LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARINĖS MEDICINOS STUDIJŲ PROGRAMA
Sandra Grišiūtė
Silosuojamų pašarų higieninės sanitarinės kokybės
gerinimas, siekiant užtikrinti galvijų sveikatingumą
Silage feed quality improvement in order to
maintain the cattle wellness
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: doc. Dr. Violeta Baliukonienė
2 TURINYS SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.2. Mikroorganizmai silosuojamuose pašaruose ... 10
1.2.1. Bakterijos ... 10
1.2.2. Mikroskopiniai grybai ... 12
1.3. Mikroskopinių grybų antriniai metabolitai - mikotoksinai ... 12
1.4. Silosuojamų pašarų higieninės sanitarinės kokybės gerinimas ... 15
1.4.1. Eteriniai aliejai (EO) ir jų bioaktyvios antigrybiniu poveikiu pasižyminčios grupės ... 15
1.5.2 Antigrybinis augalų ekstraktų poveikis ... 16
1.5.5.Eterinių aliejų panaudojimas ... 20
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 22
2.1. Tyrimo objektai ... 22
2.2. Siloso mėginių paėmimas... ...22
2.3. Bakteriologinis tyrimas ... 22
2.4. Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičiaus (kolonijas sudarančių vienetų) nustatymas skiedimo metodu ... 23
2.5. Kultūros išskyrimas: pirmo etapo metu aptiktos mikroskopinių grybų skirtingų rūšių kultūros išgrynintos, sukaupta kolekcija. ... 24
2.6. EO poveikio įvertinimas. ... 24
2.7. Pienarūgščių bakterijų nustatymas ... 25
2.8. Mikotoksikologinis tyrimas ... 25
2.9. Statistinis duomenų įvertimas ... 26
3.TYRIMO REZULTATAI ... 27
3.1. Siloso higieninė sanitarinė kokybė ... 27
3.1.1 Siloso užsikrėtimas mikroorganizmais ... 27
3.1.2. Siloso užkrėstumas tam tikromis mikromicetų gentimis ... 28
3.2. Augalų eterinių aliejų poveikis aptinkamiems mikromicetams pašare ... 30
3.2.1.Augalų eterinių aliejų poveikis Fusarium spp. mikromicetams... 30
3.2.2.Augalų eterinių aliejų poveikis Aspergillus spp. genties mikromicetams ... 31
3
3.3. Augalų eterinių aliejų ir kai kurių vaistinių augalų ekstraktų panaudojimas... 33
3.3.1. Augalų eterinių aliejų poveikis siloso mikroorganizmams ... 33
3.3.2 Vaistinių augalų ekstraktų poveikis siloso mikroorganizmams ... 35
3.4. Mikotoksinų koncentracija kukurūzų silosą, paveikus eteriniais aliejais ... 36
3.4.1. Zearalenono koncentracija kukurūzų silose, paveikus eteriniais aliejais... 36
3.4.2. Deoksinivalenolio koncentracija kukurūzų silose, paveikus eteriniais aliejais ... 37
3.4.3.T–2 toksino koncentracija kukurūzų silose paveikus eteriniais aliejais ... 38
3.4.4.Aflatoksino B1 koncentracija kukurūzų silose paveikus eteriniais aliejais ... 38
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 40
5. IŠVADOS ... 42
PADĖKA ... 43
4
SANTRUMPOS
AFL – aflatoksinai AFL B1 – aflatoksinas B1 T–2 – T-2 toksinas Cv - įvairavimo koeficientas % DON – deoksinivalenolisKsv/g – kolonijas sudarantys vienetai grame mx- vidurkio paklaida PSCh – plonasluoksnė chromatografija p - patikimumo kriterijus ZEN – zearalenonas δ - standartinis nuokrypis - aritmetinis vidurkis δ - standartinis nuokrypis mg/kg – miligramai kilograme mm – milimetrai
EO –
eterinis aliejus µl – mikrolitras mm - milimetras SM – sausosios medžiagos µg/kg – mikrogramai kilogramui LRR – lakiosios riebalų rūgštys; A/P – acetono ir propiono santykis Cm – centimetrai5
SANTRAUKA
Darbą sudaro – įvadas, literatūros apžvalga, metodika, tyrimų rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados bei literatūros sarašas. Darbo apimtis 47puslapiai. Jame yra 3 letelės, 17 paveikslėlių.
Magistro baigiamajame darbe aprašomas silosuojamų pašarų higieninės sanitarinės kokybės gerinimas, siekiant užtikrinti galvijų sveikatingumą, kukurūzų silosą paveikus Vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris), Vaistinės juozažolės (Hyssopus officinalis), Vaistinio šalavijo (Salvia
officinalis) ir Paprastojo raudonėlio ( Origanum vulgare) eteriniais aliejais, Vaistinės juozažolės ir
Vaistinio čiobrelio eteriniais ekstraktais, bei jų žolelėmis, siekiant nustatyti Aspergillus spp.,
Fusarium spp. ir Penicilium spp. mikromicetų jautrumą.
Siekiant įvertinti, kukurūzų siloso užterštumą, siloso mėginiai buvo paimti iš įvairių Lietuvos vietovių ir įvertintas užterštumas mikroormanizmais ir mikromicetais. Nustatytas mikromicetų jautrumas Vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris), Vaistinio šalavijo (Salvia officinalis) ir Paprastojo raudonėlio ( Origanum vulgare) 100% eteriniams aliejams. Užkonservavus kukurūzų siloso žaliavą laboratorinėmis sąlygomis, po 96 dienų buvo nustatytas eterinių aliejų antigrybinis ir antibakterinis veikimas minėtiems eterininiams aliejams 1:100, 1:200 koncentracijų, Vaistinio čiobrelio ir Vaistinės juozažolės, ekstraktams ir žolelėms. Nustatytos trichotecenų (T–2), deoksinivalenolo (DON), zearalenono (ZON) ir aflatoksino B1 (AFL B1), mikotoksinų koncentracijos Vaistinio čiobrelio, Vaistinės juozažolės, Vaistinio šalavijo ir Paprastojo raudonėlio eterinių aliejų 1:200 koncentracijoje. Tyrimai atlikti LSMU VA Maisto saugos ir kokybės katedroje, gyvūnų gerovės laboratorijoje.
Išanalizavus literatūroje pateikiamus duomenis, galima teikti, kad siloso higieninei sanitarinei kokybei pagerinti galima panaudoti vaistinių augalų eterinius aliejus ir ekstraktus, įvertinant jų poveikį galvijų sveikatingumui
6
SUMMARY
The Master thesis consists of the intruduction, review of the literature, research, discussion of the results, conclusions, and the list of referens and acknowledgement. It includes 47 pages, 17 pictures, 3 tables.
The research project presented in the thesis was improvment of ensiling forage hygienic sanitary to ensure the health of cattle, affecting corn silage with Thyme (Thymus vulgaris), Hyssop (Hyssopus officinalis) ), Salvia (Salvia officinalis), Oregano (Origanum vulgare), essential oils, Hyssop and Thyme extracts and their herbs, with purpose to establish Aspergillus spp., Fusarium spp. and Penicilium spp.the sencivity of fungi.
In order to assess contamination of corn silage, it´s examples were taken from diffrent locations of Lithuania and established their contamination of microorganisms. Established the sensitivity of fungi for Thyme (Thymus vulgaris), Hyssop (Hyssopus officinalis) ), Salvia (Salvia
officinalis), and Oregano (Origanum vulgare), 100% essential oils.In fermented raw corn silage on laboratory conditions after 96 days were established antibacterial and antifungal activity of essential oils in 1:100 and 1:200 concentations, Thyme and Hyssop extraxts and herbs.In mentioned essential ois 1:200 concentrations were established T–2 toksinas, deoxynivalenol ( DON) , zearalenone ( ZON ) and aflatoxin B1 ( AFL B1) mycotoxins concentrations. Investigations were carried out in LUHS VA animal welfare laboratory of Food Safety and Quality Department.
From essential oils used in our studies the most strong antifungal and antibacterial effect demonstrated Oregano (Origanum vulgare) essential oil 1:200 concentration. Acording analysed literature this essential oil and extract could be used to evaluate effect of cattle health.
7
ĮVADAS
Pastaraisiais metais tiek Lietuvos, tiek viso pasaulio galvijų laikytojai, patiria ekonominius nuostolius susijusius su galvijo sveikatingumu, kurie siejasi su teikiama produkcija ir reprodukcinėmis funkcijomis, kuriai įtakos turi pašaro kokybė. Pašaro (siloso) kokybė priklauso nuo sanitarinių higieninių sąlygų laikymosi silosavimo metu. Dažnai silose aptinkami mikromicetai, kurie gamina ypač ntoksiškus cheminius junginius – mikotoksinus (Skurdenienė ir kt, 2007). Tai ypač aktualu, nes kai kurie mikotoksina, pavyzždiui, aflatoksinas M1 randamas piene, toksiškas priegliui ir žmonėms.
Pienarūgščių bakterijų (Lactobacillus spp.).dominavimas silose – sekmingos fermentacijos ženklas (Moran, 2005).Jos yra kokybiško siloso rodiklis. Pieno rūgšties bakterijos fermentuoja turimas augalines maistines medžiagas į organines rūgštis, sumažindama siloso pH (Knicky, 2005) nuo 3,5 iki 4,5 (Moran, 2005), kuris reikalingas jų dauginimuisi.
Mikotoksinai toksiškai veikia įvairias žinduolių rūšis (Mayer et al., 2008), Jie gali pažeisti žinduolių organus, silpninti imuninę sistemą ir mažinti gyvulių produktyvumą (Bakutis, Baliukonienė, 2010). Įvairų tyrimų duomenimis mikotoksinai į gyvulio organzmą gali patekti ne tik per pašarus, bet ir per kvėpavimo sistemą (Mayer, 2008).
Mikroskopinių grybų pagrindinė savybė ta, kad jie sugeba prisitaikyti prie bet kokių aplinkos sąlygų. Iš laukų užkrėsta kukurūzų silsoso žaliava yra pargabenami į tranšėjas, kur toliau mikroskopiniai grybai vystosi ir išskiria mikotoksinus silose.Svarbiausi ir labiausiai tiriami įvairių Europos šalių mokslo įstaigose yra Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Claviceps,
Pyrenophora genčių mikromicetai (Skurdenienė ir kt., 2007).
Įvairių tyrimų duomenimis eteriniai augalų aliejai gali būti naujų antigrybelinių medžiagų šaltinis (Pepeljnjak, et al., 2003). Daugelis eterinių aliejų veikia fungistatiškai, o didesnės jų koncentracijos veikia fungicidiškai (Cassella et al., 2002, Mickienė, 2007). Taip pat jie pasižymi ir antibakterinėmis savybėmis, Lis-Balchin (2003) pastebėjo, kad gramteigiamos bakterijos yra jautresnės eteriniams aliejams nei gramneigiamos.
Siekiant išvengti mikromicetų silose ir jų sukeliamų mikotoksikozių, buvo atltiekami tyrimai, daugelyje pasaulio šalių, paveikiant silosuojamąją žaliavą su augalų eteriniais aliejais ir ekstraktais, gerinant siloso kokybę.
Darbo tikslas: įvertinti augalinės kilmės antimikrobinių priemonių panaudojimo galimybes silosuojamų pašarų higieninei sanitarinei kokybei stabilizuoti.
Darbo uždaviniai:
8
2. Nustatyti ir įvertinti augalų eterinių aliejų ir vaistinių augalų ekstraktų silose esantiems mikroorganizmams;
3. Įvertinti augalų eterinių aliejų ir vaistinių augalų ekstraktų panaudojimo galimybes silosuojamų pašarų higieninei sanitarinei kokybei užtikrinti.
4.
Išanalizuoti ir apibendrinti literatūros duomenis apie siloso higieninės sanitarinės kokybės poveikį galvijų sveikatingumui.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Siloso higieninė sanitarinė kokybė ir jos įtaka galvijųsveikatingumui
Silosuojami pašarai — pašarai, kuriuos sudaro žolinių augalų dalys, ir iš kurių gaunamas silosas. Silosas — tai anaerobinėse (be deguonies) sąlygose, fermentuoti žali augalai, kai, mikroorganizmų veiklos pasekoje, augaluose esantis cukrus fermentuojamas į organines rūgštis, iš kurių svarbiausia yra pieno rūgštis. Silosas gali būti gaminamas ne tik iš žolių, bet ir iš kitų žalių augalų – kukurūzų vegetacinė masė, varpinių ir/ar grūdinių kultūrų vegetacinės masės ir kt., (http://www.lgi.lt/files/info/Zootechniko_zinynas.pdf priega per internetą 2013-11-23).
Silosavimo procesą galima padalinti į kelis periodus (Pahlow et al., 2003)
Aerobinė fazė
Bakterijų ir mielių veiklos rezultatas yra deguonies pašalinimas iš augalinės žaliavos. Šiame etape taip pat aktyviai veikia augalų fermentai, šviežios žaliavos pH būna pH 6,0-6,5. Po derliaus nuėmimo pašaras turi būti kuo greičiau suspaustas ir užsandarinamas, ši fazė turi būti kuo trumpesnė, kad slopintų aerobinių bakterijų aktyvumą (Knicky, 2005).
Aerobinės fazės praktiniai aspektai:
Greitai užpildyti saugyklą (1 – 2 dienas),
Susmulkinti žaliavą kaip įmanoma mažesniais gabaliukais (1 – 3 cm), Suspausti pašarą saugykloje,
Saugyklą uždaryti sandariai,
Užsandarinti kuo greičiau (Moran, 2005).
Fermentacijos fazė
Šioje fazėje vyrauja anaerobinė mikroflora (Knicky, 2005). Sėkmingos fermentacijos ženklas yra pieno rūgštis – dominuoja pienarūgštės bakterijos (Moran, 2005). Pieno rūgšties bakterijos fermentuoja turimas augalines maistines medžiagas į organines rūgštis, taip sumažindama siloso pH (Knicky, 2005) nuo 3,5 iki 4,5 (Moran, 2005). Jos turi įtakos fakultatyviniams ir abligatiniams anaerobaniams mikroorganizmams, tokiems kaip: enterobakterijos, mielės, klostridijos ir bacilos. Pienarūgščių bakterijų veikimas pagrįstas skirtingu mikroorganizmų atsparumu rūgštingumui. Pienarūgštės bakterijos yra atsparios aukštam rūgštingumui, žemam pH. Padidėjęs pieno rūgšties kiekis siloso masėje, priklauso nuo pienarūgščių bakterijų populiacijos. Tai tęsiasi, kol pH nukrenta taip žemai, kad jos slopina savo augimą. Be to, organinės rūgštys ir dujos yra pagamintos
10
fermentacijos fazės metu. Greitas siloso rūgštėjimas ir pakankamai didelė pieno rūgšties koncentracija užtikrina pH stabilumą silose (Knicky, 2005).
Stabilioji siloso fazė
Kai pienarūgštės bakterijos sunaudoja visą cukrų silose arba pH sumažėja iki 4,0 – 4,2, laikoma stabiliosios fazės pradžia (Barnhart, 2008). Esant sandariai uždarytai siloso talpai ir anaerobinėms sąlygoms, šiame periode pastebimas mažas biologinis siloso aktyvumas. Jei į siloso talpyklą patenka oro arba jis prasiskverbia pro nesandarius plyšius, siloso masėje, esant aerobinėms sąlygoms, gali pradėti daugintis mielės, mikroskopiniai grybai ir bakterijos (Nadeau et al., 2008).
Šėrimo etapas
Kai siloso talpa yra atidaroma, jos paviršius vėl paveikiamas deguonies (Nadeau ir kt., 2008), padidėja aktyvumas nepageidaujamos mikrofloros: mielių, mikroskopinių grybų ir acto rūgšties bakterijų (Knicky, 2005), bacilų ir enterobakterijų (Moran, 2005), nepageidaujama mikroflora gali daugintis ir tokiu būdu pabloginti siloso kokybę. Šie organizmai likusį augalų cukrų (gliukozę), pieno rūgštį ar kitas energijos turinčias medžiagas transformuoja į anglies dioksidą, vandenį ir šilumą. Kai silosas gauna deguonies ir jo pH padidėja iki 7,0 ir daugiau, fermentinės rūgštys yra sunaikinamos. Šiluma ir mielių (alaus) kvapas yra pirmas aerobinio gedimo ženklas. Šios pašaro gedimo priežastys sukelia padidėjusius sausųjų medžiagų (SM) nuostolius, taip pat atsiranda ir toksinių mikroorganizmų produktų (toksinų), gadinančių siloso skonines savybes ir mažina pašaro energetinę vertę (Nadeau et al., 2008).
1.2. Mikroorganizmai silosuojamuose pašaruose 1.2.1. Bakterijos
Siloso higieninė sanitarinė kokybė priklauso nuo jame esančių mikrooganizmų. Siloso mikroflora galima padalinti į dvi grupes: į pageidaujamas ir į nepageidaujamas. Pageidaujamiems priskiriamos pienarūgštės bakterijos, o prie nepageidaujamų anaerobinių priskiriamos klostridijos ir enterobakterijos, prie aerobinių - mielės, mikroskopiniai grybai ir Listeria spp. Daugelis šių organizmų ne tik mažina siloso maistinę vertę, bet taip pat turi įtakos gyvūno sveikatai ir/arba pieno kokybei (Driehuis, Elferink, 2000).
Pienarūgštės bakterijos
Pienarūgštės bakterijos priklauso epifitiniams mikroorganizmams, aptinkamos ant žemesnių augalų dalių (Knicky, 2005). Jos gali būti klasifikuojamas į obligatine homofermentines,
11
fakultatyvine heterofermentines, arba obligatines homofermentines. Obligatinėms homofermentinėms priskiriama: Pediococcus damnosus ir Lactobacillus ruminis gaminančios 85 proc. pieno rūgšties iš heksozės (tirpios gliukozės). Fakultatyvinėms heterofermentinėms priskiriama: Lactobacillus plantarum, L. pentosus, Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus ir
Enterococcus faecium taip pat gaminančios pieno rūgštį iš heksozės. Obligatinėms
heterofermentinėms priskiriama: L. brevis, L. buchneri ir Leuconostoc mesenteroides (Fulgueira, Amigot et al., 2007) fermentuoja heksozes į pieno rūgštį, acto rūgštį arba etanolį ir CO2 (Knicky, 2005).
Enterobakterijos
Enterobakterijos yra fakultatyviniai anaerobiniai organizmai. Dažniausiai silose esti ne patogeninės jų padermės. Jos yra nepageidaujama siloso mikroflora, dėl savo sacharolitinių ir proteolitinių savybių, jų dėka, jos konkuruoja su pienarūgštėmis bakterijomis. Taip nutinka, fermentacijos pradžioje, prieš pradedant pieno rūgšties bakterijoms dominuoti fermentacijos fazėje. Enterobakterijos angliavandenius skaido dviem sacharolitiniais fermentais. Pirmoji fermentacija būna mišri ir charakterizuojama pieno rūgštimi, acto rūgštimi, gintaro rūgštimi ir skruzdžių rūgštimi. Tokios fermentacijos metu pH yra 6,3, butadiolinės fermentacijos metu gaminamas 2.3-butanediolis. Nepaisant to, enterobakterijos jautrios žemam pH (4,5) (Knicky, 2005), kurį vėliau sumažina pieno rūgšties bakterijos. Be to, enterobakterijos gali gaminti azoto dioksidą (NO2), azoto monoksidą (NO) ir amoniaką (Fulgueira, Amigot et al., 2007).
Bacilų bakterijos
Bacillus spp. yra lazdelės formuojančios endosporas, jos nuo klostridijų skiriasi savybė augti
aerobinėmis sąlygomis. Fakultatyvi anaerobinė bacila gali fermentuoti įvairius angliavandenius ir išskirti etanolį, glicerolį, Bacillus cereus, B. lentus, B. firmus, B. sphaericus, B. licheniformis, ir B.
Polymyxa. Tačiau jos fermetacijos fazėje vaidina tik antraeilį vaidmenį ir gadinti silosą tik
dauginantis mikroskopiniams grybams (Knicky, 2005).
Klostridijos
Klostridijos yra anaerobinis mikroorganizmas formuojantis endosporas. Daugelis iš jų gali fermentuoti angliavandenius ir baltymus. To rezultatas sumažėjusi maistinė siloso vertė, kaip ir enterobakterijos jos gamina biogeninius aminus, kurie yra kelių problemų priežastys. Klostridijos gali būti randamos išmatose ir užkrėsti pieną. Išskiriamos dvi klostridijų grupės: sacharolitinės (Clostridium butyricum, Cl. tyrobutyricum) ir proteolitinės (Cl. bifermentants, Cl. sporogenes, Cl.
12
siloso pH, tuo tarpu antroji grupė skaido amino rūgštis į sviesto rūgštį ir acto rūgštį, aminus, CO2 ir NH3, taip pat didindama pH (Fulgueira, Amigot et al., 2007).
Klostridijos galvijams yra pavojingos, jos gali sukelti infekcinį nekrotinį hepatitą (INH), piktybinę edemą, stabligę, botulizmą, „juodą koją“, tai klostridijų sukelta liga, kurios metu pažeidžiami galinių kojų raumenys (NADIS, 2013).
Listerijos
Listeria monocytogenes yra patogeninė fakultatyvinė anaerobinė bakterija keletui gyvūnų
(karvėms, avims ir ožkoms). Karvė su laikinai nusilpusiu imunitetu yra įtariama serganti listerioze. Padidėję susirgimai listerioze, siejami su naudojimu didelių siloso rulonų, kai silosas jame yra nepakankamai suspaustas (ne tankus), todėl siloso fermentacija ribojama, o L. monocytogenes gali daugintis. Listerijų dauginimasis ir išgyvenimas tokiame silose apibrėžiamas kaip netaisyklingo laikymo anaerobinėmis sąlygomis ir sumažėjusia pH verte. Todėl L. monocytogenes auga kai pH -3,2 ir 4,2 (Fulgueira, Amigot et al., 2007).
Užsikrėtimas pašarų šiomis bakterijomis karvei sukelia abortą, centrinės nervų sistemos ligas ir mirtį (Borucki, Reynolds et al., 2005).
1.2.2. Mikroskopiniai grybai
Mikroskopiniai grybai yra grupė organizmų, esanti visur ir egzistuoja kaip saprofitai arba ant augalų. Fusarium, Alternaria, Penicillium ir Aspergillus, tai gentys, dažniausiai aptinkamos pašaruose (Juraček et al., 2009), tai mikroskopiniai grybai, kurie išskiria mikotoksinus.
1.3. Mikroskopinių grybų antriniai metabolitai - mikotoksinai
Mikotoksinai – tai antriniai mikroskopinių grybų metabolitai, kuriuos išskiria mikroskopiniai grybai, kaip reakcija grybo į augalų junginius (dikumarolį) ar pakitusias aplinkos sąlygas (Yiannikouris et al., 2002). Mikotoksinai gali padidinti susirgimų skaičių ir sumažinti produkcijos efektyvumą. Bendras kai kurių mikotoksinų bendrasis poveikis yra:
Sumažina pašaro įsisavinimą,
Sumažinta maistinių medžiagų absorbciją ir metabolizmą, Virškinimo sutrikimai, įskaitant hemoragiją ir nekrozę, Audinių ir organų pakenkimas,
Galūnių gangrenavimas,
Paveikimas endokrininės sistemos,
Reprodukcinius sutrikimai, embrionų mirtis, abortai,
13
Nusilpusi imuninė sistema, Gaišimas (Knicky, 2005).
Aflatoksinai
Šiuos toksinus išskiria Aspergillus flavus ir Aspergilus parasiticus. Pagrindiniai mikotoksinai yra: aflatoksins B1 ir aflatoksinas B2, aflatoksinas G1 ir G2 ir aflatoksinas M1, kuris randamas karvių piene, yra oksiduotas metabolitas iš aflatoksino B1 (Gallo, 2007). Yra žinoma, kad aflatoksinas B1 yra hepatotoksiškas, pasižymi teratogeniniu veikimu, imunotoksiniu, genotoksiniu ir galvijas gali nugaišti (Aslan, 2011). 1 lentelėje pateikti duomenys apie kukurūzuose nustatytas aflatoksinų (bendrai) koncentracijas. Aflatotoksino M1 piene leistina koncentracija yra 0,05 µg/kg (Komisijos reglamentas (EB) Nr. 401, 2006). Ūmios aflatoksikozės simptomai galvijams: letargija, ataksija, šiurkštūs ir pasišiaušęs kailis, blyškumas, suriebėjusios kepenys. Lėtinės aflatoksikozės simptomai: sumažėjęs pašaro pasisavinimas ir apetitas, sumažėjusi pieno produkcija, gelta. Sulėtėjęs augimo greitas gali būti lėtinės aflatoksikozės ir kitas mikotoksikozės priežastimi. Mechanizmas, pagal kurį aflatoksinai lėtina augimo greitį, gali būti susijęs su pažeidimais baltymų, angliavandenių ir lipidų metabolizme (Whitlow, 2006).
Deoksinivalenolis (DON) arba Vomitoksinas
Deoksinivalenolis yra antrinis Fusarium genties gaminamas mikotoksinas (Meyer et al., 2008).Atrajotojai yra gana atsparūs šiam mikotoksinui, dėl prieskrandžio mikrofloros detoksinio potencialo (Valenta et al.,2003). Jis gali pažeisti žinduolių organus, silpninti imuninę sistemą ir mažinti gyvulių produktyvumą (Bakutis, Baliukonienė, 2010).
T–2 toksinas
T–2 toksinas yra vienas toksiškiausių trichotecenų tipo toksinas (Biomin Gmbh, 2008). A grupės trichotecenai yra toksiškesni už B grupės trichotecenus (Hope, Aldred, Magan, 2005). Svarbiausi A grupės yra T-2 ir HT-2 toksinai, kuriuos sintetina Fusarium equiseti, F. langsethiae,
F. poae, F. sporotrichioides. Šios rūšies grybų produkuojami mikotoksinai gali sukelti žmonių ir
gyvūnų mikotoksikozes.
T-2 toksinas gali sukelti: gastroenteritą, plonųjų žarnų hemoragijas, skrandžio ir prieskrandžio opaliges, depresiją, užpakalinių galūnių koordinacijos sutrikimus ir gyvulio gaišimą (Hagler, 2006).
Zearalenonas (ZON)
Zearalenonas yra Fusarium spp. išskiriamas mikotoksinas, kuris savo chemine struktūra panašus į estrogeną irgali sukelti estrogeninį atsaką gyvūnui. Randamas ant kukurūzo stiebo, lapo
14
puviniuose. ZON sukelia:vaginitą, sumažėjusią reprodukcinę funkciją, sumažėjusią pieno produkciją, diarėją, telyčioms padidėjusią pieno liauką ir visišką reprodukcijos išnykimą (Whitlow, Hagler, 2010).
Ochratoksinas A (OTA)
Ochratoksinas A yra nefropatinis ir kancerogeninis mikotoksinas, kurį gamina Penicillium
verrucosum vidutinio klimato sąlygose ir Aspergillus spp.,kaip A. ochraceus, A. melleus, A. carbonarius ir A. niger šiltesnėse ir tropinėse pasaulio dalyse. Toksinas aptinkamas karvių piene.
Atrajotojai šiam toksinui mažiau jautrūs (Rosa et al., 2008).
Fumonizinai (FB)
Fumonizinai dažniausiai yra gaminami Fusarium verticillioides (sin. moniliforme), F.
proliferatum rūšys. FB1 toksinas beveik netoksiškas galvijams, ypač mėsiniams galvijams.
Suaugusiems galvijams 148 ppb sukelia lengvą kepenų pažeidimą, limfocitų blastogenezę, kepenų fermentų padidėjimą (Diaz et al., 2000). Intoksikacijos ženklas yra ir padidėjęs serumo fermentų aktyvumas, diagnozuojant kepenų fermentus, lengvas hepatocitų pažeidimas, padidėjusi limfoblastogenezė (Fink – Gremmels, 2008). Lentėlėje Nr. 1 pateiktas mikotoksinų poveikis galvijui.
1 lentelė. Mikotoksinai ir jų poveikis gyvūnams
(https://www.dairylandlabs.net/pages/interpretations/molds_toxins.php prieiga per internetą 2013.09.20) Toksinai Toksiški mikroskopiniai grybai Žemės ūkio augalai, paveikti mikroskopiniais grybais
Gyvūnai Biologinis poveikis
Aflatoksinai Aspergillus
flavus
A. parasiticus
Javų grūdai Galvijai Hepatotoksikogeninis;
Kancerogeninis; Sulėtėjęs augimas; Apetito praradimas; Kraujavimas; Padidėjęs jautrumas kitoms ligoms. Zearalenonas Fusarium graminearum F. tricinctum F. oxysporum
Kukurūzai Galvijai Hyperestrogeninis;
Rektovaginalinis; Gimdos iškritimas Išsiplėtusi vulva; Pseudo nėštumas; Padidėjusi pieno liauka; Nevaisingumas;
15 1 lentelės tęsinys. T-2 Toksinas Fusarium Tricinctum F. Avenaceum F. Solani F. Graminearum F. Nivale Fusarium Lateritium Apdirbti Javų Grūdai, Šienas Galvijai Kraujavimas; Virškinamojo trakto Uždegimas; Vėmimas; Apetito Praradimas; Sumažėjusi Pieno Gamyba.
Deoksinivalenolis Fusarium graminearum Apdirbti javų grūdai Galvijai Vėmimas; Apetito praradimas; Viduriavimas; Svorio netekimas. Fumonizinai Fusarium moniliforme F. proliferatum Javų grūdai, apdirbti Kukurūzai Galvijai Nefrotoksinis; Abortai;
1.4. Silosuojamų pašarų higieninės sanitarinės kokybės gerinimas
1.4.1. Eteriniai aliejai (EO) ir jų bioaktyvios antigrybiniu poveikiu pasižyminčios grupės Bioaktyvūs junginiai yra natūraliai išskiriami augaluose kaip antriniai metabolitai (Castillo et al., 2012). Jiems yra priskiriami šie bioaktyvūs junginiai: karvakrolas, cineolis, citralis, citronelolis, geraniolis, linalolis, mentolis, timolis (Barrera-Necha et al., 2009), taninai, flavanoidai, alkaloidai (Castillo ir kt., 2012), terpenoidai yra žinomi kaip pasižymintys analeptiniu, antibakteriniu, antigrybiniu, antivėžiniu ir sedatyviniu veikimu (Jäger, 2010).
Eterinių aliejų antibakterinės savybės
Lis-Balchin (2003) pastebėjo, kad gramteigiamos bakterijos yra jautresnės eteriniams aliejams nei gramneigiamos, dėl mažesnio jų membranos komplekso struktūros. Karvakrolis yra pagrindinė sudedamoji medžiaga Paprastajame Raudonėlyje (Origanum vulgare), kuri veikia stipriai antibakteriškai (Baser, 2008). Pastebėtas antagonistinis ir sinergistinis veikimas komponentų, įeinančių į eterinių aliejų sudėtį (Burt, 2004). Vertinant mažiausią slopinamąją raudonėlių koncentraciją ir dviejų jo sudedamųjų dalių timolio ir karvakrolio prieš Staphylococcus aureus ir
Pseudomonas aeruginosa, Lambert et al. (2001) pastebėjo, kad šie junginiai kartu veikia
antibakteriškai stipriau nei po vieną. Delaquis et al. (2002) ištyrė antibakterinį aktyvumą nepaveiktų aliejų ir distiliuotų frakcijų krapo (Anethum graveolens L.), kalendros (Coriandrum sativum L.) sėklų, kalendros (C. sativum L.) lapų ir eukalipto (Eucalyptus dives) su šiomis bakterijomis: S.
16
typhimurium; L. monocytogenes; S. aureus; P. fragi; S. grimesii; E. agglomerans;Y. enterocolitica; B. cereus.
Nepaveiktų aliejų antibakterinis aktyvumas yra silpnesnis nei distiliuotų frakcijų. 2 lentelėje pateikta kelių augalų antibakteriniu poveikiu pasižyminčios medžiagos.
2 lentelė. Antibakteriniu poveikiu pasižyminčios augalų medžiagos (Chao et al., 2000)
Augalo pavadinimas Augalo dalis Antibakteriniu poveikiu
pasižyminti medžiaga Paprastasis raudonėlis
(Origanum vulgare)
Visas augalas Fenoliai (40%
seskviterpenai, 12.5% laisvi alkoholiai, iki 5% geranolio acetatas) Paprastasis čiobrelis (Thymus serpyllum) Žiedai Timolis Vaistinė juozažolė (Hyssopus officinalis)
Žiedai Pineno, cineolio,
kamfeno, seskviterpeno; organinių rūgščių, glikozidų, flavonoido diosmino
Vaistinis šalavijas (Salvia officinalis )
Lapai 2,5% cineolis, tujonas,
tujolis, pinenas, salvenas, borneolis
1.5.2 Antigrybinis augalų ekstraktų poveikis
Žolelių ekstraktai – tirpūs veiklieji vaistiniai ir skoniniai komponentai išskirti iš inertiškosios, pluoštinės žolės medžiagos (Hoffmann, 2000). Keletas in vitro atliktų tyrimų parodė stiprų antibakterinį poveikį, augalų ekstraktų prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas (Frankič et al., 2009).
Šaknyse, esanėčios fungitoksinės medžiagos atlieka apsauginę funkciją. Daugiau nei dvidešimt medžiagų, priklausančių izoflavanoidų grupei, buvo izoliuota iš Baltojo lubino šaknų. Borbonol – 2 hidrokarbonatinis laktonas, veikantis antigrybiškai taip pat buvo izoliuotas iš Persea
borbonica (redbay) šaknų (Harborne et al., 1976; Thara et al., 1984).
Viena iš svarbiausių augalo medžiagų sintezės yra fitoaleksinai, kurie išskiriami, kai augalą veikia patogeninis mikroorganizmas. (Darvill ir Albersheim, 1984; Ebel, 1986; Fagboun et al, 1987;. Adesanya et al, 1989;. OSBOURN, 1996). Jau seniai padaryta išvada, kad fitoaleksinai apsaugo augalą nuo grybelio (Brooks et al., 1986, 1987). Dėl savo veiklos efektyvumo, biologinės
17
saugos augalų ekstraktai yra idealūs biokonservantai maiste ir pašaruose (http://scholar.google.lt/scholar?q=PLANT+EXTRACTS+AS+ANTIMICROBIALS%3A++PROS PECTS+IN+FOOD+SAFETY+AND+HEALTH+PROTECTION++tayel+&btnG=&hl=lt&as_sdt= 0%2C5 priega per internetą 2013-10-12).
1.5.3. EO augalai pasižymintys antigrybiniu ir antibakteriniu veikimu
Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris) ir Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare) atlikto tyrimo metu stipriai veikė antifungicidiškai (Mota ir kt., 2012).
Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris)
Lietuvoje retas, daugiametis, 20-30 cm aukščio puskrūmis (http://www.vitamin.lt/vaistazoles/ciobrelis.html prieiga per internetą 2013 - 10-11). Vaistinio čiobrelio eterinio aliejaus sudėtyje yra timolio ir karvakrolio (Kummer ir kt., 2012). Todėl jis skatina virškinimą, mažina vidurių pūtimą, yra puikus antiseptikas ir veikia raminančiai.
Taip pat pasižymi stipriu antigrybiniu veikimu prieš Candida, Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium, Fusarium ir Cryptococcus genties mikroorganizmus, bei kitas bakterijas (Mota, Pereira
ir kt., 2012). Buvo nustatyta, kad čiobrelio (Thymus vulgaris) eterinis aliejus pasižymi antibakteriniu, priešgrybiniu ir antitoksiniu veikimu Taip pat tyrimai in vitro parodė, kad eterinis aliejus pasižymi antibakteriniu veikimu prieš L. monocytogenes, Salmonella typhimurium,
Esherichia coli, Bacillus cereus ir Staphylococcus aureus (Kuddusi ERHAN ir kt., 2006).
Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare)
Raudonėlio gentyje egzistuoja apie 38 rūšių (Radušienė, 2008). Kilęs raudonėlis iš Pietų Europos, o dabar aptinkamas visoje Europoje iki Skandinavijos, taip pat Centrinėje ir Šiaurės Amerikoje. Paplitęs rytinėje Lietuvos dalyje (Mockute ir kt., 2003), auga sausose pievose ir saulėtuose šlaituose, retuose miškuose, pamiškėse, kalvose, kalkinguose ir pakankamai derlinguose dirvožemiuose. Pasitaiko beveik visoje Lietuvoje, išskyrus Vidurio lygumos šiaurinius rajonus.
Raudonėlyje yra 0,12-1,2% eterinio aliejaus, kurio 12,5%, laisvi alkoholiai ir iki 5% geraniolio acetatas, taip pat rauginių medžiagų, lapuose - 565, žiedynuose - 166, ir stiebuose - 58 mg% askorbino rūgšties. Paprastajame raudonėlyje yra flavonoido apigenino, pasižyminčio antivėžiniu veikimu. Sėklose yra iki 28% greitai džiūstančio aliejaus pagrindinę dalį sudaro fenoliai (iki 40 %), seskviterpenai (http://lt.wikipedia.org/wiki/Paprastasis_raudon%C4%97lis prieiga per internetą 2013.11.19).
18
Paprastasis raudonėlis pasižymi antibakteriškiu ir antifungicidiniu poveikiu, atlikti tyrimai Vakarų Kentukio Universiteto mokslininkų parodė, kad raudonėlis stipriai antifungicidiškai veikia
Candida ir antibakteriškai C. neoformans (Adams, 2008).
Vaistinis šalavijas (Salvia officinalis)
Vaistinis šalavijas – daugiametis, pusiau sumedėjęs, stipriai kvepiantis puskrūmis, užaugantis iki 60 cm. Lietuvoje savaime neauga. Lietuvoje auga ir kelios kitos šalavijų rūšys: lipnusis šalavijas (Salvia glutinosa L.), austrinis (geltonžiedis) šalavijas (Salvia austriaca), menturinis šalavijas (Salvia verticillata L.), raudonžiedis šalavijas (Salvia splendens), kvapusis šalavijas (Salvia sclarea L.), darželinis šalavijas (Salvia horminium L.), pievinis šalavijas (Salvia pratinsis L.), miškinis šalavijas (Salvia silvestris L.). Vaistinei žaliavai naudojami šalavijo lapai (Folia Salviae). Lapuose yra iki 2,5% eterinio aliejaus (cineolis, tujonas, tujolis, pinenas, salvenas, borneolis ir kt.), rauginių medžiagų, kartumynų, flavonoidų, vitaminų, organinių rūgščių, fitoncidų (http://www.esat.lt/vaistazoles.php?lt=vaistinis_salavijas priega per internetą 2013-11-15). Šalavijo eterinis aliejus efektyviausiai veikia Trichopfyton spp. mikroskopinius grybus (Sokovič ir kt., 2012).
Vaistinė juozažolė (Hyssopus officinalis)
Tai daugiametis puskrūmis, užaugantis iki 80 cm aukščio. Vaistinė augalinė žaliava – antžeminė augalo dalis. Pjaunamos žydinčios viršūnėlės su lapeliais (http://www.infomed.lt/lt/2/Infomed_plius/vaistazoliu_katalogas,id,d3c805d234 prieiga per internetą 2013-11-15).
Hyssopus officinalis tyrimo metu parodė stiprų antifungicidinį aktyvumą minimalus
inhibitorinis kiekis buvo 5 µl/ml ir minimalus antifungicinis kiekis 15 – 20 µl/ml (Glamočlija, Sokovič et al., 2005). Taip pat pasižymi antibakteriniu, antivirusiniu ir antiseptiniu veikimu (Jukojoveč et al., 2005).
Eterinių aliejų poveikis galvijų prieskrandžių mikroorganizmams.
Eteriniai aliejai buvo tirti daugelį metų, siekiant pagerinti siloso skonines savybes ir ištirti kaip jie veikia prieskrandžio bakterijas (Oh et al., 1968). Kadangi EO turi stiprias antimikrobines savybes, todėl jie buvo naudojami kaip pašarinis priedas silose.
Karvių didžiajame prieskrandžyje vyrauja anaerobinė mikroflora. Eteriniai aliejai gali slopinti padidėjusį amoniaką gaminančių bakterijų veikimą didžiajame prieskrandyje, o dėl to sumažėja ir amino rūgščių deamininimas (Wallace, 2004; Patra ir Ligira, 2009b). Mclnotch et al., (2003) pastebėjo, kad eteriniai aliejai slopina augimą, kai kurių amoniaką gaminančių bakterijų (t. y.
19
Clostridium sticklandii ir Peptostreptococcus anaerobius), bet kitos amoniaką gaminančios
bakterijos (pvz., Clostridium aminophilus) buvo mažiau jautrios. Amoniaką gaminančios bakterijos turi aukštą gebėjimą generuoti amoniaką iš amino rūgščių (Wallace et al., 2002). Mažomis dozėmis, EO (karvakrolis, timolis, p-Cimenas, ƴ-terpeninas) mišinys gali selektyviai slopinti amoniaką gaminančių bakterijų veiklą, tačiau kitiems mikroorganizmams reikia didesnės koncentracijos sukelti norimam efektui. EO gali slopinti kolonizacija ir (arba) virškinimą, lengvai suskaidomų substratų. EO Amilolitinėms ir proteolitinėms bakterijoms celiulozės virškinime neturėjo įtakos (Wallace et al., 2002).
Didžiojo prieskrandžio pirmuonys. Mclnotch ir kt., (2003) pastebėjo, kad EO (karvakrolis, timolis, p-Cimenas, ƴ-terpeninas) mišinys maži kiekiai melžiamų karvių pašare prieskrandžio blakstienuotųjų pirmuonių antibakteriškai neveikė. Taip pat Newbold et al. (2004), Benchaar ir kt. (2007a) pranešė, kad melžiamų karvių prieskrandžio pirmuonių skaičius nekinta, pašarą paveikus EO (karvakrolis, timolis, p-Cimenas, ƴ-terpeninas) mišiniu. O į pašarus įmaišius pipirmėčių eterinį aliejų, pirmuonių skaičius sumažėja (Ando et al., 2003).
Bendra lakiųjų riebalų rūgščių (LRR) koncentracija didžiajame prieskrandyje, veikiant EO, turėjo mažai įtakos (Chaves et al., 2008a; Malecky et al., 2009; Patra et al., 2010) o jų koncentracija ypač sumažėjo (Macheboeuf et al., 2008; Kumar et al., 2009), naudojant didesnes EO koncentracijas. Yra atlikta keletas tyrimų rodančių, kad padidėjusi LRR koncentracija didžiajame prieskrandyje priklauso nuo cinamaldehido priedo nuo 0,2 kg-1
SM pasisavinimo (Chaves et al., 2008b) iki 0,25-1 kg SM pasisavinimo raudonėlio eterinio ekstrakto. EO gali slopinti azotą gaminančių bakterijų populiacijos veiklą didžiajame prieskrandyje, bet jos dalyvauja deamininimo reakcijose (Russell ir kt., 1988 m.; Wallace, 2004). Tai gali būti naudinga mažinant amoniako kiekį prieskrandyje ir gerinant baltymų įsisavinimą (Wallace et al., 2002).
Pipirmėčių eterinis aliejus turi didelę įtaką metanogenezei (Tatsouka et al., 2008; Agarwal et al., 2009). Yra žinoma, kad pipirmėčių aliejuje yra mentolio, mentylio ir mentylio acetato, mentolis pasižymi antimikrobinėmis savybėmis (Makao, Blumberg, 2006). 3 lentelėje parodyta metano gamyba ir fermentacija didžiajame prieskrandyje iš Vaistinio čiobrelio, paprastojo raudonėlio, eukalipto išskyrus timolį, mentolį išskyrus iš pipirmėtės ir eukalipto, karvakrolį iš paprastojo raudonėlio. Lentelėje Nr.2 matyti, iš čiobrelio išskirtasntimolis metanogenezę didina, iš eukalipto ir pipirmėtės išskirtas timolis – didina, iš raudonėlio išskirtas karvakrolis – mažina.
20
3 lentelė. Metano gamyba ir fermentacija didžiajame prieskrandyje (Patra, Saxeua, 2010)
Eterinio aliejaus veiklioji medžiaga, augalas
Dozė Metano dujų
gamyba Poveikis didžiajam prieskrandžiui Nuoroda Karvakrolis iš Paprastojo raudonėlio (origanum vulgare) 1,5-5mM sumažėjo LRR Macheboeuf et al. (2008) Timolis, mentolis iš Eukalipto (Eucaliptus) 2 ml didina Virškinamumas nepakito, pirmuonių skaičių sumažėjo Sallam et al. (2009) Mentolis iš Pipirmėtės (Mentha piperita) 2 ml didina Virškinamumas, LRR, pirmuonių skaičius sumažėjo, A/P sumažėjo Agarwal et al.,(2009) Timolis iš Paprastojo čiobrelio (Thymus vulgaris) 0,5–3 ml didina LRR sumažėjo, A/P sumažėjo Macheboeuf et al., (2008)
LRR – lakiosios riebalų rūgštys prieskrandyje, A/P – acetato ir propionato santykis.
Pieno produkcija ir sudėtis
Eterinių aliejų poveikis pieno produkcijai yra pastovus. Santos et al. (2010) pastebėjo, kad šeriant EO mišiniu, kurio sudėtyje yra eugenolio, geranilo acetato, kalendros eterinis aliejus, kaip pagrindinis komponentas padidino pieno riebumą (procentinis riebumas), bet neturėjo įtakos pieno produkcijai ir jo sudėčiai. Padidėjusi riebalų sintezė gali būti susijusi su sustiprėjusia acetato produkcija ir/arba acetato ir propionato produkcijos santykis didžiajame prieskrandyje, galėjo įtakoti EO priedas (Benchaar et al., 2007b; Agarwal et al., 2009) arba energijos panaudojimas iš kūno (Santos et al., 2010). Be to, yra tendencija, kad šeriant EO sumažėjo sausųjų medžiagų pasisavinimas, be jokios įtakos pieno kiekiui ir papildomo maisto medžiagų (pašaro) davinio (Santos et al., 2010).
1.5.5.Eterinių aliejų panaudojimas
Eteriniai aliejai naudojami fitomedicinoje, taip pat kaip pašarų konservantai, dedami į maistą, nes pasižymi antigrybiniu, antimikrobiniu veikimu. Fitomedicinoje naudojami gydant įvairius susirgimus, taip pat naudojami stresui mažinti (pvz., Šalavijas). Stipriu antifungicidiniu veikimu pasižymi raudonėlių eterinis aliejus. Vaistinis šalavijas, Vaistinis čiobrelis, Vaistinė juozažolė ir Paprastasis raudonėlis savo sudėtyje turi tujonų, tujolių, pinenų, fenolių, karvakrolių, kurie pasižymi antifungicidinėmis savybėmis, gerina organizmo bendrą savijautą. Gerai veikia dermatofitus,
21
Candida spp., Aspergilus spp., Rhysopus spp. (Sokovič et al., 2012; Mota, Pereira et al.,2012;
Adams, 2008; Glamočlija, Sokovič et al., 2005). EO, kaip priedas pašare (silose) teigiamai veikia prieskrandžių fermentaciją ir atrajotojų produkciją. EO gali slopinti amoniaką gaminančių bakterijų veiklą, kurios didina amoniako kiekį prieskrandyje. Taip pat EO gali ir reguliuoti prieskrandžio bakterijų augimą (Benchaar et al., 2008). Monoterpenų mišinys (α – pinenas -16,0%, β – pinenas – 2,2%, linalolas- 45,2%) neturi įtakos siloso virškinamumui (Malecky, 2009). Teigiamai veikia monoterpenai (timolis, karvakrolas, mentolis, pinenas, fenoliai) (Kamara et al., 2006).
22
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS 2.1. Tyrimo objektai
Tiriamasis darbas buvo pradėtas 2012 metais vasario mėnesį. Tyrimams buvo naudotas kukurūzų silosas iš skirtingų Lietuvos vietovių, ištirta 20 mėginių. Tyrimas buvo atliekamas trimis etapais. Pirmame etape nustatytas bendras gyvybingų mikroorganizmų skaičius, gyvybingų mikroskopinių grybų skaičius, pienarūgščių bakterijų skaičius, po to išskirtos mikroskopinių grybų kultūros.
1 pav. I etapo tyrimo schema
2.2. Siloso mėginių paėmimas: Iš pradžių imami pirminiai ėminiai, iš jų ruošiamas vidutinis ėminys. Imant ėminį, tranšėja sąlyginai suskirstoma kvadratais. Iš kiekvieno kvadrato vidurio, pašalinus dengiamąjį sluoksnį ir pradūrus plėvelę, imamas siloso mėginys.Tranšėjoje pirmas ėminys imamas iš 1 m gylio. Paskui, toje pat vietoje imamas antras ėminys iš 140-150 cm gylio ir trečias ėminys – iš 180-190 cm gylio. Gerai sumaišius ruošiamas tyrimui 1 kg vidutinis ėminys. Tiriamasis ėminys nedelsiant turi būti įdėtas į polietileno maišelį, išspaustas iš jo oras, sandariai užrištas ir kuo greitesniu būdu ištirtas. Arba iki tyrimo užšaldomas –20ºC temperatūroje, jei bus atliekamas mėginio mikotoksikologinis tyrimas, mėginys išdžiovinamas iki pastovios masės 60ºC temperatūroje. Išmatuojamas bandinių pH prieš tyrimus,
2.3. Bakteriologinis tyrimas – bendras mikroorganizmų skaičiaus nustatymas: Bendras mikroorganizmų skaičius (KSV/g) pašaruose nustatomas skiedimo metodu, sėjant į Petri lėkšteles, naudojant mitybinį agarą (Plate Count Agar, Liofilchem, Italija) pagal LST EN ISO 4833:2003. Sėjant mėginio skiedimas 1x103
ant mitybinio agaro Petri lėkštelėse. Petri lėkštelės inkubuotos 30°C temperatūroje 24 val. Gyvybingų mikroorganizmų skaičius vertintas po 24 val.
Siloso mėginių paėmimas
Ekstraktų ruošimas
Bendras mikroorganizmų skaičiaus nustatymas
Mikroskopinių grybų kultūrų identifikavimas
Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičiaus
23
2.4. Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičiaus (kolonijas sudarančių vienetų) nustatymas skiedimo metodu. Kiekybinis užterštumo mikromicetų gyvybingomis sporomis nustatymas atliktas skiedimo metodu. Kiekvienas mėginys skiedimu 1:103 sėtas į Petri lėkšteles su Čapeko terpe (Czapec Dox agar) (Liofilchem, Italija) su chloramfenikoliu 40 μg/l – užpylimo būdu. Kiekvienam mėginiui sėjimai atliekami 3-iose Petri lėkštelėse. Lėkštelės su užkrėsta terpe inkubuotos termostate 26±2oC temperatūroje 7 parų. Augančios mikroskopinių grybų kolonijos buvo skaičiuojamos 7, 10 vystymosi parą. Mikroskopinių grybų gyvybingų sporų skaičius įvertintas pagal LST ISO 6611:2004.
Siloso užkrėstumo mikroskopiniais grybais įvertinimas: Išorinis siloso užkrėstumas mikroskopiniais grybais nustatytas, sėjant jį ant Čapeko terpės. Ratu išdėliojami 9 siloso gabalėliai ir viduryje – 1 gabalėlis. Įvertinama išaugusios mikroskopinių grybų gentys ir jų įvairovė tiriamajame pašare.
2 pav. II etapo tyrimo schema
Šiame etape buvo dirbama su išgrynintomis mikroskopinių grybų kultūromis ir eteriniais aliejais.
Mikroskopinių grybų kultūrų išskyrimas
Diskelių su EO uždėjimas ant užaugintos kultūros
Auginimas termostate 26±2oC
EO poveikio mikroskopinių grybų kultūroms įvertinimas
24
2.5. Kultūros išskyrimas: pirmo etapo metu aptiktos mikroskopinių grybų skirtingų rūšių kultūros išgrynintos, sukaupta kolekcija.
2.6. EO poveikio įvertinimas: Mikromicetai buvo persėjami ant standžių Čiapeko agaro terpės ir inkubuojama 26±2oC temperatūroje 72 valandas. Po 7 parų ant kultūrų uždedami 0,6 mm popieriniai diskeliai, kurie vėliau sudrėkinami 12,5 µl 100 proc. eteriniais aliejais: pipirmėčių, čiobrelių, vaistinio laukinio šalavijo, daržinės ciberžolės, raudonėlio.
Vėliau, remiantis literatūros duomenimis buvo pasirinktas juozažolės eterinis aliejus ir toliau tirti šie eteriniai aliejai: juozažolės, čiobrelio, šalavijo ir raudonėlio.
3 pav. Penicillium spp. kultūra su EO diskeliais (nuotrauka autoriaus)
4 pav. III etapo tyrimo schema.
Siloso gamyba su eteriniais aliejais laboratorinėmis sąlygomis. Žalia kukurūzų masė laboratorinėmis sąlygomis buvo sumaišoma su raudonėlio eteriniu aliejumi, kurio pasirinktos
Siloso gamyba su EO laboratorinėmis sąlygomis
Gyvybingų mikroskopinių grybų
sporų skaičiaus nustatymas Pienrūgščių bakterijų skaičiaus
nustatytmas
Mikotoksinų koncentracijų nustatymas
Bendras mikroorganizmų skaičiaus nustatymas
25
koncentracijos buvo 1:100 ir 1:200, analogiškai kukurūzų žaliava ir čiobrelio, šalavijo, juozažolės EO, talpos sandariai uždarytos.
Kartu laboratorinėmis sąlygomis paruoštas kontrolinis mėginys, žalia kukurūzų masė sudėta į talpas ir sandariai uždaryta.
Taip pat, buvo užkonservuoti mėginiai laboratorinėmis sąlygomis su vandeniniais čiobrelio, raudonėlio, juozažolės ir šalavijo ekstraktais.
Po 96 dienų talpos atidarytos ir siloso mėginiai įvertinti organoleptiškai, bei sanitariniu higieniniu atžvilgiu. nustatytas bendras mikroorganizmų skaičius, pienarūgščių bakterijų skaičius, nustatyta mikotoksinų koncentraciją.
2.7. Pienarūgščių bakterijų nustatymas. Bendrasis mezofilinių pieno rūgšties bakterijų kolonijų skaičiaus (KSV/g) nustatymas skiedimo metodu, sėjant į Petri lėkšteles, naudojant mitybinį agarą (MRS/agar with Tween 80, Biolife, Italy/) pagal LST ISO15214: 2009. Sėjant mėginio skiedimas 1x103 ant mitybinio agaro 3- iose Petri lėkštelėse. Petri lėkštelės inkubuotos 35°C temperatūroje 72 val. Pienarūgščių bakterijų skaičius vertintas po 72 val.
2.8. Mikotoksikologinis tyrimas- mikotoksinų koncentracijos pašaruose nustatymas: Plonasluoksne chromatografija (PSCh) buvo nustatomos mikotoksinų koncentracijos pagal aprobuotas Romer Labs. Inc. (Austrija) metodikas. PSCh metodu buvo nustatomos aflatoksino B1 (AFL B1), zearalenono (ZEN), deoksinivalenolio (DON) koncentracijos. Išdžiovinti iki pastovios masės pašarų mėginiai (0,5 kg) buvo sumalami malūnu. Tyrimui surenkama smulkiausia mėginio frakcija. 25 g mėginio ekstraguota 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu, kratant 3 min. Mėginio ekstraktas perfiltruotas per celiuliozinį filtrą (porų dydis 20 µm).
Nustatant ZEN ir AFL B1 mikotoksinų kiekius, ekstrakto valymui panaudotos MycoSep® 226 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija). 2 ml išvalyto ekstrakto perkelta į mėgintuvėlį ir išgarinta, panaudojant Romer® Evap sistemą. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos 300 µl 97/3 toluolo/acetonitrilo mišinyje. Esant 60oC temperatūrai, Romer Labs PSCh autospoteriu (autospotter) ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (Romer Labs. Inc., Austrija) su specialiais mikrošvirkštais užnešama AFL B1 (2 µg ml-1 acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) ar ZEN (100 µg ml-1 acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) standartų 10, 20, 40, 80 µl ir 80 µl mėginio. Rezultatų išryškinimui plokštelė įmerkiama į 9/1 chloroformo/acetono mišinio vonelę. Laikoma, kol skystis pakyla iki 1 cm plokštelės viršaus. Plokštelė išdžiovinama ore. Toksinų koncentracijos įvertinamos ultravioletinių spindulių (UV) fone, esant ilgiausiai bangai. AFL B1 švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,45, ZEN švyti žaliai, kai Rf ≈ 0,9. Mikotoksino koncentracija paskaičiuojama µg kg-1: ant PSCh plokštelės kiekvienas toksinas tiriamajame mėginyje matomas nanogramais, mėginio ekvivalentas 0,15 g ppb=x÷0,15
26
kur ppb - toksino koncentracija mėginyje (µg kg-1); X - mikotoksino koncentracija ant plokštelės nanogramais; 0,15 – mėginio ekvivalentas (0,15 g).
Nustatant DON koncentracijas mėginiuose PSCh metodu, mėginių paruošimas toks pat, kaip nustatant ZEN ir AFL B1. Mėginio ekstrakto valymui panaudotos MultiSep® 216 ir MycoSep® 227 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija). 13 ml išvalyto ekstrakto išgarinta Romer® Evap sistema. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos 400 µl 2/1 acetono/metanolio mišinyje. Į
specialius mikrošvirkštus pritraukus 10, 20, 40, 80 µl DON standarto (100 µg ml-1 acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) ir 80 µl tiriamo mėginio, PSCh autospoteriu (autospotter) užnešamas standartas ir tiriamasis mėginys ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (Romer Labs. Inc., Austrija) 60oC temperatūroje. Rezultatų išryškinimui plokštelė įmerkiama į 1/2 toluolo/acetono mišinio vonelę. Plokštelė apipurškiama 15% aliuminio chloridu metanolyje. Plokštelė išdžiovinama ore. Toksino koncentracija įvertinama, pakaitinus plokštelę 150oC temperatūroje 5 min. ultravioletinių spindulių (UV) fone (360 nm). DON švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,5. Toksino koncentracija tiriamajame mėginyje matomas nanogramais, mėginio ekvivalentas 0,2 g. ppb=x÷0.2,
kur ppb - toksino koncentracija mėginyje (µg kg-1); X - mikotoksino koncentracija ant plokštelės nanogramais; 0,2 – mėginio ekvivalentas (0,2 g).
2.9. Statistinis duomenų įvertimas: Tyrimų duomenys įvertinti ,,Microsoft Excel“ programa. Buvo apskaičiuoti gautų duomenų aritmetiniai vidurkiai ( x ),vidurkio paklaida (mx), standartinis nuokrypis (δ) ir įvairavimo koeficientas % (Cv). Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (p) nustatytas pagal Stjudentą. Duomenys laikomi patikimais kai p< 0,01 ir p< 0,05. Duomenims grafiškai pateikti panaudota Microsoft Excel programa.
27
3.TYRIMO REZULTATAI 3.1. Siloso higieninė sanitarinė kokybė 3.1.1 Siloso užsikrėtimas mikroorganizmais
Atlikto tyrimo metu buvo ištirta 20 siloso mėginių. Nustatytas bendras tirtų mėginių užkrėstumas mikroorganizmais.. 5 paveiksle grafiškai pavaizduotas siloso užkrėstumas mikroorganizmais ir kiek gyvybingų mikroskopinių grybų kolonijų aptikta kiekviename mėginyje, nurodyta koloniją sudarančių vienetų grame (ksv/g). Bendras kukurūzų siloso užkrėstumas mikroorganizmais svyravo nuo 3 X103iki 2512X103ksv/g (Cv – 0,32, mx – 589,1 - 576,12)
Iš diagramoje pateiktų duomenų nustatyta, kad 5 proc. aptikta 512±35,94X103 ksv/g (δ – 160,76) mikroskopinių grybų, didžiausias užterštumas mikroorganizmais nustatytas mėginyje Nr.1 siekia 2512±174,20 X103ksv/g (δ – 779,06).
5 pav. Užsikrėtimas mikroorganizmais (ksv/g)
Įvertinus bendrą tirtų kukurūzų siloso mėginių užkrėstumą mikroorganizmais buvo nustatyta, kad siloso mėginiuose, paimtuose po 3 mėnesių iš skirtingų Lietuvos ūkių, bendras mikroorganizmų skaičius nebuvo didelis, nes remiantis literatūros duomenimis bendras mikroorganizmų skaičius silose gali siekti iki 1 X103, vyraujanti mikroflora pienarūgštės bakterijos.
Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičius svyravo 0 X103 iki 512 X103 ksv/g.
X
10
3 Ksv/g
28
3.1.2. Siloso užkrėstumas tam tikromis mikromicetų gentimis
Buvo nustatytas siloso mėginių užterštumas gyvūnams: Aspergillus spp., Penicillium spp.,
Fusarium spp., kurios gamina pavojingus mikotosinus. Iš tirtų 20 mėginių 65 proc. mėginių
užkrėsti minėtos mikromicetų gentys ir 35 proc. mėginių šių neaptikta. Todėl tyrimo metu buvo tirti 13 siloso mėginių.
6 pav. Tirtų mėginių užkrėstumas Fusarium spp. mikromicetais
Diagramoje pateikti užkrėstumo duomenys (6 pav.) rodo, kad labiausiai buvo užkrėstas 6 ir 8 numeriais pažymėti mėginiai (15,4 proc.), gausiausiai užkrėsti Fusarium spp. mikromicetais. Mėginyje Nr.6 užkrėstumas Fusarium spp. siekia 20 proc. (nustatyta, kad 10 proc. sudaro F.
graminearum ir F. moniliforme), Nr. 8 užkrėstumas 30 proc. (nustaytas 10 proc. užkrėstumas F. equiseti, 20 proc. F. moniliforme) Paveiksle Nr. 3 matyti, kad 46,2 proc. mėginių minėta gentimi
nebuvo užkrėsti. Fusarium genties mikromicetai yra „laukų“ mikroskopiniai grybai, aptinkami laukuose. Į silosą jie patenka su žaliavomis ir gali išlikti.
Visuose kituose mėginiuose buvo aptikta Aspergillus spp. Labiausiai Aspergillus spp.(4 pav.) genties mikromicetais užkrėsti 6, 8, 11 ir 12 mėginiai, t. y. 30,7 proc. Mėginyje Nr. 6 nustatytas 80 proc. užsikrėtimas A. Fumigatus. Mėginiuose Nr. 8 ir 11 nustatytas 60 proc. užsikrėtimas
Aspergillus spp. mikromicetais, iš kurių 10 proc. sudaro A. Niger ir 50 proc. sudaro A.fumigatus.
Mėginys Nr. 12 užkrėstas daugiausiai – 100 proc., nustatyta, kad A. fumigatus sudaro 60 proc. ir A.
niger sudaro 40 proc. Mažiausias užkrėstumas Aspergillus spp. mikromicetais nustatytas 2, 3 ir 7
mėginiuose po 10 proc. (23,1 proc. mėginių), juose nustatyta A, fumigatus (10 proc.), A. niger (10 proc.) ir A. carbonarius (10 proc.).
Aptiki
mas,
29
Atsižvelgiant į siloso užkrėstumą Asperillus spp., galima teigti, kad toks užkrėstumas „sandėlių“ mikroskopiniais grybais (Aspergillus spp.) buvo sąlygojamas, nesilaikant tinkamų siloso laikymo sąlygų tranšėjoje, bei fermentacinio proceso metu šios genties mikromicetų sporos išlieka gyvybingos.
7 pav. Tirtų mėginių užkrėstumas Aspergillus spp. mikromicetais.
Penicillium spp. mikromicetai (8 pav.) buvo nustatyti 7 mėginiuose (54 proc. mėginių), iš 13
tirtų. Didžiausias užsikrėtimo procentas 50 proc. nustatytas 9 mėginyje, jame aptikta 20 proc. P.
Verrucosum ir 30 proc. A. niger. Mėginyje Nr.8 aptikta P. Verrucosum sudaro 20 proc. užkrėstumo. P. Verrucosum 4, 5, 6, 12 ir 13 mėginiuose, t. y. 71 proc. mėginių, kuriuose aptikta 10 proc. P. Verrucosum ir 46 proc. mėginių Penicillium spp. mikromicetų neaptikta.
8 pav. Tirtų mėginių užkrėstumas Penicillium spp. mikromicetais
Aptiki mas .,% Mėginio Nr. Aptiki mas, %
30
Reminatis 3, 4 ir 5 diagramos duomenis Mėginyje Nr. 1 50 proc. užkrėstumą sudarė
Aspergilllus spp. mikromicetai. Aspergillus spp 2, 3 ir 7 mėginiuose ir Fusarium spp. 2 ir 7
mėginiuose užkrėstumas sudarė po 10 proc. Penicillium spp. kaip ir Aspergillus spp. mikromicetai yra sandėlių, tranšėjų mikromicetai, kurie išlieka gyvybingi fermentacijos metu.
3.2. Augalų eterinių aliejų poveikis aptinkamiems mikromicetams pašare 3.2.1.Augalų eterinių aliejų poveikis Fusarium spp. mikromicetams
Vertinant eterinių aliejų antigrybinį poveikį, iš kukurūzų siloso buvo išgryninta 21 Fusarium spp. kultūra ir aprašyta kaip jas veikė: Raudonėlio 100% EO, Čiobrelio 100% EO, Šalavijo 100% EO. Diagramoje (9 pav.) pateiktas eterinių aliejų antigrybinis poveikis, nustatytas diskelių metodu,
Fussarium spp. mikromicetams, rezultatai, išreikšti slopinimo zonos vidurkiu (mm) kiekvienai
kultūrai atskirai, panaudojus 12,5 µl.
Tyrimo duomenys, panaudojus raudonėlio 100% eterinį aliejų, parodė, kad Fusarium spp. mikromicetus paveikus šiuo eterinium aliejumi (14 kultūrą) slopinimo zonos skersmens vidurkis nustatytas 5,8±0,2 mm (δ – 1,6, Cv – 2,6) ir jis buvo didžiausias iš visų tyrime naudotų kultūrų. Mažiausias slopinimo zonos skersmens vidurkis 0,7±0,07 mm (δ – 0,1, Cv – 0,01) nustatytas 3,3 proc. mėginių (2 ir 16 kultūrų).
9 pav. Eterinių aliejų antigrybinis poveikis Fusarium genties kultūroms (mm)
Mėginio Nr. 14 slopinimo zonos skersmens vidurkis 8,3 karto didesnis negu 2 ir 16 mėginiai, kuriuose nustatyta mažiausia slopinimo zona Čiobrelio eterinis aliejus stipriausiu antigrybiniu poveikiu veikė Nr. 5 Fusarium genties kultūrą - 4,5±0,3 mm (δ – 1, Cv – 1,3), silpniausias antigrybinis poveikis nustatytas Nr.18 Fusarium genties kultūrai - 0,8±0,07 mm (δ – 0,1, Cv –0,01).
S
ke
rsmuo
, mm
31
Išanalizavus raudonėlio ir čiobrelio eterinių aliejų poveikį Fusarium spp., nustatytas stipresnis raudonėlio eterinis aliejaus antigrybinis poveikis.
Tiriant šalavijo eteriniu aliejumi paveiktas skirtingas Fusarium genties kultūras, tyrimai parodė, kad antigrybinis veikimas yra didžiausias 4,1±0,2 mm (δ – 1) Nr. 1 kultūrai, ir lyginant su raudonėlio poveikiu šiai kultūrai - 4,8±0,2 mm (δ – 1,6, Cv – 2,6)veikimu, šalavijo antigrybinis veikimas 0,7 karto silpnesnis. Mažiausias poveikis šalavijo EO nustatytas 3, 13, 14, 16 Fusarium kultūroms.
Įvertinus tirtų EO veikimą Fusarium spp. kultūroms, izoliuotoms iš silose, stipriausiai antigrybiniu poveikiu pasižymėjo raudonėlio EO (100%), tai yra 1,4 kartais stipriau nei šalavijo EO (100%), čiobrelio eterinio aliejaus (100%) atigrybinis poveikis buvo stipresnis nei šalavijo.
3.2.2.Augalų eterinių aliejų poveikis Aspergillus spp. genties mikromicetams Vertinant eterinių aliejų antigrybinį poveikį, iš kukurūzų siloso buvo išgryninta 9 Aspergillus spp. kultūros ir aprašyta kaip veikė (10 pav.) Raudonėlio 100% EO, Čiobrelio 100% EO, Šalavijo 100% EO. Diagramoje (10 pav.) pateiktas eterinių aliejų antigrybinis poveikis, nustatytas diskelių metodu, Aspergillus spp. mikromicetams, rezultatai, išreikšti slopinimo zonos vidurkiu (mm) kiekvienai kultūrai atskirai, panaudojus 12,5 µl.
10 pav. Eterinių aliejų antigrybinis poveikis Aspergillus genties mikromicetams (mm)
Tyrimo duomenys, panaudojus raudonėlio 100% eterinį aliejų, parodė, kad Aspergillus spp. (10 pav.) mikromicetus paveikus šiuo eteriniu aliejuni (1 kultūrą) slopinimo zonos skersmens vidurkis 2,0±0,5 mm (δ – 0,6, Cv – 0,5) ir jis buvo didžiausias iš visų tyrime naudotų kultūrų. Mažiausias slopinimo zonos skersmens vidurkis Šalavijo EO slopinimo zonos skersmens vidurkis 6 mėginyje 0,06±0,1 (δ –0,2, Cv – 0,04) mm.
Aspergillus genties kultūros
S
ke
rsmuo,
32
Išanalizavus raudonėlio EO (0,6±0,1 mm), šalavijo EO (0,06±0,1) ir čiobrelio EO (1,1±0,2 mm) slopinimo zonų skersmenų vidurkius, nustatyta, kad Aspergillus spp. mikromicetai čalavijo eteriniam aliejui mažiau jautrūs.
Remianatis tyrimo duomeninis (10 pav.) nustatyta, kad raudonėlio eteriniu aliejumi paveiktų 33,3 proc mėginių antigrybinis poveikis buvo nuo 1,0 iki 2,0 mm.
Įvertinus tirtų EO veikimą silose esantiems Aspergillus spp. kultūroms, stipriausiai antigrybiniu poveikiu pasižymėjo raudonėlio EO (100%) tai yra 1,4 karto didesniu nei šalavijo EO (100%), šalavijo eterinio aliejaus (100%) atigrybinis poveikis buvo stipresnis nei čiobrelio.
3.2.3. Augalų eterinių aliejų poveikis Penicillium spp. genties mikromicetams
Vertinant eterinių aliejų antigrybinį poveikį, iš kukurūzų siloso buvo išgryninta 13
Peniciliums spp. kultūros ir aprašyta kaip veikė: Raudonėlio 100% EO, Čiobrelio 100% EO,
Šalavijo 100% EO. Diagramoje (11 pav.) pateiktas eterinių aliejų antigrybinis poveikis, nustatytas diskelių metodu, AFusarium spp. mikromicetams, rezultatai, išreikšti slopinimo zonos vidurkiu (mm) kiekvienai kultūrai atskirai, panaudojus 12,5 µl.
11 pav. Eterinių aliejų antigrybinis poveikis Penicillium genties mikromicetams (mm).
Tyrimo duomenys, panaudojus šalavijo eterinį aliejų, parodė, kad Penicilium spp. mikromicetus paveikus šiuo eteriniu aliejumi (3 kultūrą) slopinimo zonos skersmens vidurkis nustatytas 2,0±0,2 mm (δ –0,2, Cv – 0,02) ir jis buvo didžiausias iš visų tyrime naudotų kultūrų., Mažiausias slopinimo zonos skersmes vidurkis Penicilium spp. mikromicetams nustatytas 3,3 mėginių (6 mėginio kultūroms).
Penicillium genties kultūros
S
ke
rsmuo
33
Panaudojus šalavijo EO (100%) mėginių slopnimo zonų skersmenų vidurkiai svyravo nuo nuo 1,0 iki 2,0 mm ir sudarė 7,7 proc., skersmuo nuo 0,0 iki 1,0 mm sudaro 84,6 proc. paveiktų šalavijo EO Penicilium kultūrų. Mėginiai, kuriuos paveikus raudonėlio EO (100%) slopinimo zonų skersmenų vidurkis 0,6 iki 1,2 mm sudarė 61,5 proc. mėginiai nuo 0,0 iki 0,6 mm sudarė 23,1 proc. paveiktų šiuo etriniu aliejumi.
Tiriant čiobrelio eterinio aliejaus antigrybinį poveikį Penicillium genties mikromicetams nustatyta, kad mėginiai, kurių slopinimo zonų skersmenų vidurkiai siekė nuo 0,6 iki 1,2 mm sudarė 46,2 proc., nuo 0,0 iki 0,6 mm sudarė 38,5 proc.
Išanalizavus šalavijo EO (100%) ir raudonėlio EO (100%) eterinių aliejų poveikį
Penicillium spp. nustatytas stipresnis šalavijo EO (100%) 0,6 karto.
Įvertinus tirtų EO veikimą Penicilium spp. kultūroms, izoliuotoms iš silose, stipriausiai antigrybiniu poveikiu pasižymėjo šalavijo EO (100%), tai yra 10kartų stipriau nei raudonėlio EO (100%), čiobrelio eterinio aliejaus (100%) atigrybinis poveikis buvo stipresnis nei minėtų eterinių aliejų.
3.3. Augalų eterinių aliejų ir kai kurių vaistinių augalų ekstraktų panaudojimas Šiame tyrimo etape buvo siekiama išsiaiškinti ir įvertinti vaistinių augalų eterinių aliejų (čiobrelio (Thymus vulgaris), raudonėlio(Origanum vulgare) , šalavijo (Salvia officinalis) ir juozažolės (Hyssopus officinalis) vaistinių augalų vandeninių ekstraktų (čiobrelio ir juozažolės) panaudojimą, siekiant užtikrinti silosuojamų pašarų saugą. Laboratorinėmis sąlygomis buvo užkonservuotas kukurūzų silosas, į kiekvieną mėginį įdedant skirtingas eterinių aliejų koncentracijas (1:100, 1:200), vaistinių augalų ekstraktų. Gauti rezultatai lyginami su dviem pasirinktais kontroliniais mėginiais, vienas jų buvo užkonservuotas įprastinėmis sąlygomis, kitas užkonservuotas į jį įdedant 96% spirito ir distiliuoto vandens santykiu 1:200. Tokios eterinių aliejų koncentracijos pasirinktos dėl to, kad įvertinti minimalios šių medžiagų koncentracijų efektyvumą, bei palyginti su vaistinių augalų vandeninių ekstraktais.
3.3.1. Augalų eterinių aliejų poveikis siloso mikroorganizmams
Šio etapo tyrimo metu buvo ištirtas eterinių aliejų (12 pav.) poveikis silosui po 96 dienų silosavimo, mikroorganizmams ir palyginti su kontroliniais mėginiais.
Remiantis 12 pav. pateiktais duomenimis šalavijo eterininį aliejų 1:200 koncentracijos įterpus į silosą gamybos metu ir tiriant po gamybos 96 d., bendras mikroorganizmų skaičius svyravo nuo 3X103 ksv/g iki 744X103 1 ksv/g, matyti, kad panaudojus bendras mikroorganizmų skaičius (744±284X103 ksv/g)lyginant su kontroliniu mėginiu (31,6± X103 ksvg/g ( mx – 116,3) 2,8 karto
34
didesnis, nustatyta, kad, šalavijo eterinis aliejus, neturi jokios įtakos mikroorganizmų dauginimuisi silose. Taip pat tyrimo metu panadojus kaip priedą šalavijo EO 1:200 koncentraciją silose aptikta
Penicillium spp. ir A. niger mikromicetų kultūrų.
Tyrimo metu nustatytas pienarūgščių bakterijų skaičius veikiant šalavijo eteriniam aliejui 1:200 (53,3 ±44 X103ksv/g) ir 1:100 (27±13,1X103 ksv/g) ir pastebėta, kad kuo didesnė šalavijo EO koncentracija (1:100), tuo stipresnis antibakterinis poveikis, t.y. 1,98 karto didesnis.Kontroliniame mėginyje, kuriame spirito koncentracija 1:200 pienarūgštėms bakterijoms įtakos nenustatyta.
12 pav. Eterinių aliejų poveikis siloso mikroorganizmams.
Panaudojus skirtingas raudonėlio koncentracija (1:100, 1:200) silosuojant pirminį žaliavą nustatyta, kad raudonėlio eterinis aliejus 1:100 (31,6 X103 ksv/g) antimikrobinis poveikis stipresnis nei raudonėlio EO 1:200 (300X103ksv/g). Raudonėlio koncentracijoje 1:200 aptikta A. flavus mikromicetas. Tiriant raudonėlio EO koncentracija 1:100 antigrybinį veikimą, mikroskopinių grybų neaptikta, tačiau esant 1:200 koncentracijai aptikta 2,03±0,44 X103ksv/g mikroskopinių grybų. Remiantis pateiktais duomenimis galima teigti, kad didesnė raudonėlio EO koncentracija (1:100), veikia stipriau, nei mažesnė (1:200).
Tačiau čiobrelio eterinio aliejaus 1:100 koncentracijoje mikroskopinių grybų neaptikta, bet nustatytas didžiausias mikroorganizmų skaičius 351,6±37,1 X103 ksv/g (δ – 48,2) ir čiobrelio EO 1:200 koncetracijoje nustatyta 300±X103 ksv/g. Mažiausioje čiobrelio EO 1:100 konentracijoje nustatyta 25±1,7X103 ksv/g (δ – 2,52) mikroorganizmų skaičius, pienarūgščių bakterijų neaptikta.
Abiejuose tirtose čiobrelio EO koncentracijose aptikta A. niger , A. flavus, P. Verrucosum mikromicetų. X 1 0 3 Ksv/g EO ir kontrolė
35
Diagramos (12 pav.) duomenimis pastebėta, kad silosuojant žaliavą geriau naudoti mažesnės koncentracijos EO (1:200),kuri nekenkia pienarūgščių bakterijų dauginimuisi, jos svarbiausia mikroflora norint teisingai užkonservuoti silosą, tačiau padidėja rizika mikroskopinių grybų sporoms išlikti fermentacijos metu.
3.3.2 Vaistinių augalų ekstraktų poveikis siloso mikroorganizmams
Siekiant įvertinti vaistinių augalų poveikį siloso mikroorganizmams, pasirinkti vaistiniai augalai: Vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris) ir Vaistinė juozažolės (Hissopus officinalis) iš kurių pagaminti vandeniniai ekstraktai.
Silosas pagamintas laboratorinėmis sąlygomis.
13 pav. Vaistinių augalų ekstraktų poveikis siloso mikroorganizmams.
Tyrimas parodė, kad atidarius siloso mėginius po 96 dienų (13 pav.) ir palyginus su kontrole, ekstraktais paveiktų mėginių bendras mikroorganizmų skaičius svyruoja nuo 209±92 X103 ksv/g (δ –119,9) (čiobrelio vandeninis ekstraktas) iki 258±162,2 X103 ksv/g (δ – 210) (juozaώolλs vandeninis ekstraktas), kontroliniame mλginyje bendras mikroorganizmψ skaiθius yra 300X103 ksv/g. Juozažolės ekstrakte neaptikta tiriamų mikromicetų kultūrų (Aspergillus spp., Penicilium Spp., Fusarium Spp.), tačiau aptikta kitų kultūrų, tikėtina, kad tai Candida spp. kultūraPanaudojus juozažolės vandeninį ekstraktą bendras mikroorganizmų skaičius padidėjo 14,8 proc., mikroskopinių grybų sporų sumažėjo 40,6 proc., pienarūgščių bakterijų skaičius sumažėjo 16,7 proc., lyginant su siloso kontroliniu mėginiu .Vertinant juozažolės žolelių veikimą siloso
Vaistinių augalų ekstraktai, žolelės ir kontrolė
X
10
3 Ksv
