LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Lina Rimkutė
PLYŠINIŲ JUNGČIŲ LAIDUMO
REGULIAVIMO MECHANIZMAI
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
biologija (01B)
2
Disertacija rengta 2008 – 2012 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijoje, Kardiologijos institute ir Ješiva universiteto Alberto Einšteino medicinos koledže, Neuromokslų katedroje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. (HP) Vytenis Arvydas Skeberdis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
Konsultantai:
prof. habil. dr. Feliksas Bukauskas (Ješiva universitetas, Alberto Einšteino medicinos koledžas (JAV), biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
dr. Mindaugas Račkauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
3
TURINYS
SANTRUMPOS... 5
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Plyšines jungtis formuojančių koneksinų struktūra, pasiskirstymas ir funkcijos ... 11
1.1.1. Koneksinų struktūra ... 11
1.1.2. Koneksinų raiška organizme ir jų funkcijos ... 14
1.2. Tarpląstelinės sąveikos per plyšines jungtis reguliavimas ... 17
1.2.1. Elektrinės plyšinių jungčių kanalų savybės ... 17
1.2.2. Dvivalenčių katijonų poveikis plyšinių jungčių laidumui ... 23
1.2.3. Viduląstelinio pH įtaka plyšinių jungčių funkcijoms ... 25
1.2.4. Potransliacinio modifikavimo reikšmė plyšinių jungčių laidumo reguliavime ... 27
1.2.5. Plyšinių jungčių blokatoriai ... 29
2. TYRIMŲ METODIKA ... 32
2.1. Ląstelių kultūros ... 32
2.2. Elektrofiziologiniai ir fluorescencijos matavimai ... 33
2.3. Tirpalai ir medžiagos ... 34
2.4. Statistinė duomenų analizė ... 36
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 37
3.1. Plyšinių jungčių blokatorių veikimo priklausomybė nuo viduląstelinio pH ... 37
3.1.1. Cx45 plyšinių jungčių blokavimo alkanoliais priklausomybė nuo pHi ... 37
3.1.2. Įvairių blokatorių poveikis Cx45 plyšinių jungčių laidumui priklausomai nuo pHi ... 41
3.1.3. Oktanolio blokavimo poveikio skirtingų koneksinų izoformų formuojamų plyšinių jungčių laidumui priklausomybė nuo pHi ... 45
4
3.2. Viduląstelinės magnio jonų koncentracijos įtaka plyšinių jungčių
kanalų laidumui ... 50
3.3. pHi poveikio plyšinių jungčių laidumui mechanizmas ... 54
3.3.1. Plyšinių jungčių laidumo priklausomybė nuo pHi ... 54
3.3.2. Histidinų vaidmuo Cx45EGFP baltymo jautrumui pHi ... 56
3.3.3. Cisteinų įtaka Cx36EGFP plyšinių jungčių laidumo reguliavimui priklausomai nuo pHi ... 59
4. IŠVADOS ... 64
5. BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 65
MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS ... 83
5
SANTRUMPOS
A – vartų įtampos jautrumo koeficientas, nusakantis maksimalų laidumo priklausomybės nuo įtampos statumą
Å – angstremas
ATP – adenozin-5‘-trifosfatas
BAPTA (angl. – 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester)) – Ca2+ surišantis chelatorius
BCECF (angl. –2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein) – fluorescuojantis pH jautrus dažas
CH3COONa – natrio acetatas
Cx (angl. – connexin) – koneksinas DNR –deoksiribonukleorūgštis
EGFP (angl. – enhanced green fluorescence protein) – žaliojo fluorescencinio baltymo žymė
EGTA (angl. – ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)
gj – elektrinis laidumas
HEPES (angl. – 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)– buferis, palaikantis pH ribose nuo 6.8 iki 8.2
IC50 – koncentracija sukelianti pusinį blokavimo efektą
Ij – jungties srovė
LCCA (angl. – long carbon chain alkanol) – ilgą anglies atomų grandinę turintys alkanoliai
MAPK – mitogenu aktyvuojama baltymų kinazė
MES (angl. – 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) – buferis, palaikantis pH ribose nuo 5.5 iki 6.7
MS – matavimo sritis
MKR – modifikuotas Krebs-Ringer tirpalas NBS – N-bromosukcinimidas
NF – funkcionalių kanalų skaičius
NH4Cl – amonio chloridas
PJ – plyšinė jungtis
PJP – plyšinės jungties plokštelė pHi – viduląstelinis pH
PKC – baltymų kinazė C PKG – baltymų kinazė G
S4SM (angl. – stochastic 4-state model) – tikimybinis keturių būsenų modelis
6
S16SM (angl. – stochastic 16-state model) – tikimybinis šešiolikos būsenų modelis
TAPS (angl. – 3-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}propanesulfonic acid) – buferis, palaikantis pH ribose nuo 7.7 iki 9.1
TEA (angl. – tetraethylammonium chloride) – tetraetilamonio chloridas Tris (angl. – tris(hydroxymethyl)aminomethane) – buferis, palaikantis pH ribose nuo 7.1 iki 9.0
TRPA1 (angl. – transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)
TRPV1 (angl. – transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1)
Vj – jungties įtampa
Vm – transmembraninė įtampa
Vo – įtampos, tenkančios kanalo vartams, reikšmė, kuriai esant šių vartų
atsidarymo tikimybė Po = 0.5
v-Src – virusinė tirozino kinazė
γc – uždarytos būsenos vienetinio kanalo laidumas
γo – atidarytos būsenos vienetinio kanalo laidumas
γres – vienetinio kanalo liekamasis laidumas
[Ca2+]i – viduląstelinė kalcio jonų koncentracija
[H+]i – viduląstelinė vandenilio jonų koncentracija
7
ĮVADAS
Įvairūs ląstelėse vykstantys biologiniai procesai priklauso nuo tam tikrų veiksnių, tokių kaip pH ir jonų koncentracijos pokyčiai, kurie įtakoja biomolekulių aktyvumą ir funkcijas. Jie taip pat yra svarbūs ląstelės homeostazės palaikyme bei dalyvauja viduląstelinių ir tarpląstelinių signalų perdavime. Šių veiksnių veikimo mechanizmų tyrimai suteikia žinių apie fiziologinę ir patologinę tam tikrų ląstelės elementų reikšmę bei atskleidžia galimus jų reguliavimo būdus. Tokie tyrimai dažnai yra sudėtingi atliekant eksperimentus ląstelėse, nes tenka įvertinti daugelio tiek vidinių, tiek išorinių veiksnių įtaką.
Plyšinės jungtys (PJ) yra tarpląstelinę sąveiką užtikrinantys kanalai, svarbūs ląstelių dauginimuisi, diferenciacijai, migracijai bei koordinacijai. Gausus PJ paplitimas organizme ir didelė įvairovė ligų, kurias sukelia šiuos kanalus formuojančių baltymų koneksinų (Cx) mutacijos, rodo, kad jie būtini normaliam organų funkcionavimui. PJ kanalų atliekamas funkcijas įtakoja tokie cheminiai veiksniai kaip viduląstelinis pH (pHi), viduląstelinė
dvivalenčių katijonų koncentracija (Ca2+, Mg2+), įvairūs blokatoriai. Atliekama nemažai tyrimų, siekiant suvokti šių veiksnių veikimo mechanizmus, tačiau vis dar vyksta diskusijos ar poveikis yra tiesioginis. Parodant tiesioginį poveikį, svarbu nustatyti kokios baltymo sritys atsakingos už jautrumą šiems veiksniams.
Dažnai pateikiami prieštaraujantys rezultatai, kuriuos nulemia tyrimai skirtingų tipų ląstelėse. Be to, nevienareikšmiai duomenys gaunami naudojant skirtingus tyrimų metodus. PJ kanalų savybių tyrimus ir duomenų interpretavimą apsunkina kanalo struktūra (kanalą sudaro puskanaliai išsidėstę vienas priešais kitą gretimų ląstelių membranose). Tyrimuose plačiai naudojami tarpląstelinės sąveikos blokatoriai gali veikti ne tik PJ, bet ir kitus joninius kanalus. Neištirtas tam tikrų blokatorių poveikis kitiems kanalams ar ląstelės signalo perdavimo keliams gali įtakoti netikslų rezultatų interpretavimą. Taip pat trūksta specifinių blokatorių konkrečiam koneksino tipui.
Disertaciniame darbe bandyta atsakyti į klausimus susijusius su pHi,
blokatorių ir magnio jonų įtaka PJ kanalų laidumui ir šių veiksnių veikimo mechanizmais. Šiems tikslams pasiekti buvo naudojami elektrofiziologiniai, fluorescenciniai bei mutagenezės metodai. Nustatėme grupės koneksinų PJ laidumo priklausomybę nuo pHi. Taip pat įvertinome pHi įtaką PJ blokatorių
poveikiui bei magnio jonų įtaką laidumui kontrolės sąlygomis ir priklausomai nuo pHi. Pasirinktų koneksinų taškinių mutantų tyrimai leido
8
Gauti rezultatai papildo turimas žinias ir suteikia naujų įžvalgų apie PJ laidumą reguliuojančių veiksnių bendrą poveikį bei šiam poveikiui svarbius, PJ sudarančių baltymų koneksinų, struktūrinius elementus.
9
Darbo tikslas
Nustatyti viduląstelinio pH (pHi) poveikio plyšinių jungčių (PJ) elektriniam
laidumui mechanizmus bei ištirti pHi sąveiką su kitais PJ laidumą
regu-liuojančiais veiksniais.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti pHi įtaką skirtingų tipų PJ blokatorių (alkanolių, forano,
meflokvino, flufenamo rūgšties, karbenoksolono ir arachidono rūgšties) poveikiui ir nustatyti jų veikimo mechanizmus.
2. Ištirti viduląstelinės magnio jonų koncentracijos įtaką Cx36EGFP PJ kanalų elektrinio laidumo (gj) priklausomybei nuo pHi.
3. Ištirti ir palyginti pHi įtaką PJ, sudarytų iš koneksinų (Cx) Cx36EGFP,
Cx40, Cx43, Cx45, Cx47, elektriniam laidumui (gj).
4. Ištirti histidinų vaidmenį Cx45EGFP PJ laidumui priklausomai nuo pHi.
5. Ištirti cisteinų vaidmenį Cx36EGFP PJ laidumui priklausomai nuo pHi.
Darbo mokslinis naujumas
Plyšinių jungčių priklausomybės nuo pHi tyrimams, kaip ir specifinių
blokatorių suradimui, skiriamas didelis dėmesys, tačiau vis dar trūksta žinių apie tikslius šių faktorių veikimo mechanizmus. Daugiausiai duomenų surinkta apie pHi įtaką tarpląstelinei sąveikai per gausiausiai organizme
sintetinamo Cx43 PJ. Parodyta, kad Cx43 bei Cx32 PJ elektrinio laidumo, gj, priklausomybė nuo pHi yra varpo formos [1, 2]. Disertacijos rengimo
metu atlikti tyrimai papildo turimas žinias, parodant varpo formos gj-pHi
priklausomybę keletui kitų koneksinų: Cx36, Cx40, Cx43, Cx45 ir Cx47. Vykdant disertacinį darbą, atlikti moksliniai tyrimai pirmą kartą parodė, kad plačiai naudojamų skirtingų grupių PJ blokatorių, tokių kaip alkanolių, forano, meflokvino, flufenamo rūgšties, karbenoksolono bei arachidono rūgšties, veikimas priklauso nuo pHi ir koneksino, sudarančio PJ, tipo.
10
blokatoriai veikia sudarydami vandenilinius ryšius su Cx45 baltymo histidinais.
Magnio jonų įtaka tarpląstelinei sąveikai parodyta gana seniai [3], tačiau detalesni sisteminiai tyrimai nebuvo atliekami. Mūsų tyrimuose parodyta viduląstelinės magnio jonų koncentracijos [Mg2+]i įtaka Cx43 ir Cx45 PJ
kanalų laidumui. Be to, ištirta Cx36EGFP PJ gj-pHi priklausomybė, esant
skirtingoms [Mg2+]i, kas iki šiol nebuvo tirta.
Literatūroje sutinkama duomenų apie Cx26, Cx32 ir Cx43 amino rūgštis, kurios įtakoja šių koneksinų formuojamų PJ jautrumą pHi [4-6]. Siekdami
nustatyti baltymo sritis, atsakingas už tam tikras funkcijas, sukonstravome ir ištyrėme Cx45EGFP ir Cx36EGFP mutantinius baltymus. Atlikti tyrimai suteikia naujų žinių apie Cx45 ir Cx36 amino rūgštis, kurios gali būti reikšmingos PJ laidumo reguliavimui viduląsteliniu pH.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Plyšines jungtis formuojančių koneksinų struktūra, pasiskirstymas ir funkcijos
1.1.1. Koneksinų struktūra
Plyšinės jungtys (PJ) užtikrina jonų mainus, antrinių signalinių molekulių, mažų metabolitų, neviršijančių 1 kilodaltono (kDa) molekulinį svorį, pernašą, o taip pat elektrinę sąveiką tarp ląstelių. Stuburiniuose PJ sudaro koneksinai, o bestuburiuose – ineksinai [7; 8]. Taip pat, žmogaus organizme atrastos trys paneksinų šeimos, kurios formuoja puskanalius ląstelių membranose. Paneksinai pasižymi 20 % homologija su ineksinais, tačiau paneksinai ir koneksinai nėra homologiški [9]. Koneksinai žymimi naudojantis nomenklatūra nCxZ, kur n nurodo rūšį iš kurios išskirtas baltymas, Cx yra „koneksino“ trumpinys (angl. – connexin), Z žymi baltymo molekulinį svorį kilodaltonais [10]. Pavyzdžiui, mCx45 yra pelės koneksinas (angl. – mouse, m), kurio molekulinė masė yra apytiksliai 45 kDa.
1.1.1 pav. Plyšinių jungčių kanalų ir juos formuojančių koneksinų
struktūra.
Koneksinų, paneksinų ir ineksinų struktūrą sudaro keturi transmembraniniai domenai (M1, M2, M3 ir M4), sujungti dviem ekstraląstelinėmis kilpomis (E1 ir E2) ir viena viduląsteline kilpa (CL), bei N- ir C-galai (NT ir CT, atitinkamai) citoplazminėje membranos pusėje
NT CT CL E1 E2 P us ka na lis P J k ana la s M1 M2 M3 M4 Homomerinis Homotipinis Heteromerinis Homotipinis Homomerinis Heterotipinis Heteromerinis Heterotipinis Koneksinas
12
(1.1.1 pav.). Pelės genome nustatyta 20 genų, koduojančių skirtingus koneksinus, žmogaus genome – 21 genas. Skirtingų izoformų sekų panašumas sudaro apie 40 %. Labiausiai amino rūgščių sudėtimi bei ilgiu besiskiriančios sritys yra CL ir CT domenai [11]. Koneksinai sintetinami endoplazminiame tinkle. Manoma, kad puskanalio, vadinamo koneksonu (1.1.1 pav.), formavimas iš šešių koneksinų pradedamas endoplazminiame tinkle ir užbaigiamas Goldži aparate [12; 13]. Iš Goldži aparato koneksonai vezikulėse transportuojami į plazminę membraną.
1.1.2 pav. Cx26 kanalo struktūra (A) ir puskanalio vaizdas iš
citoplazminės pusės (B).
Paveikslas padarytas naudojantis kristalografinės Cx26 baltymo struktūros modelio koordinatėmis iš baltymų duomenų banko
(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2ZW3). Naudota molekulinės grafikos programa ViewerLite42.
Ilgą laiką manyta, kad koneksonai yra tik tarpinė nepilno kanalo forma. Kadangi tam tikrų koneksinų (Cx26, Cx43 ir Cx46) formuojamų puskanalių
T ar p lą st el inė sr it is 40 Å M em b ra n inė sr it is 38 Å M em b ra n inė sr it is 38 Å Puskanalio diametras citoplazmoje 92 Å Įė ji m o di am et ra s 35Å S ia u ria us ia da lis 14Å A B
13
laidumas yra gana didelis (apie 200-350 pS) [14] ir jų atsidarymas gali sąlygoti nusistovėjusio jonų gradiento suardymą, buvo manoma, kad koneksonai egzistuoja tik uždaroje būsenoje. Tačiau vėliau buvo parodyta, kad puskanaliai ląstelės membranoje vaidina svarbų vaidmenį parakrininiame signalo perdavime [14]. Tokios citozolio signalinės molekulės kaip adenozin-5‘-trifosfatas (ATP), nikotinamido adenino dinukleotidas (NAD+), glutamatas, glutationas ir prostaglandinai gali sklisti per puskanalius į ląstelės aplinką ir, prisijungdami prie šalia esančių ląstelių receptorių, sukelti tam tikrą atsaką.
Koneksonas, suformavęs kanalą su gretimos ląstelės membranoje esančiu puskanaliu, sudaro plyšinę jungtį. Kanalų sankaupa dviejų ląstelių kontakto vietoje yra apibrėžiama kaip plyšinės jungties plokštelė (PJP). Dauguma organų ir ląstelių sintetina įvairias koneksinų izoformas, kurios tarpusavyje gali sudaryti homotipinius homomerinius, homotipinius heteromerinius, heterotipinius homomerinius ir heterotipinius heteromerinius kanalus (1.1.1 pav.), pasižyminčius skirtingomis elektrinio laidumo ir pralaidumo savybėmis [15]. Manoma, kad koneksinų C-galinė dalis (M3 domenas) gali būti svarbi subvieneto atpažinime ir, tuo pačiu, koneksono susidaryme, o N-galinėje dalyje (M1 domene ir/ar E1 kilpoje) yra signalinės sekos nulemiančios heteromerinių puskanalių susiformavimo galimybes [12].
Šiam momentui kristalografinė struktūra nustatyta tik koneksinui Cx26 [16]. PJ kanalo aukštis be CL kilpos ir C-galinės dalies sudaro apie 155 Å, membraninės kanalo dalies storis – apie 38 Å (1.1.2 pav., A). Tarpląstelinio plyšio dydis yra apie 40 Å. Koneksono diametras didžiausias citoplazminėje dalyje ties membrana (~92 Å) ir mažiausias ekstraląstelinėje erdvėje (~51 Å). Poros diametras yra apie 35 Å citoplazminėje kanalo dalyje, siaurėjantis iki 14 Å ties ekstraląsteliniu membranos paviršiumi ir platėjantis iki 25 Å ląstelės išorėje (1.1.2 pav., B). E1 ir E2 struktūroje yra trumpas antilygiagrečios β-klostės motyvas. Kiekvienoje ekstraląstelinėje kilpoje yra po tris cisteinus, kurie formuoja disulfidinius tiltelius tarp E1 ir E2. Tarpmolekulinė sąveika tarp dviejų vienas priešais kitą išsidėsčiusių koneksonų palaikoma vandenilinių ryšių pagalba.
Kristalografinės struktūros analizė rodo, kad M1 domeno amino rūgštys formuoja vidinę poros aplinką. Kiti autoriai, naudodami SCAM (angl. – substituted-cysteines accessibility method) metodą, taip pat nustatė, kad M1 amino rūgštys dalyvauja formuojant vidinę poros aplinką Cx46 ir Cx32 sudaromose PJ [17; 18]. Tačiau yra duomenų, rodančių, kad Cx32 PJ kanalo poros aplinkos sudaryme gali dalyvauti ir M3 domeno amino rūgštys [19]. Cx26 PJ kanalo pralaidžiąją dalį sudaro viduląstelinis įėjimas, poros susiaurėjimas ir ekstraląstelinė ertmė. Siauriausią poros dalį sudarančių
14
amino rūgščių šoninių grupių dydis ir elektrinės charakteristikos turėtų nulemti kanalo molekulinio pralaidumo savybes bei specifiškumą krūviui.
1.1.2. Koneksinų raiška organizme ir jų funkcijos
Koneksinų raiška stebima visuose audiniuose išskyrus eritrocitus, diferencijuotas skeleto raumens ir subrendusias spermos ląsteles [9]. PJ dalyvauja ląstelių homeostazės ir funkcijų palaikyme [20]. Trumpas koneksinų gyvavimo pusperiodis ir greita jų apykaita rodo, kad jie svarbūs procesuose, kuriuose reikalinga greita organizmo reakcija prisitaikant prie besikeičiančių sąlygų. Parodyta, kad koneksinai svarbūs įvairių audinių vystimuisi ir diferenciacijai; šių procesų metu kinta jų raiškos lygis bei fosforinimo būsena, o taip pat, kinta jų sąveika su kitais baltymais [21; 22]. Be to, koneksinai būtini tam tikrų organų normaliam funkcionavimui, kaip, pavyzdžiui, sinchroniniam širdies raumens susitraukimui [23], elektrinių sinapsių funkcionalumui smegenyse [24] ir nepakeičiami tokiuose fiziologiniuose procesuose kaip audinio uždegimas bei gijimas [25].
Dauguma ląstelių tipų sintetina dvi ar daugiau koneksinų izoformų. Žmogaus odos ląstelėse randama bent dešimt Cx genų: Cx26, Cx30, Cx30.3, Cx31.1, Cx32, Cx37, Cx40, Cx43 ir Cx45 [26]. Recesyvinė Cx26 baltymą koduojančio geno mutacija nulemia nesindrominį kurtumą, tačiau dominantinės šio geno mutacijos gali būti susijusios su odos ligomis, tokiomis kaip delnų ir padų keratozė, pasireiškianti įvairaus lygio klausos sutrikimais, KID (angl.–keratitis-ichthyosis-deafness) ir HID (angl. – hystrix-like ichthyosis-deafness) sindromai [27]. Tam tikros dominantinės mutacijos Cx43 koduojančiame gene nulemia ektoderimnės displazijos atvejį (angl. – oculodentodigital dysplasia, ODDD), kuriam būdingosveido, akių, dantų ir galūnių anomalijos [28]. Tai ryškiausias pavyzdys, rodantis vieno koneksino svarbą kelių organų funkcijoms. Odos koneksinų raiškos pakitimai taip pat pastebėti odos vėžio atvejais [29] bei žaizdų gijimo procesuose [30].
Visose skeleto ląstelėse dominuoja Cx43, taip pat, osteoblastuose randami Cx45 ir Cx46, nors jų funkcijos šiose ląstelėse nėra aiškios [31; 32]. Cx43 funkcijų sutrikimai nulemia skeleto vystymosi sutrikimus, nesugebėjimą palaikyti normalią kaulų masę, sutrikusį kaulų ląstelių atsaką į hormoninius ir mechaninius stimulus.
Tiriant šeško ir žmogaus kvėpavimo takų vystymąsi buvo pastebėta laikina Cx26 ir Cx32 raiška [33]. Taip pat, parodyta Cx37 raiška pelės embriono plaučiuose, tačiau šio koneksino neaptikta suaugusių gyvūnų
15
audinyje [34]. Cx aptinkami suaugusių gyvūnų ląstelių kultūrose. Kvėpavimo takų epitelinėse ląstelėse randama Cx32 arba Cx43, priklausomai nuo kultivavimo metodų ir tiriamų rūšių, iš kurių išskirtos ląstelės [35; 36]. Imunocitocheminiais metodais nustatyta bent penkių Cx raiška alveoliniame epitelyje: Cx26, Cx32, Cx40, Cx43 ir Cx46 [37]. Manoma, kad Cx plaučiuose ir kvėpavimo takuose svarbūs Ca2+ signaliniuose keliuose.
Žinduolių širdyje elektrinis impulsas generuojamas sinusiniame (SA) mazge, iš kurio 0.5 – 1 m/s greičiu sklinda prieširdžiais ir sukelia jų susitraukimą. Elektriniam impulsui pasiekus atrioventrikulinį (AV) mazgą, jo sklidimo greitis palaipsniui mažėja iki 0.05 m/s, ir pasiekia ~2 m/s greitį Hiso pluošte (1.1.3 pav.) [38]. Tokiu greičiu impulsas sklinda toliau Purkinje skaidulomis, sąlygodamas koordinuotą skilvelių susitraukimą. Elektrinis impulsas iš prieširdžių į skilvelius patenka per AV mazgą, kurio pagrindinė funkcija yra užlaikyti elektrinį impulsą, kad skilveliai susitrauktų vėliau nei prieširdžiai. Sužadinimo sklidimo greitis skirtingose širdies dalyse priklauso nuo audinio geometrijos, ląstelių sužadinimo savybių ir PJ, jungiančių ląsteles.
Širdyje aptinkami mCx30.2, Cx40, Cx43 ir Cx45, iš kurių mCx30.2 ir Cx45 gausiai reiškiasi SA ir AV mazguose, Cx40 sintetinamas skilvelių laidžiojoje sistemoje bei kartu su Cx43 – prieširdyje, be to, Cx43 yra pagrindinis koneksinas formuojantis PJ darbiniame miokarde (1.1.3 pav.) [39]. mCx30.2 ir Cx45 formuoja mažu elektriniu laidumu pasižyminčius homotipinius (9 ir 32 pS, atitinkamai) bei heterotipinius mCx30.2/Cx45 PJ kanalus (17 pS) [40; 41]. Mažu homotipinių ir heterotipinių mCx30.2 formuojamų PJ laidumu galima būtų paaiškinti impulso sklidimo greičio sumažėjimą AV mazge [41]. Tuo tarpu, Cx40 ir Cx43, pasižymintys dideliu vienetinio kanalo laidumu (180 ir 115 pS, atitinkamai), užtikrina greitą impulso sklidimą prieširdžiais ir nulemia jų sinchroninį susitraukimą, o Cx43 elektrinio laidumo savybės svarbios ir skilvelių susitraukimui [38]. Cx40, Cx43, Cx45 ir Cx37 raiška taip pat aptikta kraujagyslėse [42]. Mutacijos genuose, koduojančiuose širdies Cx, retai nulemia tam tikrą širdies ligą, tačiau su įvairiomis širdies ligomis susijusi pakitusi Cx raiška bei PJ išsidėstymas.
Besivystančiose smegenyse PJ ekspresuojamos periventrikulinės baltosios medžiagos pirminėse ląstelėse ir užtikrina sinchronines Ca2+ srovių osciliacijas, kurios koordinuoja ir reguliuoja nervinių ląstelių proliferaciją [43]. PJ užtikrina sąveiką tarp besidauginančių Švano ląstelių nervinio audinio vystymosi, regeneravimo ir mielininio dangalo atkūrimo procesuose. Pagrindinis koneksinas randamas Švano ląstelėse yra Cx32.
16
Mutacijos šį baltymą koduojančiame gene nulemia neuralinę raumenų atrofiją (angl. – Charcot-Marie-Tooth). Manoma, kad Cx32 PJ sudaro tarpląstelinį ryšį tarp gretimų mielino sluoksnių Schmidt-Lantermann plyšiuose ir užtikrina signalinių molekulių, metabolitų ir jonų difuziją iš vidinės Švano ląstelės citoplazminės dalies į išorinę [44]. Cx29 taip pat yra ekspresuojamas periferinėje nervų sistemoje. Centrinėje nervų sistemoje neuronuose aptinkami Cx36, Cx30.2 ir Cx45, astrocituose – Cx30 ir Cx43, oligodendrocituose – Cx29, Cx47 ir Cx32 [45]. Mutacijos Cx47 koduojančiame gene nulemia Pelizaeus Merzbacher tipo ligą, taip pavadintą dėl fenotipinio panašumo į šį sutrikimą [27].
1.1.3 pav. Širdies schema, vaizduojanti elektrinio impulso sklidimo greitį
ir koneksinų pasiskirstymą.
Modifikuota pagal Kreuzberg ir kt. [38].
Akies lęšiuko homeostazė priklauso nuo tarpląstelinio ryšio, kurį užtikrina PJ. Trys skirtingi koneksinai, Cx43, Cx46 ir Cx50, turi įtakos akies lęšiuko skaidulinių ląstelių vystimuisi, brendimui ir yra svarbūs jų funkcijų palaikyme [46; 47]. Akies lęšiuko koneksinų mutacijos susijusios su kataraktos išsivystimu [48; 49], kadangi sutrikusi PJ funkcija neužtikrina
SA mazgas ~0.05 m/s Cx30.2, Cx45 Prieširdžiai ~0.5-1 m/s Cx40, Cx43 AV mazgas ~0.05 m/s Cx30.2, Cx40, Cx45 Hiso pluoštas~2 m/s Cx30.2, Cx40, Cx45 Hiso pluošto kojytės~2 m/s Cx30.2, Cx40, Cx45 Purkinje skaidulos~2 m/s Cx40, Cx43
Darbinis miokardas ~0.5 m/s Cx43
17
ląstelių sąveikos su aplinka. Literatūriniai duomenys rodo, kad lęšiuko skaidrumą įtakoja Cx46, kuris svarbus Ca2+ homeostazės palaikyme [50]. Tuo tarpu Cx50 būtinas teisingam lęšiuko augimui.
Vidinėje ausyje koekspresuojami du pagrindiniai koneksinai, Cx26 ir Cx30, gali sudaryti homotipines ir heterotipines PJ [51]. Šių koneksinų mutacijos susijusios su klausos sutrikimais [52].
Skirtingų koneksinų raiška tame pačiame audinyje sudaro kompensavimo galimybes, kuomet kuris nors koneksinas nesintetinamas arba dėl mutacijos yra neveiksnus [53; 54]. Koneksinų izoformų sąveiką įrodo ir tai, kad mutacija viename koneksine sukelia keletą ligų, kita vertus, mutacijos dviejuose koneksinuose gali nulemti tą patį sutrikimą.
1.2. Tarpląstelinės sąveikos per plyšines jungtis reguliavimas
1.2.1. Elektrinės plyšinių jungčių kanalų savybės
Kaip daugumos jonų kanalų, PJ kanalų laidumą reguliuoja įtampa. Koneksinų formuojamų kanalų struktūra nulemia jų jautrumą dviejų tipų įtampai: 1) įtampai tarp citoplazmos ir ląstelės išorės, t.y. transmembraninei įtampai Vm; ir 2) įtampos skirtumui tarp dviejų ląstelių citoplazmos, t.y.
jungties įtampai, Vj. Kanalų įtampos jutiklis apibūdinamas kaip eilė amino
rūgščių, turinčių krūvį, kuris keičia konformaciją pakitusio elektros lauko poveikyje. Šis įtampos jutiklis buvo pavadintas kanalo vartais. PJ kanalų jautrumas Vm pirmiausiai buvo pastebėtas bestuburiuose, vėliau parodyta
elektrinio laidumo, gj, priklausomybė nuo Vm PJ kanalams sudarytiems iš
Cx57 arba Cx45 [40]. Tačiau Cx43 ir Cx47 HeLa ląstelėse formuojamų kanalų gj nepriklauso nuo membraninio potencialo. Jautrumas Vm gali
priklausyti nuo Cx-tipo ir sistemos, kurioje Cx yra ekspresuojami. Parodyta, kad Cx43 PJ kanalų laidumas, skirtingai nei HeLa ląstelėse, priklauso nuo Vm, kai yra ekspresuojamas Xenopus oocituose [40]. PJ kanalų gj
priklausomybė nuo Vj skiriasi priklausomai nuo koneksinų, sudarančių
kanalą, izoformos, tačiau bendra, visiems koneksinams būdinga, savybė yra ta, kad stacionari gj būsena didėjant Vj pasiekia plato fazę, gj,min, kuris
18
1.2.1 pav. Cx43 (A) ir Cx43-EGFP(B) vienetinių kanalų atsidarymas
priklausomai nuo įtampos.
(A) Greituosius vartus charakterizuojantys greiti perėjima tarp atidarytos būsenos (γo) ir
liekamojo laidumo būsenos (γres); (B) Lėtiesiems vartams būdingi lėti perėjimai tarp
atidarytos būsenos (γo) ir pilnai uždarytos būsenos (γc). Modifikuota pagal Bukauskas ir
Verselis [40].
Vienetinių PJ kanalų laidumo matavimų dėka buvo paaiškinta gmin
prigimtis ir pastebėta, kad PJ kanalams būdingi du užsidarymo/atsidarymo mechanizmai [40]. Registruojant vienetinių PJ kanalų laidumą, taip pat pastebėtas jo sumažėjimas iki tam tikro lygio, nepasiekiant nulio, kuris pavadintas liekamojo laidumo būsena, γres (1.2.1 pav., A). Kadangi perėjimai
iš γres į pilnai atidaryto kanalo būseną, γo, yra greiti, šis mechanizmas buvo
pavadintas greitaisiais PJ kanalo vartais. Be to, pastebėta, kad kartais vienetiniai PJ kanalai iš γo pereidavo į pilnai uždarytą būseną, γc (pav. 1.2.1
B). Dėl lėtų, apie 10 ms trunkančių perėjimų tarp γo ir γc, šis mechanizmas
pavadintas lėtaisiais kanalo vartais. Dviejų vartų egzistavimą gerai iliustruoja Cx43 ir Cx43EGFP elektrinių savybių palyginimas. Žaliai fluorescuojančio baltymo (EGFP) prikabinimas prie Cx43 CT galo pažeidžia greitųjų vartų mechanizmą, todėl vienetiniai Cx43EGFP kanalai pasižymi tik lėtiesiems vartams būdingais perėjimais, tuo tarpu vienetiniams Cx43 kanalams būdingi perėjimai tarp γo ir γres (1.2.1 pav.) [40].
Puskanalių tyrimai taip pat patvirtino dviejų vartų mechanizmo egzistavimą [56]. Cx46 puskanaliai pasižymi lėtiesiems vartams būdingais perėjimais tarp atidarytos ir pilnai uždarytos būsenos, hiperpoliarizuojant ląstelę, tuo tarpu kai ląstelė depoliarizuojama, stebimi greitiesiems vartams būdingi perėjimai tarp γo ir γres. Remiantis Cx46 puskanalių lėtųjų perėjimų
panašumu į užregistruotus naujai besiformuojančių kanalų tarp suglaustų vabzdžio ląstelių perėjimus [57], buvo pasiūlyta, kad ekstraląstelinės kilpos E1 ir E2 gali dalyvauti lėtųjų vartų mechanizme. Be to, nustatyta, kad Cx46 puskanalių vartai pasižymi skirtingu poliarumu, t.y. lėtieji vartai užsidaro
0.0 0.1 0 5 10 0.0 0.1 0 5 10 Laikas, s Laikas, s gj , nS Cx43 Vj= 50 mV Cx43EGFP Vj= 80 mV γo γc A B γres
19
paduodant neigiamą įtampą į ląstelę, o greitieji vartai – paduodant teigiamą įtampą.
Parodyta, kad visų iki šiol ištirtų koneksinų (Cx32, Cx43, Cx45, Cx46 ir Cx50) lėtieji vartai pasižymi neigiamu poliarumu, tuo tarpu greitieji vartai gali būti teigiamo (Cx37, Cx40, Cx46 ir Cx50) arba neigiamo (Cx32, Cx43 ir Cx45) poliarumo [40]. Manoma, kad neigiamas lėtųjų vartų poliarumas nulemia tai, kad puskanaliai yra uždari esant fiziologiniam ramybės potencialui. Priešingu poliarumu pasižyminčių Cx26 ir Cx32 tyrimai mutagenezės metodais atskleidė, kad šių Cx greitųjų vartų poliarumą nulemia krūvį turinčios amino rūgštys NT domene [58]. Pakeitus Cx32 neutralų asparaginą į neigiamą krūvį turinčias amino rūgštis (glutamo ar asparto rūgštį), pakinta puskanalių greitųjų vartų poliarumas, nesikeičiant lėtųjų vartų savybėms. Taip pat kinta Cx26 greitųjų vartų poliarumas, pakeitus neigiamą asparto rūgštį neutralia arba teigiama amino rūgštimi. Šie duomenys patvirtino iškeltą hipotezę, kad greitieji vartai yra išsidėstę citoplazminėje koneksonų pusėje. Remiantis surinkta informacija, pasiūlytas PJ kanalo modelis, kuriame kiekvienas kanalą sudarantis puskanalis turi dvejus vartus: lėtuosius ir greituosius (1.2.2 pav.).
1.2.2 pav. Plyšinės jungties kanalo greitųjų (geltonos rodyklės) ir lėtųjų
(mėlynos rodyklės) vartų išsidėstymo schema.
Modifikuota pagal Paulauskas ir kt. [59].
Homotipiniams kanalams būdinga simetrinė gj-Vj priklausomybė, kur
20 0 1 -100 -50 0 50 100 0 -100 -50 0 50 100 1 norm . gj norm . gj Vj, mV Vj, mV A B
pasižymi gj-Vj priklausomybės asimetrija (1.2.3 pav.). Tiriant heterotipinius
Cx43EGFP/Cx45 kanalus, gauta asimetrinė laidumo priklausomybė nuo įtampos (gj-Vj), kurios pikas yra ties Vj ≈ -25 mV [60]. Laidumo mažėjimas
teigiamų Vj reikšmių pusėje nulemtas Cx45 puskanalių užsidarymu, tuo
tarpu gj mažėjimas neigiamų Vj reikšmių pusėje nulemtas Cx43 puskanalių
užsidarymu. Cx45 ir Cx43 užsidaro esant neigiamoms įtampos reikšmėms citoplazminėje pusėje, t.y. pasižymi neigiamu poliarumu, tačiau Cx43 yra mažiau jautrus Vj nei Cx45. Skirtingas heterotipinį kanalą sudarančių Cx
jautrumas įtampai nulemia gj-Vj priklausomybės asimetriją, o Cx vienetinių
kanalų laidumo savybės sąlygoja skirtingą gmin reikšmę prie teigiamų ir
neigiamų Vj reikšmių.
1.2.3 pav. Homotipinio Cx45 PJ kanalo (A) ir heterotipinio
Cx43EGFP/Cx45 PJ kanalo (B) gj-Vj priklausomybė.
Juodai žymima eksperimentiškai gauta kreivė, pilkai – sumodeliuota naudojant S16SM modelį. Modifikuota pagal Paulauskas ir kt. [59].
Heterotipinių PJ asimetrija leidžia tirti poliarumą, kuris sunkiai paste-bimas tiriant homotipinius kanalus. Kai heterotipinį kanalą sudaro skirtingą poliarumą turintys puskanaliai, pavyzdžiui, Cx32(-)/Cx26(+), abu pus-kanaliai užsidaro esant teigiamai įtampai Cx26 puskanalio pusėje, ir abu lieka atviri, kai Vj Cx26 puskanalio pusėje yra neigiama [61]. 1.2.4 pav.
pavaizduota S16SM metodu sumodeliuota skirtingu poliarumu pasižyminčių Cx30(+)/Cx43(-) sudaryto heterotipinio kanalo gj-Vj
priklausomybė. Kanalo užsidarymą matome prie teigiamų Vj reikšmių, tuo
tarpu, esant neigiamoms Vj reikšmėms, abu puskanaliai yra atidarytoje
būsenoje, todėl nematome Cx būdingos gj-Vj varpo formos priklausomybės
21
Elektrinėms PJ kanalų savybėms aprašyti kurį laiką buvo naudojama Boltzmann lygtis [62; 63], priimant, kad PJ kanalai pasižymi dviem būsenom, atidaryta ir uždaryta:
gj = {(1 – gj,min)/[1 + exp(A(Vj – V0))]} + gj,min
kur V0 atitinka Vj reikšmę, kuriai esant gj yra lygus pusei maksimalaus
laidumo, o gj,min yra minimalus laidumas prie didelių Vj reikšmių. A yra
konstanta, nusakanti vartų krūvį, zq(kT)-1, kur z atitinka krūvių, kuriuos veikia elektrinis laukas, skaičių, q yra elektrono krūvis, k ir T – Boltzmann konstanta ir temperatūra išreikšta kelvinais, atitinkamai. Šis metodas leido aprašyti homotipinių ir heterotipinių PJ kanalų elektrines savybes, priimant, kad kiekvienas kanalą sudarantis puskanalis užsidaro nepriklausomai nuo kito, kas yra teisinga tik tuo atveju, jei abu puskanaliai pasižymi tuo pačiu poliarumu, panašiu vienetinių kanalų laidumu ir yra sąlyginai nejautrūs Vj
[64]. Tačiau, kaip jau minėta, kiekvienas puskanalis, sudarantis PJ kanalą, turi po dvejus vartus išdėstytus nuosekliai kanalo poroje [40]. Kadangi Vj
veikia visą kanalą, manoma, kad vieno iš vartų užsidarymas pakeičia Vj
pasiskirstymą kitiems vartams. Taigi, vienų vartų atsidarymo tikimybė priklauso nuo kitų vartų būsenos (angl. – contingent gating) [62]. Ši savybė buvo įvertinta kuriant stochastinį keturių būsenų modelį (S4SM) PJ kanalų elektrinių savybių įvertinimui, kuriame vartai kinta tarp atviros ir lie-kamosios būsenos su laidumais γF,o ir γF,res (F žymi greituosius vartus) [64].
Priimta, kad PJ kanalas turi du greituosius vartus, po vieną kiekviename puskanalyje, A ir B. Priklausomai nuo greitųjų vartų atsidarymo/užsidarymo kombinacijų išskiriamos keturios būsenos: 1) AoBo – abu vartai atidaryti; 2) AcBo – A vartai uždaryti, B vartai atidaryti; 3) AoBc – A vartai atidaryti, B vartai uždaryti; 4) AcBc – abu vartai uždaryti (1.2.5 pav.).
Vėliau S4SM buvo patobulintas, įtraukiant lėtųjų vartų įtaką PJ kanalų elektrinėms savybėms, ir sukurtas stochastinis 16 būsenų modelis (S16SM) [59]. Modelyje kiekvieni vartai charakterizuojami poliarumu ir vienetinių vartų laidumu atidarytoje (γo) ir uždarytoje (γc) būsenoje. Lėtieji vartai
pilnai uždaro kanalą (γS,c = 0) (S žymi lėtuosius vartus), greitieji vartai
uždaro kanalą iki liekamojo laidumo būsenos (γF,c = γF,res), kuri sudaro ~1/5
atidarytos būsenos laidumo. Šis modelis leidžia įvertinti tokius PJ elektrinių savybių parametrus kaip: γres (liekamasis laidumas), Vo (įtampos, tenkančios
vartams, reikšmė, kuriai esant šių vartų atsidarymo tikimybė Po = 0.5) ir A
(vartų įtampos jautrumo koeficientas, nusakantis maksimalų laidumo priklausomybės nuo įtampos statumą).
22
1.2.4 pav. Skirtingais poliarumais pasižyminčių koneksinų formuojamo
heterotipinio Cx30(+)/Cx43(-) kanalo elektrinės savybės.
±150 mV Vj ribose (A) įvertinta Ij (B) ir gj-Vj priklausomybė (C), naudojantis S4S
modeliu. 0 100 -100 0 -4000 4000 Vj , m V Ij , pA 0 8000 -150 150 0 0.4 0.8 norm . gj Vj, mV A B C
23
1.2.5 pav. Plyšinės jungties kanalo su greitaisiais vartais kiekviename
puskanalyje (A) keturių būsenų modelio (B) schema.
Modifikuota pagal Paulauskas ir kt. [64].
1.2.2. Dvivalenčių katijonų poveikis plyšinių jungčių laidumui
Kalcio jonų reikšmė tarpląstelinei sąveikai per PJ buvo parodyta įvairiose ląstelėse: širdies, varliagyvių embrioninėse ląstelėse, vėžio gigantiškuose aksonuose, Novikoff hepatomos ląstelėse, astrocituose ir kt. [3; 65; 66; 67; 68]. Viduląstelinės kalcio jonų koncentracijos ([Ca2+]i) padidėjimas sąlygoja
tarpląstelinės sąveikos mažėjimą per PJ. Tiksli kalcio jonų koncentracija, kuri aktyvina kanalų valdymo mechanizmą, nėra žinoma ir gali skirtis priklausomai nuo koneksinų izoformos ir ląstelės tipo. Straipsniuose nurodama, kad PJ kanalų laidumas reguliuojamas [Ca2+]i koncentracijai
esant tarp 40-400 μM vabzdžių liaukų ląstelėse [69], varliagyvių embrioninėse ląstelėse [65], žiurkės širdies ląstelėse [70]. Novikoff ląstelėse 500 nM kalcio jonų koncentracija turėjo poveikį PJ elektriniam laidumui, tuo tarpu kai 100 nM koncentracija nebuvo efektyvi tiek ties pH 7.2, tiek ties pH 6.1 [67]. PJ kanalų jautrumas nanomolinėms [Ca2+]i koncentracijoms
taip pat buvo parodytas astrocituose, kuriuose dažų sklidimo iš ląstelės į ląstelę blokavimas buvo tiesiogiai proporcingas kalcio jonų koncentracijos didėjimui nuo 150 iki 600 nM [71]. Dažų sklidimo blokavimas 500 nM [Ca2+]i koncentracija parodytas HeLa ląstelėse tarnsfekuotose Cx43 baltymu
[72].
Sunku pasakyti, kodėl gaunamos tokios skirtingos efektyvios kalcio jonų koncentracijos reikšmės. Gali būti, kad tam tikrose ląstelėse [Ca2+]i
A B AoBo AcBo AcBc AoBc K1 K2 K3 K4
24
koncentracijos padidėjimas yra per trumpas, kad paveiktų PJ. Kita priežastis gali būti netolygus kalcio jonų pasiskirstymas citozolyje, dėl kurio jungties srityje terpė gali būti veikiama minimaliai, nepaisant didelių kalcio koncentracijos pokyčių kitose ląstelės srityse. Šis teiginys remiamas labai lėtos kalcio jonų difuzijos citozolyje parodymu: kalcio difuzijos koeficientas svyruoja nuo 13 iki 65 µm2/s kalcio koncentracijoms nuo 90 nM iki 1 µM Xenopus oocitų citozolio ekstraktuose [70]. Palyginimui, inozitolio trifosfato difuzijos koeficientas yra 283 µm2/s.
Tam tikrais atvejais vidinės kalcio koncentracijos padidėjimas dėl kalcio jonų patekimo iš išorės sukelia žymesnius pokyčius nei kalcio jonų atpalaidavimas iš vidinių ląstelės rezervų [73]. Novikoff ląstelėse [Ca2+]i
koncentracijos padidėjimas iki 12 µM, kuris sukeliamas atpalaiduojant Ca2+ iš vidinių rezervų, pridėjus 100 µM ATP, sumažina tarpląstelinę sąveiką 30-40 %. Trumpai (20 s) veikiant Novikoff ląsteles arachidono rūgštimi, gautas laidumo mažėjimas iki 5-10 % nuo pradinio laidumo. Tačiau esant 2 mM BAPTA (Ca2+ surišantis buferis) registruojančioje pipetėje arba naudojant išorinį tirpalą be Ca2+, arachidono rūgšties poveikis nepasireiškė. Remdamiesi šiais rezultatais, autoriai teigia, kad arachidono rūgšties indukuota kalcio jonų difuzija į ląstelę sukelia stipresnį blokavimo poveikį nei iš vidinių rezervų atpalaiduotas Ca2+. Kita vertus, tie patys autoriai parodė, kad ilgesnės trukmės arachidono rūgšties poveikis blokuoja tarpląstelinį ryšį nepriklausomai nuo Ca2+. Kalcio jonų poveikio Cx32 ir Cx43 PJ kanalams mechanizmo tyrimai parodė, kad Ca2+ veikimui reikalingas baltymas kalmodulinas (CaM) [72; 74].Visai neseniai parodyta, kad Cx43 turi sritį CL domene, surišančią CaM, tačiau ši sritis neaptikta Cx40 baltyme [75].
Kitų dvivalenčių katijonų (Mg2+, Ba2+, Sr2+, Mn2+) poveikio PJ laidumui tyrimų nėra daug, nors jų gebėjimas blokuoti PJ kanalus parodytas ganėtinai senai [69; 76].Tik prieš tris metus buvo atlikta gilesnė magnio jonų įtakos PJ laidumui studija jūrų kiaulytės miocituose. Parodyta, kad širdies PJ kanalų laidumas didėja esant mažai viduląstelinei magnio jonų koncentracijai [Mg2+]i (0.6 mM), ir mažėja esant didelei [Mg2+]i (10 mM) [77]. Autoriai
mano, kad Mg2+ poveikis PJ kanalams yra tiesioginis, nors neatmetama galimybė, kad veikimo mechanizme dalyvauja tarpinės molekulės. Naujausi publikuoti duomenys, prie kurių prisidėjo ir mūsų laboratorijoje atlikti darbai, rodo, kad PJ, suformuotų iš neuroninio koneksino Cx36, laidumas priklauso nuo [Mg2+]i [78]. Pradinėmis sąlygomis, esant apie1 mM [Mg2+]i,
Cx36 PJ kanalai yra dalinai užblokuoti. Laidumas didėja arba mažėja, mažinant arba didinant [Mg2+]i, atitinkamai. Parodyta, kad Cx36 PJ kanalai
25
kanalo porą. Nustatyta, kad plyšinių jungčų, kurias formuoja Cx26, Cx32, Cx43, Cx45 ir Cx47, laidumas taip pat mažėja didinant [Mg2+]i, tačiau prie
mažų Mg2+ koncentracijų gj augimas nepastebėtas.
1.2.3. Viduląstelinio pH įtaka plyšinių jungčių funkcijoms
Gerai žinoma, kad biomolekulių funkcijos priklauso nuo pH. pH yra vienas iš svarbiausių veiksnių palaikančių ląstelių homeostazę, viduląstelinio pH (pHi) pokyčiai svarbūs biologiniuose procesuose tiek
fiziologinėmis, tiek patologinėmis sąlygomis. Parodyta, kad viduląstelinio pH šarmėjimas sąlygoja skausmo jutimą per TRPA1 kanalų aktyvinimą [79]. Autoriai teigia, kad šarminimu sukeltas kanalų aktyvinimas vyksta dėl dviejų, baltymo N-gale esančių cisteinų deprotonavimo arba dėl jų nuo pHi
priklausomos sąveikos su tam tikromis viduląstelinėmis medžiagomis. Senai nustatyta, kad pHi įtakoja skeleto bei lygiųjų raumenų susitraukimą [80].
Gimdymo metu, dėl stiprių gimdos raumenų susitraukimų gali sutrikti kraujotaka, sukelianti išemiją ir smarkų pHi kritimą, kuris, savo ruožtu, gali
sukelti susitraukimų blokavimą [81].
Įvairių autorių surinkti duomenys rodo, kad pH yra vienas iš svarbiausių veiksnių dalyvaujančių tarpląstelinės sąveikos per PJ kanalus reguliavime. Nemažai duomenų surinkta apie ląstelės vidaus rūgštinimo sukeliamą PJ užsidarymą, ypač daug dėmesio skiriama gausiausiai organizme sintetinamo Cx43 jautrumo pHi mechanizmo tyrimams. Klasikinis tarpląstelinės
sąveikos blokavimo rūgštinimu pavyzdys yra širdies išemijos atvejis. Viena vertus, manoma, kad PJ užsidarymas parūgštėjus viduląstelinei aplinkai gali turėti apsaugojimo funkciją, kad pažeidimas neišplistų į gretimas nepa-veiktas ląsteles. Kita vertus, PJ užblokavimas gali tapti barjeru veikimo potencialo sklidimui, kas, savo ruožtu, gali sukelti aritmijas [82; 83]. Įdomu tai, kad nedidelis kardiomiocitų viduląstelinės aplinkos rūgštinimas (iki pH 6.8) nulemia protonų tekėjimą į greta esančias ląsteles per PJ, ir tik didesnės rūgšties koncentracijos sukelia blokavimą [84].
Literatūroje iškeliamos kelios hipotezės, aiškinančios PJ elektrinio laidumo priklausomybės nuo pHi mechanizmus. Manoma, kad Cx43
sudaromų PJ kanalų laidumą H+ gali veikti tiesiogiai jungdamiesi prie tam tikrų amino rūgščių baltymo CT gale [85], arba netiesiogiai pH pokyčio sukeltu [Ca2+]i padidėjimu, kuris taip pat sąlygoja PJ kanalų užsidarymą
[86]. Pagal vieną iš hipotezių teigiama, kad Cx43 PJ užsidarymas rūgštinėje aplinkoje nulemiamas vidumolekulinėmis sąveikomis tarp koneksino CL ir CT dalies. Šis mechanizmas pavadintas dalelės-receptoriaus sąveika.
26
Pastebėta, kad sutrumpinus Cx43 baltymą, nukerpant jo CT dalį, baltymo jautrumas pH smarkiai pakinta [2].Tačiau jei ląstelėje kartu su modifikuotu Cx43, atskirai sintetinama CT dalis, jautrumas rūgštinimui atstatomas [87]. Tokiu būdu buvo nustatyta, kad CT blokavimo mechanizme veikia kaip dalelė.Vėliau parodyta, kad receptorius, su kuriuo sąveikauja dalelė, yra baltymo CL sritis [88]. Tačiau tie patys autoriai taip pat parodė, kad Cx45 baltymo CT domenas neturi įtakos jo sudaromų PJ kanalų laidumo reguliavimui pH. Manoma, kad baltymo Cx43 jautrumui viduląstelinio pH pokyčiams didelę įtaką turi CL domene esantys histidinai [5]. Kiti darbai rodo, kad Cx43 CT domene esančio Asp379 pakeitimas į Asn sukelia tokius pat gj-pHi priklausomybės pokyčius kaip ir CT dalies nukirpimas nuo 257
amino rūgšties, o Ser364 pakeitimas į proliną CT domene taip pat sąlygoja pakitusią Cx43 PJ kanalų laidumo priklausomybę nuo pH, nors 364-373 amino rūgščių delecija neturi jokio poveikio [89].
Reikia paminėti, kad Cx32 ir Cx46 modifikavimas nukerpant didžiąją CT dalį neturėjo įtakos jų jautrumui pHi [6; 90]. Cx32 CT domeno pradžioje
esančių argininų pakeitimas į asparaginą ar treoniną smarkiai padidino Cx32 PJ kanalų jautrumą CO2 sukeltai acidifikacijai [6]. Akivaizdu, kad
pasiū-lytas dalelės-receptoriaus pHi jautrumo mechanizmas galioja ne visoms Cx
izoformoms. Tiriant išgrynintus ir atkurtus liposomose homomerinius Cx32 bei heteromerinius Cx26/Cx32 puskanalius, buvo pastebėta, kad pH poveikis laidumui priklausė nuo naudojamo pH buferio [11]. Jautrumas pH priklausė nuo protonuotos aminosulfonatinių buferių (HEPES, MES, TAPS ir taurino) koncentracijos, o naudojant kito tipo buferius, tokius kaip maleato buferis, bikarbonatas ar Tris, pH jautrumas buvo žymiai mažesnis. Padaryta išvada, kad protonuotos aminosulfonatinių buferių formos tiesiogiai sąveikauja su koneksinais ir būtent ši sąveika nulemia Cx jautrumą pH.
Tuo tarpu, tyrimai su N2A ląstelėmis ir Xenopus oocitais, transfekuotais Cx46, parodė, kad H+ gali sąveikauti su Cx tiesiogiai [90]. Nustatyta, kad Cx46 kanalai ir puskanaliai yra jautrūs pH, išskirti du pH veikimo efektai: (1) greitas ir grįžtamas užsidarymas stebėtas taikant trumpos trukmės žemo pH poveikį; (2) negrįžtamas tarpląstelinės sąveikos blokavimas taikant ilgos trukmės poveikį. Cx46 puskanalių jautrumas citoplazminiam pH išliko ir matuojant jų laidumą su registruojančia pipete atplėšus ląstelės membranos dalį (angl. – excised patch), kas leidžia manyti, kad H+ poveikis yra tiesioginis. Remdamiesi gautais rezultatais autoriai teigia, kad pH jutiklis yra išsidėstęs Cx46 baltyme šalia poros įėjimo citoplazminėje pusėje.
Tiriant heterotipinius PJ kanalus, parodyta, kad dviejų skirtingų Cx puskanalių susijungimas nepakeičia kiekvieno iš jų jautrumo pH [91; 92].
27
Heterotipinio kanalo laidumą priklausomai nuo pH nulemia jautresnio puskanalio savybės.
Apibendrinus iki šiol surinktus duomenis apie Cx formuojamų PJ kanalų jautrumą pHi, galima matyti, kad nėra bendro sutarimo dėl konkretaus nuo
pH priklausomo reguliavimo mechanizmo. Iškeltos bent trys pH veikimo mechanizmo teorijos, pagrįstos eksperimentiniais rezultatais. Tai rodo, kad PJ kanalų reguliavimas pH yra sudėtingas procesas priklausantis nuo daugelio veiksnių, tame tarpe ir nuo Cx tipo.
1.2.4. Potransliacinio modifikavimo reikšmė plyšinių jungčių laidumo reguliavime
Koneksinams būdingos potransliacinės modifikacijos yra fosforinimas, hidroksilinimas, acetilinimas, disulfidinių tiltelių sudarymas, nitrozinimas ir fosfolipidų prikabinimas [93; 94; 95]. Daugiausiai dėmesio skiriama koneksinų fosforinimo tyrimams. Fosforinimo svarba PJ kanalų funkcijų formavime ir reguliavime parodyta bent devyniems skirtingiems koneksinams (Cx31, Cx32, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx46, Cx50 ir Cx56). Tuo tarpu, Cx26 nėra fosforinamas. Koneksinų fosforinimas skirtingomis kinazėmis, tokiomis kaip Src, baltymų kinazė C (PKC) ir mitogenu aktyvuojama baltymų kinazė (MAPK), įtakoja koneksinų ir koneksonų transportą, surinkimą, išardymą, degradavimą ir PJ kanalų atsidarymą ir/arba užsidarymą [96]. Fosforinimo poveikis PJ kanalų funkcijoms yra labai specifinis. Parodyta, kad panašios fosforinimo sąlygos gali turėti skirtingą poveikį tarpląsteliniam ryšiui priklausomai nuo koneksino tipo [97].
Daugiausia duomenų surinkta apie Cx43 fosforinimą. Įdomu tai, kad baltymų kinazės G (PKG) aktyvinimas sumažino žiurkės Cx43 PJ laidumą, tačiau neturėjo poveikio žmogaus Cx43 PJ [98]. Šį skirtumą galima paaiškinti tuo, kad iš žiurkės išskirtame Cx43 baltyme 257-oji amino rūgštis yra serinas, o žmogaus Cx43 – alaninas. Taip pat, parodyta, kad Cx43 fosforinimas PKC sumažina vienetinių kanalų laidumą, o pakeitus Ser368 alaninu šis fosforinimo poveikis nepasireiškia [99]. Kadangi PJ laidumas, gj,
priklauso nuo kanalų skaičiaus (N), vienetinių kanalų laidumo (γj) ir kanalų
atsidarymo tikimybės (Po), tikėtina, kad bendras jungties laidumas sumažės
fosforinant Cx43 PKC, kas buvo parodyta žiurkės naujagimių miocituose [100]. Manoma, kad Cx43 Ser368 yra fosforintas besidalijančiose ląstelėse, kadangi ląstelės S ir G2/M fazėse matomas Cx43 PJ laidumo sumažėjimas ir
28
Baltymų kinazės A (PKA) aktyvinimas sukėlė Cx40 ir Cx32 PJ laidumo padidėjimą hepatocituose, tačiau PKC aktyvinimas neturėjo įtakos Cx32 PJ laidumui [100]. Nors Cx26 žinomas kaip nefosforinamas baltymas, tačiau aktyvinus PKC buvo matomas Cx26 PJ kanalų pralaidumo Liuciferio geltonajam dažui sumažėjimas bei sumažėjęs vienetinių kanalų laidumas. Manoma, kad kinazių poveikis Cx26 PJ kanalų funkcionalumui pasireiškia per tarpines molekules [100].
Daugumoje žinduolių ląstelių, ekspresuojančių didelį kiekį virusinės tirozino kinazės (v-Src), PJ pralaidumas fluorescenciniams dažams žymiai sumažėjęs palyginus su ląstelėmis neturinčiomis v-Src [100]. In vitro tiriant Cx43 bei jo taškinių mutantų fosforinimą išgryninta ir aktyvinta Src kinaze, buvo nustatytos pagrindinės kinazės fosforinimo vietos: Tyr247 (Y247) ir Tyr265 (Y265) [102]. Teigiama, kad v-Src fosforina Cx43 tiesiogiai, nes išgryninta Src veikė in vitro ir poveikiui būtini kinazės SH2 bei SH3 domenai [103]. Ląstelių linijose, ekspresuojančiose Cx43 kartu su v-Src, gj
buvo žymiai mažesnis, nei ląstelėse, ekspresuojančiose tik Cx43 [104]. Be to, v-Src neturėjo poveikio dvigubo Cx43-Y247F/Y265F mutanto PJ laidumui. Vienetinių kanalų laidumas išliko nepakitęs veikiant v-Src kinaze tiek natyvų Cx43, tiek Cx43 mutantus.
Tiriant tirozino baltymų kinazių fosforinimo poveikį Cx45 formuojamų PJ kanalų laidumui buvo nustatyta, kad pervanadatas, tirozino fosfatazių slopiklis, sumažina elektrinį laidumą maždaug iki 57 % lyginant su pradiniu laidumu [105]. PJ laidumo sumažėjimas buvo lydimas Cx45 fosforinimo lygio padidėjimu. Prevanadatas, kaip ir v-Src Cx43 atveju, neveikia vienetinių kanalų laidumo. Prevanadato sukelto PJ laidumo pokytis pasiektas per 1-2 min. Manoma, kad tai per trumpas laiko tarpas, per kurį gali įvykti esminiai pakitimai, sąlygojantys kanalų skaičiaus sumažėjimą. Todėl prevanadato sukeliamas Cx45 PJ kanalų laidumo mažėjimas siejamas su kanalų atsidarymo tikimybės mažėjimu.
Nitrozinimas, prijungiant NO grupę prie cisteino tiolo grupės, taip pat gali keisti koneksinų savybes. Parodyta, kad NO sumažina Cx37 PJ pralaidumą dažams venos endotelio ląstelėse ir elektrinį laidumą kultivuojamose žmogaus kraujagyslių endotelio ląstelėse [95]. Cx43 nitrozinimas reguliuoja PJ pralaidumą kraujagyslių sienelių mioendotelio jungtyse. NO prijungimas prie Cx43 Cys271 sąlygojo kanalų atsidarymo tikimybės padidėjimą, o denitrozinimas žymiai sumažino heteroląstelių sąveiką ir, tuo pačiu, inozitolo trifosfato patekimą iš lygiųjų raumenų ląstelių į endotelio ląsteles per Cx43 PJ kanalus [106]. Nitrozinimas taip pat veikia Cx43 puskanalius. Smegenų žievės astrocitų metabolinis slopinimas
29
sąlygojo Cx43 puskanalių defosforinimą ir nitrozinimą, kas nulėmė puskanalių pralaidumo dažams padidėjimą [94].
Masių spektrometrijos metodu nustatyta, kad Cx26 gali būti acetilintas ir hidroksilintas [107]. NT domeno acetilinimas yra negrįžtama, baltymo sintezės metu atliekama modifikacija, kuri būdinga visiems baltymams, tame tarpe ir Cx26, turintiems metionino ir asparto rūgšties motyvą dvejose pirmose pozicijose (Met1-Asp2). NT acetilinimas gali turėti didelę reikšmę kanalo elektrinėms savybėms. Cx44 ir Cx49 N-galinis metioninas yra pašalinamas, todėl acetilinama yra sekanti amino rūgštis, glicinas [93]. Cx26 lizinai taip pat gali būti acetilinami. Ši modifikacija yra grįžtama. Kadangi Lys15 išsidėstęs Cx26 formuojamo kanalo poroje arčiau citoplazminio įėjimo, jo acetilinimas gali paveikti kanalo selektyvumą krūviui, o taip pat gali turėti įtakos PJ elektrinėms savybėms [107]. Baltymų hidroksilinimas yra negrįžtama modifikacija, dažniausiai paveikianti aromatines amino rūgštis, tačiau kartais taikiniu gali būti asparaginas. Kaip parodyta masių spektrometrijos metodu, Cx26 gali būti hidroksilinimas būtent per asparaginą [107].
1.2.5. Plyšinių jungčių blokatoriai
Blokatorių naudojimas dažnai taikomas tiriant PJ fiziologines funkcijas, tačiau vis dar trūksta Cx izomerui specifinių junginių. Iš dalies, ši problema kyla dėl to, kad nėra išaiškinti tikslūs esamų blokatorių veikimo mechanizmai. Baltymo sričių, su kuriomis sąveikauja cheminės medžiagos, identifikavimas, palengvintų specifinių blokatorių suradimą.
Dauguma PJ blokuojančių medžiagų yra farmokologiniai junginiai, tokie kaip gliciretino rūgštis ir jos dariniai, chinino dariniai (chininas, chinidinas, meflokvinas), anandamidas, n-alkanoliai (heksanolis, oktanolis ir kt.), fenamatai, 2-aminoetoksidifenilboratas (2-APB) ir jo dariniai, anestetikai (halotanas, etranas), poliaminai, riebiosios rūgštys ir jų amidai (arachidono rūgštis, oleamidas) ir kt. Daugumos šių medžiagų poveikis pasireiškia veikiant jomis ląsteles iš išorės, ir žymiai mažesnis efektas pastebėtas iš vidaus, t.y. dedant medžiagas į registruojančią pipetę. Tokie rezultatai interpretuojami padarant išvadą, kad junginių prisijungimo vieta yra ląstelės išorėje [108; 109]. Tačiau galima daryti prielaidą, kad hidrofobiniai blokatoriai difunduoja iš ląstelės, kadangi didelė dauguma jų yra laisvai praeinantys membraną.
Manoma, kad daugumos junginių blokavimo efektas pasireiškia per jų poveikį PJ lėtiesiems vartams. PJ blokatoriai yra nedideli junginiai
30
palyginus su kanalo poros diametru, todėl mažai tikėtina, kad jie tiesiogiai užkiša porą. Be to, parodyta, kad jie neveikia vienetinio kanalo laidumo, dažniausiai tik sumažina atsidarymo tikimybę (Po) [110; 111; 112].
Parodyta, kad blokatorių poveikiui būdingi lėti perėjimai tarp atidarytos ir pilnai uždarytos kanalo būsenos [110; 112; 113]. Šie perėjimai gali trukti dešimtis milisekundžių, todėl šis užsidarymo tipas buvo pavadintas PJ kanalų lėtaisiais vartais (žr. sk. 1.2.1). Beveik visi PJ kanalų blokatoriai ir kiti blokuojantys efektoriai, įskaitant žemą pH, halotaną, n-alkanolius, chininą ir fenamatus sąlygoja šiuos lėtus perėjimus, kas rodo, kad išvardintų junginių veikimo mechanizme dalyvauja tie patys baltymo struktūriniai elementai.
Gliciretino rūgštis ir jos dariniai yra saponinai, natūraliai aptinkami saldymedyje. Parodyta, kad α- ir β-gliciretino rūgštis bei karbenoksolonas blokuoja daugelį Cx įvairiuose ląstelių tipuose. Karbenoksolono blokavimo efektyvumas skiriasi priklausomai nuo Cx izoformos. Ląstelėse, ekspre-suojančiose Cx43, šis vaistas blokuoja tarpląstelinę srovę nepilnai net esant didelėms jo koncentracijoms [114], tuo tarpu Cx50 formuojamas ryšys tarp ląstelių visiškai panaikinamas [27]. Gliciretino rūgšties ir jos darinių veikimo mechanizmai nėra išaiškinti. Tam tikri duomenys rodo, kad šie junginiai veikia Cx43 fosforinimo būseną, kas nulemia PJ internalizaciją, sumažėjusią Cx43 raišką [115; 116; 117]. Dažniausiai tokiuose tyrimuose taikomas ilgos trukmės (> 30 min) vaisto poveikis. Kita vertus, 18α-gliciretino rūgštis (100-200 µM) sąveiką per PJ blokuoja per 10-15 min, kurių metu PJ plokštelės dydžio pokyčių nepastebėta [116]. Svarbu paminėti, kad PJ kanalai ar puskanaliai, sudaryti iš Cx neturinčių fosforinimo vietų pavyzdžiui, Cx26, taip pat yra jautrūs karbenoksolonui [118]. Literatūroje galima aptikti prieštaraujančių duomenų dėl gliciretino rūgšties ir jos darinių nespecifinio poveikio jonų kanalams ir įvairiems ląstelių procesams. Vienuose darbuose rodoma, kad karbenoksolonas neturi poveikio sužadintam sinaptiniam atsakui ir neuronų savybėms [119], kiti darbai parodo, kad ši medžiaga smarkiai paveikia hipokampo CA3 piramidinių ląstelių membranos savybes [120].
Chininas aktyvina puskanalius žuvies tinklainės horizontaliosiose ląstelėse bei Cx35 formuojamus puskanalius oocituose, tačiau blokuoja Cx43 [121; 122]. Meflokvino, naudojamo kaip antimaliarinis vaistas, pusinė Cx36 ir Cx50 PJ ryšio blokavimo koncentracija, IC50, yra 0.3 ir 1.1 µM,
atitinkamai, ir pasižymi apie 100 kartų mažesniu blokavimo efektyvumu Cx43, Cx32, Cx46 ir Cx26 PJ [123]. Tiriant chinino ir jo darinių veikimo mechanizmą parodyta, kad meflokvinas blokuoja Cx50 puskanalius, tačiau neturi įtakos Cx46, Cx26 ir Cx32 puskanalių laidumui [124]. Be to,
31
parodytas staigus meflokvino ir chinino poveikis Cx50 puskanaliams su registruojančia pipete atplėšus ląstelės membranos dalį (angl. – excised patch), kas leidžia manyti, kad šių medžiagų poveikis yra tiesioginis [27]. Šie rezultatai rodo, kad chininas ir jo dariniai mažina Cx kanalų aktyvumą, rišdamiesi su baltymu ląstelės citoplazmoje, galbūt kanalo poros viduje. Naudojant chininą ir jo darinius moksliniuose tyrimuose reikia turėti omeny, kad šios medžiagos taip pat blokuoja kitus kanalus ir transporterius. Meflokvinas blokuoja P2X7 receptorius [125], nuo įtampos priklausomus L-tipo Ca2+ kanalus, Kir6.2 ir KVLQT1 K+ kanalus koncentracijomis tik keletą
kartų didesnėmis nei reikalingos tarpląstelinio ryšio blokavimui [126; 127; 128; 129].
Fenamatai yra nesteroidiniai priešuždegiminiai vaistai, kurių nano-molinės koncentracijos blokuoja ciklooksigenazę bei Cl- sroves [130]. Cx kanalų blokavimo IC50 svyruoja nuo 40 iki 300 µM priklausomai nuo to,
koks darinys naudojamas. Nustatytas Hill koeficientas ~3 rodo, kad blokavimui reikalingas daugiau nei vienos molekulės prisijungimas prie baltymo [112].
PJ kanalus blokuoja didelė dalis hidrofobinių junginių, tokių kaip, ilgą anglies atomų grandinę turintys alkanoliai (LCCA, angl. – long carbon chain alkanols), anestetikai, riebiosios rūgštys ir jų amidai. Tam tikri literatūriniai duomenys rodo, kad šių cheminių medžiagų veikimo mechanizmas susijęs su junginių įsiterpimu į membraną ir jos takumo pokyčiais, arba lipidinės PJ aplinkos savybių pakitimais [11; 131].Tačiau yra duomenų, kad alkanoliai gali tiesiogiai sąveikauti su baltymais [132], todėl tiriant jų veikimo mechanizmą svarbu įvertinti ir šią galimybę. Žinoma, kad kuo ilgesnė LCCA grandinė, tuo stipresnis alkanolių blokavimo poveikis. Todėl heksanolis turės mažesnį poveikį nei tos pačios koncentracijos oktanolis. Anestetikai, tokie kaip halotanas ir foranas, greitai ir grįžtamai blokuoja tarpląstelinę sąveiką koncentracijomis, naudojamomis anestezijai [133]. Šių molekulių veikimo mechanizmas ir prisijungimo vietos Cx baltyme nežinomos. Kadangi anestetikai pasižymi geru tirpumu lipiduose, manoma, kad jų poveikis pasireiškia baltymo-lipidų kontakto vietoje, pavyzdžiui, išardant lipidų sąveiką su Cx [11]. Nors hidrofobiniai junginiai plačiai naudojami kaip PJ blokatoriai, parodyta, kad tam tikri alkanoliai ir anestetikai sumažina ir kitų membraninių kanalų sroves [134].
32
2. TYRIMŲ METODIKA
2.1. Ląstelių kultūros
Elektrofiziologiniai tyrimai buvo atliekami su žmogaus gimdos kaklelio vėžinėmis ląstelėmis HeLa (ATCC CCL2), transfekuotomis tiriamaisiais koneksinais be ir su fluorescencinio baltymo (EGFP, angl. – enhanced green fluorescence protein) žymeniu. Taip pat naudotos žiurkės hepatomos Novikoff ląstelės, pasižyminčios endogeninio Cx43 raiška. Ląstelės buvo auginamos CO2 inkubatoriuje 37 0C temperatūroje, DMEM (angl. –
Dulbecco‘s Modified Eagle‘s Medium) (Sigma-Aldrich, Vokietija) terpėje, pridedant 10 % fetalinio veršelio serumo (FVS) ir 1 % penicilino/streptomicino antibiotikų mišinio. Ląstelės persėjamos 2-3 kartus per savaitę. Elektrofiziologiniams eksperimentams ląstelės buvo sėjamos ant dengiamųjų stiklelių.
Laukinio tipo HeLa ląstelės ir transfekuotos koneksinų Cx36EGFP, Cx40, Cx45, Cx47 genais bei Novikoff ląstelės, turinčios endogeninį Cx43, gautos iš prof. dr. F. Bukausko laboratorijos (Ješiva universitetas, Alberto Einšteino medicinos koledžas, Niujorkas, JAV). Cx43EGFP chimera, kurioje CL kilpa pakeista Cx45 baltymo CL domenu, buvo sukonstruota mūsų laboratorijoje. Taip pat, sukonstruoti Cx45EGFP ir Cx36EGFP mutantiniai baltymai. Mutantų konstravimui naudoti pCx45EGFP-N1 ir pCx36EGFP-P plazmidiniai vektoriai. pCx45EGFP-N1 sukonstruotas mūsų laboratorijoje į pEGFP-N1 vektorių (Clontech, JAV) įvedant Cx45 baltymą koduojančią DNR seką. pCx36EGFP-P gautas iš prof. dr. F. Bukausko laboratorijos. Taškinių mutacijų įvedimo į minėtus vektorius procedūra paremta polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) metodu, naudojant „QuikChange Site-Directed Mutagenesis“ rinkinį (Agilent Technologies, JAV). Mutantinio baltymo geno įvedimas į HeLa ląsteles buvo atliekamas naudojant standartinį transfekcijos protokolą pagal gamintojo instrukcijas. Transfekcijai naudotas reagentas LipofectamineTM2000 (Life Technologies, JAV). Praėjus vienai ar dviem paroms po transfekcijos, ląstelės persėjamos DMEM terpėje su 10 % FVS ir atrankos antibiotiku geneticinu arba puromicinu, priklausomai nuo transfekcijai naudoto plazmidinio DNR vektoriaus.
33
Cx36 mutacijos buvo planuojamos bendradarbiaujant su dr. Česlovu Venclovu (Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto Bioinformatikos laboratorijos vadovas). Erdvinė Cx36 baltymo struktūra sukonstruota pagal kristalografinės Cx26 struktūros modelį, naudojant homologinio modeliavimo metodą [135]. Gautose Cx36 baltymo modelio koordinatėse nėra didžiosios dalies CL bei CT domenų. Šias sritis sunku struktūriškai charakterizuoti tiek kristolografine analize, tiek kompiuteriniu modeliavimu dėl jų neapibrėžtos konformacijos.
2.2. Elektrofiziologiniai ir fluorescencijos matavimai
Tarpląstelinio ryšio savybės per PJ kanalus buvo tiriamos fiksuotos įtampos dvigubo visos ląstelės „patch-clamp“ metodu. Dengiamasis stiklelis su paruoštomis ląstelėmis buvo dedamas į perfuzinę vonelę, įtaisytą ant invertuoto mikroskopo Olympus IX81 (Olympus, Japonija) paslankaus stalelio. Elektrodai, turintys atitinkamą galiuko formą, buvo gaminami P-97 mikropipečių traukimo prietaisu (Sutter Instrument Co., JAV) iš borosilikatinio stiklo. Elektrodo varža palaikoma apie 3 MΩ. Kiekvienai ląstelei pasirinktoje poroje įtampa paduodama atskirais „patch-clamp“ stiprintuvais Axopatch 200B (Molecular Devices, JAV) palaikant vienodą, artimą 0, ramybės potencialą, V1 = V2. Įtampos ir srovės matavimai atlikti ir
išanalizuoti naudojantis konverteriu Digidata 1440A ir pCLAMPTM programine įranga (Molecular Devices, JAV). PJ elektrinis laidumas, gj,
matuojamas pasirinktoje ląstelių poroje tam tikro dydžio įtampos šuoliuką paduodant į ląstelę 1 (ΔV1), bei palaikant pastovią įtampą ląstelėje 2, kurioje
matuojama tarpląstelinė srovė Ij = –ΔI2 (2.2.1 pav., B). Elektrinis laidumas,
gj, apskaičiuojamas pagal formulę –Ij/ΔV1.
Fluorescenciniai matavimai atlikti motorizuotu invertuotu mikroskopu Olympus IX81 ir programine įranga Cell^M (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Vokietija) arba UltraVIEW (PerkinElmerLifeSciences, Bostonas, MA, JAV). Dirbant su ląstelėmis, transfekuotomis fluorescuojančiu baltymu žymėtais koneksinais, eksperimentui buvo pasirenkama ląstelių pora, tarp kurių matoma švytinti PJ plokštelė (pav. 2.2.1 A). Sužadinimui naudotas 470 nm filtras, o emisijai registruoti – 540 nm filtras.
Kadangi EGFP fluorescencija priklauso nuo pH tam tikrose ribose (4.0 – 9.0) [136; 137], tiriant Cx36EGFP PJ laidumo priklausomybę nuo pHi, buvo
matuojamas EGFP fluorescencijos intensyvumo pokytis, pagal kurį nustatėme pHi reikšmes remdamiesi kalibracinėmis kreivėmis, peteiktomis
34
publikacijoje [137 (pagalbinėje medžiagoje pav. 7)]. Ląstelėse, transfekuotose koneksinais be EGFP žymės, pHi nustatymui naudojome
dažą BCECF. 4 µMBCECF buvo dedama į pipetę, iš kurios dažas patekdavo į ląsteles. Dažas pakaitomis sužadinamas 436 nm ir 500 nm ilgio bangomis, 0.5 s trukme, kas 15 s (išvengiant blukimo), emisijai naudojant 540 nm filtrą. 500 nm sužadinimas yra jautrus pH, tuo tarpu 436 nm sužadinimas yra žymiai mažiau jautrus pH. Išspinduliuotos šviesos prie dviejų sužadinimo bangų santykio matavimai (fonas atimtas) perskaičiuoti į pHi
reikšmes pagal kalibracinę kreivę. Kalibracinė kreivė gaunama veikiant ląsteles 6.6; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0 pH tiraplais su 20 µM nigericinu ir 140 mM kalio chloridu membranos permeabilizavimui ir pusiausvyros tarp skirtingų viduląstelinio ir išorinio pH nusistovėjimui [138].
2.2.1 pav.Elektrofiziologinių ir fluorescencijos matavimų principas. (A) HeLaCx45 ląstelių, užkrautų fluorescenciniu pH jautriu dažu BCECF, nuotrauka. Ląstelių kontakto vietoje matoma plyšinės jungties plokštelė (rodyklė). L1 ir L2 žymi ląstelę 1ir ląstelę 2, atitinkamai; MS-1 ir MS-2 žymi fluorescencijos matavimo sritis L1 ir
L2, atitinkamai; (B) srovės matavimo ląstelių poroje protokolas; (C) Cx45 būdinga gj-Vj
priklausomybė.
2.3. Tirpalai ir medžiagos
Elektrofiziologiniai tyrimai atlikti kambario temperatūroje, modifi-kuotame išoriniame Krebs-Ringer tirpale (MKR) (mM): NaCl, 140;KCl, 4; CaCl2, 2; MgCl2, 1; CsCl, 2; BaCl2, 1;HEPES, 5; gliukozė, 5; piruvatas, 2
(pH 7.4). Elektrodų pipetės pildytos vidiniu tirpalu (mM): KCl, 130; natrio aspartatas (NaAsp), 10; CaCl2, 0.26; HEPES, 5; EGTA, 2; tetraetilamonio
chloridas (TEA), 5; MgCl2, 1 (pH 7.2). Tiriant bendrą viduląstelinės magnio 0 -80 0 600 200 600 Laikas, s Ij , pA Vj , m V B A MS-1 MS-2 10 µm L1 L2 C gj , nS 0 5 10 0 -80 80 Vj, mV
