LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARINĖS MEDICINOS STUDIJŲ PROGRAMA
Vida Stravinskaitė
6 kursas, 2 grupėMASTITO SUKĖLĖJŲ PAPLITIMAS LIETUVOS
GALVIJŲ POPULIACIJOJE
PREVALENCE OF MASTITIS PATHOGENS IN
LITHUANIAN CATTLE POPULATION
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. dr. Vida Juozaitienė
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Mastito sukėlėjų paplitimas Lietuvos galvijų populiacijoje“:
1. Yra atliktas mano pačio.
2. Nebuvo naudojamas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2014 Vida Stravinskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe 2014 Vida Stravinskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO ... ... ...
Prof. dr. Vida Juozaitienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS GYVŪNŲ VEISIMO KATEDROJE
Prof. dr. Vida Juozaitienė
(aprobacijos data) (katedros vedėjo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro darbas yra įdėtas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretorės parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8 1.1 Mastito profilaktika ... 8 1.2 Mastito diagnostika ... 9
1.3 Karvių fiziologinės būklės įtaka mastito sukėlėjų paplitimui ... 11
1.4 Karvių laikymo aplinkos sąlygų įtaka mastito sukelėjų paplitimui ... 14
1.5 Metų sezono sąlygų įtaka mastito sukėlėjų paplitimui ... 16
1.6 Veršingumo skaičiaus ir karvių amžiaus įtaka mastito sukėlėjų paplitimui ... 18
1.7 Karvių produktyvumo ir mastito sukelėjų paplitimo ryšys ... 20
2. DARBO VIETA IR METODIKA ... 21
2.1. Tyrimų laikas, vieta, apimtis ir metodai ... 21
2.2 Mastito sukėlėjų nustatymo metodai ... 21
3. TYRIMŲ REZULTATAI... 27
3.1 Mastitų sukėlėjų tyrimai bendro karvių tešmens pieno kiekio mėginuose ... 27
3.2 Mastitų sukėlėjų paplitimo karvių tešmens ketvirčių pieno mėginiuose analizė ... 34
3.3 Somatinių ląstelių skaičiaus tyrimai pieno kiekio mėginuose ... 37
3.4 Dispersinės analizės tyrimas ... 40
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS ... 43
IŠVADOS IR PASIŪLYMAI ... 48
SANTRAUKA
Mastitas – viena iš dažniausių ir nuostolingiausių pieninių galvijų ligų.
Darbo tikslas buvo nustatyti mastito sukėlėjų paplitimą Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje. Įvertinti mastito sukėlėjų paplitimą Lietuvoje veisiamų pieninių galvijų bandose. Ištirti metų laiko įtaką mastitų sukėlėjų pasireiškimui karvių piene. Įvertinti mastitų sukėlėjų paplitimą karvių tešmens ketvirčiuose. Ištirti metų sezono ir mastito sukėlėjų įtaką somatinių ląstelių skaičiui pieno mėginiuose.
Tyrimai buvo atlikti 2011-2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijoje.
Mastito sukėlėjų rūšių ir jų grupių tyrimus sudarė sudarė 3622 karvės, o skirtingų tešmens ketvirčių pieno mėginių tyriamąją imtį sudarė 40 karvių.
Tiriamųjų mėginių imtis, kuriai buvo nustatytas somatinių ląstelių skaičius piene sudarė 2997 mėginių.
Staphylococcus spp. labiausiai buvo paplitęs žiemą (35,68 proc.), rudenį (27,62 proc.) ir
vasarą (25,39 proc.). Pavasario sezonu labiausiai paplitęs – Staphylococcus aureus (32,77 proc.). Vasaros metu nustatyta didžiausia mastitų sukėlėjų įvairovė.
Užkrečiamieji patogenai labiausiai buvo paplitę žiemą (40,27 proc.) ir pavasarį (35,62 proc.) Vasarą – aplinkos mikroorganizmai (26,56 proc.).
Visuose tešmens ketvirčiuose labiausiai paplitęs buvo Staphylococcus aureus (40-50 proc.) Daugiausiai iš tešmens ketvirčių buvo išskirta užkrečiamųjų patogenų (45,46 -59,09 proc.) Mažiausias SLS buvo vasaros laikotarpio metu tirtuose mėginiuose 456,5±29,4 tūkst./ml, žiemą nustatyta didžiausias somatinių ląstelių skaičius (583,3±74,3 tūkst./ml).
Iš tirtų mėginių daugiausiai buvo išskirta Staphylococcus aureus - 27,56 proc., o labiausiai vyraujanti grupė buvo užkrečiamieji patogenai (31,57 proc.),
Dispersinės analizės tyrimai parodė, kad metų sezonas ir sukėlėjo klasė turėjo statistiškai reikšmingos įtakos somatinių ląstelių skaičiui karvių piene (p=0,0001), tačiau tešmens pusės įtaka pieno mėginių somatinių ląstelių skaičiui statistiškai patikima nebuvo (p=0,652), kaip ir karvių tešmens ketvirčiai (p=0,558).
SUMMARY
Mastitis is one of the most frequent and costly disease in dairy cattle.
The objective of this study was to estimate mastitis pathogens prelavence in Lithuanian dairy cattle population. Evaluate the prevalence of mastitis pathogens in dairy cattle herds in Lithuania. Investigate influence of the season to mastitis pathogens manifestation in cow‘s milk. Evaluate the prevalence of mastitis pathogens in udder quarters. Investigate effect of the season and mastitis pathogens on somatic cell count in milk samples.
Studies were carried out in 2011-2013 at the Lithuanian University of Health Sciences, Lithuania Veterinary Academy.
Research of mastitis pathogens species and groups consisted of 3622 samples, whereas research of different udder-quarters consisted of 40 milk samples. Investigation of somatic cell count composed of 2997 cow‘s milk samples.
Staphylococcus spp. infections were most prevalent during the winter (35,68 %), autumn
(27,62 %) and summer time (25,39 %). The most prevalent in the spring season was Staphylococcus
aureus (32,77 %). The highest variety of mastitis pathogens was find in summer season.
Contagious pathogens were most prevalent in winter (40,27 %) and spring (35,62 %) seasons. In the summer dominant group was environmental pathogens (26,56 %).
The most common bacteria in all udder quarters was Staphylococcus aureus (40,0-50,0 %). Infectious pathogens were most isolated from udder quarters (45,46 -59,09 %).
The lower SCC was found in samples examined during the summer (456,5±29,4 thousand cell per ml), whereas highest rate of SCC was found in the winter season - 583,3±74 thousand cell per ml.
The results showed that the infectious agent species, group and season had a statistically significant effect on the somatic cell count in milk (p = 0.0001), but udder-halves influence on somatic cell count was not statistically significant (p = 0.652), as well as cow's udder-quarters (p = 0.558).
ĮVADAS
Mastitas – viena iš dažniausių ir nuostolingiausių pieninių galvijų ligų. Tai tešmens infekcija sukeliama mikroorganizmų, kurie patenka į tešmens ketvirtį per jo spenio gale esančią angą. Kai tešmuo yra veikiamas didelio skaičiaus mikrobų, pavyzdžiui dėl nešvarios aplinkos ar pažeistų spenių, kas sudaro sąlygas lengvesnei mikroorganizmų invazijai, tuomet didėja infekcijos pasireiškimo tikimybė (Thoberg, 2008).
Mastitas charakterizuojamas, kaip klinikinis arba subklinikinis, priklausomai nuo to ar pasireiškia klinikiniai simptomai ( http://www.dairyco.org.uk/technical-information/animal-health-welfare/mastitis/pathogens-the-cause-of-mastitis/ prieiga naudota 2013 04 22). Klinikinis mastitas gali toliau būti klasifikuojamas į lengvos, vidutinės ir sunkios formos mastitą (Thoberg, 2008).
Slaptasis karvių mastitas 15-40 kartų labiau paplitęs už klinikinę formą. Apie 30-60 proc. karvių nuolat serga slaptuoju mastitu. Lietuvoje serga 43-47 proc., Norvegijoje 24,1 proc., Suomijoje 37,9 proc., Švedijoje 33 proc. laktuojančių karvių (Rudejevienė, 2007). Tokių atvejų metu nėra matomų tešmens ketvirčių ar iš jų gaunamo pieno pokyčių, tačiau to pasekmė yra maženė pieno produkcija ir padidėjęs somatinių ląstelių skaičius (Thoberg, 2008), kas yra svarbus šios ligos požymis. Sveikos karvės piene SLS būna mažiau nei 100 tūkst./ml (Rudejevienė, 2007).
Tarptautinės pieno federacijos duomenimis klinikine forma serga 2-10 proc. laktuojančių karvių (Aniulis ir Japertas, 2001).
Ekonominiai nuostoliai atsiranda dėl sumažėjusio produktyvumo, pablogėjusių pieno technologinių savybių, negautų veršelių, išlaidų mastitų diagnostikai ir gydymui, karvių brokavimo.
Pavyzdžiui, Anglijoje kasmet užregistruojama apie 1 milijoną klinikinių mastitų atvejų (~40 proc. nuo turimų karvių). Taigi, dėl vienos, sergančios slaptuoju mastitu, laktuojančios karvės pieno produkcijos sumažėjimo patiriamas ~400 litrų nuostolis (Aniulis E., Japertas S. 2001), o esant klinikiniam atvejui gali siekti iki daugiau nei 700 kg (Seegers et al., 2003). Apskaičiuota, kad ligos sukelti metiniai nuostoliai siekia 1000-3000 € Belgijoje, 75-150 £ Didžiojoje Britanijoje, 150-300 € Olandijoje ir 500-1000 € Prancūzijoje (Stoliuk and Valchuk, 2011).
Mastitą gali sukelti daugiau nei 140 skirtingų rūšių mikroorganizmų. Tai gali būti įvairios mikroskopinės gyvybės formos, tokios kaip bakterijos, mikoplazmos, mielės, grybai, dumbliai ir retais atvejais virusai. Tačiau, bakterijos išlieka pagrindine tešmens infekcijų priežastimi. (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Mikroorganizmus, kurie dažniausiai sukelia mastitą, galima skirstyti į dvi kategorijas: užkrečiamieji ir aplinkos (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Kontaginiai arba užkrečiamieji mikroorganizmai gyvena ant karvės odos paviršiaus ir dauginasi infekuotų spenių ir ketvirčių viduje. Šios bakterijos plinta nuo karvės karvei, pagrinde, per užterštą melžimo įrangą, rankšluosčius ar plovimo/higienines servetėles, per melžimo procese dalyvaujančių asmenų rankas. Pagrindinės bakterijos yra šios: Staphylococus aureus, koaguliazei neigiami stafilokokai - KNS, Streptococcus agalactiae ir Mycoplasma spp.
Aplinkos mikroorganizmai gyvena ir dauginasi karvės aplinkoje: mėšle, dirvoje, pakratuose, vandenyje, augaluose. Taigi juos pašalinti yra sunku. Bloga spenių dezinfekcija ar nešvarių kaniulų intramamarinis naudojimas yra pagrindinė priežastis infekcijai pasireikšti (http://www.medvet.umontreal.ca/rcrmb/en/page.php?p=5&tm=h prieiga naudota 2013 11 30). Trys pagrindinės aplinkos bakterijų grupės, kurios sukelia mastitą: Streptococcus rūšys, žinomos kaip aplinkos streptokokai (išskyrus S. agalactiae), koliforminės bakterijos ir enterokokai. Streptokokai, kurie kelia didžiausią pavojų yra Streptococcus uberis ir Streptococcus dysgalactiae. Trys pagrindinės koliforminės bakterijos: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae ir Enterobacter
aerogenes. Dažniausiai išskiriami enterokokai: Enterococcus faecalis ir Enterococcus faecium
(Rutkauskas ir Tušas, 2011).
KNS grupei, kurie buvo išskirti mastitų tyrimo metu, priklauso daugiau nei dešimt rūšių, iš kurių labiausiai paplitę yra šie: S. epidermidis, S. chromogenes, S. warneri, S. xylosus.
Kitos bakterijų rūšys galinčios sukelti mastitą: Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium
spp., Pasteurella spp., Mannheimia haemolytica, Nocardia spp., Fusobacterium necrophorum, Mycobacterium spp., Bacillus spp., Serratia spp. Pasitaiko pavieniai, sporadiniai atvejai.
Taip pat su mastito etiologija gali būti siejamos kai kurios grybų ir dumblių rūšys (Popescu, 2010).
Darbo tikslas
Nustatyti mastito sukelėjų paplitimą Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje.
Darbo uždaviniai
Atlikti karvių pieno mastito sukelėjų tyrimus ir įvertinti jų paplitimą Lietuvoje veisiamų pieninių galvijų bandose.
Ištirti metų laiko įtaką mastito sukelėjų pasireiškimui karvių piene. Įvertinti mastito sukelėjų paplitimą karvių tešmens ketvirčiuose.
Ištirti metų sezono ir mastito sukelėjų įtaką somatinių ląstelių skaičiaus fenotipei variacijai karvių pieno mėginiuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Mastito profilaktika
Yra daug ir įvairių veiksnių predisponuojančių mastito pasireiškimą, todėl šią ligą lemia kompleksas faktorių, kurie yra vienodai svarbūs. Per didelis dėmesys vieno faktoriaus eliminavimui lyginant kito veiksnio atžilvgiu gali neduoti laukiamų rezultatų. Todėl reikia kreipti dėmesį į visus veiksnius, turinčius įtakos mastitų pasireiškimui, tokiu atveju bus pasiektas geriausias rezultatas (Kandrotienė, 2007).
Geriausias būdas šiai ligai užkirsti kelią yra profilaktika. Profilaktika – pats efektyviausias mastito gydymo būdas (http://www.gpk.lt/dokumentai/Kaip_isvengti.pdf prieiga naudota 2013 01 08). Bendras profilaktikos tikslas yra sumažinti mastito sukėlėjų kiekį bandoje. Tam karvėms reikia sudaryti tinkamas sąlygas, kad mastito sukėlėjų plitimo grandinė būtų nuolat nutraukiama (Paulauskas, 2009).
Nors visus reikalavimus atitinkanti profilaktika nėra pigi, tačiau jos netaikant ar griežtai nesilaikant, išlaidos dėl nuostolių bus žymiai didesnės.
Taigi, siekiant užkirsti kelią karvių tešmens uždegimams, svarbiausi veiksniai yra šie:
- Optimalios laikymo sąlygos. Svarbi gera tvarto ventiliacija, tvartuose neturi susidaryti skersvėjai, turi būti įrengta mėšlo šalinimo sistema arba mėšlas turi būti dažnai ir reguliariai šalinamas kitais būdais, gyvulių guoliavietės privalo būti šiltos bei sausos.
- Visavertė mityba. Siekiant sukurti subalansuotą racioną privalu atsižvelgti į karvės amžių, laktacijos laikotarpį, pieningumą, aplinką. Nuo šių veiksnių priklauso kiek ir kokiais santykiais karvės turi gauti pagrindinių maistingųjų medžiagų (Japertas ir Japertienė, 2010). - Tešmens paruošimas melžimui. Tinkamai apdorojus spenius prieš melžimą yra sumažinamas
mikroorganizmų skaičius tiek ant jų ir jų galiukų. Tuomet mažiau bakterijų patenka į spenio kanalą, kas ir lemia mažesnį naujų infekcijų pasireiškimą.
- Optimali tešmens plovimui skirto vandens temperatūra – 37-40 °C ir ne per gausus vandens naudojimas, kitu atveju yra suminkštinama tešmens oda ir susilpninama odos barjero apsauginė funkcija.
- Individualios šluostymo/higieninės servetėlės. Naudojant atskiras servetėles bakterijų skaičius ant spenių paviršiaus yra sumažinamas bent penkis kartus ir yra stabdomas patogeninių mikroorganizmų plitimas tiesioginio kontakto būdu.
- Tinkamai eksplotuojama melžimo technika. Atliekant kasmetinę įrangos patikrą galima išvengti ar maksimaliai sumažinti neigiamą melžimo įrangos įtaką karvių sergamumui tešmens uždegimu.
- Tinkamas melžiklių uždėjimas. Svarbu, kad prieš uždedant melžiklius speniai būtų švarūs, sausi, sveiki. Laikyti visus melžimo įrenginius švariai, gumines melžimo aparatų dalis plauti bei periodiškai keisti (http://www.gpk.lt/dokumentai/Kaip_isvengti.pdf prieiga naudota 2013.11.10).
- Spenių dezinfekcija po melžimo. Dezinfekavus spenius rizika ligos pasireiškimui sumažinama apie 50 proc.
- Ankstyva mastito diagnostika. Norint laiku nustatyti sergančias karves rekomenduojama jas tirti dėl mastito kartą per mėnesį. Reiktėtų patikrinti likus 10-14 dienų iki užtrūkinimo ir po apisiveršiavimo praėjus 8-10 dienų. Vertėtų tikrinti ir užtrūkusias karves, bei nuolatos
stebėti ir vertinti jų tešmens sveikatingumo būklę.
(http://www.gpk.lt/dokumentai/Kaip_isvengti.pdf prieiga naudota 2013.11.10).
- Lėtiniu mastitu sergančių karvių brokavimas. Patartina brokuoti nuo praeitų metų užsikrėtusias ir po gydymo užtrūkimo metu nesveikstančias, bei tas karves, kurios per laktaciją sirgo tris kartus klinikiniu mastitu (Japertas ir Japertienė, 2010).
- Susirgimo priežasties išaiškinimas ir likvidavimas. Gydymas, nepašalinus susirgimą sukėlusių veiksnių, bus beprasmis, kadangi efektas bus matomas tik gydymo laikotarpiu ir netrukus po gydymo pabaigos karvės vėl užsikrės ir susirgs mastitu (http://www.gpk.lt/dokumentai/Kaip_isvengti.pdf prieiga naudota 2013.11.10).
1.2 Mastito diagnostika
Pirmiausia klinikinis mastitas diagnozuojamas remiantis anamneze, kurią sudaro informacija apie ligos pradžią ir galimas priežastis sukėlusias uždegimą, tokias kaip gyvulio laikymo, šėrimo, eksplotacijos sąlygos.
Toliau atliekamas tešmens klinikinis tyrimas, įskaitant termometriją, kvėpavimo, ruminacijos dažnį, pulso skačiavimą, tikrinami limfiniai mazgai, apžiūrima ar yra tešmens ir spenių odos pažeidimų, įvertinamas ketvirčių tolygus išsivystymas, jų deformacija, kreipiamas dėmesys į tešmens kraujagysles, limfagysles. Palpacijos būdu nustatoma tešmens konsistencija, edemiškumas, skausmingumas, pieno cisternos ir kanalo pralaidumas. Pagal organoleptines pieno savybes galima spręsti apie uždegimo pobūdį.
Remiantis surinktais anamnezės duomenimis ir klinikiniu tyrimu nustatomas uždegimo pobūdis ir diferencijuojama uždegimo forma. Esant reikalui, sekretas, paimtas į sterilius mėgintuvėlius, siunčiamas labaratoriniam tyrimui, norint nustatyti sukelėjo rūšį ir atlikti antibiotikogramą (Aniulis ir Japertas, 2001).
Slaptojo mastito diagnostika. Vienas pagrindinių slaptojo mastito požymių – padidėjęs somatinių ląstelių skaičius piene. SLS karvių piene nustatomas tiesioginiu t.y. Preskoto – Brido (SLS apskaičiavimas mikroskopuojant), kuris laikomas tiksliausiu nustatymo metodu (Rudejevienė, 2007), elektroniniu, pvz., kaip „Fossomatic“, „Anadis“, „Somascope MK2“ ir kt., ir netiesioginiu, tokiais, kaip ekspres diagnostikos testais: CMT, Mastestas, Mastirapid ir kt. metodais. Somatinių ląstelių skaičiaus nustatymo CMT ekspres diagnostikos testu esmė yra ta, kad paviršinio aktyvumo medžiagos suardo somatinių ląstelių sieneles ir jų branduolius bei skatina jų agliutinaciją į gumulėlius. Suirusios ląstelės pienui suteikia klampumo ir tąsumo. Kuo didesnis SLS piene, tuo pienas bus klampesnis (Aniulis ir Japertas, 2001). Pieno SLS nustatymas yra populiariausia pieno kokybės bei sergančių karvių nustatymo priemone visame pasaulyje. Ekspres metodo tyrimus reikia patvirtinti kitų tyrimų duomenimis, ypač mikroorganizmų išskyrimu iš pieno (Rudejevienė, 2007).
Sumažėjusi pieno produkcija. Esant mastitui, vienas iš labiausiai akivaizdžių parametrų - bandos bendro pieno produkcijos kiekio sumažėjimas. Klinikinio atvejo metu pieno produkcija gali sumažėti apie 15-18 proc. (http://www.omafra.gov.on.ca/english/livestock/dairy/facts/06-049.htm
prieiga naudota 2013 06) ar netgi iki 20-30 proc. bendros karvės duodamos produkcijos kiekio per laktaciją. Subklinikinio mastito atveju pieno produkcijos kiekio sumažėjimas nėra toks didelis - apie 5 proc., bet gali siekti ir iki 10-15 proc. (Stoliuk and Valchuk, 2011).
Diagnostikai siūloma matuoti pieno elektros pralaidumą (PEP). Pieno elektros pralaidumas padidėja dėl pakitusios jonų koncentracijos piene. Sveikų karvių PEP yra 4-5,5 milisensų (mS/cm). Padidėjęs, iki 6 mS/cm ar daugiau PEP indukuoja patologinius procesus pieno liaukoje. PEP įtakai turi ir kiti veiksniai: laktacijos stadija, pieno riebumas, įvairios ligos (Aniulis ir Japertas, 2001). Matuojant PEP pieno temperatūra turi būti 25 °C (Rudejevienė, 2007).
` Pieno pH vertinimas. Sveikų karvių pieno pH – 6,5-6,8. Mastitų atveju pH gali parūgštėti – pH<6,5 arba pašarmėti – pH>6,8. Pieno pH pokyčiai yra nustatomi atliekant SLS tyrimą, kadangi tokiuose testuose yra indikatorius reaguojantis į pieno rūgštingumo kitimą (Aniulis ir Japertas, 2001). Pieno pH nustatyti gali būti naudojami filtriniai popieriai su indikatoriniais ploteliais kiekvienam tešmens ketvirčiui. Tačiau pastebėta, kad spalviniai indikatoriai padeda nustatyti tik 60-70 proc. slaptųjų mastitų (Aniulis ir kt., 2001).
Padidėjusi proteinų koncentracija. Pagrindinio aukštos maistinės vertės proteino kazeino sumažėja, o žemesnės kokybės išrūgų baltymų padaugėja (Rudejevienė, 2007). Bendrųjų baltymų
padidėjusi koncentracija aiškinama greitesniu pieno produkcijos kiekio mažėjimu negu proteinų sintezės. Iš kitos pusės, kuomet mažėja produkcijos kiekis kartu sumažėja kazeino ir kitų proteinų koncentracija. Nustatyta, kad serumo proteinai kompensuoja kazeino netekimą.
Padidėjusi riebalų koncentracija. Šis reiškinys aiškinamas lėčiau mažėjančia riebalų sinteze lyginant su pieno sekrecijos sumažėjimu.
Laktozės ir citrato koncentracijos sumažėjimas. Infekcijos pasekoje tešmenyje yra pažeidžiamas barjeras tarp kraujo ir pieno. Pieno liaukos epitelio ląstelių pažeidimas atveria plyšelius į kraujo kapiliarus, esančius tarp pieną gaminančių sekrecijos ląstelių. Taigi, citratas ir dalis laktozės, esančių piene, patenka į kapiliarus ir tokiu būdu jų koncentracijos piene mažėja. Laktozės koncentracija gali kisti dėl tešmens sekrecinių ląstelių pažeidimo ar funkcijos susilpnėjimo. Pieno produkcijai krentant, krenta ir laktozės koncentracija. (http://www.omafra.gov.on.ca/english/livestock/dairy/facts/06-049.htm prieiga naudota 2013 07).
LDH aktyvumo nustatymas piene gali būti tinkamas naudoti ankstyvajai mastitų diagnostikai ir yra matuojamas spektrofotometru. Atliktais tyrimais LDH aktyvmas buvo didesnis sergančių mastitais karvių piene, negu sveikų. Tačiau nebuvo reikšmingo LDH skirtumo sergančių ir sveikų karvių kraujo serume (Mohammadian, 2011).
1.3 Karvių fiziologinės būklės įtaka mastito sukėlėjų paplitimui
Svarbus faktorius, susijęs su karvių fiziologine būkle yra laktacijos periodas (Thoberg, 2008). Fadlelmoula (2007) atliktais tyrimais nustatyta, kad ankstyvosios laktacijos ir pieno liaukos involiucijos periodu pieno liauka yra jautriausia ligai ir šiuo periodu bendro mastitų paplitimo procentas, lyginant su kitais periodais, buvo didžiausiais ir siekė 30,9 proc., o Elbably ir kt. (2011) atliktais tyrimais nustatyta dar didesnis bendro mastitų palitimo procentas t.y. 45,5 proc.
Ligos pikas pastebimas pirmąjį laktacijos mėnesį, daugiausiai dėl pasireiškiačio funkcinio streso kūnui, o ypač tešmeniui. Sergamumas naujomis tešmens infekcijomis padidėja nuo paskutinės savaitės iki veršiavimosi (Stoliuk and Valchuk, 2011), nes piene sumažėja laktoferino koncetracija ir somatinių ląstelių veiksmingumas naikinant mikroorganizmų invaziją (Rutkauskas ir Tušas, 2011), ir laktacijos pradžioje (Stoliuk and Valcuk, 2011), dažniausiai dėl infekcijos, kuri prasidėjo vėlyvuoju užtrūkimo laikotarpiu (Rutkauskas ir Tušas, 2011). Laktacijos metu mastito paplitimas palaipsniui sumažėja ir vėl padidėja užtrūkinimo metu (Stoliuk and Valchuk, 2011). Atlikti tyrimai patvirtina, kad mastito paplitimas yra didesnis ankstyvojoje laktacijoje ir mažesnis laktacijos viduryje (Demelash Biffa et al., 2005).
Karvės mastitais dažniau serga intensyvios laktacijos metu po apsiveršiavimo (Burcenich et al., 2003). Mastito plitimui įtakos turi ir laktacijos trukmė. Jei laktacija trunka 200 dienų, serga 8,3
proc., jei 201-400 dienų – 31,4 proc., jei daugiau kaip 400 dienų – 56,2 proc. karvių (Waage, 1999; Rudejevienė, 2007).
Taip pat susirgimui mastitais turi įtakos laikotarpis po apsiveršiavimo. Tešmens ketvirčių atžvilgiu subklinikinio mastito paplitimas buvo 21,2 proc. 7-100 dieną po apsiveršiavimo ir 34,5 proc. 101-305 dieną po apsiveršiavimo. 7-100 dieną ir 101-305 dieną po apsiveršiavimo buvo 16,0 proc. ir 7,4 proc. Staphylococcus aureus, 51,5 ir 50,6 proc. koaguliazei neigiamų stafilokokų, 0,0 ir 0,8 proc. Streptococcus agalactiae ir 19,4 ir 15,6 proc. kitoms stafilokokų rūšims, Escherichia coli 1,0 ir 4,0 proc., bei Corynebacterium bovis 25,7 ir 45,1 proc. teigiamų mėginių, atitinkamai (Busato A. et al., 2000). Kitais tyrimais nustatyta, kad šansų santykis telyčioms susirgti mastitu per pirmąsias 5 d. lyginant su kitais laktacijos periodo intervalais yra žymiai didesnis, o po penktos laktacijos dienos šis santykis greitai ir stipriai nukrito. Daugiaveršėms karvėms taip pat nustatyta didesnė rizika susirgti mastitu per pirmąsias penkias laktacijos dienas lyginant su tolimesniu laktacijos periodu, tačiau buvo trys kartus mažesnis nei pirmaveršėms (Steeneveld et al., 2008).
Tyrimų istorijos eigoje buvo gauti prieštaringi rezultatai vertinant laktacijos stadijos įtaką KNS mastitų pasireiškimui. Remiantis keliais atliktais tyrinėjimais, didžiausias KNS intramamarinės infekcijos paplitimas būdingas telyčioms arti veršiavimosi periodo (Oliver and Sordillo, 1988; White et al., 1989; Fox et al., 1995). Kai kurie tyrimai nurodė, kad laktacijos stadija neturi įtakos nustatytų KNS infekcijų paplitimui (Harmon and Langlois, 1989), tuo tarpu kiti tyrinėjimai nurodė, kad KNS sukelta infekcija daugiausiai pasireiškia vėlesniuose laktacijos etapuose vyresnio amžiaus karvėms (Davidson et al., 1992) ir ankstyvojoje laktacijos stadijoje pirmaveršėms karvėms (Gröhn et al., 2004; Taponen et al., 2007; Thoberg, 2008).
Dauguma tyrimų parodė, kad didžiausias KNS paplitimas yra veršiavimosi metu. Dažniausiai naujos KNS infekcijos pasireiškia užtrūkinimo laikotarpiu, todėl būtent veršiavimosi metu didelis tešmens ketvirčių procentas yra užsikrėtęs šia bakterija. Infekcijų skaičius žymiai sumažėja pirmąjį laktacijos mėnesį dėl spontaniško pasveikimo, vėliau paplitimas iš esmės lieka pastovus iki laktacijos pabaigos. Be to, ši bakterija dažnai pasitaiko pirmosios laktacijos metu (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Karvės, kurios bent kartą buvo sirgusios Staphylococcus aureus sukeltu mastitu turi didesnę reinfekcijos galimybę. Be to, galimybė, kad karvė vėl bus infekuota Staphylococcus aureus bakterijos, didėja didėjant laktacijos dienų skaičiui ( http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_staph.-aureaus.pdf prieiga naudota 2013.06.22).
Laktacijos periodu, didžiausia rizika susirgti aplinkos mikroorganizmų sukelta infekcija yra iškart po apsiveršiavimo. Didelė dalis infekcijų įvyksta dviejų savaičių laikotarpyje iškart po užtrūkimo ir dviejų savaičių laikotarpyje prieš veršiavimąsi, kai karvės apsauginiai mechanizmai yra
silpniausi (http://www.medvet.umontreal.ca/rcrmb/en/page.php?p=5&tm=h prieiga naudota 2013 11 30).
Sergamumas aplinkos mikroorganizmų sukeltomis infekcijomis padidėja karvėms užtrūkus, tačiau užsikrėtimo dažnis visu šiuo laikotarpiu nevienodas. Aplinkos streptokokų infekcijos labai dažnos užtrūkinimo laikotarpiu, tuomet naujų infekcijų skaičius labai padidėja laktacijos metu. Naujų infekcijos atvejų padaugėja iki veršiavimosi ir ankstyvosios laktacijos laikotarpiu, tačiau sumažėja vėlesniu laktacijos laikotarpiu. Jautrumas aplinkos streptokokams, ypač Streptococcus
uberis, didžiausias pirmąsias dvi savaites po užtrūkimo ir dvi savaites iki veršiavimosi (Rutkauskas
ir Tušas, 2011). Tešmens ketvirčių atžvilgiu klinikinio mastito, sukelto Streptococcus uberis, pasireiškimo šansai buvo žymiai didesni pirmaisiais laktacijos mėnesiais, lyginant su 7 mėn. ir tolimesniu laktacijos periodu (Breen, 2009).
Labai dažnai koliforminių bakterijų nauji infekcijos atvejai, taip pat kaip aplinkos streptokokų, pasireiškia ankstyvuoju ir vėlesniais užtrūkinimo laikotarpiais ir iškart po apsiveršiavimo. Karvės nuo laktacijos vidurio iki pabaigos turi daug mažesnę koliforminės infekcijos riziką, nebent yra itin didelis kiekis koliformų ar yra žaizdų spenio gale, kas gali būti, kaip predisponuojantys veiksniai. Taigi, naujų koliforminių infekcijų dažnis karvių užtrūkinimo laikotarpiu yra keturis kartus didesnis nei laktacijos laikotarpiu ir didėja su kiekvienu vėlesniu užtrūkinimo laikotarpiu. Šių bakterijų sukeltų infekcijų sumažėja ilgėjant laktacijos trukmei. Didžioji dalis sunkios formos koliformų sukeltų klinikinių mastitų įvyksta 60d. iki laktacijos (
http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_coliform-mastitis.pdf prieiga naudota 2013.07.14).
Karvės labai jautrios aplinkos sukėlėjų infekcijoms pirmąjį laktacijos mėnesį, vėliau jautrumas mažėja. Didžiausias Escherichia coli infekcijų skaičius būna per pirmąsias 7–10 laktacijos dienas po užtrūkinimo laikotarpio (Rutkauskas ir Tušas, 2011). Be to, Burvenich ir kt., (2007) tyrimai parodė, kad Escherichia coli dažniausiai sukelia mastitą arti veršiavimosi periodo ir ankstyvosios laktacijos metu.
Sunkaus laipsnio mastitą gali sąlygoti po apsiveršiavimo susilpnėjusi karvių imuninė sistema ko pasekoje suletėja neutrofilų judėjimas (Rutkauskas ir Tušas, 2011). Breen su grupe mokslininkų (2009) atlikti tyrimai parodė, kad tešmens ketvirčių atžvilgiu klinikinio mastito, sukelto Escherichia
coli, pasireiškimo šansai buvo žymiai didesni pirmaisiais 6 laktacijos mėnesiais, lyginant su 7 mėn.
ir tolimesniu laktacijos periodu. Escherichia coli infekcijų labai retai pasikaito užtrūkinimo laikotarpio pradžioje ir viduryje, nes iš dalies arba visiškai atsistačius pieno liaukai, ji būna labai atspari infekcijai (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Infekcijos dažnio, priklausomai nuo laktacijos laikotarpio, skirtumai yra ryškesni Escherichia
coli atžvilgiu, negu apsikrėtus streptokokais. Escherichia coli naujų infekcijos atvejų retai pasitaiko
laktacijos viduryje ar pabaigoje, o aplinkos streptokokai sukelia mastitą visos laktacijos laikotarpiu.
Serratia spp. gali sukelti mastitą tiek užtrūkusioms, tiek melžiamoms karvėms (Rutkauskas ir
Tušas, 2011).
Mikoplazminiu mastitu serga laktuojančios, pirmaveršės ir užtrūkusios karvės. Gyvulys mikoplazmas išskiria apie 2 mėnesius, tačiau periodas gali būti ir trumpesnis arba ilgesnis – net iki 13 mėnesių (Šiugždaitė, 2007).
1.4 Karvių laikymo aplinkos sąlygų įtaka mastito sukelėjų paplitimui
Galvijai, laikomi ištisus metus uždarose fermose, serga infekcijomis dažniau, nei tos karvės, kurios vasaros metu yra išleidžiamos į ganyklas. Infekcijų paprastai padaugėja vasaros metu tarp karvių laikomų fermose, drėgnu oro tarp karvių, laikomų aptvaruose arba ganyklose (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Atliekant tam tikrus tyrimus buvo apsaičiuota, kad 63,9 proc. ūkių grindys buvo visiškai sausos sausojo sezono metu ir 11,2 proc. drėgnuoju metų laiku. Tik 22,6 proc. ūkių buvo paveikti mastito, kuomet grindys buvo visiškai sausos, tačiau ūkių, paveiktų mastito, procentas padidėjo iki 59,5 proc., kai fermos grindys buvo drėgnos ir žemėtos. Tai parodo, kad mastito paplitimą žymiai įtakojo grindų būklė. Pasirodo, kad grindys buvo potencialus šaltinis mastito sukėlėjams patekti į tešmenį per spenio angą (Kivaria et al. 2004; Rahman et al., 2009).
Kiti tyrimai parodė, kad mastito paplitimas buvo keturis kartus didesnis karvėms, laikomoms pagal intensyvią valdymo programą, negu toms, kurios buvo laikomos paga pusiau intensyvią valdymo programą (Arga et al., 2012).
Kai kurios KNS rūšys yra siejamos su galvijų odos mikroflora ir karvės laikymo aplinka.
Staphylococcus chromogenes gerai adaptavęsis prie pieninių galvijų ir gali būti išskirtas iš telyčių
tešmens odos, kaip ir iš naujai apsiveršiavusių telyčių bei laktuojančių karvių spenių kanalų ir pieno liaukos sekreto (Trinidad et al., 1990; Matthews et al., 1992; Nickerson et al., 1995; Aarestrup and Jensen, 1997; Taponen et al., 2008).
Staphylococcus xylosus ir Staphylococcus sciuri yra dažnai randami, kaip dalis galvijų odos
floros, taip pat, kaip ir kitų žinduolių ar paukščių (Devriese and de Keyser, 1980; Kloos, 1980; White et al. 1989; Nagase et al., 2002; Taponen et al, 2008). Šitos rūšys buvo išskirtos ir iš pakratų esančių galvijų tvartuose (Thoberg, 2008). Telyčioms, laikomoms ganyklose, būdingas mažesnis KNS paplitimas (Compton et al., 2007).
Klinikinių atvejų, kuriuos sukelia aplinkos mikroorganizmai, gali padažnėti žiemos mėnesiais, kai galvijai laikomi tvartuose. Naujų infekcijų, sukeltų aplinkos mikroorganizmų, proporcija didėja dėl to, kad sumažėję mastitų, kuriuos sukelia patogenai ir dėl to, jog pastaruoju metu galvijai vis dažniaus laikomi tvartuose (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Koliforminės bakterijos yra įprasti dirvožemio ir galvijų žarnyno gyventojai (Rutkauskas ir Tušas, 2011). Pagrindinis koliformų, kurie sukelia infekciją, šaltinis – pakratai, kraikas, žemė, mėšlas ir kitos organinės medžiagos esančios karvės aplinkoje (Hogan Smith, 2003), užterštas vanduo. Tyrinėjimai parodė, kad koliforminių bakterijų skaičius siekiantis 1,000,000 ir daugiau viename grame pakratų padidina tešmens infekcijos ir klinikinio mastito pasireiškimo tikimybę (
http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_coliform-mastitis.pdf prieiga naudota 2013.07.14). Escherichia coli ir Klebsiella rūšys dažniau yra aptinkamos pjuvenose, medienos drožlėse, perdirbtame mėšle (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Stipri korealiacija buvo nustatyta tarp Klebsiella spp. išskyrimo iš mėginių ir pjuvenų, kaip pakratų naudojimo. Tikimybė išskirti Klebsiella spp. buvo keturis kartus didesnė, kuomet pakratams buvo naudojamos pjuvenos, lyginant su šiaudų ar durpių kraiko naudojimu pakratams (Unnerstad, 2008), ypač, kai pjuvenos yra aštrios, jose yra žievių ar užterštos dirvožemiu. Plonesnės pjuvenos, ypač kietosios medienos pjuvenos gali padidinti koliforminio mastito riziką.
Escherichia coli taip pat ir kitos koliforminės bakterijos paprastai yra randamos karvių
išmatose, ir kai tik pakratai tampa stipriai sutepti karvių mėšlu, koliforminių bakterijų skaičius pakratuose padidėja, ir taip atsiranda galimybė tešmens ketvirčiui būti infekuotam koliformų.
Blogai ventiliuojamos gyvulių stovėjimo vietos ir uždaros fermos padidina naujų koliforminių infekcijų riziką, ypač vėlyvo rudens ar ankstyvos žiemos ir pavasario metu, kai aplinkos sąlygos stipriai kinta.
Laktuojančios ir užtrūkusios karvės, kurios yra laikomos purvinuose tvartuose ant purvinų guolių yra ypač jautrios koliforminėms infekcijoms ( http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_coliform-mastitis.pdf prieiga naudota 2013.07.14).
Organiniame kraike aplinkos mikroorganizmų mažiau, ypač jei kraikas laikomas sausas ir vėsioje temperatūroje. Tačiau tiek aplinkos streptokokai, tiek koliforminės bakterijos dauginasi visuose organiniuose kraikuose, ypač kai drėgmė ir aplinkos temperatūra yra palankios mikroorganizmų augimui. Pjuvenų naudojimas sumažina Streptococcus uberis išskyrimo riziką, atitinkamai lyginant su durpių ar šiaudų, kaip pakratų naudojimu (Unnerstad, 2008). Šiaudų kraike dauginasi aplinkos streptokokai, geriausiai – Streptococcus uberis. Galvijams, kuriems naudojamas šiaudų kraikas, yra didelė rizika užsikrėsti nauja infekcija.
Streptococcus uberis yra visoje melžiamų karvių aplinkoje ir jų aptinkama daugelyje karvės
kūno vietų, šie mikroorganizmai retai sukelia ligas ne pieno liaukose.
Švarus, sausas smėlis su mažu organinių medžiagų kiekiu yra „auksinis gardo kraiko standartas“, kuris sumažina mastito pasireiškimo dažnį (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Streptococcus uberis sukelto klinikino mastito paplitimo dažnis atrodo yra susijęs su ganykla,
kuomet kiti streptokokai ir Escherichia coli atrodo labiau susiję su laikymo sąlygomis (Riekerink et al., 2007).
Mastito, sukelto Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis ir KNS, paplitimo dažnis buvo didesnis pririštai laikomų karvių tarpe lyginant su palaidai laikomomis karvėmis. Laisvai laikomoms karvėms buvo būdingas didesnis mastito sukelto Klebsiella spp. ir Escherichia coli paplitimo dažnis, negu toms karvėms, kurios buvo laikomos pririštos (Riekerink et al., 2008).
Pseudomonas aeruginosa šaltinis yra užterštas vanduo. Buvo šių bakterijų kultūra išskirta iš
šilto vandens, kuriuo buvo plaunami tešmenys. Nustačius šį mikroorganizmą reiktų būtinai tirti visus vandens šaltinius (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
1.5 Metų sezono sąlygų įtaka mastito sukėlėjų paplitimui
Mastitas labiausiai karvėms pasireiškia rudenį, žiemą ir pavasarį (Stoliuk and Valchuk, 2011). Telyčios, atvestos vasarą, serga dažniau (20-21 proc.), nei atvestos žiemą (5,2-16,8 proc.) (Rudejevienė, 2007). Tyrimai parodė, kad mastito pasireiškimo tikimybė buvo daug didesnė vasaros metu, nei žiemos laikotarpiu (Fadlelmoula, 2007).
Vienų tyrimų metu buvo tiriama 347 karvės sausuoju sezonu ir 388 drėgnuoju sezonu, bendras mastito paplitimas buvo atitinkamai 19,9 ir 44,8 proc. Bendras mastito paplitimas buvo žymiai didesnis drėgnuoju metų laiku negu sausuoju laikotarpiu (Rahman, 2009).
Mastitas, sukeliamas aplinkos patogeninių mikroorganizmų, dažniausiai pasitaiko karštais ir drėgnais vasaros mėnesiais. Šių mikroorganizmų sukeliamų infekcijų paprastai padaugėja vasaros metu tarp karvių laikomų fermose, o drėgnu oru tarp karvių, laikomų aptvaruose arba ganyklose. Taigi, karvėms, kurios laikomos tvartuose, yra didesnė rizika užsikrėsti aplinkos mikroorganizmais nei karvėms, kurios ganosi ganyklose, klinikinių atvejų gali padažnėti žiemos mėnesiais, kai galvijai laikomi tvartuose, tačiau šių mikroorganizmų poveikis karvėms didelis ir vasaros laikotarpiu (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Padidėjęs naujų koliforminių infekcijų atvejų dažnumas pasireiškia po karšto ir drėgno oro bei ilgų ir gausaus kritulių kiekio laikotarpių. Sunkiausi atvejai dažnai įvyksta šiltuoju, lietingu metų laiku ir to pasekoje infekcija gali plačiai paplisti bandoje nepaisant laktacijos stadijos. Blogai ventiliuojamos gyvulių stovėjimo vietos ir uždaros fermos padidina naujų koliforminių infekcijų
riziką vėlyvo rudens ar ankstyvos žiemos ir pavasario metu, kuomet aplinkos sąlygos stipriai kinta (
http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_coliform-mastitis.pdf prieiga naudota 2013.07.14). Koliformų skaičius kraike paprastai būna mažiausias žiemos mėnesiais, o didžiausiais vasaros laikotarpiu (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Vasaros drėgmė ir temperatūra padidina koliformų skaičių pakratuose, ko pasekoje didėja koliformų sukelto klinikinio mastito paplitimo dažnis (Riekerink, 2007).
Vienais iš tyrimų buvo nustatyta, kad karvės vidutiniškai labiau buvo linkusios sirgti klinikiniu mastitu vėlyvą rudenį (ir gruodį) negu vasaros metu. Nedidelis klinikinio mastito paplitimo dažnio padidėjimas pastebimas antroje liepos mėnesio pusėje, pagrinde bandose su dideliu bendru pieno somatinių ląstelių skaičiu, kur padidėjimo priežastis pagrinde buvo
Staphylococcus aureus ir Escherichia coli sukeltų klinikinių mastitų infekcijų dažnio pikas. Escherichia coli klinikinio mastito paplitimo dažnio pikas taip pat buvo pastebėtas karvių bandose
su vidutiniu bendro pieno somatinių ląstelių skaičiumi.
Streptococcus uberis klinikinio mastito paplitimo dažnis buvo didžiausias vasarą (rugpjūčio
mėn.), laikantis gyvulių laikymo strategijos Escherichia coli atžvilgiu, ir didžiausias klinikinio mastito paplitimo dažnis buvo gruodžio ir sausio mėnesį kitiems patogenams. Didžiausia sezono įtaka buvo Streptococcus uberis, tuomet Streptococcus dysgalactiae atžvilgiu ir mažiausia įtaka -
Escherichia coli atžvilgiu, bandose, kurios vasaros laikotarpiu buvo laikomos uždarai tik per naktį.
Ryšio tarp laikymo būdo ir sezono kintamumas ypač ryškus tik Escherichia coli klinikinio mastito paplitimo dažnio atžvilgiu. Karvės, kurios vasaros metu laikomos uždaros, buvo labiau linkusios sirgti Escherichia coli klinikiniu mastitu vasaros metu negu žiemą, ir karvės laikomos vasaros metu visą parą ganyklose turėjo didesnį Escherichia coli klinikinio mastito paplitimo dažnį žiemos metu.
Staphylococcus aureus, Escherichia coli ir Streptococcus dysgalactiae klinikinio mastito
paplitimo dažnis padidėjo gruodžio ir sausio mėnesiais, kuomet Streptococcus uberis klinikinio mastito paplitimo dažnis buvo didžiausias rugpjūčio mėnesį. Sezoniškumo sukelti svyravimai buvo mažiau išreikšti KNS ir Corynebacterium bovis klinikinio mastito paplitimo dažnyje.
Daugumos didžiųjų patogenų pikas žiemos metu neatitinka kitų tyrimų (Smith et al.,1985; Erskine et al., 1988; Hogan et al., 1989b; Todhunter et al., 1991; Makovec and Ruegg, 2003), kurie parodė koliformų ir streptokokų piką vasaros metu. JAV atliktais tyrimais, uždarai laikomų galvijų fermose, Escherichia coli klinikinio mastito paplitimo dažnis taip pat buvo didelis vasaros metu lyginant su ganyklose laikomomis karvėmis, kurioms Escherichia coli klinikinio mastito paplitimo dažnio pikas buvo žiemą. Tuo tarpu Escherichia coli klinikinio mastito paplitimo dažnis bandose, laikomoms visą parą ganyklose buvo mažesnis vasaros metu (Barkema et al., 1999). Visiškai
uždarai laikomoms bandoms, vasaros karštis ir karvės aplinkos drėgmė padidina Escherichia coli augimą aplinkoje, ko rezultate matomas didelis koliformų skaičius pakratuose (Smith et al., 1985; Hogan et al., 1989b; Goldberg et al., 1992) ir taip pat didesnis pavojus jais užsikrėsti.
Tiek Escherichia coli, tiek Staphylococcus aureus sukelto klinikinio mastito paplitimo dažnio pikas buvo pastebėtas antroje liepos mėnesio pusėje karvių bandose su dideliu bendru pieno somatinių ląstelių skaičiu (Riekerink et al., 2007).
Staphylococcus aureus išskyrimas iš mėginių buvo siejamas ir sąlyginai dažnesins tvartiniu
laikotarpiu (lapkričio – balandžio mėn.) negu ganiavos t.y. gegužės-spalio mėnesiais.
Streptococcus uberis dažniau buvo išskiriamas iš mėginių ankstyvuoju tvartiniu laikotarpiu
lyginant su vėlyvuoju laikotarpiu (Unnerstad et al., 2008).
1.6 Veršingumo skaičiaus ir karvių amžiaus įtaka mastito sukėlėjų paplitimui
Svarbus faktorius, vertinant mastito riziką yra karvės amžius ir veršingumo skaičius (Thoberg, 2008). Tai patvirtina atlikti tyrimai, kurie parodė stipriai akivaizdų veršingumo skaičiaus įtaką mastito paplitimui. Didžiausias mastitų paplitimo procentas pasireiškė 2-4 veršingumo karvių tarpe, lyginant su karvėmis iki antrojo veršingumo (Elbably, 2011). Kiti tyrimai parodė, kad karvės, turinčios daugiau nei 7 veršelius turėjo apie 13 kartų didesnę riziką tešmens infekcijai, nei tos, kurios turėjo keletą (≤3) veršelių (Biffa et al., 2005). Tiriant mastito paplitimo priklausomybę nuo tam tikrų veiksnių, tokių kaip karvės amžius, laktacija ir veršingumas nustatyta, kad mastito paplitimas padidėja su amžiumi sausuoju ir drėgnuoju metų laiku. Laktacijos skaičius turėjo ryškų efektą mastito paplitimui nepriklausomai nuo metų laiko. Mastitų paplitimas mažiausiais buvo pirmosios laktacijos metu (12,3 iki 31,6 proc.) abiejuose sezonuose ir didžiausias paplitimas vyravo 6-13 laktacijos metu (41,3 proc.) sausuoju laikotarpiu ir penktosios laktacijos metu (65 proc.) drėgnuoju laikotarpiu (Rahman et al., 2009).
Daugiaveršės labiau negu pirmaveršės karvės buvo linkusios sirgti klinikiniu mastitu ir turėjo didesnį klinikinio mastito paplitimo dažnį viso laktacijos periodo metu visiems patogenams. Klinikinio mastito paplitimo dažnis didėjo kartu su veršingumų skaičiumi (Riekerink et al., 2007).
Karvių skaičius, su teigiama pieno mėginio reakcija subklinikinio mastito atžvilgiu, didėja su kiekviena laktacija. Paplitimas: iki 3 metų amžiaus – 67,4 proc., iki 4-5 metų amžiaus – 80,0 proc., iki 6-7 metų amžiaus – 80,0 proc. ir nuo 8 metų ir daugiau – 94,1 proc. (http://www.positiveaction.info/pdfs/articles/dt10.5p13.pdf prieiga naudota 2013.07.24).
Viena iš galimų priežasčių, kodėl pirmaveršės karvės yra labiau atsparios negu diaugiaveršės, yra ta, kad polimorfonuklearinių leukocitų funkcija yra labiau aktyvi pirmaveršių nei daugiaveršių karvių (Dulin et al., 1988; Rahman et al., 2009).
Kuo karvė jaunesnė, tuo ji atsparesnė mastito sukėlėjams. Mokslinės literatūros duomenimis, mastitams atsparesnės yra jaunesnės karvės: pirmaveršės – 29,8 proc.; antraveršės – 32,4 proc.; trečiaveršės – 20,0 proc.; ketvirtaveršės – 22,0 proc.; penkiaveršės – 9,3 proc.
Pastebėta, kad kai kurios karvės mastitu serga net kelis kartus per metus. Net 19,2 proc. pirmaveršių karvių mastitu sirgo du kartus; 5 proc. – tris kartus; 0,9 proc. – keturis kartus; 0,5 proc. – penkis kartus per metus (Leight, 1999; Rudejevienė, 2007).
Elbably (2011) tyrimų rezultatai nurodė didesnį mastitų paplitimą suaugusių karvių (3-5m.) tarpe lyginant su senomis (6-8 m.) karvėmis. Kiti tyrimai atskleidė, kad senesnės karvės (>10 metų) buvo labiau paveiktos, ypač subklinikinio mastito, negu jaunos karvės, kurių tarpe dominuojantis buvo klinikinis mastitas (Biffa et al., 2005). Tačiau nustatyta, kad telyčios dviejų pirmųjų laktacijos savaičių metu turėjo didesnį mastito paplitimo dažnį, negu vyresnės karvės. Tarp 2 ir 4 savaitės telyčios turėjo mažesnį paplitimo dažnį negu vyresnės, o vėlyvoje laktacijos stadijoje abiejų grupių karvės turėjo panašų ligos paplitimo dažnį (Riekerink et al., 2008).
Bendras patogenų pasiskirstymas pirmaveršių ir vyresnių karvių tarpe ryškiai nesiskyrė (Waller et al., 2008).
Pirmaveršės karvės yra imlesnės KNS (Taponen et al., 2008). KNS bakterija dažnai pasitaiko pirmosios laktacijos metu. KNS sudaro 60 proc. infekcijų pirmojo veršiavimosi metu. Paplitimas paprastai varijuoja nuo 10 iki 20 proc. ketvirčių, tačiau gali būti iki 40 proc. ketvirčių, ypač telyčioms pirmojo veršiavimosi metu (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Tyrinėjimai nurodė, kad KNS sukelta infekcija daugiausiai pasireiškia vėlesniuose laktacijos etapuose vyresnio amžiaus karvėms (Davidson et al., 1992) ir ankstyvojoje laktacijos stadijoje pirmaveršėms karvėms (Gröhn et al., 2004; Taponen et al., 2007). Pastaraisiais tyrimais nustatyta didelis KNS sukelto mastito paplitimas pirmaveršių karvių tarpe.
Tyrimais nustatyta, kad Staphylococcus epidermidis dažniausiai buvo randamas ne pas pirmaveršes karves, o Staphylococcus chromogenes paplitimas buvo didesnis pirmo veršingumo karvių grupėje negu vyresnio amžiaus karvių tarpe (Trinidad et al., 1990a; Matthews et al., 1992; Rajala-Shultz et al., 2004; Taponen et al., 2006; Thoberg, 2008).
Karvės, kurios buvo bent kartą sirgusios Staphylococcus aureus sukeltu mastitu turi didesnę reinfekcijos galimybę. Be to, galimybė, kad karvė vėl bus infekuota Staphylococcus aureus bakterijos didėja kartu su amžiumi ( http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_staph.-aureaus.pdf prieiga naudota 2013.07.22). Iki 50 proc. visų infekcijų, kurias sukelia aplinkos streptokokai, diagnozuojama jaunoms karvėms ir telyčioms. Naujų aplinkos streptokokų infekcijų skaičius palaipsniui didėja vyresnėms karvėms,
kadangi vyresnio amžiaus karvės imlesnės aplinkos mikroorganizmams nei jaunesnio amžiaus (Rutkauskas ir Tušas, 2011).
Breen ir kt. (2009) atliktų tyrimų duomenimis nustatyta, kad Streptococcus uberis, taip pat ir
Escherichia coli sukelto klinikino mastito, kaip pirmą kartą pasireiškiančio tešmens ketvirčio
infekcijos atvejo, šansai akivaizdžiai buvo mažėsni pirmaveršėms karvėms lyginant su antraveršėmis ir vyresnėmis karvėmis.
1.7 Karvių produktyvumo ir mastito sukelėjų paplitimo ryšys
Teigiama, kad vienas iš tešmens sutrikimą predisponuojančių veiksnių yra karvės produktyvumas (Rudejevienė ir kt., 2006). Kuo didesnis primilžis, tuo atsparumas mažesnis (Rudejevienė, 2007).
Tyrimais buvo nustatyta, kad aukštos produkcijos karvės yra labiau linkusios susirgti mastitu. Aukštos produkcijos karvių liaukinis audinys yra labiau jautrus infekcijai (Slettbakk et al., 1995; Radostits et al., 2000). Taip pat, vyresnių karvių organzimo apsaugos mechanizmai yra silpnesni negu jaunų karvių (Dulin et al., 1988; Rahman et al., 2009).
Labai produktyvios karvės yra labiau jautrios mastitui dėl intensyvaus metabolizmo ir sumažėjusio atsparumo. Pvz., bandose, kuriose karvės produkcija siekia 3,000 kg pieno per laktaciją karvių sergamumas siekia 4 proc., tuo tarpu bandose, kuriose karvės produkcija siekia 3,500 kg sergamumas padidėja iki 17,9 proc. (http://www.positiveaction.info/pdfs/articles/dt10.5p13.pdf
prieiga naudota 2013.07.24).
Kiti tyrimai taip pat parodė, kad produkcijos lygis yra svarbus. Karvės produkuojančios didelius kiekius pieno buvo siejamos su dažniau pasireiškiančiomis KNS intramamarinėmis infekcijomis (Gröhn et al., 2004).
Tyrimuose dėl ryšio tarp pieno produkcijos ir klinikinio mastito, daugiaveršės karvės sergančios KNS sukeltu klinikiniu mastitu, prieš pasireiškiant mastitui, buvo aukštesnės pieno produkcijos karvės lyginat su sveikomis (Gröhn et al., 2004; Thoberg, 2008).
Sunkiausi ūmaus koliforminės kilmės klinikinio mastito protrūkai pasireiškia aukščiausios produkcijos karvėms. Apie 60-70 proc. šių atvejų prasidėda ankstesniojo užtrūkimo ar veršiavimosi metu. ( http://milkquality.wisc.edu/wp-content/uploads/2011/09/mastitis-control-program_coliform-mastitis.pdf prieiga naudota 2013.07.22). Escherichia coli sukelia mastitą daugeliui aukšto produktyvumo karvių. Esant itin sunkiai Eschrerichia coli sukeltai mastito formai liga gali baigtis mirtimi, tačiau tai pasitaiko gana retai (Burvenich et al., 2003).
2. DARBO VIETA IR METODIKA
2.1. Tyrimų laikas, vieta, apimtis ir metodai
Tyrimai buvo atlikti 2011-2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijoje. Mastito sukėlėjų iš pieno mėginių tyrimai buvo atlikti VĮ „Pieno tyrimai“ laboratorijoje.
Panaudojant mastito tyrimų protokolus buvo sukurta mokslinio tyrimo duomenų bazė, kurios struktūrą sudarė duomenys:
apie karvių laikytoją,
bandos statusą (kontroliuojama, nekontroliuojama banda), mastito tyrimų rezultatus (nustatyta, nenustatyta),
mastito sukėlėjus,
kontroliuojamų bandų karvių somatinių ląstelių skaičių piene.
Buvo nustatytas atskirų mastito sukėlėjų rūšių ir jų grupių paplitimas iš bendro karvių pieno mėginio (tyrimų imtį sudarė 3622 karvės) ir iš skirtingų tešmens ketvirčių pieno mėginių (tyrimų imtį sudarė 40 karvių).
Tyrimų duomenys įvertinti naudojant „R“ statistinį paketą (http://ww.r-project.org) ir Microsoft Exel skaičiavimo programą.
Duomenys statistiškai patikimi laikyti, kai p≤0,05.
2.2 Mastito sukėlėjų nustatymo metodai
Pieno mėginiai skirti mastito sukėlėjų nustatymui privalo būti konservuojami, kitaip į laboratoriją nėra priimami, nes toks mėginys nebetinkamas tyrimams. Rekomenduojama naudoti VĮ “Pieno tyrimai” paruoštus indelius su specialiu konservantu.
Asmuo, prieš imdamas pieno mėginį privalo nusiplauti ir dezinfekuoti rankas. Tuomet karvės tešmuo ir speniai turi būti nuvalomi dezinfekciniame tirpale sumirkyta servetėle, ir prieš imant mėginį į mėgintuvėlį reikia numelžti pirmasias 4-5 pieno čiurkšles į kitą indelį. Kiekvieno tešmens ketvirčio speniai yra valomi atskiromis, dezinfekciniame tirpale sudrėkintomis, servetėlėmis. Tuomet galima imti pieno mėginį į mėgintuvėlį. Mėgintuvėlį geriausia laikyti įstrižai spenio atžvilgiu, siekiant sumažinti pašalinių medžiagų patekimą į pieno mėginį. Jei pieno mėginys imamas iš atskirų tešmens ketvirčių tuomet į indelį yra numelžiama 6-8 pieno čiurkšlės arba
apytiksliai 15 ml pieno. Jei imamas bendras pieno mėginys tuomet į tą patį mėgintuvėlį iš kiekvieno tiriamo tešmens ketvirčio yra numelžiama po apytiksliai vienodą kiekį. Uždarius indelį, jį reikia pavartyti 4-5 kartus. Iki tyrimo pradžios mėginys turi būti laikomas 4°C ±2ºC ir neilgiau iki trijų parų.
Laboratorijoje daromas pasėlis, t.y. 10 mikrolitrų pieno iš tiriamojo mėginio yra sėjama and kraujo agaro su eskulinu ir tam tikru būdu yra išskaidomas ant agaro paviršiaus, kad galėtų išaugti pavienės mikroorganizmų kolonijos. Tuomet tokie paruošti pasėliai yra patalpinami į termostatą 24 – 72 val. 36-38 ºC temperatūroje.
Ant kraujo agaro su eskulinu auga visos pagrindinės mastitą sukeliančios bakterijos. Tai bendrosios paskirties augimo terpė naudojama bakterijų kultivacijai, selektyviai izoliacijai ir diferenciacijai.
Šios terpės pagalba yra nustatomas mikroorganizmų gebėjimas gaminti hemolizinus. Hemolizinų sukeltas hemolizės laipsnis padeda diferencijuoti tokių genčių, kaip Staphylococcus,
Streptococcus ir Enterococcus rūšis.
Beta hemolizė yra visiška hemolizė. Šis hemolizės tipas yra apibūdinamas koloniją supančia permatoma zona. Beta hemolizė būdinga Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ir
Staphylococcus agalactiae rūšims.
Dalinė hemolizė yra vadinama alfa hemolize. Paprastai kolonijos yra apsuptos žalia, permatoma zona. Streptococcus pneumoniae ir Streptococcus mitis yra alfa hemoliziniai.
Gama hemolizė, kuomet nėra hemolizės požymių. Nėra pastebimų praskaidrėjimo zonų aplink kolonijas. Streptococcus epidermidis yra gama hemolizinis streptokokas.
Dažymas Gramo būdu leidžia nustatyti mikroorganizmų morfologiją. Bakterijos pagal spalvą, kuria nusidažo dažant šiuo metodu, yra skirstomos į gramteigiamas ir gramneigiamas. Bakterijų priskirimą vienai iš šių grupių lemia bakterijos ląstelės sienelės struktūros ypatybės. Gramteigiamų ląstelių sienelėje dėl storo peptidoglikano sluoksnio užsilaiko genciano violetinio dažai, o gramneigiamose bakterijose šis dažas neužsilaiko, kadangi šių bakterijų peptidoglikano sluoksnis yra daug plonesnis.
Dažymo gramo metodu eiga. Užlašinama 1-2 lašai tiriamojo mėginio ant objektinio stiklelio ir su kitu stikleliu paskleidžiama vienodai per visą objektinio stiklelio plotą. Palikti tol kol mėginys nudžius. Tuomet fiksuojama liepsna. Tepinėlį reikia greitu judesiu prabraukti du tris kartus virš liepsnos. Negalima perkaitinti, kadangi tai gali lemti klaidingus rezultatus. Metanolis yra fiksavimo liepsna alternatyva. Tepinėlis gali būti fiksuojamas pridedant vieną ar du lašus metanolio ant išdžiuvusio tepinėlio, nusausinus metanolio perteklių paliekama išdžiūti.
Tuomet reikia užlašinti tiek genciano violetinio tirpalo, kad tepinėlis būtų visiškai apsemptas. Palaukti 30 sekundžių ir po to atsargiai nuplauti dažą po kranu silpna vandens srovele. Nereikia gausiai ar stipriai plauti, kadangi intensyvus plovimas ir stipri vandens srovė gali pašalinti dažus iš gramteigiamų bakterijų. Šiuo dažymo etapu nusidažo abiejų grupių bakterijos.
Tuomet tepinėlis užpilamas Liugolio tirpalu. Palikti apie 1 minutę, tuomet vėl atsargiai ir švelniai nuskalauti tepinėlį jį laikant tam tikru kampu. Šiame etape susidaro kristalo viotelo-jodo kompleksai, kurie iš gramteigiamų ląstelių nebepasišalina.
Blukinimas su etanoliu. Šis žingsnis yra esminis. Svarbu jį atlikti tiksliai laikantis nurodymų. Etanolis pilamas ant pasvirai laikomo tepinėlio, tol kol nutekantis skystis tampa skaidrus. Tuomet tepinėlis atsargiai praskalaujamas tekančiu krano vandeniu. Šiuo etapu, paprastai kristalo violetinio-jodo kompleksai išsiplauna tik iš gramneigiamų bakterijų.
Po to užpilama safranino tirpalo ir palaukus 30 sekundžių safranino perteklius nuplaunamas su vandeniu. Paliekama nudžiūti. Tuomet galima mikroskopuoti imersiniu objektyvu.
Taigi gramteigiamos bakterijos bus violetinės, o gramneigiamos bakterijos bus rožinės ar rausvos spalvos.
Kalio hidroksido testas atliekamas norint patvirtinti Gramo dažymo metodu gautą rezultatą. Reikia uždėti ant objektinio stiklelio tiriamų bakterijų vieną ar dvi kolonijas ir užlašinti 1 lašą KOH ant ląstelių viršaus. Reakcijai įvykti stikelis paliekamas vienai minutei. Po to reikia įdėti kilpelę į mišinį, esantį ant stiklelio ir tuomet kilpelė yra po lėto traukiama į viršų. Gramneigiamos bakterijos turi palyginti ploną sienelę todėl jos suyra. DNR medžiaga yra išlaisvinama iš ląstelių, ko rezultate suspensija tampa tąsi, lipni. Gramteigiamos bakterijos, turinčios gana storą peptoglikaninę sienelę, nepakinta ir todėl emulsija išlieka vandeninga.
Taigi, jei suspensija tampa tąsi, tai nurodo, kad tiriamieji mikroorganizmai yra gramneigiamos bakterijos, o jei suspensija nepakinta, tai nurodo gramteigiamas bakterijas.
Katalazės testas yra naudojamas nustatyti organizmus gaminančius katalazės fermentą ir atliekamas norint atskirti Staphylococcus spp. nuo Streptococcus spp. Bakterijų gaminamas katalazės fermentas detoksikuoja vandenilio peroksidą suskaldydamas jį į vandenį ir dujinį deguonį. Būtent dėl išsiskiriančio dujinio deguonies susidaro akivaizdžiai matomi burbuliukai, kas ir nurodo katalazei teigiamą reakciją. Staphylococcus spp. ir Micrococcus spp. yra katalazei teigiamos, o
Streptococcus ir Enterococcus gentims būdinga katalazei neigiama reakcija.
Koaguliazės testas atliekamas gramteigiamoms, katalazei teigiamoms bakterijų rūšims norint identifikuoti koaguliazei teigiamą Staphylococcus aureus. Koaguliazė tai enzimas, kurio įtakoje kraujo plazma sutirštėja. Koaguliazė yra Staphylococcus aureus virulentiškumo faktorius. Šiuo testu yra diferencijuojama Staphyloccocus aureus nuo koaguliazei neigiamų stafilokokų rūšių.
Manitolio druskos agaras kartu yra ir selektyvi ir diferencinė terpė. Ši terpė yra selektyvi
Staphylococcus rūšims, kurie gali gyventi aplinkoje su didele druskos koncentracija. Tai yra
priešinga Streptococcus rūšims, kurių augimas yra selektyvus esant tokioms druskų koncentracijoms, kaip manitolio druskos agare. Diferencinis ingridientas manitolio druskos agare yra manitolio cukrus. Staphylococcus aureus geba naudoti manitolį kaip maisto šaltinį kartu sudaro ir rūgščius fermentacijos šalutinius produktus kas sumažina terpės pH. Terpės rūgštingumas lemia pH indikatoriaus – fenolio raudonojo spalvos kitimą į geltoną. Taigi Staphylococcus aureus geba fermentuoti manitolį, tuo tarpu pvz. Staphylococcus epidermidis - ne.
Latekso agliutinacijos reakcija naudojama nustatyti Staphylococcus aureus. Latekso reagentas yra padengtas fibrinogenu ir IgG. Staphylococcus aureus bakterijai būdinga koaguliazė ir proteinas A, kas leidžia identifikuoti mažiausiai 98 proc. šių mikroorganizmų. Staphylococcus aureus bakterijai būdinga koaguliazė, kuri gali būti laisva arba surišta, pastaroji dar yra vadinama agliutinacijos faktoriumi ir išlieka prisitvirtinusi prie mikroorganizmo ląstelės sienelės. Koaguliazė įgalina fibrinogeną formuoti krešulį, o proteinas A, randamas ant ląstelės paviršiaus, geba prisijungti prie imunoglubulino Fc dalies. Teigiama reakcija yra tuomet, kai bakterijos koaguliazė ir proteinas A sureaguoja su reagente esančiais fibrinogenu ir IgG, ir to rezultate matoma agliutinacija, įvykusi per 20 sekundžių, o reakcijos įvykusios praėjus šiam 20 sekundžių laikotarpiui turi būti ignoruojamos.
Taip pat yra nustatyta korealiacija tarp Staphylococcus aureus DNazės aktyvumo ir koaguliazės aktyvumo. Agare esanti deoksiribonukleininė rūgštis geba aptikti deoksiribonukleazę-DNazę, kuri depolimerizuoja DNR. Inkubuoti lėkšteles 18-24 val. 35-37°C temperatūroje. Po terpės su tiriamąja kultūra inkubacijos, lėktštelė yra užpilama su 1N HCl, kuri sukelia polimerizuotos DNR iškritimą nuosėdomis, kas sukelia terpės neskaidrumą. Paliekama 2 min. leidžiant rūgščiai prasiskverbti į terpę. Mikroorganizmai, kurie ardo DNR sukuria skaidrią depolimerizuotos DNR zoną aplink savo augimo vietą. Tuo tarpu terpė tolėliau nuo inokuliacijos vietos bus neskaidri ir balkšva dėl polimerizuotos DNR. DNazei neigiamų mikroorganzimų išaugimo atveju nebus matoma skaidri zona aplink bakterijas.
CAMP testu galima diferencijuoti ne tik kitus stafilokokus, bet ir Staphylococcus aureus. Įtariant Staphylococcus aureus bakteriją ant kraujo agaro yra pasėjama Staphylococcus agalactiae kultūra siauro brūkšnelio pavidalu per lėkštelės centrą. Tiriamieji kamienai turi būti sėjami kuo arčiau t.y. apie 2-3 mm nuo Streptococcus agalactiae brūkšnio. Tiriamuosius mikroorganizmus galima priskirti Staphylococcus aureus rūšiai jei pasėlių susidūrimo vietoje matomas kastuvėlio ar pjautuvo formos hemolizės zona.
Įtariant Streptococcus agalactiae yra naudojami žinomi Staphylococcus aureus kamienai. Per lėkštelės centrą brėžiamas brūkšnys, o tiriamieji kamienai yra brėžiami statmenai Staphyloccocus
aureus brūkšniui, kuo arčiau (2-3 mm), tačiau brūkšneliai negali susiliesti. Reakcija yra teigiama,
kuomet matoma strėlės ar trikampio formos padidėjusios hemolizės zona esanti brūkšnelio gale, esančio arčiau Staphylococcus aureus brūkšnio. Esant tokiai reakcijos interpretacijai galima teigti, kad tiriamieji kamienai yra Streptococcus agalactiae.
Lėkštelės inkubuojamos 35-37 °C laipsnių temperatūroje 18-24 val. Rekomenduojama vengti inkubacijos anaerobiškomis sąlygomis, nes tiriant A grupės streptokokus galimi klaidingai teigiami rezultatai.
Eskulino reakcija yra atliekama tikrinant streptokokus. Enterococcus ir tam tikri streptokokai, ypač Streptococcus uberis, hidrolizuoja glikozidą eskuliną iki eskuletino ir dekstrozės. Eskuletinas reaguodamas su geležies druskomis, esančiomis terpėje, formuoja nuo tamsiai rudos iki juodos spalvos kompleksą. Geležies citratas agare naudojamas kaip indikatorius eskulino hidrolizei ir eskuletino susiformavimui. Taigi, aplink kultūras hidrolizuojančias eskuliną susidaro nuo tamsiai rudos iki juodos spalvos zonos, kurios matomos UV (366nm) šviesoje, jeigu reakcija yra eskulinui neigiama tuomet UV šviesoje terpė fluorescuos.
PYR yra greitasis kolorimetrinis testas skirtas identifikuoti tam tikroms bakterijų grupėms. Šis testas paremtas enzimo pirolidonilo arilamidazės aktyvumu arba gebėjimu fermentiškai hidrolizuoti L-pirolidonil-β-naftilamidą (PYR). Filtrinio popieriaus diskai yra impregnuoti L-pyrolidonilo-beta-naftilamidu (PYR), kuris tarnauja, kaip substratas aptinkantis pirolidonilo arilamidazę (PYRazė). Enzimas sukelia substrato hidrolizę, ko rezultate beta naftilamidas duoda spalvinę reakciją. Tyrimo metu paimtą koloniją reikia švelniai paskleisti tam tikroje disko zonoje ir palikti kambario temperatūroje 2 minutes. Tuomet įlašinti vieną lašą spalvos ryškalo ir stebėti reakciją. Reakcija teigiama jeigu 1 min. bėgyje atsiranda (šviesiai) rožinė/raudona (vyšninė) spalva. Neigiamos reakcijos metu spalva nekinta. Teigiama PYR reakcija leidžia manyti, kad tai A grupės steptokokams priskiriamas Streptococcus pyogenes ar enterokokai. PYR neigamas yra
Streptococcus uberis.
Streptokokai, kurie nehidrolizuoja eskulino gali būti visų pirmiausia vertinami pagal hemolizės zoną. Tuomet atitinkamai, atsižvelgus į hemolizę, yra parenkami latekso agliutinacijos testai. Akivaizdi alfa hemolizė būdinga Streptococcus dysgalactiae, kuris tvirtinamas C streptokokų latekso agliutinacijos testu. Beta hemolizė būdinga Streptococcus pyogenes ir Streptococcus
agalactiae, kurie patvirtinami atitinkamai A ir B grupės streptokokų latekso agliutinacijos testais.
Pagal Lancefield klasifikaciją dalis streptokokų yra išskiriami į skirtingas grupes pagal specifinius karbohidratinius antigenus esančius and bakterijos ląsteslės sienelės. Būtent streptokų
latekso agliutinacijos testas yra skirtas nustatyti kuriai grupei tiriamasis streptokokas priklauso. Testo rinkinys susideda iš šešių buteliukų, kiekviename iš jų yra 1,5 ml latekso dalelių padengtų streptokokų grupių antiserumais, tai būtų grupės A, B, C, D, F ir G.
Gramneigiamos bakterijos yra tiriamos chromokulto agaru. Užsėtas terpes, agaru į viršų, reikia inkubuoti 35-37°C 24 val. laikotarpiui. Tyrimas grindžiamas koliforminių bakterijų gaminamos galaktosidazės gebėjimu skaidyti Salmon-GAL substratą. Taigi, Salmon-GAL substratas yra naudojamas norint identifikuoti koliformų gaminamą β-D-galaktosidazę. Šiam fermentui sąveikos su Salmon-GAL substratu rezultate matomos nuo oranžinės (lašišą primenanti spalva) iki raudonos spalvos koliformų kolonijos.
Escherichia coli identifikacija. β-D-gliukuronidazė yra būdinga tik Escherichia coli. Šio
fermento nustatymui yra naudojamas substratas gliukuronidas. Escherichia coli skaido tiek X-gliukuronidą tiek ir Salmon-GAL substratus, o kolonijų spalva varijuoja nuo tamsiai mėlynos iki violetinės. Dėl spalvos skirtumų E. coli yra lengvai atskiriama nuo kitų koliformų, kuriems būdinga raudono atspalvio kolonijos. Tačiau kai kurios E. coli t.y. 3-4 proc. yra β-gliukuronidazei-neigiamos ir išauga rausvos spalvos, kaip ir kitos koliforminės bakterijos. Daugumai kitų mikroorganizmų būdinga bespalvės kolonijos, išskyrus toms, kurios pasižymi β-D-gliukuronidazės aktyvumu. Šios kolonijos būna nuo šviesiai mėlynos iki žalsvai melsvos spalvos.
Kai kurios bakterijos įskaitant ir Escherichia coli, kurios turi fermentą triptofanazę geba hidrolizuoti triptofaną kartu produkuojant indolą, amoniaką ir pirutavo rūgštį. Indolo testas paremtas raudonos spalvos komplekso susidarymu, kuomet indolas reaguoja su p-dimetilaminobenzaldehido aldehido grupe. Indolo gamyba – svarbi savybė, pagrinde, atskiriant E.
coli nuo kitų koliformų. Yra parenkama kolonija ir uždedama ant filtrinio popieriaus sumirkyto
Kovačo reagentu. Tamsiai raudonos ar ryškiai raudonos su violetiniu atspalviu spalvos atsiradimas per 30 s. nurodo indolui teigiamą bakterijų rūšį, o geltona ar spalvos neatsiradimas per 30 s. nurodo indolui neigiamą bakterijų rūšį.
Taip pat galima naudoti MacConkey agarą, kuris yra selektyvus koliformams. Ant MacConkey agaro užaugusios Escherichia coli bakterijų kolonijos būna rožinės, sausos, plokščios/lygios, laktozei teigiamos.
Klebsiella spp. ant MacConkey agaro išauga rožinėmis, gleivingomis kolonijomis, turinčiomis
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Mastitų sukėlėjų tyrimai bendro karvių tešmens pieno kiekio mėginuose
Kaip rodo 1 paveiksle pateikti mastito sukėlėjų analizės duomenys, žiemos sezonu labiausiai buvo paplitęs Staphylococcus spp. – 35,68 proc., antroje vietoje buvo Staphylococcus aureus, kurio paplitimas buvo 1,16 karto mažesnis.
0,54% 3,50% 3,24% 12,70% 0,27% 1,62% 1,35% 3,78% 35,68% 9,46% 30,81% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% Staph. spp, Str. agalactiae S. aureus, Str. agalactiae Gram + lazdelės Gram - lazdelės E. coli Str. dysgalactiae Str. uberis Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Str. agalactiae S. aureus
Skirtingų mastito sukėlėjų rūšių paplitimas
žiemos sezonu
1 pav. Mastitų sukėlėjų rūšių paplitimo analizė žiemos sezonu
Mažiausias paplitimas žiemos laikotarpiu buvo nustatytas Escherichia coli bakterijų, kurių paplitimas buvo 0,27 proc. tirtų mėginių.
0,81% 15,95% 7,30% 35,68% 40,27% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
Daugiau nei 1 sukelėjas Kiti sukėlėjai Aplinkos mikroorganizmai Sąlyginiai patogenai Užkrečiamieji patogenai
