MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
LUKA ŠIATKUTĖ
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA PURPUREA L. MOENCH) ŠAKNŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS TYRIMAS, KAPSULIAVIMAS BEI
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS Magistro baigiamasis darbas
Vadovė: prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantas: prof. habil. dr. Arūnas Savickas
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis,
Data
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA PURPUREA L. MOENCH) ŠAKNŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS TYRIMAS, KAPSULIAVIMAS BEI
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas
prof. habil. dr. Arūnas Savickas Data Recenzentas ... ... Data Darbo vadovė
prof. dr. Nijolė Savickienė Data Darbą atliko Magistrantė Luka Šiatkutė Data KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 10
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
1.1. Augalų baltymai ir jų funkcijos ... 14
1.2. Augalų baltymų antioksidantinis aktyvumas... 14
1.3. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų cheminė sudėtis ... 15
1.4. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymai ... 16
1.5. Rausvažiedžių ežiuolių vaistinės augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas ... 17
1.6. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų kokybinė – kiekybinė analizė ... 18
1.6.1. Baltymų frakcionavimas ... 18
1.6.2. Kokybinis baltymų nustatymas ... 20
1.6.3. Baltymų kiekybinis nustatymas ... 22
1.7. Vaisto formos su baltymais ... 23
1.8. Kietųjų kapsulių gamyba ... 24
1.9. Kietųjų kapsulių tirpimo testas ... 26
2. TYRIMO METODIKA ... 28 2.1. Tyrimo medžiagos ... 28 2.1.1. Reagentai ... 28 2.1.2. Reagentų paruošimas ... 29 2.1.3. Įranga ... 31 2.2. Tyrimo metodai ... 31
2.2.1. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 31
2.2.2. Baltymų frakcionavimas ... 32
2.2.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas ... 33
2.2.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas ... 35
2.2.5. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų gamyba ir kapsulių masės vienodumo nustatymas ... 36
2.2.6. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas ... 37
2.2.7. Kietųjų kapsulių su rausvažiedžių ežiuolių baltymais antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 38
2.2.8. Statistinis duomenų vertinimas... 39
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 40
3.1. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas ... 40
3.2. Baltymų frakcionavimas ... 41
3.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas... 42
3.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas NaDS-PAGE metodu ... 43
3.5. Kietųjų kapsulių su rausvažiedžių ežiuolių baltymais gamyba ir atsipalaidavimas ... 44
3.6. Kietųjų kapsulių antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 45
4. IŠVADOS ... 46
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS TOLIMESNIEMS TYRIMAMS ... 47
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48
SANTRAUKA
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA
PURPUREA L. MOENCH) ŠAKNŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS
TYRIMAS, KAPSULIAVIMAS BEI ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO NUSTATYMAS
Lukos Šiatkutės magistro baigiamasis darbas. Darbo vadovė – prof. dr. Nijolė Savickienė1
. Konsultantas – prof. Arūnas Savickas2.
1Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra, Kaunas. 2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės
farmacijos katedra, Kaunas.
Darbo tikslas: Kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pagaminti kietąsias kapsules su šiais baltymais ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti, ar baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pasižymi antioksidantiniu aktyvumu. 2. Išskirstyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, į atskiras frakcijas pagal molekulių dydį. 3. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, koncentraciją. 4. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, molekulinę masę. 5. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, bei įvertinti baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių. 6. Įvertinti kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, antioksidantinį aktyvumą.
Darbo metodai: 1. Baltymų antioksidantinis aktyvumas nustatytas 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalų-katijonų surišimo metodu. 2. Baltymai išskirstyti, naudojantis gelchromatografijos metodu. 3. Kiekybiškai baltymų koncentracija frakcijose nustatyta spektrofotometriniu Bradford metodu. 4. Baltymų molekulių dydis nustatytas natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės (NaDS-PAGE) metodu. 5. Kietosios kapsulės gamintos, naudojant rankomis pildomą kapsuliavimo mašinėlę. Atliktas kietųjų vaisto formų tirpimo testas krepšelio metodu. 6. Kietųjų kapsulių antioksidantinis aktyvumas įvertintas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu.
Tyrimo rezultatai: 1. 100 µl baltymų, išskirtų iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, tirpalo suriša 53,59 ± 2,65 proc. ABTS radikalų-katijonų. 2. Baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pagal molekulių dydį suskirstyti į 38 frakcijas. 3. Gelchromatografijos metodu išskirstytose baltymų frakcijose nustatytas baltymų kiekis svyravo nuo 1,259 ± 0,097 µg/ml iki 6,068 ± 0,417 µg/ml. 4. Daugiausiai
baltymų turinčiose frakcijose nustatytos 14, 25, 30, 35, 36 ir 120 kDa baltymų molekulinės masės. 5. Didžiausias baltymų atsipalaidavimas iš pagamintų kietųjų kapsulių stebimas po 60 min (25,73 ± 0,793 proc). 6. Didžiausias baltymų antioksidantinis aktyvumas – 22,00 ± 1,56 proc., stebėtas, praėjus 15 min nuo kietųjų kapsulių tirpimo pradžios.
Išvados: 1. Baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, geba surišti ABTS radikalus-katijonus. 2. Gelchromatografijos metodas nebuvo selektyvus, atskiriant visus baltymus, nes dalis baltymų atsiskyrė tik dalinai. 3. Didžiausia baltymų koncentracija nustatyta keturiose gelchromatografijos pradžioje atsiskyrusių baltymų frakcijose, atitinkamai 6,068 ± 0,417 µg/ml, 5,956 ± 0,317 µg/ml, 5,083 ± 0,709 µg/ml ir 4,663 ± 0,094 µg/ml. 4. Frakcijose, kuriose nustatytas didžiausias baltymų kiekis, identifikuoti nuo 14 iki 35 kDa baltymai. Taip pat aptiktas nedidelis kiekis 120 kDa molekulinės masės baltymo. 5. Rausvažiedžių ežiuolių baltymai iš kietųjų kapsulių atsipalaiduoja tik dalinai, iki 25,73 ± 0,793 proc. baltymų. 6. Kapsuliuotų rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas susilpnėja.
Reikšminiai žodžiai: Echinacea purpurea L. Moench, ABTS, augalų baltymai, gelchromatografija, Bradford, NaDS-PAGE.
SUMMARY
QUANTITATIVE AND QUALITATIVE ANALYSIS, CAPSULATION
AND DETERMINATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF
PROTEINS FROM ECHINACEA PURPUREA L. MOENCH ROOTS
Master thesis of Luka Šiatkutė. Supervisor of the research paper: prof. dr. Nijolė Savickienė, Professor, Ph. D1.
Consultant: Arūnas Savickas, Professor, Ph. D2.
1
Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania.
2Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania.
Aim of experiment: To analyse proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots by quantity and quality, prepare hard capsules and determine antioxidant activity.
Experiment tasks: 1. To determine antioxidant activity of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots. 2. To separate proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots into fractions according to their molecular size. 3. To measure the amount of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots in prepared fractions. 4. To determine the molecular mass of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots. 5. To prepare hard capsules of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots and evaluate protein release from prepared hard capsules. 6. To determine antioxidant activity of prepared hard capsules with proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots.
Methods: 1. The antioxidant activity of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots was determined with ABTS radical scavenging assay. 2. Proteins were fractionated by gel filtration chromatography. 3. The amount of proteins was measured with Bradford Microassay. 4. The molecular mass of proteins was determined with sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. 5. Hard capsules were prepared using hand-operated filling machine. Protein release from hard capsules was evaluated by in vitro dissolution test. 6. The antioxidant activity of hard capsules with proteins was determined using ABTS radical scavenging assay.
Results: 1. 100 µL of protein fraction from Echinacea purpurea L. Moench roots scavenges 53.59 ± 2,65 percent of ABTS free radicals. 2. Proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots were separated into 38 fractions according to their size. 3. The amount of proteins in fractions was 1.259 ±
0.097 µg/mL – 6.068 ± 0.417 µg/mL. 4. The molecular mass of proteins in prepared fractions was 14, 25, 30, 35, 36 and 120 kDa. 5. The highest amount of proteins (25.73 ± 0.793 percent) released from hard capsules obtained after 60 minutes of in vitro dissolution experiment. 6. The highest antioxidant activity of hard capsules with proteins (22.00 ± 1.56 percent) obtained after 15 minutes of in vitro dissolution experiment.
Conclusions: 1. Proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots possess antioxidant activity. 2. Gel filtration chromatography is not selective enough to fractionate proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots, because not all proteins fractionated thoroughly due to their similarity of molecular size. 3. The highest amount of proteins was measured in the first four fractions: 6.068 ± 0.417 µg/mL, 5.956 ± 0.317 µg/mL, 5.083 ± 0.709 µg/m and 4.663 ± 0.094 µg/mL. 4. Proteins with molecular mass from 14 to 35 kDa were estimated in fractions with the highest amounts of proteins. Traces of 120 kDa protein were determined as well. 5. Proteins release from hard capsules is poor (only 25.73 ± 0.793 percent). 6. Encapsulated proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots lose their antioxidant activity.
Key words: Echinacea purpurea L. Moench, proteins of plants, Size Exclution Chromatography, Braford Microassay, SDS-PAGE.
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju mokslinio darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei bei prof. habil. dr. Arūnui Savickui už visokeriopą pagalbą, patarimus bei neišsenkančią kantrybę magistrinio darbo rengimo metu.
Taip pat noriu padėkoti Vilniaus Biotechnologijų Instituto mokslininkams, ypatingai Gitanai Mickienei ir Editai Mištinienei, už bendradarbiavimą, konsultacijas ir suteiktas galimybes atlikti mokslinius tyrimus.
SANTRUMPOS
ABTS●+ 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (angl. 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) katijoninis radikalas
Akrilamido-BIS N,N′-Metilen – bis - akrilamidas AGB Arabinogalaktano baltymas
BCR Bicinchoninė rūgštis (angl. Bicinchoninic acid)
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (angl. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Ph. Eur. Europos Farmakopėja
JSA Jaučio serumo albuminas
HPC Hidroksipropilceliuliozė
MS Masių spektroskopija
m/z Masės – krūvio santykis
NaDS Natrio dodecilsulfatas
NaDS-PAGE Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (angl. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
PBS Fosfatinis buferis (angl. Phosphate-buffered saline)
SN Standartinis nuokrypis
TMEDA N,N,N',N'-Tetrametiletan-1,2-diaminas (angl. N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine)
TRIS Tris(hidroksimetil)aminometanas (angl. Tris (hydroxymethyl)aminomethane) TRIS-HCl Tris(hidroksimetil)aminometano ir druskos rūgšties buferis
ĮVADAS
Šio tyrimo objektas – iš rausvažiedžių ežiuolių (Echinacea purpurea L. Moench) šaknų išskirti baltymai. Echinacea purpurea L. Moench yra astrinių (lot. Asteraceae) šeimos augalas, tradiciškai vartojamas įvairių viršutinių kvėpavimo takų infekcijų pagalbiniam gydymui ar profilaktikai. Augalas pasižymi imunomoduliuojančiu, antimikrobiniu, antivirusiniu, priešuždegiminiu bei antioksidantiniu poveikiais. Rausvažiedžių ežiuolių vaistinės žaliavos – šaknų, farmakologinius poveikius apsprendžia biologiškai aktyvūs junginai - alkamidai, įvairūs kavos rūgšties dariniai, polisacharidai ir glikoproteinai [1].
Baltymai yra pirminiai augalų metabolitai, atliekantys gyvybiškai svarbias funkcijas. Nustatyta, jog rausvažiedžių ežiuolių baltymai ir glikoproteinai turi įtakos imunostimuliaciniam ir priešvirusiniam aktyvumui [2, 3, 4]. Pastaruoju metu išaugo susidomėjimas augalų baltymų antioksidantinėmis savybėmis. Būtent, ši priežastis paskatino atlikti rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinio aktyvumo tyrimus.
Antioksidantinis aktyvumas ir farmakologiniai augalinio ekstrakto poveikiai priklauso nuo vaisto formos. Kietosios kapsulės yra viena populiariausių vaistų formų. Jas lengva pagaminti, o gamyba nereikalauja daug pagalbinių medžiagų, sudėtingų įrengimų ir neužima daug laiko. Kietosios kapsulės pasižymi geru biopasisavinimu, be to, sukapsuliuoti galima net ir tokias medžiagas, su kuriomis sudėtinga pagaminti tabletes. Taip pat kietosios kapsulės yra viena tinkamiausių vaisto formų klinikiniams tyrimams atlikti [5].
Magistrinio darbo tyrimas yra dalis bendro Lietuvos – Baltarusijos projekto „Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius imunomoduliatorius ir citostatikus“ (Nr. TAP-LB-12-006), atlikto bendradarbiaujant su Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institutu. Tyrimo metu tirta Baltarusijos mokslininkų paruošto rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymų tirpalo kokybinė bei kiekybinė sudėtis. Pirmą kartą tirtas baltymų, išskirtų iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, antioksidantinis aktyvumas. Taip pat pirmą kartą rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymams pritaikyta farmacinė forma. Magistrinio darbo tikslas pasiektas, atliekant baltymų tirpalo kiekybinę ir kokybinę analizę spektrofotometriniu Bradford metodu bei natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforeze. Baltymų antioksidantiniam aktyvumui nustatyti naudotasmodelinio ABTS radikalo-katijono surišimo metodas. Taip pat buvo pagamintos kietosios kapsulės, praturtintos rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymais. Tirtas baltymų atsipalaidavimas iš kapsulių krepšelio metodu bei atliktas kapsulių antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu.
Magistrinio darbo tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Farmakognozijos katedroje, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje bei Vilniaus Biotechnologijų institute.
Šiuo metu tęsiami kapsuliuotų rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymų biologinio aktyvumo tyrimai.
Tyrimo metu buvo paruošta publikacija žurnalui Acta Pharmaceutica tema „Fractionation and determination of proteins in Echinacea purpurea (L.) Moench roots“ (Gabriele Balčiūnaitė, Jovita Juodsnukytė, Arūnas Savickas, Ona Ragažinskienė, Luka Šiatkutė, Gitana Žvirblytė, Edita Mištinienė, Nijolė Savickienė).
Tyrimo rezultatai žodiniu pranešimu pristatyti 2014 metais vykusioje Studentų Mokslininkų Draugijos organizuotoje Jaunųjų Mokslininkų ir Tyrėjų Konferencijoje, tema „Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, išskirtų iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Be to, 2014 metais vykusioje tarptautinėje konferencijoje “The 5th
International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice“ buvo pristatytas stendinis pranešimas „Determination of antioxidant activity of capsules with proteins isolated from Echinacea purpurea (L.) Moench roots and rhizomes“.
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: Rausvažiedžių ežiuolių baltymų, išskirtų iš džiovintų šaknų, tirpalas, kurį paruošė Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos instituto mokslininkai.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Nors yra vykdyti rausvažiedžių ežiuolių sultyse esančių baltymų kokybinės – kiekybinės sudėties tyrimai, tačiau trūksta mokslinės informacijos apie augalo džiovintų šaknų baltymus. Taip pat nėra tirtas rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymų antioksidantinis aktyvumas. Be to, iki šiol nėra pagaminta jokia vaisto forma su rausvažiedžių ežiuolių baltymais.
Darbo tikslas: Kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pagaminti kietąsias kapsules su šiais baltymais ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti, ar baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pasižymi antioksidantiniu aktyvumu.
2. Išskirstyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, į atskiras frakcijas pagal molekulių dydį.
3. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, koncentraciją. 4. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, molekulinę masę.
5. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, bei įvertinti baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
6. Įvertinti kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, antioksidantinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Augalų baltymai ir jų funkcijos
Baltymai yra vieni svarbiausių junginių visuose gyvuose organizmuose, atliekantys daug įvairių funkcijų. Augalų baltymai priskiriami pirminiams metabolitams, kurie yra būtini ląstelių veiklai [6]. Taip pat yra žinoma, jog baltymai svarbūs augalų apsauginiams mechanizmams bei dalyvauja fotosintezėje. Pavyzdžiui, nuo kalcio priklausomos baltyminės kinazės padeda augalui reaguoti į įvairius vidinius ir išorinius pavojus bei stresines būkles, tokias kaip šaltis, druskos ar sausros [7, 8]. Nustatytas augalų atsparumo baltymas (anlg. resistance protein), kuris atpažįsta ligos sukelėją ir aktyvuoja tolimesnius augalo apsauginius mechanizmus. Jis ypatingas tuo, jog geba atpažinti specifiškas patogeno išskiriamas molekules, kurių neatpažįsta transmembraniniai receptoriai, turintys tą pačią funkciją [9, 10].
Baltymai dalyvauja augalų vykdomoje fotosintezėje. Tilakoidų membranose randami baltymai, kurie prisijungia chlorofilą ir yra susiję su fotosistemomis I ir II. Be to, nustatyta, jog chlorofilą prijungiantis baltymas pasižymi fotoapsauginėmis savybėmis ir apsaugo chlorofilą sausrų metu nuo oksidacijos [11]. Taip pat baltyminiai fermentai dalyvauja vandens skaidyme ir ATP gamyboje [12].
1.2. Augalų baltymų antioksidantinis aktyvumas
Antioksidantai apibūdinami kaip medžiagos, gebančios apsaugoti kitas lengvai besioksiduojančias medžiagas nuo laisvųjų radikalų žalingo poveikio [13]. Antioksidantai skirstomi į pirminius, antrinius, sinergistinius ir mišrius. Pirminiai antioksidantai stabilizuoja laisvuosius radikalus, perduodami jiems vandenilio joną arba laisvą elektroną. Antriniai antioksidantai stabilizuoja lipidų peroksidus. Tuo tarpu sinergistiniai antioksidantai gali regeneruoti pirminius ir taip sustiprinti jų poveikį arba gali veikti kaip chelatoriai bei inaktyvuoti laisvą deguonį [14].
Nustatyta, jog baltymai, peptidai, amino rūgštys ir baltymų hidrolizatai pasižymi antioksidantinėmis savybėmis ir geba apsaugoti lipidus nuo oksiduojančių medžiagų poveikio [14, 15]. Baltyminiai antioksidantai gali veikti tiek kaip metalų chelatoriai, tai yra sinergistiniai antioksidantai, tiek kaip laisvųjų radikalų stabilizatoriai – pirminiai antioksidantai [16, 17].
Baltymų antioksidantinį aktyvumą lemia amino rūgštys, tiksliau, jų šoniniai radikalai. Visos amino rūgštys geba sąveikauti su laisvaisiais radikalais, priklausomai nuo jų energijos, tačiau svarbiausios yra tos, kurios turi arba nukleofilinį sieros atomą, arba aromatinį radikalą [15].
Tyrimų metu įrodyta, jog baltymas, išskirtas iš Solanum torvum Sw. sėklų, pasižymi antioksidantiniu aktyvumu. Nustatyta, kad šis baltymas geba surišti 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalus 76 proc., taip pat įvertintos redukcinės ir chelatinės savybės [18]. Tuo tarpu baltymo, išskirto iš Phyllanthus niruri L. žolės, antioksidantinis aktyvumas įrodytas, pasitelkiant ketvirtinio butilo hidroperoksidą, kurio pagalba laboratorinių pelių kepenų ląstelėms buvo sukeltas oksidacinis stresas. Nustatyta, jog prieš oksidaciją paveikus hepatocitus baltymu, išskirtu iš Phyllanthus niruri L. žolės, hepatocitų gyvybingumas išlieka 97 proc., o nepaveiktų – mažiau nei 50 proc. Taip pat įrodytas šio baltymo apsauginis poveikis ląstelėms bei gebėjimas slopinti reaktyvių deguonies formų susidarymą [19]. Geranium sibiricum Linne glikoproteinas taip pat pasižymėjo savybe slopinti reaktyvias deguonies formas [20].
Aptarti tyrimai rodo, jog baltymai pasižymi antioksidantiniu aktyvumu ir geba apsaugoti audinius nuo oksidacinio streso.
1.3. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų cheminė sudėtis
Rausvažiedžių ežiuolių šaknys yra farmakopėjinė žaliava, aprašyta straipsnyje Ph. Eur. 01/2008:1824. Tai yra sudžiovinta, vientisa arba susmulkinta požeminė Echinacea purpurea L. Moench augalo dalis. Kokybiškoje žaliavoje kaftarino ir cikoro rūgščių suma turi būti ne mažesnė nei 0,5 proc. [21]. Kiti rausvažiedžių ežiuolių šaknų cheminiai junginiai bei jų procentinė dalis vaistinėje žaliavoje surašyti 1 lentelėje.
1 lentelė. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų pagrindiniai biologiškai aktyvūs junginiai [1, 2, 21, 22].
Junginių grupė Pagrindiniai
biologiškai aktyvūs junginiai Kiekis procentais Kavos rūgšties dariniai Cikoro rūgštis, kaftaro rūgštis,
echinakozidas ir kt. 2,0 – 2,8 proc.
Alkamidai Izobutilamidai 0,01 – 0,7 proc.
Baltymai ir glikoproteinai Arabinogalaktaną
prijungiantis baltymas (AGB) Nėra tirta. Eteriniai aliejai Kariofilenas, limonenas,
kamfenas 0,1 proc.
Polifenoliniai junginiai –
flavonoidai Kvercetinas, rutinas 0,48 proc.
Pirolizidiniai alkaloidai Tusilaginas, izotusilaginas 0,006 proc. Poliacetilenai
trideka-1-en-3,5,7,9,10-pentaienas, pontikaepoksidas Nėra tirta.
1.4. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymai
Literatūros šaltiniuose galima rasti duomenų apie rausvažiedžių ežiuolių šaknyse nustatytus 17, 21, 30 bei 120 kDa molekulinės masės glikoproteinus. Pirmus tris glikoproteinus sudaro apie 3 proc. baltymų su vyraujančiomis aspartato, glicino, glutamino ir alanino amino rūgštimis. Pagrindiniai šių glikoproteinų cukrūs yra arabinozė, galaktozė ir gliukozaminas [2]. Tuo tarpu 120 kDa molekulinės masės glikoproteinas yra vadinamas arabinogalaktaną prijungiančiu baltymu (AGB), kadangi apie 90 proc. molekulės sudaro labai šakota polisacharidų grandinė, susidedanti iš galaktozės ir arabinozės (santykiu 1,8:1). Likusius 10 proc. sudaro baltymas, kuriame dominuoja glutaminas, asparaginas, hidroksiprolinas, serinas, treoninas bei alaninas [2, 3, 23]. AGB atsakingas už augalo ląstelių augimą, dalijimąsi bei apoptozę [3].
Rausvažiedžių ežiuolių glikoproteinai yra siejami su augalo imunomoduliacinėmis savybėmis [2]. Vandeniniai rausvažiedžių ežiuolių ekstraktai, praturtinti glikoproteinais, aktyvina B ląsteles (B limfocitus) bei skatina interleukino-1, auglio nekrozės faktoriaus α ir interferono αB išsiskyrimą makrofaguose [1, 24, 25]. Tyrimais in vitro įrodytas AGB gebėjimas aktyvuoti komplemento sistemą bei jungtis prie žmogaus leukocitų. Vis dėlto lyginant AGB, išskirtus iš Baptisia tinctoria ir Echinacea pallida šaknų bei Echinacea purpurea ląstelių kultūros, nustatyta, jog Echinacea purpurea AGB silpniausiai skatina imunoglobulino M ir interleukino-6 gamybą bei pelių limfocitų proliferaciją [3]. Tyrimų metu išaiškinta, jog AGB imunostimuliaciniam aktyvumui labai svarbios arabinozės šoninės grandinės. Panaikinus šias molekulės dalis, AGB glikoproteinas praranda gebėjimą aktyvuoti komplemento sistemą [3, 26].
Echinacea purpurea L. Moench šaknyse esantys glikoproteinai pasižymėjo netiesioginiu antivirusiniu aktyvumu. Eksperimentai atlikti su pelių blužnies ląstelių kultūromis, tiriant interferonų α ir β priešvirusinį aktyvumą [4].
1.5. Rausvažiedžių ežiuolių vaistinės augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas
Yra žinoma, jog ežiuolės genties augalų, tokių kaip Echinacea angustifolia (DC.) Hell., Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. bei Echinacea purpurea (L.) Moench šaknų ekstraktai pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu [27, 28]. Mokslinės literatūros duomenimis pagrindiniai Echinacea purpurea L. Moench šaknų biologiškai aktyvūs junginiai, nulemiantys antioksidantinį aktyvumą, yra fenoliniai junginiai, tokie kaip cikoro bei kavos rūgštys, taip pat flavonoidai, alkamidai bei kai kurie polisacharidai [2, 29]. Vykdyti tyrimai su metanoliniais ežiuolės genties augalų šaknų ekstraktais įrodė šių ekstraktų gebėjimą surišti laisvuosius DPPH ir ABTS radikalus bei dvivalenčio vario jonus [28].Kitų tyrimų autoriai teigia, jog Echinacea purpurea L. Moench ekstrakto antioksidantinis aktyvumas tolygus askorbo rūgšties aktyvumui. Tyrimui išdžiovintos visos augalo dalys. Gautoje sausoje masėje buvo nustatyta 11,0 ± 1,0 mg/g fenolinių junginių ir 159,8 ± 12,4 mg/g polisacharidų. Pagamintas ekstraktas gebėjo surišti 91,4 proc. DPPH radikalų bei 70 proc. geležies jonų, lyginant su EDTA [29].
Siekiant išaiškinti Echinacea purpurea L. Moench antioksidantinio aktyvumo mechanizmą, atliktas tyrimas, kuriame lyginamas augalo ekstrakto bei išgrynintų cikoro rūgšties ir alkamidų deguonies sunaudojimo bei laisvųjų radikalų surišimo efektyvumas. Tyrimas atliktas su augalo stiebų, lapų bei šaknų ekstraktais. Ekstraktų gebėjimas surišti laisvuosius DPPH radikalus buvo proporcingas cikoro rūgšties koncentracijai juose. Taip pat nustatyta, jog išgryninta cikoro rūgštis pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, tuo tarpu išgryninti alkamidai – nepasižymėjo. Tačiau veikdami mišinyje alkamidai padidina cikoro rūgšties antioksidantinį aktyvumą. Sprendžiant iš struktūros, alkamidai neturėtų pasižymėti stipriu antioksidantiniu aktyvumu, kadangi neturi hidroksilo grupių ar aromatinių žiedų. Tyrimo autoriai spėja, jog alkamidai padidina cikoro rūgšties antioksidantinį aktyvumą ne dėl sinergistinio poveikio, o greičiau dėl paviršiaus aktyvumo savybių, tokiu būdu palengvina polinės cikoro rūgšties patekimą prie lipidų ir galimybę sustabdyti lipidų oksidaciją [30]. Pastarasis tyrimas rodo, kad yra svarbu toliau tirti rausvažiedžių ežiuolių vaistinės augalinės žaliavos biologiškai aktyvius junginius bei jų įtaką augalo biologiniams poveikiams.
1.6. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų kokybinė – kiekybinė analizė
Baltymų mišinio kokybinę – kiekybinę analizę sudaro baltymų frakcionavimas, išskirstytų baltymų identifikavimas ir kiekio įvertinimas.
1.6.1. Baltymų frakcionavimas
Išgrynintų baltymų frakcionavimas būtinas tolimesnei baltymų kiekybinei – kokybinei analizei. Baltymai frakcionuojami, atsižvelgiant į skirtingas savybes, tokias kaip molekulių dydis, krūvis bei giminingumas įvairiems ligandams. Atitinkamai baltymų frakcionavimui naudojamos gelchromatografija, jonų mainų chromatografija bei giminingumo chromatografija [31, 32]. Nežinomų baltymų pilotiniam frakcionavimui tinkamiausia yra gelchromatografija, kadangi šis metodas nereikalauja specifinių žinių apie tiriamą baltymą. Jonų mainų chromatografijai svarbu žinoti baltymų izoelektrinius taškus, o giminingumo chromatografijai reikalinga informacija apie tiriamų baltymų gebėjimą jungtis su specifinėmis medžiagomis [31].
1.6.1.1. Gelchromatografija
Gelchromatografija gali būti taikoma didelės molekulinės masės medžiagų atskyrimui nuo mažos molekulinės masės medžiagų arba daugiakomponenčių mišinių išskirstymui pagal molekulinę masę [33]. Dažnai gelchromatografija naudojama baltymų frakcionavimui pagal molekulių dydį ir formą. Baltymų tirpalas įleidžiamas į kolonėlę su įvairaus dydžio poromis, kuriose pasiskirsto skirtingo dydžio baltymų molekulės. Baltymai iš kolonėlės išplaunami vandeniniais buferiais. Gelchromatografijos metu surenkamos atskiros frakcijos su skirtingo dydžio baltymų molekulėmis. Iš kolonėlės pirmiausiai išsiskiria didesnės molekulinės masės baltymai, o mažesnės molekulinės masės baltymai išsiskiria paskutiniai, kadangi kuo mažesnė molekulė, tuo giliau prasiskverbia pro gelio poras [34, 35]. Kolonėlės, naudojamos gelchromatografijoje, dažniausiai būna užpildytos netirpiu polisacharidu, tokiu kaip dekstranas ar agarozė, arba poliakrilamidu [31].
Literatūroje aprašytas Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. AGB ir arabinano molekulinės masės nustatymas, naudojant gelchromatografiją. Naudota Sephacryl-S400 kolonėlė, lazerio šviesą sklaidantis detektorius bei žinomos molekulinės masės polisacharidų standartai arabinano masei nustatyti [36].
1.6.1.2. Jonų mainų chromatografija
Jonų mainų chromatografija yra vienas pagrindinių metodų baltymų atskyrimui ir gryninimui. Metodas remiasi elektrostatine sąveika tarp baltymo ir jonizuotų grupių, esančių nejudančiojoje fazėje. Sąveika priklauso ne tik nuo krūvių, bet ir nuo terpės dielektrinės konstantos bei konkurencijos su kitais jonais. Didelė konkuruojančių jonų koncentracija naudojama baltymams atplauti nuo sorbento [37]. Terpės pH parenkamas pagal tikslinio baltymo izoelektrinį tašką taip, kad baltymas pasirinktoje terpėje įgytų elektros krūvį. Teigiamą krūvį turintiems baltymams gryninti naudojamos neigiamai įkrautos karboksimetilceliuliozės kolonėlės, o neigiamai įkrautiems – dietilaminoetilceliuliozės kolonėlės [31].
Vis dėlto šis metodas nėra pakankamai selektyvus, todėl dažnai jo vieno neužtenka visiškam baltymo išgryninimui. Siekiant pagerinti baltymo išgryninimą jonų mainų chromatografija, gali būti taikomi įvairūs papildomi metodai, tokie kaip atgalinės tėkmės metodas, kurio principas yra leisti mėginį atvirkštine kryptimi nei eliuentą. Tokiu būdu susiaurinamos chromatogramos smailės bei išvengiama negrįžtamų baltymo jonų mainų [38].
1.6.1.3. Giminingumo chromatografija
Metodas grindžiamas grįžtamu baltymų jungimusi nekovalentinėmis jungtimis su specifinėmis medžiagomis, vadinamomis ligandais [39]. Ligandai, tokie kaip antikūnai, fermentai, lektinai, polisacharidai, metalai, įvairūs aptamerai, įtvirtinami kietoje, chemiškai intertiškoje matricoje. Imobilizuojant ligandą matricoje, svarbu išsaugoti nepakitusią jungimosi centro struktūrą [32]. Matricos dažniausiai gaminamos iš polimerų ir gelių, pavyzdžiui, agarozės, dekstrano, celiuliozės, poliakrilamido, polistireno-divinilbenzeno ir kt. [39, 40]. Injekavus baltymų tirpalą, tikslinis baltymas prisijungs prie kietoje fazėje imobilizuoto ligando, o neprisijungusios molekulės išplaunamos [32]. Baltymų ir ligandų jungimuisi svarbus terpės pH ir joninė jėga [40]. Baltymo – ligando jungtis gali būti išardoma specialiais tirpalais arba nutraukiama konkurentiškai, stipriau su ligandu besijungiančiomis medžiagomis [32]. Taip
pat baltymai gali būti išplaunami keičiant terpės pH ar joninę jėgą. Tai ypač tinka, kai baltymas su ligandu jungiasi elektrostatinėmis sąveikomis [40].
Giminingumo chromatografija tinkama frakcionuoti baltymus pagal jų amino rūgštis, pavyzdžiui, histidino turintys peptidai jungiasi prie ligando nikelio. Taip pat baltymus, turinčius nebaltymines dalis. Pavyzdžiui, glikoproteinai jungiasi prie lektinų per cukrinę molekulės dalį [32]. Tuo tarpu lektinams frakcionuoti naudojami polisacharidai [34].
1.6.2. Kokybinis baltymų nustatymas
Kokybinė augalų baltymų mišinio analizė reikalinga siekiant plačiau nagrinėti baltymų įtaką augalo biologiniam aktyvumui. Pagrindiniai naudojami metodai yra natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS-PAGE) bei masių spektroskopija (MS). Masių spektroskopija yra tikslesnis metodas, tinkamas visoms baltyminėms medžiagoms tirti, tačiau šis metodas yra brangesnis ir sudėtingesnis. Todėl pilotiniam baltymų tirpalo tyrimui tinkamesnė NaDS-PAGE. Dažnai MS taikoma po atliktos elektroforezės [41].
1.6.2.1. Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė
Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (angl. sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE) yra populiarus identifikavimo metodas, kurio principas yra krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke ir išsiskirstymas pagal molekulinę masę [31].
Natrio dodecilsulfatas (NaDS) (angl. sodium dodecyl-sulfate - SDS) „išlanksto“ baltymų molekules ir prisijungia prie jų proporcingai molekulės masei, santykiu 1,4 g NaDS: 1 g baltymo. Tokiu būdu baltymai įgauna pastovų krūvį, kuris priklauso nuo molekulinės masės. NaDS-PAGE metu baltymai juda poliakrilamido geliu: kuo mažesnė baltymo molekulė, tuo greičiau juda per gelio poras. Gali būti naudojami įvairios koncentracijos poliakrilamido geliai. Dažniausi yra 10 – 15 proc. geliai, kurie gali išskirstyti 10 – 150 kDa dydžio baltymų molekules. Siekiant pagerinti gelių gebėjimą skirstyti baltymus, naudojami linijinio arba nelinijinio gradiento geliai. Pavyzdžiui, linijinio 5 – 20 proc. koncentracijos gradiento gelis geba išskirstyti 8 – 200 kDa ir didesnės molekulinės masės baltymus [41].
Siekiant išryškinti rezultatus, atliekamas gelių dažymas Coomasie briliantiniu mėlynuoju dažikliu, taip pat sidabru arba fluorescuojančiais dažikliais, tokiais kaip salicilaldehido azinas.
Populiariausi yra Coomasie briliantinis mėlynasis ir sidabro dažiklis. Coomasie briliantinis mėlynasis dažiklis pasižymi sąlyginai mažu jautrumu, tačiau yra lengvai suderinamas su masių spektroskopija, palyginus nebrangus ir gero atsikartojamumo. Tuo tarpu sidabro dažiklis yra apie 100 kartų jautresnis už Coomasie briliantinį mėlynąjį dažiklį, tačiau yra prastesnio atkartojamumo, nesuderinamas su masių spektroskopija, be to, nekoreliuoja su baltymų koncentracija [42].
1.6.2.2. Masių spektrometrija
Masių spektrometrija remiasi tiriamos medžiagos jonizavimu ir pavertimu į dujinės fazės jonus, susidariusių jonų atskyrimu ir masės-krūvio santykio (m/z) nustatymu [43]. Metodas gali būti taikomas ne tik baltymų tapatybės ir kiekybiniam nustatymui, bet ir baltymų bei juos koduojančių genų sekos, baltymų metabolitų nustatymui ir nekovalentinių baltymų junginių aptikimui [44, 45].
Į jonizatorių baltymų mėginiai patenka tirpalo arba kietų medžiagų pavidalu. Baltymų pavertimui į dujinės formos jonus taikoma elektropurkštuvinė arba lazerinės desorbcijos jonizacija, naudojant matricą. Taikant lazerinės desorbcijos jonizaciją, gaunamas didelis baltymų m/z santykis, nes šios jonizacijos metu susidaro +1 krūvio jonai. Tuo tarpu elektropurkštuvinės jonizacijos metu susidaro didesnio krūvio jonai ir atitinkamai gaunamas mažesnis baltymų m/z santykis. Susidarę baltymų jonai atskiriami pagal jų m/z santykį, naudojant kvadrupolinį, jonų gaudyklės ar lėkio trukmės masės analizatorius. Lėkio trukmės analizatoriai matuoja laiką, per kurį susidarę jonai pasiekia detektorių. Šie analizatoriai tinka natyviniams baltymams tirti. Jonų gaudyklės surenka jonus pagal jų m/z santykį elektrinio arba magnetinio lauko pagalba. Jos yra mažiau tinkamos baltymų kiekybiniam nustatymui už kvadrupolinį analizatorių. Kvadrupolinis masių analizatorius sudarytas iš dviejų skirtingai įkrautų porų strypelių, tarp kurių atsižvelgiant į kintamąjį magnetinį lauką, vienu metu išėjimo link juda tik tam tikrą m/z santykį turinčios molekulės [45, 46, 47].
Kadangi natrio dodecilsulfatas nesijungia prie nebaltyminės molekulės dalies (dėl šios priežasties sulėtėja molėkulės judėjimas elektroforezės metu ir gaunama didesnė molekulinė masė nei yra iš tikrųjų), todėl masių spektroskopijos metodas yra tikslesnis lyginant su natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforeze, atliekant glikoproteinų ir lipoproteinų analizę [41, 48].
1.6.3. Baltymų kiekybinis nustatymas
Rausvažiedžių ežiuolių baltymai apsprendžia augalo farmakologinį poveikį, todėl svarbu kiekybiškai išanalizuoti vaistinės žaliavos baltymų sudėtį. Baltymų kiekybinei analizei naudojami anksčiau aptarti NaDS-PAGE ir MS metodai (1.6.2.1 ir 1.6.2.2. skyreliai). Taip pat dažnai taikomi spektrofotometriniai analizės metodai, tokie kaip Biuret metodas, bicinchoninės rūgšties ir Bradford metodas [47, 49].
1.6.3.1. Biuret metodas
Biuret kiekybinis nustatymas baltymų analizėje pradėtas taikyti nuo 1964 metų. Metodas remiasi violetinės spalvos komplekso susidarymu, sąveikaujant baltymų amino grupėms su dvivalenčiu variu. Reakcijai reikalinga šarminė aplinka. Susidariusio mišinio spalvos intensyvumas priklauso nuo baltymų kiekio tiriamajame tirpale. Tiriamojo tirpalo koncentracija nustatoma iš prieš tai sudarytos žinomų koncentracijų tirpalų kalibracinės kreivės, matuojant absorbciją esant 540 nm bangos ilgiui. Tyrime naudojamas Biuret reagentas, sudarytas iš vario sulfato, kalio-natrio tartrato bei kalio jodido, ištirpintų 0,2 N natrio šarme. Metodas mažai jautrus [49, 50].
1.6.3.2. Bicinchoninės rūgšties metodas
Bicinchoninės rūgšties (BCR) metodas, pradėtas taikyti 1985 metais, yra Lowry metodo modifikacija, kadangi vietoje Folin-Ciocalteau reagento (Lowry metodo reagentas) naudojama BCR. Dėl to išaugo metodo jautrumas bei suderinamumas su įvairiomis medžiagomis. Reakcijai naudojamas dvivalentis varis, kurį baltymai redukuoja iki vienvalenčio. BCR reaguoja su vienvalenčiu variu, sudarydama violetinės spalvos kompleksą. Gauto tirpalo absorbcija ties 652 nm tiesiogiai proporcinga baltymų kiekiui. Mėginio baltymų koncentracija nustatoma iš prieš taip sudarytos žinomų koncentracijų standartinių baltymų kalibracinės kreivės [49, 51].
1.6.3.3. Bradford metodas
Bradford metodas pradėtas taikyti baltymų koncentracijos nustatymui nuo 1976 metų. Šiuo metodu galima nustatyti nuo 0 iki 200 µg/ml baltymų koncentracijas. Metodas remiasi rūgštinio Coomassie briliantinio mėlynojo G 250 dažiklio sąveika su baltymais. Susidarius mėlynos spalvos kompleksui, tirpalų absorbcija matuojama esant 595 nm bangos ilgiui. Absorbcija tiesiogiai proporcinga baltymų koncentracijai, kuri nustatoma iš prieš tai sudarytos žinomų koncentracijų baltymų kalibracinės kreivės. Bradford metodas dažnai naudojamas dėl gero jautrumo, atkartojamumo ir paprastumo. Reakcija įvyksta per kelias minutes. Šiuo metodu galima nustatyti baltymus nuo 4 kDa molekulinės masės [49, 52, 53].
1.7. Vaisto formos su baltymais
Medicinoje baltymai gali būti naudojami endokrininių bei metabolinių sutrikimų gydymui (pavyzdžiui, insulinas cukrinio diabeto gydymui, virškinimo fermentai), kaip vakcinos (rekombinantinės vakcinos nuo hepatito B, Laimo ligos). Baltymai gali jungtis prie specifinių molekulių ir slopinti jų funkcijas (pavyzdžiui, monokloniniai antikūnai, interleukinai), taip pat naudojami infekcinių, endokrininių bei onkologinių ligų diagnostikoje [54].
Baltymai yra neatsparūs rūgščių ir virškinimo fermentų poveikiui, todėl šiuo metu pagrinde yra vartojami parenteraliai [55]. Tai gali būti injekciniai tirpalai arba milteliai injekciniams tirpalams ruošti. Baltymai ganėtinai greitai šalinami iš organizmo, todėl reikalingos dažnos injekcijos. Šiai problemai išspręsti gali būti vartojamos pagalbinės medžiagos, tokios kaip poliglicerolio ir riebiųjų rūgščių esteriai ar tetraglicerolio dipalmitatas [55]. Baltymai pasižymi prastu stabilumu tirpaluose, todėl priimtinesnė yra miltelių forma tirpalams ar suspensijoms ruošti prieš pat vartojimą. Milteliai gaunami baltymus liofolizuojant [56]. Pagrindinė parenteralinių vaisto formų problema yra skausmingas ir nepatogus vartojimas. Dėl šios priežasties vystomos neinvazinės baltymų vaistų formos. Baltyminiams vaistiniams preparatams tinka inhaliacinės bei intranasalinės farmacinės formos. Inhialiacinės formoms gaminti tinka molekulės, kurių diametras yra mažesnis nei 5 µm. Nustatyta, jog insulino inhaliacinės formos pasisavinama 10 proc. lyginant su subkutaninėmis injekcijomis [57]. Be to, vartojant inhaliacinius preparatus vaisto dozavimo tikslumas priklauso nuo vartojančiojo įgūdžių. Tuo tarpu intranasalinių preparatų vartojimas yra paprastesnis. Baltyminių vaistų vartojimas per nosį ypatingai naudingas neurologinių patologijų gydymui, kadangi palengvina baltymų perėjimą per hematoencefalinį barjerą bei
sumažina nepageidaujamą poveikį kitiems organams [58]. Tačiau nosies gleivinėje yra baltymus skaidančių fermentų, dėl to reikalingos pagalbinės medžiagos, apsaugančios nuo baltymų suardymo [57].
Vartojimo atžvilgiu patogiausios yra geriamos vaistų formos. Baltymų vartojimą, sisteminiam poveikiui pasiekti, per os apsunkina skaidymas žarnyne. Išeitis gali būti naudojami proteazių inhibitoriai bei medžiagos, skatinančios baltymų absorbciją [59]. Šiam tikslui naudojamos įvairios paviršiui aktyvios medžiagos ir kalcio chelatoriai. Kuriamos kapsulės su specialia, prie virškinamojo trakto limpančia sistema, sudaryta iš skirtingų sluoksnių. Išorinis sluoksnis, kapsulei patekus į žarnyną, ištirpsta ir prilimpa prie reikiamos virškinamojo trakto gleivinės dalies. Baltyminė vaistinė medžiaga, kartu su absorbciją skatinančiomis pagalbinėmis medžiagomis yra viduriniame sluoksnyje, kuris, ištirpus išoriniam sluoksniui, liečiasi su gleivine, taip sustiprindamas absorbciją skatinančių medžiagų poveikį ir baltymų absorbciją [59]. Šiuo metu daug dėmesio skiriama baltymų kapsuliavimui.
1.8. Kietųjų kapsulių gamyba
Kapsulės yra kieta vaisto forma, skirta vartoti per os, turinti kietą arba minkštą apvalkalą ir dažniausiai vienkartinę veikliosios medžiagos dozę [60]. Kietosios kapsulės yra sudarytos iš dviejų dalių – dugno ir mažesnio dangtelio, tuo tarpu minkštosios kapsulės yra vientisos [61]. Dažniausiai kietų kapsulių dangalai gaminami iš želatinos bei vandens. Taip pat gali būti pridedama įvairių dažiklių, paviršiui aktyvių medžiagų, konservantų ir kitų pagalbinių medžiagų [60].
Gaminant kietųjų kapsulių apvalkalus, pirmiausia nerūdijančio plieno rezervuaruose ruošiamas motininis želatinos tirpalas. Želatina tirpinama 60 – 70o
C demineralizuotame vandenyje. Tirpale dažnai atsiranda oro burbuliukų, tokiu atveju reikalingas vakuumas jiems nusiurbti. Želatinai tirpstant, mažėja jos klampa, todėl norint užtikrinti reikiamas tirpalo fizikochemines savybes svarbu optimizuoti tirpinimo trukmę. Pagaminus motininį tirpalą, į reikiamą jo tūrį įmaišomos reikalingos pagalbinės medžiagos. Kietųjų kapsulių apvalkalas gaminamas, panardinant į želatinos tirpalą specialias nerūdijančio plieno formas. Šios formos būna vienodo diametro, tik formos, skirtos kapsulės dugnui yra ilgesnės už skirtas kapsulės dangteliui. Be to, liejimo formos yra tokios, kad pagaminti kapsulių dangteliai sandariai užsimautų ant kapsulių dugnų. Ištraukus liejimo formas iš tirpalo jos yra sukamos horizontaliu paviršiumi, siekiant tolygiai paskirstyti želatinos sluoksnį, bei paveikiamos šalto oro srove, kad želatina sustingtų. Galiausiai formos yra džiovinamos specialiose krosnyse karšto oro srove. Išdžiovintos kapsulių apvalkalo
dalys nuimamos nuo formų ir nuvalomos [62, 63]. Kietosios kapsulės gali būti aštuonių dydžių – nuo didžiausio „000“, iki mažiausio „5“ dydžio [61].
Dažniausiai kietosios kapsulės yra užpildomos milteliais arba granulėmis [60]. Pildant kapsules milteliais, labai svarbus veiksnys yra dalelių dydis ir pasiskirstymas. Nevienodas dalelių dydis gali apsunkinti kapsulių pildymo procesą, be to, tokios dalelės yra linkę susisluoksniuoti ir tokiu būdu turėti neigiamos įtakos produkto kokybei. Jei kapsuliuojami milteliai pasižymi nevienodu dalelių dydžiu, problemai išspręsti gali būti taikomas granuliavimas [62]. Skirtingo dydžio dalelės pasižymi skirtingu birumu. Blogai byrantys milteliai apsunkina kapsulių pildymą. Geriausiai kapsulės pildomos milteliais, kurių dalelių vidutinis dydis yra tarp 50 – 100 µm. Kitu atveju kapsulių pildymui palengvinti naudojamos įvairios pagalbinės medžiagos. Birumui pagerinti dažnai dedami slydikliai, tokie kaip magnio stearatas, silicio dioksidas, talkas. Slydikliai dažniausiai būna smulkios dalelės, kurios aplimpa kapsuliuojamų miltelių daleles ir sumažina jų paviršiaus šiurkštumą, tarpusavio trauką, reguliuoja elektrostatinį krūvį arba sugeria drėgmę, tokiu būdu pagerindamos miltelių birumą. Taip pat svarbus veiksnys yra kapsuliuojamų miltelių dalelių forma. Esant labai netaisyklingai dalelių formai, galima pridėti to paties dydžio, apvalios formos pagalbinių medžiagų, tokių kaip mikrokristalinė celiuliozė ar džiovintas kukurūzų krakmolas, arba taikyti granuliavimą. Miltelių lipnumas gali apsunkinti kapsuliavimo procesą arba netgi pažeisti kapsuliavimo mašiną. Lipnumas gali pasireikšti dėl mažų dalelių adhezijos, žemos lydymosi temperatūros arba medžiagos higroskopiškumo. Jei medžiagos lydymosi temperatūra yra 70oC ir mažiau,
rekomenduotina pridėti tokių pagalbinių medžiagų kaip krakmolas ar mikroceliuliozė. Higroskopiškų miltelių išvis nerekomenduotina kapsuliuoti želatinos kapsulėse, tačiau reikalui esant galima pridėti manitolio ar bevandenės celiuliozės.
Jei kapsuliuojama miltelių masė yra per maža, naudojami užpildai, iš kurių populiariausi yra krakmolas ir laktozė [5, 62].
Gaminant mažais kiekiais kapsules, galima pildyti ranka po vieną arba naudojant rankomis pildomą kapsuliavimo mašinėlę. Pramoninėje gamyboje taikomas automatizuotas kapsuliavimas kapsulių pildymo mašinomis [61]. Naudojantis rankomis pildoma kapsuliavimo mašinėle per valandą pagaminama nuo 200 iki 2000 kapsulių. Tuščių kapsulių dugnai sudedami į apatinėje mašinėlės dalyje įtvirtintas plastikines plokšteles su reikiamo dydžio skylutėmis, tuo tarpu kapsulių dangteliai sudedami į laisvos viršutinės plokštelės skylutes. Kapsuliavimui paruošti milteliai yra išberiami ant plokštelės su įstatytais kapsulių dugnais ir išskirstomi po atvirus kapsulių dugnus taip, kad jie vienodai užsipildytų. Po šios procedūros ant plokštelės su užpildytais kapsulių dugnais uždedama plokštelė su kapsulių dangteliais ir stipriai paspaudžiama žemyn, kad skirtingos kapsulių dalys susijungtų ir kapsulės užsidarytų [5, 61].
Pramonėje naudojamos įvairios kapsuliavimo mašinos, kurios visas prieš tai išvardintas kapsuliavimo stadijas atlieka automatiškai arba pusiau automatiškai ir gali pagaminti apie 165000 kapsulių per valandą [61]. Skirtingos pramonėje naudojamos kapsuliavimo mašinos skiriasi pagal miltelių dozavimo metodą. Yra trys pagrindiniai dozavimo būdai:
1. Pildymas sraigtu, kai tuščios atviros kapsulės įstatomos į besisukantį ratą, kuriam sukantis užpildoma vis kita kapsulė;
2. Vibracinis pildymas, kai milteliai išberiami į atviras kapsules taikant vibraciją;
3. Pildymas stūmokliu, kai kapsuliuojami milteliai stūmokliais švelniai suspaudžiami į cilindrines formeles, kurios įdedamos į kapsules.
Dauguma pramonėje gaminamų kietųjų kapsulių pildomos būtent pastaruoju metodu [5, 63].
1.9. Kietųjų kapsulių tirpimo testas
Vaistinės medžiagos atsipalaidavimui iš kietųjų kapsulių ir tirpimo greičiui įvertinti atliekamas kietų vaisto formų tirpimo testas, remiantis Europos Farmakopėja 01/2010:20903. [64]
Kietųjų kapsulių veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas priklauso nuo kapsulės turinio ir apvalkalo sudėties [62]. Dėl to tirpimo testas naudingas, siekiant parinkti optimaliausias pagalbines medžiagas ir gamybos metodą [61]. Veikliosios medžiagos iš kapsulės pradeda atsipalaiduoti tuomet, kai paveikiamas kapsulės apvalkalo sluoksnis, ir jis tampa pralaidus. Šis laiko tarpas nuo kapsulės patekimo į tirpinimo terpę ir veikliųjų medžiagų skyrimosi iš kapsulės pradžios, vadinamas užlaikymu ir priklauso nuo medžiagos, iš kurios pagamintas kapsulės apvalkalas, bei nuo apvalkalo storio. Lyginant želatinines, polietilenoksido ir hidroksipropil-celiuliozės (HPC) kapsules, nustatyta, jog trumpiausiai veikliosios medžiagos užlaikomos želatininėse, o ilgiausiai HPC kapsulese [65].
Terpės, kurioje tirpinamos kapsulės, temperatūra, judėjimas, tūris ir slėgis taip pat yra svarbūs veiksniai, sąlygojantys veikliųjų medžiagų atsipalaidavimą [66]. Kietųjų kapsulių tirpimo testui atlikti dažniausiai naudojama terpė – vanduo, taip pat gali būti naudojamas fosfatinis buferis (pH = 7,5), acetato buferis (pH = 4,7) ar 0,1M HCl. Kapsulių suirimui vandeninėje terpėje pagerinti naudojami fermentai: jei pH yra mažiau nei 4, rekomenduojama pridėti pepsino, jei pH yra tarp 4 ir 6,8 – papaino arba bromelaino, o jei pH yra virš 6,8 – pankreatino [62, 67, 68]. Tyrimų metu nustatyta, jog kapsulių tirpinimui naudojant fosfatinį buferį, veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas sulėtėja [62]. Želatina geriausiai tirpsta, esant žmogaus kūno temperatūrai – 37oC. Mažėjant temperatūrai, tirpumas mažėja, o esant 30oC ir mažesnei
temperatūrai želatina tampa nebetirpi. Todėl želatinines kapsules rekomenduotina užsigerti šiltu vandeniu. Tuo tarpu hidroksipropil metilceliuliozės kapsulių tirpimui terpės temperatūra įtakos neturi [62]. Didėjant tirpalo joninei jėgai, ypač esant Al3+
jonų, mažėja veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas iš želatininių ir polietilenoksido kapsulių bei ilgėja HPC kapsulių užlaikymas. Dėl šios priežasties nerekomenduojama kapsulių vartoti su maistu arba antacidiniais vaistais [65].
Kietų vaisto formų tirpimo testas gali būti atliekamas krepšelinio, mentiniu bei pratakios kameros aparatais [64]. Krepšelinis ir mentinis aparatai sudaryti iš stiklinio ar kitos skaidrios medžiagos indo, kuris gali būti uždengtas dangteliu, taip pat maišiklio, prijungto prie greitį reguliuojančio variklio, ir šildytuvo temperatūrai palaikyti, pavyzdžiui, vandens vonios. Šie abu aparatai skiriasi tuo, kad krepšeliniame aparate 25 ± 2 mm aukštyje nuo indo dugno prie maišiklio pritvirtintas iš tinklinio audinio pagamintas krepšelis, o mentiniame – mentelė [64, 67]. Pratakios kameros aparatas sudarytas iš tirpinimo terpės rezervuaro ir siurblio terpei pakelti, pratakios kameros, sudarytos iš dviejų kamerų, bei šildytuvo, reikiamai temperatūrai palaikyti [64]. Nors kietųjų kapsulių tyrimams gali būti taikomi krepšelinis, mentinis ir pratakios kameros metodai, dėl kapsulių savybės plūduriuoti tirpalo paviršiuje, priimtiniausias yra krepšelinis metodas [62]. Atliekant kietųjų kapsulių tirpinimo tyrimą krepšeliniu aparatu viena kapsulė įdedama į tinklinį krepšelį, kuris nardinamas į tirpinimo terpę. Tyrimui naudojamas cilindrinis plokščias, dažniausiai vieno litro talpos indas su tirpinimo terpe, kurios temperatūra palaikoma 37 ± 0,5 o
C. Krepšelis su kapsule nardinamas į tirpinimo terpę ir paleidžiamas suktis reikiamu greičiu. Sukimosi metu svarbu išvengti burbuliukų susidarymo. Nustatytais laiko tarpais paimamas tikslus tūris mėginio, kuris, jei reikia, filtruojamas, ir nustatoma ištirpusio vaisto koncentracija. Mėginys imamas per vidurį tarp besisukančio krepšelio ir indo sienelių. Paėmus tam tikrą tūrį mėginio, į indą pripilamas toks pats tūris tirpinimo terpės.
Atliekant kietųjų kapsulių tirpinimo tyrimą mentiniu aparatu, tyrimo eiga analogiška krepšeliniam aparatui, tačiau kapsulė dedama ant indo dugno. Jei reikia, naudojamas papildomas įtaisas kapsulei išlaikyti ant dugno [64, 67].
Naudojant pratakios kameros aparatą, kapsulė dedama į vieną iš kamerų, prieš tai iš jos pašalinus orą. Siurblys pumpuoja 37 ± 0,5 oC temperatūros tirpinimo terpę į pirmąją kamerą su kapsule. Šiai
kamerai prisipildžius, pradeda pildytis antroji kamera, susidaro pastovaus greičio srovė, ištirpusi vaistinė medžiaga pasiskirsto terpėje. Nustatytu laiku specialioje vietoje prie kameros išėjimo imami mėginiai, kuriuose matuojama ištirpusios vaistinės medžiagos koncentracija [64].
Rezultatų patikimumui užtikrinti reikalinga tirpimo testą atlikti bent su 6 kapsulėmis. Laiko tarpai, tarp kurių imami mėginiai, pasirenkami pagal individualius reikalavimus [67].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medžiagos
Rausvažiedių ežiuolių (Echinacea purpurea L. Moench) baltymų, išskirtų iš šaknų, tirpalas, paruoštas Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute.
2.1.1. Reagentai
ABTS reagentas (Sigma-Aldrich, JAV); Kalio persulfatas (SIAL, Kanada);
PBS vandeninis tirpalas (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH = 7,4)
(Sigma-Aldrich, JAV);
Ultra švarus (I vandens kokybės lygio) vanduo (Vilniaus Biotechnologijų institutas); Jaučio serumo albuminas, naudojamas kaip baltymų standartas (Sigma – Aldrich, JAV);
Bradford reagentas (sudėtis: 100mg mėlynos spalvos briliantinio mėlynojo dažiklio G-250; 50 ml 95 proc. etanolio, 100 ml 85 proc. fosforo rūgšties. Skiedžiama ultra švariu vandeniu iki 1 litro tūrio) (Sigma-Aldrich, JAV);
Natrio fosfatas (Merck, Darmstadt, Vokietija); Natrio chloridas (Merck, Darmstadt, Vokietija); Dinatrio fosfatas (Sigma-Aldrich, JAV)
Praskiesta vandenilio chlorido rūgštis (Sigma-Aldrich, JAV);
TRIS-HCl (Tris(hidroksimetil)aminometanas-HCl, pH 8,8 ir 6,8) buferis (Sigma-Aldrich, JAV); Natrio dodecilsulfato milteliai (Sigma-Aldrich, JAV);
Amonio persulfato milteliai (Sigma-Aldrich, JAV);
30 proc. akrilamido/bisakrilamido tirpalas (Sigma-Aldrich, JAV); Tetrametiletilendiaminas (Sigma-Aldrich, JAV);
LB buferis (Lane Marker Non-reducing Sample Buffer), sudarytas iš 0,3M TRIS-HCl, 5 proc. SDS, 50 proc. glicerolio ir rožinio dažiklio. (Thermo Scientific, JAV);
TRIS – glicino – NaDS buferis (25 mM TRIS, 1,92 M glicino, 0,1 proc. NaDS pH = 8,3) (Sigma-Aldrich, JAV);
PageRuler Prestained Protein Ladder baltymų standartas, dalelių dydis 10 – 170 kDa (Fermentas Life Science, Lietuva);
Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkinys (Fisher Scientific, JAV); 96,3 proc. etanolis (reaktifikuotas spiritas) („Stumbras“, Lietuva);
99,8 proc. acto rūgštis (Standart, Lenkija); Mikrokristalinė celiuliozė Prosolv®
SMCC HD90 (JRS Pharma, Vokietija); Bevandenis koloidinis silicio dioksidas – aerosilas (Degussa AG, Vokietija); Kietos „0“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV).
Natrio šarmas (NaOH) (Sigma-Aldrich, JAV)
2.1.2. Reagentų paruošimas
Paruošti reagentai: baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymui aktyvuotas ABTS katijonas-radikalas, gelchromatografijai paruoštas fosfatinis buferis, poliakrilamido gelio elektroforezei paruošti naudoti tirpalai bei pagamintas gelis.
2.1.2.1. ABTS radikalo-katijono tirpalo ruošimas
ABTS katijonas-radikalas (ABTS●+) aktyvuotas kalio persulfatu. Atsvertas tikslus kiekis ABTS reagento (0,0548 g), ištirpintas 50 ml ultra švaraus vandens. Į gautą tirpalą įmaišytas tikslus kiekis (0,0095 g) kalio persulfato miltelių. Mišinys paliktas sausoje (santykinė drėgmė ne daugiau 60 proc.) patalpoje, apsaugotoje nuo šviesos, 16 valandų, 20 ± 1 oC temperatūroje.
2.1.2.2 Fosfatinio buferio gamyba
Analitinėmis svarstyklėmis atsverti 17,91 g HNa2O4P·12H2O ir 8,77 g NaCl kiekiai, ištirpinti
995 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų lygus 7,0. Gautas tirpalas skiedžiamas ultra švariu vandeniu iki 1000 ml. Fosfatinio buferio tirpalas laikytas 4 ºC temperatūroje.
2.1.2.3. NaDS-PAGE elektroforezėje naudotų tirpalų ruošimas
1,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 8,8. 18,15 g TRIS tirpinta 70 ml ultra švaraus vandens. Tirpalo pH sureguliuotas iki 8,8, naudojant 4 M HCl. Gautas tirpalas praskiestas ultra švariu vandeniu iki 100 ml ir laikytas 4 ºC temperatūroje;
0,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 6,8. 6,0 g TRIS ištirpintas 70 ml ultra švaraus vandens. Įpilta 4 M HCl, kol pH pasiekia 6,8. Gautas tirpalas praskiestas ultra švariu vandeniu iki 100 ml ir laikytas 4 ºC temperatūroje;
10 proc. natrio dodecilsulfato (NaDS) tirpalas. 5,0 g NaDS ištirpinta ultra švariame vandenyje ir praskiesta iki 50 ml;
10 proc. amonio persulfato tirpalas. 100 mg amonio persulfato ištirpinta 1 ml ultra švaraus vandens.
Vienkartinis (1x) elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS-glicino-NaDS elektroforezės (10x) buferinio tirpalo, pagaminto iš 25 mM TRIS, 1,9 M glicino ir 35 mM NaDS, praskiesta ultra švariu vandeniu iki 1 litro.
2.1.2.4. NaDS-PAGE elektroforezės gelio ruošimas
NaDS-PAGE elektroforezė atlikta, naudojant 4 proc. koncentruojantį ir 15 proc. frakcionuojantį poliakrilamidinį gelį.
Pirmiausia paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas, naudojant 5 ml 30 proc. akrilamido-BIS, 2,5 ml 1,5 M TRIS (pH 8,8, esant 25 ˚C temperatūrai), 2,3 ml ultra švaraus vandens, 0,1 ml 10 proc. NaDS, 0,1 ml amonio persulfato bei 0,01 ml tetrametiletilendiamino (TMEDA). Koncentruojančio gelio tirpalas sudarytas iš 1,3 ml 30 proc. akrilamido-BIS, 2,5 ml 0,5 M TRIS (pH 6,8, esant 25 ˚C temperatūrai), 6,1 ml ultra švaraus vandens, 0,1 ml 10 proc. NaDS, 0,05 ml amonio persulfato bei 0,01ml TMEDA.
Paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas atsargiai įleistas į specialią sukonstruotą formą, paliekant maždaug 4 cm atstumą iki viršaus, ir atsargiai užpiltas ultra švariu vandeniu. Praėjus 40 min, vandens likutis atsargiai nupiltas ir ant sustingusio frakcionuojančio gelio užpiltas koncentruojančio gelio tirpalas bei įstatytos specialios gelio takelius formuojančios šukos. Po 40 minučių šukos išimtos ir ultra švariu vandeniu praplauti susiformavę gelio takeliai.
2.1.3. Įranga
Automatiniai dozatoriai (Ependorf, JAV); Laikmatis (Thermo Fisher Scientific, JAV);
Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (Sartorius, Goettingen, Vokietija) (1 mg-220 g); Ultra švaraus vandens aparatas EMD Millipore Synergy (Thermo Fisher Scientific, JAV); AKTA Purifier 100 gelfiltracijos sistema (GE Healthcare, Švedija);
Centrifuga 5415R (Ependorf, JAV); DB-2D termostatas (Techne, JK);
Superdex 200 10/300 GL kolnėlė (GE Healthcare life sciences, JK); Spektrofotometras Infinite M200 (Tecan, Šveicarija);
Baltymų elektroforezės aparatas MP-300V (Cleaver Scientific LTD, JK); 2 mm sietas (Fisher Scientific, JAV);
Prietaisas miltelių birumui įvertinti Erweka AG (Erweka GmbH, Vokietija); Kapsuliavimo mašinėlė „Capsuline-15“ (Capsuline, JAV);
Erweka DZT tirpinimo įrenginys (Erweka GmbH, Vokietija).
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas
Rausvažiedžių ežiuolių baltymų, išskirtų iš šaknų, antioksidantinis aktyvumas nustatytas ABTS●+ surišimo metodu [28]. Tyrimas vykdytas į skirtingus vandeninio PBS tirpalo tūrius įpilant skirtingą rausvažiedžių ežiuolių baltymų tirpalo tūrį ir 50 µl aktyvuoto ABTS●+. Tirtų mišinių sudėtys
pateiktos 2 lentelėje. Įvykus reakcijai tarp baltymų ir ABTS●+, susidarė žalsvai melsvos spalvos tirpalas, kurio absorbcija matuota spektrofotometru, esant 734 nm bangos ilgiui. Taip pat nustatyta kontrolinio ABTS●+ tirpalo absorbcija. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas įvertintas, palyginant mėginių absorbciją su kontrolinio tirpalo absorbcija ir apskaičiuotas, naudojant 1 formulę:
𝑝𝑟𝑜𝑐. = 100 − (𝐴∗100𝐴𝑘 ) (1 formulė)
Čia: proc. - antioksidantinis aktyvumas procentais; A – tiriamojo tirpalo absorbcijų vidurkis;
Ak – kontrolinio tirpalo absorbijų vidurkis.
2 lentelė. Antioksidantinio aktyvumo tyrimui naudotų mėginių ir kontrolinio mėginio sudėtys Rausvažiedžių ežiuolių
baltymų tirpalo tūris (µl)
Baltymų kiekis tirpale (µg) ABTS●+ tirpalo tūris (µl) PBS tirpalo tūris (µl) 50 1,35 50 900 75 2,025 50 875 100 2,7 50 850
Kontrolinis ABTS●+ tirpalas
0 0 50 950
2.2.2. Baltymų frakcionavimas
Rausvažiedžių ežiuolių baltymų išskirstymui atlikta gelchromatografija (molekulių išskyrimo chromatografija) [34]. Naudota AKTA Purifier sistema ir Superdex 200 10/300 GL kolonėlė [69]. Kolonėlės sorbentas – agarozės ir dekstrano mišinys.
Prieš pradedant gelchromatografiją, 1,5 ml baltymų frakcijos centrifiguota +4 ± 1 o
C temperatūroje 15 minučių, 10000 apsisukimų per minutę greičiu, naudojant Eppendorf Centrifiuge 5415R centrifugą. Toliau tyrime naudotas atskirtas nuo nuosėdų supernatantas. Gelchromatografija atlikta, esant 4 – 16 oC temperatūrai. Kolonėlė pusiausvyrinama, leidžiant 50 ml ultra švaraus vandens, po to – 50 ml eliuento – fosfatinio buferio, sudaryto iš 50 mM HNa2O4P * 12H2O ir 0,15M NaCl, kurio pH 7,0. Tėkmės
Prieš leidžiant mėginį sistemos kilpa užpildoma fosfatiniu buferiu, kad neliktų oro. Švirkšto pagalba suleidžiamas 1 ml mėginio supernatanto. Mėginio tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Frakcijos surenkamos į Ependorfo tipo mėgintuvėlius po 0,5 ml.
2.2.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas
Atskirų baltymų frakcijų koncentracija nustatyta kiekybiniu Bradford metodu, kuris pagrįstas specifine baltymo sąveika su Bradford reagentu (briliantinio mėlynojo dažikliu G-250) ir susidariusio komplekso absorbcijos matavimu spektrofotometru.
Kalibracinės kreivės sudarymui paimta po 10 µl 2, 1,5, 1, 0,5, 0,25 bei 0,125 mg/ml koncentracijų pirminio baltymų standarto – jaučio serumo albumino (JSA) – tirpalų. 2 mg/ml tirpalai naudoti du kartus. Pirmasis 2 mg/ml koncentracijos tirpalas praskiestas 790 µl ultra švaraus vandens, o antrasis 2 mg/ml koncentracijos tirpalas ir kiti nurodytų koncentracijų tirpalai praskiesti 990 µl ultra švaraus vandens. Be to, paruoštas tuščias kontrolinis mėginys - 1000 µl ultra švaraus vandens. Pirminio standarto paruošimui naudotų tirpalų koncentracijos ir tūriai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Pirminio standarto paruošimui naudotų tirpalų koncentracijos ir tūriai
Eilės numeris
Pirminis standartas (jaučio serumo
albuminas) Ultra švaraus
vandens tūris(µl) Galutinio standarto tirpalo koncentracija (µg/ml) Tirpalo koncentracija (mg/ml) Tirpalo tūris(µl) 1 2 10 790 25 2 2 10 990 20 3 1,5 10 990 15 4 1 10 990 10 5 0,5 10 990 5 6 0,25 10 990 2,5 7 0,125 10 990 1,25 8 (tuščias mėginys) - - 1000 0
Paimta po 120 µl paruošto skirtingų koncentracijų, standarto tirpalo (2 lentelė) ir gerai sumaišoma su 120 µl Bradford reagento bei palaikoma kambario temperatūroje (20 ± 1 o
C) 5 minutes. Mišinių absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 595 nm bangos ilgiui. Gauta kalibracinė kreivė, pavaizduota 1 paveiksle.
1 pav. Bradford metodo kalibracinė kreivė, skirta baltymų koncentracijai nustatyti. Atitinkamai pamatuota tiriamųjų tirpalų absorbcija, sumaišius 120 µl tiriamo baltymų tirpalo ir 120 µl Bradford reagento bei palaikius 5 minutes, 20 ± 1 oC temperatūroje. Baltymų koncentracija frakcijose apskaičiuota, naudojant 2 formulę:
𝑋 = 𝑌−0,01050,0205 (2 formulė) Čia: X – koncentracija, µg/ml; Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
2.2.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas
Siekiant nustatyti rausvažiedžių ežiuolių baltymų frakcijų dalelių molekulinę masę buvo atlikta natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS-PAGE). Tirtos baltymų frakcijos, gautos atlikus gelfiltraciją, Tyrimui sumaišyta 32 µl baltymų mėginio su 8 µl LB buferio. Gautas mišinys 5 minutes kaitintas 95 ºC, naudojant DB-2D termostatą.
NaDS-PAGE elektroforezei naudotas gelis, sudarytas iš 15 proc. frakcionuojančio (apatinio) gelio ir 4 proc. koncentruojančio (viršutinio) gelio, bei 10 proc. TRIS – glicino – NaDS buferis. Į gelio takelius įleista po 30 µl baltymų mėginių ir 0,5 µl PageRuler Prestained Protein Ladder standarto.
y = 0,0205x + 0,0105 R² = 0,9648 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0 5 10 15 20 25 30
