KAUNAS 2021
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas Maisto saugos ir kokybės katedra
Rimantė Kačerauskaitė
Prevencinių priemonių panaudojimas sumažinti ir eliminuoti
mikotoksinų koncentracijas melžiamų karvių racionuose
The use of preventive measures to reduce and eliminate the
concentrations of mycotoxins in the diet of dairy cows
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS2
DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS
KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Prevencinių priemonių panaudojimassumažinti ir eliminuoti mikotoksinų koncentracijas melžiamų karvių racionuose“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Rimantė Kačerauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Marija Lizdenytė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui.
doc. dr. Violeta Baliukonienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Prof.dr. Rolandas Stankevičius
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 111.1 Silosuotų pašarų bei pašarų mišinių higieniniai rodikliai ... 11
1.2 Mikotoksinų paplitimas silosuotuose pašaruose ir pašarų mišiniuose ... 13
1.3 Neigiamas mikotoksinų poveikis galvijo organizmui ... 14
1.4 Prevencinės priemonės, užtikrinančios pašarų higieninę kokybę ... 16
1.4.1 Pelėsinių grybų pašaruose sumažinimas ... 16
1.4.2 Priemonės ir medžiagos prieš mikotoksinus pašaruose ... 17
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI... 19
2.1 pH nustatymas pašaruose ... 20
2.2 Bendro bakterijų skaičiaus nustatymas ... 20
2.3 Pienarūgščių bakterijų nustatymas ... 20
2.4 Mėginių užkrėstumo pelėsiniais grybais įvertinimas ... 20
2.5 Tyrimas in vitro ... 20
2.6 Mikotoksinų koncentracijos pašaruose nustatymas ... 21
2.7 Statistinis duomenų įvertinimas ... 21
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 23
3.1 2019 metų mikotoksinų koncentracijų Lietuvos ūkių silosuotuose pašaruose ir pašarų mišiniuose analizė ... 23
3.2 Silosuotų pašarų bei pašarų mišinių higieniniai rodikliai ... 24
3.2.1 Mikotoksinų koncentracijos kukurūzų silose ir pašarų mišiniuose ... 25
3.3 Mikotoksinų koncentracijos, nustatytos panaudojus mikrobinį pašarų priedą ... 26
3.4 Mikotoksinų koncentracijos, panaudojus Rhodotorula rubra mieles ... 28
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
IŠVADOS ... 33
REKOMENDACIJOS ... 34
4
Prevencinių priemonių panaudojimas sumažinti ir eliminuoti
mikotoksinų koncentracijas melžiamų karvių racionuose
Rimantė Kačerauskaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Šis mokslinis – tiriamasis darbas atliktas 2019-2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje, Mikotoksikologijos laboratorijoje. Analizuoti Mikotoksikologijos laboratorijoje atliktų 2019 metų pašarų užterštumo mikotoksinais Lietuvos ūkiuose tyrimų duomenys. Iš tirtų pašarų atrinktus mėginius, kurie toliau buvo panaudoti tyrimuose nustatyti higieniniai rodikliai. Mikotoksinų koncentracijos nustatytos plonasluoksnės chromotografijos metodu. Tyrimo metu analizuoti iš Lietuvos (X) ūkių atrinkti pašarų mišiniai, skirti melžiamų karvių šėrimui, ir pritaikytų prevencinių priemonių efektyvumas po 0, 6, 12 valandų.
Darbo apimtis: 38 puslapiai, 3 paveikslėliai, 6 lentelės.
Darbo tikslas: įvertinti Lietuvos (X) ūkiuose pagamintų silosuotų pašarų ir pašarų mišinių,
skirtų melžiamoms karvėms, taršą mikotoksinais bei pasirinktų prevencinių priemonių panaudojimą, siekiant juose sumažinti ir eliminuoti mikotoksinų koncentracijas.
Išanalizavus 2019 metais tirtų pašarų duomenis nustatyta, kad zearalenonas yra dažniausiai randamas mikotoksinas pašaruose - aptiktas 86,5 proc. tirtų mėginių, o jo koncentracijos aptinkamos didžiausios. Kukurūzų silose - 348,7 g/kg ( 246,47), pašarų mišiniuose - 466,55 g/kg ( 288,54). Rečiausiai aptiktas mikotoksinas DON.
Nustačius sanitarinius higieninius rodiklius didžiausias bendras bakterinis ir mikroskopiniais grybais užterštumas nustatytas TMR pašaruose, skirtuose melžiamoms karvėms. Pašarų mišiniuose nustatytas didžiausias pH ir pienarūgščių bakterijų skaičius. Aptikta, kad kukurūzų silosas labiausiai užterštas ZON, DON ir T-2 mikotoksinais.
Atlikus pašarų mėginių tyrimą su prevencinėmis priemonėmis Biosprint® komerciniu
mikrobiniu pašarų priedu ir Rhodotorula rubra in vitro nustatyta, kad komercinis preparatas efektyviausiai sumažino aflatoksino B1 ir T-2 toksino koncentracijas (p>0,05). Mažiausias poveikis
5
Rhodotorula rubra mielių didžiausias poveikis nustatytas AFL B1 po 12 valandų. DON
koncentracijos didžiausias sumažėjimas - po 12 valandų, šio mikotoksino koncentracija sumažėjo 47,38 proc. (p>0,05), T-2 toksino koncentracija sumažėjo 80,7 proc. (p>0,05) po 6 valandų. ZON koncentracijai mielių poveikis buvo neigiamas.
6
The use of preventive measures to reduce and eliminate the
concentrations of mycotoxins in the diet of dairy cows
Rimantė Kačerauskaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
This scientific research was undertaken in 2019-2020 in Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences, the Department of Food Safety and Quality, the Laboratory of Mycotoxicological Analysis. The investigation data of contamination of feed with mycotoxins, which was carried out in Lithuanian farms in 2019, was analysed. When the samples of investigated data, which were further used in research, were collected, hygienic parameters were established. The concentration of mycotoxins was investigated by the method of thin-layer chromatography. During the investigation period, the mixtures of Lithuanian farms (X) designated to the feed of milk cows and the effectiveness of preventive treatment after 0, 6 and 12 hours were analysed.
The scope of the work: 38 pages, 3 figures, 6 tables.
The aim of the work: to evaluate the contamination of feed and feed mixtures designated to
milk cows, the contamination by mycotoxins as well as the use of chosen preventive treatment aiming to reduce and eliminate the concentration of mycotoxins in them.
Having analysed the data of the feed researched in 2019, it was established that zearalenone was a mycotoxin most often found in feed, it was found in 86.5 % of samples, and its concentration was the highest of the detected. In corn silage, there were 348.7 g/kg ( 246.47), in feed mixtures, there were 466.55 g/kg ( 288.54). Mycotoxin DON was detected most rarely.
Were established hygienic parameters, the highest common bacteria and microscopic fungi contamination were established in TMR feed designated to milk cows. The highest pH and the number of lactic acid bacteria were found in feed mixtures. It was detected that corn silage was mostly contaminated by ZON, DON and T-2 toxins.
Having carried out the investigation of feed with preventive treatment using Biosprint® commercial microbial supplement to the feed and Rhodotorula rubra in vitro, it was established that the concentrations of aflatoxin B1 and toxin T-2 were reduced by commercial product most effectively
(p>0.05). The least effect was noticed on ZON (p<0.01), and the concentration of DON decreased slightly.
7
The highest effect of Rhodotorula rubra yeast was determined for AFL B1 after 12 hours. The
highest decrease in the concentration of DON was after 12 hours, the concentration of this mycotoxin reduced by 47.38 % (p>0.05), the concentration of T-2 toxin lessened by 80.7 % (p>0.05) after 6 hours. The effect of yeast to ZON concentration was negative.
8
SANTRUMPOS
DON - deoksinivalenolis ZON - zearalenonas TMR – pašarų mišinys AFL B1 – aflatoksinas B1 OTA - ochratoksinas A AFL - aflatoksinas UV – ultravioletiniai spinduliaiBBS – bendras bakterijų skaičius
ppb – milijardinė dalis
proc. - procentai
g - gramai
g/kg - mikrogramai kilograme
KSV/g – kolonijas sudarantys vienetai 1 grame mėginio
9
ĮVADAS
Šiandien stebime nuolatinę kukurūzų, kviečių, sojų pupelių ir jų produktų paklausos didėjimo tendenciją dėl nuolat augančios ir stiprėjančios gyvulininkystės pramonės (1). Plečiantis siūlomų produktų įvairovei, gyvūnų pašarų sauga palaipsniui tampa vis svarbesnė, o mikotoksinai yra vienas iš svarbiausių pavojų (1).
Mikotoksinų paplitimas yra reikšmingas pasaulinis iššūkis, lydimas didėjančio pavojaus gyvūnų ir žmonių sveikatai bei didelių finansinių nuostolių maisto ir pašarų gamybos pramonėje (2).
Atliktuose aflatoksino B1, zearalenono, fumonizinų, ochratoksino A, deoksinivalenolio ir T-2
toksino koncentracijos tyrimuose, surinktuose iš 100 šalių 2008–2017 m., 74 821 pašarų ir pašarinių
žaliavų (pvz., kukurūzų, kviečių, sojos pupelių) mėginių rezultatai parodė, kad 88 proc. mėginių buvo užteršti bent vienu mikotoksinu. Šių medžiagų paplitimas parodė aiškias regionines tendencijas, o pagrindinis lemiantis veiksnys buvo klimatas. Daugumoje regionų didžioji dalis mėginių parodė didžiausius mikotoksinų kiekius pagal Europos Sąjungos galiojančias rekomendacines mikotoksinų vertes pašaruose gyvūnams (3).
Gyvūnų pašarus užteršiantys mikotoksinai gali daryti toksinį poveikį gyvūnams bei patekti į gyvūninės kilmės produktus, tokiu būdu sukeldami įvairius neigiamus padarinius, įskaitant rimtą grėsmę žmonių ir gyvulių sveikatai. Neigiamas mikotoksinų poveikis sveikatai gali varijuoti nuo ūmaus apsinuodijimo iki ilgalaikių problemų, tokių kaip imuninės sistemos susilpnėjimas ir vėžiniai susirgimai. Todėl reikia sekti mikotoksinų koncentracijas pašaruose (4).
Siekiant sumažinti mikotoksinų koncentraciją maiste ir pašaruose arba palengvinti jų neigiamą poveikį gyvūnams, buvo išbandyta daug junginių ir gydymo būdų. Kai kurie iš šių gydymo būdų rodo daug žadančias komercinio taikymo perspektyvas, o kiti jau buvo naudojami komerciškai. Tačiau kol nebus plačiau prieinami, patikimi, ekonomiški, komerciškai taikomi metodai, maisto ir žemės ūkio pramonėje ir toliau bus pastebimos problemos, susijusios su užteršimu mikotoksinais ir dėl to kylančiais ekonominiais nuostoliais (5).
Maisto produktų ir pašarų užterštumo mikotoksinais tendencija didėja, todėl norint sumažinti neigiamą poveikį gyvūnams bei žmonėms ieškoma vis daugiau būdų, kaip išvengti arba sumažinti jų koncentraciją.
Darbo tikslas: įvertinti Lietuvos (X) ūkiuose pagamintų silosuotų pašarų ir pašarų mišinių,
skirtų melžiamoms karvėms, taršą mikotoksinais bei pasirinktų prevencinių priemonių panaudojimą siekiant juose sumažinti ir eliminuoti mikotoksinų koncentracijas.
10 Darbo uždaviniai:
1. Atlikti 2019 metų mikotoksinų koncentracijų Lietuvos ūkiuose silosuotuose pašaruose ir pašarų mišiniuose analizę.
2. Nustatyti atrinktų silosuotų pašarų bei pašarų mišinių higieninius rodiklius. 3. Įvertinti pasirinkto detoksikuojančio preparato efektyvumą in vitro.
4. Įvertinti Rhodotorula rubra mielių efektyvumą mikotoksinų (AFB1, ZEA, DON, T-2) koncentracijų sumažinimui ar eliminavimui in vitro.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Silosuotų pašarų bei pašarų mišinių higieniniai rodikliai
Pašarų derliui ir silosų saugai bei kokybei įtakos gali turėti daugybė veiksnių, apimančių nekontroliuojamą mikrobinį užteršimą, sugadinimą ar patogenų augimą (6) . Yra šeši pagrindiniai faktoriai, darantys įtaka pašarų kokybei: subrendimas (derliaus nuėmimo data), pasėlio rūšis (skirtumai tarp žolių ir ankštinių augalų), derliaus nuėmimo ir sandėliavimo technika, aplinka (drėgmė, temperatūra ir dienos šviesos kiekis), žemės derlingumas, veislių įvairovė. Taip pat piktžolės, vabzdžiai kenkėjai, augalų ligos ir bakterijos, pelėsiai ir/ar keli iš jų metabolitai, pavyzdžiui, mikotoksinai, gali neigiamai paveikti pašarų kokybę (7).
Pašarų kokybę nusako jų mitybinė vertė, fizinės (techninės) savybės bei higieninė kokybė. Svarbiausi silosuotų pašarų ir pašarų mišinių (TMR) higieniniai rodikliai yra šie: pH, drėgmės kiekis pašare, bendras bakterijų skaičius, enterobakterijų, pienarūgštės bakterijų, pelėsinių grybų ir mielių skaičius. pH matavimas ir kiekybinis organinių rūgščių ir alkoholių gamybos bei įvairių mikrobų populiacijų dydžio įvertinimas yra siloso fermentacijos įvertinimo pagrindas (8). pH yra labai svarbus rodiklis vertinant siloso fermentacijos kokybę (9). Tačiau, pašarinių augalų fermentacija yra labai sudėtinga, apima įvairių tipų mikroorganizmus, todėl gaunami įvairūs galutiniai produktai. 1 lentelėje galime matyti siūlomas įprastų fermentacijos galutinių produktų koncentracijas silosų rūšyse (10,11).
1 lentelė. Tipiškai siūlomos įprastų fermentacijos galutinių produktų koncentracijos įvairiuose
silosuose (8) Ankštinių silosas <30– 35% SM Ankštinių silosas 45– 55% SM Žolės silosas 25– 35% SM Kukurūzų silosas 30– 40% SM Aukštos drėgmės kukurūzai 70– 75% SM Ph 4.3 - 4.5 4.7 - 5.0 4.3 - 4.7 3.7 - 4.0 4.0 - 4.5 Pieno rūgštis, % 6 - 8 2 - 4 6 - 10 3 - 6 0.5 - 2.0 Acto rūgštis, % 2 - 3 0.5 - 2.0 1 - 3 1 - 3 <0.5 Propiono rūgštis, % <0.5 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 Sviesto rūgštis, % <0.5 0 <0.5 - 1.0 0 0 Etanolis, % 0.5 - 1.0 0.5 0.5 - 1.0 1 - 3 0.2 - 2.0 NH3-N, % iš viso azoto 10 - 15 <12 8 - 12 5 - 7 <10
12
LAB (pieno rūgšties bakterijos) atlieka svarbią funkciją maisto ir pašarų fermentacijoje kaip natūrali mikroflora ar kaip pradinės kultūros kontroliuojamomis sąlygomis pašarų virškinamumo gerinimui. Šios bakterijos stabilios esant žemam pH ir jautrios proteazėms (10). Pieno rūgšties bakterijų augimo greitis, kuris svarbus pradinei siloso fermentacijai yra veikiamas temperatūros tarp kitų paramentrų (pvz. cukraus prieinamumas, anaerobiozės laipsnis ir drėgmės lygio) bei pH (10,11). Enterobakterijos aktyvios ankstyvose fermentacijos stadijose ir yra nepageidaujamos (12). Enterobacteriaceae šeima apima daugiau nei 30 genčių, įskaitant Salmonella spp., Escherichia spp., Shigella spp. ir Yersinia spp. Daugelis genčių pasižymi patogeniškumu žmonėms, gyvūnams, vabzdžiams ir augalams, o daugelis patogeninių formų gamina toksinus. Žaliavos perdirbimas turi potencialą sumažinti užteršimo laipsnį. Natūralaus užterštumo lygis žaliavoje yra pakankamas, kad būtų galima nurodyti toliau apdoroti terminiu arba cheminiu būdu. Tokia žaliavų tarša turėtų būti vertinama kaip kritinis patogeninių bakterijų patekimo į pašarų ir maisto grandines kontrolės taškas
(13).
Gerinti drėgmės matavimus ir jų metodus yra būtina, norint pagerinti kitų maistinių medžiagų sausosios medžiagos apskaičiavimą ir tokiu būdu tobulinti racionų receptus (14). Žinoti apie pašaro drėgmę yra svarbu, nes drėgmė turi įtakos pašaro svoriui, tačiau nesuteikia maistinės vertės gyvūnui. Daugeliu atvejų didžiausią įtaką pašarų drėgnumui turi derliaus nuėmimo laikas ir būdas. Tačiau oro ir aplinkos sąlygos, tokios kaip drėgmė, lietus ir sniegas, taip pat daro įtaką pašarų drėgmės kiekiui
(15). Drėgmės kiekis pašare taip pat gali turėti įtakos bakterijų ir mikroorganizmų, pelėsinių grybų atsiradimui bei kiekiui.
Mielių ir pelėsių skaičiavimas silose gali būti naudingas, nes didelis mielių skaičius silose paprastai susijęs su didele etanolio koncentracija, o jų skaičius dažnai yra atvirkščiai susiję su siloso aerobiniu stabilumu. Didelis mielių kiekis silose taipogi yra susijęs su sumažėjusiu gyvūnų produktyvumu, nors tiksli priežasties ir pasekmės sąsaja nenustatyta. Santos ir kt. (8,16) išskyrė sugedusias mieles iš didelę drėgmę turinčių kukurūzų, kuris įdėtas į prieskrandžio skystį sumažino skaidulų virškinimą in vitro, tačiau neįrodyta, kad tai vyksta in vivo. Windle ir Kung (8,11) pranešė, kad telyčios suėda mažiau, kai pasiūlomas sugedęs pašarų mišinys (su silosu), kuriame buvo daug mielių lyginant su šviežiu pašarų mišiniu. Tiksliai nėra aišku, ar neigiamas poveikis, šeriant silosu ar pašarų mišiniu su dideliu kiekiu mielių, atsiranda dėl tiesioginio pačių mielių poveikio, pasikeitus siloso organoleptinėms savybėms, toksiškų junginių susidarymui, ar veiksnių derinio. Bendras pelėsių skaičius neturėtų būti naudojamas kaip mikotoksinų rodiklis (8,17), tačiau didelis skaičius paprastai siejamas su aerobiškai sugedusiu silosu (8).
13
1.2 Mikotoksinų paplitimas silosuotuose pašaruose ir pašarų mišiniuose
Stambieji pašarai yra vieni svarbiausių melžiamų karvių raciono komponentų, tačiau jie gali būi gausūs mitoksinų (18). Taip pat ganyklos, žolė, koncentruoti ir konservuoti pašarai, iš kurių
formuojami atrajotojų pašarų mišiniai, gali būti daugelio mikotoksinų šaltinis. Nors pagal šalis ir regionus yra tam tikrų skirtumų, pavojingiausi mikotoksinai pieninių galvijų pašaruose yra Aspergillus gaminami aflatoksinai (AFL), Penicillium ir Aspergillus spp. gaminamas ochratoksinas A (OTA) ir deoksinivalenolis (DON), zearalenonas (ZON), T- 2 toksinas ir fumonizinai (FUM), kuriuos gamina „Fusarium“ (19). AFB1 dažniausiai randamas pašaruose Europos Sąjungoje (> 98% tirtų mėginių); vis dėlto DON (~ 90% tirtų mėginių) ir ZON (~ 70% tirtų mėginių) taip pat dažnai aptinkami. FUM ir OTA buvimas pastebimas rečiau (20,21). Pagrindiniai žemės ūkio produktuose randami mikotoksinai yra aflatoksinai (AFL), zearalenonas (ZON), deoksinivalenolis ir jo derivatai, fumonizinai, patulinas ir ochratoksinas A (OTA) (22). Mikotoksinų koncentracija gatavame produkte paprastai būna mažesnė nei žaliavose (23). Gyvulininkystės produkcijai mikotoksinų kiekis pašaruose sudaro ekonominius nuostolius dėl prasto augimo ir pašarų konversijos, padidėjusio mirtingumo, skerdenų atsisakymo ir daugelio kitų su tuo susijusių problemų. Faktiškai daugelis gyvulių sveikatos sindromų yra sukeliami mikotoksinų, esančių sugedusiame silose ar pašaruose (22). Augalai užteršiami mikotoksinais, kuriuos sintetina filamentiniai grybai, dažniausiai augimo metu laukuose (pvz. mikotoksinas, dažniausiai gaminamas Fusarium sp.). Taip pat esant palankioms augimo sąlygoms, kaip temperatūrai ir drėgmei, mikotoksinus gaminantys pelėsiniai grybai, tokie kaip Aspergillus sp. ir Penicillium sp., randami pašaruose, kurie yra sandėliuojami (21,24-26). Europos Sąjungos įstatymai nurodo mikotoksinų koncentracijos orientacinės vertes gyvūnų pašaruose (2 lentelė) (21,27).
2 lentelė. Optimalios mikotoksinų gamybos sąlygos, mikotoksinų orientacinės vertės pašaruose
Europos Sąjungoje (21) Mikotoksinas Orientacinė vertė pašaruose (12 % drėgmės)(mg/kg)* Optimali temperatūra mikotoksinų gamybai (°C) Optimalus vandens aktyvumas mikotoksinų gamybai AF** 0,005-0.05 33 0,99 DON 0,9-12 26-30 0,995 FUM*** 5-60 15-30 0,9-0,995 OTA 0,05-0,25 25-30 0,98 T-2/HT-2 0,25-2 20-30 0,98-0,955 ZEA 0,1-3 25 0,96
*Su išskirtinumu tarp pašarinių žaliavų, papildų, visaverčių pašarų mišinių **Priklauso nuo formos ***FB1 ir FB2 suma
14
1.3 Neigiamas mikotoksinų poveikis galvijo organizmui
Mikotoksinai yra antriniai mikroskopinių grybų metabolitai, kurie kenksmingi tiek žmonėms tiek gyvūnams (28). Yra įrodymų, kad pašarų užteršimas pelėsiais ir mikotoksinais gali paveikti atrajotojų gyvūnų sveikatą bei produktyvumą (29,30). Mikotoksinai gali nesukelti jokių klinikinių simptomų, nebent juos lydės antrinės bakterinės infekcijos su dideliu mirštamumu (19). Paprastai atrajotojai laikomi mažiau jautriais mikotoksinų poveikiui nei monogastriniai gyvūnai, nes jų prieskrandžio mikrobiota sugeba ardyti ir deaktyvuoti kai kurias iš šių toksiškų molekulių bei paversti į mažiau toksiškus metabolitus. Nepaisant šio galimo ardymo, pastebimi labai produktyvių karvių subklinikiniai sveikatos pokyčiai/problemos susijusios su mikotoksinais, kurias atspindi neaiškūs ir nespecifiniai simptomai bei periodiškas pieno produkcijos sumažėjimas (31-33). Jauniems gyvūnams, produktyvioms karvėms ir pereinamajame laikotarpyje esantiems gyvūnams turėtų būti skiriamas ypatingas dėmesys, nes jie yra jautresni neigiamam mikroskopinių grybų toksiškų metabolitų poveikiui. Be to, mikotoksinų apykaita prieskrandyje nėra lygi visiškai detoksikacijai - galimas jų skaidymasis labai priklauso nuo prieskrandžio mikrofloros stabilumo ir pH, kurie kinta priklausomai nuo pašaro sudėties ir tiesioginio antimikrobinio mikotoksinų aktyvumo (34).
Svarbiausias skirtumas tarp monogastrinių gyvūnų ir atrajotojų yra unikali pastarųjų fiziologija. Pieninių atrajotojų skrandis turi keturių skyrių skrandį, kuris leidžia fermentuoti ir virškinti tokias augalo sudedamąsias dalis ir pluoštus kaip celiuliozė. Šis procesas, kurio tarpininkai yra prieskrandžio mikrobai (daugiausia bakterijos, taip pat pirmuonys, grybeliai ir mielės), yra gyvybiškai svarbus gyvūnui paverčiant pašaro maistines medžiagas į naudingą energiją ir baltymus. Bet kokie prieskrandžio balanso sutrikimai gali sukelti acidozę ir pakenkti atrajotojų našumui. Be kitų veiksnių, mikotoksinai susiję su atrajotojų mikrofloros ir virškinimo sutrikimais. (34) Būdingi prieskrandžio skysčio faktoriai, tokie kaip bakterijų ir mielių ląstelių sienelės ir pašarų dalelės, gali deaktyvuoti mikotoksinus (31).
Toksinis mikotoksinų poveikis dažniausiai pasireiškia kepenims ir gali sukelti teratogeninį, mutageninį, kancerogeninį, citotoksinį, neurotoksinį, nefrotoksinį, estrogeninį ir imunosupresinį efektą/poveikį. Daugybė mikotoksinų prieskrandyje inaktyvuojami atrajotojų floros, o kiti pro virškinamąjį traktą patenka nepakitę arba paverčiami metabolitais, galinčiais palaikyti jų biologinį aktyvumą. Todėl pats prieskrandis lemia melžiamų galvijų jautrumą mikotoksinui dėl barjerinės funkcijos. Šie toksinai gali nesukelti jokių klinikinių simptomų, nebent juos lydi antrinės bakterinės infekcijos su aukštu mirtingumo rodikliu (19).
Mikotoksinų poveikis gali būti ūmus, atsirandantis dėl didelės suvartojimo dozės arba lėtinis, atsirandantis dėl ilgalaikio mažo kiekio vartojimo. Mikotoksinai daro poveikį keliais būdais:
15
1. Atsisakymas ėsti arba sumažėjęs suvartojimas
2. Pašarų maistinių medžiagų kiekio pokyčiai ir maistinių medžiagų įsisavinimas bei metabolizmas
3. Poveikis endokrininei ir egzokrininei sistemai 4. Imuninės sistemos slopinimas
5. Antibiotinis poveikis 6. Ląstelių mirtis (29)
Ankstyvosiose intoksikacijos stadijose mikotoksinai sukelia nedideles problemas melžiamoms karvėms. Našumo sumažėjimas gali būti nereikšmingas. Per kelias dienas ar savaites besitęsiančio mikotoksinų suvartojimo efektas karvės būklei (pieno produkcijai ir kūno svorio priaugimui) tampa daug akivaizdesnis. Nespecifiniai požymiai kaip apetito nebuvimas, ketozė ir dislokavęs šliužas gali žymiai padidėti nurijus mikotoksinų. Kai kurie mikotoksinai gali lemti toksinį poveikį organuose „taikiniuose“, pavyzdžiui, zearalenonas, kuris sukelia estrogeninį poveikį, patinusia vulvą ir spenius bei makšties prolapsą. Sumažėję apsivaisinimo rodikliai ir abortai gali būti taip pat susiję su mikotoksinų suvartojimu. Mikotoksinų poveikį sustiprina produkcijos stresas: didelio produktyvumo karvės yra daug labiau jautrios mikotoksinų poveikiui nei mažo produktyvumo melžiamos karvės
(35,36).
Ūminei aflatoksikozei būdingas greitas bendros būklės pablogėjimas, apetito praradimas, mažas pašaro pasisavinimas, trikdžiai su reprodukciniu pajėgumu, imunosupresija, ūmus hepatitas, gelta, kraujavimas ir mirtis (29,35). Kepenys yra svarbiausias paveiktas organas, o pažeidimai atsiranda dėl hemoraginės nekrozės, centrolobulinės perkrovos, tulžies latakų ląstelių proliferacijos ir riebalų infiltracijos hepatocituose (36,37). Lėtinio toksiškumo poveikiui taip pat yra būdingi tik mažesni kepenų pažeidimai ir apima prieskrandžio mikroorganizmų augimo ir genetinius pokyčius
(29,36). Kitų svarbiausių mikotoksinų toksinis poveikis karvėms yra pateiktas 3 lentelėje.
3 lentelė. Toksinis svarbiausių mikotoksinų veikiančių karvių organizmą poveikis (36)
Mikotoksinas Toksinis poveikis
Aflatoksinas
veikia imunologines funkcijas ir prieskrandžio metabolizmą sumažina melžiamų karvių šėrimo efektyvumą
16
3 lentelės tęsinys
1.4 Prevencinės priemonės, užtikrinančios pašarų higieninę kokybę
1.4.1 Pelėsinių grybų pašaruose sumažinimas
Daugelis rūšių mikroskopinių grybų gamina mikotoksinus pašaruose. Pelėsiniai grybai gali augti ir mikotoskinai būti išskiriami prieš derliaus nuėmimą, sandeliuojant, transportuojant, apdorojant ar pašaruose. Mikotoksinų išskyrimas ir pelėsinių grybų augimas siejamas su augalo stresu dėl oro sąlygų, vabzdžių pažeidimų, taip pat dėl netinkamos laikymo praktikos ar netinkamų šėrimo sąlygų. Bendrai, aplinkos sąlygos – karštis, vanduo ir vabzdžių pažeidimai – lemia augalo stresą ir predisponuoja augalų užkrėtimą mikotoksinais laukuose (38).
Supelyję, sudusę ar apipelyję pašarai ne visada turi savyje pavojingų mikotoksinų ar pelėsių, tačiau pats pelėsio buvimas pašare gali neigiamai paveikti produkciją ir sveikatą (39). Pelėsių poveikis pašarų kokybei gali būti sumažintas kontroliuojant technikas prieš nuėmant derlių, po derliaus nurinkimo ir sandėliuojant (40). Išvengti visų problemų yra neįmanoma, bet tam tikros priemonės gali žymiai sumažinti tikimybę:
1. Vietovės apsvarstymas
Mikotoksinas Toksinis poveikis
Ochratoksinas
sukelia inkstų problemas
sumažėja primilžis
Fumonizinas
sukelia reprodukcines problemas neigiamai veikia imuninės sistemos funkciją
sukelia kepenų ir inkstų pažeidimus
Zearalenonas
sukelia nevaisingumą sumažėja primilžis
Deoksinivalenolis
sukelia hiperestrogenizmą
neigiamai veikia imuninės sistemos funkciją poveikis virškinimo traktui
T-2
sukelia ūmų hemoraginį enteritą sumažėjęs pašaro suvartojimas
17
Auginti įvairių rūšių pasėlius, prisitaikiusius prie zonos, kurioje yra ūkis, atsižvelgiant į dienas iki brandos ir augimo sezono.
2. Derliaus nuėmimas pagal rekomenduojamas praktikas
Sandėliuoti esant tinkamam drėgmės lygiui. Vengti pažeisti branduolius ar grūdus jei bus
sandėliuojami sausoje formoje. Taip pat vengti nukritusių stiebų.
3. Tinkamas sandėliavimas
Švariai ir tinkamai prižiūrėti saugyklas. Dažnai tikrinti, ar nėra pasėlių perkaitimo, pelėjimo ar kitų gedimo, pablogėjimo požymių. Vengti saugoti grūdus ir pašarus, kai drėgmė yra didesnė nei 12–13%, o siloso nei 50%, nes tai gera terpė pelėsio ir mikotoksinų atsiradimui. Saugoti nuo oro temperatūros skirtumo tarp lauko ir grūdų, kuris gali lemti kondensato atsiradimą ant dežės sienelių ir taip sudaryti sąlygas drėgmės migracijai ir pelėsio formavimuisi. Taip pat turi būti užtikrintas geras vedinimas, oro cirkuliacija.
Naudoti siloso konservantus ar priedus, kai silosavimo procese rizika drėgmės kiekiui yra žemesnė ar viršija rekomenduojamą drėgmės lygį.
4. Minkštų ar nesubrendusių grūdų tinkamas tvarkymas
Prieš pasirenkant derliaus nuėmimo ir laikymo alternatyvas, atidžiai jas apsvarstyti. Paprastai geriausia kukurūzus nuimti kuo anksčiau, kai ti orai nebeleidžia toliau bręsti. Tokiu būdu išvengiama, pelėsių ir kitokio gedimo, didelių nuostolių dėl augalų nulenkimo audros metu ir netinkamo kukurūzų drėgmės lygio ar temperatūros, kurie padidina riziką silosavimo metu.
5. Įrangos priežiūra
Po kiekvieno naudojimo iškart nuvalyti įrangą, naudojamą derliui nuimti, sandėliuoti ar šerti.
6. Atsargus elgesys su per aukšta drėgme turinčiais grūdais
Neleisti grūdams, kuriuose yra daugiau kaip 15% drėgmės, stovėti ilgiau nei šešias valandas, jų nesilosuojant, apdorojant rūgštimi, džiovinant ar aeruojant, kol laukiama džiovinimo.
7. Laikomo pašaro sandėliavimo trukmės ribojimas
Norint išvengti mikotoksinų ir pelėsių problemos silosuotuose ar šlapiuose pašaruose, juos iš sandėliavimo patalpos imti tik prieš pat šėrimą.
8. Pelėsių inhibitorių naudojimas (propiono rūgštys ir kitos organinės rūgštys) (39).
1.4.2 Priemonės ir medžiagos prieš mikotoksinus pašaruose
Mikotoksinų prevencija ar sumažinimas pašaruose tapo svarbia pašarų gamybos pramonės tema. Prevencijos metodai, įskaitant kontrolę lauke prieš derliaus nuėmimą ir laikymą sandėlyje po derliaus nuėmimo, vis dar yra veiksmingiausios strategijos, nes vargu ar įmanoma pašalinti mikotoksinus, kai jie jau yra pašarų žaliavose. Lyginant skirtingus mikotoksinų mažinimo metodus negalima teigti, kad vienas atskiras metodas yra besąlygiškai efektyvus siekiant pašalinti mikotoksinų taršą pasėliuose arba užkirsti kelią galimam poveikiui gyvūnų sveikatai. Prevencijos strategijos yra
18
plačiai taikomos, nes jos veikia kaip pirmosios eilės kliūtys medžiagoms, neapsaugotoms nuo įvairių teršalų, įskaitant mikotoksinus. Kitų pašarų gamybos technologijų, tokių kaip malimas, šlifavimas ir terminiai metodai, mikotoksinus mažinantis poveikis gali būti nenuoseklus ir apribotas įvairių praktinių sąlygų. Pašarų priedų produktai, ypač veikiantys mikotoksinus, yra perspektyvūs, tačiau vis dar yra pradinėje stadijoje, nes kai kurie produktai in vitro veikia nenuosekliai ir jų in vivo veikimui reikia daugiau įrodymų. Kalbant apie biotransformaciją, norint suprasti mikotoksinų detoksikacijos reakciją, atliekant tyrimus dėl fermentų ir jų galutinių produktų transformacijos toksiškumo, turėtų būti pabrėžiamos mikroorganizmų ar fermentų naudojimo galimybės siekiant užtikrinti saugias gyvūnų pašarų sudedamųjų dalių savybes (41).
Detoksikacijos ar mikotoksinų pašalinimo procesas yra sudėtingas, ypač dėl šių junginių šiluminio stabilumo ir jų suskaidymo į toksiškus produktus. Tačiau mikotoksinų koncentracijos sumažinimas gali būti atliktas šiais metodais: fizikiniais (virimas, kepimas, šildymas mikrobangų krosnelėje, radiacija ir kt.), cheminiais (amoniako naudojimas, druskos rūgštis, salicilo, sulfamido, sulfosalicilo, antranilo, benzoinė, boro, oksalo arba propiono rūgštis) ir biologiniais. Pirmosios dvi metodikos daugiausia koncentruojasi ties tuo, kaip procesų metu sumažinti mikotoksinų kiekį pašarų sudedamosiose dalyse, o paskutinioji - kaip kompensuoti neigiamą mikotoksinais užteršto pašaro poveikį gyvūnų organizmui (21,41,42). Biologinei detoksikacijai naudojami augalų ekstraktai, tokie kaip piperinas, liuteinas, karotinoidai ar eteriniai aliejai, taip pat fermentai, tokie kaip aflatoksiną skaidanti peroksidazė arba lakazė ir fumonizinus skaldanti karboksilesterazė arba aminotransferazė. Taip pat naudojami mikroorganizmai, galintys skaidyti mikotoksinus į mažiau toksiškus metabolitus ir tinkamai apdorojantys pašarą fermentuodami (21,24,42-45). Palyginti su fizikiniais ir cheminiais metodais, biologinės detoksikacijos metodas yra efektyvesnis, specifiškas ir saugesnis aplinkai
(21,44).
Probiotiniai mikroorganizmai, tokie kaip bakterijos, priklausančios gentims Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus faecium, mielės Saccharomyces cerevisiae ir Saccharomyces boulardii, pasižymi mikotoksinų detoksikacijos savybėmis (21,46). Anti-mikotoksiniai priedai (AMP) yra produktų grupė, kuri gali absorbuoti, inaktyvuoti ar neutralizuoti mikotoksinus gyvūnų virškinimo trakte. Kai kurie iš jų yra pagrįsti mielių ląstelių sienelėmis, naudojant natūralios struktūros Saccharomyces cerevisiae ląstelių sieneles surišant kelis mikotoksinus, tokius kaip AFL, OTA ir ZON, ir taip mažinant mikotoksinų absorbciją virškinimo trakte. Be to, produktai iš mielių gali veikti kaip probiotikai, gerinantys bendrą gyvūnų sveikatą, nes jie stimuliuoja imuninę sistemą ir skatina žarnyno gleivinės vientisumą (22,47-50).
19
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
Tiriamasis magistrinis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje, Mikotoksikologijos laboratorijoje. Tyrimai atlikti 2019-2020 metais.
Atlikta 2019 tirtų Lietuvos ūkių pašarų mikotoksinų koncentracijų analizė. Tolimesniems tyrimams atrinkti mėginiai Lietuvos ūkių 5 TMR ir 4 silosuotų pašarų mėginiai, skirti melžiamų karvių šėrimui.
Mėginiai paimti vadovaujantis LST EN ISO 6497:2002 taisyklėmis: sandariai uždaromi į polietileninius maišelius ir pristatomi į laboratoriją per 24 valandas. Mikotoksikologijos laboratorijoje buvo nustatytos mikotoksinų koncentracijos šių pašarų mėginiuose.
Tyrimo metu, visų pirma buvo atliktas higieninių pašarų rodiklių nustatymas. Tada atliktas tyrimas in vitro, kurio metu panaudotas komercinis preparatas, ir Rhodotorula rubra mielės. Šių mielių ir komercinio preparato efektyvumas buvo stebimas mikotoksinų koncentracijos sumažėjimui po 0, 6 ir 12 valandų. Galiausiai buvo įvertintos mikotoksinų koncentracijos pašaruose.
1 pav. Darbo tyrimo schema
Mėginių surinkimas (n=9) •TMR (n=5) •Kukurūzų silosas (n=4) Sanitarinių higieninių rodiklių nustatymas •pH •BBS
•Pienarūgščių bakterijų skaičius •Pelėsinių grybų skaičius
•Mikotoksinų nustatymas (DON, ZON, T-2, AFL B1) Prevencinių priemonių taikymas TMR pašaruose in vitro (n=3) •R.Rubra •Biosprint® Mikotoksinų koncentracijos nustatymas (po 0, 6, 12 valandų) •DON •ZON •T-2 •AFL B1
20
2.1 pH nustatymas pašaruose
pH nustatytas 10 g mėginio dedant į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens ir maišant maišyklėje 20 min. Naudojant pH InoLab PH 720 matuoklį buvo nustatytas mėginio pH, nekintant pH matuoklio rodmeniui.
2.2 Bendro bakterijų skaičiaus nustatymas
Bendro bakterijų skaičiaus (BBS) (KSV/g) nustatymas kukurūzų silose (n=4) ir TMR (n=5) atliktaspagal LST EN ISO 4833-1:2013 skiedimo metodu. Mėginio 10 g dedama į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens, maišyklėje maišoma 20 min. Mėginių skiedimai atliekami iki 1x104.
Reikiamo skiedinio 1 ml sėjamas užpylimo būdu į Petri lėkštelę su mitybiniu agaru PCA (Plate Count Agar).Termostate 30°C temperatūroje Petri lėkštelės laikytos 24 val. BBS kukurūzų silose ir TMR buvo vertintas praėjus 24 val.
2.3 Pienarūgščių bakterijų nustatymas
Pienarūgščių bakterijų kolonijų skaičiaus (KSV/g) nustatymas pagal LST ISO 15214: 2009 atliktas skiedimo metodu. Mėginio 10 g dedama į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens, maišyklėje maišoma 20 min. Mėginių skiedimai atliekami iki 1x103. Reikiamo skiedinio 1 ml sėjamas
užpylimo būdu į Petri lėkštelę su mitybiniu agaru MRS (De Man, Rogosa ir Sharpe). Lėkštelės anaerobinėmis sąlygomis inkubuotos 35C temperatūroje. Praėjus 72 val. buvo vertinamas pienarūgščių bakterijų skaičius.
2.4 Mėginių užkrėstumo pelėsiniais grybais įvertinimas
Pelėsinių grybų kolonijų skaičiaus (KSV/g) nustatymas atliktas skiedimo metodu pagal LST ISO 21527:2008. Mėginio 10 g dedama į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens, maišyklėje maišoma 20 min. Mėginių skiedimai atliekami iki 1x104. Reikiamo skiedinio 1 ml sėjamas užpylimo
būdu į Petri lėkštelę su mitybiniu SDA (sabūro dekstrozės agaras). Lėkštelės laikytos 25C temperatūroje. Praėjus 7 paroms buvo vertinamas pelėsinių grybų skaičius.
2.5 Tyrimas in vitro
Tyrimui naudotos priemonės: komercinis mikrobinis pašarų priedas „Biosprint“, mielės Rhodotorula rubra, KCl, NaCl, NaHCO3, pepsinas. Su hemocitometru nustatytaRhodotorula rubra
mielių koncentracija – 4,0 x 107 KSV. Pasigamintas skrandžio simuliacijos tirpalas: 720 ml dist.
vandens, 0,375 g KCl, NaCl 5,26 g, NaHCO3 2,72 g, pepsino 2,16 g. pH metru nustatytas pH, terpė
buvo rūgštinama iki 2,5 pH nuolat tikrinant pH pokytį. Atskiruose indeliuose paruošiami pašarai, pasverti po 20 g, sumaišomi su 0,7 mg preparato arba 1 μl 4,0 x 107 KSVRhodotorula rubra mielėmis,
21
temperatūroje. Pašaras vertinamas po 0, 6, 12 valandų, išdžiovinamas ir sumalamas - paruošiamas mikotoksinų tyrimui.
2.6 Mikotoksinų koncentracijos pašaruose nustatymas
Deoksinivalenolio ir T-2 toksino nustatymas atliktas plonasluoksne chromatografija pagal
Romer LAB (JAV) metodikas. Reagentų ir buferių paruošimui naudota: acetonitrilas, distiliuotas vanduo toluolas,15 proc. aliuminio chloridas metanolyje, acetonas. Pašarų mėginys buvo išdžiovintas iki pastovios masės 50C temperatūroje ir sumaltas Romer Lab malūnu. Pasvertas 25 g mėginys užpilamas 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu ir maišomas 3 minutes dideliu greičiu, perfiltruojamas per popierinį filtrą. Gryninama perleidžiant per Multisep® 216 kolonėlę.
Koncentracija nustatyta į specialius mikrošvirkštelius pritraukus 10; 20; 40; 60; 80 µl DON standarto ir 80 µl tiriamo mėginio. Ant chromatografinės plokštelės užnešta: 10; 20; 40; 60; 80 µl DON arba T-2 toksino standarto su specialiais mikrošvirkštais ir 80 µl tiriamo mėginio. Plokštelė įmerkiama į vonelę su ½ (10 ml/20 ml) toluolo/acetono mišiniu. Plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje. Plokštelė išdžiovinama ore ir pakaitinama 5 minutes 150C temperatūroje. Įvertinama DON, T-2 koncentracija UV spindulių fone (360 nm). Aptikimo riba DON - 10 ppb, o T-2 toksino – 10 ppb (µg/kg).
Zearalenono ir aflatoksino B1 nustatymas atliktas plonasluoksne chromatografija pagal
Romer LAB metodikas. Naudoti reagentai: ledinė acto rūgštis, acetonitrilas, distiliuotas vanduo, chloroformas, metanolis, toluolas, acetonas, aliuminio chloridas.Pašarų mėginys buvo išdžiovintas iki pastovios masės 50C temperatūroje ir sumaltas Romer Lab malūnu. Atsveriama 25 g mėginio į indą ir gryninama perleidžiant per Mycosep ® 226.
Koncentracija nustatyta į specialius mikrošvirkštelius pritraukus 10; 20; 40; 80 µl zearalenono standartų ir 80 µl tiriamo mėginio. Ant silikagelio chromatografinės plokštelės užnešus: 10; 20; 40; 80 µl zearalenono bei aflatoksino B 1 standartų ir 90 µl tiriamo mėginio su specialiais mikrošvirkštais. Plokštelė įmerkiama į 9/1 (18 ml/2 ml) chloroformo/acetono mišinio vonelę. Laikoma, kol skystis pakyla iki 1 cm plokštelės viršaus. Po to plokštelė išdžiovinama ore. Įvertinama AFL B 1 koncentracija Plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje. Plokštelė išdžiovinama ore. ZON koncentracija įvertinama UV spindulių fone.Aptikimo riba ZON – 10 ppb, AFL B 1 – 1 ppb.
2.7 Statistinis duomenų įvertinimas
Programos, naudotos tyrimų duomenims įvertinti: ,,Microsoft Excel 2007“ ir IBM SPSS Statistics 26.0. Programomis apskaičiuoti gautų duomenų standartiniai nuokrypiai, aritmetiniai
22
vidurkiai, variacijos koeficientas, koreliacijos koeficientas. Stjudento testas naudotas ieškant esminių skirtumų. Duomenys laikomi patikimais, jei p<0,05, p<0,01.
23
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 2019 metų mikotoksinų koncentracijų Lietuvos ūkių silosuotuose pašaruose
ir pašarų mišiniuose analizė
Analizuoti 2019 metais Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje, Mikotoksikologijos laboratorijoje atlikti mikotoksinų koncentracijų Lietuvos ūkių pašarų mišiniuose ir kukurūzų silose tyrimai. Tyrimui paimti 23 kukurūzų siloso mėginiai ir 29 TMR mėginiai: analizuotos ZON, DON, AFL B1 mikotoksinų koncentracijos (4 lentelė).
4 lentelė. Mikotoksinų koncentracijos (g/kg) skirtinguose pašaruose
Kukurūzų silosas
Mėginių skaičius 23 23 23
Mikotoksinas AFL B1 ZON DON
Vidurkis 1,54 348,7 105,22
Mediana 0,7 300 0
Standartinis nuokrypis 1,83 246,47 173,96 TMR
Mėginių skaičius 21 29 27
Mikotoksinas AFL B1 ZON DON
Vidurkis 2,05 466,55 145,37
Mediana 1,3 600 100
Standartinis nuokrypis 2,49 288,54 165,255
Silose (n=23) didžiausia AFL B1 koncentracija – 3,5 g/kg, DON – 600 g/kg, ZON – 730
g/kg. TMR didžiausia AFL B1 (n=21) koncentracija – 8 g/kg, DON (n=27) – 500 g/kg, ZON
(n=29) – 1000 g/kg. Į analizę neįtrauktas T-2 toksinas, nes šio toksino aptikimo ir koncentracijos nustatymo tyrimas atliktas tik keletui mėginių.
Mažiausios koncentracijos pašarų mišiniuose ir kukurūzų silose žemiau aptikimo ribos - AFL B1 <1 g/kg, DON <10 g/kg, ZON <10 g/kg.
Bendrai silose ir TMR AFL B1 siekia 70,5 proc., ZON - 86,5 proc. DON - 48 proc. teigiamų
mėginių.
24
86,2 proc. pašarų mišinių mėginių nustatytas užteršimas zearalenonu, o kukurūzų silose - 87 proc. mėginių.
Pašarų mišinių užterštumas deoksinivalenoliu nustatytas 59,3 proc. mėginių, siloso užterštumas - 34,8 proc. mėginių.
3.2 Silosuotų pašarų bei pašarų mišinių higieniniai rodikliai
Vertinant pašarų higieninę kokybę tiek TMR, tiek silose svarbu atkreipti dėmesį į mikroskopinių grybų ir bakterijų kiekio aptikimą juose. Mikroorganizmų kiekis pašare kinta jiems gendant bei gali padėti nuspręsti, ar pašaras vis dar tinkamas gyvulių šėrimui.
TMR (n=5) ir kukurūzų siloso (n=4) mėginiai prieš bandymą paimti iš X ūkių, kurie skirti melžiamoms karvėms.
Pašaro pH gali suteikti informacijos apie siloso kokybę, o pienarūgštės bakterijos reikalingos siloso fermentacijos procese. Didžiausias pH nustatytas 5,46 TMR, o mažiausias - 3,57 kukurūzų silose. Pienarūgščių bakterijų skaičius didžiausias aptiktas TMR - 1180x103 KSV/g, o mažiausias
silose - 1x103 KSV/g.
2 pav. Pašarų užterštumas mikroskopiniais grybais ir bendras bakterijų skaičius (KSV/g)
Tirtuose pašaruose nustatytas užterštumas mikroskopiniais grybais ir bendras bakterijų skaičius (2 pav.). Pašaruose bendras bakterinis užterštumas kito nuo 3,0x104 iki 676x104 KSV/g; tiek mažiausias, tiek didžiausias bendras bakterinis užterštumas nustatytas kukurūzų siloso mėginiuose. Mikroskopinių grybų kiekis aptiktas nuo mažiau nei 10 ksv/g iki 827x103 KSV/g, didžiausias kiekis
aptiktas TMR pašare, o mažiausias kukurūzų silose.
186,4 20,19 171,3 0,6 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 BBS Mikroskopiniai grybai Mikro sko p in ių gry b ų ir b en d ra s b ak terijų s ka iči u s (x10 4KS V/g) TMR Kukurūzų silosas
25 3.2.1 Mikotoksinų koncentracijos kukurūzų silose ir pašarų mišiniuose
Pašarų kokybę lemia ir mikotoksinų koncentracija pašare: DON, ZON, AFL B1, T-2. Įvertinus
pašarų užterštumą mikotoksinais, aptikta didžiausia deoksinivalenolio koncentracija 750 g/kg kukurūzų siloso mėginyje, mažiausia DON koncentracija <10 g/kg aptikta TMR. Šio mikotoksino koncentracija pašaruose, remiantis EU rekomenduojamomis orientacinėmis vertėmis 2006/576/EB, papildomoms pašarinėms medžiagoms ir visaverčiams pašarams 12 procentų drėgnumo pašare - 5000 g/kg, grūdams ir grūdų produktams - 8000 g/kg, šalutiniams kukurūzų produktams - 12000 g/kg. Didžiausia zearalenono koncentracija – 670 g/kg kukurūzų silose. TMR pašare aptikta mažiausia koncentracija <10 g/kg. Remiantis EU rekomendacijomis 12 proc. drėgnumo pašarų papildomoms pašarinėms medžiagoms ir visaverčiams pašarams veršeliams, pieningoms karvėms, avims ir ožkoms zearalenono koncentracijos orientacinė vertė - 500 g/kg.
Aflatoksino B1 didžiausia koncentracija 3,3 g/kg aptikta tiek kukurūzų silose, tiek TMR
pašaruose, o mažiausia šiuose pašaruose rasta koncentracija <1 g/kg. Visaverčiuose pašaruose, skirtuose pieniniams galvijams, avims, ožkoms, veršiukams, ėriukams, ožiukams, paršeliams ir naminių paukščių jaunikliams remiantis EU 2002/32/EC aflatoksino B1 koncentracija 12 proc.
drėgnumo pašaruose 5 g/kg.
T-2 aptikta didžiausia koncentracija 246 g/kg bei mažiausia <10 g/kg koncentracija TMR pašaruose. EU rekomendacijose 2013/165/ES kombinuotiems pašarams nurodoma 250 g/kg, kitiems grūdų produktams - 500 g/kg, avižų malimo produktams - 2000 g/kg. Viršijus šio toksino koncentracijas, turi būti atlikti tyrimai, ypač kiekį viršijus pakartotinai - tai nurodoma Žemės ūkio ministro 2003 m. birželio 4 d. įsakymo Nr. 3D-225 pakeitime „Dėl Pašarų privalomųjų saugos reikalavimų kontrolės įgyvendinimo taisyklių patvirtinimo“.
26
3 pav.Pašarų užterštumas mikotoksinais (g/kg)
3.3 Mikotoksinų koncentracijos, nustatytos panaudojus mikrobinį pašarų priedą
Bandymui atlikti iš tirtų TMR mėginių atrinkti 3 pašarų mišinių mėginiai. Į mėginius buvo įdėta BIOSPRINT® mikrobinis pašarų priedas, skirtas gyvūnų pašarams su Saccharomyces cerevisiae MUCL 39885 1.5 x 1010 KSV.
Mikrobinio pašarų priedo BIOSPRINT® - rekomenduojamas priedo kiekis yra 3,0 g gyvuliui per dieną; tyrimo metu šis kiekis buvo apskaičiuotas atitinkamas mėginio kiekiui. Karvės pašarų racionas dienai sudaro apie 70 kg stambių pašarų (silosas, šienainis) ir apie 18 kg koncentruoto pašaro bei laisvas priėjimas prie vandens.
Pašarų drėgmė nuo 18,31 proc. iki 19,82 proc., riebalai nuo 3,48 proc. iki 3,99 proc. baltymai nuo 24,38 proc. iki 28,97 proc., ląsteliena nuo 16,66 proc. iki 17,99 proc., krakmolas nuo 31,2 proc. iki 32,26 proc., pelenai nuo 2,45 proc. iki 3,18 proc.
Pašarų mišinių mėginių mikotoksinų koncentracijos pirmiausia įvertintos be priedo, po to su priedu po 0, 6 ir 12 valandų skrandžio simuliacijos tirpale. Kiekvienas mėginys atskirai pasvertas ir atskirai vertintas po tam tikro laiko jį apdorojus su priedu. Pašarų mišiniuose vertintos deoksinivalenolio, zearalenono, aflatoksino B1 ir T-2 koncentracijos bei stebėtas koncentracijos
27
5 lentelė. Mikotoksinų koncentracija pašare prieš ir po bandymo
Vertinimas DON (g/kg) ZON (g/kg) AFL B1 (g/kg) T-2 (g/kg)
Koncentracija pašare be priedo 158,3 100 1,7 103,8 Standartinis nuokrypis 80,36 173,2 0 127,95 Pašare su priedu Koncentracija pašare po 0 val. <10 55,67 0,85 <10 Standartinis nuokrypis 0 96,41 1,2 0 Poveikio koreliacijos koeficientas - 1,0** - - Koncentracija pašare po 6 val. 83,3 193,3 <1 <10 Standartinis nuokrypis 144,33 172,14 0 0 Poveikio koreliacijos koeficientas -0,36 0,69 - - Koncentracija pašare po 12 val. 83,3 110 1 25 Standartinis nuokrypis 144,33 190,52 1,73 43,3 Poveikio koreliacijos koeficientas 0,99 -0,5 - -0,7 *p<0,05 **p<0,01 - koreliacijos nebuvo
28
Atlikus bandymą su mikrobiologiniu pašarų priedu pastebėta, kad po 0 valandų deoksinivalenolio koncentracija pašarų mišiniuose sumažėjo apie 94-100 procentų, o mikotoksino koncentracija nustatyta žemiau aptikimo ribos t.y. <10 g/kg.
Mišinius vertinant po 6 valandų, vertė nuo pradinės DON koncentracijos sumažėjo 47,38 proc. (p>0,05), po 12 valandų pašarų mišiniuose taip pat nuo pradinės koncentracijos DON koncentracija sumažėjo 47,38 proc.(p>0,05).
Zearalenono koncentracija pašarų mišiniuose nuo pradinės koncentracijos sumažėjo 44,33 proc. (p<0,01) po 0 valandų nuo bandymo pradžios. Po 6 valandų pašarų mišiniuose šio mikotoksino koncentracija padidėjo 48,27 proc.(p>0,05) nuo pradinės koncentracijos mėginyje, o po 12 valandų mėginiuose koncentracija padidėjo 9,1 proc. (p>0,05).
Aflatoksino B1 koncentracija po 0 valandų sumažėjo 50 proc. lyginant su pradine koncentracija
pašare be priedo. Vertinant pašarus, apdorotus su priedu, po 6 valandų koncentracija sumažėjo, lyginant su pradine, ir buvo žemiau aptikimo ribos <1 g/kg. Po 12 valandų TMR pašaruose koncentracija sumažėjo 41,18 proc..
T-2 toksino koncentracijos tirtuose Lietuvos ūkių pašarų mėginiuose po 0 ir 6 valandų nuo bandymo pradžios buvo žemiau aptikimo ribos <10 g/kg t.y. sumažėjo ~ 90-100 proc..
Koncentracija po 12 valandų TMR mėginiuose nuo pradinės koncentracijos sumažėjo 76 proc. (p>0,05).
3.4 Mikotoksinų koncentracijos, panaudojus Rhodotorula rubra mieles
Mielės gali būti naudojamos kaip mikotoksinus biotransformuojančios priemonės, kai kurios jų mikotoksinus paverčia į mažiau toksiškus produktus. Prieš bandymą trys pašarų mišinių mėginiai buvo įvertinti be mielių poveikio ir vėliau su R. Rubra mielėmis. Poveikis stebėtas po 0, 6 ir 12 val. skrandžio simuliacijos tirpale (6 lentelė). Prieš tyrimą ir po tyrimo įvertintos mikotoksinų koncentracijos: ZON, DON, AFL B1, T-2. Lentelėje pateikti gautų rezultatų vidurkiai.
6 lentelė. Mikotoksinų koncentracija pašare prieš ir po bandymo
Vertinimas DON (g/kg) ZON (g/kg) AFL B1
(g/kg) T-2 (g/kg)
Koncentracija pašare
be priedo 158,3 100 1,7 103,8
29
6 lentelės tęsinys
*p<0,05
– koreliacijos nėra
Analizuojant pašaro mišinį, apdorotą su R. Rubra mielėmis, deoksinivalenolio koncentracija po 0 valandų nuo pradinės mikotoksinų koncentracijos pašarepadidėjo 20,9 proc. (p>0,05). Po 6 valandų šio mikotoksino koncentracija sumažėjo 5,25 proc. (p>0,05), po 12 valandų tirtuose pašaruose DON koncentracija sumažėjo 47,38 proc. nuo pradinių mėginių koncentracijos.
Zearalenono koncentracija pašare padidėjo po 0 ir 6 valandos vienodai 25 proc. (p>0,05) nuo bandymo pradžios. Pašaruose praėjus 12 valandų šio mikotoksino koncentracija padidėjo 40 proc. (p>0,05) nuo pradinės mikotoksino koncentracijos.
Vertinimas DON (g/kg) ZON (g/kg) AFL B1
(g/kg) T-2 (g/kg) Poveikio koreliacijos koeficientas 0,6 0,5 - -0,7 Koncentracija pašare po 6 val. 150 133,3 0,85 20 Standartinis nuokrypis 180,27 152,75 1,2 34,64 Poveikio koreliacijos koeficientas 0,9 0,95 - 0,97 Koncentracija pašare po 12 val. 83,3 166,7 <1 50 Standartinis nuokrypis 144,33 152,75 0 17,32 Poveikio koreliacijos koeficientas -0,63 0,19 - -0,97 Standartinis nuokrypis 80,36 173,2 0 127,95 Koncentracija pašare po 0 val. 200 133,3 0,85 25
30
AFL B1 mikotoksino koncentracija sumažėjo 0,tiek po 6 ir 12 valandų. Praėjus 0 valandų ir 6
valandoms, mėginiuose mikotoksino koncentracija sumažėjo vienodai 50 proc.. Po 12 valandų pašare mikotoksino koncentracija buvo žemesnė nei aptikimo riba, kuri yra <1 g/kg.
T-2 toksino koncentracija pašare po 0 valandų sumažėjo iki 76 proc. (p>0,05) nuo jo pradinės koncentracijos pašarų mišiniuose. Pašaruose po 6 valandų toksino koncentracija taip pat sumažėjo 80,7 procentais (p>0,05), po 12 valandų nuo pradinės koncentracijos toksino sumažėjo 51,8 proc. (p>0,05). .
31
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiame tiriamajame darbe tirti natūraliai mikotoksinais užteršti pašarų mišiniai ir kukurūzų silosas, skirti melžiamų karvių šėrimui. Naudojant 2019 metų duomenis nustatyta, kad kukurūzų silose ir TMR, skirtuose šerti melžiamas karves, zearalenonas yra dažniausiai pašaruose aptinkamas mikotoksinas, o rečiausiai aptinkamas - deoksinivalenolis. Taip pat nustatyta, kad ZONkoncentracija pašaruose didesnė, lyginant su kitų mikotoksinų koncentracijomis. Galima teigti, kad šis mikotoksinas yra labiausiai paplitęs tirtuose mėginiuose. Šios analizės duomenys sutapo ir su daugelio kitų autorių duomenimis, kurie nurodė, kad dažniausiai pašaruose aptinkamas ZON mikotoksinas (51-53).
Atliktame tyrime išanalizavus TMR ir kukurūzų siloso higieninius rodiklius, didžiausias bendras bakterinis užterštumas bei mikroskopinių grybų kiekis rastas pašarų mišiniuose. pH ir pienarūgščių didžiausias skaičius aptiktas TMR mėginiuose. Didžiausia aptikta zearalenono mikotoksino koncentracija kukurūzų silose viršija EU rekomenduojamas mikotoksinų vertes gyvūnų pašaruose, T-2 toksino pašarų mišinyje koncentracija artėja prie didžiausios EU rekomenduojamos vertės (54,55).
Bandyme su komerciniu BIOSPRINT® mikrobiniu pašarų priedu, įvertinus poveikį pašarams
skirtingomis valandomis, pastebėta, kad po preparato panaudojimo mėginiuose didžiausias poveikis AFL B1 ir T-2 koncentracijoms - jos sumažėjo iki žemesnės nei aptikimo ribos, kuri <10 g T-2 ir
AFL B1 <1 g/kg, lyginant su pradinėmis mikotoksinų koncentracijomis. Deoksinivalenolio
koncentracijos sumažėjimas mėginiuose didžiausias po preparato aplikavimo, vertinant kitomis valandomis šis poveikis daug silpnesnis ir koncentracijos sumažėjimas ne toks žymus. Mažiausias preparato poveikis pastebėtas ZON koncentracijai. Remiantis kitų autorių duomenimis stiprus sumažėjimas pastebėtas AFL B1 ir T-2, ZON mikotoksinų, o DON buvo labiausiai atsparus. Mūsų
duomenys sutapo dėl AFL B1 ir T-2 detoksifikacijos efektyvumo (21).
Atrinktus pašarų mišinius apdorojus su Rhodotorula rubra mielėmis nustatyta, kad AFL B1
koncentracija pašarų mėginiuose po 12 valandų buvo žemiau aptikimo ribos. T-2 toksino didžiausias koncentracijos sumažėjimas mėginiuose buvo po 6 valandų, o DON - po 12 valandų. Zearalenono koncentracija pašarų mišinių mėginiuose didėjo. Nepastebėtas pastovus bei efektyvus poveikis mikotoksinų koncentracijų sumažėjimui. Rhodotorula rubra mielių efektyvumas literatūroje nėra išsamiai išsiaiškintas. Didžiausios koncentracijos pašaruose po mielių panaudojimo: DON - 200 g/kg (±180,27), ZON – 166,7 g/kg (±152,75), AFL B1 – 0,85 g/kg (±1,2), T-2 – 50 g/kg
(±17,32). Remiantis kitų autorių duomenimis, šios mikotoksinų koncentracijos nesukeltų pastebimo neigiamo poveikio galvijams (56-58).
32
Atlikto bandymo metu pašaruose su pritaikytomis priemonėmis mikotoksinų koncentracijos kitimas įvairavo: kai kurių mikotoksinų koncentracijos sumažėjo iki žemesnės nei aptikimo ribos, kituose mėginiuose panaudojus preparatą koncentracijos padidėjo. Komercinio preparato efektyvumas didesnis nei pasirinktų mielių, bet siekiant nustatyti, ar komercinis preparatas ir Rhodotorula rubra mielės gali tik sumažinti mikotoksinų koncentracijas, ar visiškai eliminuoti mikotoksinus, reikėtų atlikti daugiau bandymų.
33
IŠVADOS
1. Atlikus 2019 metų mikotoksinų koncentracijų Lietuvos (X) ūkių silosuotuose pašaruose ir pašarų mišiniuose analizę nustatėme, kad:
1.1. ZON yra dažniausiai aptiktas mikotoksinas pašaruose 86,5 proc., kukurūzų silose ZON koncentracija svyravo nuo LOD<10 g/kg iki 730 g/kg, TMR – nuo LOD<10 g iki 1000 g/kg.
1.2. AFLB1 silosuotuose pašaruose svyravo nuo LOD<1 g/kg iki 4 g/kg, TMR LOD<1 g/kg
iki 8 g/kg;
1.3. DON silosuotuose pašaruose svyravo nuo LOD<10 g/kg iki 600 g/kg, TMR LOD<10 g/kg iki 500 g/kg;
2. Nustačius atrinktų silosuotų pašarų bei pašarų mišinių higieninius rodiklius nustatyta, kad: 2.1. pH rodiklis TMR pašaruose 3,95 iki 5,46, silosuotuose pašaruose - nuo 3,57 iki 3,64;
2.2. Bendras bakterinis užterštumas silosuotų pašarų – 3,0x104 iki 676x104 KSV/g, TMR –
53x104 iki 522x104KSV/g;
2.3. Pienarūgščių bakterijų skaičius silosuotuose pašaruose svyravo nuo 1x103 iki 422x103, TMR – 212x103 iki 1180x103KSV/g;
2.4. Mikroskopinių grybų skaičius silosuotuose pašaruose svyravonuo mažiau nei 10 ksv/g iki 1,3x104 KSV/g, TMR – 2x104 iki 82x10 KSV/g;
2.5. Silosuotuose pašaruose AFL B1 koncentracija svyravo nuo LOD<1 g/kg iki 3,3 g/kg, DON
- nuo 250 g/kg iki 750 g/kg, ZON - nuo 330 g/kg iki 670 g/kg, T-2 - nuo 88,37 g/kg iki 222,34 g/kg;
2.6. Pašarų mišiniuose AFL B1 koncentracija svyravo nuo LOD<1 g/kg iki 3,3 g/kg, DON nuo
LOD<10 g/kg iki 250 g/kg, ZON nuo LOD<10 g/kg iki 330 g/kg, T-2 - nuo LOD<10 g/kg iki 246,74 g/kg ;
3. Didžiausias detoksikuojančio preparato efektyvumas in vitro nustatytas po 0 ir 6 val., AFL B1
koncentracijai sumažėjus 50-100 proc., T-2 toksino ~ 90-100 proc. DON ir ZON koncentracijų sumažinimui statistiškai patikimo poveikio nenustatyta p>0,05.
4. Rhodotorula rubra mielių didžiausias efektyvumas sumažinant ar eliminuojant mikotoksinus in vitro nustatytas AFL B1 po 12 valandų sumažėjimas 50 proc. (p>0,05), DON didžiausias
koncentracijos sumažėjimas po 12 valandų – 47,38 proc. (p>0,05), o T-2 toksino po 6 valandų - 80,7 proc. (p>0,05). ZON koncentracijai poveikio nenustatyta (p>0,05).
34
REKOMENDACIJOS
1. Pašaruose aptikus mikotoksinų reikia ieškoti priežasčių, kurios lėmė jų atsiradimą bei jas pašalinti. Taikyti strategijas, užkertančias kelią mikroskopinių grybų ir jų metabolitų susidarymui pašarų žaliavoje prieš derliaus nuėmimą, nuėmimo metu ir sandėliuojant. Jeigu tarša randama pašaruose, taikyti mikotoksinus pašalinančias arba inaktyvuojančias priemones.
2. Pašarams esant užterštiems mikotoksinais, norint išvengti neigiamo poveikio gyvūnų sveikatai bei pasirūpinti geresne pašarų kokybe reikia taikyti prevencines priemones, kurios sumažintų arba eliminuotų mikotoksinus iš pašaro. Mikotoksinų koncentracijų sumažinimui pašaruose galima naudoti: pelėsių inhibitorius, absorbentus, fizinį atskyrimą (grūdų valymas), maišyti su neužterštais pašarais ir kt.
35
LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Santos Pereira C, C Cunha S, Fernandes JO. Prevalent Mycotoxins in Animal Feed: Occurrence and Analytical Methods. Toxins 2019;11(5):290.
2. Čolović R, Puvača N, Cheli F, Avantaggiato G, Greco D, Đuragić O, et al. Decontamination of Mycotoxin-Contaminated Feedstuffs and Compound Feed. Toxins (Basel) 2019 Oct 25;11(11):617. doi: 10.3390/toxins11110617.
3. Gruber-Dorninger C, Jenkins T, Schatzmayr G. Global Mycotoxin Occurrence in Feed: A Ten-Year Survey. Toxins (Basel) 2019 Jun 27;11(7):375. doi: 10.3390/toxins11070375.
4. Mycotoxins:https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/mycotoxins 2018. [prieiga:2020-11-15].
5. Charmley LL, Trenholm HL, Prelusky DB, Rosenberg A. Economic losses and decontamination. Nat Toxins 1995;3(4):199-203; discussion 221.
6. Weinberg ZG, Ashbell G, Chen Y, Gamburg M, Sela S. The effect of sewage irrigation on safety and hygiene of forage crops and silage. Animal Feed Science and Technology 2004;116(3):271-280.
7. Amigot S, Gaggiotti M, Romero L, Basílico J, Fulgueira C. Forage Quality: Techniques for Testing. Fresh Prod 2007;1.
8. Kung L, Shaver RD, Grant RJ, Schmidt RJ. Silage review: Interpretation of chemical, microbial, and organoleptic components of silages. Journal of Dairy Science 2018;101(5):4020-4033.
9. Muck R. Recent advances in silage microbiology. AFSci 2013;22(1).
10. Yang E, Fan L, Yan J, Jiang Y, Doucette C, Fillmore S, et al. Influence of culture media, pH and temperature on growth and bacteriocin production of bacteriocinogenic lactic acid bacteria. AMB Express 2018;8(1):10.
11. Borreani G, Tabacco E, Schmidt RJ, Holmes BJ, Muck RE. Silage review: Factors affecting dry matter and quality losses in silages. Journal of Dairy Science 2018;101(5):3952-3979.
12. Jutzi S. Assessing Quality And Safety Of Animal Feeds. ; 2007.
13. Wood AD, Howard K, Mills AL, Williams PEV. Total Enterobacteriaceae counts as an indicator of animal feedingstuffs hygiene. 1995.
14. Thiex N, Richardson C. Challenges in measuring moisture content of feeds. J Anim Sci 2004;81:3255-66.
15. Nennich T, Chase L. Dry Matter Determination . 2007.
16. Santos MC, Lock AL, Mechor GD, Kung L, J. Effects of a spoilage yeast from silage on in vitro ruminal fermentation. J Dairy Sci 2015;98(4):2603-2610.
36
18. Reisinger N, Schürer-Waldheim S, Mayer E, Debevere S, Antonissen G, Sulyok M, et al. Mycotoxin Occurrence in Maize Silage-A Neglected Risk for Bovine Gut Health? Toxins (Basel) 2019 Oct 4;11(10):577. doi: 10.3390/toxins11100577.
19. Yalçın N, Işık M, AVCI T, Oguz H, Coşkun B, ÇİFTÇİ E. The Presence of Mycotoxin in Total Mixed Rations of Dairy Cattle * Süt Sığırlarının Toplam Karışık Rasyonlarında Mikotoksin Varlığı. Atatürk Üniversitesi Veteriner Bilimleri Dergisi 2016;1.
20. Streit E, Schatzmayr G, Tassis P, Tzika E, Marin D, Taranu I, et al. Current situation of mycotoxin contamination and co-occurrence in animal feed--focus on Europe. Toxins (Basel) 2012 Oct;4(10):788-809.
21. Chlebicz-Wójcik A, Slizewska K. In Vitro Detoxification of Aflatoxin B1, Deoxynivalenol, Fumonisins, T-2 Toxin and Zearalenone by Probiotic Bacteria from Genus Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae Yeast. Probiotics and Antimicrobial Proteins 2019;12.
22. Keller L, Abrunhosa L, Keller K, Rosa CA, Cavaglieri L, Venâncio A. Zearalenone and Its Derivatives α-Zearalenol and β-Zearalenol Decontamination by Saccharomyces cerevisiae Strains Isolated from Bovine Forage. Toxins (Basel) 2015 Aug 20;7(8):3297-3308.
23. Marin S, Ramos AJ, Cano-Sancho G, Sanchis V. Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment. Food and Chemical Toxicology 2013;60:218-237.
24. Zachariasova M, Dzuman Z, Veprikova Z, Hajkova K, Jiru M, Vaclavikova M, et al. Occurrence of multiple mycotoxins in European feedingstuffs, assessment of dietary intake by farm animals. Animal Feed Science and Technology 2014;193:124-140.
25. Alshannaq A, Yu JH. Occurrence, Toxicity, and Analysis of Major Mycotoxins in Food. Int J Environ Res Public Health 2017 Jun 13;14(6):632. doi: 10.3390/ijerph14060632.
26. Ji C, Fan Y, Zhao L. Review on biological degradation of mycotoxins. Animal Nutrition 2016;2(3):127-133.
27. Nugmanov A, Beishova I, Kokanov S, Lozowicka B, Kaczynski P, Konecki R, et al. Systems to reduce mycotoxin contamination of cereals in the agricultural region of Poland and Kazakhstan. Crop Protection 2018;106:64-71.
28. Yiannikouris A, Jouany J. Mycotoxins in feeds and their fate in animals: A review. Animal Research - ANIM RES 2002;51:81-99.
29. Whitlow L, Hagler WM, Diaz DE. Mycotoxins in feeds. Feedstuffs 2010;76:66-76.
30. Fink-Gremmels J. The role of mycotoxins in the health and performance of dairy cows. The Veterinary Journal 2008;176(1):84-92.
31. Debevere S, Cools A, Baere S, Haesaert G, Rychlik M, Croubels S, et al. In Vitro Rumen Simulations Show a Reduced Disappearance of Deoxynivalenol, Nivalenol and Enniatin B at Conditions of Rumen Acidosis and Lower Microbial Activity. Toxins 2020;12:101.
32. Wambacq E, Vanhoutte I, Audenaert K, De Gelder L, Haesaert G. Occurrence, prevention and remediation of toxigenic fungi and mycotoxins in silage: a review. J Sci Food Agric 2016;96(7):2284-2302.
37
33. Debevere S, De Baere S, Haesaert G, Rychlik M, Croubels S, Fievez V. In vitro rumen simulations show a lower disappearance of deoxynivalenol, nivalenol, zearalenone and enniatin B at conditions of rumen acidosis and at dry conditions. Mycotoxin workshop. 2019.
34. Rodrigues I. A review on the effects of mycotoxins in dairy ruminants. Animal Production Science 2014;54.
35. Abidin Z, Khatoon A. International Journal of Veterinary Science Ruminal Microflora, Mycotoxin Inactivation by Ruminal Microflora and Conditions Favouring Mycotoxicosis in Ruminants: A Review. 2012.
36. Goncalves B, Corassin C, Oliveira C. Mycotoxicoses in Dairy Cattle: A Review. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances 2015;10:752-760.
37. De Oliveira, C. A. F., Corassin CH, Correa B, Oswald IP. Encyclopedia of Agriculture and Food Systems. 2nd ed.: Elsevier; 2014.
38. Whitlow L, Hagler W. Mold and Mycotoxin Issues in Dairy Cattle: Effects, Prevention and Treatment. Advances in Dairy Technology, Vol 20: Proc Western Canadian Dairy Seminar, Red Deer, AB, Canada 2008.
39. Adams RS, Kephart KB, Ishler VA, Hutchinson LJ, Roth GW. Mold and mycotoxin
problems in
livestock feeding. 1993.
40. Moulds: Their effect on nutrition and prevention. 7th International Working Conference on Stored-product Protection; 2010.
41. Peng W-, Marchal JLM, van der Poel, A. F. B. Strategies to prevent and reduce mycotoxins for compound feed manufacturing. Animal Feed Science and Technology 2018;237:129-153.
42. Aiko V, Mehta A. Occurrence, detection and detoxification of mycotoxins. J Biosci 2015;40(5):943-954.
43. Juodeikiene G, Bartkiene E, Cernauskas D, Cizeikiene D, Zadeike D, Lele V, et al. Antifungal activity of lactic acid bacteria and their application for Fusarium mycotoxin reduction in malting wheat grains. LWT 2018;89:307-314.
44. Zhu Y, Hassan YI, Lepp D, Shao S, Zhou T. Strategies and Methodologies for Developing Microbial Detoxification Systems to Mitigate Mycotoxins. Toxins (Basel) 2017 Apr 7;9(4):130. doi: 10.3390/toxins9040130.
45. Loi M, Fanelli F, Liuzzi VC, Logrieco AF, Mulè G. Mycotoxin Biotransformation by Native and Commercial Enzymes: Present and Future Perspectives. Toxins 2017;9(4):111.
46. Vinderola G, Ritieni A. Role of Probiotics Against Mycotoxins and Their Deleterious Effects. Journal of Food Research 2014;4.
47. Joannis-Cassan C, Tozlovanu M, Hadjeba-Medjdoub K, Ballet N, Pfohl-Leszkowicz A. Binding of zearalenone, aflatoxin B1, and ochratoxin A by yeast-based products: a method for quantification of adsorption performance. J Food Prot 2011 Jul;74(7):1175-1185.
