Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra
Mindaugas Marksa
Ibogaino ir noribogaino pasiskirstymas pelių organuose
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas
Santrumpos
LD50 – vidutinė mirtina dozė
18-MC - 18- metoksikoronaridinas
12-hidroksiibogainas - Noribogainas
AC – adenilciklazė
į.p – į pilvo ertmę
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
KFE – kietos fazės ekstrakcija
1.Įvadas...6 2.Tikslai ir uždaviniai...8 3.Literatūros apžvalga...9 3.1.Istorija...9 3.2.Tabernanthe iboga...11 3.2.1 Augalo charakteristika...11
3.2.2 Augale esančios veikliosios medžiagos ir jų poveikis...12
3.2.3 Indolo alkaloidai...13
3.3 Fizikinės savybės...14
3.3.1 Ibogaino fizikinės savybės...14
3.3.2 Noribogaino fizikinės savybės... 14
3.4 Cheminė struktūra...14
3.4.1 Ibogainas...14
3.4.3 18-MC...15
3.5 Metabolizmas ir veikimo mechanizmas...16
3.5.1 Metabolizmas...16
3.5.2 Ibogaino veikimo mechanizmas...16
3.5.3 Noribogaino veikimo mechanizmas...17
3.5.4 18-MC veikimo mechanizmas...17
3.6 Ibogaino, noribogaino toksiškumas ir farmakokinetika...18
3.6.1 Toksiškumas...18
3.6.2 Framakokinetika...19
3.6.3 Lyties įtaka veikimui...19
3.7 Ikiklinikiniai ir klinikiniai tyrimai...20
3.7.1 Ikiklinikiniai tyrimai...20
3.7.2 Klinikiniai tyrimai...20
3.8 Noribogaino ir ibogaino tyrimo metodai...21
3.8.2 Efektyvioji skysčių chromatografija...22
3.8.3 Sorbentų, eliuentų, kolonėlių parinkimas ...23
3.8.4 Detektoriai ...23
3.8.5 Duomenų registravimas ir apdorojimas ... 24
4. Tyrimo objektai ir metodikos... 26
4.1 Tyrimo objektai...26
4.1.1 Gyvūnai ...26
4.2 Metodikos... 27
4.2.1 Noribogaino ir ibogaino išskyrimas iš biologinių objektų ...27
4.2.2 Efektyvioji skysčių chromatografija ...28
5. Rezultatai ir jų aptarimas ...29
6.Išvados ...38
Santrauka ...39
Summary ...40
1. Įvadas
Alkoholizmas, narkomanija - viena iš didžiausių žmonijos problemų, kuri aktuali ne vien tik šiais laikais. Ji buvo žinoma ir anksčiau. Priklausomybė nuo narkotinių medžiagų ir alkoholio gali turėti žmonijai tragiškų pasekmių. Ne visada žmonės šias priemones naudojo tik tam, kad apsvaigtų, atsipalaiduotų arba patirtų euforiją. Įvairios psichotropinės medžiagos buvo vartojamos įvairių genčių apeigose, gydymui, užkalbėjimams.
Gali iškilti klausimas: „ Kodėl vartojami narkotikai ar alkoholis?“. Atsakymas būtų toks, jog jie teikia malonumą, tuo metu pagerina savijautą, atpalaiduoja ir pralinksmina, tačiau pamažu veda į pražūtį, kai prarandama viskas, kas iki tol turėta: šeima, draugai, namai, sveikata, o galiausiai ir gyvybė. Narkotinės medžiagos bei alkoholis, sukelia psichikos širdies pažeidimus, psichikos, kepenų ir inkstų sutrikimus. Vartojant narkotikus galima užsikrėsti ŽIV nuo jau panaudotų švirkštų. Problema išliko opi iki šių dienų. Dabar alkoholio ir narkotikų vartojimo amžiaus cenzas pasikeitė. Dauguma paauglių pabando bent vieną iš šių medžiagų būdami vos 13 metų ar net dar anksčiau. Aiškinama, jog dėl to kalti netinkami draugai, tėvų nepriežiūra, noras pasijusti „kietu“ ir pan. Apklausų duomenimis Lietuvoje narkotikų bent kartą gyvenime yra bandę 8,2 proc. Lietuvos gyventojų, tabaką rūkę 65,8 proc., o alkoholinius gėrimus vartoję 85 proc. Vartojant narkotines medžiagas arba alkoholį padidėja pasitikėjimas savimi. Be to daugelį šių medžiagų naudoja gydymui (pvz. depresijoms), įvairių operacijų metu kaip premeditacinės ar dezinfekcinės priemonės, moksliniams tyrimams.
Darbo tyrimo objektu tapo natūrali medžiaga, kuri, literatūros duomenimis, gali sumažinti potraukį opiatams, alkoholiui, o gal net ir visiškai pašalinti priklausomybę nuo pastarųjų medžiagų. Tyrimuose buvo naudoti Afrikoje augančio augalo Tabernanthe iboga šaknies žievės milteliai ir šaknyje esančios veikliosios medžiagos natūralus metabolitas. Tiriamoji medžiaga - indolo grupės alkaloidas ibogainas ir jo metabolitas noribogainas. Tyrimai buvo atliekami su baltosiomis laboratorinėmis pelėmis, zondo pagalba įvedant šias medžiagas tiesiai į skrandį. Buvo nustatytas jų
apskaičiuojant jų koncentracijas išvedus tirtų organų rezultatų vidurkius. Tai yra tik maži žingsneliai, kol bus visiškai išaiškintas veikimo mechanizmas, įvertintas efektyvumas, toksiškumas, saugumas ir daugelis kitų reikalingų parametrų, kad šios medžiagos būtų vartojamos kaip vaistai priklausomybėms gydyti. Atliekant tyrimus su savanoriais, kurie kentė priklausomybes, rezultatai yra tikrai geri - dauguma savanorių visiškai atsikratė savo problemos, kitiems palengvėjo bent trumpam laikui, tretiems tai padėjo pereiti prie silpnesnių svaiginamųjų medžiagų. Žinoma, iki visiško aiškumo dar yra daug darbo, reikia atlikti dar daug tyrimų, bandymų. Tobulėjant tyrimo ir analizės metodams yra vilties, kad ilgainiui šie tyrimai nenueis veltui ir bus sukurti vaistai, padėsiantys pasauliui kovoti su šia problema.
Darbo temos pasirinkimui turėjo įtakos tiriamųjų medžiagų pasiskirstymo organuose tyrinėjimo stoka. Šie rezultatai galės padėti vėlesniuose darbuose ir bus naudingi tiek mums, tiek kitiems tyrėjams. Atlikta daug tyrimų ibogaino ir noribogaino veikimo srityje. Dauguma mokslinių laboratorijų ibogaino ir noribogaino tyrimams naudoja dujų – masių spektrometriją. Mes pasirinkome efektyviosios skysčių chromatografijos metodą su fluorescenciniu detektoriumi, pastarasis detektorius daug jautresnis ir efektyvesnis. Metodas buvo pasirinktas išnagrinėjus mokslinę literatūrą ir pritaikius ją pagal mūsų galimybes.
2. Tikslai ir uždaviniai
Darbo tikslas
- nustatyti ibogaino ir noribogaino pasiskirstymą peliųorganuose.
Darbo uždaviniai:
1. Optimizuoti ibogaino ir noribogaino išskyrimo iš biologinių objektų metodikas.
2. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą kiekybiniam duomenų įvertinimui.
3.1 LITERATŪROS APŽVALGA
3.1.1 Istorija
„Bwiti“ – tai tradicinė vakarų Afrikos religija, praktikuojama Babongo ir Mitsogo genčių, gyvenančių miškuose. Babongo gentis buvo viena iš pirmųjų šios religijos pradininkų. Tradicinėms apeigoms Bwiti gentis naudojo Tabernanthe iboga augalo šaknies žievę, kuri pasižymi haliucinogeninėmis savybėmis, padeda susisiekti su mirusiaisiais ir pasisemti žinių iš dvasių pasaulio. Apie nepaprastą augalą, augantį Gabone ir Konge pradėjo kalbėti XIX amžiuje belgų ir prancūzų mokslininkai. Per didelių dozių vartojimas sukeldavo nepageidaujamų efektų: vėmimą, ataksiją ( koordinacijos sutrikimus, raumenų traukulius) [48]. Bwiti kolonijos žmonės Ibogą naudojo ne žalingų įpročių gydymui, o kūno negalavimams, tokių kaip nevaisingumas, gydyti [18]. Kolonijos bendruomenė, patyrusi krizę dėl įsivyravusio nevaisingumo, kurį sukėlė venerinės ligos, kilusios dėl padidėjusios prostitucijos, pradėjo siūlyti naudoti Ibogą, kuri gali turėti antimikrobinį aktyvumą ir daryti poveikį ląstelių imunitetui. Tyrimai su gyvūnais parodė, kad Iboga aktyviai veikia Candida albicans [29], o tyrimai in vitro rodo poveikį žmogaus vėžinėms ląstelėms [30], veikia prieš Mycobacterium tuberculosis [45], žmogaus imunodeficito 1 tipo virusą [49] ir atogrąžų parazitus Leishmania amazonensis [14].
Tabernanthe iboga - 3-4 pėdų aukščio krūmas, augantis laukymvietėse ar kultivuojamas netoli gyvenviečių namelių. Vietiniai gyventojai pastebėjo, kad šio augalo šaknų žievė yra efektyvus stimuliatorius ir afrodiziakas - pavartojus žievės raumenys tampa stipresni ir ištvermingesni bei padidina seksualinį pajėgumą. Kelios gentys atrado, kad suvalgius didelę dozę šių šaknų atsiranda regėjimai arba net sukelia mirtį. Todėl šį augalą pradėjo naudoti savo ritualuose [18], kurių tikslas buvo susisiekti su protėviais [8]. Pirmosios žinios ir tyrimai buvo užfiksuota chirurgo Grifton du Bellay
1864m, netoli Cape Lopez Gabone. Jis stebėjo vietinius žmones, kurie vartojo šio augalo šaknis, ir bandė nustatyti sukeliamą poveikį. Stebėjimų metu buvo padaryta išvada, kad: „ Naudojant nedideliais kiekiais šaknies žievės sukeldavo stimuliuojantį poveikį nervų sistemai, taip pat buvo pastebėtas afrodiziakinis poveikis. Kariai ir medžiotojai naudojo budrumo sustiprinimui naktinio budėjimo metu...“. Tais pačiais metais buvo išleistas pirmasis Tabernanthe Iboga aprašymas. Jo pavyzdys atvežtas į Prancūziją iš Gabono. 1889m. prof. H.Baillon, iš gautų pavyzdžių pasiūlė pirmą botaninį pavadinimą Tabernanthe iboga [43].
Ibogainas pirmą kartą buvo išskirtas ir identifikuotas 1901 m. [32], o jo cheminė struktūra buvo nustatyta tik 1957 m. [48] (pilna Ibogaino sintezės skelbiama 1965 metais) [53].
Medicinoje ibogainas pradėtas naudoti 1950 metais. Kai kuriuos daktarus ibogainas domino kaip pagalbinė psichoterapijos [50] arba psichozės gydymo priemonė [54, 52].
1962 metais ibogainą pradėjo tyrinėti kaip narkotinių medžiagų priklausomybes gydančią medžiagą. Bandymo metu priklausomybę turintys savanoriai gėrė įvairius haliucinogenus, sistemingai registravo savo pojūčius [33] ir pastebėjo, kad naudojusieji ibogainą nutraukimo sindromų nepatyrė.
Ibogainas nėra labai gerai žinoma medžiaga. Jis nėra plačiai aprašytas literatūriniuose šaltiniuose, išskyrus JAV, Belgiją, Vokietiją, Prancūziją, Švediją, Šveicariją ir Australiją, kur jis yra nelegalus. Internetu ibogaino galima įsigyti kitose Europos šalyse, Meksikoje ir Kanadoje [7].
Nuo 2006 metų ibogaino hidrochlorido galima buvo įsigyti JAV mokant 400-500 dolerių už gramą. Gydymui, opioidų sukeliamiems nutraukimo sindromams ibogaino hidrochlorido reikia 1-2g. - tai brangus gydymo būdas. Ibogaino hidrochloridas privalo būti 97-98 proc. grynumo. Ibogainas dar gali būti Tabernanthe Iboga ekstrakto arba džiovintų šaknų žievės pavidalo [46].
Nuo 1990 iki 2006 metų jau yra žinomi vienuolika atvejų, kuomet žmogus mirė per 72 valandas po ibogaino pavartojimo. Manoma, kad žmonės mirė dėl kardiologinių priežasčių, tokių kaip miokardo infarktas, kardiomiopatija, širdies vožtuvo ligų ar tiesiog plaučių embolijos. Kai kuriais atvejais mirties priežastimi laikomas ibogos alkaloidų perdozavimas.
3.2 Tabernanthe Iboga
3.2.1 Augalo charakteristika
Natūralus ibogainas išgaunamas iš afrikinio krūminio augalo Tabernanthe Iboga šaknų žievės [26], jis priskiriamas stepukinių (Apocynaceae) šeimai, Tabernanthe genčiai, Iboga rūšiai. Šiai šeimai priklauso nedideli krūmai ir medžiai (1 pav). Tabernanthe Iboga dažniausiai auga iki 2metrų aukščio, nors kartais, sudarius tinkamas sąlygas, gali siekti ir 10 metrų aukštį. Lapai smulkūs, žalios spalvos. Žiedai balti arba rožiniai. Vaisiai oranžinės spalvos, gali būti ištęsto ovalo arba ovalūs rutulio formos. Šakniavaisiai geltonos spalvos, kartaus skonio, o tai sukelia sisteminį odos tirpimą ir nejautrą burnoje( 2 pav). Tabernanthe Iboga auga drėgnose tropinėse Vakarų ir Centrinės Afrikos srityse. Dažniausiai randamas tropinių miškų glūdumoje [43].
2 pav. Tabernanthe iboga augalo dalys.
3.2.2 Augale esančios veikliosios medžiagos ir jų poveikis
Tabernanthe Iboga augalo šakniavaisiuose kaupiasi daug indolo grupės alkaloidų. Iš šio augalo buvo išskirti šie alkaloidai: ibogainas, tabernantinas, ibogaminas, iboluteinas, desmetoxyiboluteinas, gaboninas, kisantinas, kimvulinas [39]. Pagrindinis ir svarbiausias iš jų yra ibogainas. Didžiausia jo koncentracija (5-6 proc.) randama šakniavaisių žievėje.
Žmonės sugebėjo pažinti šio augalo savybes stebėdami įvairių gyvūnų elgesį. Iš devynioliktame amžiuje vykusių Prancūzų ir Belgų ekspedicijų ir padarytų pranešimų buvo apibūdintas sukeliamas stimuliuojančio ir afrodiziakinio poveikio efektas vartojant augalo šaknis [43].
Pirmą kartą ibogainas buvo išskiras 1901m., J.Dybowski ir E.Landrin dėka [31].
3.2.3 Indolo alkaloidai
Šiuo metu jau yra išskirta ir ištirta daugiau kaip 2000 indolo alkaloidų. Visi jie turi indolo žiedą arba triptamino fragmentą ir biogenetiškai yra kilę iš aminorūgšties triptofano. Paprastieji indolo alkaloidai yra pakeisti triptaminai, karbazolai, β-karbolinai ir piropo [2,3-b] indolai [12]. Indolo alkaloidai, ypač augalinės kilmės, yra įdomūs tuo, kad daugelis iš jų naudojami kaip medicininiai ir veterinariniai preparatai, be to, kai kurie iš jų yra labai stiprūs haliucinogenai [12]. Paprasčiausi indolo alkaloidai susidaro iš biogeninio amino triptamino. Šie alkaloidai yra chemiškai panašūs į nervinių impulsų perdavėją organizmuose serotoniną, kuris cirkuliuoja žinduolių kraujyje, todėl manoma, kad dėl šios priežasties jie pasižymi didesniu ar mažesniu haliucinogeniniu poveikiu [12, 28].
3 pav. Pagrininis indolo alkaloidų cheminis žiedas.
Ibogainas – tai pagrindinis Tabernanthe iboga Baillon alkaloidas, atrastas prancūzų mokslininkų prieš penkiasdešimt metų. Raymond – Hamed spalvinių reakcijų dėka pirmasis nustatė, kad ibogainas priklauso indolo grupei (3 pav) ir savo struktūroje turi metoksi grupę. O 1944m. Delourme – Haude‘ išvedė ibogaino formulę, kuri žinoma ir iki dabar (C20H26N2O) [11].
3.3 Fizikinės savybės
3.3.1 Ibogaino fizikinės savybės
Baltos spalvos milteliai sunkiai tirpūs vandenyje, labai gerai tirpūs alkoholiuose, taip pat gerai tirpsta eteryje, chloroforme, benzene. Savito skonio, kuris labai panašus į kokaino. Lydimosi temperatūra 1520C, išsilydo iki skaidraus, geltono skysčio. Ibogainas greitai oksiduojasi ore iki rusvai geltonos spalvos [15].
3.3.2 Noribogaino fizikinės savybės
Baltos spalvos milteliai netirpūs šaltame vandenyje, kur kas geriau tirpūs šiltame, o ypač gerai tirpūs alkoholiuose. Lydimosi temperatūra 258,2 0C laipsnių [57].
3.4 Cheminė struktūra
3.4.1 Ibogainas
Ibogainas (4 pav) – psichostimuliatorius, priklausantis indolo alkaloidų grupei, gaunamas iš afrikinio medžio Tabernanthe iboga šaknies. Jo struktūroje yra metoksi grupė, tuo skiriasi nuo noribogaino (5 pav), kuris struktūroje - hidroksi grupė [11]. Atliekant tyrimus buvo nustatyta, kad ibogainas pasižymi didesniu toksiniu poveikiu nei noribogainas. Jo vidutinė mirtina dozė yra 2,4 karto mažesnė nei noribogaino, o tai leidžia daryti prielaidą, kad būtent metoksi grupė pasižymi stipresnėmis toksinėmis savybėmis nei hidroksi grupė, esanti noribogaino struktūroje [2].
4 pav. Ibogaino cheminė formulė.
3.4.2 Noribogainas
Noribogainas – psichostimuliatorius, priklausantis indolo alkaloidų grupei. Jis yra natūralus ibogaino metabolitas, susidarantis žmogaus kepenyse vykstančio metabolizmo proceso metu, dalyvaujant kepenų fermentams. Noribogaino cheminė formulė – C19H24N2O (5 pav) [36].
5 pav. Noribogaino cheminė formulė.
3.4.3 18-MC
Sintetinis ibogaino grupės atstovas yra 18-MC [24, 47], atrastas 1996m. Albanijos medicinos koledžo farmakologo Stanley D. Glick ir Vermonto universiteto
chemiko Martin E. Kuehne. Cheminė formulė – C22H28N203 (6 pav).
6 pav. 18 – MC cheminė formulė.
3.5 Metabolizmas ir veikimo mechanizmas
3.5.1 Metabolizmas
Kol kas nedaug yra žinoma apie ibogaino metabolizmą. Nustatyta, kad 4–5 proc. ibogaino po intraveninės injekcijos išsiskiria su šlapimu. Naujausių tyrimų duomenimis ibogainas turi mažiausiai vieną aktyvų metabolitą – noribogainą, kuirs yra identifikuotas žmonių plazmoje po ibogaino vartojimo [1].
Ibogainą žmogaus organizme metabolizuoja citochromo P450 (CYP) fermentas iki noribogaino (12-hidroksiibugainas), kuris yra pagrindinis ibogaino metabolitas [36].
3.5.2 Ibogaino veikimo mechanizmas
Manoma, kad ibogainas veikia kaip antagonistas į N-metil-d-aspartato tipo glutamato receptorius (NMDA). Taip pat tiriant ibogaino alkaloidus rastas galimas antagonistinis poveikis į α3β4 nikotino acetilcholino receptorius (nAChR) [9]. Tyrimo
nikotininius ir 5HT receptorius presinapsėje dopamino išlaisvinimo metu [20]. Ibogainas gali turėti įtakos signalo sklidimui ląstelės viduje esantiems opioidiniams receptoriams ir sukelti morfino sukeltos adenilciklazės (AC) slopinimą [44]. Ibogainas pasižymi CNS stimuliuojančiu poveikiu, taip pat daugialypiu farmakologiniu efektu: gali sukelti tremorą, ataksiją, haliucinacijas [43]. Atlikti tyrimai parodė, kad ibogainas mažina potraukį opiatams ir silpnina priklausomybės simptomus žmonėms, priklausantiems nuo narkotinių medžiagų, tokių kaip heroinas, kokainas ir kitų psichostimuliantų [27, 17].
3.5.3 Noribogaino veikimo mechanizmas
Manoma, kad noribogainas taipogi veikia kaip NMDA agonistas ir kapa-opioidinis agonistas [19], dauguma efektų yra panašūs į ibogaino (slopina potraukį narkotinėms medžiagoms, alkoholiui) [20]. Atlikus neurocheminius ir elgesio tyrimus su žiurkėmis nustatyta, kad noribogainas yra farmakologiškai aktyvus ir sukelia poveikį, panašų į ibogaino – mažina potraukį morfinui ir kokainui, silpnina lokomotorinįmorfino aktyvumą [1].
3.5.4 18-MC veikimo mechanizmas
18-MC yra giminingas ibogainui, dėl to manoma, kad veikimas yra panašus į ibogaino - slopina priklausomybę morfinui, bet nesukelia tokio toksinio poveikio kaip ibogainas [21]. Tyrimais nustatyta, kad 18-MC, kuris turi nedidelių panašumų į NMDA receptorių veikimą. Atlikus tyrimus su gyvūnais nustatyta, kad 18-MC mažina opioidų sukeltus abstinencinius simptomus [23, 25].
3.6 Ibogaino ir noribogaino toksiškumas ir
farmakokinetika
3.6.1 Toksiškumas
Medžiagų toksiškumas kol kas nėra visiškai ištirtas, nežinomas tikslus toksinis poveikis žmonėms. Atlikta daugybė tyrimų, nustatinėjant šių medžiagų vidutines mirtinas dozes (LD50). LD50 – tai statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kuri sukelia 50 proc. tiriamųjų gyvūnų kritimą. LD50 apskaičiuojama pagal formulę: lgLD50 = lgDN – δ(∑Li-0.5), ( DN – didžiausia tiriamos medžiagos koncentracija, δ – įvestos medžiagos dozių santykio logaritmas, Li – dozės paveiktų ir kritusių pelių santykis) [1, 2, 38].
Tyrimuose su pelėmis nustatyta ibogaino (263mg/kg) ir noribogaino (630mg/kg) vidutinė mirtina dozė per os. Šio tyrimo metu buvo stebimas ir pelių elgesys, nes tai yra vienas žymenų apie tam tikros medžiagos toksinį poveikį gyvūnams. Įvedus mažas ibogaino ir noribogaino dozes pelių elgesio sutrikimų nepastebėta. Išorinis preparatų poveikis (traukuliai, nervingas elgesys, kojų paralyžius) stebėtas tik panaudojus didesnes medžiagų dozes: ibogaino 400 mg/kg, noribogaino 500 mg/kg kūno masės [2].
Literatūros duomenimis ibogaino LD50 nustatyta jūrų kiaulytėms (82 mg/kg – injekcija į pilvo ertmę) ir žiurkėms (327 mg/kg per os ibogaino ir 145 mg/kg i.p.). Tiriant ilgalaikį ibogaino toksiškumą (10 mg/kg 30 dienų ir 40 mg/kg 12 dienų), nerasta pakitimų žiurkių kepenyse, inkstuose, širdyje ir smegenyse. Ibogaino neurotoksiškumo požymių nenustatyta, atlikus tyrimus su beždžionėmis (5–25 mg/kg per os ibogaino keturias dienas). Vėliau paaiškėjo, kad ibogainas vis dėlto pasižymi neurotoksiniu veikimu, t.y. skatina Purkinjė ląstelių degeneraciją ir šis neurotoksiškumas yra susijęs su vaisto doze [23].
Taip pat yra žinomas mirtino apsinuodijimo atvejis, kai 48 metų negyvas vyras buvo rastas savo namuose. Nustatyta, kad mirties priežastimi buvo apsinuodijimas
Tabenanthe iboga šaknies žieve. Ibogainas ir noribogainas buvo nustatytas organizmo audiniuose ir skysčiuose. Tyrimui buvo naudota validuota masių spektrometrijos aparatūra. Ibogaino ir noribogaino didžiausios koncentracijos buvo rastos blužnyje, kepenyse, smegenyse ir plaučiuose atitinkamomis dozėmis (mg/kg): ibogaino - 1,78; 3,75; 1,16; 4,64, noribogaino – 0,83; 2,43; 0,90; 2,69. Labai mažos koncentracijos buvo nustatytos prostatos audinio pavyzdyje, taip pat ir tulžyje. Kitų organizme buvusių nuodingųjų medžiagų identifikuoti nepavyko [3].
3.6.2 Farmakokinetika
Iki šiol nenustatyta tiksli ibogaino farmakokinetika. H. J. Dhahir ir G.Zetler tyrimų duomenimis ibogaino pusinės eliminacijos laikas graužikų organizme yra apie 1 valandą. Praėjus 12 valandų, ibogaino organizme neaptinkama. Tie patys mokslininkai atliko ne vieną tyrimą šio preparato efektyvumui ir farmakokinetikai nustatyti. Vieno tyrimo metu, suleidus injekciją pelėms, po vienos valandos didžiausia koncentracija buvo nustatyta inkstuose ir kepenyse. Suleidus 10 mg/kg, po 10 sekundžių maksimali koncentracija buvo nustatyta smegenyse (48 μg/g). O pusinės eliminacijos laikas iš graužikų smegenų - 60 min. Pasišalinimo greitis iš pelių organizmo - 4 proc. per valandą, visiškai pasišalina per 12 valandų. 5 proc. injekuotos dozės pasišalina su šlapimu. Taip pat atliktas tyrimas su triušiais, kuriems buvo duota 10 mg/kg per os. Nustatyta, kad maksimali dozė pasišalina su šlapimu po 4 – 5 valandų, visiškai nebelieka po 6 valandų. Farmakologiniai ibogaino efektai priklauso nuo laiko, praėjusio po medžiagos suvartojimo [43].
3.6.3 Lyties įtaka veikimui
Atliktų tyrimų duomenimis nustatyta, kad ibogaino poveikis pelių patelėms ir patinams skiriasi. Pastebėta, kad ibogainas didesnėmis koncentracijomis pasiskirsto patelių smegenyse ir plazmoje. Tyrimo eigoje, kurio metu buvo tiriamas ibogaino poveikis morfinui, nustatyta, kad patelėms greičiau pasireiškia akivaizdus antagonistinis
ibogaino poveikis nei patinams. Tas pats buvo nustatyta ir su noribogainu. Šie duomenys leido suprasti, kad skirtumai tarp lyčių, vartojant ibogainą, parodo jo veikimo skirtumus ir sudaro galimybę rinktis pateles ar patinus tyrimams, nes veikimo greitis yra skirtingas. Tyrimas atliktas naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos su dujų- masių spektrometrijos detekcijos metodą [42].
3.7 Ikiklinikiniai ir klinikiniai tyrimai
3.7.1 Ikiklinikiniai tyrimai
Naudojant įvairius gyvūnus (triušiai, pelės ir kt.) buvo tyrinėjamas Ibogos alkaloidas ibogainas [8], jo metabolitas noribogainas [10] ir sintetinis tos pačios rūšies atstovas 18-MC [35]. Vienuolikoje iš trylikos paskelbtų ikiklinikinių tyrimų skelbiama, kad šie Ibogos alkaloidai žymiai palengvina opiatų sukeltus nutraukimo simptomus žiurkėms [16, 41], pelėms [19, 32] ir primatams [6]. Yra duomenų, kad Iboga alkaloidai mažina morfino [20, 40], kokaino [21, 13], amfetamino [34], metamfetamino [40, 22], alkoholio [46, 27] ir nikotino [22, 23] išsiskyrimą ir dopamino išsiliejimą į požievinį smegenų branduolį (lot. nucleus accumbens), kurio pagalba suvokiamas opiatų ir nikotino narkotinis poveikis.
3.7.2 Klinikiniai tyrimai
Ibogainas yra vienintelis žmonių vartotas Ibogos alkaloidas, išskyrus vieną atvejį, kai 12 savanorių dalyvavo trumpalaikiame neuropsichologiniame tyrime, kurio metu vartotas Ibogos alkaloidas ibogalinas [52].
Pacientai, fiziškai priklausomi nuo opiatų, pavartoję ibogaino hidrochloridą vienkartinėmis dozėmis 10-25mg/kg kūno svoriui, bėgant laikui po jo suvartojimo pastebėjo ženklų nutraukimo simptomų sumažėjimą [7, 37]. Ibogaino privalumas yra tas, kad jis yra labiau toleruojamas, nei standartiniai gydymo būdai, be to, mažėja potraukis vaistams, kuris gali tęstis nuo kelių dienų iki mėnesio po gydymo. Asmenys
sindromų gydymui.
Taip pat buvo atliktas tyrimas su 27 savanoriais, turinčiais priklausomybę kokainui ar kitiems opioidiniams preparatams. 14 dienų vartotas ibogainas, norint išsiaiškinti jo saugumą ir efektyvumą, medikamentinei priklausomybei gydyti. Buvo parinktos trys ibogaino hidrochlorido dozės 400, 600, 800 mg. Tyrimams buvo imamas kraujas ir daromi mėginiai, kuriuos tyrė dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu, nustatinėjant ibogaino farmakokinetiką organizme. Preparatas buvo gerai toleruojamas, taip pat buvo nustatyta, kad susilpnėjo depresijos požymiai ir susilpnėjo priklausomybė nuo narkotinių medžiagų [36].
Yra duomenų, kai buvo apklaustas 21 asmuo, dalyvavęs gydyme nuo stiprios priklausomybės vartojant ibogainą. Pacientai jį vartojo beveik 22 mėnesius. Gydymo metu penki pacientai sakė, kad visiškai nutraukė narkotikų vartojimą, devyni – kad nusustojo vartoti narkotines medžiagas, nuo kurių buvo priklausomi, bet pradėjo vartoti alkoholį ir kanapes. 19 pacientų pripažino, kad buvo nutraukę narkotinių medžiagų vartojimą, bent jau trumpam laiko tarpui. Rezultatai nėra tikslūs ir aiškūs, nes sunku nustatyti sumažėjusią priklausomybę, kai vertinimo metodas yra apklausa, kurią pagrįsti moksliškai sudėtinga [9].
3.8 Ibogaino ir noribogaino tyrimo metodai
3.8.1 Chromatografija
Kertinis chromatografijos akmuo buvo padėtas daugiau nei prieš 100 metų 1903m. [60]. Terminas „chromatografija“ pasiūlytas šio metodo kūrėjo M.Cveto. Augaliniams pigmentams atskirti M.Cvetas panaudojo kolonėlę, pripildytą kieto sorbento (kalcio karbonato). Praplaunant kolonėlę judančiuoju tirpikliu (petroleteriu) buvo užfiksuotos natūralios pigmentų spalvos chromatografinės zonos. Todėl metodo pavadinimui buvo pavartotas graikų kalbos žodis chroma, t.y spalva ir grapho – rašau [5].
Chromatografija yra fizikinės – cheminės analizės metodas, leidžiantis bandinį išskirstyti į atskirus komponentus [4]. Yra žinoma daug atskyrimo metodų. Tai sedimentacija, filtravimas, ekstrahavimas, dekantavimas, kristalizavimas, distiliavimas,
tačiau dauguma šių klasikinių metodų yra nepakankamai efektyvūs, ypač kai reikia atskirti individualias medžiagas (baltymus, pigmentus ir t.t) iš gamtinių junginių mišinių. Dėl savo paprastumo, analizės atlikimo spartos bei efektyvumo plačiausiai yra naudojami chromatografiniai metodai. Jie yra universalūs, nes juos galima taikyti kietiems, skystiems, dujiniams neorganiniams ir organiniams junginiams atskirti bei jų kiekiui nustatyti. Chromatografija naudojama junginių atskyrimui bei jų analizei [5].
3.8.2 Efektyvioji skysčių chromatografija
Sąvoka efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) (angl. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)) buvo pasiūlyta 1970m. Skysčių chromatografija – tai chromatografinis skirstymo metodas, kuris remiasi skysto būvio judria faze [4]. Ši chromatografijos rūšis gali būti atliekama kolonėlėse arba plokštuminiame formate.
Skysčių chromatografijoje nejudančioji fazė yra kietas kūnas (sorbentas), judančioji fazė yra skystis (eliuentas). Šiai chromatografijos rūšiai gali būti naudojami visi atskyrimo mechanizmai: adsorbcija, pasiskirstymas, jonų mainai ir kt.
Galimi du šio metodo variantai: 1. normalių fazių chromatografija 2. atvirkštinių fazių chromatografija. Jų skirtumai:
1. Normalių fazių – absorbentas polinis (pvz., silikagelis), eliuentas nepolinis (pvz., heksanas), tiriamosios medžiagos yra polinės.
2. Atvirkštinių fazių – absorbentas yra nepolinis (pvz., silikagelis su prijungtomis prie jo paviršiaus alkilgrupėmis), eliuentas – polinis (pvz., vanduo, alkoholiai), tiriamos medžiagos – bet kokio poliškumo [5].
3.8.3 Sorbentų, eliuentų, kolonėlių parinkimas
Mišinio komponentų atskyrimo sėkmė priklauso nuo tinkamo kolonėlės, sorbento, eliuento, tirpiklio ir eksperimento sąlygų parinkimo. Efektyviosios skysčių
chromatografijos metu eliuentas turi didelę reikšmę. Nejudančios fazės derinių skaičius ribotas [5], jais gali būti kietos medžiagos susmulkintos iki tam tikro laipsnio (50 iki 1000 m2/g) [5], todėl eliuentai gali būti pasirenkami ir naudojami įvairių santykių mišiniais, be to yra galimybė keisti eliuento sudėtį ir santykį chromatografavimo metu (gradientinis režimas). Tai leidžia išskirti įvairios kilmės medžiagų mišinius [5]. Parenkant tirpiklius, vadovaujamasi šia taisykle: nepoliniai absorbentai absorbuoja iš polinių tirpiklių daug geriau negu iš nepolinių [4].
Kolonėlės pasirinkimas sudėtingas procesas, jis glaudžiai susijęs su chromatografijos efektyvumo ir skirstymo tikslumu. ESC įkrovos matrica (kolonėlės užpildas – sorbentas) gali būti neorganinės arba organinės kilmės polimerinė medžiaga. Dažniausiai naudojamos neorganinės kilmės matrica silikagelis ir aliuminio oksidas. Normalių fazių chromatografijoje naudojamas nemodifikuotas silikagelis ar aliuminio oksidas, o atvirkštinių fazių chromatografijoje – silikagelis su chemiškai prijungtais angliavandenilių ligandais, granitinė anglis ar stireno-divinilbenzenas. Kolonėlės taip pat turi prieškolonėles, kurios skirtos apsaugoti kolonėlę nuo užteršimo. Tai prailgina kolonėlės naudojimo laiką. Prieškolonėlė – tai trumpi cilindriniai segmentai, pakrauti dažniausiai tos pačios sorbcijos medžiagomis [4].
3.8.4 Detektoriai
Svarbi efektyviosios skysčių chromatografo dalis yra detektorius, kuris fiksuoja ištekančio iš kolonėlės srauto sudėties kitimą. Nuo detektoriaus darbo parametrų priklauso chromatografo jautrumas ir gautų rezultatų tikslumas. Daugelis junginių sugeria UV spinduliuotę ir išspinduliuoja didesnio bangos ilgio spinduliuotę tiesiogiai (fluorescencija) arba po tam tikros laiko trukmės (fosforescencija). Paprastai išspinduliuotos ir absorbuotos energijos santykis yra mažas. Tačiau kai kuriems
junginiams ši reikšmė siekia 0,1-1. Tokiems junginiams tinka fluorescencinė detekcija. Savaime fluorescuojantys junginiai turi konjuguotą ciklinę struktūrą (policikliniai aromatiniai angliavandeniliai). Daugelis nefluorescuojančių junginių gali būti perversti į fluorescuojančią formą, naudojant atitinkamus reagentus. Fluorescuojančių junginių nustatymui ESC yra naudojamas fluorescencinis detektorius, kuris pasižymi dideliu jautrumu (iki 1000 kartų jautresnis už UV detektorių) ir skiriamosios gebos fluorescencine detekcija, todėl tinka kiekybinei tikslinių medžiagų analizei mažų koncentracijų lygyje [4].
3.8.5 Duomenų registravimas ir apdorojimas
Duomenų registravimui, rezultatų apskaičiavimui bei ataskaitos paruošimui naudojamos duomenų registravimo bei apdorojimo programos. Savirašis brėžia iš detektoriaus gaunamo elektrinio signalo priklausomybę trukmės atžvilgiu, tai yra tam tikru laiku iš detektoriaus yra gaunamas signalas ir pagal jį brėžiama chromatograma. Kiekviena medžiaga yra sulaikoma detektoriuje ir perduodama iš jo į savirašį tik po tam tikro laiko. Fiksuojant detektoriumi ištekančio iš kolonėlės srauto sudėties kitimą, gaunama chromatograma. Medžiagų mišinio chromatografinio atskyrimo rezultatų išraiška yra chromatogramos parametrai, vadinamieji sulaikymo parametrai.
Kokybinė analizė – šios analizės metu siekiama: ar bandinys turi ieškomąją analitę; ar analitė gali būti atskirta nuo kitų komponenčių; ar chromatografinė smailė neturi priemaišų. Kokybiniam nustatymui pakanka eliucijos trukmės ar spektro sutapimo [5].
Kiekybinė analizė – šios analizės uždavinys yra nustatyti bandinio komponentų kiekius/koncentracijas. Tikslas gali būti pasiektas keliais kiekybiniais analizės metodais:
1. Išorinio standarto 2. Vidinio standarto
Taip pat kiekybiniai metodai dar gali būti skirstomi į kalibruotus arba nekalibruotus, pastarieji yra paprasčiausi iš procentinės analizės būdų. Procentinę bandinio sudėtį nustatome pagal smailių plotų arba aukščių santykį su bendru, suminiu smailių plotu arba aukščiu.
metodas. Atliekant analizę šiuo metodu, braižomas tapatus analitei etalono kalibracinės kreivės grafikas ir analogiškomis chromatografinėmis sąlygomis atliekama nežinomos koncentracijos bandinio analizė. Nežinomos koncentracijos analitės smailė palyginama su matuojamojo signalo priklausomybės nuo kiekio kalibracine kreive. Atliekant kiekybinę analizę išorinio standarto metodu būtina įleisti pastovų bandinio kiekį.
Vidinio standarto metodas pranašesnis už išorinio standarto metodą, kadangi papildomai naudojamas antrasis junginys, kurio vienodas ir tikslus kiekis dedamas tiek į kalibracinius etalono tirpalus, tiek į nežinomos koncentracijos bandinį. Šis junginys atlieka vidinio standarto vaidmenį. Pasirinktas vidinis standartas chemine sandara ir chromatografinėmis savybėmis turi būti panašus į tiriamąją analitę, tačiau chromatografijos metu turi visiškai atsiskirti nuo analitės smailės [4].
4. Tyrimo objektai ir metodikos
4.1 Tyrimo objektai
4.1.1 Gyvūnai
Eksperimentai buvo atlikti su baltomis, vyriškos lyties laboratorinėmis pelėmis, sveriančiomis 20-25 g. (Valstybinės veterinarijos tarnybos leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais Nr. 0153). Prieš eksperimentą sveiki gyvūnai aklimatizuoti laboratorinėmis sąlygomis. Pelės atrinktos atsitiktiniu būdu, suskirstytos į grupes ir pasvertos. Ibogainas ir noribogainas sunkiai tirpsta vandenyje, todėl įvedimui naudota jų suspensija. Tiriamos medžiagos buvo įvedamos zondu per os į pelės skrandį. Kontrolinės grupės pelėms pagal tą pačią schemą buvo įvedamas atitinkamas kiekis fiziologinio tirpalo. Vidaus organai ( kepenys, inkstai, smegenys, širdis, blužnis ir raumuo) paimti po 15min., 30min., 2val., 4val., 6val., 8val., 16val., 24val. ir užšaldyti -400C temperatūroje. Vėliau su jais atlikti tyrimai dėl ibogaino ir noribogaino pasiskirstymo organuose.
4.2 Metodikos
4.2.1 Noribogaino ir ibogaino išskyrimas iš biologinių objektų
Norėdami ištirti ibogaino ir noribogaino pasiskirstymą pelių organuose, visų pirmiausia reikėjo šias medžiagas išskirti iš biologinių objektų. Tačiau dėl organuose esančių įvairių medžiagų (baltymų ir pan.), reikėjo atlikti šių balastinių medžiagų valymą. Atlikus literatūrinių šaltinių analizę rasti keli valymo budai: kietos fazės ekstrakcija, plonasluoksnė chromatografija, ekstrakcija skystis-skystis. Tyrimai parodė, kad dėl didesnio efektyvumo ir geresnio balastinių medžiagų pašalinimo kietos fazės ekstrakcija tinkamaiusias metodas. KFE tyrime naudotos SPE Oasis HLB, Supelclean LC-18 SPE, Supelclean ENVI-18 SPE kolonėles. Geriausiai balastines medžiagas pašalino SPE Oasis HLB kolonėlės. Kolonėlės aktyvinimui naudojamas 1ml metanolio, po to plaunama 1ml distiliuotu vandeniu.
Organo paruošimas. Organas du kartus plaunamas 0,9 % natrio chlorido tirpale po 30s, kad nuplauti kraują. Nusausinimui organas dedamas ant filtrinio popieriaus. Sutrinamas sveriamas 50 – 350mg (tikslus svoris), atsižvelgiant į organo dydį: kepenys apie 350mg, blužnis apie 65mg, inkstai apie 100mg, smegenys apie 200mg, raumuo apie 200mg, širdis apie 50mg. Pasvertas organas patalpinamas į centrifūginį mėgintuvėlį ir užpilamas 300 µl plazmos. Mėginį 20s gerai sumaišome vibracine maišykle ir paliekame 4oC temperatūroje 24 valandoms.
Mėginio paruošimas. Į mėgintuvėlį, kuriame yra plazma užpiltas organas pilame 0,5ml koncentruota acto rūgštimi parūgštinto vandens 100ml/l (1 proc.) ir 20µl vidinio standarto fluoresceino (20,1 mg/l). Mėginį gerai sumaišome ir centrifuguojame 20min. 1500 apsukų per minutę. Centrifūgatas atsargiai nutraukiamas ir pilamas į paruoštą kolonėlę, kuri buvo aktyvinta 1ml metanolio ir praplauta 1ml vandens. Kolonėlė praplaunama 2ml distiliuoto vandens, tam, kad išplauti balastines medžiagas ir priemaišas, po to 2min. džioviname vakumu. Tiriamos medžiagos išplovimui pilame 2ml metanolio, kurį renkame į iš anksto paruoštą švarų mėgintuvėlį. Surinktą ištrauką
džioviname azoto srove kol lieka sausas likutis, jį tirpiname 100µl mobilioje fazėje (15 proc. acetonitrilo ir 85 proc. 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalo). 10 µl šio tirpalo injekuojama į chromatografą.
4.2.2 Efektyvioji skysčių chromatografija
Prieš atlikdami tyrimą turėjome pasirinkti tinkamą metodiką ir ją pritaikyti savo darbui. Metodiką pasirinkome nagrinėdami literatūrinius šaltinius, kuriuose buvo atlikta ibogaino ir noribogaino analizė. Dažniausiai literatūros šaltiniuose buvo minima efektyvioji skysčių chromatografijos su masių spektrometrijos detekcija. Buvo naudota Zorbax eclipse XD8 C8 kolonėlė, mobilioji fazė acetonitrilas su trimetilaminu ir amonio esterio buferiniu tirpalu. Vidinis standartas buvo naudotas fluoresceinas. Pasirinkome efektyviąją skysčių chromatografiją su fluorescenciniu detektoriumi, dėl pastarojo efektyvumo ir didelio jautrumo, vidiniu standartu naudojant fluoresceiną. Tyrimui rinkomės kolonėlę tiriamųjų medžiagų atskyrimui. Tyrimai buvo atlikti su SunFire C18 ( 15cm x 3.0 mm x 3,5 µm), Supelco LC18 (15cm x 4.6mm x 5,0 µm) ir Xterra RP18 (3x150mm) . Efektyviausia pasirinkta kolonėlė Xterra (RP18). Analizei atlikti naudotas chromatografas „Waters 2695“ su fluorescenciniu detektoriumi „Waters 474“. Kolonėlė Xterra (RP18) 3x150mm, su prieškolonėle 3,9x20mm, sorbento dalelių dydis – 3,5µm. Bangos ilgiai pasirinkti pagal anksčiau atliktus tyrimus, aprašytus moksliniuose straipsniuose. Fluorescencija sužadinama 230nm bangos ilgio spinduliais, matuojama fluorescencija prie 336nm bangos ilgio. Vidinio standarto (fluoresceino) fluorescencija sužadinama 440nm bangos ilgio spinduliais, o matuojama fluorescencija prie 514nm bangos ilgio. Injekuota 10µl tiriamojo tirpalo. Eliuavimas – gradientinis, gradiento tėkmės greitis – 0,4ml/min. Eliuentas A – acetonitrilas, eliuentas B – 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalas. Taikytas šis gradiento kitimas: 0min–7min. – 15 proc. A ( 85 proc. B), 20min. – 80 proc. A ( 20 proc. B), 22min. – 100 proc. A (0 proc. B), 25min. – 15proc. A ( 85 proc. B). Duotomis sąlygomis noribogaino sulaikymo laikas 9,4min., ibogaino – 15,2min. Iš nubraižytų chromatogramų apskaičiuojamos medžiagų koncentracijos tam tikrame organe.
5. Rezultatai ir jų aptarimas
Tyrimai parodė, kad gautuose mėginiuose iš pelių organų nustatyti ibogainą ir noribogainą negalima, nes tam trukdo kartu išsiekstragavusios pašalinės lydinčios medžiagos. Dėl to jas reikėjo pašalinti, tam buvo panaudotas vienas iš valymo būdų – kietos fazės ekstrakcija. Mūsų eksperimentai parodė, kad efektyviausiai balastinių medžiagų išvalymui tinka kietos fazės ekstrakcija, naudojant SPE Oasis HLB kolonėles.
Metodo validavimui naudota žmogaus kraujo plazma. Norint nusodinti 0,5ml plazmoje esančius baltymus pilama 0,5ml vandens, parūgštinto 1 proc. koncentruota acto rūgštimi. Ibogaino ir noribogaino nustatymui tirpalas ruošiamas į 0,5ml plazmos įpilant 20µL vidinio standarto fluoresceino (20,1 mg/l) ir 100μl tirpalo, kuriame ištirpintos tiriamos medžiagos. Abu mėginiai maišomi ir centrifuguojami 20min. 1500 apsukų per minutę. Pagal anksčiau nurodytą metodiką gauname sausą likutį, kurį ištirpinus 100µl mobilioje fazėje (15 proc. acetonitrilo ir 85 proc. 0,1 proc. TFA) 10µl įvedama į chromatografą. Atlikus chromatografiją be tiriamųjų medžiagų kraujo plazmoje (7 pav.) nustatytos skirtingų aukčių ir plotų chromatografinės smailės, kurios rodo, kad darbo metu naudota kietos fazės ekstrakcija visiškai balastinių medžiagų neišvalo. Tačiau šios smailės netrukdo nustatyti tiriamas medžiagas (8 pav.) pelių organuose, nes noribogaino sulaikymo laikas 9,4min., ibogaino 15,2min., o fluoresceino 18,6min., kurių vietoje pašalinių smailių nėra.
8 pav. Chromatograma su tiriamosiomis medžiagomis: 1-noribogainas,
2-ibogainas, 3-fluoresceinas.
Tiriamųjų kontrolinės ir tiriamosios grupės pelių raumens (12, 13, 14 pav.) ir blužnies (9, 10, 11 pav.) chromatogramos:
10 pav. Tiriamoji blužnis su ibogainu: 1 – noribogainas, 2 – ibogainas, 3 –
fluoresceinas.
11 pav. Tiriamoji blužnis su noribogainu: 1 – noribogainas, 3 –
12 pav. Kontrolinės pelės raumens chromatograma.
13 pav. Tiriamasis raumuo su ibogainu: 1 – noribogainas, 2 – ibogainas, 3 –
14 pav. Tiriamasis raumuo su noribogainu: 1 – noribogainas, 3 –
fluoresceinas.
Tiriamų medžiagų kiekybiniam nustatymui sudarytas kalibracinis grafikas naudojant vidinį standartą. Jo sudarymui pagaminti tirpalai su kraujo plazma (0,5ml), į kurią įpilta 20µl vidinio standarto fluoresceino (20,1 mg/l) ir 100μl atitinkamos koncentracijos darbinio tirpalo. Prieš atliekant paruoštų tirpalų kietos fazės ekstrakciją kiekvienas jų sumaišomas vibracine maišykle ir paliekamas 20oC temperatūroje 20min., kad gerai susimaišytų su rišamąja medžiaga.
Kalibracinis grafikas sudarytas tiriamos medžiagos ir vidinio standarto plotų santykio priklausomybės nuo tiriamos medžiagos koncentracijos būdu. Vidinio standarto koncentracija parenkama tokia, kad jo duotas pikas būtų apylygis vidutinių koncentracijų pikams.
Ibogainas
y = 0,0007x + 0,0041 R2 = 0,986 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 0 500 1000 1500 2000 2500 Koncentracija ng/ml S a n ty k is15 pav. Ibogaino kalibracinis grafikas.
Noribogainas
y = 0,0004x + 0,0154 R2 = 0,9968 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 0 1000 2000 3000 4000 5000 Koncentracija ng/ml Sa n ty k is16 pav. Noribogaino kalibracinis grafikas.
Norint nustatyti ibogaino (15 pav) ir noribogaino (16 pav) pasiskirstymą pelių organuose, grafike rasta medžiagos koncentracija perskaičiuojama
pagalba tiesiai pelėms į skrandį, didžiausia koncentracija randama pelių blužnyje, o mažiausia – raumenyse (1 lentelė, 17 pav). Tokius rezultatus gali įtakoti tai, kad blužnis yra organas, valantis kraują nuo kenksmingų medžiagų. Blužnyje greičiausiai ir daugiausiai susikaupia tiriamoji medžiaga, o raumuo linkęs pasisavinti tik jam reikalingas, atėjusias su krauju, medžiagas.
1 lentelė. Ibogaino ir noribogaino pasiskirstymas pelių organuose.
0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 20,00% 25,00% 30,00% 35,00% 40,00% 45,00% 50,00%
Širdis Raumuo Smegenys Inkstai Blužnis Kepenys
Ibogainas Noribogainas
17 pav. Ibogaino ir noribogaino pasiskirstymo organuose grafikas.
Organai Ibogainas Noribogainas
Širdis 13,74% 22,68% Raumuo 3,13% 4,22% Smegenys 23,79% 9,15% Inkstai 20,66% 12,33% Blužnis 29,86% 46,25% Kepenys 8,82% 5,37%
Literatūros duomenimis, injekavus ibogainą žiurkėms į pilvo ertmę ir į paodį nustatyta, kad didžiausia medžiagos koncentracija susidaro smegenyse ir riebaliniame audinyje praėjus vienai valandai po jos įvedimo.
Tyrimo eigoje sudarėme ibogaino ir noribogaino koncentracijos priklausomybės nuo laiko grafikus. Plazmoje nustatyta, kad bėgant laikui ibogaino koncentracija didėja, po kiek laiko pradeda mažėti (18pav). Noribogaino koncentracija plazmoje kinta taip pat kaip ir ibogaino (19pav).
Ibogainas 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 1 2 3 4 5 6 7 Laikas, val. K o n ce n tr a ci ja n g /m l Ibogaina s
Noribogainas 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Laikas, val. K o n ce n tr a ci ja n g /m l Noribogainas
6. Išvados
1. Tiriamųjų medžiagų ( ibogaino, noribogaino ) išskyrimui iš biologinių objektų pritaikyta kietosios fazės ekstrakcija, panaudojant SPE Oasis HLB kolonėles.
2. Kiekybiniam ibogaino ir noribogaino nustatymui panaudotas ESC metodas su fluorescenciniu detektoriumi.
3. Atlikus ibogaino ir noribogaino pasiskirstymo pelių organuose analizę, gauti tokie rezultatai: didžiausios noribogaino (46,25 proc.), ibogaino (29,86 proc.) koncentracijos nustatytos blužnyje, mažiausios koncentracijos raumenyje: ibogaino (3,13 proc.), noribogaino (4,22 proc.).
Santrauka
Mindaugas Marksa. Vadovai: prof.L.Ivanauskas. Ibogaino ir noribogaino pasiskirstymas pelių organuose.
Raktiniai žodžiai:
ibogainas, noribogainas, chromatografija, kietos fazėsekstrakcija, pasiskirstymas.
Tyrimo objektas ir metodai:
Ibogainas ir noribogainas, laboratorinėspelės, kietos fazės ekstrakcija, kiekybiniam nustatymui naudota ESC – efektyvioji skysčių chromatografija su fluorescenciniu detektoriumi.
Darbo tikslas:
Nustatyti ibogaino ir noribogaino pasiskirstymą pelių organuose.Darbo uždaviniai:
atlikti mokslinės literatūros apžvalgą. Pasirinkti tyrimometodiką ir ją pritaikyti ibogaino, noribogaino pasiskirstymo nustatymui pelių organuose.
Išvados:
atlikta mokslinės literatūros apžvalga ir palyginta su mūsų atliktais tyrimais. Pritaikyta tyrimo metodika. Tyrimo metu įvertinus duomenis, nustatyta, kad didžiausios dozės tiek ibogaino, tiek noribogaino yra blužnyje, o mažiausios raumenyje.Summary
Mindaugas Marksa. Head: prof.L.Ivanauskas. Distribusion of ibogaine and noribogaine in mice organs.
Key words:
ibogaine, noribogaine, chromatography, tight phaze extraction,distribusion.
Object and methods:
ibogaine and noribogaine, laboratory mice, tight phaze extraction, assay analysis has been performed by HPLC method with fluorescence detector.Aim:
to find the distribusion of ibogaine and noribogaine in white miceorgans.
Objective:
to perform analysis of scientific literature. To choose the method for appreciate distribusion of ibogaine and noribogaine in mice organ‘s.Rezults:
to perform analysis of scientific literature and compare to ours research. To accomplish our material we do the conclusion that bigest doses of ibogaine and noribogaine was in spleen, the least doses in muscle.
7. Literatūros sąrašas
1. Kazlauskas, S., Kontramavičiūtė, V., Sveikata, A. Ibogaino vartojimas
toksikomanijoms gydyti. Neurocheminis ir farmakologinis veikimas; Medicina 2004 . p. 216-217.
2. Kubilienė, A., Marksienė, R., Kazlauskas, S., Sadauskienė, I., Ražukas, A., Ivanov, L. Ūminis ibogaino ir noribogaino toksiškumas; Medicina 2008 .p. 984-988.
3. Kontramavičiūtė, V., Mathieu, O., Mathieu-Daudé, Jean-Claude., Vainauskas, P., Casper, T., Baccino, E., Bressolle, Françoise, M.M. Distribution of Ibogaine and Noribogaine in a Man Following a Poisoning Involving Root bark of the Tabernanthe iboga Shrub. Journal of analytical toxicology; 2006 .p. 434-440.
4. Maruška, A., Kornyšova, O., Machtejevas, E. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai; 2005 .p. 9-18, 55-150.
5. Mickevičius, D. Cheminės analizės metodai 2 dalis; 1999 .p. 168-169, 175-179.
6. Aceto, M.D., Bowman, E.R., Harris, L.S. Dependence studies of new compounds in the rhesus monkey and mouse. NIDA Research Monograph; 1992 .p. 119, 513-558.
7. Alper, K.R, Lotsof, H.S., Frenken, G.M., Luciano, D.J., Bastiaans, J. Treatment of acute opioid withdrawal with ibogaine. American journal on addictions; 1999 . p. 234-244.
8. Alper, K.R. Ibogaine: A review. The alkaloids: chemistry and biology; 2001 .p. 56, 1-138.
9. Alper, K.R., Lotsof, H.S., Kaplan, C.D. The ibogaine medical subculture; 2007.
10. Baumann, M.H., Rothman, R.B., Pablo, J.P., Mash, D.C. In vivo neurobiological effects of ibogaine and it‘s O-desmethyl metabolite, 12 – hydroxyibogamine
(noribogaine), in rats. Journal of pharmacology and experimental therapeutics; 2001 .p. 297, 531-539.
11. Bartlett, M.F., Dickel, D.F., Taylor, W.I. The alkaloids of Tabernanthe iboga. Part IV. The structures of ibogamine, ibogaine, Thabernanthe and Voacangine; 1937 .p. 126.
12. Breitmaier, E. Alkaloide – Stuttgart/Leipzig/Wiesbaden, B.G. Teubner Gmbh; 2002 .p. 192.
13. Cappendijk, S.L., Dzoljic, M.R. Inhibitory of ibogaine on cocaine self-administration in rats. European journal of pharmacology; 1993 .p. 241, 261-265.
14. Delorenzi, J.C., Freire- de- Lima, L., Gattass, C.R., de Andrade Costa, D., He, L., Keu ohne, M.E., Saraiva, E.M. In vitro activities of iboga alkaloid congeners and 18-methoxycoronaridine against Leishmania amazonensis. Antimicrobial agents and chemotherapy; 2002 .p. 46, 2111-2115.
15. Dybowski, J., Landrin,E. „Plant Chemistry. Cincerning iboga, it‘s exsitement-producing properties, it‘s composition, and the new alkaloid it contains, ibogaine“. C.R.Acad.Sci. 133: 748. http://ibogaine.desk.nl/dybowski.html. Retrieved 2006-06-23.
16. Dzoljic, E.D., Kaplan, C.D., Dzoljic, M.R. Effect of ibogaine on naloxsone-precipitated withdrawal syndrome in chronic morphine-dependent rats. Archives Internationales de pharmacodynamie et de therapie; 1988 .p. 294, 64-70.
17. Dworkin, S.I., Gleeson, S.D.M., Koves, T.R., Martin, T.J. Effects of ibogaine on responding maintained by food, cocaine and heroin reinforcement in rats.
Psychopharmacology; 1995 .p. 117, 257-261.
18. Fernandez, J.W. Bwiti: An Etnography of religious imagination in Africa. Princeton university press, Princeton, NJ; 1982.
19. Frances, B., Gout, R., Cros, J., Zajac, J.M. Effects of ibogaine on naloxone-precipitated withdrawal in morphine-dependent mice. Fundamental and Clinical Pharmacology; 1992 .p. 6, 327-332.
20. Glick, S.D., Rossman, K., Steindorf, S., Maisonneuve, I.M., Carlson, J.N. Effects and after effects of ibogaine on morphine self-administration in rats. European journal of pharmacology; 1991 .p. 195, 341-345.
21. Glick, S.D, Keuhne, M.E., Raucci, J., Wilson, T.E., Larson, D., Keller, Jr., R.W., Carlson, J.N. Effects of iboga alkaloids on morphine and cocaine selfadministration in rats: relationship to tremorigenic effects on dopamine release in nucleus accumbens and stratium. Brain reaserch; 1994 .p. 657, 14-22.
22. Glick, S.D., Maisonneuve, I.M., Dickison, H.A. 18 – MC reduces methamphetamine and nikotine self-administration in rats. Neuroreport; 2000 .p. 11, 2013-2015.
23. Glick, S.D., Maisonneuve, I.M., Visker, K.E., Fritz, K.A., Bandarage, U.K., Keuhne, M.E. 18-Methoxycoronaridine attenuates nikotine-induced dopamine release and nikotine preferences in rats. Psychopharmacology; 1998 .p. 139, 274-280.
24. Glick, S.D., Keuhne, M.E., Maisonneuve, I.M., Bandarage, U.K., Molinari, H.H. 18-Methoxycoronaridine, a non toxic iboga alkaloid congener: effects on morphine and cocaine self-administration and on mesolombic dopamine release in rats.
25. Glick, S.D., Maisonneuve, I.M., Szumlinski, K.K. Mechanisms of action of ibogaine: relevance to putative therapeutic effects and development of a safer iboga alkaloid congener. The Alkaloids: Chemistry and Biology; 2001 .p.56, 39-53.
26. He, Dao-Yao., McGough, Nancy N.H., Ravindranathan, A., Jeanblanc, J., Logrip, Marian L., Phamloung, K., Janak, Patricija H., Ron, D. Glial cell line-derived
neurothropic factor mediates the desirable actions of the anti-addiction drug ibogaine against alcohol consuption. The journal of neuroscience; 2005 .p. 619-628.
27. He, Dao-Yao., Dorit, R. Autoregulation of glial cell line-derived neurothropic factor expression: implications for the long-lasting actions of the anti-addiction drug, ibogaine. The FASEB journal; 2006 .p. 1820-1821.
28. Hesse, M. Alkaloide. Flucht oder segent der natur?-Zurich: Verlag helvetica chimica acta; 2000 .p. 420.
29. Yordanov, M., Dimitrova, P., Patkar, S., Falcocchio, S., Xoxi, E., Saso, L., Ivanovska, N. Ibogaine reduces organ colonization in murine systemic and gastrointestinal Kandida albicans infection. Journal of medical microbiology; 2005 .p. 54, 647-653.
30. Kam, T.S., Sim, K.M., Pang, H.S., Kolona, T., Hayashi, M., Komiyama, K. Cytotoxic effects and reversal of multidrug resistance by ibogan and related indole alkaloids. Bioorganic and medicinal chemistry letters; 2004 .p. 14, 4487-4489.
31. Landrin, A. Science Pharmacology. 1905 .p. 11.
32. Leal, M.B., Michelin, K., Souza, D.O., Elisabetsky, E. Ibogaine attenuation of morphine withdrawal in mice: role of glutamate N-methyl-d-aspartate receptors. Progress i neuro-psychopharmacology and biological psychiatry; 2003 .p. 27, 781-785.
33. Lotsof, H.S., Alexander, N.E. Case studies of ibogaine treatmens: implications for patient management strategies. The alkaloids: chemistry and biology; 2001 .p. 56, 293-313.
34. Maisonneuve, I.M., Keller, Jr., R.W., Glick, S.D. Interactions of ibogaine and
d-amphetamine: in vivo microdiayisis and motor behavior in rats. Brain research; 1992 .p. 579, 87-92.
35. Maisonneuve, I.M., Glick, S.D. Anti-addictive actions of an iboga alkaloid congener: a novel mechanism for a novel treatment. Pharmacology biochemistry and behavior; 2003 .p. 75, 607-618.
36. Mach, D.C., Kovera, C.A., Pablo, J., Tyndale, R.F., Ervin, F.D., Williams, I.C., Singleton, E.G. Ibogaine: complex pharmacokinetics, concerns for safety, and preliminary efficacy measures .p. 395-396.
37. Mach, D.C., Kovera, C.A., Pablo, J., Tyndale, R.F., Ervin, F.D., Kamlet, J.D., Hearn, W.L. Ibogaine in the treatment of heroin withdrawal. The alkaloids: chemistry and biology ; 2001 .p. 56, 155-171.
38. O‘Hearn, E., Molliver, M.E. The olivocerebellar projection mediates ibogaine-induced degeneration of purkinje cells: a model of indirect, trans-synaptic excitotoxicity. The journal of neuroscience; 1997 .p. 17, 22.
40. Pace, C.J., Glick, S.D., Maisonneuve, I.M., He, L.W., Jokiel, P.A., Kuehne, M.E., Fleck, M.W. Novel iboga alkaloid congeners block nicotinic receptors and reduce drug self-administration. European journal of pharmocology; 2004 .p. 241, 261-265.
41. Panchal, V., Taraschenko, O.D., S.D., Maisonneuve, I.M. Attenuation of morphine withdrawal signs by intracerebral administration of 18-Methoxycoronaridine. European journal of pharmocology; 2005 .p. 525, 98-104.
42. Pearl, S.M., Hough, L.B., Boyd, D.L., Glick S.D. Sex difference in ibogaine antagonism of morphine-induced locomotor activity and in ibogaine brain levels metabolism; 1997.
43. Popik, P., Layer, R.T., Skolnick, P. 100 years of ibogaine: neurochemical and pharmacological actions of putativen anti-addictive drug; 1995.
44. Rabin, R.A., Winter, J.C. Ibogaine and noribogaine potentiate the inhibition of adenylyl cyclase activity by opioid and 5-HT receptors. European Journal of Pharmacology; 1996 .p. 316, 343-348.
45. Rastogi, N., Abaul, J., Goh, K.S., Devallois, A., Philogene, E., Bourgeois, P. Antimycobacterial activity of chemically defined natural substances from the caribbean flora in guadeloupe. FEMS immunology and Medical Microbiology; 1998 .p. 20, 267-273.
46. Rezvani, A.H., Overstreet, D.H., Lee, Y.W. Attenuation of alcohol intake by ibogaine in three strains of alcohol-preferring rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior; 1995 .p. 52, 615-620.
47. Rho, B., Glick, S.D. Effects of 18-Methoxycoronaridine on acute signs of morphine withdrawal in rats.
48. Samorini, G. „The Bwiti religijon and the psychoactive plant Tabernanthe iboga (Equatoriel Afrika)“. The originally published in Integration 5; .p. 105-114.
49. Silva, E.M., Cirne-Santos, C.C., Frugulhetti, I.C., Galvao-Castro, B., Saraiva, E.M., Kuehne, M.E., Bou-Habib, D.C. Anti- HIV- 1 activity of yhe iboga alkaloid congener 18-Methoxycoronaridine. Planta medica; 2004 .p. 70, 808-812.
50. Snelders, S., Kaplan, C. LSD therapy in Dutch psychiatry: changing socio-political settings and medical sets. Medical History; 2002 .p. 46, 221- 240.
51. Schmid, P.B. Die psychische wirkung von ibogaline-hydrochlorid ( The psychological effect of ibiogalin hidrochloride). Arzneimittel-Forshung; 1967 .p. 17, 485-490.
52. Schneider, J.A., Sigg, E.B. Neuropharmacological studies on ibogaine, an indole alkaloid with central-stimulant properties. Annals of the New York Academy of Sciences; 1957 .p. 66, 765-776.
53. Taylor, W.I. J. Am. Chem. Soc.; 1957 .p. 79.
54. Turner, W.J., Merlis, S., Carl, A. Concerning theories of indoles in schizophrenigenesis. American Journal of Psychiatry; 1955 .p. 112, 466-467.
55. Internetinė prieiga: http://gamta.vdu.lt/mokytojai/kursai/Skirstymo mokslas.
56. Internetinė prieiga: www.Ethnogarden.com, 2006. Ethnogarden botanicals: ibogaine HCl and iboga pure alkaloid extract (Tabernanthe iboga).
