkėlimas į kitas vandens talpas ir pan.), sukeliančios stresą ir mažinančios žuvies imuninės sistemos efektyvumą, kas lemia mažesnį atsparumą bakterijų kolonizacijai ir infekcijai. Todėl infekcijų grėsmei išvengti antibiotikai naudojami profilaktiškai, ypač šalyse, kuriose nenaudojamos kitos prevencinės priemonės. Antibiotikai dažniausiai suduodami žuvų grupėms oraliai su pašaru. Rečiau naudojamos vonelės, kai gyvūnai perkeliami į uždaras talpyklas. Individualiai gali būti atliekamos injekcijos. Akvakultūroje antimikrobinės medžiagos paprastai skiriamos visai populiacijai, kurioje yra ir sergantys, ir sveiki, ir patogenus nešiotojantys individai. Šis procesas vadinamas metafilaktika (43, 44).
Taigi suprantama, kad akvakultūroje naudojamų antibiotikų dozės gali būti proporcingai didesnės, nei sausumos gyvūnų auginime naudojamos dozės. Tačiau tikslius kiekius apskaičiuoti sunku, kadangi skirtingos šalys turi nevienodas vaistų paskirstymo ir registracijos sistemas (45). Be to, tokios praktikos padariniai kelia nerimą, nes žuvų pašare esančios medžiagos gali ilgą laiką išlikti vandens aplinkoje ir greitai išplisti į kitas ekosistemas (46). Kadangi žuvys nemetabolizuoja antibiotikų efektyviai, daug aktyviųjų medžiagų su išmatomis patenka į aplinką. Manoma, kad apie 70–80 proc. akvakultūroje panaudotų antibiotikų pasiskirsto vandens sistemose. Šie antibiotikų likučiai išlieka vandens telkinių sedimente ir daro įtaką vietinei mikrofloros sudėčiai bei skatina atsparių bakterijų išsivystymą. Vandens ekosistemoje susidariusios atsparumo determinantės gali būti perduotos horizontaliu būdu vandens bei sausumos bakterijoms, įskaitant žmonių ir gyvūnų patogenus (41, 43).
Kai pradedamas antibiotikų kursas (paprastai per vaistinį pašarą), žuvų virškinimo trakto mikroflora ir fermos aplinkos bakterijos turi kontaktą su panaudotomis antimikrobinėmis
18 medžiagomis. Nustatyta, kad žuvininkystėje naudojamas oksitetraciklinas yra susijęs su didesniu kiekiu oksitetraciklinui atsparių mikroorganizmų. Taip pat, ištyrus atsparumo oksitetraciklinui paplitimą gėlavandenių lašišų fermose, nustatyta, kad daugiausia atsparių bakterijų aptinkama nuotekų mėginiuose (8–69 proc.). Oksitetraciklinas yra vienas dažniausiai žuvininkystėje naudojamų antibiotikų, tačiau per žuvies virškinimo traktą vaistas prastai pasisavinamas. Jis naudojamas didelėmis dozėmis – 100–150 mg/kg žuvų, 10–15 dienų iš eilės. Toks gydymas lemia lėtą didelių antibiotiko kiekių išskyrimą į aplinką, taip skatindamas okistetraciklinui atsparių bakterijų selekciją žuvų žarnyne ir aplinkoje (41).
Daugumoje Europos šalių akvakultūroje leidžiama naudoti oksitetracikliną, florfenikolį, sarafloksaciną, eritromiciną ir sulfonamidus (derinant su trimetoprimu ar ormetorpimu), o JAV – oksitetracikliną, florfenikolį, sulfadimetoksiną–ormetoprimą (43, 45).
Nepaisant griežto reguliavimo kai kuriuose regionuose, pirmaujančiose akvakultūros produkcijos šalyse vaistų naudojimo reguliacinė sistema silpnai išvystyta. Indija yra antra šalis pagal pagaminamą žuvies produktų kiekį ir tiekia 8 proc. pasaulinės produkcijos, tačiau antibiotikų pardavimas ir naudojimas joje nereguliuojamas (47). Kinija yra didžiausia žuvies bei jos produktų eksportuotoja ir pagamina 67 proc. pasaulio akvakultūros produkcijos, tačiau visiems gyvūnams naudojamiems antibiotikams nereikia veterinarinių receptų (43, 48, 49).
Šalyse, kuriose kontrolė nėra griežta, antimikrobinių medžiagų naudojimas akvakultūroje gali pranokti jų naudojimą žmonių medicinoje (50, 51). Čilėje, kuri yra antra didžiausia auginamos lašišos gamintoja po Norvegijos, lašišų akvakultūroje 2007 ir 2008 m. buvo sunaudota 385 ir 325 tonos antibiotikų, taip pat 149 ir 57 tonos kvinolonų tais pačiais metais (52). Be to, metinis florfenikolio suvartojimas nuo maždaug 400 kg 2000 m. pakilo iki 233 000 kg 2007 m. F. Cabello et al. (44) 2016 m. nustatė, kad Čilės pramoninės žuvininkystės ūkyje 1 tonai lašišos pagaminti sunaudojama 279 g antimikrobinių medžiagų, tuo tarpu tokiam pat kiekiui lašišos pagaminti Norvegijoje sunaudojama tik 4,8 g antibiotikų (43).
Norvegija gali būti laikoma šios srities pavyzdžiu, nes antibiotikų naudojimo reguliavimas lašišų akvakultūroje itin griežtas. Kartu su tobulesne diagnostika, įskaitant jautrumo tyrimus ir vakcinų bei probiotikų naudojimą, Norvegija sumažino antimikrobinių medžiagų naudojimą iki leidžiamų kiekių (43, 46, 53).
1.3.2. Bakterijų atsparumo antibiotikams tyrimai akvakultūroje
S. J. Lim et al. (9) 2013 m. Pietų Korėjoje ištyrė 4 gėlo vandens akvakultūros įmonių nuotekų mėginius, iš kurių išskirta 20 bakterijų izoliatų. Dauguma padermių buvo Aeromonas spp. (75 proc.), kiek mažiau nustatyta Enterobacter spp. (15 proc.). Taip pat išskirtos pavienės bakterijos, priklausančios šioms gentims: Citrobacter spp., Bacillus spp., Pantoea spp., Marinobacter spp.,
19 Pseudomonas spp. Visos išskirtos bakterijos buvo atsparios antimikrobinėms medžiagoms. 41,7 proc. izoliatų buvo atsparūs vienam antibiotikui, 58,3 proc. – atsparūs kelioms medžiagoms. Visos atsparios bakterijos veiksmingai dezinfekuotos naudojant 2 kGy elektronų pluošto švitinimo metodą.
2012 m. P. Gao et al. (6) šiaurės Kinijoje atliko tyrimą, siekiant nustatyti akvakultūros aplinkoje esančias sulfonamidui ir tetraciklinui atsparias bakterijas bei atsparumo genus. Ištirtuose 6 žuvų fermų vandens mėginiuose daugiausia nustatyta sulfonamidui rezistentiškų genų. Manoma, jog toks rezultatas gautas dėl to, kad šioje vietovėje sulfonamidai naudojami dažniau nei tetraciklinai. Nustatyta, kad daugiausia atsparių bakterijų buvo Bacillus spp., tiek sulfametoksazolui (63,27 proc. iš visų atsparių bakterijų), tiek tetraciklinui (57,14 proc. iš visų atsparių bakterijų). Kitos nustatytos sulfametoksazolui atsparios bakterijos buvo: Pseudochrobactrum, Exiguobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, Rummeliibacillus, Brevibacterium ir Enterococcus. Kitos tetraciklinui atsparios bakterijos: Sporosarcina aquimarina, Virgibacillus, Lysinibacillus, Acinetobacter, Planomicrobium ir Paenibacillus. Iš išskirtų atsparumo genų (tetM, tetO, tetT, tetW, sul1ir sul2) bent 2 buvo aptikti B. cereus, B. subtilis, B. megaterium bei A. lwofii ir visi genai aptikti B. cereus. Tai įrodo, kad šiaurės Kinijoje paplitęs bakterijų dauginis atsparumas antibiotikams.
2009 m. D. W. Verner–Jeffreys et al. (54) tyrė daugiaatsparias bakterijas ir atsparumo genus, izoliuotus iš dekoratyvinių žuvų ir jų pervežimo vandens, bei išskyrė Aeromonas spp. bakterijas. Pusė šiltavandenių žuvų Aeromonas spp. izoliatų buvo atsparūs 15 ar daugiau skirtingų antibiotikų (iš 34 tirtų medžiagų). Nustatytas ryškus dauginis atsparumas – 64 proc. izoliatų buvo atsparūs antimikrobinėms medžiagoms iš 7 ar daugiau skirtingų klasių. Dauguma izoliatų iš šaltavandenių žuvų rūšių taip pat buvo daugiaatsparūs – 27 proc. atsparūs medžiagoms iš 3 ar daugiau antibiotikų klasių. Nustatyti ir antibiotikai, kuriems dauguma Aeromonas spp. bakterijų buvo ypač jautrios: 3 ir 4 kartos cefalosporinai (ceftriaksonas, ceftazidimas, cefpodoksimas, cefepimas ir moksalaktamas), taip pat karbapenemai, imipenemas bei meropenemas. Nustatyta, kad 37 proc. izoliatų turėjo qnrS2 – kvinolonų ir fluorokvinolonų atsparumo geną.
2016 m. M. M. Kathleen et al. (55) atliko tyrimą Borneo, siekdami nustatyti atsparias bakterijas iš auginamų žuvų, krevečių bei vandens ir sedimentų. Išskyrus 94 bakterijų izoliatus, didžiausias atsparumas nustatytas streptomicinui (85 proc.), ampicilinui (56,8 proc.), penicilinui (47,1 proc.), eritromicinui (43,1 proc.) bei cefalotinui (42,3 proc.). Mažiausias atsparumas nustatytas gentamicinui (1,1 proc.), tobramicinui (2,2 proc.), chloramfenikoliui (4,0 proc.), norfloksacinui (5 proc.) ir amikacinui (5,6 proc.).
2018 m. T. T. H. Pham et al. (56) ištyrė Vietnamo krevečių fermos nuotekų kanalo vandenį bei sedimentus ir nustatė Aeromonas, Acinetobacter, Citrobacter, Corynebacterium, Dietzia, Escherichia, Klebsiella bakterijų gentims būdingus atsparumo genus. Efektyvų genų perdavimą tarp
20 skirtingų tvenkiniuose esančių bakterijų parodo nustatytų atsparumo genų dažnis: sul1 (94,1 proc.), sul2 (82,4 proc.), qnrA (88,2 proc.) ir ermB (94,1 proc.). Tai įrodo ir dauginio atsparumo paplitimą.
2018 m. O. S. Imade ir F. I. Akinnibosun (57) ištyrė daugiaatsparių bakterijų paplitimą Nigerijos šamų žuvininkystės įmonėse ir išanalizavo tvenkinių vandens bei nuo žuvų paimtus mėginius. 79 proc. mikroorganizmų izoliatų pasižymėjo dauginiu atsparumu antibiotikams, iš kurių 71 proc. nustatyti kaip patogeninės bakterijos. Tirtuose žuvų jauniklių ir auginimo tvenkiniuose nustatytas aukštas bakterijų atsparumas ampicilinui (86–93 proc.), kotrimoksazolui (47–87 proc.) ir chloramfenikoliui (95–100 proc.). Auginimo tvenkiniuose taip pat nustatytas aukštas atsparumas amoksicilinui su klavulano rūgštimi (75–83 proc.). Ištirta, kad izoliuotos daugiaatsparios bakterijos buvo E. cloacae, C. freundii, B. cereus, P. aeruginosa, E. coli ir E. faecalis.
2018 m. C. Novais et al. (58) Portugalijoje ištyrė antibiotikams atsparių enterokokų paplitimą tarp upėtakių. Mėginiai paimti iš tvenkinių vandens, sedimentų, pašarų, auginamų upėtakių bei parduodamų upėtakių. Iš 91 proc. mėginių išskirti E. faecalis (34 proc.), E. faecium (27 proc.), E. hirae (21 proc.), E. durans (5 proc.), E. casseliflavus (5 proc.), E. galinarum (2 proc.) ir kiti Enterococcus spp. Sedimente dominavo E. faecalis ir E. hirae, o vandenyje – E. faecalis. Nustatyta, kad išskirtos bakterijos atsparios tetraciklinui, eritromicinui, ciprofloksacinui, chloramfenikoliui, kvinupristinui–dalfopristinui, nitrofurantoinui ir aminoglikozidams. Daugiaatsparaus E. faecium aptikimas pašare, tvenkiniuose bei upėtakiuose rodo, kad pašaras gali būti papildomas akvakultūros taršos šaltinis.
2018 m. M. Ružauskas et al. (59) Lietuvoje tyrė daugiaatsparių gram–neigiamų bakterijų paplitimą akvakultūroje auginamose ir laukinėse gėlavandenėse žuvyse. Iš 120 akvakultūroje augintų žuvų kloakų išskirti 38 daugiaatsparūs (atsparūs bent 3 antibiotikams) izoliatai, iš kurių daugiausia vyravo Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Aeromonas ir Chryseobacterium mikroorganizmai. Tuo tarpu iš 120 laukinių gėlavandenių žuvų išskirti tik 6 dauginį atsparumą turintys izoliatai. Mikroorganizmai, išskirti iš akvakultūros žuvų, daugiausia buvo atsparūs β– laktamams, kotrimoksazolui ir nitrofurantoinui. Kai kurie Enterobacteriaceae izoliatai buvo atsparūs karbapenemams, amikacinui ir tobramicinui. Daugiaatsparūs izoliatai iš laukinių žuvų nustatyti tik upių žuvyse. Nustatyta, kad labiausiai paplitę atsparumą koduojantys genai buvo tetA, tetB, oxa-3, oxa-5, ctx-M, dfr1, dfr2 ir sul2, kurie yra susiję su rezistentiškumu tetraciklinams, β– laktamams, trimetoprimui ir sulfonamidams.
M. Ružauskas et al. (60) 2018 m. Lietuvoje taip pat atliko tyrimą, siekiant nustatyti iš pramoninių tvenkinių žuvų izoliuotų gram–neigiamų bakterijų atsparumą antibiotikams. Išskirti 119 bent vienam antibiotikui atsparūs izoliatai, iš kurių daugiausia nustatyta šių genčių bakterijų: Pseudomonas, Chryseobacterium, Enterobacteriaceae ir Aeromonas. Daugiausia daugiaatsparių izoliatų priklausė Pseudomonas spp., o mažiausiai – Aeromonas spp. Nustatyta, kad išskirti
21 mikroorganizmai labiausiai atsparūs β–laktamams. Atsižvelgiant į žemą atsparumą fluorokvinolonams, nedidelį kiekį kliniškai svarbių atsparumo genų ir nustatytą bakterijų taksonominę sudėtį, galima manyti, kad paplitusios antibiotikams atsparios bakterijos priklauso autochtoninei mikrobiotai.
22
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimo vieta ir objektai
Tiriamasis darbas atliktas 2019–2021 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Mikrobiologijos ir virusologijos institute, Mikrobiologijos tyrimų laboratorijoje. Tyrimo metu ištirti vandens mėginiai iš 5 Lietuvos pramoninių žuvininkystės tvenkinių.
2.2. Medžiagos paėmimas, bakterijų išskyrimas ir identifikacija
Iš 5 žuvininkystės tvenkinių imta po vieną vandens mėginį į sterilius 1,5 l talpos indus, tada kiekvienas mėginys sunumeruojamas ir pažymimas vandens telkinys, iš kurio paimtas vanduo. Mėginiai laikomi šaldytuve (4°C temperatūroje) ir per 24 val. pristatomi į Mikrobiologijos laboratoriją tyrimui.
Mikrobiologijos laboratorijoje kiekvienas vandens mėginys (n=5) švelniai išmaišomas, pamatuojama 250 ml mėginio ir filtruojama vakuumine sistema (KNF, Vokietija) per 47 mm filtracinę membraną (1 pav.). Tiriamoji medžiaga nuo filtracinės membranos sėjama į terpes: Aeromonas agarą (AER, EO Labs, Jungtinė Karalystė), Acinetobacter MDR agarą (MDR AB, EO Labs, Jungtinė Karalystė), Cetrimido agarą (Liofilchem, Italija), Manito druskos agarą (MSA, Liofilchem, Italija) ir TBX agarą (Biolife, Italija) (2 pav.). Terpės inkubuojamos termostate (Memmert, Vokietija) 48 valandas 30°C temperatūroje.
23 2 pav. Aeromonas agaras (viršuje) ir Acinetobacter MDR agaras (apačioje) (EO Labs, Jungtinė
Karalystė)
Pradinei bakterijų identifikacijai visoms bakterijų kolonijoms buvo atliekamas KOH testas (n=104). Tokiu būdu atskiriamos gram–teigiamos ir gram–neigiamos bakterijos: kelias bakterijų kolonijas išmaišius laše 3 proc. kalio hidroksido tirpalo, gram–neigiamos bakterijos pasidaro tįstančų gleivių pavidalo. Visoms gram–teigiamoms bakterijoms atliktas katalazės testas (n=14): bakterijų izoliatas sumaišomas su 3 proc. vandenilio peroksido tirpalu – jei tiriama bakterija gamina katalazės fermentą, skiriasi dujų burbuliukai. Visoms bakterijoms atliktas oksidazės (BD, JAV) testas (n=104): filtracinis popierius suvilgomas diagnostiniu reagentu ir ant jo perkeliama gryna bakterijų kultūra, jei per 3 min. skaidrus reagentas tampa tamsiai mėlynos spalvos, bakterijos okidazei teigiamos, jei per 3 min. reagento spalva nepasikeičia – bakterijos oksidazei neigiamos.
Visos išskirtos padermės pakartotinai tiriamos darant tepinėlį, kuris dažomas Gramo metodu ir mikroskopuojamas (n=104). Gram–teigiamos bakterijos nusidažo tamsiai mėlyna ar violetine spalva, o gram–neigiamos bakterijos – rožine ar raudona spalva. Po mikroskopavimo bakterijos persėjamos į diferencines terpes – MacConkey agarą (MAC, Liofilchem, Italija), Cetrimido agarą ir TBX agarą, inkubuojamos 48 valandas 30°C temperatūroje (n=104). Galiausiai atliekamas SIM (sulfido, indolo, judrumo) testas, kuris inkubuojamas 24 valandas 30°C temperatūroje (n=104).
Gram–neigiamos bakterijos, kurios augo ant Cetrimido agaro, priskiriamos Pseudomonas spp. genčiai. Bakterijos, kurių kultūros ant Cetrimido agaro buvo salotinės spalvos, identifikuojamos kaip Pseudomonas aeruginosa. Gram–teigiamos ir oksidazei teigiamos bakterijos priskiriamos Micrococcus spp. genčiai. Micrococcus spp. bakterijos diferencijuojamos nuo Staphylococcus spp., įvertinat jų jautrumą furozalidonui ir bacitracinui. Jei mikroskopuojant stebimos gram–teigiamos, lazdelės formos bakterijos, jos priskiriamos Bacillus spp. genčiai.
Visos gram–neigiamos bakterijos iki rūšies identifikuojamos naudojant GnA+B-ID (Microgen, Jungtinė Karalystė) identifikavimo sistemą (3 pav.) su gamintojo pateikta kompiuterine programa (n=90).
24 3 pav. GnA+B-ID identifikavimo sistema (Microgen, Jungtinė Karalystė)
2.3. Išskirtų bakterijų atsparumo antibiotikams nustatymas
Bakterijos identifikuojamos iki genties, tuomet nustatomas jų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms Kirby–Bauer tyrimo metodu (n=104). Iš bakterijų kultūrų paruošiama 0,5 McFarland standarto tankio suspensija, naudojant McFarland Densitometer analizatorių (Biosan, Olandija). Bakterijų suspensija sėjama į Sojos agarą (Liofilchem, Italija). Specialiu dispenseriu (Oxoid, Jungtinė Karalystė) ant agaro uždedami standartiniai antibiotikų diskai: sulfametoksazolo– trimetoprimo (SXT, 1,25/23,75 µg), gentamicino (CN, 10 µg), ciprofloksacino (CIP, 5 µg), chloramfenikolio (C, 30 µg), cefpodoksimo (CPD, 10 µg), ampicilino (AMP, 10 µg) ir tetraciklino (TE, 30 µg). Terpės su antibiotikų diskais inkubuojamos 30°C temperatūroje, po 48 valandų rezultatai vertinami liniuote matuojant sterilias zonas aplink diskus. Padermės įvertinamos kaip jautrios, vidutiniškai jautrios ir atsparios, pagal Klinikinių ir laboratorinių standartų instituto (CLSI) ir Europos jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimų komiteto (EUCAST) rekomendacijas (2, 3 lentelės).
Atsparios bakterijos buvo įvertintos kaip kultūros, rezistentiškos bent vienai antimikrobinei medžiagai. Iš vandens mėginių išskirtų bakterijų nustatytos 47 antibiotikams atsparios padermės (4 lentelė).
2 lentelė. Naudoti antibiotikai, jų koncentracijos diskuose ir Enterobacteriaceae šeimai atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės
Antimikrobinė medžiaga
Koncentracija diske, µg
Klinikinė reikšmė (CLSI), sterili zona
jautri, ≥ mm vid. jautri, mm atspari, ≤ mm Sulfametoksazolas– trimetoprimas 1,25/ 23,75 16 11–15 10 Gentamicinas 10 15 13–14 12 Ciprofloksacinas 5 26 22–25 21 Chloramfenikolis 30 18 13–17 12 Cefpodoksimas 10 21 18–20 17 Ampicilinas 10 17 14–16 13 Tetraciklinas 30 15 12–14 11
25 3 lentelė. Naudoti antibiotikai, jų koncentracijos diskuose bei Bacillus spp. ir Micrococcus spp. atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (pagal Staphylococcus spp. rekomendacijas)
Antimikrobinė medžiaga
Koncentracija diske, µg
Klinikinė reikšmė (CLSI, EUCAST), sterili zona jautri, ≥ mm vid. jautri, mm atspari, ≤ mm Sulfametoksazolas– trimetoprimas 1,25/ 23,75 16 11–15 10 Gentamicinas 10 15 13–14 12 Ciprofloksacinas 5 21 16–20 15 Chloramfenikolis 30 18 13–17 12 Cefpodoksimas 10 21 18-20 17 Ampicilinas 10 18 - 17 Tetraciklinas 30 19 15–18 14
2.4. Tyrimo duomenų statistinis vertinimas
Tyrimo analizė atlikta naudojant „Microsoft Excel'2007“ skaičiuoklę ir SPSS duomenų analizės programinę įrangą. Sudaryti statistiniai modeliai, naudojant lenteles ir diagramas. Atsparumo duomenims palyginti apskaičiuota Chi–kvadrato reikšmė, Anova testas ir Post Hoc (LSD) testas (bakterijų rūšims, kurių išskirta 3 ir daugiau izoliatų). Tyrimo duomenys patikimi, kai p<0,05; p<0,01 ir p<0,001.
4 lentelė. Tyrimo schema
Mėginių paėmimas, vandens filtravimas (n=5) ↓
Bakterijų sėjimas į AER, MDR AB, Cetrimido, Manito druskos, TBX agarus (30°C, 48 val.) (n=5)
↓
KOH, oksidazės testai (n=104); Katalazės testas (n=14)
↓
Dažymas Gramo metodu, mikroskopavimas (n=104) ↓
Sėjimas į MAC, TBX, Cetrimido agarus (30°C, 48 val.) (n=104); SIM testas (30°C, 24 val.) (n=104)
↓
Identifikavimas GnA+B-ID sistema (n=90) ↓
0,5 MacFarland tankio bakterijų suspensijos sėjimas į Sojos agarą, Kirby-Bauer jautrumo antibiotikams tyrimas (30°C, 24 val.) (n=104)
26
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Iš pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens išskirtų bakterijų rūšinė
įvairovė
Tyrimo metu iš pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens išskirtos 104 bakterijų padermės, iš kurių 47 buvo atsparios bent vienai antimikrobinei medžiagai (4 pav.).
4 pav. Iš pramoninių žuvininkystės tvenkinių vandens išskirtos antibiotikams atsparios bakterijų gentys ir rūšys (n=47)
Pagal 4 paveiksle pateiktus duomenis, tarp išskirtų antibiotikams atsparių bakterijų dominavo gram–neigiamos bakterijos (87,23 proc.). Dažniausiai buvo išskiriamos Pseudomonas spp. (29,79 proc.), Pseudomonas fluorescens (21,28 proc.), Pseudomonas aeruginosa (10,64 proc.) ir Pseudomonas putida (6,38 proc.) bakterijos. Visos Pseudomonas genties bakterijos sudarė daugiau nei pusę išskirtų izoliatų (68,09 proc.). Rečiau nustatyti Micrococcus spp. (8,51 proc.) ir Aeromonas veronii (6,38 proc.) bakterijų izoliatai. Po vieną ar du kartus išskirtos Acinetobacter lwofii, Aeromonas hydrophila, Bacilus spp., Flavobacterium odoratum ir Serratia marcescens bakterijos (svyravo 2,13–4,26 proc. ribose).
1 2 3 2 2 4 5 10 3 14 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Iš ski rt os anti biot ikam s at spari ų bakt er ij ų pader m ės , vnt . Bakterijų rūšys
27
3.2. Iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens išskirtų bakterijų
atsparumas antibiotikams
5 paveiksle pateikti visų bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
5 pav. Visų tyrimo metu išskirtų antibiotikams atsparių bakterijų (n=47) jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Analizuojant 5 paveikslo duomenis, matyti, kad didžiausias išskirtų bakterijų atsparumas nustatytas ampicilinui (91,5 proc.) ir cefpodoksimui (78,7 proc.). Išskirti izoliatai jautrūs ciprofloksacinui (91,5 proc.), tetraciklinui (85,1 proc.) ir gentamicinui (80.9 proc.).
3.2.1. Išskirtų Pseudomonas genties bakterijų atsparumas antibiotikams
6 paveiksle pateikti visų Pseudomonas genties bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
91.5 14.9 8.5 66 19.1 78.7 66 8.5 85.1 91.5 34 80.9 21.3 34 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Išskirtų bakterijų kiekis, proc.
A nti mi kro binė medž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru
28 6 pav. Visų išskirtų antibiotikams atsparių Pseudomonas genties bakterijų (n=32) jautrumas
antimikrobinėms medžiagoms
Analizuojant 6 paveikslo duomenis, matyti, kad didžiausias išskirtų Pseudomonas genties bakterijų atsparumas nustatytas ampicilinui (100 proc.), cefpodoksimui (93,8 proc.), chloramfenikoliui (84,4 proc.). Išskirti Pseudomonas genties izoliatai jautrūs ciprofloksacinui (96,6 proc.), gentamicinui (93,8 proc.) ir tetraciklinui (81,3 proc.).
7 paveiksle pateikti P. fluorescens bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
7 pav. Antibiotikams atsparių P. fluorescens bakterijų (n=10) jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Pagal 7 paveiksle pateiktus duomenis matyti, kad išskirtos P. fluorescens bakterijos atsparios ampicilinui (100 proc.) ir cefpodoksimui (100 proc.). Visi išskirti izoliatai jautrūs gentamicinui (100 proc.), ciprofloksacinui (100 proc.) ir tetraciklinui (100 proc.).
100 18.8 3.1 84.4 6.3 93.8 53.1 81.3 96.9 15.6 93.8 6.3 46.9 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Pseudomonas genties bakterijų kiekis, proc.
A nti mi kro binė medž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru 100 80 100 90 100 100 20 100 10 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Pseudomonas fluorescens kiekis, proc.
A nti m ikrobinė m edž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru
29 8 paveiksle pateikti P. aeruginosa bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
8 pav. Antibiotikams atsparių P. aeruginosa bakterijų (n=5) jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Analizuojant 8 paveikslo duomenis, matyti, kad išskirtos P. aeruginosa bakterijos atsparios sulfametoksazolui–trimetoprimui (100 proc.), cefpodoksimui (100 proc.), chloramfenikoliui (100 proc.) ir ampicilinui (100 proc.). Visi izoliatai jautrūs gentamicinui (100 proc.) ir ciprofloksacinui (100 proc.).
Iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens taip pat išskirti 3 P. putida bakterijų izoliatai. Visi jie atsparūs cefpodoksimui (100 proc.), chloramfenikoliui (100 proc.) ir ampicilinui (100 proc.). 2 iš 3 izoliatų atsparūs sulfametoksazolo–trimetoprimo kombinacijai, 1 iš 3 izoliatų atsparus gentamicinui. Visos išskirtos P. putida bakterijos jautrios ciprofloksacinui (100 proc.) ir tetraciklinui (100 proc.).
9 paveiksle pateikti kitų Pseudomonas spp. bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
100 60 100 100 100 40 100 100 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Pseudomonas aeruginosa kiekis, proc.
A nti m ikrobinė m edž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru
30 9 pav. Antibiotikams atsparių Pseudomonas spp. bakterijų (n=14) jautrumas antimikrobinėms
medžiagoms
Pagal 9 paveiksle pateiktus duomenis matyti, kad visos išskirtos Pseudomonas spp. bakterijos atsparios ampicilinui (100 proc.), taip pat nustatytas didelis izoliatų atsparumas cefpodoksimui (85,7 proc.) ir chloramfenikoliui (78,6 proc.). Išskirtos bakterijos jautrios sulfametoksazolui– trimetoprimui (92,9 proc.), gentamicinui (92,9 proc.) ir ciprofloksacinui (92,9 proc.).
3.2.2. Išskirtų Aeromonas genties bakterijų atsparumas antibiotikams
10 paveiksle pateikti visų Aeromonas genties bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
10 pav. Visų išskirtų antibiotikams atsparių Aeromonas genties bakterijų (n=5) jautrumas antimikrobinėms medžiagoms 100 21.4 7.1 78.6 7.1 85.7 7.1 78.6 92.9 21.4 92.9 14.3 92.9 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Pseudomonas spp. kiekis, proc.
A nti m ikrobinė m edž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru 100 20 40 40 40 60 100 80 60 60 60 40 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Aeromonas spp. kiekis, proc.
A nti m ikrobinė m edž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru
31 Pagal 10 paveiksle pateiktus duomenis, visos išskirtos Aeromonas genties bakterijos atsparios ampicilinui (100 proc.). Išskirti bakterijų izoliatai jautrūs tetraciklinui (100 proc.) ir ciprofloksacinui (80 proc.).
Iš 5 išskirtų izoliatų, 2 bakterijos identifikuotos kaip A. hydrophila. Abu izoliatai atsparūs chloramfenikoliui ir ampicilinui. Abi bakterijos jautrios sulfametoksazolo–trimetoprimo kombinacijai, cefpodoksimui, ciprofloksacinui ir tetraciklinui.
Iš 5 išskirtų izoliatų, 3 bakterijos identifikuotos kaip A. veronii. Visi 3 izoliatai atsparūs sulfametoksazolui–trimetoprimui ir ampicilinui, 2 iš 3 bakterijos atsparios cefpodoksimui. Visos 3 bakterijos jautrios chloramfenikoliui ir tetraciklinui.
3.2.3. Išskirtų Micrococcus genties bakterijų atsparumas antibiotikams
11 paveiksle pateikti visų Micrococcus genties bakterijų, išskirtų iš pramoninės žuvininkystės tvenkinių vandens, atsparumo antimikrobinėms medžiagoms duomenys.
11 pav. Visų išskirtų antibiotikams atsparių Micrococcus genties bakterijų (n=4) jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Analizuojant 11 paveikslo duomenis, matyti, kad dauguma išskirtų Micrococcus spp. izoliatų atsparūs cefpodoksimui (75 proc.). Visos bakterijos jautrios sulfametoksazolo–trimetoprimo kombinacijai (100 proc.) ir tetraciklinui (100 proc.).
3.2.4. Kitų išskirtų bakterijų atsparumas antibiotikams
Išskirtas vienas Acinetobacter lwofii izoliatas, kuris buvo atsparus ciprofloksacinui.
Išskirtos 2 Bacilus spp. genties bakterijos, kurių abi buvo jautrios chloramfenikoliui ir ciprofloksacinui. Nustatyta, kad vienas izoliatas atsparus gentamicinui, o antras – atsparus ampicilinui, tetraciklinui, cefpodoksimui ir sulfametoksazolo–trimetoprimo kombinacijai.
50 25 25 50 75 50 100 75 75 50 25 100 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP10 TE30 CIP5 C30 CN10 CPD10 SXT25
Micrococcus spp. kiekis, proc.
A nti m ikrobinė m edž iaga ir jos kon ce ntr aci ja dis ke, µg Atsparu Jautru
32 Taip pat išskirtos 2 Flavobacterium odoratum bakterijos, kurios abi atsparios cefpodoksimui, gentamicinui ir ampicilinui. Abu izoliatai jautrūs ciprofloksacinui ir tetraciklinui.
Tyrime nustatytas vienas Serratia marcescens izoliatas, kuris atsparus cefpodoksimui, gentamicinui ir ampicilinui.
3.2.5. Išskirtų bakterijų atsparumas ampicilinui
Nustatyta, kad atsparumas ampicilinui statistiškai patikimai priklauso nuo bakterijų rūšies (p<0,001).
Tiriant bakterijų rūšis, kurių tyrimo metu išskirta 3 ir daugiau izoliatų, apskaičiuota, kad Micrococcus spp. genties bakterijos yra statistiškai patikimai jautresnės ampicilinui nei A. veronii (p<0,05) (1 priedas).
3.2.6. Išskirtų bakterijų atsparumas tetraciklinui
Nustatyta, kad atsparumas tetraciklinui statistiškai patikimai priklauso nuo bakterijų rūšies (p<0,05).
Vertinant bakterijų rūšis, kurių tyrimo metu išskirta 3 ir daugiau izoliatų, nustatyta, kad P. aeruginosa bakterijos yra statistiškai patikimai atsparesnės tetraciklinui nei A. veronii (p<0,05), P. fluorescens (p<0,001), P. putida (p<0,05) ir kiti Pseudomonas spp. genties izoliatai (p<0,05). Išskirtos P. fluorescens bakterijos yra statistiškai patikimai jautresnės tetraciklinui nei kiti Pseudomonas spp. izoliatai (p<0,05) (2 priedas).
3.2.7. Išskirtų bakterijų atsparumas ciprofloksacinui
Nustatyta, kad atsparumas ciprofloksacinui statistiškai patikimai priklauso nuo bakterijų rūšies (p<0,05).
Statistiškai patikimo skirtumo tarp bakterijų, kurių išskirta 3 ir daugiau izoliatų, atsparumo ciprofloksacinui nenustatyta (3 priedas).
3.2.8. Išskirtų bakterijų atsparumas chloramfenikoliui
Nustatyta, kad atsparumas chloramfenikoliui statistiškai patikimai priklauso nuo bakterijų rūšies (p<0,001).
Tiriant bakterijų rūšis, kurių tyrimo metu išskirta 3 ir daugiau izoliatų, apskaičiuota, kad A. veronii bakterijos yra statistiškai patikimai jautresnės chloramfenikoliui nei Micrococcus spp. (p<0,05), P. aeruginosa (p<0,001), P. fluorescens (p<0,001), P. putida (p<0,05) ir kiti Pseudomonas spp. genties izoliatai (p<0,001) (4 priedas).
33
3.2.9. Išskirtų bakterijų atsparumas gentamicinui
Vertinant bakterijų rūšis, kurių tyrimo metu išskirta 3 ir daugiau izoliatų, apskaičiuota, kad P. aeruginosa izoliatai yra statistiškai patikimai atsparesni gentamicinui nei P. fluorescens bakterijos (p<0,05) (5 priedas).
3.2.10. Išskirtų bakterijų atsparumas cefpodoksimui
Nustatyta, kad atsparumas cefpodoksimui statistiškai patikimai priklauso nuo bakterijų rūšies (p<0,001).
Tiriant bakterijų rūšis, kurių tyrimo metu išskirta 3 ir daugiau izoliatų, apskaičiuota, kad A. veronii bakterijos yra statistiškai patikimai jautresnės cefpodoksimui nei P. aeruginosa (p<0,05), P. fluorescens (p<0,05), P. putida (p<0,05) ir kiti Pseudomonas spp. genties izoliatai (p<0,05) (6 priedas).
3.2.11. Išskirtų bakterijų atsparumas sulfametoksazolui–trimetoprimui
Nustatyta, kad atsparumas sulfametoksazolui–trimetoprimui statistiškai patikimai priklauso nuo bakterijų rūšies (p<0,001).
Vertinant bakterijų rūšis, kurių tyrimo metu išskirta 3 ir daugiau izoliatų, apskaičiuota, kad Micrococcus spp. genties bakterijos yra statistiškai patikimai jautresnės sulfametoksazolo– trimetoprimo kombinacijai nei A. veronii (p<0,001) (7 priedas).
