LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS
FAKULTETAS
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija
Vaida Palačenkait÷
Kiaulių miostatino geno polimorfizmas ir jo ryšys su m÷sos
kokybiniais bei kiekybiniais rodikliais
Magistro darbas
Darbo vadovas:
e.prof.p. Ilona Miceikien÷
Magistro darbas atliktas 2007 – 2008 metais Lietuvos veterinarijos akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Magistro darbą paruoš÷: Vaida Palačenkait÷
(v., pavard÷) (parašas)
Magistro darbo vadovas: e.prof. p. dr. I.Miceikien÷ (LVA, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra)
(parašas)
Recenzentas:
TURINYS
Santrumpų sąrašas...4
Įvadas...6
1. LITERATŪROS APŽVALGA...7
1.1. Genai, įtakojantys kiaulienos kiekį ir kokybę...7
1.2. Miogenino (MYOG) genas...7
1.3. Leptino (LEP) genas...8
1.4. Augimo hormono (GH) genas...8
1.5. Rapole (RN) genas...9
1.6. Halotano (HAL) genas...9
1.7. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas...11
1.8. Kiaulių selekcija genetinių žymenų pagalba...11
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA...13
2.1. Tyrimų medžiaga ir metodai...13
2.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷s...14
2.3.DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio ląstelių...14
2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas...14
2.5. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija...15
2.5.1. Kiaulių miostatino geno MYF5 (PGR-RFIP) tyrimo metodika………..15
2.6. Statistin÷ duomenų analiz÷...16
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS...17
3.1. Kiaulių miostatino geno polimorfizmo ištyrimas...17
4. IŠVADOS...22
5. SUMMARY...23
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
ATP – adenozintrifosfatas bp – bazių pora
CRC – halotono genas
DFD – tamsios, kietos, sausos m÷sos sindromas (dark, firm, dry) DNR – dezoksiribonukleinin÷ rūgštis
DTT - dithiotreitolis
ESR – estrogenų receptorius GH – augimo hormono genas
GHR – augimo hormono receptorius
GHRH – augimo hormoną atpalaiduojančio receptoriaus genas GHRHR – augimo hormoną atpalaiduojanč receptorius
H-FABP –riebiąsias rūgštis jungiantis baltymo genas IGF-I – insulino augimo faktorius
MC1R - melanocitus stimuliuojančio hormono receptoriaus genas MC4R – melanokortino 4 receptorius
MHS – stresinį sindromą sąlygojantis genas MYOG – miogeno genas
PGR – polimerazin÷ grandinin÷ reakcija PIT-1 – hipofiz÷s transkripcijos faktorius
PSE – blyškios, minkštos, vandeningos m÷sos sindromas (pale, soft, exudative) RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas
RN – Rapole genas
QTL – kokybinių požymių lokusai OD - optinis tankis
TaqI – restriktaz÷ TAE – TAE buferis
Darbo tikslas
Ištirti miostatino geno įvairovę kiaulių tarpe ir nustatyti polimorfizmo įtaką kiaulių produktyvumo savyb÷ms.
Darbo uždaviniai
• Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie miostatino geną.
• Įdiegti kiaulių miostatino geno tyrimo metodiką LVA K.Janušausko Gyvūnų genetikos laboratorijoje.
• Ištirti miostatino geno įvairovę kiaulių tarpe, naudojant sumodeliuotus pradmenis pagal geno seką.
• Suformuoti fenotipinių požymių duomenų bazę.
• Ištirti miostatino geno įvairov÷s įtaką kiaulių produktyvumo savyb÷ms.
Darbo naujumas
• LVA Gyvūnų genetikos laboratorijoje įdiegta kiaulių miostatino geno, ištyrimo metodika.
•
Pirmą kartą ištirtas miostatino geno polimorfizmas bei jo variantų įtaka kiaulių produktyvumo savyb÷msPraktinis pritaikymas
Įdiegta metodika leidžia ištirti kiaulių genome miostatino geną, nustatyti alelių polimorfizmą ir įvertinti jo poveikį kiaulių fenotipin÷ms savyb÷ms.
Siūloma atsižvelgti į kiaulių genome esančio miostatino geno polimorfizmą, atrenkant ir parenkant gyvulius, turinčius ekonomiškai naudingus alelius, kad būtų galima pagerinti produktyviąsias savybes.
ĮVADAS
Kiaulių produktyviąsias savybes veikia tiek fenotipiniai, tiek genetiniai faktoriai. Kiaulių autosomose atrasti genai arba genų grup÷s, lemiantys vislumą, pen÷jimosi spartą, raumeningumą, m÷sos kokybę, rezistentiškumą ligoms. Gyvulių atrinkimas veisimui, pagal konkrečius genus, leidžia suformuoti bandas su pageidaujamais požymiais.
Pasaulyje, paskutiniu dešimtmečiu kiaulių genetikoje susidom÷ta esamais kiekybinių požymių lokusais bei jų įtaka skerdenos sud÷ties pokyčiams (t.y. riebalų šalinimui bei liesos m÷sos didinimui) ir skerdenos kokybei , tai svarbiausios šios charakteristikos apibr÷žiančios skerdenos kokybę ir vartotojų poreikį. Kiekybinių požymių lokusų įtakos galvijų bei kiaulių augimo greičiui ir skerdenos sud÷čiai tyrimai buvo aprašyta eil÷je publikacijų (Alexandra et al., 1997; Switonski, 2002; Di Stasio et al., 2003).
Tačiau, kadangi aukštus kokybinius ir kiekybinius rodiklius įtakoja eil÷ genų bei genų grupių, kurių ekspresija ne visada būna vienoda, tod÷l, prieš įtraukiant į selekcijos programas, geno žymenio įtaką būtina įvertinti konkrečiose kiaulių veisl÷se (Chikuni et al., 1997; Grochowska et al., 1999; Curi et al., 2005).
Lietuvos veterinarijos akademijoje veikianti K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija vykdo naminių gyvūnų ir paukščių paveldimų ligų ir ydų tyrimus, užsiima selekcijos efektyvumo, gyvulių produktyvumo bei pieno ir m÷sos kokyb÷s gerinimu molekulinių genetinių metodų pagalba, vykdo žem÷s ūkio gyvūnų genetinių išteklių monitoringą. LVA gyvūnų genetikos laboratorijoje buvo atlikti tyrimai ir nustatyta melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių augimo greičiui ir skerdienos kokybei, o taip pat buvo analizuota kiaulių stresinį sindromą sąlygojančio geno (MHS) įtaka kiaulių sveikatingumui, produktyvumui ir reprodukcin÷ms savyb÷ms (Jokubka and Miceikien÷, 2001; Malevičiūt÷ et al., 2002; Jokubka and Miceikien÷,2003:).
Yra žinoma visa eil÷ genų įtakojančių kiaulienos produkcijos kiekį bei kokybę. Tai miostatino, leptino, augimo hormono, augimo hormono receptoriaus, halotano ir kt. genai (Switonski, 2002). Lietuvoje miostatino geno įtaka kiaulių produktyvumui, produkcijos kokybei bei reprodukcin÷ms savyb÷ms nebuvo tyrin÷ta.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Genai, įtakojantys kiaulienos kiekį ir kokybę
Kiaulių DNR yra išsid÷sčiusi 19 chromosomų porų ir sudaryta iš daugiau kaip 100 tūkstančių funkcionuojančių genų. Kiaulių atrinkimas pagal genetinius markerius gali tur÷ti svarbią įtaką kiaulienos kiekiui ir kokybei.
1.2. Miogenino (MYOG) genas
Miogeno (MYOG) geno pagrindinis vaidmuo yra raumenų diferenciacija, kontroliuojant miofibrilių susidarymą. M÷siniuose gyvuliuose, tokiuose kaip kiaul÷s ir galvijai, miofibrilių skaičius yra susijęs su augimo galia. Saumillion A. ir kt. (Saumillion, 1997) išanalizavo kiaulių MYOG geno genetinį kintamumą ir jo ryšį su augimo savyb÷mis. MYOG geno fragmentai buvo išskirti naudojant PGR ir patikrinti pagal genominę biblioteką su keturių žmonių MyoD DNR fragmentais. Ir egzonų, ir promotoriaus regionai buvo labai panašūs į žmogaus ir pel÷s genus. Sautern bloto 105 negiminingų kiaulių analiz÷ parod÷ tris polimorfines MspI sritis, esančias geno promotoriaus regione, antrame introne ir 3’ krašte. Buvo sukurti PGR-RFIP testai, randantys keturis MYOG alelius. PGR-RFIP testai ir mikrosatelitų žymenys suteik÷ galimybę genotipuoti didelį kiaulių skaičių, norint išanalizuoti m÷sos atsid÷jimo ir augimo savybių genetinį ryšį. MyoD geno šeima sudaryta iš keturių struktūriškai artimų genų – tai MYOD1, MYOG, MYF5 ir MYF6. Šie genai koduoja pagrindinius spiral÷-kilpa-spiral÷ (bHLH) baltymus ir susiję su raumeninių ląstelių diferenciacija tiek in vitro, tiek in vivo. MYOG yra vienintelis MyoD genas, kuris randamas visų skeleto raumenų ląstelių linijose. Pagrindinis MYOG vaidmuo raumenų diferencijos procese, manoma, gali būti susijęs su skirtingais mioblastų ir miofibrilių kiekiais. Norint nustatyti skirtingų MYOG alelių įtaką kiaulių raumenų vystimuisi ir augimui, reikia išskirti genominius MYOG fragmentus ir apibūdinti keturis haplotipus, esančius MspI srityje. Greitas PGR-RFIP testas suteikia galimybę nustatyti ryšius susijusius su augimo savyb÷mis (Saumillion, 1997). Myf-5 ir MyoD1 genai ekspresuojami proliferuojančiose pirmin÷se ląstel÷se, vadinamomis mioblastais. Myf-6 genas iš esm÷s ekspresuojamas pogimdyminiu periodu (Pas, 1999).
1.3. Leptino (LEP) genas
Kiaulių riebumas yra vienas iš ekonomiškai svarbių požymių, kadangi rinka pageidauja liesesn÷s kiaulienos, be to, riebalų kiekio padid÷jimas reikalauja didesnių pašarų sąnaudų. Leptinas yra 16 kDa baltymas, išskiriamas baltųjų riebalų ląstelių (adipocitų), kuris reguliuoja pašaro įsisavinimą, energijos sunaudojimą bei viso organizmo energijos balansą. Leptino geno mutacijos nulemia visiškai nutukusio fenotipo ob/ob pasireiškimą pel÷se (Jiang, 1999).
Leptiną išskiria riebalinis audinys ir nulemia svorio praradimą graužikams, sumažinant pašaro įsisavinimą ir padidinamas energijos suvartojimas. Pastaraisiais metais daug tyrimų atliekama norint išsiaiškinti leptino įkatą svorio reguliavime, paaiškinant nutukimo fiziologiją. Leptinas yra svarbus ne tik svorio reguliavimui ir energijos balansui, bet taip pat veikia kaip metabolinis ir neuroendokrininis hormonas. Leptino receptoriai buvo rasti choroidiniame rezginyje ir pagumburyje, taip pat hipofizio liaukoje skirtingose rūšyse, tokiose kaip žiurk÷s ir pel÷s, kiaul÷s, avys ir žmogus.(Barata et.al., 2002; Saleri et al., 2002).
1.4. Augimo hormono (GH) genas
Augimo hormono geno pasireiškimo kelias susideda iš skirtingų tarpusavyje susijusių genų, tokių kaip GH (augimo hormonas), IGF1 (insulino augimo faktorius), PIT1 (hipofiz÷s transkripcijos faktorius), GHRH (augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas), somatostatinas, GHRHR (augimo hormoną atpalaiduojančio hormono receptorius), GHR (augimo hormono receptorius) veiklos. Riebalų storis ir vidutinis dienos prieaugis yra labai svarbūs požymiai kiaulienos produkcijai, nes jie koreliuoja su augimu ir liesos m÷sos kiekiu skerdenoje. GH genas yra susijęs su šiais dviem požymiais. Tyrin÷damas ApaI ir HinpI polimorfizmą, Knorr ir kiti (1997) rado ryšį tarp genų variantų ir riebalų savybių ir padar÷ išvadą, kad GH lokusas turi būti atidžiai ištirtas ir įtrauktas į naudingas selekcija žymenų pagalba programas. Panašiai, Yu ir kiti (1995, 1999), Franco Mauricio ir kiti (2005) ištyr÷ ryšį tarp PIT1 polimorfizmo ir skerdenos bei požymių savybių ir pareišk÷, kad šis genas gali būti genas kandidatas, tiriant kiaulių QTL (kokybinius požymių lokusus) (Pierzchala et al., 2004).
Kiaulių augimo hormono genas yra sudarytas iš 190 amino rūgščių ir jį išskiria priešakin÷s hipofiz÷s somatotropin÷s ląstel÷s. GH genas yra randamas 12 chromosomoje. GH genas yra žinomas, kaip turintis didelę įtaką kiaulių skerdenos kokybei (Sun et al., 1997).
1.5. Rapole (RN) genas
Jeigu didžioji dalis pjetr÷nų savo genome turi streso (halotano) geną, tai hempšyrų ir su jais poruotų kiaulių 15-toje chromosomoje yra atrastas RN genas. Pastarasis genas taip pat blogina m÷sos kokybę, ypač kumpio.
RN geno neigiamų pasekmių priežastis yra glikogeno kiekio padid÷jimas raumenyje, tose kiaul÷se, kurios turi geną. Šis genas egzistuoja 2 alelinių genų formoje: rn + alelinis genas (normalus alelinis genas) ir RN-alelinis-genas (alelinis genas su neigiamu efektu N). Ligi šiol, šis genas buvo surastas Hempšyrų veisl÷je ir Hempšyrų mišrūnų linijose. Nepalankus alelinis genas (RN-) paveikia technologinę m÷sos kokybę, radikaliai didindamas glikogeno kiekį. Glikogenas yra susikaupusio cukraus kiekis, kurio atsargos yra kaupiamos kepenyse ir raumenyse. Po skerdimo, glikogenas raumenyse yra paverčiamas į pieno rūgštį, kuri sumažina raumens pH. Tod÷l, kuo daugiau glikogeno yra raumenyje, tuo pieno rūgšties bus daugiau pagaminta ir tuo bus žemesnis galutinis raumens pH. Padidintas pieno rūgšties kiekis, gali būti priežastis to, kad raumens pH nukrenta žemiau 5,5 per 24 valandas po skerdimo. "Rūgšti m÷sa" labai panaši savo savyb÷mis į išblyškusią, minkštą ir vandeningą (PSE) m÷są, sukeltą PSS geno. Iš tikrųjų, kai PSS genas dalyvauja, jis stiprina padarinį RN geno m÷sos kokybei. Skirtingai nuo Hal geno, RN genas turi poveikį turiniui, bet ne normai, pH nukritimo (pH 24 val. <5.5), kuris priveda prie “ rūrščios m÷sos”, geriau žinomos kaip Hampšyro padarinys. RN-alelinio geno pasekm÷ yra vandeninga m÷sa (4% skirtumas) ir padid÷ję virimo nuostoliai (8 % skirtumas), sąlygojantis didelius finansinius nuostolius. Neseni atradimai molekulin÷je genetikoje, leido nustatyti RN geną 15 chromosomoje ir kitimą PRKAG3 gene, susijusiame su glikogeno kiekiu. Jie gali būti identifikuoti nauju molekuliniu metodu, geresnei šio geno kontrolei (Hamilton et al., 2001)
1.6. Halotano (HAL) genas
Halotano genas turi kelis pavadinimus. Jis dar vadinamas streso (STRES) genu, MH (hipertermijos) genu, CRC (kalcio pralaidumo kanalo) genu, RYR (riadonino receptoriaus) genu.
Intensyvinant selekciją m÷singumo gerinimo kryptimi, padid÷jo stresams jautrių kiaulių skaičius. Šį reiškinį sukelia kiaulių 6-oje chromosomoje sutinkamas recesyvinis halotano genas (n). Jeigu šis genas yra homozigotin÷s būkl÷s (nn), tokios kiaul÷s yra jautrios stresams. Literatūros ir atliktų tyrimų duomenimis, stresams jautrios kiaul÷s sunkiau negu jiems
atsparios išgyvena stresines situacijas, blogiau prisitaiko prie pakitusių aplinkos sąlygų, jautrios stresams kiaul÷s blogiau penisi, jų m÷sa šviesi, minkšta, vandeninga (angl., pale, soft, exudative – sutrumpintai žymima PSE) arba atvirkščiai – tamsi, kieta ir sausa (angl., dark, firm, dry – sutrumpintai žymima DFD). Jautrios stresams kiaul÷s yra raumeningesn÷s, tačiau jų m÷sa, kuriai būdingos PSE savyb÷s, yra blogos kokyb÷s, ne taip tinka perdirbti, ypač rūkytiems gaminiams, prastesn÷ jos prekin÷ išvaizda. Tokią m÷są perdirbant did÷ja gamybos kaštai, maž÷ja produkcijos išeiga, o galiausiai – blog÷ja ekonominiai kiaulienos gamybos rodikliai (Leach et al., 1996; Hamilton et al., 2001)
Įvairių veislių kiaul÷s į stresus reaguoja skirtingai. Labai produktyvių veislių gyvuliai yra jautresni. Dažniausiai tai m÷sinių veislių kiaul÷s, ilgai selekcionuotos m÷singumo gerinimo kryptimi. Tokių gyvulių organizme vykstantys intensyvūs metabolizmo procesai skatina mas÷s augimą, o adaptacin÷s savyb÷s prast÷ja. Apibendrintais įvairių užsienio šalių literatūros duomenimis, jautriausi stresams yra pjetr÷nai ir įvairios selekcijos landrasai. Be to, stresams jautresni yra kuiliukai negu kiaulait÷s (Kriauzien÷ ir kt., 2005)
Kiaulininkyst÷je daugelį stresinių situacijų būtina pašalinti, tačiau jų visiškai išgyvendinti neįmanoma. Tod÷l greta m÷singumo gerinimo turi būti vykdoma ir stresams atsparesnių kiaulių atranka. Kiaulių stresinę reakciją galima nustatyti daugeliu metodų, tačiau tiksliausią stresams atsparesnių kiaulių atranką galima padaryti, naudojant genotipinio įvertinimo metodus. Daugelyje pasaulio šalių sparčiai diegiamas genetinių žymenų metodas (polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos metodas, sutrumpintai žymimas PGR). Juo galima ištirti įvairaus amžiaus kiaules. Tam užtenka iškirpti ausies gabaliuką, galima paimti spermos, kraujo arba šerių su šaknel÷mis pavyzdžius, kurie laboratorijoje specialiai apdorojami ir iš jų išskiriama DNR (deoksiribonukleinin÷ rūgštis). Analizuojant DNR grandinę, genetinių žymenų metodu nustatomos ne tik jautrios stresams kiaul÷s (nn), bet ir tos, kurios yra heterozigotin÷s (Nn) ir su visiškai dominuojančiais atsparumo stresams genais (NN). Šis metodas įdiegtas ir Lietuvoje.
1.7. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas
Genas yra lokalizuotas kiaulių 1 chromosomoje q22-27 regione. MC4R genas vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant kiaulių medžiagų apykaitos energijos balansą, riebalų atsid÷jimą, augimo greitį ir maisto medžiagų pasisavinimą. Kiaulių energijos balansas remiasi energijos suvartojimu iš maisto medžiagų kūno energijai ir medžiagų apykaitai.
Melanokortino 4 receptoriaus lokuso nustatytas pleotropinis poveikis produktyvumo savyb÷ms: paros priesvoriui (g), nugaros lašinių storiui (mm), raumeningumui (%). Šis genetinis žymuo gali būti naudojamas veisimo tikslais atrenkant gyvulius pagal tokius požymius kaip riebalų atsid÷jimas, augimo greitis bei pašarų pasisavinimas. Atlikus tyrimus Lietuvoje nustatyta, melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių augimo greičiui ir skerdienos kokybei. (Jokubka ir kt., 2003;Miceikien÷ ir kt., 2007).
1.8. Kiaulių selekcija genetinių žymenų pagalba
Dabartin÷s kiaulininkyst÷s tikslą galima būtų įvardinti kaip selekcijos proceso spartinimą veisiant aukšto produktyvumo, atsparias ligoms bei aplinkos veiksniams, genetinių defektų neturinčias kiaules, iš kurių gaunama produkcija būtų saugi žmonių mitybai, o jos perdirbimas produktų gamybai reikalautų kuo mažiau ekonominių, energetinių bei laiko sąnaudų. Vienas iš būdų per trumpesnį laiką pasiekti šiuos tikslus yra naujų biotechnologinių metodų, tokių kaip genetinių žymenų (MAS), diegimas ir taikymas selekcijoje. Genas ar genų grup÷, lemianti tam tikrą požymį, yra vadinama genetiniu žymeniu. Genetinių žymenų įjungimas į veisimo programas leidžia padidinti selekcijos efektyvumą ir prapl÷sti požymių, kuriais galima efektyviai manipuliuoti, spektrą. Panaudojant žymenis, galima vykdyti selekciją tiek pagal vieną požymį, kurį lemia vienas genas, tiek pagal vieną ar kelis požymius, kuriuos lemia keletas genų. Kiaulių veislininkyst÷je naudojamus genetinius žymenis galima suskirstyti į dvi grupes:
Kai požymį lemia vienas genas:
HAL genas - esantis 6 chromosomoje, lemiantis jautrumą stresams, pablog÷jusią m÷sos kokybę ir tuo pačiu įtakojantis didesnį raumeningumą;
RN genas - esantis 15 chromosomoje, lemiantis pablog÷jusią m÷sos kokybę; ESR genas - esantis 1 chromosomoje, lemiantis paršelių skaičių lizde.
Kai požymį lemia genų grup÷, vadinama "kiekybinių požymių lokusu": OPN lokusas - esantis 8 chromosomoje, lemiantis paršelių skaičių lizde;
Lokusas 4 chromosomoje, įtakojantis pen÷jimosi spartą;
K 88 lokusas, esantis 13 chromosomoje, lemiantis atsparumą kai kurioms ligoms.
Taigi, atsiradus naujiems - molekuliniams - genotipo įvertinimo metodams, atsiveria naujos galimyb÷s kiaulių selekcijoje. Ją galima vykdyti pagal šiuos genetinius žymenis (EPL - ekonominių požymių lokusus):
• m÷sos kokyb÷s rodiklius - m÷sos pH (rūgštingumą), vandens rišlumą, tarpraumeninių riebalų kiekį sąlygojančius genų žymenis;
• reprodukcines savybes - paršelių skaičių vadoje sąlygojantį estrogeno receptoriaus žymenį;
• produktyvumo požymius - pen÷jimosi intensyvumo lokuso žymenį, m÷singumo lokuso žymenį;
• sveikatingumo požymius – organizmo bendro atsparumo ligoms (MHC) lokuso žymenis, organizmo atsparumo stresams (HAL) geno žymenį.
Išvardinti pagrindiniai rodikliai yra svarbūs kaip objektas, atliekant kiaulių genetinius tyrimus. Žem÷s ūkio gyvulių genomų tyrimai sudar÷ sąlygas žem÷s ūkio gyvulių genetinių žem÷lapių sudarymui, o jų palyginimas leido atlikti genų, susijusių su kiekybinių požymių lokusais, paiešką. Gyvulių genomo genetiniai žem÷lapiai yra pritaikyti atliekant kelių lokusų sąsajų, lokusų ir genų, susijusių su kiaulių ekonomiškai naudingais požymiais, tyrimus. Nežiūrint į tai, nustatytų kiekybinių požymių lokusų skaičius vis dar yra nedidelis, o nustatytų atskirų genų, kurie yra identifikuoti kaip atsakingi už kiekybinius požymius skaičius – dar mažesnis. Nustatyti pavieniai genai, susiję su kiekybinių požymių lokusais, įtraukiami į veisimo programas, derinant juos su įprastiniais fenotipiniais selekciniais metodais – atliekant gyvulių selekciją genetinių žymenų pagalba (MAS). Toks kombinuotas populiacijos selekcijos būdas daug efektyvesnis ir rezultatai pasiekiami per trumpesnį laiko tarpą.
Genetinių žymenų, kurie gali būti panaudoti selekcijoje, paieška yra pagrįsta dvejomis strategijomis: kiekybinių požymių lokuso kartografavimu ir potencialių genų įtakos nustatymu. Kiekybinių požymių lokusų paieška, atliekant pilną genomo skenografiją, yra apibūdinama kaip chromosomų segmentų, kuriuose yra lokalizuoti kandidatiniai genai, atsakingi už požymį, tyrimas, nenustatant konkretaus geno ar mutacijos. Kandidatinio geno tyrimo būdas yra parankus, kadangi yra tiriami vienas ar keletas konkrečių genų, kurie, manoma, turi įtakos tiriamiems požymiams (Miceikien÷ ir kt., 2007).
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimų medžiaga ir metodai
M÷giniai tyrimams imti Valstybin÷je kiaulių veislininkyst÷s stotyje Baisogaloje laikomų 40 kiaulių .
Tyrimų metodai
DNR skyrimas iš plaukų
Kiaulių miostatino geno padauginimas polimeraz÷s grandin÷s reakcijos metodu (PGR);
Kiaulių miostatino geno variantų identifikavimas restrikcinių fragmentų ilgio polimorfiškumo tyrimo metodu (RFIP).
Miostatino geno variantų frakcionavimas horizontalios elektroforez÷s metodu agaroz÷s gelyje bei gelio dažymas etidžio bromidu; analiz÷ Herolab video dokumentavimo sistema.
Kiaulių produktyvumo ir produkcijos kokyb÷s požymių duomenų baz÷s suformavimas.
Miostatino geno įtakos kiaulių produktyvumo ir produkcijos kokyb÷s savyb÷ms įvertinimas.
2.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷s
Buvo surinkti duomenys ir suformuota kiaulių sekančių požymių duomenų baz÷: Pen÷jimosi savyb÷s –
amžius skerdimo metu, d.; amžius esant 100 kg mas÷s, d.; priesvoris per parą, g.; suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį; pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.
M÷sin÷s savyb÷s –
šiltos skerdienos mas÷, kg; skerdienos pusel÷s ilgis, cm; bekono pusel÷s ilgis, cm; nugaros raumens plotas, cm²; kumpio mas÷, kg; lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm; lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm; lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm; lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu; lašinių storis taške Fat1, mm; lašinių storis taške Fat2,mm; raumeninis
storis taške Fat2, mm; raumeningumas, %.
2.3. DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio ląstelių
Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. Paruošiamas lizavimo mišinys (DTT -7,5 µl, Chelex- 200µl, Protenaze K (20mg/ml)- 10.7µl). M÷gintuv÷lio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2µl paruošto mišinio). M÷gintuv÷liai 30s. maišomi maišykl÷s „Vortex" pagalba. Centrifuguojami l0 s 13500 aps./min. greičiu. Pavyzdžiai 30 min. inkubuojami 56°C temperatūroje. Po inkubacijos m÷giniai (po 10µm) pakaitinami 94°C temperatūroje (inaktyvuojami - amplifikatoriuje) bei paliekami nakčiai.
2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genomin÷s DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba. Tam tikslui paruošiamas l00 µl skiestos DNR tirpalas: imama l0 µl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50ug dvigrand÷s DNR.
DNR kokyb÷ įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų
koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genomin÷s DNR valymą.
.
2.5. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija (PGR)
Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija yra metodas, pavadintas pagal DNR polimerazę, fermentą, vykdantį DNR replikaciją ląstel÷je. Tai yra nukleino rūgščių sintez÷s in vitro metodas, kuriuo laboratoriniame m÷gintuv÷lyje gali būti specifiškai padauginti (amplifikuoti) atskiri DNR fragmentai. PGR metodas yra labai jautrus, tod÷l padauginti pasirinkta DNR atkarpa gali sudaryti netgi vieną milijoninę bendro DNR pavyzdžio dalį. Tai reiškia, kad, naudojant PGR galima amplifikuoti net ir vienintelį pasirinktą geną.
2.5.1. Kiaulių miostatino geno MYF5 (PGR-RFIP) tyrimo metodika
MYF-5 geno pradmenys:
Pirminis (5‘ CTCCGAATTAGTGTGGCTTC-3‘)
Atvirkštinis (5‘ –GTTCTTTCGGGACCAGACAGGCCTC-3‘) Mišinys PGR reakcijai:
PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (µl)
Geros kokyb÷s dejonizuotas vanduo ddH2O 2,75
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
MgCl2 (konc. 50mM) 1,5
dNTP miksas (2mM) 2,5
Pirminis pradmuo (darbin÷ konc. 10pmol) 2,5
Atvirkštinis pradmuo (darbin÷ konc. 10pmol) 2,5
BSA 0,25
Taq polymeraz÷ (1vnt./µl) aktyvumo 0,5
PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje GeneAmp ® PGR sitema 2700, AB Applied Biosystems.
PGR režimas:
95 OC, 5 min (pirmin÷ denatūracija) 94 OC, 45s (denatūracija),
60 OC 1 min (oligonukleotidų prisijungimas), 72 OC 1 min (DNR grandin÷l÷s sintez÷).
72 OC, Sintez÷s užbaigimui 10 min. Laikyti: 4 OC Reakcija atliekama 35 ciklus
MYF-5 geno variantų ištyrimas
PGR produktas – 322 bp
DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu HinfI, 370C per naktį. A (alelis) -322 bp. B (alelis) - 170 bp, 143 bp. A B 322bp 170bp 143bp
2.6. Statistin÷ duomenų analiz÷
Kiaulių miostatino alelių ir genotipų dažnumai tirtoje grup÷je, faktinis ir prognozuojamas heterozigotiškumas tirtuose lokusuose buvo apskaičiuoti R – statistiniu paketu.
Vertinant miostatino geno įtaką kiaulienos kiekybiniams ir kokybiniams rodikliams buvo atlikta vienfaktorin÷ dispersin÷ analiz÷ Vienfaktorin÷s analiz÷s būdu buvo įvertinta atskirų genų ir agreguotų genotipų įtaka fenotipiniams požymiams.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1. Kiaulių miostatino geno polimorfizmo ištyrimas
Viso buvo paimta 40 kiaulių m÷ginių, iš kurių buvo išskirta DNR, nustatyta jos koncentracija bei švarumas. Tiriamas genas buvo padaugintas polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos metodu, o aleliai identifikuoti skaldant gautus PGR produktus karpymo fermentu ...
Kiaulių miostatino geno rasti 2 skirtingi aleliai (1 lentel÷, 1,paveikslas). 1 lentel÷. Rastas MYF5 geno alelių skaičius tirtoje kiaulių grup÷je
Lokusas Alelių skaičius
MYF5 2
1 paveikslas.Miostatinas (MYF – 5):1-markeris, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 – PGR ; 3, 9, 11, 19 - AA genotipas;5, 7, 13, 15, 17 – AB genotipas.
Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą visoje tirtoje gyvulių grup÷je faktinis heterozigotiškumas buvo rastas didesnis, nei teorinis, kas rodo pakankamą genetin÷s įvairov÷s kiekį tirtame lokuse, nors skirtumas n÷ra statistiškai reikšmingas. (2 lentel÷).
2 lentel÷. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas tirtame geno lokuse
Lokusas H faktinis H teorinis χ
2
– kriterijaus reikšm÷ (P – reikšm÷)
MYF5 0,550 0,439 2,57 (p=0,276)
Kiaulių MYF5 geno A alelis rastas 0,675 dažniu, o B alelis 0,325 dažniu; AA genotipą tur÷jo 40 proc. tirtų kiaulių, AB genotipą 22 proc. o BB genotipą 5 proc. (3 lentel÷).
3 lentel÷. MYF5 genotipų ir alelių dažniai
MYF5 N Dazniai Aleliai Dazniai
AA 16 0,400 A 0,675
AB 22 0,550 B 0,325
BB 2 0,050
40 1 1
Siekiant įvertinti MYF5, geno įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms buvo suformuota sekančių fenotipinių požymių duomenų baz÷ - šiltos skerdenos mas÷, skerdenos pusel÷s ilgis, bekono pusel÷s ilgis, nugaros raumens plotas, kūno mas÷, lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, lašinių storis ties 10 šonkauliu, lašinių storis ties paskutiniu juosmens slaksteliu, lašinių storis taške Fat1, lašinių storis taške Fat2, raumens storis taške Fat2, raumeningumas.
Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal MYF5 geno homo ir heterozigotinius genotipus (4 lentel÷). Kiaulių miostatino geno MYF5 B alelis didina šiltos skerdenos masę, skerdenos pusel÷s ilgį, bekono pusel÷s ilgį, nugaros raumens plotą ir raumeningumą. Geriausius m÷sines savybes tur÷jo MYF5 geno BB genotipo kiaul÷s (4 lentel÷).
4 lentel÷. MYF5 geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms Genotipa s n Šiltos skerdenos mas÷, kg Skerdenos pusel÷s ilgis, cm Bekono pusel÷s ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² Kumpio mas÷, kg
Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm AA 16 75,04± 0,230 a 99,2± 0,503 78,06± 0,423 39,53± 0,981 11,77± 0,059 18,13± 0,890 A AB 22 75,47± 0,041 b 99,13± 0,331 78,32± 0,357 37,51± 1,136 11,66± 0,071 20,8± 1,093 B BB 2 75,50± 0,000 100,50± 0,500 79,50± 0,500 41,70± 2,900 11,81± 0,210 18,15± 1,000 a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje
(p<0,05)
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05)
4 lentel÷ (tęsinys). MYF5 geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms Genotip
as n
Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm
Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm Lašinių storis taške Fat2, mm Raumens storis taške Fat2, mm Raumeningumas, % AA 16 16,88± 1,210 17,38± 0,916 15,63± 0,926 A 44,88± 1,661 54,54± 0,953 A AB 22 19,53± 1,143 19,8± 1,050 18,05± 1,012 B 43,05± 1,494 52,18± 0,989 B BB 2 16,15± 1,000 17,65± 0,500 13,50± 1,500 43,00± 0,000 55,55± 0,550 a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje
(p<0,05)
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05)
Siekiant įvertinti MYF5, geno įtaką pen÷jimosi rodikliams buvo suformuota sekančių fenotipinių požymių duomenų baz÷ – amžius skerdimo metu, amžius esant 100 kg mas÷s, priesvoris per parą, suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį, pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.
Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal MYF5 geno homo ir heterozigotinius genotipus. Mažiausias amžius esant 100 kg mas÷s buvo kiaulių, turinčių MYF5 geno BB genotipą, mažiausias suvartotas pašarų per pen÷jimosi laikotarpį kiekis bei mažiausios pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių su MYF5 geno genotipu AA(5 lentel÷).
5 lentel÷. MYF5 geno įtaka kiaulių pen÷jimosi savyb÷ms
Genotipas n Amžius skerdimo metu,d. Amžius esant 100 kg mas÷s, d. Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio AA 16 173,63±3,519 A 179,77±3,859 747,8±23,372 a 177,33±2,244 a 2,67±0,039 a AB 22 181,50±2,878 B 187,47±2,939 686,93±16,687 b 183,32±1,426 b 2,78±0,023 b BB 2 167,00±10,00 174,08±10,67 712,38±67,381 182,85±0,25 2,81±0,025 a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje
(p<0,05)
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05)
Liesos m÷sos svoris galvijų, kiaulių ir kitų gyvulių organizme priklauso nuo miofibrilių skaičiaus. Kiaul÷s, turinčios daugiau raumeninių skaidulų greičiau auga ir turi didesnę raumeninę masę. Mutacija, suardanti normalią baltymų veiklą miostatino gene nulemia dvigubo raumeningumo fenotipą (Pas, 1999). Miostatinas priklauso augimo faktoriaus β šeimai ir yra ekspresuojamas skeleto raumenyse tiek embrioniniu, tiek poembrioniniu laikotarpiais. Miostatinas užkerta kelią besaikei mioblastų diferenciacijai. Esant funkcijos praradimo mutacijai miostatinas gali gaminti papildomas raumenų skaidulas, d÷l ko susiformuoja raumenų hiperplazija (Guimaraesa, 2007).
Koduojanti miostatino seka apima 1128 bp (McPherron and Lee, 1998). Dvi šio geno iššifruotos sekos buvo rastos kiaulių raumenyse bei pieno liaukose - 800 ir 1500 ilgio (Sonstegard et al., 1998). Šis genas sudarytas iš trijų egzonų , kurių ilgiai 373, 374 ir 381 bp atitinkamai. Aktyvi baltymo forma apima 376 amino rūgštis (Stratil and Kopečny, 1999) . Kai kurie geno pakitimai buvo aptikti, tačiau jų paplitimas labai nedidelis. Tai reiškia, kad kiaulių tarpe miostatino genas daug stabilesnis nei galvijų tarpe (Stratil and Kopečny, 1999). Geno stabilumą dar kartą patvirtina ir tai, kad didelio raumeningumo kiaul÷ms retai pasireiškia
raumenų hiperplazija. Tačiau joms būdinga raumenų hipertrofija, ypač Pjetr÷nų ir Belgijos landrasų veisl÷ms. Remiantis atliktais tyrimais teigiama, jog Jorkšyrų veisl÷s kiaul÷s geba geriau sintetinti baltymus raumenyse (Ezewke ir Martin, 1975), tod÷l jos raumeningesn÷s nei to paties amžiaus ir svorio kitų veislių kiaul÷s.
Specialistų grup÷ ištyr÷ 105 skirtingų veislių kaules ir 3‘ polimorfizmą jie aptiko visose tirtose kiaulių veisl÷se, išskyrus Meishan populiaciją. Ernst ir kolegos (1993) surado dominuojantį alelinį MYOD geną skirtingose kinų kiaulių veisl÷se (Fengjing, Meishan, Minzu), tai paaiškina kod÷l šių veislių kiaulių JAV ir Europoje yra tiek mažai.
Pagal mūsų gautus tyrimų rezultatus kiaulių miostatino genas veik÷ tiek m÷sines tiek pen÷jimosi savybes. Panašius tyrimų rezulatatus gavo ir kiti mokslininkai (Saumillion et al.,1997; Cieslak et al., 2003; Fausto et al.,2005).
Intensyvios gyvulininkyst÷s sąlygomis, kai pagrindinius reikalavimus diktuoja rinka, ypač svarbu yra tinkamai pritaikyti selekcijos ir genetikos pasiekimus. Kiaulininkyst÷je selekcijos procesas labiau nukreiptas į efektyvų heteroz÷s efekto panaudojimą. Pagrindiniais kiaulių gerinimo būdais išlieka kryžminimas bei linijų selekcija. Elitiniuose veislynuose yra išvedamos vertingos linijos, kurios dauginamos reprodukciniuose ūkiuose, o iš jų patenka į pramoninius, kuriose pl÷tojama komercin÷ kiaulininkyst÷ ir auginami hibridai m÷sai. Laikantis tokios selekcijos sistemos, kiaulininkyst÷je yra siekiama pagerinti kiaulių pen÷jimosi, m÷sines ir reprodukcines savybes, sukurti bekoninio ir m÷sinio tipo hibridus.
Tačiau pastaruoju metu kiaulių veislininkyst÷je drauge su ekonominiais, iki šiol laikytais pagrindiniais, selekcionuojamais požymiais vis didesnis d÷mesys kreipiamas į antraeilius – kokyb÷s ir sveikatos požymius. Manoma, kad ateityje sudarant kiaulių veislininkyst÷s programas būtina atkreipti d÷mesį į svarbiausių selekcionuojamų požymių biologinius ir genetinius ryšius, daugiau d÷mesio skirti gaunamos produkcijos kokybei, gyvulių sveikatingumui bei gerbūvio sąlygoms, o nustatant kiaulių veislinę vertę, taikyti metodus, kurie apjungtų fenotipo ir genetinę informaciją (Miceikien÷ ir kt., 2007).
4. IŠVADOS
1. Kiaulių MYF5 geno A alelis rastas 0,675 dažniu, o B alelis 0,325 dažniu; AA genotipą tur÷jo 40 proc. tirtų kiaulių, AB genotipą 22 proc. o BB genotipą 5 proc 2. Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą faktinis heterozigotiškumas buvo
rastas didesnis, nei teorinis, kas rodo pakankamą genetin÷s įvairov÷s kiekį ir sudaro prielaidas vykdyti gyvulių selekciją pagal miostatino geną.
3. Kiaulių miostatino geno MYF5 B alelis statistiškai reikšmingai didina šiltos skerdenos masę ir raumeningumą.
4. Geriausius m÷sines savybes tur÷jo MYF5 geno BB genotipo kiaul÷s.
5. Mažiausias amžius esant 100 kg mas÷s buvo kiaulių, turinčių MYF5 geno BB genotipą.
6. Mažiausios pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių su MYF5 geno genotipu AA.
5. SUMMARY
Master's work;
Master: Vaida Palačenkait÷
Topic of Master degree thesis: Polymorphism of pig myostatin gene and it‘s inluence to meat quantitative and qualitative traits.
Tutor: Ilona Miceikien÷
Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.
Master‘s work accomplished in the year 2007 – 2009, volume of Master work 26 pages original, 5 tables.
Object and tasks of work. Analyse and summarize literature about myostatin gene in pig. Introduce pig Myf 5 gene research methodology at K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics, LVA..Investigate Myf 5 gene polymorphism and distribution of different alleles and genotypes in pigs, create data base of phenotypic traits, investigate myostatin gene polymorhism influence to pig productive traits.
Research methodology. DNA extraction from hair roots; PGR to amplify MYF5 gene;RFLP method to identify mutation; Electrophoresis in agarose gel;.Staining with etidium Bromide Genotyping;.Statistical analysis of data.
Results and conclusions. There were found two alleles for pocine MYF5 gene allele with frequency 0,675 , B allele with frequency 0,325 ; AA genotype had 40 percent of tested pigs, AB genotype 22 percent, BB genotype 5 percent. Observed heterozigosity was found higher than expected what showed enough genetical variation and gave oportunity to use miostaytin gene as genetic marker in selection programs. Pig myostatin gene MYF5 B allele statistically significantly increased warm carcas weight and muscularity. The best meat traits had pigs with genotype BB. Also they had the lowest age while reaching 100 kg. Smallest feed intake for 1 kg makeweigt had pigs with genotype AA.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Alexandra C. McPherron and Se-Jin Lee. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997.Vol. 94, pp. 12457-12461.
2. Barata M., Saleri R., Mainardi G.L., Valle D., Giustina A., Tamanini C. Leptin Regulates GH Gene Expression and Secretion and Nitric Oxide Production in Pig Pituitary Cells. Endocrinology.2002. V.143(2), P.551-557.
3. Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Fukumoto Y. & Ozawa S. A simple method for genotyping thr bovine growth hormone gene. Animal Genetics. 1997. 28, 230
4. Cieslak D., Blicharski T., Kapelanski W., Pierzchala M. Investigation of polymorphisms in the porcine myostatin (GDF8; MSTN)gene. Czech J Anim Sci. 2003. 48: 69 – 75. 5. Curi R.A., Oliveira H.N., Silveira A.C. and Lopes C.R. Effects of polymorphic
microsatellites in the regulatory region of IGF1 and GHR on growth and carcass traits in beef cattle. Animal Genetics. 2005. Vol. 36. P. 58-62.
6. Ernst C.W., Vaske D.A., Larson R.G., Rothschild M.F. Rapid communication: MspI restriction fragment length polymorphism at the swine MYOG locus. Czech J Anim Sci.1993. 71, 3479.
7. Ezekwe, M.O. and R.J. Martin. Cellular characteristics of skeletal muscle in selected strains of pigs and mice and the unselected controls. 1975. Growth. 39:95.
8. Franco Mauricio M., Antunes Robson C., Silva Heyder D., Goulart Luiz R. Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs. J. Appl.Genet. 2005. v. 46(2), P.195-200.
9. Fausto Morena da Silva, Guimaraes Simone Eliza Facioni, Lopes Paulo Savio, Pires Aldrin Vieira, Guimaraes Marta Fonseca Martins, Barbosa da Silva Marcos Vinicius Gualberto, Schierholt Alexs Sandro, Silva Kleibe de Moraes and Gomide Lucio Alberto de Miranda. Association of MYF5 gene allelic variants with production traists in pigs. Genetic and Molecular Biology. 2005. 28, 3, 363 – 369.
10. Hamilton D.N., Ellis M., Miller K.D., McKeith F.K., Parrett D.F. The effect of the halothane and rendement napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs. Journal of Animal Science. 2001. N. 78. P. 2862 – 2867.
11. Grochowska R., Zwierschowski L., Snochowski M. and Reklewski Z. Stimulated growth hormone (GH) release in Friesian cattle with respect to GH genotypes. Reproduction Nutrition Development. 1999. Vol. 39. P. 171-180.
12. Guimaraes Simone, Stahl Chad, Lonergan Steven, Geiger Becky, Rothschild Max. Myostatin promoter analysis and expression pattern in pigs. Livestock Science. 2007. V. 112, P. 143-150.
13. Jokubka R., Miceikien÷ I. Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism screening for the HAL gene. Proceedings of the Latvian Academy of Sciences. ISSN 1407-009X. 2001. N. 5/6. P.237-241.
14. Jokubka R., Miceikien÷ I. A missence variation of melanocortin – 4 receptior gene (MC4R) in Lithuanian White pig breed. Proceedings of the 9th Baltic Animal Breeding Conference. Sigulda. 2003. P.65-67.
15. Yu, T-P., Tuggle C.K., Schmitz C.B., Rothschild M.F.. Association of PIT1 polymorphism with growth and carcass traits in pigs. J. Anim. Sci. 1995. V. 73, P. 282-288.
16. Jiang Zhi-Hua, Gibson John P. Genetic polymorphisms in the leptin gene and their association with fatness in four pig breeds. 1999. Mammalian Genome. V.10, P.191-193. 17. Knorr C., Moser G., Muller E. and Geldermann H. Association of GH gene variants with
performance traits in F-2 generations of European wild boar. Pietrain and Meishan pigs. Animal Genetics. 1997. Vol. 28. P. 124-128.
18. Kriauzien÷ Janina, Miceikien÷ Ilona, Masiulien÷ Angel÷, Baltr÷nait÷ Lina. HAL geno įvairov÷ S linijos kiaulių bandoje. Geno įtaka kiaulių reprodukcin÷ms savyb÷ms 2005. Veterinarija ir Zootechnika. T.30 (52).
19. Leach L.M., Ellis M., Sutton D.S. et al. The growth performance, carcass characteristics, and meat quality of halothane carrier and negative pigs. Journal of Animal Science. 1996. N.74. P. 934 – 943.
20. Malevičiut÷ J., Baltr÷nait÷ L., Pečiulaitien÷ N., Miceikien÷ I. Genetinių žymeklių panaudojimas gyvulių selekcijoje. Ūkininko patar÷jas. 2002. Nr.131 (1425).
21. McPherron A.C., Lee S. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12457-12461.
22. Miceikien÷ I., Baltr÷nait÷ L., Pečiulaitien÷ N., Kriauzien÷ J. Kiaulių veisimas ir genetika. Kaunas: Terra Publica. 2007. 58 psl.
23. Pas M.F.W., Soumillion A.,. Harders F. L,. Verburg F. J, Bosch, Galesloot P., The Meuwissen Influences of Myogenin Genotypes on Birth Weight, Growth Rate, Carcass Weight, Backfat Thickness, and Lean Weight of Pigs. 1999. J. Anim. Sci.. V.77. P.123-126.
24. Pierzchała Mariusz, Blicharski Tadeusz, Kurył Jolanta. Growth rate and carcass quality in relation to GH/MspI and GH/HaeII PCR-RFLP polymorhism in pigs. Poland, 2004. Animal Science Papers and Reports V. 22 N. 1, P. 57-64.
25. Saleri R., Mainardi G.L., Valle D., Giustina A., Tamanini C. Leptin Regulates GH Gene Expression and Secretion and Nitric Oxide Production in Pig Pituitary Cells. Endocrinology.2002. V.143(2), P.551-557.
26. Soumillion Ann, Erkens Jo H.F., Lenstra Johannes A., Günther Rettenberger, Pas Marinus F.W. Genetic variation in porcine myogenin gene locus. 1997. Mammalian Genome. V.8, N.8, P. 564-568.
27. Sonstegard T.S., Rohrer G.A., Smith T.P.L. Myostatin maps to porcine chromosome 15 by linkage and physical analyses. 1998. Anim. Genet., 29, 19-22.
28. Stasio L. Di., Brugiapaglia A., Destefanis G., Albera A., Sartore S. GH1 as candidate gene for variability of meat production traits. J. Anim. Breed. Genet. 2003. 120, 358 – 361.
29. Stratil A., Kopečny M. Genomic organization, sequence and polymorphism of the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene. 1999. Anim. Genet., 30, 468-470.
30. Switonski M. Molecular genetics in beef cattle breding a review. Animal Sciense Papers and Reports. 2002. Vol. 20. Supplement 1, 7-18.
31. Sun H.,.Taylor C, Robic A.,. Wang L, Rothschild M. F., Tuggle C.K. Mapping of growth hormone receptor of swine chromosome 18. 1997. Animal Genetics. V. 28, P. 351-353.
