FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
INDRĖ ČIŢAITĖ
PUSIAU KIETŲ VAISTO FORMŲ SU SKYSTUOJU VAISTINIŲ
MELISŲ (Melissa officinalis L.) EKSTRAKTU MODELIAVIMAS IR
BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof.dr. Kristina Ramanauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
PUSIAU KIETŲ VAISTO FORMŲ SU SKYSTUOJU VAISTINIŲ MELISŲ (Melissa officinalis L.) EKSTRAKTU MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Kristina Ramanauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Data Indrė Čiţaitė
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Vaistinės melisos bendra charakteristika ir cheminė sudėtis ... 11
1.2. Fenolinės rūgštys, jų įvarovė ir biologinis aktyvumas ... 12
1.3. Vaistinės melisos farmakologinis poveikis ir pritaikymo galimybės medicinoje ... 14
1.3.1 Vaistinių melisų vietinio vartojimo preparatų pritaikymas ... 16
1.4. Vaistinių melisų preparatai Lietuvoje ... 17
1.5. Puskietės vaisto formos, jų kategorijos ir apibūdinimas ... 18
1.6. Puskiečių preparatų kokybės vertinimas ir biofarmaciniai tyrimai ... 21
1.7. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ... 21
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 23
2.1. Tyrimo medţiagos ir įranga ... 23
2.1.1. Naudotos medţiagos ir reagentai ... 23
2.1.2. Naudota įranga ... 23
2. 2. Vaistinių melisų preparatų gamybos technologijos ... 24
2.2.1. Melisos ţolės ekstrakto technologija ... 24
2.2.2. Dermatologinių preparatų su skystaisiais vaistinių melisų ekstraktais technologija ... 24
2.2.2.1. Gelių su karbomero pagrindu gamyba ... 24
2.2.2.2. Gelių su metilceliuliozės pagrindu gamyba ... 25
2.2.2.3. Gelių su metilceliuliozės ir karbomero mišinio pagrindu gamyba ... 26
2.3.1. Skystųjų melisų ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu ... 28
2.3.2. Skystųjų melisų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu . 28 2.3.3. Vaistinių melisų antimikrobinio aktyvumo nustatymas ... 29
2.3.4. Pusiau kietų vaisto formų dinaminės klampos nustatymas ... 29
2.3.5. Pusiau kietų vaisto formų pH reikšmės nustatymas ... 29
2.3.6. Veikliųjų junginių atpalaidavimo iš puskiečių vaisto formų tyrimas in vitro ... 30
2.4. Statistinė analizė ... 31
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
3.1. Vaistinių melisų ekstraktų gamyba ir kokybės vertinimas ... 32
3.2. Vaistinių melisų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymas ... 33
3.3. Vaistinių melisų ekstrakto antimikrobinio aktyvumo nustatymas ... 33
3.4. Puskiečių preparatų su vaistinių melisų ekstraktais dinaminės klampos nustatymas ... 35
3.5. Puskiečių preparatų su vaistinių melisų ekstraktais pH nustatymas ... 36
3.6. Biofarmacinis pusiau kietų vaisto formų su skystaisiais vaistinių melisų ekstraktais tyrimas in vitro ... 37
3.7. Atpalaiduoto rozmarino rūgšties kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu ... 41
4. IŠVADOS ... 44
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 46
7. MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO REZULTATŲ SKLAIDA ... 52
SANTRAUKA
I. Čiţaitės magistro baigiamasis darbas „Pusiau kietų vaisto formų su skystuoju vaistinių melisų (Melissa officinalis L.) ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“/ mokslinė vadovė prof. K. Ramanauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas: sumodeliuoti pusiau kietas vaisto formas su skystuoju vaistinių melisų ekstraktu
ir nustatyti jų kokybę, pagrindţiant biofarmaciniais tyrimais.
Tyrimo uţdaviniai: 1. Apţvelgti mokslinėje literatūroje Melissa officinalis L. biologinį
aktyvumą ir pritaikymo galimybes vietinio poveikio vaistų formų modeliavime. 2. Pagaminti skystuosius vaistinių melisų ekstraktus ir ištirti jų kokybę. 3. Sumodeliuoti puskietes vaisto formas su vaistinių melisų ekstraktu, įvertinti ir palyginti jų kokybę. 4. Įvertinus biofarmacinių tyrimų rezultatus, atrinkti tinkamiausią pagrindą.
Metodai: Vaistinių melisų ekstraktų kokybė įvertinta nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį
spektrofotometriniu metodu, nustatant antiradikalinį aktyvumą taikant DPPH radikalų surišimo tyrimą ir įvertinant antimikrobinį aktyvumą - pagal Ph Eur. 07/2010, 2.6.12. Tyrimo metu įvertinta pagamintų puskiečių preparatų dinaminė klampa, pH reikšmės, atliktas biofarmacinis veikliųjų junginių atpalaidavimo iš hidrogelių tyrimas in vitro.
Tyrimo objektas: pusiau kietos vaisto formos su skystuoju vaistinių melisų ekstraktu.
Tyrimo rezultatai: Pagaminti skystieji vaistinių melisų ekstraktai yra gelsvai rudos spalvos,
pasiţymi antioksidaciniu ir antimikrobiniu aktyvumu. Sumodeliuoti stabilūs vaistinių melisų hidrogeliai, kurių pH reikšmės 5,96 - 7,75, dinaminė klampa 0,01 - 3,49 Pa·s. Po 6 val. biofarmacinio tyrimo in vitro iš gelių atpalaiduojama ne maţiau kaip 4,56 proc. rozmarino rūgšties.
Išvados: Tyrimų rezultatai parodė, jog pasirinktas gelifikantas ir jo kiekis daro įtaką vaistinių
melisų gelių kokybei. Biofarmaciniu atpalaidavimo tyrimu in vitro nustatyta, kad didėjant gelifikuojančių medţiagų koncentracijai rozmarino rūgšties atpalaidavimas lėtėja.
Rekomendacijos: Remiantis atliktų tyrimų rezultatais, rekomenduojama pagrindinė gelifikuojanti medţiaga gelių gamyboje - sintetinės kilmės karbomeras (ne daugiau kaip 1,0 proc.), o metilceliuliozę tikslinga naudoti kaip preparato terapinį poveikį prailginančią medţiagą.
SUMMARY
I. Čiţaitė„s final thesis for master„s degree „Modeling and quality evaluation of topical semisolid dosage forms with Melissa officinalis L. extract“/ scientific supervisor Prof. K. Ramanauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
Objective: to model semisolid dosage forms with lemon balm extract and evaluate their quality
by carrying out the biopharmaceutical research.
Aims: 1. To make an overview of Melissa officinalis L.: it„s biological activity and application
opportunities in the production of semisolid dosage forms. 2. To evaluate the quality of the prepared extracts of lemon balm. 3. To evaluate the quality of modeled hydrogels containing lemon balm extract. 4. Based on the results of biopharmaceutical study, select the most appropriate gel„s matrix for lemon balm extract.
Methods: The quality of lemon balm extracts was evaluated spectrophotometrically by
determining the total polyphenols content and determining DPPH· free radical scavenging activity. Antimicrobial activity was determined by Ph Eur. 07/2010, 2.6.12. method. For evaluation of the quality of modeled gels containing lemon balm extract, pH value, dinamic viscosity measurements and the active compounds release in vitro studies were carried out.
The object of the study: semisolid dosage forms with lemon balm„s liquid extract.
Results: Atioxidant and antimicrobial activities of lemon balm„s extracts were determined during
the experiment. In the course of studies, the hydrogels with lemon balm‟s liquid extract were produced. They are stable with a pH value of 5,96-7,75, a viscosity of 0,01-3,49 Pa·s. In vitro release studies showed that after 6 hours of this test no less than 4,56 percent of rosmarinic acid was released from hydrogels containing lemon balm‟s liquid extracts.
Conclusions: In vitro release studies showed that the quality of hydrogels containing lemon
balm‟s extract depends on the selected viscosity-inducing agent and it‟s concentration: the increased viscosity of hydrogels causes the slower release of rosmarinic acid from them.
Practical recommendations: In vitro release studies revealed that the more appropriate
semisolid dosage form for Melissa Officinalis (L.) extract is hydrogels containing carbopol as a gel‟s matrix. Methylcellulose is usefull when prolonged action of the active substance is needed.
PADĖKA
Uţ suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, teorinę pagalbą ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Pusiau kietų vaisto formų su skystuoju vaistinių melisų (Melissa officinalis L.) ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedros prof. dr. Kristinai Ramanauskienei ir kolektyvui.
Uţ antimikrobinio aktyvumo tyrimų įgyvendinimą dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos, Dr. Leono Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikos gydytojui dr. A. Grigoniui.
SANTRUMPOS
DDD/1000 gyventojų/per dieną - vaisto vidutinė terapinė paros dozė skaičiumi, tenkančiu 1000 gyventojų per vieną dieną
proc. – procentai
COX-1 – ciklooksigenazė 1 COX-2 – ciklooksigenazė 2
GABA – gama-amino sviesto rūgštis ALT – alaninaminotransferazė AST – aspartataminotransferazė ALP – šarminė fosfatazė
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija HSV – Herpes simplex virusas
IgE – imunoglobulinas E IFN-γ – interferonas gama IL-4 – interleukinas 4 °C – laipsniai Celcijaus
MSK – maţiausia slopinančioji koncentracija DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
EC50 – efektyvi preparato koncentracija, reikalinga 50 proc. pradinės DPPH koncentracijos surišti
ĮVADAS
Didėjant ţmonių sergamumui, senstant visuomenei, didėja ir vaistinių preparatų suvartojimo skaičius. Lietuvos Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis, 2012 m. vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje siekė 989 DDD/1000 gyventojų/per dieną, 2013 m. - 1031 DDD/1000 gyventojų/per dieną, o 2014 m. – 1065 DDD/1000 gyventojų/per dieną [1]. Tendencingas cheminių preparatų vartojimas lemia padidėjusį pranešimų apie vaistų sukeliamas šalutines reakcijas skaičių. Dėl šios prieţasties vis daugiau ţmonių, ypač sergantys lėtinėmis ligomis, renkasi seniausiai pasaulyje ţinomą gydymo būdą – fitoterapiją.
Vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.) - jau nuo senų laikų išlikusi viena populiariausių bei daţniausiai vartojamų vaistinių augalų fitoterapijos praktikoje. Dėl savo antivirusinių, priešuţdegiminių, antioksidacinių, antimikrobinių savybių vaistinių melisų preparatai skiriami daugelio ligų gydymui ir profilaktikai [2,3]. Šiuo metu skiriamas didelis dėmesys šio tradicinio vaistinio augalo vietinio vartojimo galimybėms. Atliekami tyrimai nustatant vaistinių melisų preparatų poveikį gydant Herpes simplex virusą ar atopinį dermatitą [3,4,5,6,7]. Todėl aktualu sumodeliuoti vaistinių melisų puskiečius preparatus ir įvertinti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais. Tikslinga nustatyti veikliosios medţiagos išsiskyrimą iš sumodeliuotų pusiau kietų vaisto formų, nes nuo atpalaiduoto veikliosios medţiagos kiekio priklauso preparato kokybė ir veiksmingumas [8,9].
Optimalaus terapinio poveikio, dermatologinių preparatų stabilumo ir pacientui priimtinų juslinių savybių uţtikrinimui didelę įtaką daro vaistinės medţiagos nešiklio parinkimas [9], todėl, dėl savo pranašumo prieš kitas pusiau kietas vaisto formas, tyrimams pasirinktas pagrindas – gelis [10,11,12]. Tyrimų metu planuojama įvertinti pagamintų vaistinių melisų preparatų antioksidacines, antimikrobines savybes, nustatyti puskiečių preparatų pH ir dinaminės klampos reikšmes bei biofarmaciniais tyrimais in
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Tyrimo problema: mokslinių duomenų trūkumas apie pusiau kietų vaisto formų su natūralia
veikliąja medţiaga - vaistine melisa, kokybinius ir kiekybinius tyrimus.
Tyrimo objektas: pusiau kietos vaisto formos su skystuoju vaistinių melisų ekstraktu.
Darbo tikslas - sumodeliuoti pusiau kietas vaisto formas su skystuoju vaistinių melisų ekstraktu
ir nustatyti jų kokybę, pagrindţiant biofarmaciniais tyrimais.
Uţdaviniai:
1. Apţvelgti mokslinėje literatūroje vaistinio augalo Melissa officinalis L. biologinį aktyvumą ir pritaikymo galimybes vietinio poveikio vaistų formų modeliavime. Teoriškai parinkti puskiečių preparatų sudėtį, pagalbines medţiagas, technologiją.
2. Pagaminti skystuosius vaistinių melisų ekstraktus ir, nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacines, antimikrobines savybes, ištirti jų kokybę.
3. Sumodeliuoti puskietes vaisto formas su skystuoju vaistinių melisų ekstraktu. Nustatyti ir palyginti jų kokybę pagal šiuos kriterijus: homogeniškumą, dinaminės klampos ir pH reikšmes.
4. Nustatyti pasirinkto pagrindo daromą įtaką bendro fenolinių junginių bei rozmarino rūgšties kiekio atpalaidavimui iš pusiau kietų preparatų su vaistinių melisų ekstraktu ir atrinkti tinkamiausią pagrindą.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Vaistinės melisos bendra charakteristika ir cheminė sudėtis
Vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.) priklauso notrelinių (lot. Lamiaciae), dar kitaip
ţinomai kaip lūpaţiedţių (lot. Labiatae), šeimai [2,13,14]. Tai yra daugiametis ţolinis augalas, uţaugantis iki 1 m aukščio ir turintis statų, šakotą, plaukeliais apaugusį stiebą. Augalo lapai ryškiai ţalios spalvos, šviesesne apatine puse, 2 - 8 cm ilgio, priešiniai, plačiai ovalūs ar širdiški, karbuoti, turi ilgus lapkočius. Jų paviršius negausiai plaukuotas, su ryškiai matomomis įspaustomis gyslomis. Ţiedai baltos arba šviesiai roţinės spalvos, viršūninių lapų paţastyse susitelkę po 4 - 12 vienašoniuose netikruose menturiuose [2,13,14,15].
Daţniausiai naudojama melisos vaistinė augalinė žaliava – dar nepraţydus augalui surinktos ir išdţiovintos stiebų viršūnės, turinčios lapus ir ţiedus. [2,15]. Europos Farmakopėjoje aprašoma vaistinė augalinė ţaliava – vaistinių melisų lapai [16,17]. Ţaliava yra citrinų kvapo, kurį suteikia vaistinės melisos kaupiamas eterinis aliejus [2,16]. Jo augalas gali kaupti nuo 0,1 iki 0,4 proc. [16]. Daugiausiai šio komponento susikaupia vyraujant Vidurţemio jūros klimato sąlygoms. Pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai: monoterpenai geranialis (citralis A, trans izomeras) ir neralis (citralis B, cis izomeras), kurie sudaro 45 – 90 proc. eterinio aliejaus komponentų, bei citronelalis, kurio aptinkama nuo 1 iki 40 proc. [2,13,16]. Ţaliavoje nustatytos hidroksicinamono rūgštys (6 - 11 proc.), tarp kurių rozmarino rūgštis (2 – 5 proc.) ir kavos rūgštis (2 proc.) bei jos junginiai. Taip pat yra aptinkami nedideli p-kumaro (0,09 proc.) ir ferulo (0,01 proc.) rūgščių kiekiai. Kiti cheminės sudėties komponentai: flavanoidai, pagrinde luteolino 3‟ – gliukoronidas (0,3 proc.), triterpenai, pagrinde ursolo rūgštis (0,6 proc.) ir oleonolo rūgštis (0,2 proc.), bei benzoinės rūgšties dariniai [16]. Pagrindinių junginių struktūros pavyzdţiai pateikiami 1 paveiksle.
1.2. Fenolinės rūgštys, jų įvarovė ir biologinis aktyvumas
Fenolinės rūgštys yra antriniai aromatiniai augalų metabolitai [18,19,20]. Tai grupė junginių, kurių struktūros pagrindą sudaro karboksilo grupė bei aromatinis ţiedas, prie kurio prisijungusi viena (fenolis) arba daugiau (polifenolis) hidroksi- grupių ir nulemia fenolinių rūgščių įvairovę [18]. Remiantis karboksilo grupės struktūra, gali būti išskiramos dvi fenolinių rūgščių grupės: benzoinės rūgšties dariniai, kuriems priklauso galo rūgštis, bei cinamono rūgšties dariniai, kurių pagrindiniai atstovai yra kumaro, kavos bei ferulo rūgštys [18,21]. Fenolinių rūgščių įvairovė pateikiama 1 lentelėje.
1 lentelė. Fenolinių rūgščių molekulinės struktūros (Stalikas, 2007)
R1 R2 R3 R4 Pavadinimas H H H H Benzo rūgštis H H OH H p-hidroksibenzoinė rūgštis H OH OH OH Galo rūgštis H OH OH H Protokatechino rūgštis OH H H H Salicilo rūgštis
H H H H Cinamono rūgštis OH H H H o-kumaro rūgštis
H OH H H m-kumaro rūgštis
H H OH H p-kumaro rūgštis
H OCH3 OH H Ferulo rūgštis H OH OH H Kavos rūgštis
Mokslinėje literatūroje pateikiami duomenys, jog fenolinės rūgštys pasiţymi antioksidacinėmis, priešvirusinėmis, priešuţdegiminėmis, antibakterinėmis ir priešvėţinėmis savybėmis [22,23,24,25]. Cueva
et al. (2010) atlikto tyrimo metu nustatytas fenolinių rūgščių priešmikrobinis aktyvumas prieš Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa bakterijas. Autorių teigimu, šio poveikio
aktyvumui įtakos turi benzeno ţiede esančių pakaitų skaičius ir pozicija bei sočiosios šoninės grandinės ilgis [19]. Priešuţdegimines savybes fenolinės rūgštys išreiškia inhibuodamos COX-1 ir COX-2 izofermentus ir taip slopindamos prostaglandinų ir leukotrienų, kurie dalyvauja uţdegiminėse reakcijose, sintezę [23]. Antioksidacinis fenolinių rūgščių poveikis pasireiškia dėl jų cheminės struktūros – elektronų delokalizacijos aromatiniame ţiede [24]. Išskiriamos dvi antioksidacinio mechanizmo stadijos: grįţtama laisvųjų radikalų sulaikymo ir negrįţtama neutralių medţiagų susidarymo stadijos [25]. Nustatyta, jog polifenolinės rūgštys pasiţymi stipresnėmis antioksidacinėmis savybėmis nei monofenolinės rūgštys [22]. Kadangi rozmarino rūgštis savo molekulinėje struktūroje turi keturias hidroksigrupes, galima teigti, jog ji pasiţymi didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu (ţr. 1 pav.).
Rozmarino rūgštis yra kavos rūgšties ir 3,4 – dihidroksifenipieno rūgšties esteris [26]. Tai viena pagrindinių fenolinių rūgščių, esančių Melissa officinalis L. cheminėje sudėtyje ir nulemianti augalo farmakologinį poveikį bei pritaikymą medicinoje [2,3,16,26]. Remiantis Europos Farmakopėja, rozmarino rūgšties vaistinės melisos ţaliavoje negali būti maţiau nei 4 proc. [17]. Atlikta daugybė tyrimų, nustatant šios fenolinės rūgšties antioksidacinį, priešvirusinį, imunomoduliacinį, priešuţdegiminį, priešvėţinį poveikius [20,26]. Mokslinių tyrimų metu rozmarino rūgšties nustatymui vaistinės melisos ţaliavoje daţniausiai yra naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodika [27,28], o bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui pasitelkiamas spektrofotometrinis metodas [9,29].
1.3. Vaistinės melisos farmakologinis poveikis ir pritaikymo galimybės medicinoje
Vaistinė melisa ir jos preparatai pasiţymi lengvai raminančiu, miego kokybę gerinančiu poveikiu [2,3,13,30,31,32]. Vaistinės melisos preparatų gebėjimą sumaţinti patiriamą stresą, miego sutrikimus bei pagerinti nuotaiką įrodė Cases J. et al. (2011) atliktas tyrimas, kurio metu per 15 dienų pacientams, vartojantiems vaistinės melisos lapų ekstraktą, turintį daugiau nei 15 proc. hidroksicinaminės rūgšties junginių, su nerimu susiję simptomai (emocinis nestabilumas, nuovargis, įtampa ir kt.) palengvėjo 15 proc. , o miego sutrikimai – 42 proc. [30]. Nerimo, jam būdingų simptomų sumaţėjimas gali būti grindţiamas rozmarino bei triterpeninių (ursolo, oleonolo) rūgščių gebėjimu inhibuoti fermentą GABA – transaminazę, skaidantį GABA neurotransmiterį ir taip sukeliantį įvairius nervų sistemos sutrikimus [31]. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog vaistinė melisa kombinuojama kartu su vaistiniu valerijonu taip pat gali pagerinti miego kokybę ir moterims, kenčiančiomis nuo menopauzės metu atsiradusių miego sutrikimų [32]. Nustatyta, jog šis vaistinių augalų derinys yra gerai toleruojamas ir gali būti vartojamas kaip alternatyva raminamiesiems vaistams [33].
Remiantis moksline literatūra, vaistinė melisa gali būti vartojama siekiant pagerinti paţintinę funkciją ţmonėms, sergantiems Alzheimerio liga [2,3,16,34]. Toks augalo poveikis pasireiškia dėl vaistinės melisos gebėjimo inhibuoti fermentą acetilcholinesterazę, kuris, skaidydamas nervų impulsus perduodančią medţiagą acetilcholiną, sukelia Alzheimerio ligai būdingus simptomus [3,35]. Taip pat nustatytas vaistinės melisos gebėjimas aktyvuoti acetilcholino receptorius centrinėje nervų sistemoje [36].
Melissa officinalis L. pritaikymas neurologinių sutrikimų gydymui gali būti grindţiamas ir išreikštomis
augalo antioksidacinėmis savybėmis [3,35]. Mokslinės literatūros duomenimis, šias savybes labiausiai lemia fenolinės rūgštys (rozmarino, kavos, galo rūgštys), flavanoidai (kvercetinas, kvercitrinas) ir triterpenai (ursolo rūgštis), nustatyti vaistinės melisos ţaliavoje [29,37]. Neutralizuodami organizme susidariusį per didelį aktyviųjų deguonies formų ir laisvųjų radikalų kiekį, vaistinės melisos preparatai, kaip ir kiti antioksidantai, sumaţina jų sukeliamą ţalą nervų sistemos bei kitoms organizmo ląstelėms ir sulėtina neurodegeneracinių ligų progresavimą [29,38].
Taip pat įrodytas vaistinės melisos teigiamas poveikis medţiagų apykaitai [3,39,40,41]. 2005 metais atliktas tyrimas [39] su hiperlipideminės būklės ţiurkėmis, siekiant nustatyti Melissa officinalis L. poveikį lipidų koncentracijai kraujyje. 28 dienas ţiurkėms buvo skiriama po 2 g/kg vandeninio augalo ekstrakto. Pastarojo vartojimas ne tik sumaţino serumo bendrąjį cholesterolio ir lipidų kiekį, bet ir sumaţino fermentų ALT, AST, ALP, kurie yra pagrindiniai kepenų paţeidimo rodikliai ir daţniausiai
būna padidėję esant hiperlipidemijai, kiekius. Bolkent et al. tyrimo metu taip pat nustatė, jog vaistinės melisos ekstrakto vartojimas padidina natūralaus antioksidanto glutationo kiekį kepenų audinyje ir kraujyje. Tad nustatyta, jog vaistinė melisa pasiţymi hipolipideminėmis ir hepatoprotekcinėmis savybėmis [39]. Remiantis moksline literatūra, vaistinių melisų eterinis aliejus, dėl jo sudėtyje esančių komponentų geranialio, neralio, linalolio, taip pat yra efektyvus sumaţinant lipidų kiekį kraujyje [3,40] bei pasiţymi hipoglikeminiu poveikiu [41]. Chung et al. (2010) atlikus tyrimus su 2 tipo cukriniu diabetu uţkrėstomis pelėmis, nustatyta, jog vaistinės melisos eterinio aliejaus vartojimas ne tik sumaţina gliukozės kiekį kraujyje, padidindamas gliukozės įsisavinimą ir metabolizmą kepenyse, bet ir padidina serumo insulino kiekį [3,41].
Vaistinė melisa bei jos preparatai gali būti skiriami norint pagerinti virškinamojo trakto veiklą, suţadinti apetitą bei atpalaiduoti ţarnyno spazmus [2,13,16,42]. Reyhaneh Vejdani et al. (2006) atliktas tyrimas su preparatu Carmint®, kurio sudėtyje yra vaistinių melisų, šaltmečių ir blakinių kalendrų ekstraktai, siekiant nustatyti šių vaistinių augalų poveikį gydant dirgliosios ţarnos sindromą. Rezultatai parodė, jog natūralaus augalinio vaistinio preparato vartojimas kartu su kitais preparatais (loperamidu, balkšvojo gysločio sėklų luobelėmis) padeda sumaţinti pilvo skausmo, diskomforto bei pūtimo pojūčius, susijusius su šia liga [42]. Tačiau tyrimo metu nenustatyta, jog būtent vaistinė melisa turi didţiausią įtaką
Carmint® veiksmingumui, tad galima teigti, jog preparato sudėtyje esančios augalinės veikliosios
medţiagos veikia sinergistiškai palengvindamos dirgliosios ţarnos sindromo sukeltus simptomus.
Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog vaistinės melisos preparatai pasiţymi antihipertenziniu poveikiu bei gali padėti esant sustiprėjusiam širdies plakimui [29,43]. 2015 metais atlikto dvigubai aklo, atsitiktinių imčių, placebu kontroliuojamo tyrimo [43] duomenimis, kasdienis 500 mg sausojo vaistinių melisų ekstrakto vartojimas kapsulių forma reikšmingai sumaţino tiriamųjų pacientų sustiprėjusio širdies plakimo epizodus lyginant su kontroline grupe. Taip pat nustatyta, jog vaistinės melisos turi teigiamą retinantį poveikį širdies daţniui ir nedaro įtakos širdies susitraukimo jėgai [44].
Daugelio autorių teigimu, vaistinė melisa gali būti vartojama kaip prakaitavimą skatinanti [45], nuskausminanti [45,46,47] ar priešuţdegiminė priemonė [47,48]. Pateikiami duomenys, jog vaistinis augalas taip pat pasiţymi priešvėţiniu aktyvumu in vitro ir in vivo [49].
1.3.1 Vaistinių melisų vietinio vartojimo preparatų pritaikymas
Daugelio tyrimų duomenimis vaistinė melisa pasiţymi antivirusiniu poveikiu, todėl augalo ekstraktas gali būti vartojamas vietiškai kovojant su Herpes simplex (HSV) virusu [2,3,4,5]. Nustatyta, jog pagrindiniai komponentai, apsprendţiantys vaistinės melisos antivirusinį poveikį, yra polifenoliniai junginiai, ypač rozmarino rūgštis [4,5]. G. Mazzanti et al. (2008) atliktas tyrimas parodė, jog vaistinės melisos hidroalkoholinis ektraktas, kuriame buvo 4,1 proc. rozmarino rūgšties, efektyviai sumaţino HSV – 2 viruso replikaciją šiuo virusu uţkrėstose Vero ląstelėse [4]. Remiantis moksline literatūra, vaistinių melisų eterinis aliejus taip pat yra efektyvus kovojant su Herpes simplex virusu [50].
Vietinis augalinio ekstrakto vartojimas gali būti pritaikomas gydant ir atopinį dermatitą [6,7]. Tai – lėtinė liga, kurios atsiradimui įtakos gali turėti genetinis polinkis, imuninės sistemos sutrikimas ar odos barjero funkcijos paţeidimas, dėl ko susilpnėja odos atsparumas aplinkos dirgikliams, alergenams. Pagrindiniai poţymiai - odos uţdegimas, jos sausumas bei stiprus nieţėjimas [51]. Dėl savo antioksidacinio, priešuţdegiminio, imunomoduliacinio poveikio [26] rozmarino rūgštis, įeinanti į vaistinės melisos cheminę sudėtį, yra efektyvi norint sumaţinti šiuos bendruosius atopinio dermatito simptomus.
Jongsung Lee et al. (2008) atliktas in vivo tyrimas parodė, kad ţmonėms, sergantiems atopiniu dermatitu,
kasdien tepant rozmarino rūgšties emulsiją, eritema sumaţėjo po 4 – 8 savaičių, o odos vandens praradimas - po 8 savaičių [6]. Išsamesnis rozmarino rūgšties veikimo mechanizmas sergant atopiniu dermatitu yra aprašomas An - Hee Jang et al. (2011) atliktame tyrime su Nc/nga pelėmis. Tyrimas parodė, jog kasdienės rozmarino rūgšties 10 arba 50 mg/kg injekcijos efektyviai sumaţino bendrąjį IgE lygį serume ir CD4+ T ląstelių išskiriamų INF-γ bei IL-4 kiekį. Taip pat, rozmarino rūgštis sumaţino CD4+ T, CD8+ T ir putliųjų ląstelių kaupimąsi paţeistose odos vietose, kas yra būdinga sergant atopiniu dermatitu [7].
Atopinio dermatito gydymui įprastai yra skiriami steroidiniai preparatai, tačiau šie gali sukelti daugybę pašalinių efektų: kraujagyslių išsiplėtimą, depigmentaciją ir kt. [51]. Vietinis
Melissa officinalis L. vartojimas – alternatyva steroidiniams vaistams norint išvengti nepageidaujamų jų
1.4. Vaistinių melisų preparatai Lietuvoje
Lietuvoje vaistinė melisa yra vienas populiariausių tradicinių augalų, nuo seno vartojama nerimo, įtampos simptomų malšinimui, širdies darbo stiprinimui bei virškinimo ir miego kokybės gerinimui. Lietuvos vaistinėse randamas platus asortimentas augalinės kilmės produktų su vaistinėmis melisomis [1]:
Arbatos:o
UAB „Acorus Calamus“ gamintojo arbatos Neuro – 1, Neuro – 3, vartojamos esant dirglumui, įtampai ar nemigai;o
To paties gamintojo arbata Mano dienos, vartojama esant skausmingoms menstruacijoms ir jų metu atsiradusiems miegos sutrikimams;
Maisto papildai:o
Švedijos gamintojo UAB „New Nordic“ tabletės Melissa Dream, vartojamas norint pagerinti miego kokybę;
Tradiciniai augaliniai vaistiniai preparatai:o
UAB „Walmark“ preparatas Benosen trio, kurio sudėtyje be vaistinių melisų lapų sausojo ekstrakto yra ir vaistinių valerijonų bei pasiflorų ţaliavų sausieji ekstraktai. Vaistinis preparatas skirtas sumaţinti patiriamą stresą bei miego kokybei pagerinti;o
Slovėnijos gamintojo „Lek Pharmaceuticals d.d” dengtos tabletės Persen ir kietos kapsulės Persen Forte, kurių sudėtyje trys veikliosios medţiagos – vaistinių melisų, vaistinių valerijonų ir pipirmečių ţaliavų sausieji ekstraktai – taip pat pasiţymi raminamuoju poveikiu ir yra skiriami nervinei įtampai ar miego sutrikimams malšinti;o
Lietuvos gamintojo UAB „Valentis” geriamieji lašai Neuromed. Preparato sudėtyje – skystieji ekstraktai iš vaistinių valerijonų, vaistinių melisų, vaistinių šventagaršvių, paprastųjų apynių, tikrųjų levandų ţaliavų. Preparatas vartojamas kankinant nerimui ar nemigai;o
Vokietijos gamintojo „Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH“ geriamasis skystisIberogast gali būti skiriamas funkcinės dispepsijos arba dirgliosios ţarnos sindromo
o Taip pat Vokietijos gamintojo „Queisser Pharma GmbH & Co” geriamasis skystis
Doppelherz Cardioherbal, skiriamas palaikyti širdies ir kraujagyslių sistemos
funkcijas ir kamuojant nervinei įtampai.
Apţvelgus vartojamų Melissa officinalis L. produktų asortimentą Lietuvos vaistinėse, galima teigti, jog vaistinė melisa yra populiaresnė kaip raminantis, per os skiriamas preparatas. Vietiškai vartojamo augalinio vaistinio preparato Lietuvos rinkoje nėra, todėl aktualu sumodeliuoti puskietes sistemas su vaistinių melisų ţaliava ir įvertinti jų kokybę ir veiksmingumą gydant odos ligas.
1.5. Puskietės vaisto formos, jų kategorijos ir apibūdinimas
Europos farmakopėjoje nurodoma, jog puskietės vaisto formos yra skirtos gauti veikliųjų medţiagų vietinį poveikį ar poveikį per odą, apsauginį, minkštinantį veikimą [17]. Vietinį poveikį puskietės vaisto formos gali išreikšti veikdamos ant odos paviršiaus, veikdamos raginį sluoksnį arba reguliuodamos epidermio arba dermos funkciją. Vaistiniai preparatai, vartojami ant odos, gali pasiţymėti ir sisteminiu poveikiu, kai vaistinė medţiaga, esanti puskietėje sistemoje, prasiskverbia į kraują ir sukelia tam tikrą biologinį atsaką [52].
Pusiau kieto preparato biofarmacinėms savybėms ir farmakoterapiniam veiksmingumui didelę įtaką turi pagrindo (nešiklio), kuriame ištirpinama viena ar daugiau veikliųjų medţiagų, ir pagalbinių medţiagų parinkimas. Pagrindas gali būti vienfazis arba daugiafazis, savo sudėtyje turėti natūralių arba sintetinių medţiagų bei pasiţymėti hidrofilinėmis arba hidrofobinėmis savybėmis [17]. Dermatologinių preparatų biologinis pasisavinimas priklauso nuo pagrinde ištirpusios ar disperguotos vaistinės medţiagos koncentracijos ir vaistinės medţiagos gebėjimo pereiti iš nešiklio į odos raginį sluoksnį [53]. Tinkamas pagalbinių medţiagų parinkimas taip pat gali garantuoti reikiamą veikliosios medţiagos biologinį pasisavinimą. Modeliuojant puskiečius preparatus daţnai pasitelkiamos prasiskverbimą gerinančios medţiagos [54]. Šios gali veikti dvejopai: pakeisdamos lipidinio sluoksnio struktūrą arba kaip tirpikliai, padidindami vaisto koncentraciją odos membranoje. Tai gali būti sulfoksidai, glikoliai, riebalų rūgštys ir jų esteriai, alkoholiai, pirolidonai. Kitos pagalbinės medţiagos daţnai naudojamos dermatologinių preparatų modeliavime: tirštikliai, emulsikliai, antimikrobinės medţiagos, drėkikliai ar lipnumą reguliuojančios medţiagos [54].
Tepalai. Tai yra pusiau kieta vaisto forma, skirta vartoti išoriškai – tepti ant odos ar gleivinių.
Tepalai yra sudaryti iš vienfazio pagrindo, kuriame veiklioji medţiaga yra disperguota kieta arba skysta forma. Daţniausiai tepaluose yra maţiau nei 20 proc. vandens ar lakių medţiagų bei daugiau nei 50 proc. angliavandenilių, vaškų ar glikolių. Moksline literatūra remiantis išskiriami hidrofobiniai, vandenį emulguojantys ir hidrofiliniai tepalai [10,17,52]. Tipiški pagrindai, naudojami hidrofobinių tepalų gamyboje – kieto ar skysto pavidalo parafinas, sintetinai gliceridai, augaliniai aliejai, riebalai ar vaškai. Hidrofobiniai tepalai gali absorbuoti tik nedidelius vandens kiekius, tuo tarpu, vandenį emulguojantys
tepalai absorbuoja daug didesnį kiekį vandens. Pastarieji taip pat, emulsiklių pagalba, gali sudaryti
vanduo/aliejuje arba aliejus/vandenyje emulsijas. Hidrofilinių tepalų pagrindai daţniausiai yra sudaryti iš kietų ar skystų polietileno glikolių ir gerai maišosi su vandeniu ir vandeniniais tirpikliais [17].
Kremai. Skirtingai nei tepalai, tai yra daugiafaziai preparatai, sudaryti iš lipofilinės ir vandeninės
fazės. Gali būti skiriami lipofiliniai ir hidrofiliniai kremai. Lipofilinių kremų gamyboje naudojamos vandenį aliejuje emulguojančios medţiagos - riebalų alkoholiai, sorbitamo esteriai, monogliceridai. Tuo tarpu, hidrofilinių kremų gamyboje yra naudojamos aliejų vandenyje emulguojančios medţiagos – polisorbatai, trolamino ar sulfatintų riebalų alkoholiai [17].
Pastos. Tai pusiau kieti preparatai, skirti vartoti ant odos ir kuriuose smulkiai disperguotos
vaistinės medţiagos yra daugiau nei 25 proc. [17].
Šutekliai. Šios pusiau kietos formos yra sudarytos iš hidrofilinio pagrindo, kuris sulaiko šilumą ir
kuriame yra disperguotos skystos ar kietos formos veikliosios medţiagos [17].
Medicininiai pleistrai. Tai lankstūs preparatai, kuriuose gali būti įterptos viena ar daugiau
veikliųjų medţiagų. Medicininiai pleistrai, vartojami ant odos, yra skirti palaikyti artimą veikliosios medţiagos sąlytį su oda, jog vaistinė medţiaga lėtai rezorbuotųsi arba veiktų kaip apsauginė ar keratolitinė priemonė [17].
Geliai. Šios pusiau kietos formos preparatai yra sudaryti iš skysčių, gelifikuotų tam tikromis
medţiagomis. Geliai, kaip ir kremai, gali būti lipofiliniai arba hidrofiliniai. Lipofilinių (oleogelių) sudėtyje pagrindas daţniausiai yra skystas parafinas su polietilenu arba riebaliniai aliejai, gelifikuoti koloidiniu silicio dioksidu. Tuo tarpu, hidrofilinių gelių (hidrogelių) pagrindą sudaro propilenglikolis, vanduo arba glicerolis, gelifikuoti celiuliozės dariniais, krakmolu [17]. Be to, geliai gali būti vienfaziai bei dvifaziai. Pastarieji yra sudaryti iš atskirų maţų dalelių tinklo, o vienfaziai geliai – iš organinių makromolekulių, tolygiai pasiskirsčiusių skystyje taip, kad nėra nustatyta aiškių ribų tarp skysčio ir jame disperguotų makromolekulių [10].
Geliai taip pat gali būti apibūdinami kaip pusiau standţios sistemos, kuriose dispersinės terpės judėjimas yra suvarţytas susipynusių dalelių trimačio tinklo arba dispersinėje terpėje išbrinkusių makromolekulių. Dalelių susipynimas bei atsiradusi vidinė trintis ir nulemia geliuose padidėjusią klampą bei jų pusiau kietą formą [10].
Gelių gamyboje yra naudojamos įvairios gelifikuojančios medţiagos: natūralūs polimerai (akacijos guma, tragakantas, natrio alginatas ir kt.), pusiau sintetinės kilmės celiuliozės dariniai (metilceliuliozė, karboksimetilceliuliozė, hipromeliozė ir kt.) bei sintetiniai polimerai (karbomeras, poloksameras, polivinilo alkoholis) [10,12,55]. Daţniausiai šių medţiagų koncentracija geliuose yra maţesnė nei 10 proc. [55]. Išanalizavus mokslinę literatūrą, atsiţvelgta į daţniausiai gelių technologijoje naudojamų gelifikuojančių medţiagų savybes [11,55,56,57].
Karbomeras – didelės molekulinės masės akrilo rūgšties polimeras. Tai balti, purūs, specifinio
kvapo higroskopiniai milteliai, brinkūs vandenyje ir glicerolyje. Vandenyje brinkinamas karbomeras suformuoja rūgštinę koloidinę dispersiją (0,2 proc. vandeninės dispersijos pH svyruoja nuo 2,4 iki 4,0), kurią neutralizavus, susidaro didele dinamine klampa pasiţymintys geliai. Didţiausias gelių klampumas stebimas, esant pH 6 – 11. Kaip gelifikuojanti medţiaga, karbomeras gelių gamyboje yra naudojamas 0,5 - 2,0 proc. koncentracijomis [55,57].
Metilceliuliozė – celiuliozės darinys, kuriame 27 – 32 proc. hidroksilo grupių yra pakeista metilo
eterio grupėmis. Tai balti, pluoštiniai, bekvapiai milteliai, brinkstantys šaltame vandenyje ir sudarydami klampią, koloidinę dispersiją. 1 proc. vandeninės metilceliuliozės suspensijos pH varijuoja nuo 5,0 iki 8,0. Daţniausiai metilceliuliozė sutinkama 15, 25, 100, 400, 1.500 bei 4.000 cP klampumo. Veikiant metilceliuliozės tirpalus didėjančia temperatūra, stebimas dinaminės klampos sumaţėjimas, tačiau prie 50 - 60°C ji vėl padidėja. Šią terminę gelifikaciją sukelia molekulių, turinčių metoksilo grupes, hidrofobinė sąveika. Esant ţemai temperatūrai, celiuliozės molekulės yra hidratuotos ir nesąveikauja tarpusavyje. Kylant temperatūrai, molekulės absorbuoja kintamąją energiją ir galiausiai atpalaiduoja vandenį, kas ir nulemia dinaminės klampos sumaţėjimą. Toliau keliant temperatūrą, polimerai pradeda sąveikauti tarpusavy, sudarydami tinklinę struktūrą ir taip lemdami tirpalo susidrumstimą ir staigų klampos padidėjimą [55,57,58].
Gelių privalumas prieš tepalus ar kremus yra tas, jog, jie yra stabilesnė, ne gliti pusiau kieta vaisto forma [11]. Stebimas greitesnis veikliųjų junginių išsiskyrimas iš gelių, lyginant su veikliųjų junginių atpalaidavimu iš kremų ar tepalų. Taip pat veikliųjų junginių atpalaidavimui iš gelių neturi didelės įtakos vaistinės medţiagos įvedimo forma [10].
1.6. Puskiečių preparatų kokybės vertinimas ir biofarmaciniai tyrimai
Parinkus veikliajai medţiagai tinkamą nešiklį ir pagalbines medţiagas ir pagaminus puskietį preparatą, svarbu įvertinti jo kokybę. Atliekami pH, dinaminės klampos reikšmių, konsistencijos indekso nustatymo tyrimai, vertinamas sumodeliuotų sistemų vienalytiškumas, stabilumas, pasiskirstymas ant odos bei veikliųjų junginių atpalaidavimas in vitro [12,17]
Veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimo in vitro atlikimas pusiau kieto preparato vystymo metu yra rekomenduojamas tiek Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje, tiek šios šalies maisto ir vaistų administracijos (FDA) gairėse [8]. Šis tyrimas leidţia daryti išvadas apie pakitusią pradinių medţiagų – veikliosios arba pagalbinių medţiagų – kokybę, galimus gamybos proceso nuokrypius ar transportavimo ir laikymo įtaką produkto stabilumui [8].
Mokslinėje literatūroje aprašomi įvairūs prietaisai ir metodai, naudojami įvertinti veikliosios medţiagos išsiskyrimą iš sumodeliuoto puskiečio preparato [8,9,11]. JAV farmakopėjoje rekomenduojamas ir daţniausiai atpalaidavimo in vitro tyrimams pasitelkiamas prietaisas yra Franz difuzijos celė, kuri yra sudaryta iš donorinės ir akceptorinės terpių, perskirtų pusiau pralaidţia, inertiška membrana. Veiklioji medţiaga difuzijos būdu per membranos sudarytą barjerą skverbiasi iš didesnės koncentracijos donorinės terpės į maţesnės koncentracijos akceptorinę terpę [8]. Atpalaiduotas vaistinės medţiagos kiekis yra nustatomas spektrofotometriškai [11] arba efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [9]. Veikliųjų junginių atpalaidavimo in vitro tyrimo sąlygos yra parenkamos atsiţvelgiant į odos fiziologines savybes: tyrimo temperatūra turi atspindėti normalią odos temperatūrą (32 ± 0,5°C), o akceptorinės terpės pH reikšmė turi būti artima odos pH reikšmei (5,0 – 6,0 ± 0,05) [8]. Akceptorinės terpės parinkimas taip pat priklauso nuo veikliosios medţiagos tirpumo joje – vaistinė medţiaga turi visiškai ištirpti akceptoriniame skystyje [8]. Odos fiziologinių savybių atkūrimas atliekant atpalaidavimo
in vitro tyrimus, leidţia numanyti veikliosios medţiagos išsiskyrimo iš dermatologinio vaistinio preparato
kinetiką in vivo bei įvertinti jų farmakoterapinį veiksmingumą.
1.7. Literatūros apţvalgos apibendrinimas
Atlikus mokslinės literatūros analizę galima teigti, jog Melissa officinalis L. gali būti plačiai pritaikoma medicinos praktikoje. Nustatyta, kad farmakologinis vaistinės melisos poveikis pasireiškia dėl cheminėje sudėtyje esančių biologiškai aktyvių junginių - hidroksicinamono rūgščių, flavanoidų, eterinio
aliejaus komponentų: geranialio, citralio ir neralio. Vaistinių melisų preparatai dėl išreikštų antioksidacinių, antimikrobinių, prieuţdegiminių, antivirusinių savybių gali būti vartojami gydant miego, širdies ir kraujagyslių sistemos, virškinamojo trakto, organizmo metabolizmo sutrikimus, gali būti pritaikomi Alzheimerio ligos, herpetinių infekcijų ar atopinio dermatito gydymui. Pastarųjų ligų gydymui aktualu sumodeliuoti vietiškai veikiantį puskietį vaistinių melisų preparatą. Pasirinkus tinkamą pusiau kietos vaisto formos kategoriją, pagalbines medţiagas ir natūralios veikliosios medţiagos, vaistinės melisos, įvedimo formą, tiriamajame darbe planuojama suformuoti kokybiškus vaistinių melisų puskiečius preparatus ir įvertinti jų kokybę. Mokslinės literatūros ir tyrimo apţvalga pateikiama sudarytoje schemoje:
2 pav. Mokslinės literatūros ir mokslinio tyrimo apžvalgos schema Melissa officinalis L. Literatūros apţvalga Pagrindiniai cheminės sudėties komponentai Eterinio aliejaus komponentai Hidroksicinamono rūgštys Flavanoidai Triterpeninės rūgštys Sukeliamas farmakologinis poveikis Anksiolitinis Antioksidacinis Priešvirusinis Priešuţdegiminis Hepatoprotekcinis Priešvėţinis Analgetinis Hipolipideminis Hipoglikeminis Pritaikymo galimybės
Vartojimas per os esant:
Nervinei įtampai, miego sutrikimams Alzheimerio ligai Virškinimo sistemos sutrikimams Širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimams Sutrikusiam organizmo metabolizmui
Vietinis vartojimas esant:
Herpetinei infekcijai
Atopiniui dermatitui
Pusiau kietų vaisto formų su vaistinių melisų ekstraktu modeliavimas ir kokybės vertinimas
Puskiečio preparato kategorijos teorinis
parinkimas
Vaistinių melisų skystos vaisto formos gamyba ir
kokybės vertinimas
Gelifikuojančių medţiagų įtakos puskiečių preparatų kokybės vertinimui kriterijų parinkimas
pH Dinaminė klampa Bendro fenolinių junginių kiekio atpalaidavimo tyrimas in vitro Rozmarino rūgšties kiekio atpalaidavimo tyrimas in vitro Hidrogelių su vaistinių
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo medţiagos ir įranga
2.1.1. Naudotos medţiagos ir reagentai
Sausasis vaistinės melisos lapų ekstraktas 4:1 - Gehrilcker GmbH, Eurasburg, Vokietija Karbomeras 980 - Lubrizol, Ohajo valstija, JAV
Etanolis 96,6 proc.- AB „Stumbras“, Lietuva
Trietanolaminas 98 proc. - Sigma-Aldrich, Saint Luisas, JAV Metilceliuliozė 15cP – Sigma-Aldrich, JAV
1,2 – Propandiolis (Propilenglikolis) – Sigma-Aldrich, Vokietija Natrio hidroksidas, NaOH – Erba Lachema, Čekija
Folin-Ciocalteu reagentas – Sigma-Aldrich, Saint Luisas, JAV Natrio karbonatas, Na2CO3 – Sigma-Aldrich, Saint Luisas, JAV 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas DPPH – Sigma-Aldrich, Vokietija
Acto rūgštis – ≥99,8 proc.grynumo, Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Acetonitrilas – ≥99,9 proc. grynumo, Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija
2.1.2. Naudota įranga
Spektrofotometras: Agilent 8453 UV-Vis, Agilent Technologies, JAV Viskozimetras: Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija
pHmetras: ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija
Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija
Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi: IKAMAG C-MAG HS7, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija
2. 2. Vaistinių melisų preparatų gamybos technologijos
2.2.1. Melisos ţolės ekstrakto technologija
1 būdas. Etanolinis vaistinės melisos ţolės ekstraktas gaminamas maceracijos būdu [59,60],
vadovaujantis bendromis ekstraktų gamybos taisyklėmis. Ţaliavos ir ekstrahento santykis 1:1 [59]. Ekstrahentas – 50 proc. etanolis. Jo kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:
V = V1 + PK, kur V1 – reikiamas pagaminti ekstrakto kiekis; P – ţaliavos kiekis; K – ţaliavos sugerties koeficientas [59].
Pasvertas reikiamas ţaliavos kiekis uţpilamas apskaičiuotu kiekiu 50 proc. etanoliu. Maceruojama 7 dienas, po to filtruojama pro bepelenį filtrą. Gaunamas gelsvai rudos spalvos, specifinio kvapo skystasis ekstraktas.
2 būdas. Gaminamas 5 proc. vaistinės melisos lapų skystasis ekstraktas. Parinktas ekstrahentas –
išgrynintas vanduo. Skystasis ekstraktas gaminamas ištirpinant atitinkamą kiekį sausojo vaistinės melisos ekstrakto (4:1) apskaičiuotame kiekyje išgryninto vandens [59]. Filtruojama pro bepelenį filtrą. Kad būtų uţtikrintas skystojo ekstrakto skaidrumas, jis taip pat yra filtuojamas pro membraninį 0,22 µm filtą. Gaunamas gelsvai rudos spalvos, specifinio kvapo skystasis ekstraktas.
2.2.2. Dermatologinių preparatų su skystaisiais vaistinių melisų ekstraktais
technologija
2.2.2.1. Gelių su karbomero pagrindu gamyba
Gaminami geliai, kurių pagrindą sudaro 0,5 proc., 1,0 proc. ir 1.5 proc. koncentracijų sintetinė klampą didinanti medţiaga – karbomeras. Kaip veiklioji medţiaga įterpiama 10 proc. etanolinio vaistinių melisų ekstrakto arba 10 proc. vandeninio vaistinių melisų ekstrakto. Karbomero neutralizavimui parinkta neutralizuojanti medţiaga – trietanolaminas [61]. Gaminama po 50 g kiekvienos kompozicijos, kuri yra pateikta 2 lentelėje, gelio.
2 lentelė. Karbomero pagrindo gelių su skystaisiais vaistinių melisų ekstraktais sudėtys
Gamybos eiga:
Į tris stiklinėles įpilama po 5,0 g etanolinio vaistinės melisos ekstrakto, o gaminant karbomerinius gelius su vandeniniu vaistinės melisos ekstraktu – po 5,0 g vandeninio veikliosios medţiagos ekstrakto. Po to, supilamas atitinkamas kiekis papildomo 50 proc. etanolio arba išgryninto vandens ir stiklinėlės yra dedamos ant maišyklės. Pradedamas maišymas. Pasirinktas maišymo greitis 1. Lėtai suberiamas apskaičiuotas karbomero kiekis bei padidinamas maišymo greitis iki 1,5. Paliekama maišytis 30 minučių. Tuomet lašinama 6 – 7 lašus rūgščių mišinio (0,1M H+). Maišoma iki vienalytės masės. Maišant neutralizuojama paskaičiuotu trietanolamino kiekiu. Gaunami geliai [61].
2.2.2.2. Gelių su metilceliuliozės pagrindu gamyba
Gaminami geliai su veikliosiomis medţiagomis, etanoliniu vaistinės melisos ekstraktu (1:1) bei vandeniniu vaistinės melisos ekstraktu (5 proc.), kurių gamybai naudojama gelifikuojanti medţiaga - metilceliuliozė. Gaminama po 50,0 g kiekvienos kompozicijos gelio, sudėtys pateiktos 3 lentelėje.
Sudėtinės medžiagos N1 N2 N3 N4 N5 N6 Kiekis, proc. Karbomeras 980 0,5 1,0 1,5 0,5 1,0 1,5 Etanolinis vaistinės melisos ekstraktas (1:1) 10,0 10,0 10,0 5 proc. vandeninis vaistinės melisos ekstraktas 10,0 10,0 10,0 Etanolis 50 proc. 88,5 87,0 85,5 Išgrynintas vanduo 88,5 87,0 85,5 Trietanolaminas 1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3,0
3 lentelė. Metilceliuliozės pagrindo gelių su skystaisiais vaistinių melisų ekstraktais sudėtys
Gamybos eiga:
Metilceliuliozė yra disperguojama 30 ml karšto (80°C - 90°C) išgryninto vandens ir paliekama 24 val šaldytuve (2-8°C), jog ištirptų. Tuomet į metilceliuliozinį tirpalą įpilamas trūkstamas kiekis išgryninto vandens. Visos sudėtinės dalys yra sumaišomos: metilceliuliozė, vaistinės melisos etanolinis/ vandeninis ekstraktai ir propilenglikolis. Maišoma iki vienalytės masės [62].
2.2.2.3. Gelių su metilceliuliozės ir karbomero mišinio pagrindu gamyba
Gaminami vaistinių melisų geliai su dviejų polimerų – metilceliuliozės ir karbomero mišinio pagrindu (4 lentelė). Remiamasi tokia pat gamybos technologija, kaip ir gaminant gelius su metilceliuliozės pagrindu, tik į šiuos gelius pridedama sintetinės kilmės gelifikuojanti medţiaga karbomeras bei jo neutralizatorius - 1 proc. NaOH. Bendra gelio masė – 50,0 g.
Sudėtinės medžiagos N7 N8 N9 N10 N11 N12 Kiekis, proc Metilceliuliozė 15cP 1,0 2,0 4,0 1,0 2,0 4,0 Etanolinis vaistinės melisos ekstraktas (1:1) 10,0 10,0 10,0 5,0 proc. vaistinės melisos vandeninis ekstraktas 10,0 10,0 10,0 Propilenglikoli s 20,88 20,88 20,88 20,88 20,88 20,88 Išgrynintas vanduo qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100
4 lentelė. Metilceliuliozės ir karbomero mišinio pagrindo gelių su skystaisias vaistinių melisų ekstraktais sudėtys
Gamybos eiga:
Metilceliuliozė yra disperguojama 20 ml karšto (80°C - 90°C) išgryninto vandens ir paliekama 24 val šaldytuve (2-8°C), jog ištirptų. Dalyje išgryninto vandens disperguojamas karbomeras. Karbomero dispersija neutralizuojama 1 proc. natrio hidroksido vandeniniu tirpalu iki pH 7. Po to įpilamas likęs išgryninto vandens kiekis ir maišoma iki vienalytės masės. Į pagamintą karbomero gelį įterpiamas metilceliuliozės tirpalas, vaistinės melisos etanolinis/ vandeninis ekstraktai bei propilenglikolis, maišoma iki homogeniškos masės [62].
Sudėtinės medžiagos N13 N14 N15 N16 N17 N18 Kiekis, proc. Metilceliuliozė 15cP 1,0 2,0 4,0 1,0 2,0 4,0 Karbomeras 980 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Etanolinis vaistinės melisos ekstraktas (1:1) 10,0 10,0 10,0 5 proc. vandeninis vaisinės melisos ekstraktas 10,0 10,0 10,0 Propilenglikolis 20,88 20,88 20,88 20,88 20,88 20,88 1 proc. NaOH qs ad pH 7 qs ad pH 7 qs ad pH 7 qs ad pH 7 qs ad pH 7 qs ad pH 7 Išgrynintas vanduo qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100 qs ad 100
2.3. Vaistinių melisų preparatų kokybės vertinimo metodai
2.3.1. Skystųjų melisų ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis pagamintuose skystuosiuose vaistinės melisos ekstraktuose nustatomas atliekant reakciją su Folin – Ciocalteu reagentu ir matuojant absorbciją 765nm bangos ilgyje Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometru [9,29].
Reakcijai atlikti gaminami skystųjų ekstraktų tirpalai santykiu 1:50. 50 ml matavimo kolbutėje atsveriamas 1,0 g etanolinio vaistinės melisos ekstrakto (1:1) ir skiedţiama 50 proc. etanoliu iki ţymos. Skiedţiant vandeninį vaistinės melisos ekstraktą, kaip tirpiklis yra naudojamas išgrynintas vanduo.
Reakcijos eiga: į matavimo kolbutę, kurios tūris 10 ml, įpilama 3 ml išgryninto vandens, 1 ml Folin reagento ir 1 ml tiriamojo tirpalo. Suplakama ir laikoma 2 – 3 min. Įpilama 1,5 ml 20 proc. Na2CO3 vandeninio tirpalo. Praskiedţiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml ţymos. Reakcijos trukmė – 30 min. Mėginiai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje [9,29].
Koncentracija nustatoma naudojant kalibracinį grafiką pagal p - kumaro rūgštį [9].
2.3.2. Skystųjų melisų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Skystųjų vaistinių melisų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas nustatomas atliekant DPPH radikalų surišimo tyrimą.
Tiriant į kiuvetę įpilama 2.9 ml DPPH, kurio koncentracija – 40,0 µg/ml, ir 0,1 ml tiriamojo tirpalo. Laikoma tamsoje 15 min, supurtoma ir laikoma dar 15 min. Absorbcija matuojama 518nm bangos ilgyje Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometru. Lyginamasis tirpalas – 96,3 proc. etanolis [60,61]
Apskaičiavimui naudojama formulė:
Y = 92,6108 x (1,0531 – a) + 2,5796, kur Y – sujungto DPPH kiekis procentais, a – absorbcija. Gauti rezultatai lyginami pagal trolokso kalibracinę kreivę ir pateikiami kaip efektyvi 50 proc. radikalų surišanti koncentracija EC50 [60,61].
2.3.3. Vaistinių melisų antimikrobinio aktyvumo nustatymas
Vaistinių melisų antimikrobinis aktyvumas nustatytas pagal Europos Farmakopėjos Ph Eur.
07/2010, 2.6.12. straipsnyje pateiktą tyrimo metodiką [17]. Aseptinių sąlygų reikalaujančio tyrimo metu
nustatoma maţiausia slopinančioji koncentracija (MSK) – maţiausia preparatų koncentracija, kuri slopina tam tikrų mokroorganizmų kultūrų augimą. Paruošti pagrindiniai tirpalai, kuriuos skiedţiant 10 ml Miulerio-Hintono agaru gaunami darbiniai skiedimai. Toliau Petri lėkštelėse, kuriose yra tam tikro skiedimo vaistinių melisų ekstrakto turintis Miulerio-Hintono agaras, sėjamos etaloninės mikroorganizmų kultūros: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis. Mikroorganizmų
kultūros laikomos 24 valandas termostate, esant 37°C temperatūrai. Galiausiai, įvertinamas mikroorganizmų augimas [60,63].
2.3.4.Pusiau kietų vaisto formų dinaminės klampos nustatymas
Gelių su veikliosiomis medţiagomis – etanoliniu vaistinės melisos ekstraktu (1:1) bei vandeniniu vaistinės melisos ekstraktu (5 proc.) - dinaminė klampa buvo nustatyta viskozimetru Vibro viscometer SV-
10 (A&D Company ltd, Japonija). Tiriamasis gelis, kuris turi būti kambario temperatūros, įdedamas į
viskozimetro celę, nuleidţiama sensorinė plokštelė ir pamatuojama dinaminė klampa.
2.3.5. Pusiau kietų vaisto formų pH reikšmės nustatymas
Puskiečių preparatų pH buvo nustatytas pHmetru, specialiai skirtu pusiau kietų formų pH nustatymui (ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N). Kiekvieno gelio pH buvo matuojamas tris kartus ir po to išvedamas vidurkis.
2.3.6. Veikliųjų junginių atpalaidavimo iš puskiečių vaisto formų tyrimas in vitro
Bendro fenolinių junginių atpalaidavimo iš hidrogelių, kuriose įterptas vaistnės melisos ekstraktas, tyrimas in vitro yra atliekamas naudojant Franz tipo modifikuotas difuzijos celes, sudarytas iš stiklinėlės, plastikinio vamzdelio su stūmokliu ir pusiau pralaidţios celiuliozinės membranos, skiriančios donorinę (1,0±0,05 g hidrogelio) ir akceptorinę (25 ml išgryninto vandens) terpes. Prieš tyrimą, celiuliozinė membrana yra brinkinama 12 val. išgrynintame vandenyje ir tik tuomet pradedamas tyrimas [9,60].
Tyrimo metu yra palaikoma pastovi 32±0.5°C temperatūra [8]. Atpalaiduotų fenolinių junginių kiekiui įvertinti yra imami mėginiai po 1 ml, tiriant gelius su karbomero pagrindu, ir po 3 ml, tiriant gelius, kurių sudėtyje yra metilceliuliozės ir karbomero mišinio bei su metilceliuliozės pagrindais. Mėginiai imami po 1, 2, 4, 6 valandų [8,9,64].
a) Bendras fenolinių junginių, išsiskyrusių iš vaistinių melisų hidrogelių, kiekis yra nustatomas atliekant reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu ir matuojant absorbciją 765nm bangos ilgyje Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometru [9].
b) Atpalaiduotas rozmarino rūgšties kiekis įvertinamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, naudojant Agilent Infinity 1260 kapiliarinį skysčių chromatografą su Agilent diodų matricos detektoriumi. Analizė atliekama remiantis Stelmakienės A. ir kt. (2015) publikuota metodika [64]. Chromatografinės analizės sąlygos:
rozmarino rūgšties atskyrimui naudojama ACE C18 kolonėlė (150 x 0,5 mm v.d.);
mobilioji fazė - 0,5 proc. acto rūgšties vandeninis tirpalas (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B);
eliucija pradedama nuo 25 proc. tirpiklio B, 10 min. gradientas linijiškai keliamas iki 40 proc. tirpiklio B, tuomet 11-15 min. – 70 proc. tirpiklio B ir nuo 15 min iki 25 min gradientas graţinamas į pradines sąlygas – 25 proc. tirpiklio B;
tėkmės greitis: 10 µL min-1;
2.4. Statistinė analizė
Visi tyrimai atlikti po tris kartus. Rezultatų vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai apskaičiuoti naudojant Microsoft Office Excel 2010 programą. Tyrimų rezultatų skirtumų reikšmingumas įvertintas naudojant IBM SPSS statistics 19 programą - vieno faktoriaus dispersinės analizės modelį One way ANOVA. Skirtumai yra statistiškai reikšmingi, kada p<0,05. Taip pat įvertintas Spirmeno koreliacijos koeficientas.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Vaistinių melisų ekstraktų gamyba ir kokybės vertinimas
Puskiečių preparatų, kurie galėtų būti pritaikomi atopinio dermatito gydymui, gamybai, dėl savo antivirusinio, priešuţdegiminio, antioksidacinio poveikio kaip veiklioji medţiaga yra pasirinkta natūrali vaistinė augalinė medţiaga – vaistinių melisų ekstraktas. Siekiant įvertinti tirpiklio įtaką skystųjų ekstraktų kokybei, tyrimams pagamintas etanolinis (50,0 proc. v/v) bei vandeninis vaistinių melisų ekstraktai (5 proc.). Ištyrus šiuos ekstraktus nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, pateiktas 3 paveiksle.
3 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis vaistinių melisų ekstraktuose (mg/ml)
Tyrimų rezultatai parodė, jog didesnis fenolinių junginių kiekis, ekvivalentiškas kumaro rūgščiai, nustatytas vandeniniame vaistinių melisų ekstrakte (6,262±0,15 mg/ml). Tuo tarpu, tiriant vaistinių melisų ekstraktą, kurio gamyboje kaip tirpiklis naudotas 50 proc. v/v etanolis, gautas šiek tiek maţesnis fenolinių junginių kiekis (5,875±0,10 mg/ml). Tarp veikliųjų junginių kiekio šiuose ekstraktuose nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05), todėl tolimesniuose tyrimuose yra naudojami abu ekstraktai. Tuo siekiama įvertinti pagamintų ekstraktų pritaikymo perspektyvas puskiečių sistemų gamyboje.
3.2. Vaistinių melisų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymas
Tiriant vaistinių melisų skystųjų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, nustatyta, kad antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi skystieji ekstraktai, kurių gamyboje tirpikliais naudojami tiek 50 proc. v/v etanolis, tiek išgrynintas vanduo. Tai taip pat pagrindţia mūsų pasirinkimą, jog abu ekstraktai gali būti naudojami apsauginio poveikio puskiečių preparatų modeliavime. Tyrimo rezultatai pateikti 4 pav.
4 pav. Skystųjų vaistinių melisų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymo rezultatai
Antiradikalinio aktyvumo nustatymo, pagrįstu DPPH radikalų surišimo metodu, rezultatai pateikiami kaip efektyvi koncentracija (EC50) – antioksidanto kiekis, reikalingas 50 proc. pradinės DPPH koncentracijos surišti [65]. Maţesne efektyvia koncentracija, ekvivalentiška troloksui, pasiţymi vandeninis vaistinių melisų ekstraktas (EC50 = 0,055 g/ml), šiek tiek didesne – etanolinis vaistinių melisų ekstraktas (EC50 = 0,06 g/ml). Tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo, vertinant skystųjų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, nenustatyta.
3.3. Vaistinių melisų ekstrakto antimikrobinio aktyvumo nustatymas
Tyrimų metu buvo nuspręsta nustatyti sausojo vaistinių melisų ekstrakto (4:1), kuris įvairiais santykiais gali būti panaudojamas skystųjų ekstraktų gamybai, antimikrobinį aktyvumą. Įvertinta
maţiausia vaistinio augalo koncentracija, slopinanti tam tikros mikroorganizmų kultūros augimą. Tyrimo rezultatai pateikiami 5 pav.
5 pav. Sausojo vaistinių melisų ekstrakto (4:1) antimikrobinis aktyvumas
Tyrimo rezultatai parodė, jog labiausiai jautrios vaistinių melisų ekstrakto poveikiui yra S. aureus bei K. pneumoniae bakterijos – maţiausia šių bakterijų kultūrų augimą slopinančioji koncentracija yra 1,79 mg/ml. Atspariausias vaistinių melisų ekstraktui yra grybelis C. albicans. Taip pat maţiau jautrios yra E. coli, P. aeruginosa bei E. faecalis bakterijų kultūros.
Atlikto mikrobiologinio tyrimo rezultatus pagrindţia Raišytės T. (2014) atliktas antimikrobinio aktyvumo nustatymo tyrimas su vaistinių melisų tinktūromis. Šio tyrimo metu taip pat nustatyta, jog vaistinio augalo preparatų poveikiui labiau jautrios yra gramteigiamos bakterijų kultūros (S. aureus, K.
pneumoniae), o labiau atsparios - gramneigiamos mikroorganizmų kultūros (P. aeruginosa ir P. mirabilis) ir grybelis C. albicans [66].
Taigi, galima teigti, jog vaistinių melisų preparatai pasiţymi antioksidacinėmis ir antimikrobinėmis savybėmis. Kadangi atliekama daug tyrimų tiek su vandeniniu, tiek su etanoliniu vaistinių melisų ekstraktais [3,30,35,37,64], aktualu įvertinti abiejų ekstraktų daromą įtaką vaistinio augalo puskiečių preparatų kokybei.
3.4. Puskiečių preparatų su vaistinių melisų ekstraktais dinaminės klampos
nustatymas
Pagaminti puskiečiai preparatai su vaistinių melisų ekstraktais, kurių sudėtis pateikta 2.2.2 skyrelyje. Gelių gamyboje pasirinktos dvi gelifikuojančios medţiagos – pusiau sintetinės kilmės 1 proc., 2 proc. ir 4 proc. koncentracijų metilceliuliozė [10,56,62] ir sintetinės kilmės 0,5 proc., 1 proc. bei 1,5 proc. koncentracijų karbomeras [10,11,56,62]. Pirmajame tyrimų etape, siekiant įvertinti pagamintų dermatologinių preparatų kokybę, tikslinga atlikti dinaminės klampos nustatymą (6 pav.). Tai yra vienas svarbiausių kokybės parametrų, galintis turėti įtakos veikliųjų junginių atpalaidavimui iš puskiečių preparatų. Taip pat pagaminti puskiečiai preparatai turi būti tinkamos konsistencijos, jog kokybiškai teptųsi bei išliktų sąlytyje su paţeista odos vieta [55].
6 pav. Dinaminės klampos nustatymas geliuose, kuriuose įterpta skystieji vaistinių melisų ekstraktai
Iš pateiktų rezultatų matome, jog pasirinktas gelifikantas turi įtakos suformuluotų gelių klampai. Didesne klampa pasiţymi geliai [N1 – N6], kuriuose kaip pagrindinė gelifikuojanti medţiaga naudojamas karbomeras: nuo 0,85±0,08 iki 3,49±0,09 Pa•s, maţesne klampa – geliai [N13 – N18], kurių gamybai naudojamas karbomero ir metilceliuliozės mišinio pagrindas: nuo 0,54±0,07 iki 2,24±0,03 Pa•s. Maţiausia dinaminė klampa nustatyta geliuose [N7 – N12], pagamintuose tik su metilceliuliozės pagrindu: 0,02±0,02
– 0,71±0,01 Pa•s. Pastarosios puskietės sistemos pasiţymi skysta konsistencija. Tai parodo, jog sintetinės kilmės karbomeras yra stipresnė gelifikuojanti medţiaga nei pusiau sintetinės kilmės metilceliuliozė.
Tyrimo rezultatai pagrindė mokslinės literatūros duomenis, jog puskiečių preparatų klampai įtakos turi gelifikuojančios medţiagos koncentracija - didinant tiek karbomero, tiek metilceliuliozės koncentracijas puskiečiuose preparatuose, jų dinaminė klampa didėja [11,56,61].
3.5. Puskiečių preparatų su vaistinių melisų ekstraktais pH nustatymas
Puskiečių preparatų su vaistinių melisų ekstraktais kokybei įvertinti, be dinaminės klampos nustatymo, taip pat svarbus yra ir pH reikšmių nustatymas. Remiantis moksline literatūra, dermatologinių preparatų pH reikšmės gali turėti didelę įtaką veikliųjų medţiagų prasiskverbimui pro odą: norint pasiekti maksimalų dermatologinių preparatų efektą, jų pH turi būti artimas fiziologiniam odos pH (5,4 – 5,9) [67]. Atkreiptinas dėmesys, jog sergant atopiniu dermatitu, odos pH gali būti padidėjęs (6,0 – 6,5) [68], todėl svarbu pagaminti tinkamo pH puskietį preparatą. Tokiu būdu yra uţtikrinamas kokybiškas veikliųjų junginių atpalaidavimas iš puskiečio preparato ir jis neturi dirginančio poveikio odai. Pagamintų gelių su skystaisiais vaistinių melisų ekstraktais pH reikšmių matavimo rezultatai pateikti 7 pav.
Remiantis rezultatų duomenimis, aukštesnėmis pH reikšmėmis pasiţymi geliai, kurių gamyboje yra naudojamas karbomeras ir karbomero bei metilceliuliozės mišinys [N1 – N6; N13 – N18] : pH reikšmės vyrauja nuo 7,09±0,06 iki 7,75±0,06. Tuo tarpu, geliai, kurių gamyboje kaip gelifikuojanti medţiaga naudota vien metilceliuliozė [N7 – N12], pasiţymi silpnai rūgštiniu pH – reikšmės vyrauja nuo 5,96±0,05 iki 6,58±0,01. Pastebėta, jog didėjant metilceliuliozės koncentracijai šiuose geliuose, didėja ir gelių pH reikšmė ir jie tampa maţiau rūgštiniai.
Lyginant gelių, kuriuose įterpta vaistinių melisų augalinė ţaliava etanoline ar vandenine forma, klampos, pH reikšmių nustatymo rezultatus, statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p > 0,05). Galima teigti, jog įterpiama į gelius veikliosios medţiagos forma neturi įtakos šių pusiau kietų vaisto formų konsistencijai ar pH reikšmei. Tyrimų metu toliau planuojama nustatyti vaistinės melisos įterpimo į puskietį preparatą etanoline arba vandenine forma ir pagrindo įtaką veikliosios medţiagos išsiskyrimui iš puskiečių sistemų.
3.6. Biofarmacinis pusiau kietų vaisto formų su skystaisiais vaistinių melisų
ekstraktais tyrimas in vitro
Nustačius gelių su vaistinių melisų ekstraktais dinaminės klampos, pH reikšmes, kokybės uţtikrinimui tikslinga atlikti ir veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro, kad būtų įvertinta pasirinktų gelifikuojančių medţiagų įtaka veikliųjų medţiagų išskyrimui iš pagamintų hidrogelių.
Atpalaiduotas bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas atliekant reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu ir matuojant absorbciją 765nm bangos ilgyje spektrofotometru [9].
8 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio atpalaidavimo iš karbomero pagrindo gelių su etanoliniu ir vandeniniu vaistinių melisų ekstraktais in vitro kinetika
Atliekant fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro su vaistinių melisų geliais, kuriuose kaip pagrindinė gelifikuojanti medţiaga naudotas karbomeras (8 pav.), nustatyta, jog didţiausias fenolinių junginių kiekis po 6 val. yra atpalaiduojamas iš N3 kompozijos gelio – 1,91±0,05 mg/cm2
ir iš N6 kompozicijos gelio - 1,82±0,06 mg/cm2. Maţiausias kiekis fenolinių junginių po 6 val. atpalaiduojamas iš iš N1 ir N4 kompozicijos gelių, atitinkamai 1,27±0,07 mg/cm2
ir 1,40±0,01 mg/cm2 fenolinių junginių. Tyrimo rezultatai parodė, jog didėjant gelifikuojančios medţiagos koncentracijai geliuose su skystaisias vaistinių melisų ekstraktais, didėja ir atpalaiduotas veikliųjų junginių kiekis. Tačiau statistiškai reikšmingas skirtumas tarp po 6 val. tyrimo atpalaiduoto bendro fenolinių junginių kiekio nustatytas tik tarp N1 ir N2 bei N4 ir N5 kompozicijų gelių (p<0,05), tuo tarpu, tarp N2 ir N3 bei iš N5 ir N6 kompozicijų gelių – statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p>0,05). Vertinant tirpiklių, naudojamų vaistinių melisų ekstraktų gamyboje, įtaką veikliųjų junginių atpalaidavimui iš vaistinių melisų gelių, statistiškai reikšmingo skirtumo taip pat nenustatyta (p>0,05). Galima teigti, jog tinkamiausia sintetinės kilmės gelifikuojančios medţiagos, karbomero, koncentracija, atsiţvelgiant į atpalaiduotų veikliųjų junginių kiekį, gelių gamybai tiek su etanoliniu, tiek su vandeniniu vaistinių melisų ekstraktais, yra 1,0 proc.
