ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
EGLĖ VASIUKONYTĖ
PAPRASTOJO AMALO (VISCUM ALBUM L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ
IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. Andrejus Ževžikovas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
PAPRASTOJO AMALO (VISCUM ALBUM L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ
IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Andrejus Ževžikovas
Data
Recenzentas Dar atliko
Magistrantė Eglė Vasiukonytė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Paprastojo amalo (Viscum album L.) morfologiniai požymiai, paplitimas ... 10
1.2 Paprastojo amalo žaliavos paruošimas ... 11
1.3 Paprastojo amalo žaliavos cheminė sudėtis ... 11
1.4 Paprastojo amalo kaupiamų iologiškai aktyvių junginių farmakologinės savy ės ... 12
1.4.1 Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 13
1.4.2 Antidiabetinis poveikis ... 13
1.4.3 Priešvėžinis aktyvumas ... 14
1.4.4 Antioksidantinis poveikis ... 14
1.5 Fenolinių junginių klasifikacija ... 15
1.5.1 Fenolinių junginių svar a ... 15
1.5.2 Fenolinės rūgštys ... 16
1.6 Fenolinių junginių analizė ... 18
1.6.1 Fenolinių junginių ekstrakcija ... 18
1.6.2 Fenolinių rūgščių koky inės ir kieky inės analizės metodai ... 18
1.7 Antioksidantai, antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 19
2. TYRIMO METODAI ... 21
2.1 Tyrimo objektas ... 21
2.2 Medžiagos ir reagentai ... 22
2.3 Aparatūra ... 22
2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 22
2.5 Tyrimo metodai ... 23
2.5.1 Fenolinių rūgščių nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 23
2.5.2 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 24
2.5.3 Antioksidantinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu ... 25
2.6 Duomenų statistinis vertinimas ... 26
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1 Fenolinių rūgščių koky inis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu Viscum album L. žolėje ... 28
3.2 Fenolinių rūgščių kieky inis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu
Viscum album L. žolėje ... 30
3.2.1 Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas ... 30
3.3 Suminio fenolinių junginių kiekio kitimo dinamikos nustatymas Viscum album L. žolėje ... 34
3.3.1 Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas pagal skirting žaliavos džiovinimo ūd .. 36
3.3.2 Chlorogeno rūgšties ir suminio fenolinių junginių kiekių koreliacinių ryšių vertinimas ... 38
3.4 Antioksidantinio aktyvumo kitimo dinamikos nustatymas Viscum album L. žolės ekstraktuose 39 3.4.1 Antioksidantinio aktyvumo įvairavimas pagal skirting žaliavos džiovinimo ūd ... 41
3.4.2 Antioksidantinio aktyvumo ir suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimo palyginimas .. 44
3.4.4 Antioksidantinio aktyvumo, suminio fenolinių junginių ir chlorogeno rūgšties koreliacinių ryšių vertinimas Viscum album L. žaliavoje, džiovintoje natūraliomis s lygomis ... 45
4. IŠVADOS ... 47
5.PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48
SANTRAUKA
E. Vasiukonytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. Andrejus Ževžikovas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Paprastojo amalo (Viscum album L.) žolės fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas.
Raktiniai žodžiai: Paprastasis amalas, Viscum album L., plonasluoksnė chromatografija, fenoliniai junginiai, fenolinės rūgštys, spektrofotometrija, Folin – Ciocalteu metodas, CUPRAC metodas.
Tyrimo objektas ir metodai: ant skirtingų medžių ir skirtingose vietovėse auganti Viscum album L. žolė. Fenolinių rūgščių koky inė ir kieky inė sudėtis nustatyta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu (EPC). Suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas Folin-Ciocalteu metodu. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas CUPRAC spektrofotometriniu metodu.
Tyrimo tikslas: nustatyti skirtingais ūdais džiovintos ir nuo įvairių medžių surinktos paprastojo amalo (Viscum album L.) žolės fenolinių rūgščių koky in ir kieky in sudėtį taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metod , bei nustatyti žaliavoje esantį suminį fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvum .
Darbo uždaviniai: nustatyti paprastojo amalo augalinėje žaliavoje esanči fenolinių rūgščių koky in ir kieky in sudėtį efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu. Ištirti suminį fenolinių junginių kiekį V. album L. žolėje, džiovintoje dviem skirtingais ūdais, ei įvertinti jų kiekių kitimo dinamik . Taikant CUPRAC metod nustatyti paprastojo amalo žolės etanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo įvairavim ir įvertinti džiovinimo ūdo įtak jam. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp fenolinių rūgščių ir suminio fenolinių junginių kiekio ei antioksidantinio aktyvumo.
Tyrimo rezultatai ir išvados: visuose V. album L. žolėje, mėginiuose identifikuota fenolinė rūgštis – chlorogeno rūgštis, kieky iškai nustatyta žaliavoje, džiovintoje natūraliomis s lygomis (0,319- 1,096 mg/g). Suminis fenolinių junginių kiekis V. album L. mėginiuose įvairuoja 13,23-18,29 mg/g. Antioksidantinis aktyvumas varijuoja 65,66-168,25 mg/g. Didesnis antioksidantinis aktyvumas ir suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas paprastojo amalo žaliavoje, džiovintoje natūraliomis s lygomis nei 60 C temperatūroje. Didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis, suminis fenolinių junginių kiekis ir antioksidantinis aktyvumas nustatytas nuo Malus L., Doškonyse, Alytaus raj., rinktoje ir natūraliomis s lygomis džiovintoje V. album L. žaliavoje (atitinkamai 1,0960,012 mg/g, 18,290,33 mg/g, 168,250,69 mg/g). Stipriausias koreliacinis ryšys nustatytas tarp chlorogeno rūgšties ir suminio fenolinių junginių kiekio (R2
SUMMARY
E. Vasiukonytė masters thesis. Supervisor doc. dr. Andrejus Ževžikovas Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological chemistry. – Kaunas, 2018.
Title: Research of phenolic compounds and antioxidant activity in Mistletoe (Viscum album L.) herb.
Keywords: Mistletoe, Viscum album L., thin-layer chromatography, phenolic compounds, phenolic acids, spectrophotometry, Folin – Ciocalteu method, CUPRAC method.
Object and methods: on different host trees and in different locations growing Viscum album L. herb. The quantitative and qualitative composition of phenolic acids is determined using high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) analysis method. A total amount of phenolics compounds is determined by Folin-Ciocalteu method. Antioxidant activity was assessed using CUPRAC spectrophotometric method.
The aim: to investigate qualitative, quantitative composition and its variance of phenolic acids in mistletoe (Viscum album L.) herb handpicked from various trees and dried in different methods, using high-performance thin-layer chromatography method and to evaluate the amount of total phenolic compounds and antioxidant activity of extracts.
The objective of the Study: to evaluate a quantitative and qualitative composition of phenolic acids in mistletoe herb using the HPTLC analysis method. To determine the amount of total phenolic compounds in herb of V. album L., dried in two different ways and evaluate changes in the dynamics. Determine variation and drying method effect on the antioxidant activity of mistletoe ethanolic extracts by using CUPRAC method. Evaluate correlation between quantities of phenolic acids and total phenolic compounds and antioxidant activity.
Results and conclusions: Phenolic acid – chlorogenic acid was identified in all V. album L. samples and was quantified in herb dried naturally in the air (0,319-1,096 mg/g). A total amount of phenolic compounds in V. album L. samples varies 13,23-18,29 mg/g. Antioxidant activity varies 65,66-168,25 mg/g. Increased antioxidant activity and the amount of total phenolic compounds were determined in naturally dried raw material in comparison with raw material dried at 60 C temperature. The mistletoe hosted by Malus L., in Doškonys, Alytus region proved to be the richest in chlorogenic acid, total amount of phenolic compounds and antioxidant activity (1,0960,012 mg/g, 18,290,33 mg/g, 168,250,69 mg/g accordingly). The strongest correlation was estimated between the chlorogenic acid and the amount of total phenolic compounds content.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2-azino- is-(3-etil enztiazolino-6-sulfono rūgštis)ANOVA - vieno faktoriaus dispersinė analizė (angl. analysis of variance)
CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Copper Reduction Assay) DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija
FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) GRE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. gallic acid equivalents)
PC – plonasluoksnė chromatografija Rf – sulaikymo rodiklis
RNS – reaktyviosios azoto formos (angl. reactive nitrogen species) ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) R - Pirsono koreliacijos koeficientas
R2 - regresijos koeficientas
ĮVADAS
Pastaraisiais dešimtmečiais vaistinė augalinė žaliava ir jos preparatai įgauna vis didesnį susidomėjim dėl farmakologinio veikimo įvairovės ir plataus pritaikymo įvairių ligų gydymui ir profilaktikai. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, apie 80 proc. visų gyventojų savo pirminės sveikatos priežiūros reikmėms daugiausia renkasi tradicin medicin . Didelė dalis naujų vaistų gaminami iš antrinių meta olitų ir junginių išskirtų iš natūralių šaltinių [11]. Siekiant racionalaus vaistinių preparatų vartojimo la ai svar u įvertinti augalinės žaliavos koky inius ir kiekybinius parametrus bei iologiškai aktyvių medžiagų įvairavimo dėsningumus.
Paprastasis amalas (Viscum album L.) yra visžalis, pusiau parazitinis ant medžių augantis puskrūmis, priklausantis Santalinių (Santalaceae) šeimai [17]. Amalas nuo seno žinomas kaip pasižymintis antihipertenziniu, spazmolitiniu ir nervų sistemos aktyvum slopinančiu poveikiu [8]. Vėliau pradėtas vartoti ne tik tradicinėje medicinoje, bet ir komplementariam gydymui dėl tyrimais įrodyto imunostimuliuojančio, citotoksinio, proapoptotinio [7], antidiabetinio, antioksidantinio, priešuždegiminio, priešvirusinio, anti akterinio ir priešgry elinio poveikio [19, 20, 45]. Farmakologinį aktyvum lemia kaupiami iologiškai aktyvūs junginiai – lektinai, viskotoksinai, alkaloidai, polisacharidai, triterpenoidai, amino rūgštys, neorganiniai junginiai bei fenoliniai junginiai [20]. Žinoma, kad fitocheminė sudėtis kinta priklausomai nuo medžio, ant kurio auga amalas, augalo augimo s lygų ir jo naudojamos dalies [3, 4, 11, 20, 50]. Biologiškai aktyvių medžiagų kieky iniai ir kokybiniai sudėties pokyčiai s lygoja farmakologinio aktyvumo kitimus, todėl fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinių savy ių įvairavimas yra svarbus vertinant žaliavų koky ir nustatant jų aktyvumo principus. Fenolinių junginių koky inei ir kieky inei sudėčiai įvertinti pasirinktas greitas, pakankamai jautrus ir tikslus efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas, endram jų kiekiui ir antioksidantiniam aktyvumui vertinti - plačiai taikomi spektrofotometriniai analizės metodai. Darbo naujumas. Lietuvoje šiuo metu nėra atliktas paprastojo amalo žaliavos, surinktos nuo skirtingų medžių, fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimo tyrimas bei įvertinta skirtingo žaliavos džiovinimo ūdo įtaka šių rodiklių kitimui. Taip pat tyrimas įvertina fenolinių rūgščių, suminio fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo koreliacinius ryšius.
Darbo tikslas – nustatyti skirtingais ūdais džiovintos ir nuo įvairių medžių surinktos paprastojo amalo (Viscum album L.) žolės fenolinių rūgščių koky in ir kieky in sudėtį taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metod , ei nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavim .
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti skirtingais ūdais džiovintos ir nuo įvairių medžių surinktos paprastojo amalo (Viscum album L.) žolės fenolinių rūgščių koky in ir kieky in sudėtį taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metod , bei nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavim .
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti paprastojo amalo augalinės žaliavos fenolinių rūgščių koky in ir kieky in sudėtį efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu.
2. Ištirti suminį fenolinių junginių kiekį Viscum album L. žolėje, džiovintoje dviem skirtingais ūdais, ei įvertinti jų kiekių kitimo dinamik .
3. Taikant spektrofotometrinį CUPRAC metod nustatyti paprastojo amalo žolės etanolinių ekstraktų redukcinės ge os įvairavim ir įvertinti džiovinimo ūdo įtak antioksidantiniam aktyvumui.
4. Įvertinti kieky inės fenolinių rūgščių sudėties, suminio fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo koreliacinius ryšius.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Paprastojo amalo (Viscum album L.) morfologiniai požymiai,
paplitimas
Paprastasis amalas (Viscum album L.) – santalinių (Santalaceae) šeimos augalas (1 pav.). Anksčiau Viscum gentis priklausė Viscaceae šeimai, tačiau genetinių tyrimų metu (The Angiosperm Phylogeny Group, 2003) augalas priskirtas Santalaceae L. šeimai [17]. Viscum genčiai priklauso daugiau kaip 450 rūšių, o Lietuvoje aptinkama viena – Viscum album L. rūšis. Mokslinėje literatūroje dar vadinamas Europietiškuoju amalu ir skirstomas į tris Viscum album L. porūšius: Viscum album ssp. album, augantis ant lapuočių medžių, Viscum album ssp. abieties, parazituojantis ant eglių, ir Viscum album spp. austriacum – ant pušų [18, 20].
1 pav. Paprastasis amalas (Viscum album L.) [55]
Tai yra pusiau parazitinis visžalis ir nuodingas rutulio formos puskrūmis, dažniausiai 15-80 cm skersmens. Amalo stie as yra plikas, apvalus, dichotomiškai šakotas. Lapai - priešiniai, 50-80 mm ilgio, ovalūs, uki, odiški, gelsvai žali. Augalo žiedai yra dvinamiai, gelsvai žali, ekočiai. Amalai žydi vasario- alandžio mėnesiais. Vaisiai yra netikros, lipnios, žirnio dydžio (6-10 mm), baltos uogos, kurios prinoksta vėlai rudenį ir lieka ant augalo vis žiem [53]. Paukščiai maitinasi amalo uogomis ir lipnias sėklas perneša ant kitų medžių, taip sėklos prikim a žievėje, sudygsta, daigo šaknis prasiskver ia pro žiev ir pasiekusi medien - įsitvirtina. Augalas gali augti ant spygliuočių ir lapuočių medžių, tačiau dažniausiai parazituoja ant lapuočių: o elų, gluosnių, žuolų, tuopų, klevų, eržų,
šermukšnių. Nustatyta, kad ypač vertingi amalai augantys ant spygliuočių medžių: pušies, kėnio. Tai lėtai augantys puskrūmiai, pasižymintys ilgu gyvenimo ciklu – galintys gyvuoti apie 70 metų. Pusiau parazitiniams augalams Viscum album L. priskiriamas dėl ge ėjimo maitintis šeimininko – medžio vandeniu ir jame ištirpusiomis mineralinėmis medžiagomis, o organines medžiagas pasigaminti patys žaliuose lapuose ir stiebuose [47].
Viscum album L. svar us tiek iologinei įvairovei, tiek dėl plataus farmakologinio spektro. Dėl palankių klimato s lygų, amalas la ai išplito ir pastaruoju metu tampa net ir nepageidaujamas. Paprastasis amalas plačiai paplit s centrinėje Europoje (nuo šiaurės Afrikos iki pietų Anglijos ir pietų Skandinavijos), pietvakarių ir rytų Azijos iki Japonijos [47].
Lietuvoje paprastasis amalas daugiausia paplit s pietvakariniuose ir vidurio Lietuvos rajonuose (Lazdijų, Varėnos, Alytaus, Kauno, Marijampolės, Prienų, Kaišiadorių ir kt.), kitur yra retesnis [54]. Paste imos kelios gausesnės amalo paplitimo vietos: Kauno, Lekėčių, Veiverių, Prienų, Rumšiškių ir į pietus nuo Kapčiamiesčio, Leipalingio, Merkinės. Mūsų kraštuose dažniausiai aptinkamas ant tuopų, eržų, klevų, gluosnių, o elų, šermukšnių (Snarskis 1959, Navasaitis 2004).
1.2 Paprastojo amalo žaliavos paruošimas
Tinkamas vaistinės augalinės žaliavos paruošimas yra svarbus kokybei bei iologiškai aktyvių medžiagų išsaugojimui džiovintoje žaliavoje, todėl svar u parinkti geriausi žaliavos apdorojimo ūd .
Kaip vaistinė augalinė žaliava naudojama amalo žolė, jauni stie ai su lapais [20, 50]. Dažniausiai žaliava renkama nuo vėlyvo rudens iki kovo- alandžio mėnesio [46]. Mokslininkai Vicaş, Rugina, Socaciu (2011) paste ėjo, kad didesnis fenolinių junginių kiekis fiksuojamas V.album L žaliavoje rinktoje pavasarį nei rudenį [2]. Surinkta žaliava džiovinama paskleidus j plonu sluoksniu ir apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių, kam ario temperatūroje. Taip pat šaltiniuose pateikiama ir kita džiovinimo metodika: siekiant išvengti fermentų degradacijos, paprastojo amalo žaliava greitai džiovinama 90 C temperatūroje, 48 val. (Markham, 1982). Toliau žaliava smulkinama, malama, ruošiami etanoliniai, vandeniniai, metanoliniai ekstraktai, tinktūros ar sausieji ekstraktai [50].
1.3 Paprastojo amalo žaliavos cheminė sudėtis
Apžvelgus literatūr ir susisteminus daugelio autorių mokslinių tyrimų duomenis, galima teigti, kad ekstraktų cheminė sudėtis priklauso nuo medžio rūšies, ant kurios auga amalas, augimo
s lygų, augalo metų ir jo naudojamos dalies, ekstraktų paruošimo, bei reagentų koncentracijos ir gamybos proceso [3, 4, 20, 50, 52].
Vieni svar iausių randamų sudedamųjų medžiagų - amalo lektinai I, II, III (ML I, II, III), chitin sujungiantys lektinai 1 (c ML1), 2 (c ML2), 3 (c ML3), kurių kiekis svyruoja nuo 340 iki 1000 g/g sausoje žaliavoje. Kiti farmakologiniu atžvilgiu la ai svar ūs junginiai – viskotoksinai (A1, A2, A3, B, B2, C1, 1-PS), kurių nustatoma 0,05 – 0,1 proc. [49]. Remiantis mokslinių tyrimų duomenimis, nustatoma la ai įvairi kieky inė ir koky inė fenolinių junginių sudėtis. Dažniausiai identifikuojamos fenolinės rūgštys: galo, chlorogeninė, anyžio, ferulo, kavos, vanilino, gentizino, p-OH enzoinė, siringino, salicilo, p-kumaro, n-kumaro, sinapo, trans-cinamono, elago, rozmarino rūgštys, bei flavonoidai: kvercetinas, naringeninas, kemferolis. Be fenolinių junginių taip pat aptinkamos ir kitos medžiagos: polisacharidai (pektinas, arabinogalaktanas, ramnogalakturonanas, ksiloglukanas), triterpenodai ir fitosteroliai (β-sitosterolis, stigmasterolis, β-amirinas, β-amirino acetatas, betulino r., oleanolio r., ursolio r., r., lupeolis) sudarantys apie 0,2 proc., ir aminai (cholinas, acetilcholinas, β-fenilalaninas, tiraminas, histaminas), amino rūgštys (argininas, cisteinas, γ-aminosviesto r., valinas, asparaginas), alkaloidai, sudarantys 9,3 proc. [20, 49]. Nedideliais kiekiais nustatomi neorganiniai junginiai (manganas, kalis, kalcio oksalatas), askor o rūgštis [17, 20].
1.4 Paprastojo amalo kaupiamų biologiškai aktyvių junginių
farmakologinės savybės
Viscum album L. kaip medicininis augalas žinomas nuo Antikos laikų [5, 21]. Tuo metu amalas uvo vartojamas kaip augalas, pasižymintis antihipertenziniu, spazmolitiniu ir nervų sistemos aktyvum slopinančiu, žaizdų gijim skatinančiu poveikiu [8]. Vis didėjantis susidomėjimas amalu ir jo savy ėmis skatino reikšmingus tyrinėjimus ir naujų pritaikymo galimy ių ieškojim . Remdamiesi moksliniais rezultatas, Antroposofijos medicinos metodo pradininkai, Wegman ir Steiner, 1917m. pristatė, kad Viscum album L. ekstraktai ir preparatai gali ūti taikomi ir vėžio gydyme [6]. Atlikti in vivo ir in vitro tyrimai parodė, kad vandeniniai amalo ekstraktai ir jo preparatai turi imunostimuliuojantį, citotoksinį, proapoptotinį poveikį [7]. Taip pat nustatytas antidia etinis, antioksidantinis, priešuždegiminis, priešvirusinis, anti akterinis ir priešgry elinis poveikiai [2, 19, 20].
1.4.1 Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
Tyrimų duomenimis, kardiovaskulinis poveikis priklauso nuo amalo sudėtyje esančių cheminių junginių: cholino, acetilcholino, γ-amino utiro rūgšties, tiramino, histamino. Dėl šių junginių pasireiškia trumpalaikis hipotenzinis poveikis [18, 50]. Tyrimų su gyvūnais metu nustatyta, kad Viscum album L. etanoliniai ekstraktai reikšmingai sumažina kraujo spaudim . Ekstraktų poveikis grindžiamas poveikiu per muskarino receptorius (Radenkovic ir kt. 2009) ir susij s su atsaku į nervų sistemos poveikį periferinėms kraujagyslėms (Oferm ir kt. 2007). Taip pat nustatyta, kad fenoliniai junginiai – fenilpropanoidai ir flavonoidai, išskirti iš Viscum album ssp. album, inhibuodami cAMP-fosfodiesteraz , sukelia nuo dozės priklausom kraujagyslių išsiplėtim ir taip sumažina kraujo spaudim [20, 52]. Tolimesnių tyrimų metu nustatyta, kad amalo sudėtyje esantys viskotoksinai gali sukelti refleksin radikardij , pasižymėti neigiamu inotropiniu poveikiu ir sukelti vazokonstrikcij kačių ir triušių širdies raumenyje [52].
1.4.2 Antidiabetinis poveikis
Gliukozės kiekį kraujyje mažinantis amalo poveikis pagrįstas in vitro ir in vivo tyrimais. Mokslininkų teigimu, Viscum album L. sudėtyje yra vandenyje tirpių, karščiui atsparių, padidinančių gliukozės transport ir meta olizm ei insulino išskyrim skatinančių medžiagų (Gray ir Flatt, 1999). Vieno tyrimo metu pelėms ir triušiams uvo sušvirkšta poodinė aloksano injekcija. Po vandeninių amalo ekstraktų pavartojimo uvo paste ėtas reikšmingas gliukozės kiekio kraujyje sumažėjimas ir insulino kiekio padidėjimas (Ohiri ir kt. 2003; Shahaboddin ir kt. 2011). Ekstraktai pagerino kraujo antioksidantinį aktyvum , o tai yra la ai svar u dia eto komplikacijų profilaktikai (Shahaboddin ir kt. 2011). Panašus poveikis paste ėtas ir streptozotocino sukelto dia eto pelėms. Po trijų savaičių gydymo metanoliniu amalo ekstraktu lyginant su kontroline grupe nustatytas reikšmingas hiperglikemijos sumažėjimas ir dvigu ai didesnis -amilazės aktyvumas [18, 21]. Be to, tyrimai rodo, amalo galim apsauginį poveikį dia eto sukeltam inkstų funkcijos sutrikimui ir kepenų fermentų, lipidų rodiklių gerinimui (Adaramoye ir kt, 2012). Buvo įrodyta, kad kai kurie fenoliniai junginiai slopina pažangius glikacido galutinius produktus, kurie yra daugelio dia eto sukeltų komplikacijų priežastis (Choudhary ir kt. 2010) [18].
1.4.3 Priešvėžinis aktyvumas
Susidomėjimas alternatyviu ir papildomu gydymu (APG) pasaulyje nuolat didėja. Įvairių klinikinių ir epidemiologinių tyrimų duomenimis, nuo 58 iki 74 proc. sergančiųjų pikty iniais navikais kartu su tradiciniu gydymų vartoja įvairius APG metodus, tarp jų ir gydym vaistažolėmis [48]. Šiuo metu didelis dėmesys vėžio gydyme skiriamas amalo preparatams. Vandeniniai Viscum album L. ekstraktai pagaminti iš žaliavos, surinktos nuo skirtingų medžių vartojami, kaip alternatyvus gydymas ar adjuvantinė vėžio terapija.
Įrodymais pagrįstas amalo preparatų priešvėžinis aktyvumas nagrinėjamas daugelyje pu likuotų straipsnių (Ernst ir kt. 2003; Kienle ir kt. 2003; ir kt. 2004; Horneber ir kt. 2008; Marvibaigi ir kt. 2014). Dėl poveikio imuninei sistemai ir vėžinėms l stelėms, vieni svar iausių ir daugiausiai tyrinėjimų yra lektinai ir viskotoksinai. Kiti, antinavikiniu poveikiu pasižymintys amalo komponentai fenoliniai junginiai. Fenoliniai junginiai apsaugo l stelių komponentus (DNR, altymus, lipidus) nuo oksidacinių procesų žalos, sumažina kenksming ir mutageninį laisvųjų deguonies radikalų kiekį, susidarantį radio- ar chemoterapijos metu, o fenolinės rūgštys pasižymi ir imunostimuliuojančiu poveikiu [19, 24, 33]. Mokslinių šaltinių duomenimis, tokios fenolinės rūgštys, kaip kavos rūgštis, chlorogeno rūgštis, slopina tumoro l stelių aktyvum veikdamos naviko l stelių adhezij , proliferacij , migracij ir invazij (Yagasaki ir kt., 2000; Weng ir kt., 2012). Dėl tokių iologiškai aktyvių medžiagų savy ių, amalo klinikiniams tyrimams ir analizei skiriamas vis didesnis dėmesys. Nuo 1995 metų kas ketverius metus yra rengiami amalo priešvėžiniam aktyvumui skirti simpoziumai. Remiantis naujausios konferencijos duomenimis, atliktais Viscum album L. preparatų tyrimais, nustatyta, kad amalo ekstraktai turi įtakos gydymo atsakui, endram išgyvenamumui, gyvenimo koky ės gerinimui. Preparatai sumažina priešvėžinio gydymo šalutinius reiškinius, o patys turi mažai nepageidaujamų reakcijų [47].
1.4.4 Antioksidantinis poveikis
Pastaraisiais metais skiriama daug dėmesio amalo antioksidantinio aktyvumo tyrimams (Onay-Ucar ir kt. 2006; Leu ir kt., 2006; Yao ir ktl., 2006; Shi ir kt., 2006; Vicas ir kt, 2009b; Choudhary ir kt., 2010). Naujausių tyrimų duomenimis, nedidelių koncentracijų etanoliniai Viscum album L. lapų ekstraktai turi didesnį antioksidantinį aktyvum nei vitaminas C [12]. Amalo ekstraktų antioksidantinį aktyvum daugiausiai lemia fenoliniai junginiai, ypač fenolinės rūgštys ir flavonoidai – dėl savo redukcinių savy ių ge antys apsaugoti žmogaus organizm nuo oksidacinio streso [17].
Sengul ir kiti (2009) nustatė, kad Viscum album L. turi didelį antioksidantinį aktyvum (82,23 proc.) ir endr fenolinių junginių kiekį (24,29 mg/g) [23].
Mokslininkų teigimu, paprastojo amalo antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo medžio, ant kurio auga augalas ir nuo jų rinkimo laiko [2, 17,19, 21]. Dėl parazituojančio augalo savy ių kai kurias medžiagas gauti iš medžio, sudėtis ir iologinis aktyvumas gali labai skirtis ir turėti reikšming įtak . Siekiant kuo geriau išsiaiškinti Viscum album L. sudėties ir aktyvumo principus, turi ūti atliekami tolimesni tyrimai [19].
1.5 Fenolinių junginių klasifikacija
Fenoliniai junginiai yra viena iš plačiausiai paplitusių iologiškai aktyvių junginių grupių augaluose, žinomi kaip natūralūs antriniai meta olitai [25]. Netirpūs fenoliai yra pasiskirst augalo l stelių sienelėse, kai tuo tarpu tirpūs yra suskaidomi l stelių vakuolėse [29]. Žinoma apie 8000 skirtingų fenolinių junginių, kuriems ūdinga struktūrinė ypaty ė - aromatinis žiedas, galintis turėti vien ar kelet hidroksilo grupių [25, 27, 51]. Nėra nustatytos tikslios fenolinių junginių klasifikacijos, todėl juos galima klasifikuoti pagal kilm , iologines savy es, chemin struktūr , atsižvelgiant į anglies atomų skaičių. Pagal chemin struktūr klasifikacija pateikta 2 paveiksle [28].
2 pav. Fenolinių junginių klasifikacija pagal cheminę struktūrą
1.5.1 Fenolinių junginių svarba
Per pastaruosius du dešimtmečius galima rasti daugy ė mokslinių pu likacijų, susijusių su fenolinių junginių analize. Augalams fenoliniai junginiai svar ūs augimui ir reprodukcijai užtikrinti, turi įtakos augalų spalvai ir organoleptinėms savy ėms. Augalų ge ėjimas sintetinti fenolinius junginius vystėsi evoliucijos metu, šios medžiagos yra kaip gyny inė priemonė, padedanti prisitaikyti prie kintančių aplinkos s lygų: žemos temperatūros, UV spindulių, patogeninių mikroorganizmų,
Fenoliniai junginiai
Polifenoliai
Flavonoidai Stilbenai Lignanai Taninai
Paprastieji
Fenolinės
žolėdžių, maisto medžiagų trūkumo, oksidacinio ei deguonies trūkumo sukelto streso. Tyrimų duomenimis, augalai į tokias s lygas atsako didindami savo ge ėjim prisijungti laisvuosius radikalus [25, 27].
Fenoliniai junginiai pasižymi plačiu farmakologiniu spektru: antioksidantinį, antimikro inį, priešuždegiminį, priešalerginį, vazodilatacinį, priešvėžinį ir lipidų ei gliukozės kiekį kraujyje mažinantį poveikį. [18, 25, 26, 32, 33]. Šiuolaikinių tyrimų duomenimis, fenoliai laikomi stipriais antioksidantais in vitro ir demonstruoja didesnį antioksidantinį aktyvum , nei vitaminas C ir E, karotenoidai. Dėl to jie svar ūs įvairių oksidacinio streso sukeliamų lėtinių degeneracinių ligų, tokių kaip vėžio, osteoporozės, širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių ligų profilaktikai.
1.5.2 Fenolinės rūgštys
Pagal struktūr fenolinės rūgštys skirstomos į dvi grupes: hidroksicinamono rūgštys, kurioms ūdinga C6-C3 konformacinė struktūra (3 pav.) ir hidroksi enzoinė, su C6-C1 struktūra (4 pav.).
Fenolinių rūgščių struktūros pagrindas yra enzeno žiedas, o jų įvairovė priklauso nuo hidroksilo ir metoksi grupių padėties prie aromatinio žiedo (1-2 lentelės). Įvairūs fenoliniai junginiai randami skirtingomis augalo augimo stadijomis, kadangi yra žinoma, kad augimo s lygos turi įtakos fenolinių rūgščių sudėčiai augaluose. Dažniausiai augaluose randamos fenolinės rūgštys – kavos rūgštis, p-kumaro, vanilino ir ferulo rūgštys. Kitos fenolinės rūgštys nustatomos priklausomai nuo augalo rūšies (pvz., gentizino, siringino) [26].
1 lentelė. Hidroksicinamono rūgščių struktūros pavyzdžiai [26] Pavadinimas R1 R2 R3 R4 Cinamono rūgštis H H H H o-Kumaro rūgštis OH H H H m-Kumaro rūgštis H OH H H p-Kumaro rūgštis H H OH H
Ferulo rūgštis H OCH3 OH H
Sinapo rūgštis H OCH3 OH OCH3
Kavos rūgštis H OH OH H
4 pav. Hidroksibenzoinių rūgščių struktūrinė formulė 2 lentelė. Hidroksibenzoinių rūgščių struktūros pavyzdžiai [26]
Pavadinimas R1 R2 R3 R4
Benzoinė rūgštis H H H H
p-Hidroksibenzoinė rūgštis
H H OH H
Vanilino rūgštis H OCH3 OH H
Galo rūgštis H OH OH OH
Protokatechino rūgštis H OH OH H
Siringino rūgštis H OCH3 OH OCH3
Gentizino rūgštis OH H H OH
Veratro rūgštis H OCH3 OCH3 H
Salicilo rūgštis OH H H H
Kiek išsiskirianti iš kitų cinamono rūgščių yra natūraliai susidaranti chlorogeno rūgštis - esterifikuota kavos rūgštis su chinino rūgštimi (5 pav.).
5 pav. Chlorogeno rūgšties struktūra [26]
Fenolinių rūgščių įvairovė, lemianti skirting iologinį aktyvum , ei jų kintamumas yra vienas iš veiksnių, lemiančių fenolinių rūgščių analizės sudėtingum [26].
1.6 Fenolinių junginių analizė
1.6.1 Fenolinių junginių ekstrakcija
Augalinės žaliavos ekstrakcija pirmas ir labai svarbus žingsnis analitiniame procese siekiant išskirti augalo antrinius meta olitus (Bangoura ir kt., 2013; Sahin ir kt., 2013). Fenoliniai junginiai gali ūti ekstrahuojami švieži, šaldyti ar išdžiovinti, prieš tai atlikus žaliavos smulkinim , malim , homogenizavim . Fenolių ekstrakcijai naudojami tirpikliai: etanolis, metanolis, acetonas, etilacetatas, vanduo ar jų mišiniai, pasirenkami pagal analizuojamus junginius [25]. Dažnai naudojamas etanolis, kuris fenolinių junginių ekstrakcijai yra geras tirpiklis ir pakankamai saugus žmogaus vartojimui [34]. Fenoliai yra lengvai hidrolizuojami ir oksiduojami, todėl reikalinga atsižvelgti į ekstrakcijos laiko ir temperatūros parinkim [25]. Siekiant kuo geresnių koky inių ir kieky inių rodiklių, parenkamas optimalus ekstrakcijos ūdas. Dėl savo paprastumo ir pigios aparatūros fitofarmacijoje analizei plačiai taikoma ultragarsinė ekstrakcija. Vieno iš palyginamųjų tyrimų metu ekstrakcija ultragarsu sukėlė mažesn fenolinių junginių degradacij ir uvo daug greitesnė, nei mikro angų ar superkritinių skysčių ekstrakcija [35]. Atlikus ekstrakcij , yra atliekamas ekstraktų filtravimas, gryninimas ir toliau iologiškai aktyvių junginių koky inės ir kieky inės sudėties tyrimai.
1.6.2 Fenolinių rūgščių kokybinės ir kiekybinės analizės metodai
Kokybinei fenolinių junginių analizei naudojami įvairūs analizės metodai, tokie kaip efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC), randuolių magnetinio rezonanso spektroskopija [26, 44,].
Plonasluoksnė chromatografija (PC) - nuo 1960 metų naudojamas ir šiomis dienomis vis dar plačiai taikomas fenolinių rūgščių nustatymo metodas natūraliuose produktuose [26]. Tai yra patogus, greitas, patikimas, selektyvus, nereikalaujantis didelio medžiagos kiekio ir pakankamai gerai pritaikomas plataus spektro medžiagų tyrimams [26, 28, 37]. Šiuo metodu galima tiksliai identifikuoti tiriam sias medžiagas, taip ir nustatyti, kiek komponentų yra mišinyje, įvertinti medžiagos grynum , sekti reakcijos eig , naudojant įvairias tirpiklių sistemas ei sor entus [15, 45]. Naujesnis metodas – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, kurioje naudojamos aukštesnės koky ės silikagelinės plokštelės, su mažesnėmis dalelėmis ir lygesniu paviršiumi, pasižymi jautrumu ir geresniu atkuriamumu [37]. Būtent dėl šių savy ių plonasluoksnė chromatografija vis dar taikoma fitocheminei analizei.
Fenolinių junginių kieky in analiz galima klasifikuoti į: endro fenolinių junginių kiekio ir atskirų specifinių grupių [25, 28]. Kieky iniam fenolinių junginių nustatymui augaluose naudojami: efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, ultravioletinio ir regimojo spektro sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji plonasluoksnės chromatografija, rečiau – kapiliarinė elektroforezė [26]. Nustatant endr fenolinių junginių kiekį plačiai taikoma spektrofotometrinė analizė. Pagrindinis metodo principas yra toks, kad kiekvienas junginys sugeria ar a praleidžia švies tam tikrame diapazone. Matuojamas šviesos intensyvumas, pereinančios per cheminės medžiagos tirpal [45]. Bendram fenolinių junginių kiekiui vienas dažniausiai taikomų ir geriausiai tinkamų endro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodų - Folin-Ciocalteu [44, 51]. Metodas paremtas fenolinių grupių reakcija su fosfomoli dato ir fosfovolframo rūgščių kompleksu, kuris po reakcijos iš gelsvos spalvos pereina į mėlyn spalv . Tuomet spektrofotometru matuojama tirpalo a sor cija esant maždaug 760 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis standartas dažniausiai naudojama galo rūgštis [25].
1.7 Antioksidantai, antioksidantinio aktyvumo nustatymas
Dauguma laisvųjų radikalų yra nesta ilūs ir la ai reaktyvūs, gali atakuoti visame kūne esančias molekules ir taip s lygoti homeostazinius pakitimus [38]. Reaktyvusis deguonis (ROS) ei aktyvios azoto (RNS) formos gali sukelti deoksiri onukleorūgščių (DNR), ri onukleorūgščių (RNR), angliavandenių, lipidų, fermentų ar altymų oksidacines modifikacijas [25, 38, 39]. Tokiu tikslu, siekiant išvengti oksidacinių procesų žalos yra plačiai vartojami iš natūralių šaltinių, daugiausiai iš augalų gauti antioksidantai.
laisvuosius radikalus ir sumažinančios oksidacinį stres . Lyginant su sintetiniais, natūralūs antioksidantai yra lengvai gaunami, ekonomiški ir yra saugūs vartoti - sukelia mažai ar a visai nesukelia šalutinių poveikių. Literatūros šaltinių duomenimis, fenoliai, yra nepamainomi antioksidantai dėl to, kad turi fenolin hidroksilo grup , galinči atiduoti vandenilio atom ar elektron laisviesiems radikalams ir taip pat turi konjuguot aromatin sistem , ge anči delokalizuoti nesuporuot elektron [25]. Manoma, kad fenoliniai junginiai (F) kaip antioksidantai veikia per kelet mechanizmų: 1) surišdami laisvuosius radikalus ROS/RNS - veikia kaip laisvųjų radikalų akceptoriai ir greitai perduoda vandenilio atom radikalams (R) sudarydami sta ilius junginius ir nutraukdami grandinines reakcijas: R+FOH→RH+FO· 2) mažindami ROS/RNS susidarym slopinant ar aktyvinant kai kuriuos fermentus; 3) sudarydami chelatus su metalais, kurie skatina reaktyvių formų susidarym [25, 31].
Vieni iš dažniausiai taikomų, elektronų perdavimu pagrįstų, antioksidantinio aktyvumo nustatymo ūdų yra: 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) ir 2,2‘- azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties (ABTS) radikalų surišimo įvertinimas, vario (CUPRAC) ir geležies (FRAP) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymas [1, 25]. Taip pat gali ūti taikomi ir kiti analizės metodai vandenilio atomo perdavimo (HAT) principu: endro radikalų gaudyklės parametro nustatymo metodas (TRAP), deguonies radikalų a sor cijos (ORAC) ge os analizė ir kiti elektrocheminiai metodai [17, 25]. Detekcijai taikoma spektrofotometrinis regimosios šviesos a sor cijos pokyčio metodas. Nors mokslinėje literatūroje vieni iš populiariausių ABTS ir DPPH metodai, pastaruoju metu vis dažniau fenolinių junginių antioksidantiniam aktyvumui vertinti taikomas CUPRAC metodas (Apak ir kt. 2004, 2007). CUPRAC metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į chromogeninį vienvalenčio vario ir neokuproino kompleks [1, 43]. Tyrimai vykdomi esant neutralioms s lygoms (pH=7,0). CUPRAC spektrofotometrinis metodas - paprastas, greitas, ne rangus ir sudėtingos aparatūros nereikalaujantis antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas. Lyginant su kitais, šis metodas turi pakankamai privalumų. CUPRAC reagentas yra stabilesnis ir lengviau pagaminamas nei ABTS ir DPPH reagentai. Taip pat yra selektyvesnis, nes Cu (II) turi žemesnį redokso potencial (apie 0,60 V), nei ABTS•+ ar Fe (III) reagentai[1, 42, 43]. Dėl šių ir kitų savy ių CUPRAC pritaikomas daugelyje mokslo sričių siekiant įvertinti antioksidantinį aktyvum .
2. TYRIMO METODAI
2.1 Tyrimo objektas
Eksperimento metu tirta 16 paprastojo amalo (Viscum album L.) žaliavų mėginių, rinktų skirtingose vietovėse, nuo skirtingų medžių, augančių natūraliomis s lygomis (3 lentelė). Tyrimui naudota žaliava - žolė – amalo stiebai su lapais. Visos žaliavos rinktos 2017 metų alandį, amalo žydėjimo metu, kuomet medžiai vis dar uvo numet lapus. Žaliava išdžiovinta dviem skirtingais ūdais: 8 mėginiai džiovinti natūraliomis s lygomis gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių, 8 mėginiai – džiovinti 60 C temperatūros krosnelėje. Išdžiovintas tiriamasis o jektas supakuotas į popierinius maišelius ir laikytas tamsioje, sausoje vietoje.
3 lentelė. Žaliavų žymėjimas, medis ant kurio augo amalas ir vietovė
Žymėjimas Medis, ant kurio augo Viscum album L. Vietovė 1 Karpotasis eržas (Betula pendula L.) Kaunas, Vilijampolė 2 Karpotasis eržas (Betula pendula L.) Kaunas, Aukštieji Šančiai
3 Obelis (Malus domestica L.) Kaunas, Kalniečiai
4 Tuopa (Populus nigra L.) Kaunas, Aukštieji Šančiai
5 Paprastasis šermukšnis (Sorbus aucuparia L.) Kaunas, Kalniečiai
6 Obelis (Malus domestica L.) Doškonys, Alytaus raj.
7 Obelis (Malus domestica L.) Išlaužas, Prienų raj.
8 Gluosnis (Salix alba L.) Prienai, Kauno apskr.
1-60 Karpotasis eržas (Betula pendula L.) Kaunas, Vilijampolė 2-60 Karpotasis eržas (Betula pendula L.) Kaunas, Aukštieji Šančiai
3-60 Obelis (Malus domestica L.) Kaunas, Kalniečiai
4-60 Tuopa (Populus nigra L.) Kaunas, Aukštieji Šančiai
5-60 Paprastasis šermukšnis (Sorbus aucuparia L.) Kaunas, Kalniečiai 6-60 Obelis (Malus domestica L.) Doškonys, Alytaus raj. 7-60 Obelis (Malus domestica L.) Išlaužas, Prienų raj.
2.2 Medžiagos ir reagentai
Paprastojo amalo stie uose ir lapuose esančių fenolinių junginių analizei naudojami analitinio švarumo tirpikliai, reagentai, standartai: etilo alkoholis (96 proc., Vilniaus degtinė), ledinė acto rūgštis (UAB Fasuotos cheminės medžiagos“ Vilnius, Lietuva), Folin – Ciocalteu ( Sigma – Aldrich Chemie Gm H“, Steinheim, Vokietija), natrio karbonatas (,,Sigma-Aldrich“, Vokietija), etilacetatas (Sigma-Aldrich, Toluca, Meksika), skruzdžių rūgštis (98-100 proc.) rūgštis (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Vokietija), išgrynintas vanduo Millipore“ (JAV) vandens gryninimo sistem CUPRAC reagentas gamintas iš: vario (II) chlorido ( Alfa Aesar Gm H & Co KG“, Karlsruhe, Vokietija), neokuproino ( Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija), amonio acetatinio uferio ( Sigma-Aldrich“, Belgija). Apipurškimui naudotas su 2-aminoetildifenil orinatas (≥97 proc.) gautas iš Fluka analytical (Schnelldorf, Vokietija) ir makrogolis 400 ( Alcon Chemicals“, Šveicarija). Standartai: 3,4-dihidro enzoinė rūgštis (400 g/ml, 80 proc. metanolis); trans-cinamono rūgštis (400 g/ml, 80 proc. etanolis); kavos rūgštis (1 mg/ml, 70 proc. etanolis); kavos ir chlorogeno rūgšties mišinys (0,524 mg/ml, 0,535 mg/ml); galo rūgštis (0,5mg/ml, 96,3 proc. etanolio), ferulo rūgštis (99 proc., 5 mg/ml, 96,3 proc. etanolio, Sigma-Aldrich, Vokietija), elago rūgštis (0,99 ml/ml); p-kumaro rūgštis (0,5 mg/ml, 98 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija).
2.3 Aparatūra
Elektrinis malūnas (Retsch 200, Haan, Vokietija), analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija), automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV) termostatinė ultragarsinė vonelė (Heidolph, Sch a ach, Vokietija), 20 cm aukščio ir pločio 20 cm stiklo plokštelės (silikagelis 60F254; Merck, Vokietija), stiklinė plonasluoksnės chromatografijos kamera su metaliniu dangčiu (Camag, Muttenz, Šveicarija), plonasluoksnės chromatografijos vizualizatorius (Camag, Muttenz, Šveicarija), pusiau automatinis mėginių užnešėjas Camag Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija), spektrofotometras Halo DH – 20 UV Vis Dinamika Gm H (Šveicarija), elektrinė kaitlentė (Camag, TLC Plate Heater III, Šveicarija).
2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas
Paprastojo amalo (Viscum album L.) žolė, lapai ir stie ai, buvo susmulkinti į mažesnes dalis ir džiovinami dviem ūdais: 8 mėginiai natūraliomis s lygomis, tamsioje, nuo drėgmės apsaugotoje
vietoje ir 8 mėginiai prie 60 C temperatūros krosnelėje. Ekstrakcija vykdoma remiantis analizuota moksline literatūra [17, 52]. Išdžiovinta žaliava susmulkinta elektriniu smulkintuvu. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti, pagaminti Viscum album L. žaliavų 1:10 etanoliniai ekstraktai. Atsvėrus 1g (tikslus svėrinys) susmulkintos augalinės žaliavos, užpilama 10ml 70 proc. (V/V) etanolio (n=16). Ekstrahuojama 15 minučių ultragarso vonelėje, palaikant pastovi 25 C temperatūr . Gauti ekstraktai centrifuguojami ir laikomi 24 val. tamsaus stiklo talpyklėse, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.
Efektyviajai plonasluoksnei chromatografijai ir antioksidantiniam aktyvumui nustatyti buvo pagaminti ekstraktai tokiomis pačiomis s lygomis tik su 2 g žaliavos ir užpylus 10 ml 70 proc. (V/V) etanolio.
2.5 Tyrimo metodai
2.5.1 Fenolinių rūgščių nustatymas efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Etaloniniai 3,4-dihidro enzoinės rūgšties, trans-cinamono rūgšties, kavos, galo, ferulo, p-kumaro, vanilino rūgščių, kavos ir chlorogeno rūgčių mišinio tirpalai ir tiriamieji paprastojo amalo ekstraktų mėginiai užnešti ant silikageliu dengtos aukšto efektyvumo chromatografinės plokštelės, naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėj Camag Linomat 5 su 100 l tūrio mikrošvirkštu, plokštelėje paliekančiu rūkšnio pavidalo dėm . Pažymima 10 cm ri a nuo mėginių užnešimo linijos. Išanalizavus mokslin literatūr , paste ėta, kad fenoliniams junginiams dažnai taikoma sistema, sudaryta iš acto rūgšties, skruzdžių rūgšties, vandens ir etilacetato. Paruošta plokštelė perkeliama į chromatografavimo kamer , kuri užpildoma eliuentų sistemos mišiniu, sudarytu iš skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, vandens ir etilacetato (3,75:3,75:8,75:33,75V/V/V/V). Tirpikliui pakilus 10 cm nuo mėginių užnešimo linijos (2 cm nuo plokštelės apačios), plokštelė ištraukiama ir apipurškiama 10 g/l 2-aminoetildifenilborinato tirpalu metanolyje. Tuomet plokštelė apipurkšta 50 g/l makrogolio 400 tirpalu metanolyje. Makrogolis naudojamas tam, kad sta ilizuotų šviesos emisij ir sustiprintų dėmių fluorescencij [15]. Džiovinama ant Camag kaitlentės 100-105 C temperatūroje 10 min.
Plokštelės atvėsinamos traukos spintoje, pernešamos į Camag vizualizacijos sistem ir apšviečiamos 366 nm angos ilgio UV šviesa, apšvitinta plokštelė nufotografuojama. WinCats
programinės įrangos pagalba nustatomos Rf reikšmės.
su WinCats programa, apdorojančia duomenis ei VideoScan programa, leidžianči atlikti kieky in chromatogramų analiz .
2.5.2 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu
metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometru, naudojant kolorimetrinį Folin-Ciocalteu metod .
Gaminamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas: ištirpinant 17,5 mg natrio karbonato 250 ml distiliuoto vandens.
Darbinio Folin-Ciocalteu reagento paruošimas: Folin Ciocalteu reagentas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu, santykiu 1:9.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: imamas 1 ml augalinės žaliavos etanolinio ekstrakto ir sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens. Po 5 min. įpilama 10 ml 7,5 proc. natrio kar onato tirpalo ir distiliuotu vandeniu praskiedžiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90 min. tamsioje vietoje, kam ario temperatūroje. Po inkubacinio laikotarpio spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija esant 750 nm bangos ilgiui. Matavimai kartojami 3 kartus.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas tomis pačiomis s lygomis kaip ir tiriamasis, tačiau vietoje amalo žaliavos ekstrakto yra pilamas 1 ml distiliuoto vandens.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml tiriamojo ekstrakto uvo pilami 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant galo rūgšties 70 proc. metanolinį tirpal paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5 mg/ml; 1,0 mg/ml 1,5 mg/ml 2,0 mg/ml ir 2,5 mg/ml. Išmatavus galo rūgšties žinomų koncentracijų tirpalų a sor cijos dydį, sudaryta kali racinė kreivė (6 pav.).
Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formul :
GRE = c xV/m, mg/g;
c - galo rūgšties koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml;
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kali racinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: y = 0,9068x + 0,0617;
𝑅2
= 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml
6 pav. Galo rūgšties kalibracinis grafikas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti
2.5.3 Antioksidantinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu
Tiriamųjų andinių antioksidantinis aktyvumas tirtas naudojant UV spektrofotometr ir CUPRAC reagent . CUPRAC metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į chromogeninį vienvalenčio vario ir neokuproino kompleks [1, 43]. CUPRAC reagento tirpalas buvo gautas sumaišius vario drusk (CuCl2x2H2O), neokuproin ((CH3)2 C12 H6N2)) ir
acetaninį uferį, kurio pH=7, santykiu 1:1:1. CUPRAC reagento sudėtis: 1,010-2 M vario (II) chlorido vandeninis tirpalas, 1,010-3 M amonio acetato buferinis tirpalas (pH=7), 7,5x10-3 M neokuproino etanolinis tirpalas. CuCl2 tirpalas buvo gaminamas atsvėrus 0,167 g CuCl2x2H2O
druskos, kuri uvo tirpinama išgrynintame vandenyje ir skiedžiama matavimo kol oje iki 100 ml. Amonio acetatinis uferis gaminamas atsvėrus 0,0169 g amonio acetato (NH4CH3CO2), tirpinamas vandenyje ir praskiedžiamas vandeniu matavimo kolboje iki 1000 ml. Neokuproino tirpalas buvo gaminamas tirpinant 0,1560 g neokuproino nedideliame kiekyje 96 proc. etanolio. Tuomet tirpalas dedamas į ultragarso vonel 5 min. ir po to matavimo kol oje skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100
ml. Į 3 ml kiuvet įpilama 3 ml sumaišyto reagento tirpalo ir automatinėmis pipetėmis įpilama 10 l tiriamojo ekstrakto mėginio. Paruošti mėginiai 1 valand laikomi tamsoje, kam ario temperatūros s lygomis. Spektrofotometru matuojama tiriamųjų mėginių šviesos a sor cija, esant 450 nm bangos ilgiui. Antioksidantinis aktyvumas CUPRAC metodu išreiškiamas pagal trolokso kali racin kreiv : y=0.3899x + 0.0908; R2=0.99; Trolokso kalibracinė kreivė pateikta paveiksle (7 pav.). Trolokso koncentracijos ribos (0,22 – 1,54 mg/ml).
Redukcinio aktyvumo ge a išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formul :
𝑇𝐸 𝐶𝑈𝑃𝑅𝐴𝐶 =CxV/m; mol/g
– trolokso koncentracija ( mol/ , nustatyta iš kalibracinės kreivės; – ekstrakto tūris ( ;
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g .
7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė CUPRAC metodui
2.6 Duomenų statistinis vertinimas
Tyrimų duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV) programa. Visi andymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė standartinis nuokrypis (SN). Apskaičiuotas tyrimo duomenų standartinis santykinis nuokrypis (SSN). Rezultatai įvertinti naudojant aprašomosios statistikos charakteristikas. Vidurkiai palyginti taikant Stjudento-t” kriterijų nepriklausomoms imtims. Duomenų analizei naudotas tiesinis regresijos modelis. Kiekvieno regresijos
modelio tinkamumui įvertinti uvo naudojamas determinacijos koeficientas R2 ir p-reikšmė (p), gauta tikrinant hipotez apie regresijos netiesiškum . Tarp nagrinėjamų kintamųjų uvo tiriamas tiesinio koreliacinio ryšio stiprumas, kurį įvertina Pirsono koreliacijos koeficientas (R). Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant vienfaktorin dispersin analiz (ANOVA). Rezultatai statistiškai reikšmingi jei p<0,05.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Fenolinių rūgščių kokybinis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodu Viscum album L. žolėje
Fenolinės rūgštys V. album L. žaliavoje sudaro didel dalį iologiškai aktyvių junginių [17]. Atlikus literatūros šaltinių analiz , pasirinktos analizuoti vienos dažniausiai nustatomų fenolinių rūgščių, kurios pagal anksčiau atliktus tyrimus buvo identifikuojamos amalo augalinėje žaliavoje [1, 17, 18, 24].
Pirmiausiai atliekamas kokybinis tyrimas su standartiniais tirpalais: 3,4-dihidro enzoinės rūgšties, trans-cinamono rūgšties, kavos, galo, ferulo, p-kumaro, vanilino rūgščių, kavos ir chlorogeno rūgščių mišinio, kaip atskirų komponenčių identifikavimui. Toliau analizė atliekama su paprastojo amalo ekstraktais. Amalo žaliava surinkta nuo skirtingų medžių ir vietovių 2017 metų alandį, išdžiovinta dviem skirtingais ūdais. Pagaminti etanoliniai žolės ekstraktai (n=16), (8 mėginiai džiovinant natūraliomis s lygomis, 8 mėginiai, džiovinant 60 C temperatūros krosnelėje), kurie lyginami su standartiniu tirpalu.
Taikant aprašyt plonasluoksnės chromatografijos metod fenolinių junginių nustatymui, Viscum album L. žolėje esančių junginių ištraukų analizė uvo atlikta tris kartus. Paveiksle 8 pateikiama visų tirtų Viscum album L. mėginių chromatograma. Pagal dėmių spalvas matomos fenolinės rūgštys (mėlynos dėmės) ir flavonoidai (geltonos dėmės). Remiantis literatūros šaltinių duomenimis, vieni iš dažniausiai nustatomų flavonoidų – kvercetinas, kemferolis, naringeninas [17, 18]. Tyrimo tikslas buvo nustatyti fenolines rūgštis amalo žaliavos ekstraktuose, todėl flavonoidai laikomi kaip neidentifikuoti junginiai. Visuose mėginiuose uvo nustatyta fenolinė rūgštis - chlorogeno rūgštis. Chlorogeno rūgšties standarto Rf (0,660). Ryškesnės dėmės chromatogramoje
matomos normaliomis s lygomis džiovintoje žaliavoje (1-8). Nustatytos Rf reikšmės varijuoja
0,663-0,681. Ėminiuose, džiovintuose natūraliai (1-8): 1 mėginyje, rinktame nuo Betula L., Vilijampolėje, Kaune – 0,6810,01, 2 mėginyje, rinktame nuo Betula L., A. Šančiuose, Kaune – 0,6690,02, 3 mėginyje, rinktame nuo Malus L., Kalniečiuose, Kaune - 0,6670,02, 4 mėginyje, rinktame nuo Populus L., A. Šančiuose, Kaune – 0,6750,02, 5 mėginyje, rinktame nuo Sorbus L. Kalniečiuose, Kaune – 0,6710,01, 6 mėginyje, nuo Malus L. Doškonyse, Alytaus raj. – 0,6670,03, 7 mėginyje, nuo Malus L., Išlauže, Prienų raj. – 0,6670,02, 8 mėginyje, nuo Salix L., Prienuose – 0,6690,03. Džiovintos 60 C temperatūroje (mėginiai nuo 1-60 iki 8-60) atitinkamai 0,6680,02; 0,6670,03; 0,6810,04; 0,6770,03; 0,6660,04; 0,6800,03, 0,6630,02; 0,6730,05.
8 pav. Visų tirtų Viscum album L. žolės etanolinių ekstraktų chromatograma (S-standartas chlorogeno rūgštis)
Dėl parazituojančio augalo savy ių kai kurias medžiagas gauti iš medžio ir fenolinių junginių buvimo priklausomai nuo vegetacijos ir augimo s lygų, ekstraktų paruošimo, sudėtis yra la ai kintanti ir plačiai varijuojanti [26]. Todėl rezultatus palyginti su kitų mokslininkų atliktais tyrimais yra gana sudėtinga. Palyginti Vokietijoje atliktos PC analizės duomenis nustatant V. album L. žaliavos, surinktos nuo 8 skirtingų medžių, fenolinių junginių profilį, su atlikto tyrimo duomenimis, galima pagal tris medžius: Malus, Populus, Salix L. Tyrimo tikslas buvo diferencijuoti fenolinius junginius pagal skirtingus medžius. Nors literatūros duomenimis viena iš dažniausiai aptinkamų fenolinių rūgščių yra kavos rūgštis, j pavyko identifikuoti tik V. album L. žaliavoje, rinktoje nuo Salix L. vasar . Ferulo rūgštis uvo identifikuota nuo Populus L. žiem , o galo ir vanilino rūgštys, kaip ir mūsų tyrime taip pat identifikuotos nebuvo. Chlorogeno rūgštis uvo nustatyta visuose mėginiuose: Malus L. vasar ir žiem , Populus L. vasar , o Salix L. vasar ir žiem rinktoje žaliavoje [47]. Nors mūsų tyrime ne uvo tiriama sudėtis esant skirtingoms vegetacijos fazėms, tačiau šie duomenys parodo, kad tai uvo viena dažniausiai ir eveik visuose tirtuose medžiuose nustatyta fenolinė rūgštis. Svarbu atsižvelgti į tai, kad skiriasi mėginių paruošimas, žaliavų rinkimo laikas, vietovė.
Apibendrinus kokybinio nustatymo rezultatus, atliktus EPC metodu, visuose tiriamuosiuose mėginiuose uvo identifikuota chlorogeno rūgštis, kitos rūgštys identifikuotos ne uvo. Tolimesni tyrimai atliekami kieky iškai vertinant chlorogeno rūgštį su tos pačios koncentracijos etanoliniais amalo ekstraktais.
3.2 Fenolinių rūgščių kiekybinis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodu Viscum album L. žolėje
3.2.1 Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas
Standartinio tirpalo kalibracinės kreivės sudarymas. Literatūros duomenimis, chlorogeno rūgštis pasižymi geromis antioksidantinėmis savy ės ir yra svar i priemonė prieš dia et ei širdies ir kraujagyslių ligas [2]. Dėl to yra svar us jos kiekinis įvertinimas V. album L. žaliavoje. Chlorogeno rūgšties kieky iniam įvertinimui, ei įvairavimo palyginimui skirtinguose paprastojo amalo mėginiuose, yra sudaroma chlorogeno rūgšties kali racinė kreivė. Kali racinės kreivės sudaromos iš atskirų standartinio tirpalų skiedimų, ant chromatografinių plokštelių užpurškiant skirtingos koncentracijos tirpalų.
EPC tyrimai su chlorogeno rūgšties tirpalais atliekami taip pat, kaip ir kokybiniam nustatymui. Sudaroma kali racinė kreivė iš 7 taškų. Standartinio tirpalo kali racinės kreivės sudarymui buvo naudojama chlorogeno rūgštis, kurios koncentracijų ri os 0,135-1,08 mg/ml. Sudaryta kalibracinė kreivė yra paremta šviesos a sor cijos smailės ploto priklausomy e nuo analizuojamo junginio koncentracijos (mg/ml) dėmėje. Gauti skirtingų chlorogeno rūgšties koncentracijų plotai buvo įvertinti naudojant vizualizatorių ir VideoScan program . Kali racinė kreivė pateikta 9 paveiksle.
9 pav. Chlorogeno rūgšties kalibracinė kreivė
Po chlorogeno rūgšties kali racinės kreivės sudarymo, chromatografuojami tiriamieji ekstraktai. Kieky iniai skaičiavimai atlikti pagal kali racinės kreivės sudaryt matematin lygtį: y=182581x + 2036,5. Iš čia Y – kreivės plotas, X – junginio koncentracija.
y = 182581x + 2036,5 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Kre iv ės p lot as Koncentracija (mg/ml)
Kiekybinis nustatymas. Kieky inė analizė atlikta su Viscum album L. žaliavos, džiovintos natūraliomis s lygomis, ekstraktais (1-8). Kitiems 8 ekstraktams, kuriuose žaliava uvo džiovinta 60 C temperatūroje, kieky inė analizė ne uvo taikyta, kadangi dėl neryškių dėmių chromatogramoje, ir kai kurių junginių persiklojimo su šalia esančiais neidentifikuotais junginiais, buvo sunku tiksliai įvertinti chlorogeno rūgštį kieky iškai. Dėl šių priežasčių uvo nuspr sta tokių ekstraktų kieky iškai nevertinti.
Pagal kali racinės kreivės sudaryt matematin lygtį atlikti kieky iniai skaičiavimai, suskaičiuojami jų kiekiai saus jam ekstraktui. Tyrimai kartojami tris kartus apskaičiuojant jų standartinį nuokrypį (SN) ir santykinį standartinį nuokrypį (SSN) procentais. Lentelėje pateikti chlorogeno rūgšties vidutiniai kiekiai skirtinguose amalo žolės mėginiuose (Nr.1-8) (4 lentelė). Grafiškai rezultatai pateikti (10 pav.).
Atlikus paprastojo amalo žolės ekstraktų (Nr.1-8) analiz efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, nustatyta, kad chlorogeno rūgšties kiekis V. album L. žolės etanoliniuose ekstraktuose varijuoja nuo 0,3190,016 mg/g (SSN=4,8 proc.) iki 1,0960,012 mg/g (SSN=1,09 proc.). Iš pateiktų rezultatų ir diagramos matyti, kad didžiausias kiekis (1,0960,012 mg/g) nustatytas žaliavoje, rinktoje nuo Malus L., Doškonyse, Alytaus raj. Mažiausias chlorogeno rūgšties vidutinis kiekis nustatytas amalo žolėje, rinktoje nuo Malus L., Kalniečiuose, Kaune (0,3180,016 mg/g, p0,05). Vidutinis chlorogeno rūgšties kiekis V. album L. žolės etanoliniuose ekstraktuose 0,620,005 mg/g. Remiantis gautais rezultatais, chlorogeno rūgšties kiekis neviršijo leistinos 5 proc. paklaidos.
4 lentelė. Chlorogeno rūgšties vidutinis kiekis (mg/g) V.album L. žaliavoje, džiovintoje natūraliomis sąlygomis Betula, Vilijampolė, Kaunas Betula, A.Šančiai, Kaunas Malus, Kalniečiai, Kaunas Populus, A.Šančiai, Kaunas Sorbus, Kalniečiai, Kaunas Malus, Doškonys, Alytaus raj. Malus, Išlaužas, Prienų raj. Salix, Prienai Chlorogeno rūgštis (mg/g) 0,541 0,520 0,319 0,423 0,777 1,096 0,748 0,532 SN (mg/g) 0,021 0,019 0,015 0,014 0,021 0,012 0,015 0,021 SSN (proc.) 3,830 3,710 4,811 3,291 2,650 1,090 1,973 3,990
Chlorogeno rūgšties kiekio kitimas 8 tirtuose paprastojo amalo žolės mėginiuose, iš skirtingų vietovių, pavaizduotas grafike (10 pav.).
10 pav. Chlorogeno rūgšties kiekiai V. album L. žolės ėminiuose mg g , rinktuose nuo skirtingų medžių ir vietovių
Išanalizavus literatūros šaltinius, nepavyko rasti duomenų apie V. album L. ekstraktų kieky inį įvertinim taikant EPC. Kiekybinei analizei dažniausiai pasirenkamas metodas - efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Įvairiuose literatūros šaltiniuose randami tyrimų duomenys la ai skiriasi. Vieno iš ESC atlikto tyrimo metu Luczkiewicz ir kt. (2001), nustatė, kad amalo, rinkto nuo Malus L. pagrindinis junginys buvo rozmarino rūgštis (17.48 mg proc.), o nuo Populus L. chlorogeno rūgštis (12.34 mg proc.). S. Vicas, Vicas, D. Rugina ir C. Socaciu atliktos analizės metu, kuomet buvo tirta Malus L. ir Populus L. chlorogeno rūgštis nustatyta ne uvo, o dominuojantis junginys uvo ferulo rūgštis (7,8 µg/g ir 11,52 µg/g).
Mokslinių tyrimų duomenimis, ekstraktų cheminė sudėtis priklauso ir nuo medžio rūšies, ir nuo augimo s lygų [2, 3, 4, 20]. Tokiu tikslu palyginama sudėtis ir tarp amalo, rinkto nuo tos paties medžio rūšies, šiuo atveju o els (11 pav.). Matyti, kad chlorogeno rūgšties kiekis tarp amalo, surinkto nuo o elų, et skirtingų vietovių ženkliai skiriasi ir svyruoja nuo 0,319 iki 1,096 mg/g. V. album L. ėminiuose nuo Malus L. chlorogeno rūgšties aptinkama tiek daugiausiai, tiek mažiausiai lyginant su visais tirtais mėginiais. Skirtumas tarp didžiausio kiekio Malus L., Doškonyse rinktos žaliavos ir tarp mažiausio Malus L. Kalniečiuose - 0,777 mg/g. Amale, surinktame nuo Malus L. Doškonių kaime, Alytaus rajone nustatytas chlorogeno rūgšties kiekis 3,44 karto didesnis nei Kalniečių mikrorajone, Kaune ir 1,46 karto didesnis nei Išlauže, Prienų raj.
11 pav. Chlorogeno rūgšties kiekio kitimas nuo obels rinktuose V. album L. mėginiuose
Atlikus duomenų statistinio patikimumo tyrimus, nustatyta, kad chlorogeno rūgšties kiekių skirtumai nuo o elų rinktoje žaliavoje reikšmingai skiriasi nuo visų tiriamųjų mėginių (p<0,05) Įvertinus rezultatus, daroma prielaida, jog chlorogeno rūgšties kiekio pokyčiams tarp tos pačios medžio rūšies įtakos galėjo turėti augaviet veikiantys veiksniai, tokie kaip temperatūra, drėgmės ir šviesos kiekis, tarša.
Pastaruoju metu skiriama daug dėmesio amalo fenolinių junginių profilio diferencijavimui pagal skirtingas medžio rūšis. Literatūroje pateiktų tyrimų metu vis dar nėra aiškių fenolinių junginių kitimo dėsningumų tarp Viscum album ssp. album L., todėl tikslinga palyginti tyrimo metu nustatytus chlorogeno rūgšties kiekius tarp skirtingų medžių rūšių.
Apskaičiavus amalo mėginių, rinktų nuo trijų Malus (0,7210,389 mg/g) bei dviejų nuo Betula (0,5310,016) medžių chlorogeno rūgšties kiekių vidurkį, uvo palygintos visos medžių rūšys, ant kurios augo paprastasis amalas. Matyti, kad didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas amalo, augančio ant medžių tokia tvarka: Sorbus aucuparia L.> Malus domestica L.> Salix alba L. > Betula pendula L. > Populus nigra L. (12 pav.). Nors pagal anksčiau pateiktus visų tiriamųjų mėginių rezultatus, didžiausias chlorogeno rūgšties vidutinis kiekis nustatytas nuo Malus L. surinktos amalo žaliavos, tačiau palyginus visų trijų nuo o els surinktų amalo etanolinių ekstraktų sudėtį, matomas platus rezultatų pasiskirstymas ir dėl to išvestas matematinis vidurkis gautas mažesnis nei Sorbus L.
12 pav. Chlorogeno rūgšties kiekis mg g V. album L. žaliavoje, rinktoje pagal skirtingas medžių rūšis
Api endrinus kiekinio nustatymo rezultatus, galima sakyti, kad kieky inį chlorogeno rūgšties įvertinim žaliavoje, džiovintoje 60 C, apsunkino nedidelės šios medžiagos koncentracijos ir dėl to esančios nepakankamai ryškios dėmės. Taip pat įtakos turėjo kai kuriuose mėginiuose matomas dėmių persiklojimas. Dėl to analizė uvo atlikta su žaliavos mėginiais, džiovintais natūraliomis s lygomis. Palyginus visus tirtus mėginius, didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas nuo Malus L, Doškonyse rinktos paprastojo amalo žaliavos (1,0960,012 mg/g). Mažiausias - nuo Malus L., Kalniečiuose, Kaune (0,3180,016 mg/g). Tarpusavyje palyginus chlorogeno rūgšties kiekį pagal medžius, didžiausias kiekis gautas nuo Sorbus L. rinktoje amalo žaliavoje.
3.3 Suminio fenolinių junginių kiekio kitimo dinamikos nustatymas
Viscum album L. žolėje
Tyrimo metu įvertintas V. album L. žaliavų, rinktų nuo įvairių medžių ir augaviečių, ei džiovintų dviem skirtingais ūdais, fenolinių junginių kiekis. Atliktos analizės rezultatai gali ūti naudingi vertinant fenolinių junginių kieky inių rodiklių kitimo dėsningumus paprastojo amalo žolėje priklausomai nuo medžio ir augavietės, o taip pat ir nustatant džiovinimo įtak žaliavos koky ei.
Suminio fenolinių junginių kiekio kintamumas įvairiose augavietėse rinktuose mėginiuose sudarė nuo 13,23 0,18 mg/g, (SSN=1,33 proc.) iki 18,29 0,33 mg/g, (SSN=1,82 proc.) (13 pav.). Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Doškonių kaime, Alytaus rajone nuo o els – Malus L. rinktame ir kam ario temperatūroje džiovintos žaliavos mėginyje 18,29 0,33 mg/g (Nr.6). Kiek mažesni kiekiai rasti Kalniečių mikrorajone nuo Sorbus L. rinktų ir natūraliomis s lygomis džiovintų
