FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
SILVIJA KEDYTĖ
FENOLKARBOKSIRŪGŠČIŲ IR FLAVONOIDŲ ĮVAIRAVIMO
BALTAŽIEDŽIŲ NOTRELIŲ (LAMIUM ALBUM L.) ŽOLĖJE
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
dr. Raimondas Raudonis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, parašas
Data
FENOLKARBOKSIRŪGŠČIŲ IR FLAVONOIDŲ ĮVAIRAVIMO
BALTAŽIEDŽIŲ NOTRELIŲ (LAMIUM ALBUM L.) ŽOLĖJE
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas
KAUNAS, 2017
Darbo vadovas
dr. Raimonas Raudonis, parašas
Data
Darbą atliko
Magistrantė
Silvija Kedytė, parašas
Data
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Notrelių genties apibūdinimas, morfologija, panaudojimas, fitocheminė sudėtis ... 10
1.2. Baltažiedžių notrelių apibūdinimas, paplitimas ir žydėjimo ypatumai ... 12
1.3. Baltažiedžių notrelių morfologinis apibūdinimas ... 13
1.4. Baltažiedžių notrelių vaistinių augalinių žaliavų fitocheminė sudėtis ... 14
1.5. Baltažiedžių notrelių žaliavų preparatų farmakologinis poveikis ... 16
1.6. Fenolinių rūgščių ir flavonoidų analizės metodai ... 18
1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Baltažiedžių notrelių žolės analizei naudoti reagentai ... 21
2.3. Baltažiedžių notrelių žolės analizei naudota aparatūra ... 22
2.4. Baltažiedžių notrelių žolės ekstraktų ruošimo metodika ... 22
2.5. Suminės fenolkarboksirūgščių koncentracijos nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 22
2.6. Suminės flavonoidų koncentracijos nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 23
2.7. Fenolinių junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 24
2.8. Duomenų statistinis vertinimas ... 25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1. Baltažiedžių notrelių žolės ekstrakcijos sąlygų nustatymas - ekstrahento koncentracijos parinkimas ... 26
3.2. Baltažiedžių notrelių žolės ekstrakcijos sąlygų nustatymas – ekstrakcijos trukmės nustatymas . 27 3.3. Fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracijų įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje vegetacijos periodo metu ... 28
3.4. Fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracijų įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje iš įvairių Lietuvos regionų ... 30
3.4.1. Suminės fenolkarboksirūgščių koncentracijos įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje iš įvairių Lietuvos regionų ... 30
3.4.2. Bendros flavonoidų koncentracijos įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje iš įvairių
Lietuvos regionų ... 31
3.5. Baltažiedžių notrelių žolės analizė ESC metodu ... 34
3.5.1. Chlorogeno rūgšties ir rutino koncentracijų įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje vegetacijos periodo eigoje ... 35
3.5.2. Chlorogeno rūgšties ir rutino koncentracijų įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje, rinktoje iš įvairių Lietuvos regionų ... 37
3.6. Rezultatų apibendrinimas ... 39 4. IŠVADOS ... 41 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43 PRIEDAI ... 49
SANTRAUKA
S. Kedytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas: dr. Raimondas Raudonis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų įvairavimo baltažiedžių notrelių (Lamium
album L.) žolėje tyrimas.
Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimo objektas – baltažiedžių notrelių žolė rinkta vegetacijos periodo metu ir skirtinguose Lietuvos regionuose. Suminė fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracija baltažiedžių notrelių žolėje nustatyta UV spektrofotometriniu metodu, individualios fenolinės rūgštys ir flavonoidai nustatyti ESC metodu.
Darbo tikslas: Nustatyti fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų įvairavimą baltažiedžių notrelių žolėje.
Darbo uždaviniai: Nustatyti baltažiedžių notrelių žolės suminį fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų, bei identifikuotų junginių koncentracijos įvairavimą augalo vegetacijos periodo eigoje ir keturiolikoje Lietuvos vietovių rinktoje žolėje. Atlikti spektrofotometriniu ir ESC metodais gautų rezultatų koreliacinę analizę.
Rezultatai ir išvados: Baltažiedžių notrelių žolėje esančių junginių kiekis kinta augalo vegetacijos periodo metu. Daugiausiai fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų spektrofotometriniu metodu nustatyta augalo masinio žydėjimo metu rinktoje žolėje, atitinkamai 103,88 ± 3,11 mg CAE/g ir 29,55 ± 0,45 mg RE/g. Tuo pačiu metodu nustatyta, fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracija baltažiedžių notrelių žolėje rinktoje iš skirtingų Lietuvos regionų buvo labai įvairi, tačiau pastebėta, kad flavonoidų koncentracija svyravo mažiau. ESC metodu identifikuoti junginiai: chlorogeno rūgštis ir rutinas. Abiejų junginių didžiausios koncentracijos nustatytos baltažiedžių notrelių masinio žydėjimo metu rinktoje žolėje. Rutino koncentracija baltažiedžių notrelių žolėje rinktoje iš įvairių Lietuvos vietų svyravo labiau nei chlorogeno rūgšties koncentracija. Nustatytas labai stiprus koreliacijos ryšys tarp suminės flavonoidų koncentracijos ir rutino koncentracijos įvairavimo baltažiedžių notrelių vegetacijos periodo metu (rs=0,952, p < 0,01).
SUMMARY
Title: Study of phenol carboxylic acids and flavonoids variation in white dead-nettle (Lamium
album L.) herb.
Object and methods: Object – herb of white dead-nettle collected during vegetation period and from various regions of Lithuania. Total amount of phenol carboxylic acid and flavonoids were evaluated using UV spectrophotometry, individual phenolic acids and flavonoids were identified and evaluated using HPLC.
Aim: To evaluate the variability of phenol carboxylic acids and flavonoids in white dead-nettle herbs.
Objective: To determine white dead-nettle herbs qualitative and quantitative properties. To assess the variations of chemical compounds using spectrophotometry and HPLC in the white dead-nettle herbs during the vegetation stages and in herbs collected from different regions of Lithuania. Compare the results by correlative analysis.
Results and conclusions: In this study it was found that the amount of chemical compounds which comprises the white dead-nettle herb variates through out the stages of vegetation. The peak amount of phenol carboxylic acid and flavonoids were found in the massive flowering period. Respectively 103,88 ± 3,11 mg CAE/g and 29,55 ± 0,45 mg RE/g. Amount of phenol carboxylic acid and flavonoids variated in different regions, although flavonoid concentration changed less than carboxylic acid concentration. Chlorogenic acid and rutin was identify by using HPLC method. Both of the chemicals reached their peak concentration in the massive flowering period. Changes in rutin concentration were higher than it was observed in chlorogenic acid concentration in different regions of Lithuania. Also a strong statistical significant correlation (rs=0,952, p < 0,01) between common
SANTRUMPOS
CAE – chlorogeno rūgšties ekvivalentai DAD – diodų matricos detektorius
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija GAE – galo rūgšties ekvivalentai
KE – kvercetino ekvivalentai MS – masių spektrometrija p – reikšmingumo lygmuo RE – rutino ekvivalentai
rs – Spirmeno koreliacijos koeficientas SP – standartinė paklaida
UV - ultravioletinė spinduliuotė
ĮVADAS
Baltažiedė notrelė (Lamium album L.) daugiametis žolinis augalas priklausantis notrelinių (Lamiaceae Lindl) šeimai. Jis naudojamas liaudies medicinoje kaip kraują stiprinanti, priešspazminė, priešuždegiminė priemonė, menoragijos, gimdos kraujavimų, makšties ir gimdos uždegimų, leukorėjos gydymui [51]. Prancūzų liaudies medicinoje ji naudojama kaip diuretinė, inkstų funkciją gerinanti priemonė [66].
Atlikti moksliniai tyrimai nustatė baltažiedžių notrelių preparatų platų biologinį poveikį: įvairūs augalinės žaliavos ekstraktai pasižymi priešvirusiniu [65, 74], antimikrobiniu, priešgrybeliniu [43], antioksidantiniu [66], citoprotekciniu [53], priešvėžiniu [34, 65], priešuždegiminiu [66] ir psichosedaciniu [43] poveikiais. Neseniai nustatyta, kad baltažiedė notrelė pasižymi cholesterolio kiekį kraujyje mažinančiu poveikiu [57]. Visus šiuos efektus lemia didelė biologiškai aktyvių junginių įvairovė: flavonoidai, iridoidai, fenolinės rūgštys, polisacharidai, triterpenai, saponinai, fitoekdosteroliai, aminai ir eteriniai aliejai [51].
Šiuo metu labiausiai tyrinėjama biologiškai aktyvių medžiagų grupė yra polifenoliniai junginiai. Jie pasižymi įvairiomis farmakologinėmis savybėmis, tokiomis kaip antioksidantinis, imunostimuliacinis ar priešvėžinis veikimas [2]. Atlikti tyrimai nustatė, jog baltažiedžių notrelių augalinių žaliavų antioksidantinį poveikį žmogaus organizme lemia fenoliniams junginiams priklausančios fenolinės rūgštys ir flavonoidai. Šie junginiai redukuoja laisvuosius radikalus ir mažina žalingą jų poveikį [38], galintį sukelti kardiovaskulines, neurodegeneracines ligas, kai kurias uždegimines ligas, vėžį, diabetą ar autoimuninius sutrikimus [24].
Fenolinių rūgščių ir flavonoidų koncentracija bei įvairovė skiriasi tarp Portugalijoje [54], Bulgarijoje [71] ir Lenkijoje [51] rinktų baltažiedžių notrelių žaliavų. Norint gauti kokybišką augalinę žaliavą, pasižyminčią maksimaliu biologiniu poveikiu tikslinga ištirti kokia yra fenolinių rūgščių ir flavonoidų kokybinė ir kiekybinė sudėtis Lietuvos klimate augančių baltažiedžių notrelių žolėje vegetacijos periodo metu, bei žaliavoje, rinktoje skirtinguose Lietuvos regionuose. Fenolines rūgštis ir flavonoidus galima įvertinti taikant paprastus, greitus, plačiai ištyrinėtus fenolinių junginių analizės metodus – ultravioletinės spinduliuotės (UV) spekrofotometriją ir efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC) [41].
Nors baltažiedės notrelės labai paplitusios Lietuvoje, tyrimų apie jos žolės kokybinę ir kiekybinę sudėtį atlikta nėra. Pirmą kartą bus nustatinėjama flavonoidų ir fenolkarboksirūgščių kokybinė ir kiekybinė sudėtis Lietuvos klimato sąlygomis rinktoje baltažiedžių notrelių žolėje.
Atlikto tyrimo tikslas – nustatyti fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų įvairavimą baltažiedžių notrelių žolėje.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų įvairavimą baltažiedžių notrelių žolėje.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracijų įvairavimą baltažiedžių notrelių žolėje, augalo vegetacijos periodo metu;
2. Nustatyti baltažiedžių notrelių žolės, rinktos skirtinguose Lietuvos regionuose, fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracijų įvairavimus;
3. Įvertint baltažiedžių notrelių žolės kokybinę fenolinių rūgščių ir flavonoidų sudėtį ir nustatyti joje identifikuotų konkrečių junginių koncentracijų įvairavimą augalo vegetacijos periodo eigoje.
4. Nustatyti baltažiedžių notrelių žolėje, rinktoje skirtinguose Lietuvos regionuose, identifikuotų konkrečių junginių koncentracijų įvairavimą.
5. Atlikti spektrofotometriniu ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais gautų rezultatų koreliacinę analizę.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Notrelių genties apibūdinimas, morfologija, panaudojimas, fitocheminė
sudėtis
Notrelių (Lamium) gentį sudaro beveik 40 rūšių, kurios natūraliai auga Europoje, Azijoje, bei Šiaurės Afrikoje [36]. Nors šios genties augalai toleruoja įvairų šviesos kiekį bei gali prisitaikyti prie įvairų drėgmės sąlygų, jiems palankesnės pavėsingos ir drėgnos augavietės. Natūraliai notrelių genčiai priklausantys augalai dažniausiai auga lengvai uolėtuose šlaituose ar pamiškėse [58].
Notrelių genčiai priklausantys augalai gali būti ir daugiamečiai, ir vienmečiai. Genčiai būdingi lancetiški, elipsiški, inkstiški ar ovalūs lapai su dantytais ar karbuotais kraštais. Lapai priešiniai, apatiniai būna daug ilgesni, kylant į stiebo viršų mažėjantys [36, 58]. Žiedai išsidėstę tankiuose, vienas nuo kito nutolusiuose menturiuose po 2-12 žiedų [36], būdinga vamzdiška ar varpelio formos penkiadantė taurelė, kuri išorėje gali būti apaugusi plaukeliais [36,58]. Taurelės dantys gali būti lygūs arba skirtingi [36,58]. Vainikėlio spalvos įvairuoja nuo purpurinės, rausvai violetinės ar rožinės iki kreminės, gelsvos arba kartais baltos. Vainikėlis dvilūpis, išorėje gali būti apaugęs plaukeliais. Viršutinė lūpa stačia, pailga, suapvalintu kraštu, ar šiek tiek įpjauta ties viršūne, ji uždengia apatinę lūpą. Apatinė lūpa gali būti triskiltė arba dviskiltė. Triskiltės lūpos vidurinė skiltis širdies formos, nusmailėjanti ties pagrindu arba plačiai ovali, taip pat su susiaurėjusiu galu žiedo pagrinde, gali būti įpjauta ties viršūne. Dviskiltės lūpos skilčių kraštai suapvalinti, dantyti arba karbuoti [36, 58]. Artėjant prie lapo ašies lūpos susijungia į vientisą tūbelę [36].
Geriausiai žinomos ir ištyrinėtos šios genties rūšys – baltažiedė notrelė (Lamium album L.), dėmėtoji notrelė (Lamium maculatum L.) bei raudonžiedė notrelė (Lamium purpureaum L.). Notrelių genčiai priklausančių augalų preparaitai daugiausiai yra naudojami liaudies medicinoje - traumų, lūžių, paralyžiaus, hipertenzijos, hipermenoragijos ir gimdos kraujavimo gydymui [36].
Atliekant mokslinius tyrimus, buvo nustatyti įvairūs šių augalų žaliavų biologiniai poveikiai. Nustatyta, kad baltažiedžių notrelių preparatai pasižymi antioksidantiniu, laisvuosius radikalus surišančiu, antiproliferaciniu poveikiais [35, 66]. Dėmėtosios notrelės preparatai, paplitę kinų liaudies medicinoje, kaip traumas, lūžius, paralyžių ar hipertenziją gydančios priemonės [62]. Jos, kaip ir raudonžiedės notrelės preparatai, pasižymi antioksidantiniu [66], laisvuosius radikalus surišančiu [35, 66], priešuždegiminiu [37] ir priešmikrobiniu [35] aktyvumu.
Fitocheminė notrelių genties sudėtis tyrinėjama nuo 1967 metų [36]. Iridoidai vieni svarbiausių šios genties kaupiamų biologiškai aktyvių junginių. Jie žinomi kaip genties taksonominiai markeriai. Kai kurie iridoidai yra specifiški konkrečiai rūšiai, pavyzdžiui - karioptozidas nustatytas tik baltažiedėse notrelėse [4].
Pirmieji šioje genties augalų žaliavose nustatyti iridoidai buvo lamiolis ir lamiozidas. Šiuo metu yra išskirta ir identifikuota daugiau kaip 20 iridoidų iš skirtingų notrelių genties rūšių. Labiausiai genčiai būdingi C10 ir C9 iridoidai. C10 iridoidus sudaro ciklopentano pirano žiedai, kurių C-11
padėtyje paprastai yra -COOR ar -CH3 liekanos [4]. Vienintelis nustatyta iridoidas su C-11 padėtyje esančia –COOH liekana buvo deacetilasperulozido rūgštis [6]. Tarp C-7 ir C-8 anglies atomų paprastai yra dviguba jungtis, tačiau kartais šioje vietoje gali susidaryti epoksidas kaip sezamozide. Nustatytas vienas atvejis, kai iridoidas buvo esterifikuotas C-6 padėtyje [28]. Notrelių genčiai priklausančiose rūšyse identifikuotuose iridoiduose β-hidroksilacija nustatyta C-5, 6, 7, 8 atomams, α-C-7 hidroksilo funkcinę grupę turi tik lamiido α-epimeras – lameriozidas [3]. Notrelių gentyje išskirti du C9 iridoidai -
harpaginas ir 8-O-acetilharpaginas [6]. Beveik visi šios genties augalų žaliavose nustatyti iridoidai yra monoglikozidiniai junginiai su β-gliukopiranoze sujungti per C-1 anglies poziciją. Eriobiozidas pirmas iridoidas su dviem glikozidais nustatytas notrelių genties augalų žaliavose [34].
Vieninteliai išskirti sekoiridoidai notrelių genties augalų žaliavose yra sekoiridoidų glikozidai albozidai A ir B [19].
Visi feniletanoidų glikozidai, kurie yra iškirti iš notrelių genties augalų žaliavų yra diglikozidiniai arba triglikozidiniai junginiai. Taip pat išskirti feniletanoidų glikozidai: verbaskozidas, lamalbozidas, cis-acetozidas, lamiuzidai A-E [6, 21, 33, 62].
Notrelių genčiai priklausančių rūšių žaliavose aptikta keletas monomerinių ir dimerinių fenilpropanoidų. Didžiąją dalį sudaro monomeriniai fenilpropanoidai - salidrosidas, chlorogeno rūgštis [6,13].
Taip pat čia nustatyti septyni flavonoidų glikozidai: kempferolio-3-O-gliukozidas, rutozidas, 3'-O-metilkvercerino-3-rutinozidas, kvercetino-3-O-gliukozidas, trans-tilirozidas, cis-tilirozidas,
kvercitrozidas ir flavonolis 3,7-dimetoksikvercetinas [13, 21, 62].
Aštuoni antocianinai buvo nustatyti notrelių genties augalų žieduose. Penki iš jų buvo cianidino dariniai – cianidin-3-gliukozidas, cianidin-3,5-digliukozidas, cianidin–3-(6''-p-kumaroilgliukozidas)-5-(6'''-malonilgliukozidas), cianidin–3-(6''-malonilgliukozidas)–5-(6'''-malonilgliukozidas), cianidin-3-(6''-p-kumaroilgliukozidas)-5-gliukozidas ir trys peonidino glikozidai: peonidin-3,5-digliukozidas, peonidin-3,5-monomalonildigliukozidas, peonidin-3-(6''-malonylgliukozidas)-5-gliukozidas. Antocianinai su malonilo radikalu sujungtu su gliukoze penktoje padėtyje yra unikalūs notrelinių (Lamiaceae) šeimai priklausantiems augalams [59].
Fitoekdisteroidai – tai vabzdžių hormonų analogai išskiriami kai kurių augalų, kad apsisaugtų nuo fitofagų vabzdžių. Buvo nustatyti šeši ekdosteroidai notrelių genties augalų žaliavose: 20-hidroksiekdizonas, polipodinas B, abutasteronas, inokosteronas, pterosteronas, 24-epi-pterosteronas [6, 21, 60, 62]. Taip pat notrelių genties augalų žaliavose nustatyti steroliai, tokie kaip β-sitosterolis, daukosterolis ir stigmasterolis [21].
Lamium gentyje nustatyti azoto turinčios junginių grupės benzoksazinoidai ir betainai. Taip pat pavieniai azoto turintys junginiai alantoinas ir uridinas [21].
Benzoksazinoidai – tai arilhidroksaminės rūgšties dariniai. Jie svarbūs augalų apsaugai nuo bakterijų, grybų ar vabzdžių. Lamium gentyje nustatyti penki benzoksazinoidai: blefarinas, 2-O-β-D-Gliukopiranosil-(4)-hidroksi-2H-1,4-benzoksazin-2(4H)-onas, 2-O-β-D-Gliukopiranosil-(6)-hidroksi-2H-1,4-benzoksazin-2(4H)-onas, 2-O-β-D-Gliukopiranosil-(7)-hidroksi-2H-1,4-benzoksazin-2(4H)-onas ir 4-hidroksi-2H-1,4-benzoksazon-3(4H)-2-O-β-D-Gliukopiranosil-(7)-hidroksi-2H-1,4-benzoksazin-2(4H)-onas [6].
Betainai – tai natūralūs junginiai, kurie lemia osmosinio streso atsparumą įvairiuose organizmuose: bakterijose, dumbliuose, žinduoliuose ir augaluose [73]. Nustatyti betainai – du pipekolio rūgšties dariniai: pipekolio rūgšties betainas ir trans-4-Hidroksipipekolio rūgšties betainas ir du prolino betainai: prolino betainas ir trans-4-hidroksiprolino betainas taip pat nustatytas betainas trigonelinas [44]
Eterinių aliejų kiekis, gaunamas iš šviežių notrelių gentiesaugalų žiedų varijuoja tarp 0,01 proc. ir 0,31 proc. Nustatytas kokybinis ir kiekybinis skirtumas tarp eterinių aliejaus sudėties notrelių genties augaluose, rinktuose iš skirtingų vietų [3]. Genties augalų eterinių aliejų sudėtyje vyrauja germakrenas, trans-chrisantenilacetatas, 1, 8-cineolis [29].
1.2. Baltažiedžių notrelių apibūdinimas, paplitimas ir žydėjimo ypatumai
Baltažiedė notrelė – tai daugiametis, sinantropinis, entomofilinis žolinis augalas priklausantis notrelinių (Lamiaceae Lindl) arba kitaip lūpažiedžių (Labiatae Juss) šeimai (1 pav) [1, 22, 64]. Augalas plačiai paplitęs Europoje (išskyrus šiaurines sritis) ir Azijoje (Kaukazas, Vakarų ir Rytų Sibiras, Tolimieji Rytai, Mažoji ir Vidutinė Azija, Iranas, Indija, Mongolija, Kinija, Japonija) Baltažiedė notrelė dažniausiai aptinkama uolėtose vietose, pakelėse, patvoriuose, miško proskynose ar brūzgynuose [1, 64].
Vidutiniškai baltažiedės notrelės žydi nuo ankstyvo pavasario balandžio, kartais gegužės mėnesio iki rudens spalio ar lapkričio mėnesių su trumpa pertrauka nuo birželio pabaigos iki liepos pabaigos [22, 36, 64]. Žydėjimo pertrauką gali lemti sumažėjęs apdulkintojų skaičius, padaugėjus kitų augalų konkurencijai [23]. Žydėjimo pradžios ir pabaigos fazės labai trumpos – trunka keturias ar penkias dienas. Dažniausiai baltažiedės notrelės pražysta ryte [22].
Pavasarį vidutiniškai daugiau kaip 80 proc. žiedų išsiskleidžia ryte nuo devintos valandos ryto. Dienos metu šis procesas sulėtėja ir nuo 10 valandos ryto iki 16 valandos vakaro didėjimas siekia vos 0,7 - 6 proc. bendro žiedų atsivėrimo. Rudenį žiedai atsiveria vėliau. Anot B. Denisow (2008) šis procesas greičiausiai priklauso nuo dienos ilgio ir apdulkintojų aktyvumo suintensyvėjimo laiko [22].
1 pav. Baltažiedė notrelė (Lamium album L.)
1.3. Baltažiedžių notrelių morfologinis apibūdinimas
Baltažiedė notrelė 50 – 100 cm daugiametis žolinis augalas. Stiebas žalias status, keturbriaunis, tuščiaviduris, apaugęs minkštais plaukeliais. Lapai tamsiai žali, priešiniai, kiaušiniški, nusmailėjusiomis viršūnėmis su širdiškais apvaliais pagrindais, stambiai dantytais kraštais, apaugę minkštais plaukeliais. Lapų dydis įvairus (vidutininkai 3 – 8 cm ilgio 1,5 – 5 cm pločio), apatiniai lapai didesni, viršutiniai mažesni, apatiniai lapai ilgakočiai, viršutiniai – bekočiai [64].
Žiedai kremiškai balti ar balti, dvilūpiai. Išsidėstę menturiuose po 5 - 22 žiedus, vienas augalas gali turėti nuo 16-119 žiedų, vidutiniškai apie 56 žiedus.
Žiedą sudaro varpelio formos 8 - 12 mm ilgio žalia taurelė su 5 ilgais danteliais, apsupančiais vainikėlį. Vainikėlis dvilūpis apie 6,8 - 8,6 mm ilgio ir 2,6 - 3,1 mm pločio, jis praplatėja ir išsilenkia ties pagrindu. Į šalmą panašios viršutinės lūpos paviršius ir kampai padengti 200 - 565 μm trichomomis. Viršutinė lūpa apsaugo purką ir žiedadulkes atpalaiduojančią dulkinę. Apatinė lūpa sudaryta iš trijų skilčių. Didžiausia centrinė skiltis ant savo paviršiaus turi simetriškai išsidėsčiusius geltonai - žalius taškus. Apatinės lūpos šoninės skiltys turi ilgus dantelius. Viršutinės lūpos apatinis paviršius skleidžia eterinių aliejų kvapą, kuris sklinda iš liaukinių trichomų ir kai kurių epidermio ląstelių [22, 64].
Vainikėlio viduje, ant apatinės lūpos, 3 - 5 mm virš nektarinės išsidėsčiusios gyvybingos, šiek tiek suplokštėjusios, nusmailėjusiu galu nuo 283,1 μm iki 428,5 μm ilgio trichomos. Kitokios trichomos yra ant vainikėlio vamzdelio, esančio prie stiebo. Jos yra kūginės formos ir skleidžia eterinių aliejų kvapą [64].
Baltažiedžių notrelių kuokelyną sudaro 4 kuokeliai: 2 su ilgesniais koteliais, 2 su trumpesniais koteliais. Ilgesnių ir trumpesnių kuokelių kotelių ilgiai atitinkamai 8,4 - 12,8 mm ir 5,8 - 7,0 mm. Visų kuokelių dulkinių ilgiai panašūs: 1,5 - 1,9 mm ilgesnių kuokelių ir 1,6 - 1,8 mm trumpesnių kuokelių.
Kuokeliai, kaip ir vainikėlio žiedlapiai skleidžia eterinių aliejų kvapą. Jį skleidžia liaukinės trichomos, esančios ant dulkinės paviršiaus. Nustatyta vidutinė šviežiai pasvertų 100 dulkinių masė - 76,6 mg [64].
Baltažiedžių notrelių žiedadulkių dydis įvairuoja nuo 24,2 iki 25,8 μm [64]. Nustatyta, kad šio augalo dulkinės pagamina nuo 3,5 mg iki 7,15 mg žiedadulkių per 100 dulkinių [22].
Baltažiedžių notrelių mezginė yra viršutinė ir žalia, sudaryta iš keturių dalių. Žiedo apatinėje dalyje prie mezginės yra nektarinė. Nustatyta, kad nektarinės dar kurį laiką išskiria nektarą po vainikėlių nukritimo. Nektarinė lengvai kreminės ar geltonos spalvos, jos forma primena netaisyklingą diską, vietomis apgaubiantį mezginę. Nektarinės aukštis prieš aukščiausio taško siekia 513 μm. Nektarinės epidermio ląstelės forma netaisyklinga, o jų išorinė siena padengta lygia kutikule [64].
Baltažiedžių notrelių žiedų nektaras aromatingas ir gausus cukraus. Nustatytas vidutinis cukraus kiekis nektare siekia 43 proc. Nektarą nuo lietaus apsaugo trichomos esančios vainikėlio gerklėje. [64].
Baltažiedžių notrelių vaisiai yra pailgi kiaušiniški, beveik tribriauniai, tamsiai pilki, matininiai riešutėliai: 2,6 - 4,0 mm ilgio, 1,2 - 2,0 mm pločio. Vienas augalas gali išauginti iki 150 sėklų [22,64].
1.4. Baltažiedžių notrelių vaistinių augalinių žaliavų fitocheminė sudėtis
Notrelinių šeimai priklausančiose vaistinių augalų žaliavose nustatytos įvairios biologiškai aktyvios medžiagos: fenilpropanoidai, flavonoidai, antocianai, fitoekdisteroidai, betainai, terpenai ir eteriniai aliejai [11, 36]. Dauguma šių junginių kaupia ir baltažiedžių notrelių augalinės žaliavos. Biologiškai aktyvių medžiagų įvairovė, baltažiedžių notrelių vaistinėse augalinėse žaliavose, lemia jų platų terapinį panaudojimą [38].
Iridoidai. Tai monoterpeniniai junginiai, dažnai aptinkami notrelių genčiai priklausančių augalų žaliavose [11, 38]. Baltažiedžių notrelių žolėje nustatyta apie 2 proc. iridoidų [50]. Paprastai jie aptinkami kaip glikozidai [38]. Pagrindinis baltažiedžių notrelių žolės kaupiamas iridoidas - lamiridozidas [27]. Kiti išskirti iridoidai lamiridozido izomerai A ir B, barlerinas, lamiolis [5, 38, 74] bei karioptozidas. Nustatyti ir keli sekoiridoidai - albozidas A ir albozidas B [19].
Fenoliniai junginiai . Baltažiedžių notrelių žolė ir žiedai kaupia įvairius fenolinius junginius. Nustatytas jų kiekis ir įvairovė skiriasi priklausomai nuo to, koks ekstrahentas naudotas ekstrakcijos metu, bei kokiomis sąlygomis augintos baltažiedės notrelės. In vitro sąlygomis augusių baltažiedžių notrelių žolėje nustatyta mažesnė fenolinių junginių įvairovė bei kiekis nei in vivo sąlygomis augusių augalų žolėje. [71]. Baltažiedžių notrelių žolės ekstraktuose nustatyti tokie fenoliniai junginiai:
feniletanoidiniai glikozidai. Daugiausiai nustatyta verbaskozido ir izoverbaskozido, aptiktas unikalus, dar niekur kitur neidentifikuotas junginys lamalbozidas [51], taip pat nustatytas lamiuzidas A [13].
flavonoidai. Baltažiedžių notrelių žolė kaupia apie 0,52 proc. flavonoidų. Daugiausia nustatyta kvercetino ir kempferolio glikozidų [50]. Įvairiuose ekstraktuose nustatyti flavonoidų aglikonai kvercetinas, miricetinas, hesperitinas [51, 55, 70, 71]. Bei flavonoidų glikozidinės fomos – rutinas, tilirozido glikozidinės formos, izokvercetinas, kempferolio-3-O-glikozidas [13, 51], luteolino-7-O-glikozidas, apigenino-luteolino-7-O-glikozidas, apigenino-7-O-rutinosidas, naringenino-7-O-rutinozidas [54].
fenolinės rūgštys. Baltažiedžių notrelių žolėje nustatyta daugiau kaip 3,4 proc. fenolinių rūgščių [50]. Nustatytos protokatecho, chlorogeno, vanilino, kavos, p-kumaro, ferulo, sinapo, rozmarino, galo, 2-hidroksibenzolo, siringo, cinamono rūgštys [51, 55, 70, 71].
Fitoekdisteroidai. Jaunesni baltažiedžių notrelių lapai kaupia šių junginių žymiai mažiau, todėl manoma, kad jie yra labiau pažeidžiami. Baltažiedėje notrelėje nustatyti ekdisteroidai: abutasteronas, inokosteronas, polipodinas B ir pterosteronas [60].
Eteriniai aliejai. Baltažiedžių notrelių žaliavose nustatyta daugiau kaip 0,46 proc. eterinių aliejų [50]. Lapuose nustatytas germakrenas D, β-kariofilenas E. Ištyrus baltažiedžių notrelių žiedų eterinio aliejaus sudėtį, buvo nustatyti 43 komponentai, kurie sudarė 90,7 proc. visos sudėties.
Pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai 6,10,1trimetil-2-pentadekanonas (10,2 proc.) ir 4-hidroksi-4-metill-2-pentanonas (9,1 proc.). Eterinio aliejaus sudėtis augalinėse žaliavose, tirtose tais pačias metodais, gali skirtis priklausomai nuo pačio augalo rinkimo laiko, jo tirtų augalinių žaliavų (lapai, stiebai, žolė), amžiaus, vegetacijos fazės, bei išorinių veiksnių, tokių kaip: dirvožemio sudėtis, klimato sąlygos, žaliavos džiovinimo sąlygos [47].
Terpenai. Baltažiedžių notrelių žolėje nustatytas hemiterpeno glikozidas – hemialbozidas [18], bei triterpeninai ursolinė rūgštis, oleanolinė rūgštis ir β-amirinas [51, 72].
Megastigmenai. Taip pat baltažiedžių notrelių žolėje nustatyta nauja megastigmenų glikozidų klasė bei išskirtas ir charakterizuotas 9-O-β-D-gliukopiranosiloksi-5-megastigmeno-4-onas [36].
Betainai. Dar viena nedidelė junginių grupė nustatyta baltažiedžių notrelių žolėje azoto turintys junginiai – betainai. Indentifikuotas prolino betainas ir trans-4-hidroksiprolino betainas [44].
Amino rūgštys ir monosacharidai. Tirtuose baltažiedžių notrelių žolės, rinktos žydėjimo metu, 70 proc. etanoliniuose ekstraktuose nustatyta 20 amino rūgščių ir 4 monosacharidai. Identifikuotos amino rūgštys: asparto rūgštis, glutamo rūgštis, 4-hidroksiprolinas, asparaginas, glutaminas, serinas, glicinas, argininas, treoninas, alaninas, prolinas, γ-aminobutirinė rūgštis, valinas, izoleucinas, leucinas, fenilalaninas, monoetanolaminas, histidinas, lizinas ir cisteinas. Nustatyta 3,39 proc. amino rūgščių, tarp kurių dominavo asparto rūgštis ir glutamo rūgštis.
Bendras monosacharidų kiekis baltažiedžių notrelių žolės etanoliniame ekstrakte - 27,82 proc. Dominuojantis monosacharidas – ramnozė. Kiti nustatyti monosacharidai: gliukozė, galaktozė, arabinozė ir ribozė. [50].
Mikro ir makro elementai. Žinoma, kad elementų kiekis augale priklauso nuo įvairių sąlygų: augalo augimo vietos, cheminės dirvožemio sudėties, oro sąlygų. Ištirta, kad baltažiedžių notrelių žolėje daugiausia yra makroelemento kalcio (2829 mg/kg), taip pat nemažai kitų makroelementų: kalio, magnio bei fosforo, mažiau geležies ir visai nedaug natrio. Iš mikroelementų dominuoja manganas, kobaltas ir cinkas, o alavo, seleno, chromo, vario kiekiai yra daug mažesni. Tyrimai parodė, kad nustatytų sunkiųjų metalų – švino, kadmio, arseno ir gyvsidabrio kiekiai baltažiedžių notrelių žolėje yra labai maži ir nepavojingi [69].
1.5.
Baltažiedžių notrelių žaliavų preparatų farmakologinis poveikis
Baltažiedžių notrelių žaliavų preparatai daugiausiai naudojami liaudies medicinoje, kaip priemonės nuo skausmo ar reumatizmo bei kitų artritinių susirgimų. Taip pat hipermenoragijos, gimdos kraujavimui, makšties ir gimdos kaklelio uždegimams ir leukorėjos gydymui, kaip diuretinė, inkstų funkciją gerianti priemonė [47, 64, 66].
Priešvirusinis aktyvumas. Vandeninis baltažiedžių notrelių žolės ekstraktas, kurio pagrindiniai komponentai lamiridozidas A ir B sumažino hepatitą C sukeliančio viruso aktyvumą 50 proc. [74]. Chloroforminiai baltažiedžių notrelių žolės ekstraktai, gauti iš in situ ir in vitro augintų augalų, reikšmingai (90 proc.) nuslopino herpes simplex virusų pirmą ir antrą tipą ir nepasižymėjo citotoksiškumu prieš žmogaus ląsteles. Nėra nustatyta, kurie aktyvūs junginiai galėjo lemti tokį poveikį [65].
Antimikrobinis aktyvumas. Ištirta, kad etanolinis baltažiedžių notrelių šakniastiebių ekstraktas pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš Bacillus cereus ir Staphylococcus aureus [42]. Taip pat nustatyta, kad įvairūs baltažiedžių notrelių žolės ekstraktai turi antibakterinį aktyvumą prieš
Bacillus subtilis, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Proteus hauseri, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis. Gram-teigiamos bakterijos yra jautresnės
baltažiedžių notrelių žolės ekstraktų antibakteriniam poveikiui nei gram-neigiamos, o in vitro augintų augalų žaliavų preparatai pasižymi platesniu antibakteriniu poveikiu nei in situ augintų šio augalo žaliavų ekstraktai [14].
Antioksidantinis poveikis. Žinoma, kad antioksidantinis ir laisvuosius radikalus surišantis augalinių ekstraktų poveikis, daugiausiai priklauso nuo fenolinių junginių. Tirti įvairūs baltažiedžių
notrelių žolės ekstraktai ir jų antioksidantinis aktyvumas [12]: rezultatai parodė, kad butanolinėje chloroforminio ekstrakto frakcijoje nustatyta daugiausiai fenolinių junginių ir reikšmingai stiprus antiradikalinis aktyvumas [45].
Nustatytas vidutinio stiprumo koreliacijos ryšys tarp antioksidantinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio baltažiedėžių notrelių žolės ekstraktuose [66]. Lyginant baltažiedžių notrelių žolės ekstraktų antioksidantinį veikimą, augaluose augintuose in vitro ir in situ sąlygomis, nustatyta, kad natūraliai augančių augalų žolių ektraktai pasižymi stipresniu antioksidantiniu ir laisvuosius radikalus surišančių pajėgumu [68].
Citoprotekcinis aktyvumas. Studijose buvo aptikta, kad heptaninis baltažiedžių notrelių žaliavos ekstraktas, kurio aktyvūs komponentai yra triterpenai, pasižymi, stimuliuojančiu žmogaus odos fibroblastų proliferaciją, poveikiu. Fibrblastų proliferacija rodo, kad audiniai atsinaujina, todėl baltažiedžių notrelių žaliavos ekstraktas pasižymi žaizdas gydančiu poveikiu ir gali būti naudojamas odos apsaugai [71].
Taip pat nustatytas baltažiedžių notrelių žolės etanolinio ekstrakto citoprotekcinis poveikis prieš kalio dichromato sukeltą toksiškumą kepenų ląstelėse. Šį poveikį lėmė ekstrakte esantis verbaskozidas, mažindamas kalio dichromato sukeltą ląstelių aktyvumo mažėjimą [55].
Priešvėžinis aktyvumas. Atlikus tyrimus, buvo rasta, kad baltažiedžių notrelių žolės hidroalkoholinio ekstrakto vandeninė frakcija reikšmingai sustabdė spontanišką vėžinių ląstelių proliferaciją pelėse. Nors šio ekstrakto sudėtis nebuvo nustatyta, Trouillas et al., (2003) teigia, kad tai greičiausiai priklausė nuo fenolinių junginių kiekio ekstrakte ir jų sukelto antioksidantinio aktyvumo [66].
Metanolinis 4,5 mg/ml baltažiedžių notrelių žiedų ektraktas pasižymėjo teigiamu poveikiu prieš plaučių vėžio ląstelių proliferaciją. Tai aiškinama sumažėjusia ląstelių adhezija, dėl ko galima išvengti tolesnio vėžinių ląstelių vystymosi. Adhezijos sumažėjimą galėjo lemti dvi priežastys: sumažėjęs integrinų, transmembraninių baltymų, kurie dalyvauja ląstelių adhezijoje ir migracijoje kiekis arba membranos fosfolipidų suardymas. Stipriausias priešvėžinis poveikis pastebėtas gydant kombinuotu metanoliniu ir chloroforminiu ekstraktais. Taip pat nustatyta, kad baltažiedžių notrelių žiedų ekstraktai selektyviai inhibuoja vėžinių ląstelių proliferaciją, tačiau nepaveikia normalių, sveikų žmogaus ląstelių. [48].
Chloroforminis, in vitro kultivuotų baltažiedžių notrelių žolės, ekstraktas pažeidė vėžinių ląstelių membranas, bet nepakenkė normalioms, sveikoms ląstelėms. In vitro kultivuotų augalinių vaistinių žaliavų ekstrakto poveikis buvo nuo 5 proc. iki 15 proc. stipresnis nei in vivo sąlygomis kultivuotų augalų vaistinių augalinių žaliavų [70].
Priešuždegiminis veikimas. Nustatyta, kad baltažiedžių notrelių žolės hidroalkoholinio ekstrakto vandenine frakcija pasižymėjo priešuždegiminėmis savybėmis, slopindama uždegimo
mediatorius. Šį poveikį lėmė fenoliniai junginiai, tokie kaip kavos rūgštis ir ursolinė rūgštis, kurie veikia kaip lipoksigenazes inhibitoriai. Taip pat fenoliniai junginiai mažina uždegimo metu atsirandančių reaktyvių laisvų radikalų susidarymą [66].
Taip pat nustatyta, kad baltažiedžių notrelių žiedų heptano ekstraktai gali būti naudojami akių lašų, gydančių su uždegimu susijusias akių ligas, gamybai [52].
1.6. Fenolinių rūgščių ir flavonoidų analizės metodai
Norint kiekybiškai ir kokybiškai nustatyti fenolinius junginius galima taikyti toliau išvardintas metodikas – efektyviąją skysčių chromatografiją, plonasluoksnę chromatografiją, skysčių chromatografiją, dujų chromatografiją ar kapiliarinę elektroforezę. Nepaisant naujai atsiradusių metodų gausos, vienas iš paprasčiausių metodų – ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties spektrofotometrija [7, 17].
Spektrofotometrinė analizė. Flavonoidai ir fenolinės rūgštys sugeria šviesą UV spektro dalyje dėl jų struktūroje esančių aromatinių žiedų [56]. Būtent dėl UV šviesos absorbcijos flavonoidai ir fenolinės rūgštys gali būti analizuojami spektrofotometriniais analizės metodais. Dažniausiai spektrofotometriniu metodu įvertinamas bendras junginių (fenolinių, flavonoidų, fenolkarboksirūgščių) kiekis ekstrakte [75].
Bendras flavonoidų kiekis gali būti nustatomas po reakcijos su natrio nitrito ir aliuminio chlorido mišiniu ar oksaloboratiniu reagentu. Absorbcija yra matuojama ties 510 nm ir 401 nm bangos ilgiais [30, 39]. Bendras fenolkarboksirūgščių kiekis spektrofotometriškai nustatomas po ekstrakto reakcijos su Arnow reagentu. Tiriamųjų mėginių absorbcijos dydis matuojamas esant 525 nm bangos ilgiui [10, 30]. Spektrofotometrinės metodikos yra nesudėtingos, greitos ir ekonomiškos. Tačiau šis metodas netinka, norint įvertinti individualių junginių kiekybinę sudėtį [32].
Efektyvioji skysčių chromatografija. ESC šiuo metu yra dominuojantis metodas fenolinių junginių analizei [63] Šis metodas gali būti naudojamas kokybiniam ir kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui. Nustatymui dažniausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija su įvairiais detekcijos variantais. Dažniausiai identifikavimui naudojami ultravioletinės – regimosios spinduliuotės (UV/VIS), diodų matricos (DAD) ir masių spektrofotometriniai (MS) detektoriai, tačiau taip pat pritaikomi UVfluorescentiniai ar diodų gardelės detektoriai. Fenolinių rūgščių maksimumai yra 200 -360 nm diapazone. Flavonoidai turi du maksimumus ties 240 -285 nm ir 300 – 550 nm diapozonais. ESC metodo privalumai: metodas jautrumas, atskiriami visi galimi junginių dariniai ir degradacijos produktai, platus kolonėlių pasirinkimas, didesnis informatyvumas nei kiti analiziniai metodai. Pagrindiniai metodo trūkumai yra ilgas analizės laikas ir maža skiriamoji geba [41, 49, 56, 63].
Plonasluoksnė chromatografija. Šį metodą galima pritaikyti ir kokybiniai, ir kiekybinei analizei, tačiau dažniausiai plonasluoksnė chromatografija naudojama kokybinei analizei. Ji ypač tinka greitai kokybiniai ekstraktų analizei, nustatant aktyvius junginius, prieš atliekant išsamesnius tyrimus [16, 63]. Dažniausiai kaip nejudri fazė naudojamas silicio dioksidas, o detekcija atliekama naudojant UV šviesą [63]. Plonasluoksnės chromatografijos metodas yra greitas ir paprastas [16, 63], tačiau šis metodas laikomas senu ir mažiau moderniu palyginus su kitais analitiniais metodais. Jį rekomenduojama pakeisti kitais chromatografiniais metodais, tokiais kaip ESC [16].
Kapiliarine elektroforeze. Šiuo metodu galima kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti mažos ir vidutinės molekulinės masės įvairius fenolinius junginius. Detekcija dažniausiai atliekama su UV detektoriumi, bet taikomi ir kiti, kaip MS detektorius. Metodo privalumai – didelė skiriamoji geba, trumpas analizės laikas, mažos reagentų ir bandinių sąnaudos. Tačiau lyginant su dujų ar skysčių chromatografija, šiam metodui būdingas gana prastas duomenų atkuriamumas [32, 41, 56, 63].
Dujų chromatografija. Lakių junginių analizei gali būti naudojamas dujų chromatografijos metodas. Šis metodas taip pat tinka tiek kiekybiniam, tiek kokybiniam flavonoidų ir fenolinių rūgščių vertinimui. Junginių aptikimui paprastai taikomi tokie detektoriai, kaip liepsnos jonizacinis ar masių spektrometrijos detektoriai. Kombinuojant dujų chromatografiją su MS pasiekiamas didesnis metodo jautrumas ir selektyvumas. Metodo trūkumas – jo pritaikymą riboja mažas fenolinių junginių lakumas, prieš atliekant analizę būtina iš ekstrakto pašalinti lipidus ir fenolius junginiu išlaisvinti iš glikozidinių ar esterinių formų [41, 63].
1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Baltažiedės notrelės yra vienos iš labiausiai paplitusių, notrelių genčiai priklausančių, vaistinių augalų. Jos išsiskiria kremiškai baltais ar baltais, dvilūpiais, menturiuose po 5 - 22 išsidėsčiusiais žiedais [22, 64].
Mokslinių tyrimų metu baltažiedžių notrelių žaliavose (dažniausiai žolėje ir žieduose) nustatyti junginiai: iridoidai, fenoliniai junginiai, fitoekdisteroidai, eteriniai aliejai, terpenai, megastigmenai, betainai, amino rūgštys, monosacharidai, mikro ir makro elementai. Atlikta nemažai tyrimų su baltažiedžių notrelių žaliavų ekstraktais ir nustatyta jų priešvirusinis, antimikrobinis, antioksidantinis, citoprotekcinis, priešvėžinis ir priešuždegiminis aktyvumai.
Yra žinoma, kad antioksidantinį ir priešuždegiminį poveikius lemia baltažiedžių notrelių žaliavose esantys fenoliniai junginiai [12, 66]. Fenoliniams junginiams priskiriami flavonoidai ir fenolinės rūgštys. Jų kiekybiniam nustatymui augalinių žaliavų ekstraktuose dažniausiai naudojama UV spektrofotometrija, o individualių junginių identifikavimui ir analizei ESC [7, 17].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimui naudota augalinė žaliava – baltažiedžių notrelėių žolė. Ji rinkta iš natūralių augaviečių 2015 metais ir 2016 metais.
Baltažiedių notrelių žolė 2015 metais rinkta viso vegetacijos periodo metu iš vienos augavietės Puskelnių kaime, Marijampolės rajone. Augavietės plotas apie 15m2
. Žolė rinkta kas dvi savaites nuo balandžio 19 dienos iki liepos 27 dienos. Surinkti 8 žolės ėminiai. Žolės rinkimo datos (2015 m.) ir baltažiedžių notrelių vegetacijos tarpsnis:
1. Augimo fazė – balandžio 19 d. 2. Butonizacija – gegužės 3 d.
3. Žydėjimas – gegužės 17 d. ir gegužės 31 d. 4. Intensyviausias žydėjimas – birželio 14 d. 5. Žydėjimo pabaiga – birželio 28 d.
6. Vaisių brendimas – liepos 12 d. 7. Vegetacijos pabaiga – liepos 26 d.
Kitais metais baltažiedžių notrelių žolė rinkta iš keturiolikos natūralių augaviečių, esančių įvairiuose Lietuvos regionuose. Augalinė žaliava rinkta nuo birželio 25 dienos iki liepos 16 dienos. Augaviečių pavadinimai ir rinkimo datos (2016 m.):
1. Rėkyvos parkas, Šiaulių miestas (birželio 25 d.); 2. Viduklės apylinkės, Raseinių rajonas (birželio 26 d.); 3. Kleboniškio miško parkas, Kauno miestas (birželio 28 d.); 4. Palangos miškas, Palangos miestas (birželio 29 d.);
5. Stumbrių miškas, Rietavo seniūnija (birželio 29 d.);
6. Bukčių miškas, Lazdynų seniūnija, Vilniaus miestas (liepos 1 d.); 7. Rambyno regioninis parkas, Pagėgių savivaldybė (liepos 3 d.); 8. Puskelnių kaimo apylinkės, Marijampolės rajonas (liepos 6 d.); 9. Burbiškių kaimo apylinkės, Anykščių rajonas (liepos 7 d.); 10. Degučių kaimo apylinkės, Zarasų rajonas (liepos 8 d.); 11. Likiškėlių kaimo apylinkės, Alytaus rajonas (liepos 9 d.); 12. Druskininkų miškas, Druskininkų miestas (liepos 9 d.); 13. Žagarės regioninis parkas, Žagarė (liepos 15 d.);
2 pav. Teritorinis baltažiedžių notrelių žolės rinkimo vietų pasiskirstymas
2.2. Baltažiedžių notrelių žolės analizei naudoti reagentai
Ekstraktų paruošimui naudoti reagentai: išgrynintas vanduo („Millipore“, JAV); etanolis 96,3 proc. (v/v) („Vilniaus degtinė“, Lietuva).
Spektrofotometrinei analizei naudoti reagentai: analitinio švarumo natrio nitratas, natrio molibdatas (≥ 99 proc.), vandenilio chlorido rūgštis, natrio šarmas (99 proc.), aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), acto rūgštis („Sigma-Aldrich“, Vokietija), rutino trihidratas („ROTH“, Vokietija), heksametilentetraminas („Alfa Aesar“, JAV).
ESC analizei naudoti reagentai: dejonizuotas vanduo, paruoštas naudojant “Milli-Q” valymo sistemą (Bedford, JAV), chromatografinio švarumo acetonitrilas (“Sigma-Aldrich GmbH”, Buchs, Šveicarija), chromatografinio švarumo trifluoracto rūgštis (“Sigma-Aldrich GmbH”, Buchs, Šveicarija). Standartai: liuteolino-7-gliukozidas, kavos rūgštis ir rozmarino rūgštis (“Extrasynthese” (Genay, Prancūzija)), protokatechino, kaftaro ir cikoro rūgštys įsigytos (“Fluka” (Buchs, Šveicarija)), chlorogeno rūgštis, rutinas („Carl Roth Gmbh, Karlsrujė“, Vokietija).
2.3. Baltažiedžių notrelių žolės analizei naudota aparatūra
Tirta augalinė žaliava ir reagentai sverti ,,Sartorius CP64-0CE“ (Vokietija) analitinėmis svarstyklėmis. Ruošiant ekstraktus naudota ultragarso vonelė - „Elmasonic P“ (Vokietija). Kiekybinis fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų nustatymas atliktas spektrofotometru ,,Spectronic Camspec M550‘‘ (Anglija). Chromatografavimui skirti ekstraktai filtruojami pro membraninius filtrus (Carl Roth Gmbh, Karlsrujė, Vokietija). ESC, nustatant fenolinius junginius, atlikta chromatografu “Waters Alliance e2695” (JAV) su DAD “Waters 2998 PDA”. Duomenys apdoroti „Empower 3“ programine įranga (JAV).
2.4. Baltažiedžių notrelių žolės ekstraktų ruošimo metodika
Baltažiedžių notrelių žolė buvo džiovinama kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje. Sudžiovinta augalinė žaliava smulkinama elektriniu smulkintuvu. Ekstraktai ruošiami 0,0001 g tikslumu atsvėrus 0,2500 g augalinės žaliavos ir užpylus 25 ml 70 proc. (v/v) etanolio. Mišinio ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 10 minučių kambario temperatūroje. Gauti ekstraktai filtruojami pro popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliukus. Iš kiekvienos augalinės žaliavos mėginio ruošiami 3 ekstraktai. Ekstrakcijos sąlygos – ekstrakcijos laikas ir ekstrahento koncentracija pasirinkti, atlikus ekstrakcijos sąlygų nustatymą ir atsižvelgus į gautus rezultatus.
2.5. Fenolkarboksirūgščių koncentracijos nustatymas spektrofotometriniu metodu
Tiriamas tirpalas gaminamas 5 ml kolbutėje, sumaišant 0,5 ml pagaminto baltažiedžių notrelių žolės ekstrakto su 1 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 1 ml Arnow reagento ir 1 ml praskiesto natrio šarmo. Šis tirpalas praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 5 ml ir sumaišomas. Iš karto matuojama gauto tirpalo absorbcija, esant 525 nm bangos ilgiui.Lyginamasis tirpalas ruošiamas kolbutėje sumaišant 0,5 ml tiriamo ekstrakto su 1 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties ir 1 ml praskiesto natrio šarmo. Gautas tirpalas praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 5 ml ir sumaišomas. Tyrimai kartojami 3 kartus, rezultatuose pateikiamas matematinis vidurkis ± standartinė paklaida.
Analizei reikalingų reagentų paruošimas. Vandenilio chlorido rūgšties 0,5 M tirpalas pagamintas pamatavus 42 ml 37 proc. vandenilio chlorido rūgšties, sumaišant ją su išgrynintu
vandeniu iki 1 litro. Praskiestas natrio šarmo tirpalas pagamintas pasvėrus tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį ir ištirpinus jį išgrynintame vandenyje praskiedžiant iki 100 ml. Arnow reagento gamyba: pirma pasveriamas tikslus 10,000 g natrio molibdato kiekis ir ištirpinamas 70-80 ml išgryninto vandens. Tuomet pasveriamas tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris ištirpinamas jau gautame natrio molibdato tirpale. Gautas natrio molibdato ir natrio nitrito tirpalas praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
Bendra procentinė fenolkarboksirūgščių koncentracija procentais ekstrakte perskaičiuota chlorogeno rūgštimi remiantis formule:
A – tiriamo tirpalo absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui; m – tiriamos augalinės žaliavos masė gramais;
2.6. Suminės flavonoidų koncentracijos nustatymas spektrofotometriniu metodu
Suminė flavonoidų koncentracija nustatyta spektrofotometriškai ir išreikšata rutino ekvivalentu (RE). Tiriamas tirpalas gaminamas 5 ml matavimo kolbutėje, įpilant 0,2 ml paruošto baltažiedžių notrelių žolės ekstrakto, 2 ml 96 proc. v/v etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo, 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo. Tuomet kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir viskas sumaišoma. Praėjus 30 min. matuojamas tirpalo absorbcijos dydis. Šis dydis lyginamas su palyginamuoju tirpalu (γ = 407 nm).Palyginamasis tirpalas ruošiamas visų pirma į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, tuomet įpilama 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio ir galiausiai 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo. Kolbutės turinys užpildomas išgrynintu vandeniu iki žymės
Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami etaloninio rutino tirpalo tiriamasis ir palyginamasis tirpalai, tačiau vietoje 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, pilama 0,2 ml etaloninio rutino tirpalo.
Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,0125 g rutino (tikslus svėrinys), tirpinant 70 proc. v/v etanolyje 25 ml talpos matavimo kolbutėje. Tyrimai kartojami 3 kartus, rezultatuose pateikiamas matematinis vidurkis ± standartinė paklaida.
Flavonoidų koncentracija augalinėje žaliavoje, perskaičiuota rutinu ir išreikšta procentais (X), skaičiuota naudojantis formule:
m(r) – rutino standarto masė gramais, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti; V(važ) – visas paruoštos augalinės žaliavos tūris mililitrais;
A(važ) – paruoštos augalinės žaliavos tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m(važ) – augalinės žaliavos masė gramais, sunaudota ištraukai ruoši. A(r) – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis.
2.7. Fenolinių junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Tiriamųjų tirpalų paruošimas. Tirti skirtingu vegetacijos metu ir iš skirtingų augaviečių surinkti baltažiedžių notrelių žolės ekstraktai, kurių gamyba aprašyta 2.4 skirsnyje. Prieš atliekant analizę su ESC, gauti etanoliniai ekstraktai perfiltruojami per membraninius filtrus, kurių porų dydis 0,22 μm.Chromatografinė analizė. Analizė atlikta, naudojant „Waters Alliance e2695“ chromatografą su „Waters 2998 PDA” diodų matricos detektoriumi. Analičių skirstymui atliktas su „ACE Excel 3 SuperC18” (250 mm × 4.6 mm, dalelių dydis 3 µm) analitine kolonėle, kuri termostatuota 25 °C temperatūroje. Analizės metu naudota mobili fazė, sudaryta iš eliuento A (0,1 proc. trifluoracto rūgštis vandenyje) ir eliuento B (acetonitrilas). Gradientinis kitimas, naudotas analizės metu:
0-30 min. - 15-30 proc. eliuento B ir 85-70 proc. eliuento A; 30-50 min. - 30-60 proc. eliuento B ir 70-40 proc. eliuento A; 50-55 min. - 60-90 proc. eliuento B ir 40-10 proc. eliuento A; 55-60 min. - 90-15 proc. eliuento B ir 10-85 proc. eliuento A. Tirpiklio tėkmės greitis – 0,5 ml/min, bandinių injekcijos tūris - 10 μL.
ESC metodo taikymo metu individualių fenolinių junginių nustatymas atliktas naudojant standartinius tirpalus. Gautų chromatografinių smailių identifikavimas buvo atliktas pagal analitės ir standartų sulaikymo laikus ir spektrinius duomenis. Detekcija atlikta 200–400 nm bangos ilgių srityje.
Kiekybinės sudėties įvertinimas atliktas naudojantis etaloninių tirpalų kalibraciniais grafikais. Su kiekvienu žaliavų mėginiu bandymai kartojami 3 kartus ir išvedamas gautų rezultatų vidurkis ± standartinė paklaida.
2.8. Duomenų statistinis vertinimas
Gauti tyrimų duomenys statistiškai apdoroti Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV) ir SPSS 17.0 (SPSS Inc., JAV) programomis. Microsoft Office Excel 2007 apskaičiuoti vidurkiai, standartinės paklaidos ir nubraižyti grafikai. Su SPSS 17.0 statistikos programa apskaičiuoti Spirmeno koreliacijos koeficientai (rs), vieno faktoriaus dispersinė analizė (ANOVA) su Tukey kriterijumi.
Analizės metu taikytas α=0,05 ir α=0,01 reikšmingumo lygmenys. Tarpusavyje statistiškai reiškingai nesiskiriančios reikšmės grafikuose pažymėtos tomis pačiomis raidėmis
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Baltažiedžių notrelių žolės ekstrakcijos sąlygų nustatymas – optimaliausios
ekstrahento koncentracijos parinkimas
Sąlygoms nustatyti panaudota 2015 m. gegužės 17 d. surinkta baltažiedžių notrelių žolė. Ji buvo ekstrahuojama įvairių koncentracijų (30, 40, 50, 60, 70 ir 80 proc.) (v/v) etanolio vandens mišiniu ultragarso vonelėje. Ultragarso vonelėje gaminamos ultragarso bangos, sukuriančios šalia mėginio audinių oro pūsleles, kai pūslelės sprogsta ląstelių sienelės yra suardomos, o medžiagos išsiskiria į tirpiklį. Ultragarsu paremta ekstrakcija yra taikoma gana dažnai dėl savo paprastumo ir pigumo [26, 72]. Ekstrakcija vykdyta 10 minučių. Optimali ekstrahento koncentracija pasirinkta, vertinant fenolkarboksirūgščių kiekį 2.5 skirsnyje aprašytu spektrofotometriniu metodu. Rezultatai išreikšti miligramais chlorogeno rūgšties ekvivalentu (CAE) grame Su kiekvienu augalinės žaliavos mėginiu bandymas buvo kartojamas 3 kartus. Gauti rezultatai pateikti 3 pav.
3 pav. Optimaliausios ekstrahento koncentracijos nustatymas baltažiedžių notrelių žolės ekstrakcijai (SP ≤ 5 proc., n=3)
Analizuojant rezultatus, nustatyta, kad didžiausia fenolkarboksirūgščių koncentracija (75,23 ± 2,14 mg CAE/g) išsiekstrahavo, veikiant augalinę žaliavą 70 proc. (v/v) etanoliu, tačiau ši reikšmė statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo fenolkarboksirūgščių koncentracijos (67,15 ± 1,83 mg CAE/g) išsiekstrahavusios su 40 proc. (v/v) etanoliu. Tolimesniems ekstraktams ruošti buvo naudojamas 70 proc. (v/v) etanolis.
Išskirti biologiškai aktyvius junginius iš baltažiedžių notrelių vaistinių augalinių žaliavų mokslininkai naudojo įvairius ekstrahentus, tokius kaip – vanduo [74], chloroformas [14, 48, 74], metanolis [45, 48], etanolio ir vandens mišinys [42, 55, 68], etilo acetatas [42] ar heptanas [51]. Flavonoidai yra poliniai junginiai ir geriau išsiekstrahuoja su poliniais tirpikliais. Nors fenolinės rūgštys ekstrahuojasi su įvairaus poliškumo tirpikliais, tačiau naudojant polinius tirpiklius
B BC A AB C AB 45 50 55 60 65 70 75 80 20 30 40 50 60 70 80 90 F en olk ar b ok sirūg šč ių kon ce ntr ac ija m g C A R /g Etanolio koncentracija % (V/V)
nustatoma didesnė jų įvairovė ir kiekiai [51]. Tai patvirtinančius rezultatus nustatė R. Veleva et al., (2015): baltažiedžių notrelių lapų mažiau poliniame chloroformo ekstrakte buvo nustatytos 4 fenolinės rūgštys, o tuo tarpu labiau poliniame metanoliniame ekstrakte nustatyta 11 fenolinių rūgščių. Chloroformo ekstrakte nustatyta mažiau nei 4 mg/g sinapo rūgšties, o metanolio ekstrakte 61,8 mg/g tos pačios rūgšties [71]. Labai polines fenolinės rūgštis (cinamono rūgštis) rekomenduojama ekstraguoti su alkoholio – vandens ar acetono – vandens mikstūromis [63].
Tyrimui pasirinktas ekstrahentas – etanolio ir vandens mišinys. Šis ekstrahentas susideda iš skirtingo poliškumo tirpiklių, todėl jo mišinys gali išektrahuoti tiek mažiau, tiek labiau poliškus junginius. Taip pat šis ekstrahentas yra palyginus nebrangus ir saugus žmogui [26].
M. K. Wojciank et al., (2013) nustatinėjo su kuriuo ekstrakcijos metodu iš baltažiedžių notrelių žiedų išsiektrahuos daugiausiai triterpeninių rūgščių. Buvo vykdoma žiedų maceracija, Soksleto ekstrakcija, mikrobangomis, ultragarsu bei šildymu skatinama ekstrakcija. Daugiausiai junginių išsiektrahavo vykdant mikrobangomis skatinančią ekstrakciją [72].
3.2. Baltažiedžių notrelių žolės ekstrakcijos sąlygų nustatymas – ekstrakcijos
trukmės nustatymas
Optimalus ekstrakcijos laikas buvo nustatytas ekstrahuojant baltažiedžių notrelių žolę su 70 proc. (v/v) etanoliu ultragarso vonelėje. Pagaminti atskiri mėginiai buvo ekstrahuojami po 5, 10, 15, 20, 30 ir 40 min. Bandymas kartotas tris kartus. Gautuose ekstraktuose nustatinėjamas fenolkarboksirūgščių koncentracija spektrofotometriniu metodu aprašytu 2.5. skirsnyje. Gauti rezultatai pavaizduoti 4 pav.
4 pav. Optimaliausios ekstrakcijos trukmės parinkimas baltažiedžių notrelių žolės ekstrakcijai (SP ≤ 5 proc., n=3) AB D CD BC ABC A 45 50 55 60 65 70 75 80 0 10 20 30 40 50 F en olk ar b ok sirųg šč ių k on ce n tr ac ija m g CA E /g
Analizuojant gautus rezultatus, nustatyta, kad didžiausia fenolkarboksirūgščių koncentracija išsiekstrahuoja po 10 min. vykdytos ekstrakcijos (75,23 ± 2,14 mg CAE/g). Tačiau negalima teigti, kad 10 min. ekstrakcijos laikas (p > 0,05) yra geresnis pasirinkimas už 15 min. ekstrakciją, po kurios nustatyta 66,43 ± 1,65 mg CAE/g fenolkarboksirūgščių.
Tolimesni tyrimai buvo atlikti su baltažiedžių notrelių žolės ekstraktais gautais ekstrahuojant žolę ultragarso vonelėje 10 min. su 70 proc. (v/v) etanoliu.
3.3. Fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracijų įvairavimas baltažiedžių
notrelių žolėje vegetacijos periodo metu
Tyrimo metu buvo nustatinėjami Lietuvos klimate augančių baltažiedžių notrelių žolės kaupiamų bendro fenolkarboksirūgščių ir bendro flavonoidų kiekio pokyčiai vegetacijos periodo eigoje. Baltažiedžių notrelių žolė, šiam tyrimui buvo rinkta iš Puskelnių kaimo apylinkėse (Marijampolės raj.) esančios pievos kas dvi savaites nuo balandžio 19 d. iki liepos 27 d. Buvo ištirti 8 baltažiedžių notrelių žolės 70 proc. (v/v) etanoliniai ekstraktai. Nustatinėti fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų kiekius žolėje baltažiedžių notrelių vegetacijos periodo metu pasirinktas paprastas, greitas, jautrus, pritaikomas nedideliems junginių kiekiams UV spektrofotometrinis metodas [9, 67]. Gauti rezultatai pateikti 5 pav. ir 6 pav.
5 pav. Fenolkarboksirūgščių koncentracijos įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje vegetacijos periodo metu (SP ≤ 5 proc., n=3)
Baltažiedžių notrelių augimo tarpsnio metu (balandžio 19 d.) rinktoje žolėje nustatyta 42,97 ± 2,13 mg CAE/g fenolkarboksirūgščių. Butonizacijos pradžioje (gegužės 3 d.) rinktoje žaliavoje
A B BC C D BC BC A 35,00 45,00 55,00 65,00 75,00 85,00 95,00 105,00 115,00
05.Bal 19.Bal 03.Geg 17.Geg 31.Geg 14.Bir 28.Bir 12.Lie 26.Lie 09.Rgp
F en olk ar b ok sirūg šč ių k on ce n tr ac ija m g CA E /g
fenolkarboksirūgščių kiekis padidėjo iki 58,79 ± 2,55 mg CAE/g. Žydėjimo pradžioje fenolkarboksirūgščių didėjo toliau iki 70,60 ± 0,97 mg CAE/g, o intensyviausio žydėjimo metu (birželio 14 d.) baltažiedžių notrelių žolės ekstraktuose nustatytas didžiausias (p < 0,05) fenolkarboksirūgščių kiekis, kuris siekė 103,88 ± 3,11 mg CAE/g. Augalo žydėjimo pabaigoje nustatytas fenolkarboksirūgščių kiekio sumažėjimas (63,60 ± 1,90 mg CAE/g). Mažiausias fenolkarboksirūgščių kiekis (40,99 ± 1,90 mg CAE/g) nustatytas liepos 26 d. rinktoje baltažiedžių notrelių žolėje, esant vegetacijos periodo pabaigai. Šis kiekis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo baltažiedžių notrelių žolėje augimo tarpsnio metu nustatyto fenolkarboksirūgščių kiekio (5 pav.). Remiantis moksline literatūra, baltažiedė notrelė kaupia daugiau kaip 34 mg/g fenolinių rūgščių [50].
Tuose pačiuose baltažiedžių notrelių žolės ekstraktuose nustatytas bendras flavonoidų kiekis. Rezultatai parodė, kad jis augalo vegetacijos eigoje svyravo (6 pav.). Baltažiedžių notrelių augimo metu (balandžio 19 d.) nustatytas bendras flavonoidų kiekis buvo 14,43 ± 0,45 mg RE/g. Butonizacijos metu (gegužės 3 d.) bendras flavonoidų kiekis pakilo iki 24,66 ± 0,48 mg RE/g. Žydėjimo pradžioje ir suintensyvėjus žydėjimui iki gegužės pabaigos bendras flavonoidų kiekis sumažėjo iki 17,27 ± 0,54 mg RE/g. Didžiausias (p < 0,05) flavonoidų kiekis (29,55 ± 0,45 mg RE/g) nustatytas birželio 14 d. – augalo intensyviausio žydėjimo metu rinktoje baltažiedžių notrelių žolėje. Mažiausias kiekis (13,62 ± 0,34mg RE/g) flavonoidų nustatytas birželio 28 d. – baltažiedžių notrelių žydėjimo pabaigoje rinktos žaliavos ektraktuose. Nuo žaliavos, kurioje nustatytas mažiausias flavonoidų kiekis statistiškai reikšmingai nesiskyrė ir kitos dvi mažiausiai flavonoidų kaupusios žaliavos, rinktos baltažiedžių notrelių augimo metu ir suintensyvėjusio žydėjimo metu.
6 pav. Suminės flavonoidų koncentracijos įvairavimas žolėje baltažiedžių notrelių vegetacijos periodo metu (SP < 4 proc., n=3)
Nepastoviam flavonoidų kiekiui įtakos galėjo turėti santykinė oro drėgmė. Y. Shin et al.,
(2007) nustatė, kad santykinės oro drėgmės didėjimas lemia didesnį flavonoidų kiekį [61].
A B BC A D A BC B 10,00 14,00 18,00 22,00 26,00 30,00 34,00
05.Bal 19.Bal 03.Geg 17.Geg 31.Geg 14.Bir 28.Bir 12.Lie 26.Lie 09.Rgp
F lavon oid ų k on ce n tr ac ija m g RE/ g
Didžiausias kiekis fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų nustatytas baltažiedžių notrelių žolėje, rinktoje intensyviausio žydėjimo metu. Šiuo metu baltažiedžių notrelių žolėje nustatyta beveik 4 kartus mažiau flavonoidų nei fenolkarboksirūgščių. Nustatyta, kad baltažiedžių notrelių žydėjimas priklauso nuo dienos ilgio, sezono, bei oro sąlygų. Taip pat žydėjimo gausa priklauso nuo oro sąlygų prieš žydėjimą. Aukšta temperatūra ir sausra trumpina žiedų gyvavimo trukmę, o žemesnė temperatūra ir drėgmė ją ilgina. B. Denisow et al., (2008) nustatė, kad Lenkijoje, Lublino m. augusių baltažiedžių notrelių žiedų gyvavimo trukmė esant 18oC vidutinei dienos temperatūrai buvo 4-5 dienos, o
temperatūrai pakilus nuo 25o
C iki 30oC laipsnių žiedų gyvavimo trukmė sutrumpėjo 2 dienomis. Šiame tyrime minėta, kad Lublino m. intensyviausias baltažiedžių notrelių žydėjimas trunka nuo balandžio 28d. iki gegužės 7 d. esant aukštesnei, kaip 20o
C temperatūrai [24]. Mūsų tirtoje augavietėje Lietuvos klimato sąlygomis augančių baltažiedžių notrelių masinis žydėjimas prasidėjo mėnesiu vėliau. Tai gali lemti vėsesnis Lietuvos klimatas. Tikslinga būtų atlikti tyrimus susijusius su baltažiedžių notrelių žydėjimo priklausomybe nuo temperatūros ir drėgmės.
3.4. Fenolkarboksirūgščių ir flavonoidų koncentracijų įvairavimas baltažiedžių
notrelių žolėje iš įvairių Lietuvos regionų
Tyrimo metu nustatytas bendras fenolkarboksirūgščių ir bendras flavonoidų kiekis baltažiedžių notrelių žolės ekstraktuose UV spektrofotometriniu metodu. Baltažiedžių notrelių žolė surinkta iš 14 natūralių augimviečių Lietuvoje (10 Lietuvos apskričių) per 23 dienų laikotarpį. Baltažiedžių notrelių žolė buvo rinkta iš kaimų apylinkėse esančių pievų: Viduklės (Raseinių raj.), Puskelnių (Marijampolės raj.), Burbiškių (Anyksčių raj.), Degučių (Zarasų raj.), Likiškėlių (Alytaus raj.) ir Paežerių (Biržų sav.) kaimų. Miestuose esančių parkų: Rėkyvos parko (Šiaulių m.), ir Kleboniškio miško parko (Kauno m.). Taip pat baltažiedžių notrelių žolė buvo rinkta iš kelių regioninių parkų: Rambyno regionino parko (Pagėgių sav.) ir Žagarės regioninio parko (Žagarė m.) bei miškų: Palangos miško (Palangos m.), Stumbrių mišo (Rietavo sen.), Bukčių miško (Vilniaus m.) ir Druskininkų miško (Druskininkų m.).
3.4.1. Suminės fenolkarboksirūgščių koncentracijos įvairavimas baltažiedžių
notrelių žolėje iš įvairių Lietuvos regionų
Didžiausia (p < 0,05) fenolkarboksirūgščių koncentracija (63,25 ± 1,25 mg CAE/g) nustatyta Palangos miške rinktoje baltažiedžių notrelių žolėje. Kitos 2 augavietės, kuriose rinktoje baltažiedžių
notrelių žolėje nustatyta didžiausia koncentracija fenolkarboksirūgščių yra Paežerių kaimo apylinkė (Biržų raj.) - 57,24 ± 0,42 mg CAE/g ir Žagarės regioninis parkas (Žagarės m.) - 56,04 ± 0,67 mg CAE/g. Mažiausi fenolkarboksirūgščių kiekiai nustatytai Rambyno regioniniame parke (39,08 ± 0,80 mg CAE /g), Puskelnių kaimo apylinkėse - 40,85 ± 0,55 mg CAE/g ir Bukčių miške - 41,55 ± 0,73 mg CAE/g rinktose baltažiedžių notrelių žolėse. Gauti rezultatai pateikti 7 pav. Nustatytas vidutinis fenolkarboksirūgščių kiekis visuose mėginiuose buvo 50,49 ± 0,86 mg CAE/g.
7 pav. Fenolkarboksirūgščių koncentracijos įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje iš įvairių Lietuvos regionų (SP < 4 proc., n=3)
3.4.2. Bendros flavonoidų koncentracijos įvairavimas baltažiedžių notrelių žolėje
iš įvairių Lietuvos regionų
Baltažiedžių notrelių žolės mėginių, surinktų iš skirtingų Lietuvos regionų, bendro flavonoidų kiekio analizė parodė kitokius rezultatus nei fenolkarboksirūgščių analizė. Nustatyta flavonoidų vidutinė koncentracija (20,37 ± 0,34mg RE/g) buvo daugiau kaip du kartus mažesnė nei tuose pačiuose baltažiedžių notrelių žolės ekstraktuose nustatyta fenolkarboksirūgščių koncentracija.
Daugiausia (p < 0,05) flavonoidų – 29,12 ± 0,56 mg RE/g buvo nustatyta Žagarės regioniniame parke (Žagarės m.), o mažiausiai – 14,95 ± 0,45 mg/g Viduklės kaimo apylinkėse (Raseinių raj.) rinktose baltažiedžių notrelių žolėse. Taip pat dideli kiekiai flavonoidų nustatyti Paežeių kaimo apylinkėse bei Palangos miške rinktose baltažiedžių notrelių žolės ekstraktuose.
EFG DEFG CD H CDE AB A A CDEF EFG FG BC G G 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 F en olk ar b ok si rū gščių k on ce n tr ac ija m g CA E /g
