LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Ingrida Balsytė
Galvijų didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos
tyrimas
Investigation of microbial ecosystem in the rumen of
cattle
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: Prof. dr. Rasa Ţelvytė
2
DARBAS ATLIKTASANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Galvijų didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos tyrimas“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1)_________________________________________________________________________ 2)_________________________________________________________________________ (vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 91.1 Didţiojo prieskrandţio anatominiai ir funkciniai ypatumai ... 9
1.2 Didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos įvairovė ir reikšmė ... 10
1.2.1 Pirmuonys ir jų reikšmė atrajotojo organizmui ... 11
1.2.2 Bakterijos ir jų reikšmė atrajotojo organizmui... 13
1.3 Veiksniai turintys įtakos rumen mikroorganizmų aktyvumui ... 14
1.4 Didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos reguliacija ... 15
1.4.1 Fermentų naudojimas rumen funkcijai reguliuoti ... 16
1.4.2 Mielių naudojimas rumen funkcijai reguliuoti ... 17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŢIAGA ... 18
2.1 Tyrimo vieta, sąlygos, schema ... 18
2.2 Bandomosios karvės, grupių sudarymas ... 19
2.3 Rumen turinio ėmimas, transportavimas ... 20
2.4 Pirmuonių skaičiaus tyrimo ir jų genčių identifikavimo metodika ... 20
2.5 Bendro bakterijų skaičiaus ir bakterijų aktyvumo rodiklių tyrimo metodikos ... 23
2.6 Tyrimo rezultatų statistinių skaičiavimų metodika ... 24
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 25
3.1 Didţiojo prieskrandţio turinio mikrobiologinių rodiklių pereinamajame laikotarpyje rezultatai 25 3.1.1 Didţiojo prieskrandţio mikroorganizmų skaičiaus rodiklių analizė I etapo metu ... 25
3.1.2 Didţiojo prieskrandţio turinio bendro bakterijų skaičiaus ir jų aktyvumo rodiklių tyrimo rezultatai ... 27
3.1.3 Didţiojo prieskrandţio mikrobiologinių rodiklių koreliacinė analizė ... 28
3.1.4 Didţiojo prieskrandţio mikrobiologinių rodiklių regresinė analizė ... 30
3.2 Didţiojo prieskrandţio turinio mikrobiologinių rodiklių tvartiniame laikotarpyje rezultatai ... 32
3.2.1 Didţiojo prieskrandţio turinio pirmuonių tyrimo rezultatai ... 32
3.2.2 Didţiojo prieskrandţio turinio bendro bakterijų skaičiaus ir jų aktyvumo rodiklių tyrimo rezultatai ... 34
3.2.3 Didţiojo prieskrandţio mikrobiologinių rodiklių koreliacinė analizė ... 35
3.2.4. Didţiojo prieskrandţio mikrobiologinių rodiklių regresinė analizė ... 37
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 41
IŠVADOS ... 43
SIŪLYMAS ... 44
PADĖKA ... 45
4
SANTRAUKA
Galvijų didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos tyrimas Ingrida Balsytė
Magistro baigiamasis darbas
Darbą sudaro: įvadas, literatūros apţvalga, tyrimo metodika, tyrimų rezultatai, tyrimų rezultatų aptarimas, išvados, siūlymas, padėka ir literatūros sąrašas. Darbo apimtis – 52 puslapiai. Jame yra 12 lentelės, 22 paveikslai. Panaudoti 74 literatūros šaltiniai.
Darbo tikslas - ištirti pieninių karvių didţiojo prieskrandţio mikrobinę ekosistemą.
Tyrimas buvo atliktas su 12 Lietuvos juodmargių veislės pieninių karvių dviem etapais: pereinamuoju iš ganyklinio į tvartinį ir tvartiniu laikotarpiais. Kiekvienam etapui sudarytos dvi grupės: kontrolinės grupės karvės šeriamos konkretaus laikotarpio racionu; tiriamosios grupės karvėms į konkretaus laikotarpio racioną buvo įterpiama egzogeninių fermentų mišinio ir mielių priedo. Kiekviename etape buvo imami didţiojo prieskrandţio turinio mėginiai ir tiriami mikrobiologiniai rodikliai. Nustatyta, kad bendras pirmuonių skaičius (BPS) turinyje nepriklausė nuo raciono pasikeitimo pereinamajame iš ganyklinio į tvartinį laikotarpyje. Šiame laikotarpyje, naudojant fermentų ir mielių priedą, nustatyta pirmuonių skaičiaus didėjimo tendencija. Tvartiniame laikotarpyje pirmuonių skaičius kito neţymiai. Karvių didţiojo prieskrandţio turinyje identifikuotos 6 pirmuonių gentys: Eudiplodinium, Epidinium, Dasytricha, Polyplastron,
Ostracodinium ir Entodinium. Tiriamas priedas ţymios įtakos atskirų pirmuonių genčių skaičiui
neturėjo. Fermentų ir mielių priedas turėjo teigiamos įtakos bendram bakterijų skaičiui, t. y. pereinamajame laikotarpyje šis rodiklis statistiškai reikšmingai padidėjo vidutiniškai 2 proc., tvartiniame – 1,7 proc.; bakterijų aktyvumo rodikliai: gliukozės rūgimo reakcija (GRR) ir redukcinis aktyvumas, turėjo tendenciją didėti. Pereinamajame laikotarpyje aukšta teigiama koreliacija bei reikšmingas statistinis patikimumas tiriamojoje karvių grupėje nustatytas tarp
Polyplastron ir Eudiplodinium pirmuonių genčių, Epidinium ir Eudiplodinium bei Polyplastron ir Epidinium, tarp GRR ir Dasytricha, bei tarp GRR ir BPS. Tvartiniame laikotarpyje aukšta teigiama
statistiškai reikšminga koreliacija tiriamojoje grupėje nustatyta tarp Entodinium ir BPS,
Ostracodinium ir Eudiplodinium, Polyplastron ir Eudiplodinium, Polyplastron ir Epidinium, Epidinium ir Eudiplodinium; aukšta neigiama statistiškai reikšminga koreliacija šioje grupėje
nustatyta tarp Dasytricha ir Epidinium.
5
SUMMARY
Investigation of microbial ecosystem in the rumen of cattle Ingrida Balsytė
Master's thesis
Structure of the thesis: introduction, literature’s review, research methodology, results, discussion, conclusions, suggestion gratitudeand references. Thesis consists of 52 pages. It contains 12 tables, 22 pictures. 74 references used.
Aim of the work - to investigate the microbial ecosystem in the rumen of dairy cows.
The study was carried out with 12 Lithuanian black-and-white dairy cows in two stages: period of transition from grazing to indoor and period of indoor (winter). For each stage, two groups were formed: the control group cows were fed a ration for a paticular period; the trial group cows were fed with the same ration supplemented with a mixture of exogenous enzymes and a yeast. Samples of rumen content were taken at each stage and microbiological indicators were investigated. It was found that the total number of protozoa (TP) did not depend on the change of diet during the transition period from pasture to barn. During this period, the use of the supplementation demonstrated increasing tendency in protozoa number. The number of protozoa changed insignificant during the winter period. Six protozoan genera have been identified in rumen content: Eudiplodinium, Epidinium, Dasytricha, Polyplastron, Ostracodinium and Entodinium. The supplement had no significant effect on the number of individual protozoan genera. The exogenous enzyme mixture and yeast supplement had a positive effect on the total number of bacteria: during the transition it increased statistically significantly by 2% on average, in the winter period - by 1.7%; bacterial activity indicators: glucose fermentation reaction (GFR) and reductive activity demonstrated tendency to increase. During the transition period, a high positive correlation and significant statistical reliability was observed between the Polyplastron and Eudiplodinium protozoan genera, Epidinium and Eudiplodinium; Polyplastron and Epidinium, between GFR and
Dasytricha, and between GFR and TP. In the winter period, a high positive statistically significant
correlation was found between Entodinium and TP, Ostracodinium and Eudiplodinium,
Polyplastron and Eudiplodinium, Polyplastron and Epidinium, Epidinium and Eudiplodinium in the
study group; high negative statistically significant correlation in this group was found between
Dasytricha and Epidinium.
6
SANTRUMPOS
K – kontrolinė grupė T – tiriamoji grupė
U – tarptautiniai aktyvumo vienetai KSV – kolonijas sudarantys vienetai kg – kilogramai m. – metai g – gramai val. – valandos d. – diena proc. – procentai
CO2 – anglies dioksidas CH4 – metanas
H2S – vandenilio sulfidas H2 – vandenilis
N2 – azotas O2 – deguonis
LRR – lakiosios riebalų rūgštys
EFF – egzogeniniai ląstelieną skaidantys fermentai SM – sausosios medţiagos
BPS – bendras pirmuonių skaičius RBA – redukcinis bakterijų aktyvumas GRR – gliukozės rūgimo reakcija BBS – bendras bakterijų skaičius
7
ĮVADAS
Viena perspektyviausių ūkinių veiklų, galinčių daryti stiprią įtaką Lietuvos ekonomikos augimui yra pieno sektorius, kuris sukuria apie 2 proc. šalies bendrojo vidaus produkto ir jame įdarbinta 65,3 tūkst. gyventojų (1). Be to, ilgalaikėje perspektyvoje didėjant gyventojų skaičiui pasaulyje paklausa pieno produktams augs (2). Jau per 2016–2017 m. laikotarpį pieno produktų suvartojimas pasaulyje padidėjo 1,33 proc (3). Tai sudaro palankias sąlygas didėti pieno produktų eksportui.
Vadovaujantis ES pieno sektoriaus 2015-2020 m prognozėmis, teigiama, kad Lietuvoje, kaip ir visoje ES, kasmet maţės pieno ūkių ir juose laikomų karvių skaičiai, tačiau pieno gamyba išliks stabili, o superkamo pieno kiekio augimui turės įtakos gerėjantys primilţio iš karvės rodikliai (1). Tačiau Lietuvos statistikos departamento duomenimis 2017 m. Lietuvos Respublikoje iš vienos karvės vidutiniškai primelţta 5601 kg pieno (4) ir tai yra vienas iš ţemiausių primilţių ES (1).
Vienas iš svarbiausių pieno gamybos veiksnių yra pašarai ir karvių mityba, kurie sudaro 50– 60% pieno gamybos savikainos, todėl šio veiksnio optimalus panaudojimas nulemia pienininkystės ūkių efektyvumą ir konkurencingumą. Tačiau siekiant efektyviai išnaudoti vietinius pašarų resursus ir uţtikrinti stabiliai aukštą pieno produkciją bei gerą gyvulio sveikatą, būtina aktyvinti didţiojo prieskrandţio (rumen) fermentacinius procesus, kurie sąlygoja gerą pašarų virškinamumą ir padeda aprūpinti gyvulį pakankamu energijos kiekiu (5). Atrajotojų prieskrandţių fermentaciniai procesai padeda suskaidyti maisto medţiagas, kurių kiti ţinduoliai negali suvirškinti. Didysis prieskrandis yra atrajotojų virškinimo sistemos dalis, kurioje yra didelė įvairovė mikroorganizmų, kurių dėka vyksta pašaro fermentacijos procesai (6) ir susiformuoja galutiniai virškinimo produktai (7). Rumen mikrobinę ekosistemą sudaro anaerobiniai mikroorganizmai - bakterijos, pirmuonys, grybai bei archėjos (8). Didţiąją dalį didţiojo prieskrandţio ekosistemos, t. y. apie 77,5 proc sudaro bakterijos, archėjos – 0,7 proc., o eukariotai (grybai ir pirmuonys) sudaro apie 27,8 proc (9, 10). Šie mikroorganizmai atrajotojų prieskrandyje vykdo įvairias funkcijas, kurios suteikia privalumų atrajotojo virškinimo procese, kai daug ląstelienos turintys pašarai suskaidomi ir jų sudedamosios dalys tampa lengviau įsisavinamos (9). Rumen mikroorganizmai yra labai jautrūs besikeičiančioms aplinkos sąlygoms, todėl staigus perėjimas nuo vieno raciono prie kito gali lemti sumaţėjusią pieno gamybą (11). Pieninių karvių didţiojo prieskrandţio mikrobiologiniams rodikliams kritinis laikotarpis yra perėjimas iš tvartinio į ganyklinį ir iš ganyklinio į tvartinį racioną. Tuo laikotarpiu rumen mikrobinė ekosistema prisitaiko prie naujų mitybos sąlygų ir todėl ne visada geba uţtikrinti optimalų fermentacinių procesų aktyvumą. Be to, net ir prisitaikiusi prie raciono, mikrobinė ekosistema ne visada uţtikrina efektyvią fermentaciją prieskrandyje ir sparčiai augantį energijos poreikį. Todėl atrajotojų sveikatos ir jų produkcijos našumo gerinimas ligi šiol išlieka pagrindiniu mokslininkų, susijusių su gyvulininkystės sektoriumi, tikslu (12).
8 Siekant padidinti mikrobiologinių procesų prieskrandyje efektyvumą ir lengvesnį mikroorganizmų prisitaikymą pereinamuoju laikotarpiu atrajotojų racionai gali būti papildomi įvairiais egzogeninių fermentų bei probiotikų priedais (5, 13). Mokslininkai, tyrę įvairius ląstelieną
skaidančių egzogeninių fermentų (14, 15) bei mielių priedus (16, 17) nurodo, kad tokių priedų vartojimas sudaro palankias sąlygas aktyviai didţiojo prieskrandţio mikroorganizmų fermentacinei veiklai, jų gausai bei rūšinei įvairovei, dėl ko gerėja organinės medţiagos ir ląstelienos virškinamumas, padidėja lakiųjų riebalų rūgščių gamyba, pieno produkcijos kiekis ir kokybė bei pagerėja bendra gyvulio sveikatos būklė. Nors kai kurie autoriai nurodo, kad pašarų virškinamumui (18) ir jų panaudojimo efektyvumui (19) egzogeniniai fermentai įtakos neturėjo. Literatūroje randama daug informacijos apie priedų teigiamą įtaką bakterijų skaičiui ir rūšinei įvairovei bei pirmuonių skaičiui, tačiau duomenų apie jų įtaką pirmuonių rūšinei sudėčiai rasti nepavyko. Be to, reikėtų paminėti, kad Lietuvos juodmargių veislės karvių didţiojo prieskrandţio pirmuonių rūšinė sudėtis nebuvo tirta.
Darbo tikslas: Ištirti pieninių karvių didţiojo prieskrandţio mikrobinęekosistemą. Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti bendrą pirmuonių skaičių didţiojo prieskrandţio turinyje pereinamajame iš ganyklinio į tvartinį ir tvartiniame laikotarpiuose, karves šeriant konkretaus laikotarpio racionu ir jį papildţius egzogeninių fermentų mišinio bei mielių priedu;
2. Identifikuoti pirmuonių gentis didţiojo prieskrandţio turinyje pereinamajame iš ganyklinio į tvartinį ir tvartiniame laikotarpiuose, karves šeriant konkretaus laikotarpio racionu ir jį papildţius egzogeninių fermentų mišinio bei mielių priedu;
3. Nustatyti bendrą bakterijų skaičių ir bakterijų aktyvumo rodiklius didţiojo prieskrandţio turinyje pereinamajame iš ganyklinio į tvartinį ir tvartiniame laikotarpiuose, karves šeriant konkretaus laikotarpio racionu ir jį papildţius egzogeninių fermentų mišinio bei mielių priedu;
4. Išanalizuoti didţiojo prieskrandţio turinio mikrobiologinių rodiklių koreliacinius ryšius ir atlikti regresinę analizę.
9
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Didţiojo prieskrandţio anatominiai ir funkciniai ypatumai
Atrajotojų skrandis skiriasi nuo kitų rūšių gyvūnų tuo, kad jis yra sudarytas iš keturių kamerų: tinklainio, didţiojo prieskrandţio, knygenų ir šliuţo (2) iš kurių tik šliuţas turi liaukinę funkciją. Didysis prieskrandis neturi liaukinės dalies, apimtimi - tai pats didţiausias atrajotojų virškinimo sistemos trakte esantis skyrius. Jis randasi kairėje pilvo pusėje, uţima beveik visą tos pusės pilvo ertmės dalį, forma primena suspaustą maišą, o kaudalinė dalis yra uţsisukusi į dešinę pusę. Didysis prieskrandis vidutiniškai talpina 102-148 litrų turinio. Didţiojo prieskrandţio gleivinė išklota daugiasluoksniu plokščiuoju ragėjančiu epiteliu, paviršius yra šiurkštus, kadangi jis yra padengtas speneliais (20). Tokia didţiojo prieskrandţio sandara padidina jo paviršiaus plotą, per kurį vyksta medţiagų apykaita (21).
Didysis prieskrandis yra suskirstytas į maišus:
Priekinį, į kurį atsiveria stemplė, tarp apatinio didţiojo prieskrandţio maišo ir tinklainio;
Viršutinį, kuris savo kaudaliniame gale turi viršutinį akląjį maišą;
Apatinį, kurio priekinis galas dar vadinamas didţiojo prieskrandţio kišene, o kaudalinis galas turi apatinį akląjį maišą.
Atrajotojų didţiojo prieskrandţio gleivinėje nėra liaukų, išskiriančių virškinimo fermentus, tačiau jame yra didelė įvairovė mikroorganizmų, kurie išskiria maistines medţiagas skaidančius fermentus. (2, 24). Prieskrandţiuose pašarai yra apdorojami mechaniniu, cheminiu ir mikrobiologiniu būdu, tačiau didţiajame prieskrandyje vyksta pagrindiniai fermentacijos procesai, susiję su mikroorganizmais (24, 2).
Mikrobinis virškinimas didţiajame prieskrandyje uţima daug daugiau laiko, kadangi skaidomos sunkiai virškinamos daug ląstelienos turinčios medţiagos, o ţarnyne skaidomi paprastesni junginiai todėl ir virškinimo laikas ten atitinkamai trumpesnis. Virškinimo prieskrandyje laiko trukmė yra labai svarbi, nes kuo ilgiau uţtrunka mikrobiologinė fermentacija, tuo geriau yra suskaidomos maistinės medţiagos (22).
Didţiajame prieskrandyje turinys pasiskirsto nevienodai. Didţiojo prieskrandţio turinys yra pasidalinęs į tokias frakcijas:
1. Viršutinė dalis – dujos. Jos išsiskiria angliavandenių fermentacijos proceso metu ir į jų sudėtį įeina anglies dioksidas (CO2), metanas (CH4), vandenilio sulfidas (H2S), vandenilis (H2), azotas (N2) ir deguonis (O2).
2. Vidurinė dalis – skystas pašaras. Šiame sluoksnyje susikaupia stambesnės pašaro dalys kurios susimaišo su anksčiau pradėtu fermentuoti pašaru, gausu dujų burbuliukų,
10 kurie susidaro vykstant fermentaciniams procesams taip pat dalis oro yra nuryjama. Pašaro dalelės plūduriuoja paviršiuje ties dujų frakcija, jos ten plūduriuoja tol, kol yra dar pakankamai daug skaidomosios medţiagos.
3. Apatinė dalis – kietas ir sunkus pašaras. Susilpnėjus fermentacijos procesui, susilpnėja dujų išskyrimas iš skaidomos medţiagos, dalelės tampa sunkios ir jos sėsta į apatinį turinio sluoksnį. Leidimosi greitis yra priklausomas nuo fermentuojamų dalelių dydţio ir fermentacijos intensyvumo (23).
Anatominė atrajotojų virškinimo sistemos adaptacija sudarė sąlygas jiems naudoti celiuliozę kaip energijos šaltinį be papildomų išorinių B vitamino atsargų ar reikalingų aminorūgščių, dėl to, kad rumen mikroorganizmai sugeba patys pasigaminti šiuos produktus (2).
1.2 Didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos įvairovė ir reikšmė
Siekis padidinti didţiojo prieskrandţio medţiagų apykaitą skaidant augalų sienelės sudėtines dalis įgijo labai didelę svarbą gyvulininkystėje, nes mikroorganizmai, esantys didţiajame prieskrandyje geba ţemos kokybės augalinių pašarų pluoštus paversti produktais, kurie yra naudojami ţmonių reikmėms. Sąveika tarp atrajotojo organizmo ir mikrobinės ekosistemos leidţia skaidyti pašarus, kuriuose yra gausu augalinių pluoštų (24), bei maţai baltyminių sudedamųjų dalių (2). Angliavandeniai yra pagrindinės atrajotojų pašarų sudedamoji dalis ir pirminis energijos šaltinis, gaunamas iš pašaro. Suskaidytų medţiagų metabolizmas vyksta dėl sinchroninės mikroorganizmų išskiriamų fermentų veiklos didţiajame prieskrandyje (24). Sudėtingi ląstelės sandaros ypatumai, tokie kaip, sienelės netirpumas ir nepralaidumas sunkina fermentacijos procesus didţiajame prieskrandyje (26).
Nurytas pašaras patenka į didįjį prieskrandį, kuriame jis skaidomas įvairių mikroorganizmų. Mikroorganizmai didţiajame prieskrandyje pasiskirstę įvairiais kiekiais (13): didţiąją dalį sudaro anaerobinės bakterijos, po to – grybai ir pirmuonys, maţiausią dalį uţima archėjos. Skaičiumi,
rumen bakterijos yra gausiausi mikroorganizmai, tačiau nors pirmuonių yra maţiau, jie yra uţ
bakterijas daug didesni. Pagal biomasę pirmuonys ir bakterijos didţiajame prieskrandyje yra pasiskirstę panašiai. Mikroorganizmų tankis tarp skirtingų rūšių išlieka santykinai pastovus, kuomet šėrimo rėţimas yra stabilus. Staigus pašaro pakeitimas, pavyzdţiui pereinamuoju laikotarpiu, gali turėti pastebimų mikroorganizmų skaičiaus pakitimų (9, 11).
Rumen mikroorganizmai yra prisitaikę išgyventi įvairiomis sąlygomis, pavyzdţiui, juos
daţnai skiedţiant, ar atvirkščiai - esant dideliam mikroorganizmų ląstelių tankiui, aktyviai vykstant pirmuonių fagocitavimo procesams (24). Jie apdoroja apie 70-80 proc. virškinamos masės, patekusios į didįjį prieskrandį (28). Pagrindinis galinis metabolizmo produktas, gautas iš pašaro, kuris buvo fermentuojamas rumen mikroorganizmų yra lakiosios riebalų rūgštys (LRR) (2).
11 Didţiąją dalį pašaro skaidymo proceso atlieka grybai ir bakterijos (80 proc.), o pirmuonys prisideda maţa dalimi (20 proc.) (24). Jie visi fermentuoja pašaro sudedamąsias dalis, suformuodami ATP molekules, palaikyti jų pačių homeostazei ir augimui. Rumen mikroorganizmai gali sintezuoti 10 aminorūgščių, kurios yra būtinos ţinduolio gyvybiniams procesams audiniuose palaikyti (29). Rumen mikroorganizmai geba grūdines kultūras ar ţemos kokybės baltymus, ar ne baltyminį azotą paversti kokybišku mikrobiniu baltymu, kurį panaudoja savo reikmėms, arba juos verčia į LRR. (30). Skirtingos bakterijų ir pirmuonių rūšys atlieka skirtingas funkcijas. Vienos virškina krakmolą ir cukrų, kitos – celiuliozę. Kiekvieno mikroorganizmo skaičius ir santykis priklauso nuo gyvūno mitybos (28 , 31). Įvairių mikrobų mišinys yra būtinas, kad didysis prieskrandis funkcionuotų veiksmingai. (28). Didţiojo prieskrandţio mikroorganizmai yra niša, kurią atitinkamai paveikus būtų galima pasiekti didelio medţiagų apykaitos didţiajame prieskrandyje efektyvumo (29).
1.2.1 Pirmuonys ir jų reikšmė atrajotojo organizmui
Pirmuonių populiacija sudaryta iš dviejų poklasių, abu priklauso Ciliata klasei. Poklasiui
Holotrichs priklauso šios gentys: Isotricha, Dasytricha, Blepharacorys, Charon, Buetschilla.
Poklasiui Spirotrichia priklauso Entodinimorpha būrys, o jam priklauso šios gentys: Diplodinium,
Eremoplastron, Eudiplodinium, Entodinium, Eodinium, Polyplastron,Epidinium, Ostracodinium Ophryoscolex Opisthotrichum (31). Šie du poklasiai pasiţymi skirtingomis savybėmis dalyvaujant
virškinime bei medţiagų apykaitoje (7). Entodinium gentis yra labiausiai paplitusi ir sudaro 90% visų pirmuonių didţiajame prieskrandyje skaidant koncentruotus pašarus (32, 2).
Nors pirmuonių skaičius sudaro tik nedidelę dalį (5 proc.) mikrobinės biomasės, jie turi labai didelę reikšmę stabilizuojant fermentacijos procesus prieskrandyje. Pirmuonys buvo pasiūlyti naudoti kaip fermentacijos stabilizatoriai, nes jie fermentuoja atsarginius angliavandenius, tokius kaip cukrus ir krakmolas daug ilgesnį laiką nei bakterijos. Tai apsaugo nuo trumpos grandinės riebalų rūgščių atsiradimo turinyje, pH sumaţėjimo bei acidozės atsiradimo rizikos dėl padidėjusio pienarūgščių bakterijų kiekio. Rumen pirmuonys yra daţnai apibūdinami kaip pranašesni uţ bakterijas, nes sugeba suskaidyti daugiau rezervinių baltymų, tačiau naudoti pirmuonis kaip raciono priedą negalima todėl (30), kad pirmuonys neturi savybių augti laboratorinėmis sąlygomis. (30, 24). Didţiojo prieskrandţio pirmuonių veikla labai prisideda prie augalinių pašarų sienelės sudedamųjų dalių skaidymo ir jų išnykimas iš rumen ekosistemos gali turėti neigiamos įtakos virškinimui (24). Polyplastron ir Eudiplodinium pirmuonių gentys pasiţymi didţiausiu aktyvumu skaidant ir fermentuojant celiuliozę, kai tuo tarpu maţoji Entodinia ir Holotrichs celiuliozės neskaido. Moksliniais bandymais nustatyta, kad pirmuonys Epidinium caudatum ir Polyplastron
multivesiculatum gali suvirškinti iki 40 proc. celiuliozės in vitro praėjus 48 val. (33, 2). Nagrinėjant
grūdinių kultūrų virškinimą, didţiojo prieskrandţio pirmuonys atlieka įvairias ir svarbias funkcijas krakmolo metabolizmo procese. Pirmuonys krakmolą ir netirpius angliavandenius paverčia į
12 amilopektinus, kurie yra visų pirmuonių energijos šaltinis. Jį panaudojus Isotricha ir Entodinium gentys pradeda aktyviai gaminti fermentus, reikalingus pašaro virškinimui (33). Atlikti tyrimai rodo, kad pirmuonys išskiria visus fermentus, pasiţyminčius savybe skaidyti ląstelieną, bet platesnis jų fermentinio aktyvumo nagrinėjimas kol kas yra sudėtingas, nes pirmuonys neauga laboratorinėmis sąlygomis (24, 30).
Ląstelių sienelės virškinimo procesas vyksta dėl suderintų ir sudėtingų reakcijų. Tam tikrų pašaro struktūrinių dalių hidrolizės procesai vyksta tik tuomet, kai jas veikia atitinkamas savybes turintys fermentai. Didţiajame prieskrandyje veikia šie fermentai (24, 2):
skaidantys ląstelėse esančius angliavandenius - celiulazė, ksinalazė, β-gliukanazė, pektinazė, amilazė;
skaidantys baltymus - proteazė, fitazė;
skaidantys specifinius augalų toksinus.
1 lentelėje nurodyta kokiomis virškinimo savybėmis pasiţymi atskiros pirmuonių rūšys. Kad pašaras, kurį sudaro įvairūs komponentai būtų efektyviai skaidomas, reikalinga koordinuota šių mikroorganizmų veikla (24).
1 lentelė. Įvairių pirmuonių rūšių virškinimo tipai (24)
Pirmuonys: Virškinimo aktyvumo tipas
Celiuliolitinis Hemiceliuliolitinis Pektinolitinis
Eudiplodinium maggii Ostracodinium dilobum Epidinium caudatum Metadinium affine Eudiplodinium bovis Orphryoscolex caudatus Polyplastron multivesiculatum Diplodinium pentacanthum Endoploplastron triloricatum Orphyroscolex tricoronatus Ostracodinium gracile Entodinium caudatum Isotricha intestinalis Isotricha prostoma + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Nustatyta, kad didţiausiu fermentiniu aktyvumu pasiţymintys mikroorganizmai yra bakterijos. Jos turi didţiausią įtaką virškinimui didţiajame prieskrandyje, o pirmuonys turi nedidelį metabolinį aktyvumą jame. Todėl mokslininkai Wallace ir Cotta teigia, kad didţiojo prieskrandţio pirmuonių veikla yra labiausiai orientuota į pašarinių dalelių skaidymą ir bakterinių baltymų virškinimą, bet efektyvumas skaidant baltymus dar yra vertinamas prieštaringai (32, 34).
Pirmuonys nėra gyvybiškai svarbūs atrajotojams, tačiau tyrimai parodė, kad pašalinus pirmuonis iš didţiojo prieskrandţio sumaţėjo pašaro dalelių pilnavertiškas skaidymas ir perdirbimo
13 efektyvumas prieskrandyje. Nepaisant to, daugelis mokslininkų teigia, kad pirmuonių veikimo principas vis dar nėra gerai suprantamas. Neaišku, ar pirmuonys tiesiogiai prisideda prie ląstelieną skaidančių fermentų sekrecijos, ar jie sukuria palankias sąlygas bakterijų veikimui (10). Rumen pirmuonys taip pat pasiţymi šiomis teigiamomis savybėmis: yra svarbus nesočiųjų riebalų šaltinis, neutralizuoja toksinus, gautus su augaliniu pašaru, stabilizuoja „blogosios“ mikrofloros kiekį prieskrandyje tuo pačiu maţindami jų gaminamos pieno rūgšties kiekį (32). Didţiojo prieskrandţio pirmuonys atlieka svarbų vaidmenį metano gamyboje, nes atlikdami savo veiklą išskiria vandenilį, kuris naudojamas metanogenezėje (33, 35, 2).
Didţiojo prieskrandţio pirmuonių populiacija gali skirtis priklausomai nuo veiksnių, veikiančių gyvūną. Populiacijos įvairovė priklauso nuo gyvūno rūšies, metų laiko bei šėrimo tipo, - pirmuonių populiacija buvo skirtinga šeriant ţaliu pašaru ir pluoštiniais pašarais (9). Pereinamuoju laikotarpiu staigus pašaro pasikeitimas gali turėti neigiamos įtakos pirmuonių aktyvumui didţiajame prieskrandyje. Jie yra labai jautrūs staigiems pasikeitimams, todėl prie pašaro pasikeitimo atrajotojai turi būti pratinami palaipsniui (11). Labai svarbūs faktoriai, įtakojantys prieskrandţio turinio mikroorganizmų įvairovę yra vandens suvartojimo gausumas ir metų laikas. Faktoriai, kurie turi įtakos pirmuonių įvairovei didţiajame prieskrandyje gali būti skrandţio turinio surinkimo metodas bei vieta prieskrandyje, iš kurios paimamas turinys (9).
1.2.2 Bakterijos ir jų reikšmė atrajotojo organizmui
Bakterijos turi didţiausią įtaką virškinimui didţiajame prieskrandyje (33, 23). Fibrobacter
succinogenes, Ruminococcus flavefaciens ir Ruminococcus albus yra pagrindinės bakterijos,
atsakingos uţ augalų sienelės skaidymą rumen turinyje (24).
Didţiojo prieskrandţio bakterijos klasifikuojamos pagal tai, kokią medţiagą sintetina ir kokie yra galutiniai metabolizmo produktai. Dauguma bakterijų gali skaidyti įvairius substratus, tačiau taip pat yra labiau specializuotų (37).
Amilolitinės bakterijos skaido krakmolą ir tirpius angliavandenius pašare, bet negali suskaidyti celiuliozės, esančios ląstelės sienelėse ar kitų struktūrinių angliavandenių, kurių monomerai yra sujungti β-glikozidinėmis jungtimis. Kai gyvūnai yra gausiai šeriami grūdiniais pašarais, amilolitinės bakterijos gamina LRR taip greit, kad vandenilio jonų koncentracija prieskrandyje gali padidėti iki 10 - 50 kartų, lyginant su koncentracija prieš šėrimą (37).
Celiuliolitinės bakterijos lėtai skaido angliavandenius, kurie yra ląstelių sienėlęje, tokius kaip celiuliozė, hemiceliuliozė, fruktozė ir pektinas. Bakterijos prisitvirtina prie šių angliavandenių paviršiaus ir didelės jų molekulės yra padalijamos į maţesnes dalis panaudojant skirtingus fermentus. Celiuliozės ir hemiceliuliozės skaidymo procesas yra labai jautrus pH pasikeitimams: kai pH didţiajame prieskrandyje nukrenta iki 6, skaidymas labai sulėtėja (37).
14 Proteolitinės bakterijos skaido su pašaru gaunamus baltymus. Procesas vyksta,0 2kai bakterijų išskirta proteazė suskaido pašaro baltymus į peptidus ar aminorūgštis. Amino rūgštys yra panaudojamos mikroorganizmų sintezei ar deamininamos ir tokiu būdu gaunamos organinės rūgštys bei amoniakas. Amoniakas gali būti naudojamas kaip azoto šaltinis mikrobinių baltymų gamybai. Proteolitinių bakterijų veikimas yra naudingas pačiam atrajotojui, nes amoniakas ir aminorūgštys skatina angliavandenius skaidančių bakterijų augimą. Tačiau, jei atrajotojai būtų šeriami vien tik pašaru, kuriame gausu baltymų, skaidant juos pasigamintų didelis kiekis NH4+
, kuris gali veikti toksiškai (37).
Metanogeninės bakterijos. Metanas sudaro 30 – 40 proc. didţiojo prieskrandţio dujų. Metanogeninės bakterijos naudoja vandenilį anglies dioksido redukcijai, kad galėtų pagaminti metano dujas (37).
2-oje lentelėje pavaizduotas prieskrandyje randamų bakterijų virškinimo tipas. 2 lentelė. Įvairių bakterijų rūšių virškinimo tipai (24)
Bakterijos Virškinimo aktyvumo tipas
Celiuliolitinis Hemiceliuliolitinis Pektinolitinis
Fibrobacter succinogenes Ruminococcus albus Ruminococcus flavefaciens Butyrivibrio fibrisolvens Eubacterium cellulosolvens Clostridium longisporum Clostridium locheadii Prevotella ruminantium Eubacterium xylanophilum Ruminobacter amylophilus Succinimonas amylolytica Succinivibrio dextrinosolvens Selenomonas ruminantium Selenomonas lactilytica Lachnospira multiparus Streptococcus bovis Megasphaera elsdenii + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Mikroorganizmų kiekinei ir rūšinei įvairovei įtakos turi atrajotojo organizmas. Vanduo, kurį išgeria atrajotojas, yra reikalingas bakterijų augimui. pH taip pat yra labai svarbus veiksnys. Seilių gamyba ir jų patekimas į didįjį prieskrandį turi įtakos pH reguliacijai – svarbu palaikyti optimalų pH, nes bakterijos yra jautrios pH svyravimui (25). pH ypač aktualus pereinamuoju laikotarpiu, kuomet atrajotojai pradedami šerti koncentruotais pašarais. Jų sklilimo produktai rūgština rumen aplinką, todėl bakterinis aktyvumas maţėja (27).
1.3 Veiksniai turintys įtakos rumen mikroorganizmų aktyvumui
Pagrindiniai faktoriai, kurie turi įtakos didţiojo prieskrandţio mikroorganizmų augimui ir aktyvumui yra temperatūra, pH, buferinė talpa, osmotinis slėgis ir redokso potencialas. Šiuos
15 faktorius lemia aplinka. Normali didţiojo prieskrandţio temperatūra yra 39 – 39,5 °C ir ji gali staiga pakilti iki 41 °C po to, kai atrajotojas nuryja pašarą ir prasideda fermentinis jo apdorojimas. pH reikšmė yra priklausoma nuo seilių gamybos gausumo ir trumpos grandinės riebalų rūgščių absorbcijos, pašaro tipo. pH nuolatos kinta rumen turinyje, bet jis išlaiko 5,5 – 7,0 reikšmių ribas. Išlaikyti normalų pH padeda pašaro tipas, seilės. Mikroorganizmai, išskiriantys fermentus, yra jautrūs pH pasikeitimams – gali sumaţėti jų dauginimasis. Slėgis didţiajame prieskrandyje yra 250 mOsm/kg ir jam įtakos gali turėti fermentacijos procesas, pašaro tipas. Kuomet pašaras patenka į
rumen, osmotinis slėgis staiga padidėja nuo 350 iki 400 mOsm ir periodiškai sumaţėja per 8 – 10
val. (2,48).
Svarbiausi veiksniai, turintys įtakos mikroorganizmų populiacijai didţiajame prieskrandyje:
Gyvūno rūšis, veislė, amţius, rumen vystymosi etapas (49 - 51).
Racionas ir pašarų cheminė sudėtis (52).
Rumen turinio sluoksnis (52, 53).
Mitybos strategija (54).
Mėginio paėmimo ir šėrimo laikas (55).
Rumen turinio pH (56).
Individualios gyvulio savybės (56).
1.4 Didţiojo prieskrandţio mikrobinės ekosistemos reguliacija
Vartotojai ir sveikatos prieţiūros institucijos, ypač Europoje, vis daţniau diskutuoja apie cheminius pašarų priedų, tokių kaip jonoformų ir antibiotikų naudojimą. Siekiama sumaţinti jų ir padidinti gamtinių produktų panaudojimą gyvulininkystėje. Taigi, mokslininkai ieško naujų būdų, kurie gali padėti manipuliuoti didţiojo prieskrandţio fermentacijos procesus (36).
Gerinti atrajotojų sveikatą ir jų produkcijos našumą yra pagrindinis mokslininkų, susijusių su gyvulininkystės sektoriumi, tikslas. Mikrobiniai pašarų papildai, kaip natūralūs augimo skatintojai, gali atlikti svarbų vaidmenį gerinant atrajotojų sveikatą ir produktyvumą, uţkertant kelią ligoms, norint padidinti pageidaujamo mikroorganizmo augimą, išlaikyti didţiojo prieskrandţio turinio pH, pakeisti atrajotojų fermentacijos modelius, padidinti maistingųjų medţiagų virškinamumą ir maistinių medţiagų srautą į plonąją ţarną. Mikrobinių pašarų papildų apibrėţimas yra labai platus ir gali apimti specifines ir nespecifines mieles, grybus, bakterijas, ląstelių fragmentus ir filtratus. Mikrobiniai pašarų papildų preparatai turi teigiamą poveikį naminiam gyvūnui, gali gaminti antimikrobines medţiagas, geba ilgai funkcionuoti ir kolonizuoti didţiojo prieskrandţio ir ţarnų epitelio ląsteles. Mikrobinių pašarų papildų naudojimas gali sumaţinti kenksmingą patogeninių bakterijų rūšių poveikį atrajotojų virškinimo sistemai ir taip pagerinti gyvūnų našumą (12). Egzogeniniai ląstelieną skaidantys fermentai buvo pradėti naudoti, siekiant pagerinti virškinimą
16 didţiajame prieskrandyje, visai nesenai. Ląstelieną skaidantys fermentai gali padidinti rumen mikroorganizmų kolonizaciją aplink pašaro daleles, taip pašaras yra efektyviau virškinamas. Kai kurie fermentai yra ilgo veikimo ir gali funkcionuoti ne tik prieskrandyje, bet ir kituose virškinimo organuose (58).
1.4.1 Fermentų naudojimas rumen funkcijai reguliuoti
Kaip jau minėta ankstesniuose skyriuose, ląstelieną skaidančius fermentus gamina didţiąjame prieskrandyje esančios bakterijos ir grybai, kurie padeda skaidyti augalinius pluoštus. Natūralus pašaro virškinamumas didţiąjame prieskrandyje yra labia ţemas (<50 proc.). Nustatyta, kad pašaro virškinamumas gali būti pagerintas pridedant į karvių racioną egzogeninių fermentų (37). Arriola ir kt. mokslininkai teigė, kad fermentų pridėjimas į pašarą padidino maistinių medţiagų virškiniamumą, tačiau jie neturėjo įtakos jų pasisavinimui (38). Kombinuota celiulazės ir ksinalazės veikla turi daug didesnį pranašumą, nei fermentus kaip priedus naudojant atskirai (39). Naudingas egzogeninių fermentų veikimas priklauso nuo daugelio faktorių, tokių kaip pašaro sudėtis, fermentų tipo, jų stabilumo, specifinio aktyvumo, kiekio bei aplikacijos metodo (40).
Tyrimai, atlikti mokslininko Chung, parodė ryšius tarp fermentų priedo įtakos lakiųjų riebalų rūgščių (LRR) gamybai ir amoniako srauto, pH, bendro pirmuonių ir bakterijų skaičiaus. Jų kiekiai didţiojo prieskrandţio turinyje liko nepakitę. Papildţius racioną fermentais buvo pastebėta, kad taip pat padidėjo metano dujų gamyba didţiąjame prieskrandyje (28). Mokslininkai atlieka tyrimus, naudodami egzogeninius ląstelieną skaidančius fermentus, siekiant padidinti karvių pieno laktaciją. Vieni mokslinikai ištyrė, kad fermentai didina pieno laktaciją bei sausos medţiagos (SM) virškninamumą, kiti pasikeitimų nepastebėjo (18). Šie neatitikimai siejami su fermentų aktyvumo, naudojimo daţnumo ir kieko skirtumais, laktacijos periodu, didţiojo prieskrandţio mikrobiniu aktyvumu, pašaro stabilumu, specifiškumu (41). Papildomi veiksniai, kurie gali turėti įtakos netiksliems tyrimų atsakymams yra: netinkami eksperimentai, netinkama eksperimento trukmė, netinkamas fermentų parinkimas (39).
Egzogeninius fermentus, kurie yra naudojami atrajotojų mityboje, galima suskirstyti į tris pagrindines kategorijas: ląstelieną skaidantys, amilolitiniai ir proteolitiniai fermentai. Fitazė, kuri yra naudojama monogastrinio virškinimo tipo gyvūnams, pradedama daţnai taikyti atrajotojų šėrime. Atrajotojų dietos papildymas ląstelieną skaidančiais fermentais, teigiant daugeliui mokslininkų, padidina augalinių pluoštų virškinamumą 65-70 proc. (28).
Tyrimai parodė, kad egzogeninių fermentų priedai turėjo įtakos rumen mikroorganizmams. Fermentų pridėjimas padidina visomis virškinimo savybėmis pasiţyminčių bakterijų skaičių. Galima daryti išvadą, kad fermentai didina mikrobinę biomasę didţiajame prieskrandyje, o tai gerina angliavandenių skaidymą (42).
17 1.4.2 Mielių naudojimas rumen funkcijai reguliuoti
Mielės gyvulio organizmui yra naudingos tuo, kad jose yra daug organizmui naudingų medţiagų, tokių kaip vitaminai, mineralinės medţiagos, lengvai skaidomi baltymai, nukleininės rūgštys ir fermentai. Šios medţiagos turi teigiamos įtakos pašarų virškinamumui, o geras virškinamumas sąlygoja gerą sausųjų medţiagų pasisavinimą iš pašaro. Kuomet atrajotojai pasisavina iš pašaro daugiau sausųjų medţiagų – tuo pieno primilţiai yra didesni. (5).
Atlikti bandymai su mielių priedais rodo, kad jie padidina celiuliolitinių mikroorganizmų kiekį rumen turinyje (5, 44) o padidėjęs jų kiekis didina pH reikšmę didţiajame prieskrandyje. Kai
rumen turinio pH reikšmė yra aukštesnė, skatinamas ląstelieną skaidančių (43), tokių kaip kaip Fibrobacter succinogenes ir Ruminococcus albus (44) bei laktatus utilizuojančių (43), tokių kaip Selemonas ruminantium ir Meganosphera elsdenii (44) bakterijų skaičiaus augimas bei aktyvumas
(43). Taip pat mielių priedai sudaro nepalankias sąlygas bakterijoms, kurios gamina pieno rūgštį (Streptococcus bovis) (44). Šis mielių veikimas per bakterijas yra kaip prevencinė priemonė, norint išvengti acidozės.(5, 45, 46, 43). Mokslininkai Brossard ir kiti nustatė, kad naudojant mielių priedus keičiasi ir pirmuonių kiekybinė bei kokybinė sudėtis. Tiriant mielių priedo įtaką telyčių didţiojo prieskrandţio mikroorganizmams buvo nustatyta, kad naudojant mielių metabolitus didėja bendras pirmuonių skaičius, o naudojant gyvas mieles – jis maţėja. Nėra atlikta daug tyrimų su pirmuonimis, todėl, kad jie nėra auginami laboratorinėmis sąlygomis. (44).
Saccharomyces cerevisiae yra daţniausiai naudojama mielių kultūra, kuri dedama į pašarų
priedus atrajotojams (46). Tyrimais įrodyta, kad šių mielių priedas didindamas bakterijų skaičių, didina jų aktyvumą fermentuojant pašarą, tuomet didėja virškinamumas. Bakterijų skaičiaus didėjimas yra aiškinamas tuo, kad mielės sunaudoja į rumen kartu su pašaru patekusį deguonį. Deguonis yra toksiškas prieskrandyje veikiančioms bakterijoms, todėl mielės sudaro anaerobines salygas. Tokiose sąlygose dauginasi bakterijos. (46). Taip pat nustatyta didesnė LRR koncentracija, aukštesnis pH. (5, 45, 46, 43). Teigiama, kad poveikis S. cereviciae yra labai skirtingas. Jis priklauso nuo to, kokios pašaro sudedamosios dalys sudaro karvių racioną ir kokios yra naudojamos mielės. Skirtingi mielės skirtingai prisitaiko rumen aplinkoje. (47).
18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŢIAGA
2.1 Tyrimo vieta, sąlygos, schema
Tyrimai atlikti 2017–2018 metais LSMU VA Virškinimo fiziologijos ir patologijos moksliniame centre prie Anatomijos ir fiziologijos katedros. Tyrimo objektas buvo Lietuvos juodmargių veislės pieninės karvės, laikomos Panevėţio raj. esančios akcinės bendrovės ūkyje, kuriame uţtikrinamos gerovės sąlygos vadovaujantis Ūkinės paskirties gyvūnų gerovės reikalavimais (59).
Bandymas su pieninėmis karvėmis buvo vykdomas dviem etapais:
I. pereinamuoju iš ganyklinio į tvartinį laikotarpiu mėginiai buvo imami 3 kartus, t. y. pirmą kartą ganyklinio laikotarpio pabaigoje, antrą – pereinant prie tvartinio raciono ir trečią – tvartinio laikotarpio pradţioje. Šis etapas truko 32 dienas, iš kurių 12 dienų buvo paruošiamasis tarpsnis, t. y. vienos grupės karvės su pašarais gavo tiriamąjį priedą, ir 20 dienų – tiriamasis tarpsnis.
II. tvartiniu laikotarpiu mėginiai buvo imami 3 kartus, t. y. vieną kartą per mėnesį. Šis etapas truko 72 dienas, iš kurių 12 dienų buvo paruošiamasis ir 60 dienų – tiriamasis tarpsniai.
Vykdant bandymą, buvo atsiţvelgta LR Gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymą (60), Mokslo ir mokymo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo, prieţiūros ir naudojimo reikalavimais (61). Mėginiai surinkti vadovaujantis VMVT išduotu leidimu atlikti bandymo su gyvūnais projektą (G2-60, 2017-02-15).
Tyrimo schema yra pavaizduota 1 paveiksle.
19
2.2 Bandomosios karvės, grupių sudarymas
Bandymui buvo pasirinktos kliniškai sveikos 6 karvės atsiţvelgiant į jų kūno masę (vid. 500 kg), vidutinį paros primilţį (vid. 30 kg), laktacijų skaičių (2–4 lakt.) ir laiką po apsiveršiavimo (5–6 sav.). Karvės buvo laikomos besaičiu būdu, girdytos iš automatinių girdyklų at libitum, melţiamos 2 kartus per dieną (4 ir 16 val.). Karvės buvo šeriamos du kartus per dieną (7 ir 17 val.) visų raciono pašarų mišiniu (angl. total mix ration – TMR), be to ganykliniu laikotarpiu 6 val. per dieną buvo ganykloje. Abiejų laikotarpių racionai buvo subalansuoti pagal proteinų bei energijos poreikius ir atitiko karvių mitybos fiziologines normas (62). Bandomųjų karvių mitybos ypatumai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Bandomųjų karvių mityba Laikotarpiai
Ganyklinis Pereinamasis Tvartinis
10:00–16:00 – ganykloje: kultūrinių pievų ir ganyklų ţolė, susidedanti iš daugiametės svidrės (70%) raudonųjų dobilų (30%) at
libitum
7:00 ir 17:00 – tvarte:
TMR, susidedantis iš ţolių
siloso (52%), kukurūzų siloso (16%) ir kombinuotųjų pašarų (32%)
Vienai karvei vidutiniškai apskaičiuota, kad per vieną ganymosi valandą ji suėda 1 kg ţolės sausosios medţiagos (SM), t. y. 6 kg SM per dieną. TMR buvo skiriama 17 kg SM. Dienos raciono maistingumas sudarė apie 155 MJ neto energijos laktacijai.
Ganyklinis laikotarpis baigėsi spalio 2 d.
Spalio 3 d. prasidėjo
tvartinis laikotarpis ir
adaptacija prie šėrimo tik TMR
TMR, susidedantis iš ţolių
siloso (52%), kukurūzų siloso (16%) ir kombinuotųjų pašarų (32%), papildytas vitaminais ir mineralinėmis medţiagomis. Šeriamos – 07:00 ir 17:00 val.
Vienai karvei per dieną buvo skiriama 23 kg sausųjų medţiagų ir raciono maistingumas sudarė 156 MJ neto energijos laktacijai
TMR, susidedantis iš ţolių
siloso (52%), kukurūzų siloso (16%) ir kombinuotųjų pašarų (32%), papildytas vitaminais ir mineralinėmis medţiagomis. Šeriamos – 07:00 ir 17:00 val.
Vienai karvei per dieną buvo skiriama 23 kg sausųjų medţiagų ir raciono maistingumas sudarė 156 MJ neto energijos laktacijai
Karvės buvo suskirstytos į dvi grupes:
Kontrolinė (K) grupė – karvės (n=3), kurios buvo šeriamos konkretaus laikotarpio racionu (3 lent.).
Tiriamoji (T) grupė – karvės (n=3), kurioms į konkretaus laikotarpio racioną buvo įterpiama 10,5 g tiriamuojo priedo, sudaryto iš egzogeninių angliavandenius skaidančių fermentų mišinio ir mielių. Su tiriamuoju priedu kiekviena karvė per dieną vidutiniškai gavo ksilanazės – 3,7 × 105 tarptautinių aktyvumo vienetų (U), celiulazės – 4,5×105
20
Saccharomyces cerevisiae – 1010 kolonijas sudarančių vienetų (KSV). Kiekviename tyrimų etape
paruošiamasis tarpsnis, kurio metu vyko adaptacija prie tiriamojo priedo, truko 12 dienų.
2.3 Rumen turinio ėmimas, transportavimas
Abiejų grupių karvių didţiojo prieskrandţio turinio mėginiai buvo imami praėjus vidutiniškai 4,5 val. po rytinio šėrimo, naudojantis ryklės–stemplės zondu GDZ–1 (63). Kiekviename tyrimų etape rumen mėginiai buvo imami po tris kartus:
I etape pirmą kartą mėginys buvo imamas paskutinę ganyklinio laikotarpio dieną, pasibaigus paruošiamajam tarpsniui (I-0 d.); antrą kartą – praėjus 10 dienų nuo tvartinio laikotarpio pradţios (I-10 d.); trečią kartą – praėjus 20 dienų nuo tvartinio laikotarpio pradţios (I-20 d.).
II etape pirmą kartą mėginys buvo imamas tvartiniu laikotarpiu, pasibaigus paruošiamajam tarpsniui (II-0 d.), antrą kartą – praėjus 30 dienų (II-30 d.) ir trečią kartą – 60 dienų nuo pirmojo mėginio paėmimo (II-60 d.).
Kiekvienos karvės rumen turinys buvo supiltas į pašildytą termosą ir sandariai uţdaryti termosai patalpinti į termodėţę iš putų polistirolo, siekiant išlaikyti temperatūrinį rėţimą iki tyrimų pradţios. Mėginius pristačius į laboratoriją, jie nedelsiant buvo tiriami pagal ţemiau aprašytas metodikas.
2.4 Pirmuonių skaičiaus tyrimo ir jų genčių identifikavimo metodika
Pirmuonių skaičiaus tyrimui 2 ml rumen turinio mėginio buvo praskiesti distiliuotu vandeniu santykiu 1:5 ir fiksuoti kambario temperatūroje 4 lašais 3,5 proc. formalino tirpalu. Paruošto mėginio lašas buvo įlietas į Fuchs-Rosenthal skaičiavimo kamerą (Blaubrand, Wertheim, Vokietija) ir mikroskopuojamas Olympus BX43 mikroskopu (Hamburgas, Vokietija) su 40 kartų padidinimu. Kameros langeliuose matomi pirmuonys buvo fotografuojami su mikroskope integruota kamera Olympus U-TV1X-2 (Tokyo, Japonija). Kiekvienas mėginys buvo mikroskopuojamas po du kartus.
Analizuojant nuotraukas buvo skaičiuojamas kiekviename kameros tinklelio langelyje esančių pirmuonių bendras ir atskirų jų genčių skaičiai. Pirmuonių skaičius 1 ml rumen turinio (X) buvo apskaičiuotas pagal 1 formulę:
kur a – pirmuonių skaičius kameros tinklelyje; 5 – praskiedimo kartai; 3,2 – kameros tūris ir 1000 – koeficientas.
Rezultatuose pateiktas pirmuonių skaičius 1 ml turinio (Y) yra išreikštas dešimtainiu logaritmu (log10/ml), kuris apskaičiuotas pagal 2 formulę:
Y=log10 (X), 2 , 3 1000 5 a X
21 kur X – pirmuonių skaičius 1 ml rumen turinio, apskaičiuotas pagal 1 formulę.
Didţiojo prieskrandţio pirmuonys buvo identifikuojami, analizuojant mėginių nuotraukas, ir suskirstyti į gentis vadovaujantis Dehority metodika (7).
Identifikuojant pirmuonių gentis buvo atsiţvelgiama į pirmuonių išvaizdos skirtumus bei dydį, kurie yra nurodyti 4 lentelėje.
4 lentelė. Pirmuonių genčių skirtumai
Ilgis, µm Plotis, µm Branduolio forma
Spyglių skaičius
Operkulas Balkstie-nėlės Eudiplodinium 105-198 56-120 Kablio 0
Nepaste-bimas
1
Epidinium 102-150 44-72 Pailgas 0-5 Maţas Aplink burnos ertmę
Dasytricha 45-100 25-50 Apvalus 0 Nepaste-bimas
Aplink kūną Polyplastron 123-205 98-123 Lazdelės 0 Didelis,
atsikišęs
1 Ostracodinium 58-133 36-54 Įvairi 0-2 Įvairus 1
Entodinium 22-95 11-68 Įvairi 0-6 Nėra Aplink burnos
ertmę
Gentis: Entodinium (2 pav.) Šios genties blakstienotasis epitelis yra išsidėstęs aplink burnos ertmę. Pulsuojančioji vakuolė ir branduolys yra nematomas ir lokalizuotas nugarinėje dalyje. Maţasis branduolys yra šiek tiek arčiau. Nėra vienos konkrečios ląstelės skeleto padėties (9).
2 paveikslas. Entodinium genties pirmuonių dydis (autoriaus nuotrauka)
Gentis: Dasytricha (3 pav.) Šios genties infuzorijų kūnas yra kiaušinio formos, blakstienėlės apima visą kūną. Mikro ir makro branduoliai yra viduryje arba nugarinėje dalyje, ląstelė neturi pulsuojančiosios vakuolės (9).
22
3 paveikslas. Dasytricha genties prmuonių dydis (autoriaus nuotrauka)
Gentis: Epidinium spp. (4 pav.) Blakstienėlės yra lokalizuotos aplink burną, branduolys yra kiaušinio formos. Šios genties pirmuonys ląstelėje daugiau neturi jokio išskirtinio bruoţo. Kūno skeletas susideda iš 3 dešiniųjų, kairiųjų ir centrinių membranų (9).
4 paveikslas. Epidinium genties pirmuonių dydis (autoriaus nuotrauka)
Gentis: Eudiplodinium (5 pav.) Ši gentis apima mikroorganizmus, kurie turi dorsalinę
blakstieną, vieną siaurą skeleto plokštelę, kablio formos branduolį ir branduolėlį kablio „akyje“ (9).
5 paveikslas. Eudiplodinium genties pirmuonių dydis (autoriaus nuotrauka)
Gentis: Polyplastron (6 pav.) Turi dvi siauras lygiagrečiai einančias skeleto plokšteles, kurios
gali būti suijungusos. Polyplastron turi 9 pulsuojančias vakuoles ir išsikišusį išraiškingą operkulą. Dydis priklauso nuo augimo salygų - 123 µm kai auginama in vitro be pašalinės mikrofloros, 175 µm – normalus dydis, 205 µm – kuomet praryja maţąsias pirmuonių rūšis (9).
23
6 paveikslas. Polyplastron genties pirmuonių dydis (autoriaus nuotrauka)
Gentis: Ostracodinium (7 pav.) Turi dorsalines blakstienėles ir platų skeletą, kuris gali būti
įvairių formų. Šios genties rušys gali turėti arba ne kaudalinį dangtelį (9).
7 paveikslas. Ostracodinium genties pirmuonių dydis (autoriaus nuotrauka)
2.5 Bendro bakterijų skaičiaus ir jų aktyvumo rodiklių tyrimo metodikos
Bendras bakterijų skaičius (BBS) rumen turinyje tiriamas van Gylswyk metodu (64). Šio metodo esmė ta, kad bakterijos auginamos specialiuose deguoniui nepralaidţiais kamščiais uţdaromuose Hungate mėgintuvėliuose, kuriuose, pripildţius juos anglies dioksidu, sudaromos anaerobinės sąlygos.
Tiriant, 10 g rumen turinio buvo praskiesta anaerobiniu skiedikliu, kurio sudėtyje buvo distiliuoto vandens, K2HPO4, NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4×7H2O ir indigokarmino. Sumaišius ir praskiedus iki reikiamo laipsnio, atlikti sėjimai į terpę, kuri buvo papildyta gliukoze, krakmolu ir ksilanu. Mėgintuvėliai buvo inkubuoti 39°C temperatūroje 72 valandas. Po to bakterijų suformuotos kolonijos buvo skaičiuojamos stereomikroskopu (Olympus SZX7, Japonija).
Rezultatuose pateiktas BBS (X) yra išreikštas kolonijas sudarančių vienetų dešimtainiu logaritmu 1 ml turinio (log10KSV/ml) ir apskaičiuotas pagal 3 formulę:
X=log10 (a),
24 Didţiojo prieskrandţio turinio bakterijų aktyvumo du rodikliai: redukcinis bakterijų aktyvumas ir gliukozės rūgimo reakcija buvo tiriami pagal A. Sederevičiaus ir kitų mokslininkų aprašytas metodikas (63):
tiriant redukcinį bakterijų aktyvumą, išreiškiamą sekundėmis (s), 20 ml rumen turinio sumaišoma su 1 ml metileno mėlynojo 0,3 proc. tirpalu, kurį bakterijos redukuoja (norma iki 180 s) ir jis netenka spalvos.
tiriant gliukozės rūgimo reakciją, išreiškiamą kubiniais centimetrais CO2 išskirto per 1 val. (cm3/h), 10 ml rumen turinio sumaišoma su 0,5 ml 16 proc. gliukozės tirpalu ir, uţpildţius Einhorno sacharometrą, po 1 val. vertinamas CO2 gamybos intensyvumas (norma 1–2 cm3/h).
2.6 Tyrimo rezultatų statistinių skaičiavimų metodika
Tyrimo metu, naudojantis IBM® SPSS® Statistic 20 ir Microsoft Exel 2010 programomis apskaičiuoti tiriamųjų rodiklių aritmetiniai vidurkiai (Xv), aritmetinių vidurkių paklaidos (±Sx), aritmetinių vidurkių skirtumų patikimumo koeficientas (p), koreliacijos koeficientai tarp pirmuonių ir bakterijų rodiklių (rs), regresinės analizės determinacijos koeficientas (R2
). Statistiškai patikimi tyrimo rezultatai ţymimi p<0,05 ir p<0,01, o statistiškai nepatikimi – p>0,05 (65).
25
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Didţiojo prieskrandţio turinio mikrobiologinių rodiklių pereinamajame
laikotarpyje rezultatai
I tyrimų etapo, t. y. pereinamojo iš ganyklinio į tvartinį laikotarpio metu kontrolinės grupės (K) karvės buvo šeriamos konkrečiam laikotarpiui būdingu racionu. Tiriamosios grupės (T) karvių racionas buvo papildytas fermentų mišinio ir mielių priedu. Buvo ištirti bandomųjų karvių didţiojo prieskrandţio turinio mikrobiologiniai rodikliai: bendras pirmuonių skaičius (BBS), identifikuotos 6 pirmuonių gentys: Entodinium, Ostracodinium, Polyplastron, Dasytricha, Epidinium,
Eudiplodinium, redukcinis bakterijų aktyvumas (RBA), gliukozės rūgimo reakcija (GRR) ir bendras
bakterijų skaičius (BBS). Visų šiame etape tirtų rodiklių rezultatai pateikti 3.1.1. – 3.1.4 skirsniuose.
3.1.1 Didţiojo prieskrandţio mikroorganizmų skaičiaus rodiklių analizė I etapo metu I etapo pirmuonių skaičiaus bandomųjų karvių rumen turinyje rezultatai pateikti 5 lentelėje. 5 lentelė. I etapo pirmuonių skaičiaus bandomųjų karvių rumen turinyje rezultatai
Rodiklis
Mėginio ėmimo laikas
I - 0 d. I - 10 d. I - 20 d.
Kontrolinė Tiriamoji Kontrolinė Tiriamoji Kontrolinė Tiriamoji BPS log10/ml 5,35 ±0,08 5,36 ±0,06 5,33 ±0,17 5,44 ±0,11 5,31 ±0,15 5,62 ±0,16 Gentys: Eudiplodinium log10/ml 1,95 ±1,95 4,12 ±0,08 2,29 ±2,00 4,05 ±0,76 2,41 ±2,13 3,04 ±2,64 Epidinium log10/ml 0 3,87 ±0,37 0 2,84 ±2,49 2,77 ±2,48 3,04 ±2,67 Dasytricha log10/ml 3,58 ±0,39 1,95 ±1,95 3,39 ±0,17 3,95 ±0,49 3,74 ±0,43 4,22 ±0,65 Polyplastron log10/ml 1,75 ±1,75 3,77 ±0,27 1,06 ±1,84 3,85 ±0,48 2,33 ±2,02 2,77 ±2,42 Ostracodinium log10/ml 1,60 ±1,60 0 0 1,06 ±1,84 0 1,06 ±1,84 Entodinium log/ml 5,33 ±2,14 3,49 ±0,30 4,46 ** ±1,67 3,49 ** ±2,42 8,84 ±3,20 10,99 ±1,93 Kitos log10/ml 1,61 ±1,54 1,53 ±1,53 3,00 ±0,1 1,16 ±2,02 0 0
**p<0,01; statistinis patikimumas nustatytas lyginant tiriamąją grupę su kontroline.
Kaip matome iš 2 lentelės duomenų, kontrolinės grupės karvių, kurios buvo šeriamos atitinkamai ganykliniu arba tvartiniu racionu, bendras pirmuonių skaičius kiekvieną mėginių ėmimo dieną maţėjo ir I-20 d., t. y. tyrimo pabaigoje, jis buvo 0,04 log10/ml (p>0,05) maţesnis nei I-0 d., t.
26 y. kai karvės 6 val. per dieną ganėsi. Tiriamosios grupės BPS kiekvieną mėginių ėmimo dieną didėjo ir I-20 d. buvo 0,26 log10/ml didesnis (p>0,05) nei I-0 d. BPS lyginant tarp grupių, šis rodiklis I-0 d. buvo 0,01 log10/ml (p>0,05), I-10 d. – 0,11 log10/ml (p>0,05), I-20 d. – 0,31 log10/ml (p>0,05) buvo didesnis tiriamojoje grupėje, tačiau šie rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi.
Eudiplodinium genties pirmuonių kontrolinėje grupėje neţymiai daugėjo (5 lent.): praėjus 10
dienų nuo pirmojo mėginio paėmimo (I-10 d.) šios genties pirmuonių skaičius išaugo 0,34 log10/ml (p>0,05), o praėjus dar 10 dienų (I-20 d.) – 0,12 log10/ml (p>0,05). Tiriamojoje grupėje šios genties skaičiai maţėjo: nuo tyrimo pradţios praėjus 10 dienų (I-10 d.) skaičius sumaţėjo 0,07 log10/ml (p>0,05), o praėjus dar 10 dienų (I-20 d.) – 1,01 log10/ml (p>0,05). Tačiau tiriamosios grupės karvių didţiojo prieskrandţio turinyje Eudiplodinium genties pirmuonių kiekvienu mėginio ėmimo laiku buvo nustatyta atitinkamai 2,17, 1,76 ir 0,63 log10/ml daugiau (p>0,05) nei kontrolinėje grupėje.
Kontrolinėje grupėje Epidinium genties pirmuonių I-0 ir I-10 mėginių tyrimo etapais nebuvo aptikta, tačiau I-20 šios genties skaičius siekė 2,77 log10/ml. Tiriamojoje grupėje šios genties pirmuonių skaičius kito nevienodai ir I-10 d. buvo maţesnis 1,03 log10/ml (p>0,05) uţ I-0 d., o I-20 d. rodiklis buvo 0,2 log10/ml (p>0,05) didesnis uţ I-10 d. Paskutinę tyrimo dieną (I-20 d.) tiriamosios grupės karvių rumen turinyje Epidinium genties pirmuonių buvo 0,27 log10/ml (p>0,05) daugiau nei kontrolinės grupės karvių.
Dasytricha genties pirmuonių skaičius kontrolinėje grupėje kito netolygiai. Nuo tyrimo
pradţios praėjus 10 d. (I-10 d.) šios genties pirmuonių skaičius sumaţėjo 0,19 log10/ml (p>0,05), o po dar 10 dienų (I-20 d.) padidėjo 0,35 log10/ml (p>0,05). Tiriamojoje grupėje Epidinium genties pirmuonių skaičius didėjo ir po 10 dienų (I-10 d.) jis išaugo net 2 log10/ml (p>0,05), po dar 10 dienų (I-20 d.) – 0,27 log10/ml (p>0,05). Kontrolinėje grupėje Dasytricha skačius buvo didesnis tik I-0 tyrimo dieną lyginant su tiriamąja grupe ir skirtumas buvo lygus 1,63 log10/ml (p>0,05). I-10 ir I-20 tyrimo dienomis šios genties pirmuonių skaičius buvo didesnis tiriamojoje grupėje ir atitinkamai nuo kontrolinės grupės jis skyrėsi 0,56 log10/ml (p>0,05) ir 0,48 log10/ml (p>0,05).
Polyplastron kontrolinėje grupėje kito nevienodai. Lyginant I-0 d. ir I-10 d. rezultatus, šios
genties pirmuonių skaičius sumaţėjo 0,69 log10/ml (p>0,05), o praėjus dar 10 dienų (I-20 d.) padidėjo 1,27 log10/ml (p>0,05). Tiriamojoje grupėje per pirmąsias 10 tyrimo dienų (I-10 d.) šių pirmuonių skaičius padidėjo 0,08 log10/ml (p>0,05), o 20-tą tyrimo dieną (I-20 d.) jis buvo 1,08 log10/ml maţesnis (p>0,05) nei I-10 tyrimo dieną. Visomis I etapo mėginių ėmimo dienomis tiriamojoje grupėje šios genties pirmuonių buvo daugiau nei kontrolinėje: I-0 d. – 2,02 log10/ml (p>0,05), I-10 d. – 2,79 log10/ml (p>0,05), I-20 d. – 0,44 log10/ml (p>0,05).
Ostracodinium genties pirmuonys buvo aptikti kontrolinėje grupėje tik pas vieną karvę I-0
tyrimo metu. Tiriamojoje grupėje I-0 d. tyrimo metu taip pat pirmuonių nebuvo aptikta, sekančių dienų tyrimuose ši gentis buvo aptikta vienodais kiekiais.
27 Epidinium genties pirmuonių kontrolinėje grupėje (5 lent.) per pirmąsias 10 tyrimo dienų
(I-10 d.) sumaţėjo 0,87 log10/ml (p>0,05), o per sekančias 10 dienų (I-20 d.) padaugėjo net 4,38 log10/ml (p>0,05). Tiriamojoje grupėje šios genties pirmuonių skaičius I-0 ir I-10 mėginių ėmimo dienomis išliko toks pats, o I-20 d. išaugo 7,5 log10/ml (p>0,05). kontrolinėje grupėje šių pirmuonių skaičius I-0 d. buvo 1,84 log10/ml (p>0,05), I-10 d. – 0,97 log10/ml (p<0,01) didesnis nei tiriamojoje grupėje, o I-20 mėginių tyrimo dieną nustatytas 2,15 log10/ml (p>0,05) didesnis Entodinium genties pirmuonių skaičius tiriamojoje grupėje.
Abiejų grupių karvių rumen turinyje nepavyko identifikuotų pavienių pirmuonių.
3.1.2 Didţiojo prieskrandţio turinio bendro bakterijų skaičiaus ir jų aktyvumo rodiklių tyrimo rezultatai
I etapo bendro bakterijų skaičiaus ir jų aktyvumo rodikliai bandomųjų karvių rumen turinyje rezultatai pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. I etapo bendro bakterijų skaičiaus ir jų aktyvumo rodiklių bandomųjų karvių rumen turinyje tyrimo rezultatai
Rodiklis
Mėginio ėmimo laikas
I - 0 d. I - 10 d. I - 20 d.
Kontrolinė Tiriamoji Kontrolinė Tiriamoji Kontrolinė Tiriamoji RBA, s 107,67 ±15,53 99,00 ±14,11 129,67 ±16,62 98,00 ±8,00 103,67 ±10,26 95,00 ±8,54 GRR, cm3/h 1,57 ±0,21 1,60 ±0,26 1,43 ±0,25 1,70 ±0,53 1,60 ±0,46 1,97 ±0,21 BBS log10KSV/g 11,08 ±0,16 11,15 ±0,07 10,92** ±0,12 11,34** ±0,08 11,10* ±0,05 11,27* ±0,06
**p<0,01; *p<0,05, * - statistinis patikimumas nustatytas lyginant tiriamąją grupę su kontroline.
Iš 3 lentelėje pateiktų duomenų matome, kad kontrolinėje karvių grupėje, perėjus prie tvartinio raciono (I-10 d.), redukcinis bakterijų aktyvumas sulėtėjo 22 s (p>0,05), praėjus dar 10 dienų (I- 20 d.) RBA pagreitėjo 26 s (p>0.05) ir buvo 4 s greitesnis (p>0,05) nei ganykliniu laikotarpiu (I-0 d.). Tiriamojoje grupėje RBA palaipsniui greitėjo ir I-20 d. buvo 4 s (p>0,05) greitesnis nei I-0 d. Lyginant RBA trukmę tarp kontrolinės ir tiriamosios grupių, I-0 dieną šis rodiklis buvo 8,67 s (p>0,05), I-10 d. – 31,67 s (p>0,05), I-20 d. – 8,67 s (p>0,05) greitesnis nei kontrolinėje grupėje.
Gliukozės rūgimo reakcija kontrolinėje grupėje kito nevienodai (6 lent.). I-0 – I-10 d. laikotarpiu šis rodiklis sumaţėjo 0,06 cm3
/h (p>0,05), o I-10 – I-20 d. laikotarpiu padidėjo 0,07 cm3/h (p>0,05). Nuo tyrimo pradţios (I-0 d.) paskutinę šios grupės tyrimo dieną (I-20 d.) šis rodiklis padidėjo 0,03 cm3/h (p>0,05). Tiriamojoje grupėje šis rodiklis palaipsniui didėjo: I-0 – I-10 d. laikotarpiu jis padidėjo 0,1 cm3
28 kontrolinę grupę su tiriamąja, tiriamojoje grupėje šis rodiklis kiekvieną mėginių tyrimo dieną buvo didesnis uţ kontrolinę: I-0 – 0,03 cm3
/h (p>0,05), I-10 – 0,27 cm3/h (p>0,05) ir I-20 d. 0,37 cm3/h (p>0,05).
Bendras bakterijų skaičius (BBS) abiejose grupėse kito nevienodai (6 lent.). Kontrolinėje grupėje BBS per pirmąsias 10 tyrimo dienų (I-10 d.) sumaţėjo 0,16 log10KSV/ml (p>0,05), o per sekančias 10 dienų padidėjo 0,18 log10KSV/ml (p>0,05). I-20 tyrimo dieną BBS buvo didesnis 0,02 log10KSV/ml (p>0,05) uţ I-0 d. Tiriamojoje grupėje BBS per pirmąsias 10 tyrimo dienų (I-10 d.) padidėjo 0,14 log10KSV/ml (p<0,05), o per sekančias 10d. (I-20 d.) sumaţėjo 0,07 log10KSV/ml (p>0.05). I-20 tyrimo dieną BBS buvo didesnis 0,12 log10KSV/ml uţ I-0 d. duomenis (p>0,05). Lyginant tarp grupių visomis mėginio tyrimo dienomis tiriamojoje grupėje BBS buvo didesnis. I-0 d. – 0,07 log10KSV/ml (p>0,05), I-10 d. – 0,42 log10KSV/ml (p<0,05), I-20d. – 0,17 log10KSV/ ml (p<0,05).
3.1.3 Didţiojo prieskrandţio mikrobiologinių rodiklių koreliacinė analizė
I etapo bandomųjų karvių didţiojo prieskrandţio mikrobiologinių rodiklių koreliacinės analizės rezultatai pateikti 7 ir 8 lentelėse.
7 lentelė. Koreliaciniai ryšiai tarp I etapo kontrolinės grupės karvių rumen turinio mikrobiologinių rodiklių Rodikliai B P S Eudipl odini um Epidi nium Dasy tri cha Poly plast ron Ostracodinium Entodi nium RBA GRR BBS 0,228 -0,073 0,333 0,387 0,217 -0,090 -0,312 -0,173 0,604++ GRR -0,186 -0,520+ 0,086 -0,204 -0,340 0,001 -0,401+ 0,150 - RBA -0,402+ 0,029 -0,329 -0,254 -0,555+ -0,264 -0,084 - Entodinium -0,044 0,343 0,219 0,471+ 0,003 0,302 - Ostracodinium -0,145 0,309 -0,263 -0,390 -0,350 - Polyplastron 0,640++ -0,227 0,101 0,486+ - Dasytricha 0,376 0,093 0,582+ - Epidinium 0,140 0,040 - Eudiplodinium -0,281 - BPS -
++ - aukšta koreliacija, + - vidutinė koreliacija
Aukšta koreliacija (7 lent.) nustatyta kontrolinėje grupėje tarp BBS ir GRR (r = 0,604, p>0,05), taip pat tarp Polyplastron ir BPS (r=0,640, p>0,05). Vidutinė teigiama koreliacija
29 nustatyta tarp Entodinium ir Dasytricha pirmuonių genčių (r=0,471, p>0,05), tarp Polyplastron ir
Dasytricha genties pirmuonių (r=0,486, p>0,05) ir tarp Dasytricha bei Epidinium genties pirmuonių
(r=0,582, p>0,05). Vidutinė neigiama koreliacija nustatyta tarp GRR ir Eudiplodinium genties pirmuonių (r=-0,520, p<0,05), GRR ir Entodinium pirmuonių (r=-0,401, p>0,05), RBA ir
Polyplastron genties pirmuonių (r=-0,555, p>0,05), RBA ir BPS (r=-0,402, p>0,05).
8 lentelė. Koreliaciniai ryšiai tarp I etapo tiriamosios grupės karvių rumen turinio mikrobiologinių rodiklių Rodikliai B P S Eudipl odini um Epidi nium Dasy tri cha Poly plast ron Ostracodinium Entodi nium RBA GRR BBS 0,267 -0,148 -0,176 0,737*/++ -0,122 -0,036 0,113 0,278 -0,031 GRR 0,744*/++ 0,137 0,335 0,454+ 0,165 0,552+ -0,069 -0,006 - RBA 0,101 0,553+ 0,632++ 0,389 0,553+ -0,020 -0,575+ - Entodinium -0,135 -0,377 -0,574+ -0,051+ -0,373 -0,028 - Ostracodinium 0,269 0,303 0,341 0,237 0,288 - Polyplastron 0,126 0,982**/++ 0,757*/++ -0,091 - Dasytricha 0,662++ -0,163 -0,062 - Epidinium 0,164 0,836**/++ - Eudiplodinium 0,069 - BPS -
++ - aukšta koreliacija, + - vidutinė koreliacija, ** - p<0,01, * - p<0,05.
Aukšta teigiama koreliacija bei reikšmingas statistinis patikimumas (8 lent.) tiriamojoje karvių grupėje, kurių racionas buvo papildytas egzofermentų ir mielių priedu, nustatytas tarp
Polyplastron ir Eudiplodinium pirmuonių genčių (r=0,982, p<0,01), taip pat tarp Epidinium ir Eudiplodinium (r=0,836, p<0,01), ir tarp Polyplastron ir Epidinium (r=0,757, p<0,05), tarp GRR ir Dasytricha (r=0,737, p<0,05), bei tarp GRR ir BPS (r=0,744, p<0,05). Dasytricha ir BPS (r=0,662,
p>0,05) bei RBA ir Epidinium (r=0,632, p>0,05) rodė taip pat aukštus koreliacinius ryšius, bet jie nebuvo statistiškai reikšmingi. Vidutinė teigiama koreliacija nustatyta tarp GRR ir Dasytricha, GRR ir Ostracodinium, RBA ir Eudiplodinium, RBA ir (r=0,552 - 0,454), bet šie ryšiai nebuvo statistiškai patikimi. (p>0,05). Vidutinė neigiama koreliacija nustatyta tarp RBA ir Entodinium,
Entodinium ir Epidinium, Entodinium ir Dasytricha (r=-0,051--0,575), tačiau ryšiai taip pat neturėjo
