PREPARATŲ SU TIKRŲJŲ MARGAINIŲ VAISIŲ EKSTRAKTU TYRIMAS IR VERTINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

ALBINA LIPSKAITĖ

PREPARATŲ SU TIKRŲJŲ MARGAINIŲ VAISIŲ EKSTRAKTU

TYRIMAS IR VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Doc. dr. Giedrė Kasparavičienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis Data

MARGAINIŲ VAISIŲ PREPARATŲ TYRIMAS IR VERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc., dr. Giedrė Kasparavičienė Data

Recenzentas

(vardas, pavardė, parašas) Data Darbą atliko Magistrantė Albina Lipskaitė Data KAUNAS, 2016

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Tikrasis margainis (Silybum marianum L.) ... 10

1.1.1. Tikrojo margainio vaisių cheminė sudėtis ... 10

1.1.2. Silimarino farmakokinetika ... 11

1.1.3. Farmakologinis poveikis ... 12

1.1.4. Silimarino preparatų pritaikymas ... 14

1.1.5. Sąveika su kitais vaistais ... 16

1.1.6. Silimarino dozavimas ... 17

1.1.7. Silimarino nepageidaujamas poveikis ... 17

2. TYRIMO METODIKA ... 18

2.1. Tyrimo objektai: ... 18

2.2. Naudoti reagentai ... 20

2.3. Naudoti prietaisai ... 20

2.4. Tyrimo metodai ... 21

2.4.1. Literatūros analizės metodas ... 21

2.4.2. UV – VIS spektrofotometrija ... 21

2.4.3. Statistinis duomenų vertinimas ... 22

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 23

3.1. Preparatų sudėčių ir farmacinių formų analizė ... 23

3.1.1. Tikrųjų margainių vaistinės augalinės žaliavos formos pasiskirstymas preparatų sudėtyse 23 3.1.2. Vaisto formos pasiskirstymas preparatuose su tikrųjų marginių žaliava ... 24

3.1.3. Preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava farmacinių formų rekomenduojami suvartojamumo kartai paroje ... 25

3.1.4. Preparatų su tikrųjų margainių žaliava sudėčių analizė ... 26

3.2. Preparatų sudėčių eksperimentinė analizė ... 31

3.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 32

3.2.2 Preparatų antioksidacinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio sąryšis ... 38

IŠVADOS ... 41

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42

SANTRAUKA

MARGAINIŲ VAISIŲ PREPARATŲ TYRIMAS IR VERTINIMAS

A. Lipskaitė. Magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas prof. dr. G. Kasparavičienė; Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas.

1. Darbo tikslas: Atlikti Lietuvoje registruotų pasirinktų preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava sudėčių ir farmacinių formų palyginamąją analizę, įvertinti kiekybiškai ir nustatyti antioksidacinį aktyvumą. Darbo uždaviniai: Ištirti Lietuvoje registruotų preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava pasiūlą. Atlikti šių preparatų palyginamąją analizę vertinant sudėtis. Pasirinktuose preparatuose nustatyti fenolinių junginių kiekį spektrofotometriniu metodu. Spektrofotometriškai nustatyti pasirinktų preparatų antioksidacinį aktyvumą DPPH metodu. Tyrimo objektai ir metodai: Preparatai su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava. Spektrofotometrinis metodas naudotas analizei: bendras fenolinių junginių kiekis – pagal galo rūgšties kalibracinę kreivę ir išreikštas mg/ml GRE; antioksidacinis aktyvumas – DPPH laisvojo radikalo inaktyvavimo spalvinę reakciją. Tyrimo rezultatai ir išvados: Iki 2015 m. birželio mėn. Lietuvoje buvo registruoti 52 preparatai su tikrųjų margainių vaistinės augalinės žaliavos skirtinga forma. Iš jų 7 nereceptiniai vaistiniai preparatai ir 45 maisto papildai. Visi registruoti nereceptiniai vaistiniai preparatai (į šį skaičių neįtraukti homeopatiniai vaistiniai preparatai) savo sudėtyje turintys standartizuotą tikrųjų margainių sausąjį vaisių ekstraktą. 95 proc. maisto papildų yra nestandartizuoti preparatai. 57,14 proc. visų Lietuvoje registruotų nereceptinių vaistinių preparatų su tikrųjų margainių ekstraktu sudaro vienkomponentiniai preparatai. 42,86 proc. – daugiakomponenčiai. Maisto papildų didesnę dalį t.y. 53,33 proc. sudaro daugiakomponenčiai preparatai, o mažesnę – 46,67 proc. vienkomponenčiai preparatai. Populiariausios sudedamosios medžiagos daugiakomponenčiuose preparatuose: paprastosios kiaulpienės šaknų ekstraktas, daržovinių artišokų ekstraktas, vitaminai E ir C. Atliekant tirpumo testą didžiausias fenolinių junginių kiekis 11,33 ± 0,34 mg nustatytas maisto papilde „Silimarina”, mažiausias – 3,13 ± 0,14 mg maisto papilde “HigHWay Liver-San“. Atliekant tirpumo testą iš tirtų preparatų didžiausiu 60,3 ± 0,97 proc. antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo maisto papildas “Silimarina”, mažiausiu –15,33 ± 0,75 proc. maisto papildas „HigHWay Liver-San“. Atliktame tirpimo teste po 60 min. didžiausias fenolinių junginių kiekis 10,9±0,45 mg (96,2 proc.) nustatytas maisto papilde „Silimarina”, mažiausias – 3,37 ± 0,2 mg (80,43 prc.) nereceptiniame vaistiniame preparate „Carsil“. Tirpimo testo metu didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu 68,56 ± 0,15 proc. pasižymėjo maisto papildas „Silimarina“, mažiausiu - 20,69 ± 0,32 proc. maisto papildas „HigHway Liver – San“. Atlikus fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo koreliacijos analizę, paaiškėjo, kad kuo didesnis fenolinių junginių kiekis, tuo didesnis antioksidacinis preparato aktyvumas. Koreliacija tarp kintamųjų yra vidutinė (r = 0.61).

SUMMARY

SUMMARY THE RESEARCH AND EVALUATION OF MILK THISTLE FRUIT PREPARATIONS

A. Lipskaitė. Master thesis / supervisor prof. dr. G. Kasparavičiėnė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, the Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy – Kaunas.

Purpose of the work: To make the comparable analysis of ingredients and pharmaceutical forms of selected milk thistle preparations registered in Lithuania, evaluate quantitatively and determine the antioxidant activity. Tasks: To investigate the supply of milk thistle preparations registered in Lithuania. To make the comparable ingredient analysis of the chosen preparations. Determine the quantity of phenolic compounds by using the spectrophotometry method. Measure the antioxidant activity of selected preparations using DPPH method. Research objects and methodology: Preparations with milk thistle medical plant raw material. Spectrophotometric methods were used for analysis: total phenolic content according calibration curve of galic acid and externalized in mg/ml GRE; antioxidant activity – DPPH free radical inhibition. Results and conclusions: Until June, 2015 y. there were registered 52 preparations with different forms of milk thistle fruit medical plant raw material in Lithuania. Among them there were 7 non-prescription medications and 45 were sold as food supplements. All registered non-prescription medications (excluding the homeopathic medications) had the standardized dry extract of milk thistle fruit. 95 percent of food supplements are non-standardized preparations. 57,14 percent of non-prescription medications with milk thistle extract registered in Lithuania are one-component. 42,86 percent – multicomponent. The biggest part, i.e. 53,33 percent of food supplements are multicomponent and there are less, i.e. 46,67 percent – one-component preparations. The most popular one-components in multione-component preparations: common dandelion root extract, globe artichoke extract, vitamins E and C. According to the results of fusibility test, spectrophotometricaly determined that the highest levels of the phenolic compounds are 11,33 ± 0,34 mg in food supplement ”Silimarina“, the lowest – 3,13 ± 0,14 mg in food supplement “HigHWay Liver-San“. The highest antioxidant activity (60,3 ± 0,97 percent) was detected in food supplement ”Silimarina“, the lowest – 15,33 ± 0,75 percent in food supplement “HigHWay Liver-San“. According to the fusibility test results after 60 minutes, spectrophotometricaly determined that the highest levels of the phenolic compounds are 10,9±0,45 mg (96,2 percent) in food supplement ”Silimarina“, the lowest – 3,37 ± 0,2 mg (80,43 percent) in non-prescription medication „Carsil“. Antioxidant activity showed that the highest activity 68,56 ± 0,15 percent detected in food supplement „Silimarina“, lowest – 20,69 ± 0,32 percent in non-prescription medication “HigHWay Liver-San“. After the correlation analysis of phenolic compounds and antioxidant activity, the results showed that when quantity of phenolic compounds is bigger, then bigger antioxidant activity of preparations exists. The correlation between these two variables reaches the medium meaning (r = 0.61).

SANTRUMPOS

AA – antioksidacinis aktyvumas ALT – alaninaminotransferaze AST – aspartataminotransferazė

CYP2D6 – citochromas P450 2D6, viena iš CYP450 fermentų didšeimės izoformų (citochromas P450, antra šeima, D pošeimis, šeštas polipeptidas)

CYP3A4 – citochromas P450 3A4, viena iš CYP450 fermentų didšeimės izoformų (citochromas P450, trečia šeima, A pošeimis, ketvirtas polipeptidas)

CYP3A4 – citochromas P450 3A4, viena iš CYP450 fermentų didšeimės izoformų (citochromas P450, trečia šeima, A pošeimis, ketvirtas polipeptidas)

DHS – dehidrosilibinas DPPH - 2,2-difenilo-2-pikrylhidrazyl HBV – hepatito B virusas HCV – hepatito C virusas MDA – malodialdehidas PD – paros dozė

P-gp – transportinis baltymas P-glikoproteinas PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija RPD – rekomenduojama paros dozė

UGT1A1 – uridino difosfato gliukuroniltransferazė α-TE – α- tokoferolis

SĄVOKOS

Augalinis vaistinis preparatas – vaistinis preparatas, kurio veiklioji(-iosios) medžiaga(-os) yra arba augalinė(-ės) medžiaga(-os), arba augalinis(-iai) ruošinys(-iai), arba tokios(-ių) augalinės(-ių) medžiagos(-ų) ir tokio(-ių) augalinio(-ių) ruošinio(-ių) mišinys [3].

Maisto papildas – tai maisto produktas, skirtas papildyti įprastą maisto racioną, kuris vienas arba derinyje su kitomis medžiagomis yra koncentruotas maistinių ar kitų medžiagų, turinčių mitybinį arba fiziologinį poveikį, šaltinis [4].

Vaistas (vaistinis preparatas) – vaistinė medžiaga arba jų derinys, pagaminti ir teikiami vartoti, kadangi atitinka bent vieną šių kriterijų: 1) pasižymi savybėmis, dėl kurių tinka žmogaus ligoms gydyti arba jų profilaktikai; 2) dėl farmakologinio, imuninio ar metabolinio poveikio gali būti vartojamas ar skiriamas atkurti, koreguoti ar modifikuoti žmogaus fiziologines funkcijas arba

ĮVADAS

Šiuo metu vis dažniau stengiamasi išvengti cheminių vaistų norint pagerinti sveikatą, o kartu ir labiau susirūpinama ligų profilaktika, gyvenimo kokybės gerinimu natūraliais preparatais. Augaliniai preparatai yra lengviau įsisavinami, turi mažiau šalutinių poveikių lyginant su cheminiais, veikia švelniau bei saugiau, dėl šių priežasčių vis aktualesnis tampa vaistingųjų augalų panaudojimas medicinoje ir farmacijos pramonėje.

Tikrasis margainis (Silybum marianum L.) – Astrinių šeimos (Asteraceae) augalas, augantis pietvakarių Europoje ir Viduržemio pajūrio šalyse. Moksliniuose šaltiniuose plačiai kalbama apie teigiamą tikrojo margainio poveikį kepenims. Apie šio augalo gydomasias savybes rašė senovės graikų mokslininkas Dioskaritas, romėnų gydytojas ir filosofas Galenas. Viduramžių laikų Europoje tikrasis margainis plačiai naudotas nudegimų, kepenų ir tulžies pūslės ligoms gydyti. Iki XIX amžiaus Europoje augalas buvo specialiai auginamas ir maistui vartojamos visos jo dalys.

Nuo to laiko atliekami įvairūs tyrimai atskleidė daug faktų apie šiame augale randamų veikliųjų medžiagų poveikį. Nustatyta tikrųjų margainių vaisių kokybė ir kiekybė daro prielaidą įvairioms indikacijoms, kurios patvirtina gydymo receptus kepenų sutrikimams gydyti.

Pagrindinė cheminių junginių grupė, apsprendžianti farmakologinį poveikį, flavonolignanų mišinys (2 – 3 proc.), bendrai vadinamas silimarinu. Pagrindinis ir aktyviausias jo komponentas yra silibininas [33].

Maisto papildų populiarumas, jų vartojiškumas visuomenėje auga, tačiau šių preparatų kokybė, o kartu ir nauda, nedaug moksliškai tyrinėjama ir nėra iki galo įrodoma. Tarp mažai tyrinėjamų augalinių žaliavų maisto papildų įeina ir preparatai, kurių sudėtyje viena pagrindinių sudedamųjų dalių yra tikrųjų margainių vaistinė augalinė žaliava. Įdomu įsitikinti, ar gamintojas pateisina vartotojo lūkesčius pakuotės ženklinime nurodydamas veikliosios medžiagos kiekius ir dozuotes. Šiuo darbu siekta nustatyti ir įvertinti Lietuvoje registruotų preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava sudėties kokybę.

Darbo reikšmė: buvo ištirtas Lietuvoje registruotų vaistų, bei maisto papildų asortimentas su tikrųjų margainių vaistinė augalinė žaliava, nustatytas fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas spektrofotometriniu metodu.

Tyrimo problema: preparatų, ypatingai maisto papildų, galimas kokybės neatitikimas lyginant su pakuotės ženklinime pateikiama sudėties informacija.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: atlikti Lietuvoje registruotų tikrųjų marginių preparatų sudėčių ir farmacinių formų palyginamąją analizę, įvertinti pasirinktus preparatus kiekybiškai, nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti Lietuvoje registruotų preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava pasiūlą. 2. Atlikti šių preparatų palyginamąją analizę vertinant sudėtis.

3. Nustatyti fenolinių junginių kiekį spektrofotometriniu metodu pasirinktuose preparatuose. 4. Nustatyti pasirinktų preparatų antioksidacinį aktyvumą DPPH metodu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Tikrasis margainis (Silybum marianum L.)

Tikrasis margainis (Silybum marianum L.) – Astrinių šeimos (Asteraceae) augalas, augantis pietvakarių Europoje ir Viduržemio pajūrio šalyse. Lietuvoje auginamas darželiuose, sodybų soduose. Tai vienmetis ar dvimetis 60 – 150 cm aukščio augalas. Stiebas status, šakotas, plikas arba viršūninė dalis voratinkliškai plaukuota. Lapai plačiai lancetiški ar kiaušiniški, pliki, odiški, palei gyslą išmarginti pailgomis baltomis dėmėmis, kraštas dygliuotas. Graižai 4 – 5 cm, skersmens, pavieniai, vainikėlis purpurinis arba baltas. Vaisius lukštaviasis, iki 7mm ilgio, lygus, blizgantis, tamsiai rudas ar juosvas su šviesiomis išilginėmis dėmelėmis. Gydymo tikslais naudojami

margainio vaisiai [5].

Tikrųjų margainių vaisiai pasižymi antioksidaciniu poveikiu, stabilizuoja ląstelių membranas, stimuliuoja nukleorūgščių sintezę ribosomose ir ląstelių regeneracijos procesus [5]. Todėl margainių vaisiai vartojami vaistinių preparatų, skirtų kepenų funkcijos gerinimui, gamybai.

1.1.1. Tikrojo margainio vaisių cheminė sudėtis

Margainio vaisiuose yra 20 – 30 proc. riebalinių aliejų trigliceridų pavidale. Daugiausia randama linoleinės rūgšties (60 proc.), oleininės rūgšties (30 proc.), palmitininės rūgšties (9 proc.). Randama tokoferolio (vit. E) (0,038 proc.), sterolių (0,63 proc.), tokių kaip cholesterolis, kampesterolis, stigmasterolis, sitosterolis, bei apie 25 – 30 proc. baltymų ir nedidelis kiekis gleivių. Farmakologinį poveikį apsprendžia flavonolignanų mišinys (2 – 3 proc.), bendrai vadinamas

1 pav. Tikrasis margainis ( Silybum marianum L.) L.)

silimarinu. Pagrindinis ir aktyviausias Margainio vaisių komponentas yra silibininas. Jis sudaro apie 50 proc. silimarino ir yra randamos dvi jo izomerinės formos – silibininas A (3 pav.) ir silibininas B (4 pav.). Taip pat randami nedideli kiekiai izosilibinino A (5 pav.) ir izosilibinino B (6 pav.), silikristino (7 pav.), silidianino (8 pav.). Tikrojo margainio vaisiuose randami nedideli kiekiai kitų flavonoidų ir jų darinių: taksifolino, kvercetino, dihidrokemferolio, apigenino, naringino, eriodiktiolio [33].

1.1.2. Silimarino farmakokinetika

Tikrojo margainio ekstraktas yra sunkiai tirpus vandenyje [30,33]. Iš virškinamojo trakto pasisisavinama 23 – 47 proc. silibino. Įtakos tam turi keletas veiksnių: jo sunkus tirpimas vandenyje ir kitos sudėtyje esančios medžiagos: flavanoidai, amino rūgštys, baltymai, tokoferolis, riebalai, cholesterolis, taip pat pačio ekstrakto koncentracija [30]. Apie 20 - 40 procentų suvartotos dozės išsiskiria su tulžimi, sulfato ir gliukuronidų konjungato pavidalu, 2 – 5 proc. išsiskiria su šlapimu, likęs

nepakitęs silimarinas išsiskiria su išmatomis. Eksperimentuose su žmonėmis ir gyvūnais buvo nustatyta, jog didžiausia silibino koncentracija kraujo plazmoje yra praėjus 4 – 6 val. po išgertos dozės. Pusinės eliminacijos periodas 6 val. [30,33]. Tiriant 6 sveikus savanorius, vartojusius 240mg slibino dozę, nustatyti šie rodikliai: absorbcijos pusperiodis 0,17 ± 0,09 val., pusinės eliminacijos periodas 6,32 ± 3,94 val., didžiausia koncentracija kraujo plazmoje 1,32 ± 0,16 g/ml, laikas per kurį susidarė didžiausia koncentracija kraujo plazmoje – 1,32 ± 0,45 val. [33].

1.1.3. Farmakologinis poveikis

Dauguma tyrimų atliktų in vitro ir in vivo patvirtintino, kad bendru poveiku ląstelėms silimarinas gali būti apibūdinamas kaip: 1) antioksidantas; 2) tiesioginis arba netiesioginis uždegimo ir fibrogenesės moduliatorius; 3) tiesioginis arba netiesioginis kepenų medžiagų apykaitos moduliatorius [26].

Antioksidacinis silibino poveikis buvo nustatytas visose tyrinėjamose ląstelėse. Jis pasižymi antioksidacinėmis savybėmis dėl laisvųjų radikalų formavimosi inhibicijos, interferuoja su lipidų membranų peroksidacija (taigi, taip pat moduliuoja membranos pralaidumą), ir padidina ląstelės vidinių junginių, neutralizuojančių laisvuosius radikalus, kiekį. Silibinas mažina superoksido anionų radikalų ir nitro oksido (NO) formavimąsi, padidina ATP kiekį fosfatizuodamas ADP, sumažina malodialdehido (MDA) kiekį [26].

Šie rezultatai, kurie yra priklausomi nuo silibino dozės, buvo nustatyti izoliuotose žiurkių Kupferio ląstėlse, hepatocituose, HEPG2 ląstelėse, izoliuotose mitochondrijose iš žiurkių hepatocitų bei žiurkių kepenų išemijos-reperfuzijos modeliuose. Eksperimentiškai sukelto kepenų pažeidimo atveju, žiurkėms per os duodant konjuguotą silibiną (0,6 g/kg), silibino kiekis mikrosomose, išmatuotas naudojant specifinę HPLC analizę, buvo 2,5 μg/mg baltymo, tai atitinka galutinę 10 μmol/L silibino koncentraciją [26]. Vėlesnėse studijose buvo keliama idėja, kad dehidrosilibinas (DHS), oksiduota silibino forma, yra tris kartus aktyvesnis antioksidantas nei silibinas, tikriausiai dėl nesočiųjų jungčių, kurios leidžia molekulei lengviau atiduoti vandenilio joną. Geresnis DHS kaip junginio, neutralizuojančio laisvuosius radikalus veikimas, taip pat gali būti geresnių galimybių reaguoti su lastelės membrana dėl aukštesnės lipofilijos nei silibinas, rezultas [38].

Silimarinas ir silibinas interferuoja su NF-κB-kontroliuojama transdukcijos kaskada. NF-κB yra indukuojamas prie DNR prisijungiantis baltymas, kuris veikia kaip transkripcijos faktorius genams, kurie yra svarbūs uždegiminių procesų, ląstelės išgyvenimo, diferenciacijos, ir augimo procesų iniciavimui bei kontrolei. Nestimuliuojamose ląstelėse, NF-κB yra izoliutas citoplazmoje dėl

inhibicinio baltymo 1 κ B α (IκBα) veikimo. Kai NF-κB aktyvuojamas oksidacinio streso, jis disocijuojasi nuo IκBα, kuris vėliau suyra. NF-κB translokuojasi į ląstelės branduolį ir, dėl kinazių fosfatacijos, aktyvuoja genus, sukeliančius uždegimą. Kartu su silibino antioksidaciniu aktyvumu, jis taip pat neleidžia aktyvuoti ir translokuoti NF-κB dėl IκBα fosfatacijos ir degradacijos procesų slopinimo. Staigaus pelių kepenų pažeidimo atveju, kurio metu pelėms buvo duodamas konkavalinas A, silibinas sumažino plazmos transaminazių lygį, sukeltą plazmos ir kepenų uždegiminių procesų, neleido aktyvuoti hepatinių NF-κB, ir padidino plazmos ir audinių IL-10 (citokino sintezes inhibicijos faktorius, interleukinas 10) lygius [26]. Žiurkėms, kurioms chroniškas kepenų pažeidimas buvo sukeltas naudojant dimetil-nitrozamina, silibino-fosfatidicholino-vitamino E junginys, padėjo išvengti kūno ir kepenų masės praradimo, taip pat sumažino kepenų pažeidimo laipsnį, kuris buvo nustatytas naudojant ALT reikšmes ir nekro-uždegiminę taškų sistemą. Šis efektas buvo asocijuotas su sumažinta stelatinių kepenų ląstelių aktyvacija ir dauginimusi, po abiejų, 1 ir 5 savaičių gydymo atvejų [11].

In vitro žmogaus fibrogenezės modelyje, buvo pademonstruotas tiesioginės ir netiesioginės silibino antifibrotinės savybės. Stelatinėse žmogaus kepenų ląstelėse silibinas sumažino iš trombocitų kilusio augimo (PDGF) - indukuotą DNR sintezę ir lastelių dauginimąsi, esant 25 μmol/L koncentracijai. Silibinas taip pat sumažino PDGF-indukuotą lastelių migraciją, kuri buvo priklausoma nuo silibino dozės. Priešlaikinis apdorojimas su 25-50 μmol/L koncentracijos silibinu reikšmingai sumažino TGF-β-indukuotą de novo I tipo prokolageno sintezę ląstelių kultūroje. Silibino pro-uždegimiminių savybių moduliacijos vaidmens ištyrimui hepatopoetinėse kamieninėse ląstelėse, ląstelės buvo stimuliuojamos IL-1β (20 ng/ml), stipriu pro-uždegiminiu citokinu, silibino veikimas buvo inhibuotas nuo dozės priklausomu būdu, IL-1 indukuota sintezė žmogaus MCP-1 (monocitu chemotraktinis baltymas 1) ir žmogaus IL- 8 buvo aptikti ląstelių kultūroje [37].

Silibinas interferuoja su kai kuriais insulino veikimo mechanizmais. Jis moduliuoja gliukozės sugėrimą adipocituose blokuodamas nuo insulino priklausomą gliukozės transporterį 4. Žiurkių hepatocituose, silibinas, prie 25-100 μmol/L mažina gliukozės formaciją iš kitų gliukoneogeneinių substratų inhibuodamas piruvato kinazės veiklą [26]. Kaip galima matyti iš praėjusių studijų, mažos silibino dozės hepatocitų kultūroje sumažina reaktyvaus deguonies susidarymą dėl mitochondrijų veiklos, tai sukelia iš glikolizės kylančių anglies junginių oksidaciją. Silibinas inhibuoja (priklausomai nuo dozės) gliukoneogenezę ir glikoneogenezę, joms esant bazinėse sąlygose po nuo gliukagono priklausomos stimuliacijos, blokuodamas gliukozės-6-fosfato hidrolizę. Šis efektas buvo pademonstruotas naudojant įvairius substratus, tokius kaip dihidroksiacetoną, laktatą/piruvatą, glicerolį ir fruktozę [37].

1.1.4. Silimarino preparatų pritaikymas

Šio darbo pagrindinis tikslas yra išsiaiškinti Lietuvoje registruotų preparatų su tikrojo margainio vaistine augaline žaliava, dažniausia skirtų kepenų funkcijos gerinimui, sudėties kokybę. Svarbu aptarti kepenų patologijas, kurių profilaktikai naudingi būtent šie augaliniai preparatai.

PSO duomenimis, hepatito C virusu (HCV) pasaulyje užsikrėtę apie 200 mln. žmonių, kai kuriose šalyse šios infekcijos paplitimas apima apie 20 proc. gyventojų. Hepatito B virusu (HBV) užsikrėtę apie 350 mln. žmonių. Daugiau nei 500 000 žmonių kasmet miršta dėl HBV sukeltų komplikacijų [1]. 2011 m. Lietuvoje registruoti 229 nauji virusinio hepatito atvejai. Nors HCV ir HBV paplitimas Lietuvoje nėra didelis, PSO ekspertai, atlikę serologinius tyrimus, atkreipė dėmesį, kad yra žemas šių virusų nustatymo lygis, todėl faktinis susirgimų skaičius gali būti 6 kartus didesnis nei registruojamas. Maži mirštamumo ir sergamumo rodikliai rodo, kad kepenų virusinės infekcijos diagnozuojamos vėlai, dažniausiai prasidėjus šių virusų sukeltoms komplikacijos. Hepatitai B ir C yra svarbiausios kepenų cirozės bei kepenų vėžio priežastys. 25 proc. hepatitu C užsikrėtusių ligonių per 20–25 metus išsivysto grėsmingos komplikacijos: kepenų cirozė, pirminis kepenų vėžys. Lietuvoje apie 50 proc. kepenų transplantacijų atliekama dėl HCV sukeltos kepenų cirozės ir vėžio [1].

Silimarino terapinis panaudojimas siejamas su aktyvių junginių poveikiu žmogaus ląstelėms. Šiuo metu labiausiai ištirtas silimarino antioksidacinis aktyvumas, kuris lemia ekstrakto pritaikymą vidaus organų ligų gydymui ir profilaktikai. Dėl antioksidacinio poveikio silimarinas pasižymi regeneruojančiu poveikiu kepenų ląstelėms, todėl šiuo metu plačiausiai naudojamas kaip hepatoprotektorius. Atlikta nemažai ikiklinikinių ir klinikinių tyrimų, įrodančių teigiamą silimarino poveikį kepenų ligų gydymui.

Atlikus klinikinius tyrimus su pacientais, kurių kepenys yra pažeistos alkoholio nustatyta, kad ilgalaikis (3 – 6 mėn.) silimarino vartojimas ne tik žymiai pagerino kepenų funkciją, bet ir teigiamai veikė kepenų audinį. Serumo transaminazių (ALT, AST, γ -GT) lygis ir bendro bilirubino kiekis normalizavosi žymiai greičiau nei placebo grupėje. Atlikus kepenų biopsiją, teigiami histologiniai pokyčiai silimarinu gydytoje grupėje buvo žymiai dažnesni nei placebo grupėje. To pasekoje pagerėjo pacientų fizinė sveikata ir gyvenimo kokybė [8].

Kito klinikinio, placebu kontroliuojamo tyrimo metu tirtas silimarino (280 ir 560 mg kas 8 valandas 7 dienas) poveikis pacientams, kuriems nustatyta nealkoholinė kepenų steatozė arba lėtinis hepatitas C. Pastebėtas teigiamas poveikis kepenų funkcijai vertinant biocheminius rodiklius (bendro bilirubino, alanino transaminazės, aspartato aminotransferzės, trombocitų kiekius). Lyginant skirtingas silimarino dozes, stipresnis poveikis nustatytas vartojant didesnę silimarino dozę [35].

Be atsitiktinių imčių, placebu kontroliuojamo tyrimo metu, pacientams sergantiems nealkoholine kepenų steatoze buvo skiriama po 280 mg silimarino per dieną, 24 savaites. Atliktas tyrimas parodė, kad per šį laikotarpį sumžėjo kepenų fermentų aktyvumas [30].

Esant virusinei infekcijai vyksta grandininė reakcija reiškinių, kurių pasekmė – toksiniai ir uždegiminiai kepenų ląstelių pokyčiai. Nors silimarinas neveikia virusų dauginimosi, jis gali turėti svarbios reikšmės virusinio hepatito gydymui dėl savo priešuždegiminių ir citotoksinį poveikį mažinančių savybių. Be to, silimarinas skatina ląstelių regeneraciją ir normalizuoja kepenų fermentų kiekį bei veiklą. Atliekant klinikinius tyrimus su pacientais, sergančiais hepatitu, nustatyta, kad lyginant su placebo grupe, silimarino grupėje kepenų veiklos rodikliai (AST) normalizavosi žymiai greičiau [27]. Be to, pagerėjo pacientų gyvenimo kokybė.

Kitame dvigubai aklame tyrime, buvo vertinama 429 mg per parą silimarino dozė, pacientams sergantiems lėtiniu hepatitu C, fermentų rodiklių pagerėjimo pastebėta nebuvo, pacientai vis dar turėjo HCV ir HCV RNR. Panaši situacija buvo ir placebo grupėje. Tačiau visų pacientai subjaktyvi savijauta pagerėjo, ligos progresavimas per 24 tyrimo mėnesius buvo lėtesnis [30].

Silimariną taip pat rekomenduojama vartoti pacientams gydomiems rifampicinu, izoniazidu, ypač jeigu šie vaistai vartojami ilgą laiką [15].

Silimarinas (monoterapija arba kombinacija su penicilinu) gali buti naudojamas apsinuodijus žaliąja musmire. Žaliosios musmirės toksinai faloidinas ir alfa amanitas (amatoksinas) žaloja kepenų ląsteles, silimarinas slopina amotoksino pasisavinimą kepenų ląstelėse. Tyrimas, kuriame buvo nagrinėjami 364 apsinuodijimo žaliąja musmire atvejai parodė, jog intraveninis silimarino vartojimas sumažina pacientų mirtingumą, rečiau reikalinga kepenų transplantacija. Todėl silmarinas puikiai tinka, kaip kompleksinio intensyvios terapijos gydymo dalis [17].

Šie tyrimai parodė silimarino hepatoprotekcinį poveikį esant įvairiems kepenų pažeidimamas. Šiuo metu visi Lietuvoje registruoti preparatai, kurių sudėtyje yra silimarino vartojami esant kepenų ligoms ir profilaktikai. Kitos silimarino produktų pritaikymo galimybės ir jas patvirtinantys moksliniai tyrimai pateikiami 1 lentelėje.

1 lentelė. Silimarino produktų pritakymo galimybės

Indikacija Tyrimo išvada Literatūros

šaltinis Prostatos vėžys Silimarinas sumažino fibronektino sukeltą ląstelių

proliferaciją, ženkliai padidino vėžinių ląstelių žūtį, mažina metastazių atsinaujinimo tikimybę.

[9]

II tipo cukrinis diabetas Silimarinas turi keleriopą teigiamą poveikį: jis sumažina lipoperoksidaciją, gliukozuriją, rezistentiškumą insulinui, taip pat žymiai sumažina injekcinio (egzogeninio)

insulino poreikį. Visa tai rodo pagerėjusią gliukozės kontrolę. Be to, kaip papildomas efektas, buvo pastebėtas kūno masės indekso sumažėjimas.

Žaizdų gydymas Silimarinas ženkliai padidino epitelizaciją po 10 ir 15 dienų bei ir sumažino uždegimą po 5, 10 ir 15 dienų lyginant su nešiklio (PEG) grupe. Žaizdos sumažėjimui, kolagenizacijai bei hidroksiprolino kiekiui silimarinas įtakos neturėjo.

[10]

UV sukelti odos pažeidimai

Silimarino tepalas veiksmingai apsaugo odą nuo UV pažeidimų. Visų tirtų pacientų odos pažeidimai sumažėjo per vieną savaitę. Šalutinių poveikių nepastebėta.

[7]

1.1.5. Sąveika su kitais vaistais

In vitro tyrimai parodė, kad didelės silimarino koncentracijos ( apie 10 µmol) slopina CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9 fermentus. Dozės, reikalingos, kad plazmoje atsirastų farmakologinė koncentracija yra žymiai mažesnės (apie 0,5 mcmol), lyginant su reikalinga fermentų slopinimui. Taip pat slopina fermentą gliukuroniltransferazę (UGT1A1), kuri atsakinga už kai kurių vaistų (naltreksono, buprenorfino, estradiolio ir kt.) metabolizmą, sumažina transportinio baltymo P-glikoproteino (P-gp) aktyvumą [24, 30, 33].

Atliktame randomizuotame tyrime, kuriame dalyvavo 16 sveikų savanorių, buvo siekiama nustatyti tikrųjų margainių ekstrakto poveikį indinaviro farmakokinetikai. Tikrojo margainio preperatai yra dažniausiai vartojamas hepatoprotektorius, pacientų, kurie gydomi anti – retrovirusine terapija. Nors ankstesni tyrimai rodė, kad tikrojo margainio ekstraktas slopina fermento CYP3A4 poveikį, šio tyrimo rezultatai parodė, jog reikšmingo skirtumo tarp grupės vartojusios tik indinavirą ir grupės vartojusios indinavirą kartu su tikrųjų margainių ekstraktu (450mg per dieną), nėra [28]. Šiuos rezultatus taip pat patvirtina kitas tyrimas su 10 sveikų savanorių, vartojusių 459 mg silimarino per dieną [32]. Taigi tikrasis margainis įpratinėmis dozėmis neturėtų trikdyti indinaviro terapijos žmonėms užsikrėtusiems žmogaus imunodeficito virusu.

Kitame klinikiniame bandyme su 12 sveikų sąvanorių, buvo siekiama ištirti tikrojo margainio įtaką H2 receptorių antagonistų (ranitidino) biopraeinamumui, kurie taip pat metabolizuojami fermento CYP3A4. Tiriamieji pirmą savaitę gavo po vieną 150mg ranitidino tabletę, antrą savaitę – po vieną 140mg silimarino kapsulę tris kartus dienoje, vėliau silimarinas ir ranitidinas buvo skiriami kartu. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad silimarinas nedaro jokios įtakos ranitidino pasisavinimui [30].

Klinikinių tyrimų duomenimis, preparatai su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava yra saugūs vartoti, tačiau gydytojams reikėtų atreipti dėmesį į galimas vaistų sąveikas skiriant vaistus, skaidomus tuo pačiu metaboliniu keliu, kartu su didelėmis silimarino dozėmis.

1.1.6. Silimarino dozavimas

Patvirtintos silimarino vartojimo paros dozės nėra. Tačiau skirtinguose šaltiniuose autorių nurodomos rekomenduojamos dozės yra panašios: per os 200 - 400 mg silimarino per parą [13]; 70mg 3 kartus paroje, po valgio. Sunkesniais atvejais po 140mg tris kartus paroje. Palaikomoji dozė po 35-70mg 2 - 3 kartus paroje. Gydymo trukmė – 3 - 6 mėnesiai. Apsinuodijus blyškiąja musmire silimarinas vartojamas intraveniškai. Rekomenduojama pradinė dozė: 5mg/kg kūno svorio per pirmąją valandą po apsinuodijimo. Vėliau skiriamos po 20 - 50 mg/kg kūno svorio silimarino infuzijos dar 4 - 6 dienas. Vaikams skiriama po 5mg/kg kūno svorio (35 - 70mg) 2 - 3 kartus paroje, po valgio. Silimarinas gali būti skiriamas tik vyresniems kaip 5 metų vaikams [25];

1.1.7. Silimarino nepageidaujamas poveikis

Nepageidaujamas preparatų su tikrųjų margainių augaline žaliava poveikis pasitaiko retai. Yra įtraukti šie nepageidaujami reiškiniai: lengvi virškinamojo trakto sutrikimai (burnos džiūvimas, pykinimas, skrandžio veiklos sutrikimas, skrandžio dirginimas ir viduriavimas), galvos skausmas, alerginės reakcijos (dermatitas, dilgėlinė, niežulys, astma, anafilaksija). Nepaisant to, daugumos klinikinių tyrimų metu jokie nepageidaujami reiškiniai nepasireiškė, nebuvo skirtumo tarp placebo ir tiriamųjų grupių [30]. Atliekant klinikinį tyrimą nepageidaujamų reiškinų dažnis buvo mažas - 3 nepageidaujami reiškiniai 28 pacientams. Iš jų tik vienas (galvos svaigimas) galėjo būti siejamas su tikrųjų margainių prepeparatų vartojimu (560 mg). Pacientų, sergančių nealkoholine kepenų steatoze ir vartojusių tikrųjų margainių preparatus, grupėje – 2 iš 12 (16,7 proc.) pacientų pasireiškė bent vienas nepageidaujamas poveikis. Palcebo grupėje – 1 iš 4 (25 proc.) tiriamųjų [35]. Pasak farmakologinio budrumo duomenų bazės nėra nepageidaujamų reiškinių, sunkių nepageidaujamų reiškinių ar mirčių susijusių su preparatų, savo sudėtyje turinčių tikrųjų margainių vaistinės augalinės žaliavos, vartojimu [30].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektai

Tyrimas atliktas analizuojant Lietuvos vaistinių asortimentą iki 2015 m. birželio mėn., atsižvelgiant į kepenims skirtų augalinių maisto papildų sudėtis. Ieškota preparatų, kurių pagrindinė sudėtinė dalis ar viena iš sudedamųjų dalių yra tikrųjų margainių (Silybum marianum L.) vaistinė žaliava. Rasti 52 Lietuvoje registruoti preparatai su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava. Iš jų 7 nereceptiniai vaistiniai preparatai ir 45 maisto papildai. Šių preparatų sąrašas pateiktas pirmame priede.

Eksperimentiniam tyrimui buvo pasirinkti penki skirtingi preparatai, kurių sudėtyje yra tikrųjų margainių vaisių ekstrakto, atitinkančio 140mg, 35mg ir 22,5mg silimarino vienoje tabletėje/kapsulėje.

2 lentelė. Eksperimentiniam tyrimui pasirinkti preparatai Eil. nr. Preparato pavadinimas Vaistinis preparatas/maisto papildas Veikliųjų medžiagų kiekis vienoje tab./kaps. Pagalbinės medžiagos 1. Livosil, kapsulės („Aconitum“, Lietuva) Vaistinis preparatas 215,38 – 350 mg margainių vaisių rafinuoto ir standartizuoto sausojo ekstrakto (24-27:1), atitinkančio 140 mg silimarino, apskaičiuoto pagal silibininą. Kapsulės turinys: Bevandenis kalcio-vandenilio fosfatas Karboksimetilkrakmolo A natrio druska Talkas Magnio stearatas Koloidinis bevandenis silicio dioksidas Kapsulės apvalkas: Želatina

Titano dioksidas (E171) Raudonasis geležies oksidas (E172

2. Silimarina, tabletės („S.C. Remedia“,

Rumunija)

Maisto papildas Tikrųjų margainių sausasis ekstraktas (140 mg silimarino) Lipnumą reguliuojančios medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė laktozės monohidratas ,stabilizatorius polivinilpirolidonas, skersinio ryšio natrio

karboksimetilceliuliozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos: talkas, silicio

dioksidas, magnio

stearatas.

3. Highway Liver- San („UAB Losbalt“,

Lietuva)

Maisto papildas Tikrųjų margainių sėklų ekstraktas 175mg (atitinka 140mg silimarino), cholinas 100mg, DL-alfa-tokoferilacetatas 48mg, daržinių ciberžolių šaknų ekstraktas 40mg (38mg kurkuminoidų) Kapsulės turinys: Kukurūzų krakmolas, magnio stearatas. Kapsulės apvalkas: želatina. 4. Carsil, dengtos tabletės („SOPHARMA AD“, Bulgarija) Vaistinis preparatas 40,9 - 56,3 margainių vaisių rafinuoto ir standartizuoto sausojo ekstrakto (35-50:1), atitinkančio 22,5 mg silimarino, išreikšto silibininu 55,38 mg laktozės monohidrato, 162,19 mg sacharozės, 20,60 mg gliukozės, 55,38 mg kviečių krakmolo, 4,13 mg sorbitolio (E420), metilo parahidroksibenzoato (E218), propilo parahidroksibenzoato (E216). 5. Heparsin Fytolab, dengtos tabletės („UAB CeMex Farma, Lietuva)

Maisto papildas Sausasis tikrųjų margainių vaisių ekstraktas (35mg silimarino) Saldiklis – izomaltas, pregelifikuotas kukurūzų krakmolas, lipnumą reguliuojančios medžiagos – silicio dioksidas, magnio stearatas.

Vaistiniai preparatai ir maisto papildai atrinkti atsižvelgiant į sudėtyje esančias medžiagas ir jų kiekį. Tyrimui buvo pasirinkta vienkomponenčiai preparatai su tikrųjų margainių ekstraktu ir daugiakomponentis preparatas, kurio sudėtį papildo cholinas, saugantis kepenis nuo riebalų sankaupų, DL-alfa-tokoferilacetatas ir daržinių ciberžolių (Curkuma longa) šaknų ekstraktas.

Tokia preparatų atranka siekiama palyginti nereceptiniuose vaistiniuose preparatuose ir maisto papilduose su tikrųjų marginių ekstraktais esantį bendrą fenolinių junginių kiekį ir jų tirpalų antioksidacinį aktyvumą.

Fenolinių junginių kiekio ir DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymui: 1 tabletės arba kapsulės turinys tirpinamas 100 ml išgryninto vandens ir filtruojamas pro 0,45 μm miliporų filtrą.

Tablečių, kapsulių tirpumo ir tirpimo - veikliosios medžiagos išsiskyrimo laiko nustatymui atliktas kietų vaistų formų tirpimo testas, naudojant krepšelinį prietaisą. Tyrimas atliktas 500 ml vandens, 37°C temperatūroje. Kas penkiolika minučių keturis kartus paimama po 5 ml tirpalo. Tirpalas filtruojamas pro 0,45 μm miliporų filtrą. Šis tirpalas buvo naudojamas bendro fenolinių junginių kiekio ir DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymui.

2.2. Naudoti reagentai

1. Išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2008:0008, LSMU Laboratorija); 2. Etilo alkoholis 96° (UAB ,,Stumbras”, Lietuva);

5. Folin-Ciocalteu reagentas (,,Sigma“, Šveicarija);

6. 2,2-difenilo-2-pikrylhidrazyl reagentas (,,Sigma-Aldrich”, Vokietija); 7. Natrio karbonatas (,,Sigma“, Šveicarija);

8. Galo rūgštis (,,Sigma“, Šveicarija).

2.3. Naudoti prietaisai

1. Spektrofotometras (UNICOM UV/VIS; Didžioji Britanija); 2. Besisukančio krepšelio aparatas („NATA“; Rusija);

Krepšelinį prietaisą sudaro:

 Cilindrinis indas iš borosilikatinio stiklo su pusrutuliniu dugnu ir 1000 ml nominaliąja talpykla. Garavimui sulėtinti uždengiamas dangtelis, kurio centre yra skylės maišiklio velenui, termometrui bei priemonėms skyščiui ištraukti;

 Maišiklis, sudarytas iš vertiklauas veleno, prie kurio apatinės dalies pritvirtintas cilindrinis krepšelis. Krepšelis turi dvi dalis: viršutinė dalis, turinti 2 mm angą, yra suvirinta su velenu ir turi tris spyruoklines sąvaržas, kurios leidžia pašalinti apatinę dalį, kad būtų galima įdėti tiriamąjį preparatą, ir tvirtai laiko apatinę dalį koncentriškai su indo ašimi sukimo metu. Apatinė krepšelio dalis yra padaryta iš lydyto tinklinio audinio, suformuoto į cilindrą, kurio viršus ir apačia apjuosti siaura metaline juostele. Audinys sudarytas iš 0,254 mm skersmens storio vielos ir turi 0,381 mm²; testo metu

krepšelio dugnas turi būti 25 ± 2 mm atstumu nuo vidinio indo dugno; viršutinė veleno dalis sujungta su varikliu, turinčiu greičio reguliatorių; maišiklis sukasi tolygiai, be didesnių nuokrypių;

 Vandens vonia.

3. Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija).

2.4. Tyrimo metodai

2.4.1. Literatūros analizės metodas

Lietuvoje registruotų tikrųjų margainių ekstrakto preparatų sudėčių analizė buvo atliekama pagal UAB ,,Limedika" sukurtą programą ,,MedInfo“ ir internetės prieigos: <http://extranet.vvkt.lt/paieska/>, <http://vmvt.lt/maisto-papildai/>,

<http://www.vaistai.lt/nereceptiniai-vaistai/virskinimo-sistema-ir-metabolizma-veikiantys-vaistai?Itemid=1138 >.

2.4.2. UV – VIS spektrofotometrija

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui atliekama spalvinė reakcija su Folin-Ciocalteu reagentu. Reakcija: prie 2,5 ml Folin - Folin-Ciocalteu (1:10) tirpalo pridedama 0,5 ml tiriamojo tirpalo ir 2 ml 7,5% natrio karbonato tirpalo. Tirpalas įgauna mėlynai žalią spalvą. Praėjus 30 minučių spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 765 nm bangos ilgyje.

Kiekybiniam nustatymui sudaroma kalibravimo kreivė 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/ml koncentracijos galo rūgšties tirpalams. Gauta koncentracija išreiškiama galo rūgšties

ekvivalentais (GRE) mg/ml.

Kiekvienas mėginys analizuotas po tris kartus ir vestas vidurkis, turintis ± paklaidą.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu

Laisvųjų radikalų neutralizacija preparatams atlikta tirpalus veikiant 2,2-difenilo-2-pikrylhidrazyl (DPPH) reagentu pagal Brand-Williams ir kitų mokslininkų aprašytą procedūrą. Antioksidacinis aktyvumas įvertintas matuojant kiek procentų stabilaus DPPH radikalo neutralizuoja

tiriamojoje medžiagoje esantys ir antioksidaciniu aktyvumu pasižymintys junginiai. Antioksidantinis tirpalas (0,1 ml) sumaišytas su 2,9 ml 0,1 mM DPPH. Spektrofotometru išmatuotas mėginių absorbcijos mažėjimas 515 nm bangos ilgyje kol pasiekta absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 30 min.). Etaloninis - 96 proc. etanolis. Antioksidacinis tirpalų aktyvumas apskaičiuotas pagal formulę, išreikštas inaktyvuoto DPPH procentais:

Čia Ab – tuščiojo bandinio absorbcija (t = 0 min);

Aa – bandinio su tiriamuoju tirpalu absorbcija (po 30 min).

Kiekvienas mėginys analizuotas po tris kartus ir vestas vidurkis ± paklaida.

2.4.3. Statistinis duomenų vertinimas

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Preparatų sudėčių ir farmacinių formų analizė

3.1.1. Tikrųjų margainių vaistinės augalinės žaliavos formos pasiskirstymas

preparatų sudėtyse

8 pav. Tikrųjų margainių vaistinės augalinės žaliavos formos pasiskirstymas Lietuvoje registruotuose preparatuose

Atlikus Lietuvoje registruotų preparatų su tikrųjų margainių vaistine augline žaliava analizę, nustatyta, jog į preperatų sudėtį įeina 7 skirtingos tikrojo margainio žaliavos formos. Dažniausiai pramonėje gaminami maisto papildai, kurių sudėtyje yra sausasis tikrųjų margainių vaisių ekstraktas. Būtent ši žaliavos forma sudaro 32,69 proc. visų analizuotų preparatų, 26,92 proc. - preparatai su sausuoju tikrųjų margainių ekstraktu, 15,38 proc. yra tikrųjų margainių aliejaus (8 pav.).

Atliekant analizę pastebėta, kad 48 proc. preparatų nenurodyta ar žaliava standartizuota, silimarino kiekis žaliavoje (į šį skaičių neįtraukti homeopatiniai preparatai). Šios informacijos

trūkumas gali klaidinti vartotoją, nes būtent silimarino kiekis apsprendžia farmakologinį poveikį [33]. Preparatuose „Altajaus margainių aliejus“, „Altajaus margainių miltai“, „Tikrojo margainio aliejus“ nenurodytas vaistinės žaliavos kiekis vienoje produkto dozėje. Visi šie produktai registruoti, kaip maisto papildai. Visuose produktuose, kurie registruoti, kaip nereceptiniai vaistiniai preparatai, nurodytas tikslus silimarino kiekis.

3.1.2. Vaisto formos pasiskirstymas preparatuose su tikrųjų marginių žaliava

9 pav. Vaisto formos pasiskirstymas preparatuose

Atlikus tiriamųjų preparatų teorinę analizę, paaiškėjo, jog dažniausiai nagrinėjami vaistiniai preparatai rinkai pateikiama tabletuota ir kapsuliuota forma (9 pav.). Atitinkamai tai sudaro po 40,38 proc. Miltelių, aliejinė ir skysto ekstrakto vaistinių preparatų formos procentaliai sudaro nežymią visų preparatų dalį. Atitinkamai tai sudaro 9,62 proc., 7,27 proc. ir 3,64 proc.

Lyginant šias vaistų formas kapsuliuota vaistų formą galima vertinti kaip pranašiausią, nes fenolinių junginių absorbcija aktyviausiai vyksta žarnyne, todėl kapsulės apvalkalas – viena tinkamiausių apsaugų nuo skrandžio rūgščiosios terpės [2].

Visuose aliejinės formos maisto papilduose nenurodytas silimarino kiekis, todėl ši vaistų forma nerekomenduotina vartotojui.

3.1.3. Preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava farmacinių formų

rekomenduojami suvartojamumo kartai paroje

10 pav. Lietuvoje registruotų preparatų su tikrųjų margainių žaliava farmacinių formų rekomenduojami suvartojamumo kartai paroje

Pagal 10 paveiksle pateiktą diagramą, populiariausias tiriamųjų preparatų vartojimo dažnumas yra 1 ir 2 kartai per dieną. Tai sudaro po 23,08 proc. visų tiriamųjų preparatų. Penkis preparatus, kurie sudaro 9,62 proc. visų tiriamųjų preparatų, rekomenduojama vartoti net iki 12 kartų per dieną. Tai trys maisto papildai: „Tikrojo margainio aliejus“, kapsulės („OOO Mirrolla“, Rusija), „Tikrojo margainio aliejus“, kapsulės (ZAO “Realkaps”, Rusija), “Tikrojo margainio aliejus”, kapsulės („RealKaps“, Rusija) ir du nereceptiniai vaistiniai preparatai: “Carsil“ ir „Livosil“ (su 22,5 mg silimrino).

Galima daryti prielaidą, kad viena iš priežasčių, kodėl dozavimo dažnumas svyruoja nuo 1 iki 12 vartojimų per dieną, gali būti tikslios silimarino rekomenduojamos paros normos nebuvimas, taip pat skirtingas veikliųjų medžiagų kiekis viename farmacinės formos vienete. Tačiau remiantis analizuotais literatūros šaltiniais ir klinikiniais tyrimais, optimaliausia silimarino paros dozė yra 400 - 420 mg. Toks silimarino kiekis yra vienoje maisto papildo „Hepamax“ tabletėje ir trijose nereceptinio vaistinio preparato „Livosil“ kapsulėse.

3.1.4. Preparatų su tikrųjų margainių žaliava sudėčių analizė

11 pav. Daugiakomponenčių ir vienkomponenčių preparatų pasiskirstymas tiriamųjų preparatų su tikrųjų mrgainių žaliava tarpe

48,08 proc. tiriamųjų preparatų yra vienkoponenčiai ir 51,92 proc. daugiakomponenčiai (11 pv.). Galima teigti, kad ženklaus skirtumo tarp vienkomponenčių ir daugiakomponenčių preparatų pasiskirstymo tarp Lietuvoje registruotų preparatų su tikrųjų margainių augaline žaliava nėra.

Didžioji dalis (57,14 proc.) nereceptinių vaistinių preparatų yra vienkomponenčiai. Maisto papldų tarpe didesnę dalį (53,33 proc.) sudaro daugiakomponenčiai preparatai. Galima manyti, kad įtakos skirtingam vienkomponenčių ir daugiakomponenčių preparatų pasiskirstymui gali turėti skirtinga maisto papildų ir nereceptinių vaistinių preparatų paskirtis.

Dažniausios papildomos medžiagos daugiakomponenčių preparatų su tikrųjų margainių žaliava sudėtyse

Paprastosios kiaulpienės (Taraxacum officinale) šaknų ekstraktas

Tolesnei analizei iš 52 preparatų su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava buvo atrinkti 27 daugiakomponenčiai preparatai.

Atlikus analizę, paaiškėjo, jog po tikrojo margainio augalinės žaliavos vienas iš dažniausiai pasikartojančių augalinis sudėties komponentas – paprastųjų kiulpienių (Taraxacum officinale) šaknų ekstraktas, turintis seskviterpeninių laktonų, taraksacino, 25 – 30 proc. inulino, organinių rūgščių, vitmino C, vitamino B2 ir kitų medžiagų [5].

Paprastoji kiaulpienė didina virškinimo liaukų sekreciją bei tulžies išsiskyrimą, laisvina vidurius, skatina medžiagų apykaitą, aktyvina apsaugines organizmo funkcijas. Atlikti tyrimai rodo, kad paprastosios kiaulpienės apsaugo kepenis nuo alkoholio toksinų. Tyrimai su pelėmis in vitro parodė, kad vandeninis paprastosios kiaulpienės šaknų ekstraktas apsaugo hepatocitus nuo alkoholio sukeltų pažeidimų didinant antioksidacinį aktyvumą ir mažinant ląstelių peroksidacija [22]. Kito tyrimo metu buvo siekiama įvertinti kiaulpienės šaknų vandeninio – etanolinio mišinio veiksmingumą anglies tetrachlorido sukeltai kepenų fibrozei. Gauti rezultatai įrodė mišinio terapinį poveikį kepenims ir suteikė mokslinių įrodymų, pagrindžiant paprastosios kiaulpienės šaknų vartojimą esant kepenų sutrikimams [12].

Paprastųjų kiaulpienių šaknų ekstraktas yra 25,92 proc. visų daugiakomponenčių preparatų su tikrųjų margainių vaistine augline žaliava sudėtyse (12 pav.). Didžiausias kiaulpienių šaknų kiekis

(714 mg), pagal pakuotės ženklinimą, įeina į „Herbomix Kepenų funkcijos palaikymui“ maisto

papildą. Į šį preparatą įeina ir toks pat tikrųjų margainių vaisių ekstrakto kiekis. Tokiu pačiu santykiu vaistinės medžiagos pasiskirsto „Gastroval“, „Gastroval Forte“ ir „Hepasan Forte“ maisto papilduose. Galima daryti prielaidą, kad gamintojai tikrųjų margainių sėklų ekstraktą ir paprastųjų kiaulpienų šaknų ekstraktą vertina kaip lygevertes medžiagas kepenų sutrikimų profilaktikai.

Į maisto papildo „Digestiveaid“ sudėtį įeinantis paprastųjų kiaulpienių šaknų ekstrakto kiekis yra didesnis už tikrųjų margainių vaisių ekstrakto kiekį. Gali būti, jog juose būtent šis augalas, o ne tikrųjų margainių vaisių ekstraktas traktuojamas kaip pagrindinis augalinis antioksidantas. Taip pat įtakos gali turėti skirtinga žaliavų standartizacija nulemianti veikliųjų junginių kiekį.

12 pav. Paprastosios kiaulpienės vaistinės augalinės žaliavos kiekis tirtuose daugiakomponenčiuose preparatuose1

Daržovinio artišoko (Cynara Scolymus) ekstraktas

Kitas augalinis komponentas, sudarantis 29,63 proc. daugiakomponečių preparatų su tikrųjų

margainių vaistine žaliava (13 pav.) yra daržovinis artišokas (Cynara Scolymus).

Moksliniame tyrime, kurio metu buvo tiriamas hepatoprotekcinis vandeninio artišokų lapų ekstrakto poveikis paracetamolio pažeistoms kepenims ir jo poveikis lyginamas su N-acetilcisteino poveikiu, buvo nustatyta, kad šis ekstraktas gali apsaugoti žiurkių kepenis nuo paracetamolio sukelto kepenų toksiškumo dėl savo antioksidacinių savybių [14]. Kito tyrimo metu buvo siekiama nustatyti artišokų lapų ekstrakto poveikį žmonėms, kurie serga lėtiniu hepatitu C. 17 pacientų, sergančių lėtiniu hepatitu C, 12 savaičių vartojo po 3200 mg standartizuoto vandeninio artšokų lapų ekstrakto. Po 12 savaičių nei vienam iš pacientų biocheminiai kepenų rodikliai reikšmingai nepakito, tačiau jau po 4 gydymo savaičių sumažėjo su hepatitu C siejamami simptomai: nuovargis, nemalonus jausmas viršutinėje pilvo dalyje, sąnarių problemos. Vandeninis artišokų lapų ekstraktas buvo įvertintas kaip gerai toleruojamas, nepasireiškė sunkių šalutinių poveikių [20]. Artišokų lapų ekstraktas turi hepatoprotekcinių savybių ir yra vartojamas pacientams sergantiems lėtinėmis kepenų ligomis.

Didžiausias artišokų ekstrakto kiekis (600 mg) yra „Tabletės skrandžiui ir kepenims su margainiu“ maisto papilde. Šiame maisto papilde, remiantis pakuotės ženklinimu, tikrųjų margainių

sausojo sėklų ekstrakto yra 2,5 karto mažiau nei daržovinio artišoko ekstrakto, o maisto papilde „Hepar formula“ - 8,64 karto mažiau (162 mg), todėl galima daryti prielaidą, kad šiuose preparatuose gamintojas daržovinio artšoko ekstraktą pasirinko kaip pagrindinį augalinį ekstraktą kepenų funkcijos gerinimui ir palaikymui. Preparate „Hepasan Forte“ nurodytas toks pats abiejų ekstrakų kiekis, vertinat šiuos vaistinius augalus, kaip lygiaverčius kepenų apsauginės funkcijos atžvilgiu. Kituose keturiuose maisto papilduose dominuoja tikrųjų margainių vaistinė augalinė žaliava. Skirtingiems ekstraktų kiekiams didelę įtaką gali daryti skirtinga žaliavų standartizacija, kuri nulemia skirtingą veikliųjų junginių kiekį.

13 pav. Daržovinio artišoko ekstrakto kiekis tirtuose daugiakomponenčiuose preparatuose2

Vitaminų C ir E kiekio pasiskirstymas daugiakomponenčiuose preparatuose

48,15 proc. daugiakomponenčių preparatų su tikrųjų margainių vaistine žaliava sudėtį papildo vitaminai. Populiariausi ir dažniausiai sutinkami visuose atrinktuose preparatuose yra vitaminai C (askorbo rūgštis) ir E (α-takoferolis).

Vadovaujantis diagramoje (14 pav.) pateiktais preliminariais duomenimis, matyti, jog dažniausiai sudėtyje esantis vitaminas tiriamuosiuose preparatuose – α-tokoferolis (vit. E). Pakuotės ženklinime vitaminas E nurodomas 6 preparatuose iš 27, o askorbo rūgštis (vit. C) - 5.

14 pav. Vitaminų C, E kiekių santykis tiriamuose preparatuose su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava3

Vitaminas E atlieka stipraus antioksidanto vaidmenį ir yra svarbus membranos stabilizavimui. Literatūros šaltiniai teigia, kad vitaminas E sukelia kepenų steatozės regresiją [31]. Po vienerių gydymo vitaminu E metų sergantiems kepenų ciroze reikšmingai sumžėjo alanininės transaminazės (ALT) aktyvumas, vidutiniškai sumažėjo steatozės ir uždegimo laipsnis bei labai sumažėjo plazmos beta-1 transformuojančio augimo faktoriaus koncentracija. Šis faktorius aktyviai dalyvauja kepenų fibrozės patogenezėj. Vitamino E skiriama po 12 mg per dieną valgant [31].

Buvo atliktas tyrimas siekiant įvertinti vitamino E poveikį mažinant alaninaminotransferazės (ALT) ir aspartataminotransferazės ( AST) kiekį pacientams sergantiems nealkoholine kepnų steatoze ir lėtiniu hepatitu C. Gauti rezultatai rodo, kad vitaminas E gali sumažinti aminotransferazių koncentraciją šiems pacientams [19]. Dvigubai aklame atsiktiktinių imčių tyrime buvo tiriami 23 hepatitu C sergantys pacientai. Jie vartojo dideles dozes vitamino E ( 2 x 400 TV alfa -tokoferolio/dienai) 12 savaičių. Stebint ligos būklę buvo nustatyti klinikiniai parametrai: alaninaminotransferazės (ALT), aspartataminotransferazės (AST), vitamino E kiekis plazmoje ir plazmos lipidų kiekis. Po 12 savaičių gydymo Alfa-tokoferoliu, jo koncentracija plazmoje apie 2 kartus padidėjo visiems 23 pacientams. 11 iš 23 pacientų klinikiniai parametrai, rodantys kepenų pažeidimą, buvo sumažėję: ALT koncentracija buvo sumažėjus 46%, o AST koncentracija buvo sumažėjus 35%. Nustatyta, kad vitaminas E yra netoksiškas net esant aukštoms jo dozėms ir vartojant

ilgą laiką. Remiantis šiais rezultatais tyrėjai rekomenduoja vitaminą E vartoti palaikomajam gydymui pacientams sergantiems hepatitu C [39]. Kitame tyrime buvo tirti 247 atsitiktinai parinkti žmonės, sergantys nealkholine kepenų steatoze. 96 savates jie vartojo po 800 TV vitamino E dozę per parą. Gauti rezultatai parodė, kad vitaminas E yra efektyvus, lyginat su placebu, šia liga sergantiems pacientams [34]. Analizuotuose klinikiniuose tyrimuose vitamino E dozė buvo 800 – 1200 IU.

Šis vitaminas yra 22,2 proc. visų 27 analizuojamų daugiakomponenčių preparatų (14 pav.). Iš 6 analizuojamų kompleksinių preparatų, kurių sudėtyje yra vitaminas E, 50 proc. vitmino E kiekis viršija nustatyta RMV. 14 paveiksle pateiktoje diagramoje didžiausias vitamino E kiekis matomas maisto papilde „HigHWay Liver-San“. Šį preparatą numanomai rekomenduotina vartoti pacientams, kurie jaučia vitamino E trūkumą, čia jis nustatytą vit. E RMV viršija 8 kartus. Šio preparato notifikacija dar nagrinėjama. Preparatuose „bioSilymarin 105 mg“, „Šviesintas margainių vaisių aliejus su vitaminu E“, ir „Tikrojo margainio aliejus“ (OOO “Živitel”, Rusija) vitamino E kiekis nesiekia rekomenduojamos paros normos.

Vitaminas C (askorbo rūgštis) yra reikalingas įvairioms organizmo funkcijoms palaikyti, veikia kaip stiprus oksidatorius. Pagal Lietuvos higienos normą HN 119:2002 vitamino C RPN yra 80 mg.

Atliktame tyrime in vitro buvo analizuojams vitamino C poveikis tulžies rūgšties sukeltai hepatocitų apoptozei. Gauti rezultatai parodė, kad vitaminas C turi teigiamą poveikį gydant cholestaznius kepenų pažeidimus [23]. Kitame tyrime nustatyta, kad vitaminas C yra veiksmingas apsaugant vaivorykštinių upėtakių kepenis nuo oksidacinių pažeidimų jas veikiant metilu [29].

5 prparatai iš 27 nagrinėjamų daugiakomponenčių preparatų savo sudėtyje kaip papildomą antioksidantą prie tikrųjų margainių fenolinių junginių turi vitaminą C. 14 paveiksle pateiktoje diagramoje matomais duomenimis vienoje maisto papildo „Hepamax“ tabletėje yra visa vitamino C rekomenduojama paros dozė. Du preparatai „Tabletės skrandžiui ir kepenims su margainiu“ ir „Silymarin complex“ viršija rekomenduojamą vitamino C paros dozę. Askorbo rūgštis - tirpus vandenyje vitaminas, perdozavimo atvejų pasitaiko labai retai, perteklius iš organizmo pasišalina su skysčiais, todėl tokia dozė nekelia pavojaus organizmui [36].

3.2. Preparatų sudėčių eksperimentinė analizė

3.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Pasirinkti preparatai yra maisto papildai ir nereceptiniai vaistiniai preparatai,

vienkomponenčiai ir daugiakomponentis, taip pat skiriasi farmacine forma (tabletės ir kapsulės). Vienoje tiriamųjų preparatų su tikrųjų margainių vaistine augline žaliava tabletėje/kapsulėje yra 140 mg, 35 mg ir 22,2 mg silimarino.

3.2.1.1 Tirpumo testas

15 pav. Fenolinių junginių kiekio pasiskirstymas tiriamuosiuose preparatuose su tikrųjų margainių ekstraktu

Didžiausias fenolinių junginių kiekis (11,33 ± 0,34 mg) vienoje tabletėje nustatytas preparate „Silimarina“, po jo seka preparatas „Carsil“, tačiau šiame preparate fenolinių junginių kiekis 2,7 karto mažesnis (4,19 ± 0,12 mg). Mažiausias fenolinių junginių kiekis (3,13 ± 0,14 mg) yra maisto papilde „HighWay Liver-San“. Gautiems rezultatams įtakos galėjo turėti neįprasta, lyginant su kitais tirtais preparatais, maisto papildo kapsulių turinio forma. Kapsulės turinys buvo nevienalytis, tai galėjo turėti įtakos tirpimui. Šis maisto papildas vienintelis, iš tirtųjų preparatų, yra daugiakomponentis, tai taip pat galėjo įtakoti kapsulės turinio išvaizdą ir preprato tirpumą.

Lyginant teorinį silimarino kiekį, pateikiamą vartotojui pakuotės ženklinime, ir fenolinių junginių kiekį, nustatytą tyrimo metu, nerastas vientisumas tarp rodmenų (16 pav.). Tikrųjų margainių žaliavos kiekis neįtakoja fenolinių junginių kiekio.

16 pav. Nurodyto silimarino kiekio palyginimas su nustatytu fenolinių junginių kiekiu vienoje tabletėje/kapsulėje

Nereceptiniame vaistiniame preparate „Livosil“ fenolinių junginių kiekis sudaro 2,9 proc. nurodyto silimarino kiekio, maisto papildo preparate „Silimarina“ 140 - 11,77 proc., maisto papilde ,,HighWay Liver-San“ - 2,24 proc., nerceptiniame vaistiniame preparate „Carsil“ daugiausiai - 18,62 proc., o maisto papilde „Heparsin Fytolab“ 10,94 proc.

Lyginamuosius rezultatus lemia daug faktorių, pavyzdžiui, žaliavos augimo sąlygos ir regionas, žaliavos rinkimo laikas augalo brandoje, žaliavos paruošimo sąlygos ar preparato ruošimo technologija, kurios metu galimi cheminių junginių pakitimai.

Remiantis 16 pav. duomenimis, galima daryti prielaidą, kad santykis tarp teorinio silimarino kiekio ir nustatyto fenolinių junginių kiekio vienoje preparatų tabletėje arba kapsulėje yra labai mažas, nesiskiria maisto papilduose ir nereceptiniuose vaistiniuose preparatuose.

3.2.1.2 Tirpimo testas

17 pav. Tirpimo testo metu nustatytas fenolinių junginių kiekis tiriamuosiuose preparatuose su tikrųjų margainių ekstraktu

Remiantis rezultatais 17 pav. galima teigti, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis (10,9±0,45 mg/tab.) išsiskyrė maisto papilde „Silimarina“, mažiausias (3,37 ± 0,2 mg/tab.) - nereceptiniame vaistiniame preparate „Carsil“.

Greičiausiai (per pirmas 15 tirpimo testo minučių) fenoliniai junginiai išsiskiria preparatuose „Livosil“ ir „Silimarina“. Juose taip pat nustatytas ir didžiausias šių junginių kiekis.

Preparatuose „Carsil“ ir „Heparsin Fytolab“ po pirmų 15 tirpimo testo minučių išsiskyrusių fenolinių junginių kiekis buvo panašus (2,56 ± 0,28 mg/tab. ir 2,02 ± 0,28 mg/tab.), tačiau testo pabaigoje maisto papilde „Heparsin Fytolab“ šių medžiagų kiekis buvo 1,06 mg/tab. didesnis. Preparate didžiausias fenolinių junginių kiekis išsiskyrė per pirmąsias 45 tirpimo testo minutes (4,4 ± 0,12 mg/tab).

Maisto papilde ,,HighWay Liver-San“ fenolinių junginių kiekis palaipsniui didėjo kas 15 tirpimo testo minučių ir testo pabaigoje neženkliai (0,54 mg/kaps.) skyrėsi nuo nereceptiniame vaistiniame preparate „Livosil“ nustatyto fenolinių junginių kiekio.

Skirtingus tirpimo testo rezultatus galėjo lemti skirtingos preparatų gamybos technologijos, pagalbinės medžiagos, sudedamosios vaistinės medžiagos. Atsižvelgiant į kapsuliuotos preparatų formos

privalumus lyginant su tabletuota, nustatyta, kad tai neturi įtakos fenolinių junginių atsipalaidavimui iš preparato.

3.2.1.3 Tirpumo ir tirpimo testų rezultatų palyginimas

18 pav. Tirpumo ir tirpimo testų metu nustatytų fenolinių junginių kiekio palyginimas preparate „Livosil“

19 pav. Tirpumo ir tirpimo testų metu nustatytų fenolinių junginių kiekio palyginimas preparate „HighWay Liver- San“

Remiantis 18 pav. ir 19 pav. duomenimis, galime matyti, kad preparatuose „Livosil“ ir „HighWay Liver- San“ tirpumo testo metu išsiskyrė mažiau fenolinių junginių, lyginant su tirpimo testu. Tokiems rezultatams įtakos galėjo turėti skirtinga tirpinimui naudoto išgrynintojo vandens temperatūra. Silimarinas sunkiai tirpsta vandenyje, todėl aukštesnė vandens temperatūra (37 °C) galimai pagreitino jo tirpimą [30, 33]. Taip pat įtakos galėjo turėti skirtingi tirpinimo metodai. Tirpumo testo metu preparatų kapsulių turinys tirpintas tol, kol medžiagos vizualiai atrodė ištirpusios, neatsižvelgiant į tirpinimo laiką, nenaudojant papildomų prietaisų. Maisto papildo „HighWay Liver- San“ kapsulės turinys tirpo sunkiau, lyginant su nereceptiniu vaistiniu preparatu „Livosil“. Skirtingam šių preparatų kapsulių turinio tirpimui įtakos galėjo turėti maisto papildo „HighWay Liver- San“ esančios sudėtinės medžiagos. Jo sudėtyje yra vitaminas E, kuris priskiriamas riebaluose tirpiems vitaminams.

20 pav. Tirpumo ir tirpimo testų metu nustatytų fenolinių junginių kiekio palyginimas preparate „Heparsin Fytolab“

Panaši situacija stebima ir maisto papildui „Heparsin Fytolab“ 20 pav. Tirpimo testo metu nustatytų fenolinių junginių kiekis 15,67 proc. didesnis nei tirpumo testo metu. Nors skirtumas tarp rezultatų nėra toks didelis, kaip preparatuose „Livosil“ ir „HighWay Liver- San“, tam įtakos galėjo turėti tie patys veiksniai: aukštesė išgrynintojo vandens temperatūra (37 °C), ilgesnis tabletės tirpinimo laikas, krepšelinio prietaiso naudojimas tirpimo testo metu.

21 pav. Tirpumo ir tirpimo testų metu nustatytų fenolinių junginių kiekio palyginimas preparate „Silimarina“

Maisto papildo „Silimarina“ tabletėje nustatytas fenolinių junginių kiekis abiejų testų metu buvo labai panašus, skirtumas tarp rezultatų 0,43 mg/tab. 21 pav. Remiantis šiais rezultatais galima teigti, kad išsiskyrusių fenolinių junginių kiekio nustaytymui skirtingos testų sąlygos įtakos neturėjo.

Nereceptiniame vaistiniame preparate „Carsil“ tirpimo testo metu nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis nei tirpumo testo metu 22 pav. Tokiems rezultatams įtakos galėjo turėti preparato tabletės išankstinis susmulkinimas prieš tirpumo testą. Galima daryti prielaidą, kad tirpimo testo laiko (60min.) neužteko visam fenolinių junginių kiekiui išsiskirti iš tabletės, nors tabletė testo pabaigoje buvo visiškai suirusi. Preparatas neatitinka vaistiniams preparatams keliamo reikalvimo, kad 75 proc. vaistinės medžiagos turi atsipalaiduoti per pirmąias 45 tirpimo testo minutes [23]. Šiuo atveju per pirmąsias 45 tirpimo testo minutes išsiskiria tik 66,56 proc, fenolinių junginių.

3.2.2 Preparatų antioksidacinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio sąryšis

Siekiant įvertinti skirtingų preparatų antioksidacines savybes, tirtas DPPH radikalų sujungimo aktyvumas. Literatūros šaltiniuose teigiama, jog egzistuoja stiprus koreliacinis ryšys tarp augalinės žaliavos radikalų sujungimo aktyvumo ir randamo fenolinių junginių kiekio [6]. Gauti rezultatai šį teiginį patvirtina.

23 pav. Antioksidacinio preparatų aktyvumo priklausomybė nuo nustatytų fenolinių junginių kiekio atliekant tirpumo testą

Atlikus sprektrofotometrinę analizę antioksidacinis aktyvumas kito nuo 15,33 proc. iki 60,3 proc. 23 pav., priklausomai nuo skirtingos nagrinėjamo maisto papildo sudėties. Akivaizdu, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis (11,33 ± 0,34 mg) nustatytas maisto papilde „Silimarina“ , šio preparato radikalų sujungimo aktyvumas taip pat nustatytas didžiausias – 60,3 ± 0,97 proc. Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas maisto papilde „HighWay Liver- San“, šiame preparate mažiausias ir antioksidacinis aktyvumas - 15,33 ± 0,75, nors jo sudėtį papildo vitaminas E, kuris taip pat pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksiacinio aktyvumo, tiriamuosiuose preparatuose, tirpumo testo metu, nustatyta stipri koreliacija r = 0,84.

24 pav. Nustatytas antioksidacinis aktyvumas tiriamuosiuose preparatuose su tikrųjų margainių vaistine augaline žaliava atliekant tirpimo testą

Tiriamųjų preparatų antioksidacinis aktyvumas kito nuo 20,06 proc. iki 68,56 proc. 25 pav. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, kaip ir tirpumo testo metu, pasižymėjo maisto papildas „Silimarina“ (68,56 ± 0,15) . Koreliacija tarp šio preparato nustatyto antioksidacinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio yra stipri, r = 0,99.

Antras preparatas, pagal nustatytą antioksidacinį aktyvumą yra „Heparsin Fytolab“, nors šio preparato fenolinių junginių kiekis nustatytas kaip vienas iš mažiausių (4,43mg ± 0,17) (17 pav.). Koreliacija tarp kintamųjų yra vidutinė, r = 0,63.

Nereceptiniame vaistiniame preparate „Carsil“ nustatytas vidutinis (31,78 ± 0,23 proc.) antioksidacinis aktyvumas 25 pav., nors nustatytas fenolinių junginių kiekis pats mažiausias (3,37 ± 0,2 mg) iš visų penkių tirtųjų preparatų 17 pav. Koreliacija tarp kintamųjų yra stipri, r = 0,87.

Maisto papilde „HighWay Liver- San“ nustaytas vienas iš mažiausių antioksidacinių aktyvumų (20,69 ± 0,32 proc.) ir vidutinis (7,36 ± 0,16 mg) fenolinių junginių kiekis 17 pav. Koreliacija tarp dydžių yra stipri, r = 0,99.

Pats mažiausias antioksidacinis aktyvumas (20,06 ± 0,36 proc.) nustatytas nereceptiniame vaistiniame preparate „Livosil“, tačiau jame nustatytas vienas iš didžiausių fenolinių junginių kiekių (7,9 mg ± 0,43) (17 pav.). Koreliacija išlieka stipri, r = 0,94.

Galima teigti, kad beveik visuose tiriamuosiuose preparatuose yra stiprus koreliacinis ryšys tarp augalinės žaliavos radikalų sujungimo aktyvumo ir randamo fenolinių junginių kiekio.

Tyrimai parodė, kad vartotojui pakuotės ženklinime nurodoma sudėties kiekių informacija nevisada atitinka tikrovę. Jo teorinės kiekybinės sudėties ir veikimo santykis priklauso nuo augalinės žaliavos kokybės, surinkimo laiko, paruošimo technologijos. Dėl šių ir daugelio kitų faktorių kartais teorinio augalinės žaliavos kiekio ir veikliųjų junginių santykis jame, būna labai didelis, o tuo pačiu tai keičia galimą maksimaliai stiprų maisto papildų ir nereceptinių vaistinių preparatų poveikį žmogaus organizmui.