LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMJA
Veterinarijos fakultetas
Deimantė Dziegoraitytė
MIKOTOKSINŲ IR KITŲ HIGIENINIŲ RODIKLIŲ POVEIKIS GALVIJŲ
SVEIKATINGUMUI BEI PROFILAKTINIŲ PRIEMONIŲ PAIEŠKA
GERINANT SILOSUOTŲ PAŠARŲ KOKYBĘ
The effects of mycotoxins and other hygiene parameters on health cattle status
and to identify of prophylaxis methods for improving silage quality
Veterinarijos medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Bronius Bakutis
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Mikotoksinų ir kitų higieninių rodiklių poveikis galvijų sveikatingumui bei profilaktinių priemonių paieška gerinant silosuotų pašarų kokybę“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas)
vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 10 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 111.1. Mikroskopinių grybų antriniai metabolitai – mikotoksinai ... 11
1.1.1. Aflatoksinai ... 11 1.1.2. T-2 toksinas ... 12 1.1.3. Ochratoksinas A (OTA) ... 12 1.1.4. Fumonizinai ... 12 1.1.5. Deoksivalenolas (DON) ... 12 1.1.6. Zearalenonas ... 13
1.2. Mikroorganizmai silosuojamuose pašaruose ... 13
1.2.1. Bakterijos ... 13
1.2.2. Mikroskopiniai grybai ... 14
1.3. Siloso higieninė sanitarinė kokybė ... 15
1.3.1. Aerobinė fazė ... 15
1.3.2. Anaerobinė fazė ... 15
1.3.3. Stabili siloso fazė ... 16
1.3.4. Fermentacijos fazė ... 16
1.4. Kukurūzų siloso higieninės sanitarinės kokybės gerinimas ... 16
1.4.1. Eteriniai aliejai (EO) ir jų antigrybinis poveikis kukurūzų silosui ... 16
1.4.2. Eterinių aliejų antibakterinės savybės siloso gerinimui ... 16
1.4.3. Priešgrybinis augalinių ekstraktų poveikis kukurūzų silosui ... 17
1.5. Augalai, pasižymintys antimikrobiniu veikimu ... 17
1.5.1. Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare) ... 17
1.5.2. Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris) ... 18
1.5.3. Etanolinių ekstraktų ir eterinių aliejų poveikis galvijų organizmui ... 18
1.6. Mikotoksinų poveikis organizmo ląstelėms ... 19
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGA ... 20
2.1. Tyrimų objektai ... 20
2.2. Žaliavų ir iš jų gamintų silosuotų pašarų higieninių rodiklių nustatymas ... 21
2.3. Augalinių ekstraktų, kaip profilaktinių priemonių, panaudojimas siloso higieninei kokybei pagerinti ... 22
2.4. Kristalinio mikotoksino DON ir etanolinių ekstraktų ląstelių proliferacijai įvertinimas in vitro ... 23
2.5. Statistinis duomenų įvertinimas ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1. Kukurūzų žaliavos po fermentacijos higieninė kokybė ... 25
3.1.1. Mikotoksinų koncentracija silose ... 25
3.1.2. Mikrobiologiniai siloso rodikliai ... 27
3.2. Mikotoksino DON ir etanolinių ekstraktų ląstelių proliferacijai poveikis in vitro ... 30
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33
IŠVADOS ... 35
REKOMENDACIJOS ... 36
4
SANTRAUKA
Mikotoksinų ir kitų higieninių rodiklių poveikis galvijų sveikatingumui bei
profilaktinių priemonių paieška gerinant silosuotų pašarų kokybę
Deimantė Dziegoraitytė Magistro baigiamasis darbas
Magistro baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti augalų: paprastojo raudonėlio ( lot.
Origanum vulgare) ir vaistinio čiobrelio (lot. Thymus vulgaris) etanolinių ekstraktų galimybes
siloso kokybei bei higieniniams sanitariniams rodikliams pagerinti, bei nustatyti tiriamojo siloso mėginių su skirtingomis koncentracijomis citotoksinį poveikį (eksperimentas in vitro). Tiriamieji siloso mėginiai su etanoliniais ekstraktais buvo užkonservuoti laboratorijoje. Tyrimo metu visuose siloso tiriamuose mėginiuose buvo nustatytas sausųjų medžiagų (SM) kiekis procentais, pH, nustatytos toksinų: AFL B1, ZON, DON, ir T-2 mikotoksinų koncentracijos, pienarūgščių
bakterijų skaičius, bendras mikroskopinių grybų skaičius, mielių skaičius tiriamuose siloso mėginiuose bei bendras mikroorganizmų skaičius. Taip pat buvo išskirtos ir identifikuotos mikroskopuojant mikroskopinių grybų gentys. Buvo įvertintas tiriamuose siloso mėginiuose esančių mikotoksinų poveikis ląstelių linijoms BHK – 21 ir MH (eksperimentas in vitro). Tirtuose siloso mėginiuose daugiausia buvo rasta Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium
spp., Rhizopus spp., Chromelosporium spp. ir Mucor spp. mikroskopinių grybų gentys.
Stipriausias poveikis, veikiantis mikroskopinius grybus, buvo raudonėlio etanolinis ekstraktas. Iš panaudotų raudonėlio ir čiobrelio etanolinių ekstraktų tiriamuose siloso mėginiuose stipriausiu poveikiu veikiant mikotoksinus: AFL B1, ZEA, DON, ir T-2, pasižymėjo raudonėlio etanolinis
ekstraktas. Stipriausiu poveikiu nustatant ląstelių citotoksinį poveikį BHK – 21 ir MH pasižymėjo mėginys su čiobrelio etanoliniu ekstraktu. Remiantis atlikto tyrimo gautais rezultatais, galima teigti, kad paprastojo raudonėlio ir vaistinio čiobrelio etanolinius ekstraktus galima naudoti siloso kokybei ir jo higieniniams sanitariniams rodikliams gerinti, prieš tai įvertinus jų poveikį galvijų sveikatingumui.
DARBO IŠVADOS:
1. Iš panaudotų dviejų vaistinių augalų etanolinių ekstraktų, tiriamojo siloso mėginiuose, stipriausiu mikotoksinus mažinančiu poveikiu pasižymėjo RE. DON koncentraciją stipriausiai mažino RE 25, net 12,5 karto. (p>0,05). ZEA koncentraciją stipriausiai veikė (RE 50), o T-2 ir AFL B2 – CE 50.
5 2. Etanoliniai čiobrelio ir raudonėlio ekstraktai turėjo įtakos higieniniams sanitariniams
rodikliams, t.y. padidino pienarūgščių bakterijų skaičių, sumažino mikroskopinių grybų ir bendo mikroorganizmų skaičių, tačiau neturėjo poveikio mielių skaičiui:
2.1. Didžiausias pienarūgščių bakterijų skaičius (4,22 log ksv/g) nustatytas siloso mėginiuose su abiejų koncentracijų čiobrelių etanoliniais ekstraktais. (p>0,05)
2.2. Daugiausiai mikroskopinių grybų skaičius 12 proc. (p<0,05) sumažėjo silose su CE 25, o bendras mikroorganizmų skaičius 16 proc. (p<0,05) sumažėjo silose su RE 50.
3. Čiobrelio ir raudonėlio etanoliniai ekstraktai, 30 µl koncentracijos, pasižymėjo stipriausiu proliferaciją slopinančiu poveikiu. Inkstų BHK-21 linijos ląstelės pasižymėjo didžiausiu jautrumu kristalinio mikotoksino DON (10 µg/ml) poveikiui.
6
SUMMARY
The effects of mycotoxins and other hygiene parameters on health cattle status
and to identify of prophylaxis methods for improving silage quality
Deimantė Dziegoraitytė Master’s Thesis
The aim of the master's thesis was to evaluate the possibilities of the use of ethanolic extracts of plants: oregano (lot. Origanum vulgare) and thyme (lot. Thymus vulgaris) to improve the quality of silage and sanitary hygiene index also to determine the cytotoxic effects of silage samples with different concentrations (in vitro experiment). The samples of silage with ethanolic extracts were preserved in the laboratory. During the study, in the silage samples the percentage of dry matter (DM), pH, the concentration of AFL B1, ZON, DON and T-2 mycotoxins, the number of lactic acid bacteria, the total number of microscopic fungi, the number of yeasts and total number of microorganisms were measured. Tribes of microscopic fungi were also identified using microscope. The effects of mycotoxins on the BHK-21 and MH cell lines (in vitro experiment) were also evaluated in the samples of tested silage. In the studied silage samples mainly
Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Chromelosporium spp. and Mucor spp. were found. Oregano ethanolic extract had the strongest effect on microscopic fungi.
Out of used oregano and thyme ethanol extracts in the silage samples the strongest effect on mycotoxins: AFL B1, ZEA, DON, and T-2 was with oregano ethanolic extract. A thyme ethanolic extract showed the strongest effect with cytotoxicity on BHK - 21 and MH. Based on the results of the study, it can be said, that ethanolic extracts of oregano and thyme can be used to improve the quality of the silage and to improve its sanitary hygiene, after assessing their effect on bovine well-being.
DARBO IŠVADOS:
1. Iš panaudotų dviejų vaistinių augalų etanolinių ekstraktų, tiriamojo siloso mėginiuose, stipriausiu mikotoksinus mažinančiu poveikiu pasižymėjo RE. DON koncentraciją stipriausiai mažino RE 25, net 12,5 karto. (p>0,05). ZEA koncentraciją stipriausiai veikė (RE 50), o T-2 ir AFL B2 – CE 50.
7 2. Etanoliniai čiobrelio ir raudonėlio ekstraktai turėjo įtakos higieniniams sanitariniams
rodikliams, t.y. padidino pienarūgščių bakterijų skaičių, sumažino mikroskopinių grybų ir bendo mikroorganizmų skaičių, tačiau neturėjo poveikio mielių skaičiui:
2.1. Didžiausias pienarūgščių bakterijų skaičius (4,22 log ksv/g) nustatytas siloso mėginiuose su abiejų koncentracijų čiobrelių etanoliniais ekstraktais. (p>0,05)
2.2. Daugiausiai mikroskopinių grybų skaičius 12 proc. (p<0,05) sumažėjo silose su CE 25, o bendras mikroorganizmų skaičius 16 proc. (p<0,05) sumažėjo silose su RE 50.
3. Čiobrelio ir raudonėlio etanoliniai ekstraktai, 30 µl koncentracijos, pasižymėjo stipriausiu proliferaciją slopinančiu poveikiu. Inkstų BHK-21 linijos ląstelės pasižymėjo didžiausiu jautrumu kristalinio mikotoksino DON (10 µg/ml) poveikiui.
8
SANTRUMPOS
AFL B1 – aflatoksinas B1
ATCC – Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American Type Culture Collection, ATCC) BHK – 21 ląstelių linija – Sirijos žiurkėno vienos dienos amžiaus individo inkstų ląstelės (angl. baby hamster kidney fibroblasts)
BMS – bendras mikroorganizmų skaičius
CE 50 – čiobrelio etanolis ekstraktas + 50 gramų grynos raudonėlio masės CE 25 - čiobrelio etanolis ekstraktas + 50 gramų grynos raudonėlio masės DNR – deoksiribonukleorūgštis
DON – deoksinivalenolis EE – etanolinis ekstraktas g – gramai
IC50 – mėginio koncentracija, sukelianti pusės (50 proc.) ląstelių biologinių ar biocheminių
funkcijų netekimą kg – kilogramai
Ksv/g – kolonijas sudarantys vienetai grame KV – kristalvioletinis dažas
mg/kg – miligramai kilograme mg/ml – miligramai mililitre
MH-22A – pelės kepenų ląstelių linija ml – mililitrai
MTT – 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromidas ng – nanogramai
nm – nanometrai
p - patikimumo kriterijus pav – paveikslas
pH – vandenilio potencialas
ppb – milijardinė dalis (part per billion µg kg-1) ppm – milijoninė dalis (part per million mg kg-1) proc – procentai
9 PSCh – plonasluoksnė chromatografija
RE 50 – raudonėlio etanolis ekstraktas + 50 gramų grynos raudonėlio masės RE 25 - raudonėlio etanolis ekstraktas + 25 gramų grynos raudonėlio masės SM – sausosios medžiagos
spp – rūšis, įeinanti į aukštesnį taksoną T–2 – T-2 toksinas UV – ultravioletiniai spinduliai x – aritmetinis vidurkis ZON – zearalenonas µg – mikrogramai µg/kg – mikrogramai kilogramui µg/ml – mikrogramai mililitrui µg/l – mikrogramai litrui µl – mikrolitrai µm – mikrometrai
10
ĮVADAS
Šiais laikais praėjus evoliucijai labai keitėsi prijaukintų gyvulių išvaizda, šėrimas, produktyvumas. Laikui bėgant buvo kuriamos naujos, tobulėjančios produktyvumo sąlygos. Tačiau dėl netinkamo gyvulių šėrimo bei laikymo atsirado įvairių susirgimų. Gyvulių sveikatingumui didelę įtaką daro daugelis veiksnių: pašarų kokybė, mityba, laikymo sąlygos, priežiūra. (1). Pasikeitus ūkininkavimo reikalavimams, vis didesnio dėmesio sulaukia pašarų kokybės gerinimas. Šiais laikais labai suaktyvėjo mikroskopiniai grybai, kurie parazituodami ant augalų, produkuoja toksiškus gyvuliams ir žmonėms junginius – mikotoksinus. Jie sukelia mikotoksikozes ir neigiamai veikia gyvulių organizmą.
Ūkininkai ir gyvulių prižiūrėtojai privalo gerai prižiūrėti gyvulius bei reguliuoti šėrimo ir laikymo sąlygas, tik tuomet bus išvengta didelių susirgimų. Geras gyvulių sveikatingumas parodo, kad daugelio gyvūnų laikymas atitinka visas zoohigienos sąlygas, taip pat atitinka gyvūnų gerovę (2). Mikotoksinai yra toksiški, biologiškai stiprūs mikromicetų antriniai metabolitai. Daugiausia aptinkama Aspergillus, Fusarium, ir Penicillium grybų gentys. Be gyvulių sveikatingumo mikotoksinai plačiai susiję su dideliais ekonominiais nuostoliais. Mikotoksinus gaminančios rūšys dažniausiai yra labai susiję su pašarais ir grūdais lauko sąlygomis, derliaus nuėmimo metu, džiovinant, ir laikant.
Gyvulių prieskrandžio mikroflora padeda apsaugoti gyvūno organizmą nuo patogenų vystymosi atrajotojų virškinimo trakte (3). Mokslininkų pastebėjimu, eteriniai aliejai, augalų ekstraktai gali būti naujas antigrybinių medžiagų šaltinis (4). Didelė dalis eterinių aliejų veikia fungicidiškai, o didesnės jų koncentracijos veikia antibakteriškai (5).
Darbo tikslas: išanalizuoti mikotoksinų bei kitų higieninių rodiklių poveikį galvijų sveikatingumui, bei panaudoti ir įvertinti augalų etanolinius ekstraktus, kaip profilaktinę priemonę, gerinančią silosuotų pašarų kokybinius rodiklius.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti čiobrelio ir raudonėlio etanolinių ekstraktų poveikį mikotoksinų koncentracijoms silose;
2. Ištirti čiobrelio ir raudonėlio etanolinių ekstraktų poveikį siloso higieniniams sanitariniams rodikliams;
3. Nustatyti ir įvertinti etanolinių ekstraktų bei kristalinio mikotoksino (DON) poveikį
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Mikroskopinių grybų antriniai metabolitai – mikotoksinai
Mikotoksinai – tai antriniai mikroskopinių grybų metabolitai, juos išskiria mikroskopiniai grybai. Dėl mikotoksinų toksinio poveikio ir jų sinergetinių savybių įvairovės mikotoksinai laikomi rizikingais užterštų maisto produktų vartojimui. Mikotoksinų metabolizmas yra sudėtingas, jis apima bioaktyvacijos ir detoksikacijos kelią tiek žmonėms, tiek gyvūnams. Gyvūnams šie mikotoksinai veikia kancerogeniškai – tai aflatoksinai, T-2 toksinas, ohratoksinas, fumonizinai, deoksivalenolas (DON, vomitoksinas), zearalenonas. (6). Mikotoksinai gali padidinti susirgimą bandose ir sumažinti jų produkcijos efektyvumą.
Bendra kai kurių mikotoksinų įtaka yra: • Nusilpusi imuninė sistema,
• Nervų sistemos sutrikimai, drebėjimas, koordinacijos sutrikimai, • Endokrininės sistemos sutrikimas,
• Galūnių gangrena,
• Audinių ir raumenų pakitimai, • Sutrikusi medžiagų apykaita, • Sutrikęs pašaro metabolizmas,
• Reprodukciniai sutrikimai, distokija, abortas, • Nekrozės,
• Gaišimas (7). 1.1.1. Aflatoksinai
Šiai grupei priklauso: aflatoksinas B1 ir aflatoksinas B2, aflatoksinas G1 ir G2 ir aflatoksinas
M1, šis aflatoksinas dažniausiai yra randamas karvių piene, yra oksiduotas metabolitas iš
aflatoksino B1 (8). Yra žinoma, kad aflatoksinas B1 yra hepatotoksiškas, kancerogeniškas
žmonėms ir ypač gyvūnams, pasižymi imunotoksiniu veikimu, genotoksiniu ir galvijas gali nugaišti (9)
Ūmių aflatoksikozių simptomai: kepenų lipidozė, gleivinių blyškumas, letargija, ataksija, sumažėjęs odos elastingumas, susivėlęs, pasišiaušęs kailis.
Lėtinių aflatoksikozių simptomai: kepenų gelta, pablogėjusi pieno kokybė bei sumažėjęs pieno kiekis, sutrikęs apetitas. Sutrikęs augimo greitis dažniausiai būna lėtinės aflatoksikozės ir
12 kitų mikotoksikozių priežastis. Priežastis, dėl kurios aflatoksinai lėtina augimo greitį, būna susijus su pažeidimais baltymų, angliavandenių ir riebalų sintezėje (10).
1.1.2. T-2 toksinas
T-2 toksinas yra vienas toksiškiausių fuzariotoksinų ,,šeimos’’ trichotecenų grupės mikotoksinų. Šios grupės mikotoksinai gali sukelti žmonių ir gyvūnų mikotoksikozes. Patekęs su silosu į gyvulių organizmą šis toksinas labai greitai yra transformuojamas. Dėl skaidymo žarnų epitelyje susidaro šio mikotoksino metabolitai. Iš kitų mikotoksinų jie skiriasi tuo, kad pradedami skaidyti dar nepasiekę kepenų. Vėliau jis baigiamas skaidyti kepenyse ir pasišalina kartu su tulžimi bei šlapimu. T-2 toksinas slopina proteinų sintezę. (2). T-2 toksinas gali sukelti ligas: užpakalinių galūnių veiklos sutrikimus, depresiją, gastroenteritą, plonųjų žarnų hemoragijas, gaišimą, skrandžio ir prieskrandžio opaliges (10).
1.1.3. Ochratoksinas A (OTA)
Ochratoksinas A – tai pavojingiausias ohratoksinų grupės mikotoksinas. (2). Šis mikotoksinas su silosu patenka į karvių pieną. Šiam toksinui jautriausios yra kiaulės. Galvijams šie toksinai yra nepavojingi, jie yra atsparūs dėl prieskrandžių specifiškos mikrofloros veiklos (11). Lėtiniai simptomai: sumažėjęs priešsvoris, pažeidimai inkstų veikloje, kepenyse, bei šlapimo pūslėje (2).
1.1.4. Fumonizinai
Fumonizinai plačiai paplitę tarp augalų, jų yra kelios rūšys: B1, B2, B3, B4, A1, A2. Šis toksinas yra mažai toksiškas galvijams. Suaugusiems galvijams 148 ppb sukelia kepenų pažeidimą, tačiau labai lengva forma taip pat gali sukelti limfocitų blastogenezę, kepenų fermentų padidėjimą (3). Ūmus simptomas - kepenų masės mažėjimas. Lėtiniai simptomai: sumažėjęs produktyvumas. Šis mikotoksinas kaupiasi galvijų kepenyse bei inkstuose. (2)
1.1.5. Deoksivalenolas (DON)
Deoksinivalenolas yra antrinis mikotoksinas (12). Galvijai yra atsparūs šiam mikotoksinui dėl prieskrandžio mikrofloros (12). Jis gali pažeisti galvijų organus, tačiau labai nežymiai turi įtakos imuninei sistemai, ją silpnina, taip pat turi įtakos gyvulių produktyvumui. (13). Dažnai šis toksinas sukelia stiprų viduriavimą, vėmimą, hemoragiją, leukocitozę, anoreksiją, imunologinius pokyčius (14).
13 1.1.6. Zearalenonas
Zearalenonas – tai mikotoksinas, kurio didžiausios koncentracijos randamos kukurūzuose ir kviečiuose. Šis mikotoksinas yra artimas estrogenams. Pagrindinis galvijų sutrikimas atsiradus šiam mikotoksinui organizme yra stiprus reprodukcijos sutrikimas. Jo poveikis organizmui yra aktuali šių laikų problema Europoje. Zearalenono poveikis pasireiškia ūmiais bei lėtiniais simptomais. Ūmūs simptomai: viduriavimas bei abortai. Lėtiniai galvijų simptomai: dirglumas, sumažėjęs pieningumas bei sumažėjęs produktyvumas. (2)
1.2. Mikroorganizmai silosuojamuose pašaruose
1.2.1. BakterijosSiloso higieninė sanitarinė kokybė priklauso nuo didelio mikroorganizmų kiekio pačiame silose. Siloso mikroflora dalinasi į dvi atskiras grupes:
• pageidaujamas; • nepageidaujaas;
Pageidaujamas bakterijas sudaro pienarūgštės bakterijos.
Nepageidaujamas bakterijas sudaro (anaerobinės ir aerobinės). Anaerobinės bakterijos – tai klostridijos ir enterobakterijos, aerobinės – mielės, mikroskopiniai grybai ir Listeria spp. Dauguma šių organizmų ne tik mažina siloso maistinę vertę, bet ir turi įtakos gyvūno sveikatai, pieno kokybei. (15).
1.2.1.1. Pienarūgštės bakterijos
Pienarūgštės bakterijos priklauso augalinės medžiagos epifitinei mikroflorai (mikroorgnizmams) Pasėlių savybės yra tokios pačios kaip sausųjų medžiagų koncentratas. Epitinė mikroflora gali būti klasifikuojama į 3 grupes:
• Obligatines homofermentines; • Fakultatyvines heterofermentines; • Obligatines heteroermentines.
Obligatinės homofermentinės – tai Pediococcus damnosus ir Lactobacillus ruminis gaminančios 85proc. pieno rūgšties iš heksozės (tirpios gliukozės).
Fakultatyvinės heterofermentinės – Lactobacillus plantarum, L. Pentosus, Pediococcus
acidilactici, P. pentosaceus ir Enterococcus faecium, kurios taip pat gamina pieno rūgštį iš
14 Obligatinės heterofermentinės – tai L. brevis, L. buchneri ir Leuconostoc mesenteroides. (16). Jos visos fermentuoja heksozes į pieno rūgštį, acto rūgštį arba etanolį ir CO2 (7).
1.2.1.2. Klostridijos
Klostridijos yra anaerobei terpei priklausantis mikroorganizmas, formuojantis endosporas. Dėl endosporų dauginimosi sumažėja maistinė siloso vertė. Klostridijos gali būti randamos gyvulių išmatose ir taip užkrėsti pieną. Išskiriamos dvi klostridijų grupės:
• sacharolitinės (Clostridium butyricum, Cl. tyrobutyricum)
• proteolitinės (Cl. bifermentants, Cl. sporogenes, Cl. perfringens) (16).
Klostridijos galvijams yra labai pavojingos, nes jos gali sukelti daug įvairių infekcinių ligų, tokių kaip: infekcinis nekrotinis hepatitas (INH), piktybinę edemą, stabligę (Clostridium tetani) botulizmą (Clostridium botulinum) „juodą koją“, tai klostridijų sukelta liga, kurios metu pažeidžiami galinių kojų raumenys (16).
1.2.1.3. Enterobakterijos
Enterobakterijos – tai fakultatyviniai anaerobiniai organizmai. Dažniausiai silose vyrauja ne patogeninės jų padermės. Jų mikroflora silose yra nepriimtina dėl savo sacharolitinių ir proteolitinių savybių. Jos tarpusavyje veikia su pienarūgštėmis bakterijomis. Enterobakterijos angliavandenius skaido fermentais. Pirmoji fermentacija būna charakterizuojama į pieno rūgštį, acto rūgštį, gintaro rūgštį ir skruzdžių rūgštį Tokios fermentacijos metu pH yra 6,3. Enterobakterijos yra jautrios žemam pH (4,5) (7), kurį vėliau sumažina pienarūgštės bakterijos. 1.2.1.4. Mielės
Silose, kuriame yra daug mielių, atsiradusių dėl aerobinio gedimo, koncentracija yra dažnai susijusi su nesaugia gyvulių būkle. Atsiradus siloso sąveikai su oru, jame pradeda daugintis įvairios mielių rūšys, tokios kaip: Candida, Pichia, Hansenula, and Endomycopsis (17). Mielių skaičius silose gali turėti labai daug reikšmės ne tik gyvulių sveikatingumui, bet ir fermentaciniame periode, įskaitant ir galutinius produktus (18). Taip pat Candida ir Hansenula yra mielių rūšys, kurios gali metabolizuoti pieno rūgštį. Nepakankamai fermentuotuose pašaruose gali atsirasti net 25-50 milijonų mielių. (19).
1.2.2. Mikroskopiniai grybai
Mikroskopiniai grybai – tai mikotoksinų producentai. Dėl didelės mikroskopinių grybų veiklos gali susidaryti metabolitai, kurie yra toksiški žmonėms bei gyvuliams. Šiais laikais žinoma
15 apie 250 grybų rūšių, kurie gamina mikotoksinus. Pagrindiniai yra šie: Fusarium, Alternaria,
Penicillium ir Aspergillus. Tai gentys, kurios yra dažniausiai aptinkamos pašaruose (2). Norint, kad
gyvuliai būtų sveiki, yra privaloma užtikrinti aukštą siloso kokybę. Jis turi atitikti siloso higieninius sanitarinius rodiklius, būti neužterštas mikroorganizmais, tokiais kaip Clostridium botulinum,
Listeria monocytogenes ir Escherichia coli, mikroskoponiais grybais ir mikotoksinais.
Mikroorganizmai gali sukelti neigiamą poveikį galvijų sveikatai bei jų produktyvumui (20). Dėl didelio mikroorganizmų kiekio silose, nukenčia taip pat ir siloso kokybė. Norint mažinti mikroorganizmų gausumą silose privaloma laikytis pagrindinių principų – kuo greičiau sudaryti anaerobines sąlygas ir sumažinti siloso pH. Jei galvijai buvo šeriami ilgą laiką nekokybišku silosu, vėliau tai gali pasireikšti pieno ir mėsos kokybės blogėjimu (21).
1.3. Siloso higieninė sanitarinė kokybė
Silosuojami pašarai — pašarai, kurie sudaryti iš žolinių augalų, ir iš kurių gaunamas silosas. Silosas — tai anaerobinėse sąlygose fermentuoti žali augalai, kai mikroorganizmų veikloje, augaluose esantis cukrus fermentuojamas į organines rūgštis, iš kurių svarbiausia yra pieno rūgštis. Silosas gali būti gaminamas nebūtinai iš žolių, bet ir iš kitų žalių augalų, tokių kaip kukurūzų masė, varpinių ar grūdinių kultūrų masės ir kt., (22). Žoliniai pašarai yra pagrindinė mitybos dalis galvijams, o didžiausią mitybos dalį sudaro silosas, nuo kurio labai priklauso galvijų sveikatingumas ir produktyvumas. Silosas visame pasaulyje yra geriausia raciono dalis (23). Geros kokybės silosas gali sudaryti net iki 40-50 proc. sultingųjų pašarų viso karvių raciono. Galvijus patartina šerti išsaugojant jų produktyvumą daugiamečių žolių ir vienmečių ankštinių žolių silosu . (24).
1.3.1. Aerobinė fazė
Tai yra laikotarpis iškart po pašarų silosavimo. Šiai fazei būdingi tęstiniai kvėpavimo ir fermentiniai procesai žolėje, kurių svarbiausias kvėpavimas ir proteolizė. Proteolizė yra nepageidaujamas baltymo skilimo procesas, dėl kurio slopinamas rūgštėjimas ir sumažinamas siloso pasėlių utilizavimas azotu. (7)
1.3.2. Anaerobinė fazė
Tai anaerobinė fazė, fermentacija, kurioje auga ir vystosi acto rūgštį gaminančios bakterijos. Šios bakterijos fermentuoja angliavandenius ir gamina jų galutinį produktą – acto rūgštį. Kai siloso masėje sumažėja pH vertė iki 5,0 - tai reiškia, kad įvyksta acto rūgšties bakterijų augimas (25).
16 1.3.3. Stabili siloso fazė
Tai yra tokia fazė, kai pienarūgštės bakterijos sunaudoja visą cukrų silose ir tuomet silose esantis pH sumažėja iki 4,0 – 4,2. Tai yra vadinama stabili siloso fazės pradžia (26). Jei kažkokiu būdu (mechaninio pažeidimo ar kt. būdais) į siloso talpyklą patenka oro arba jis prasiskverbia pro nesandarius plyšius, visame silose, esant aerobinėms sąlygoms, gali pradėti daugėti mielių, mikroskopinių grybų ir bakterijų (27).
1.3.4. Fermentacijos fazė
Tai yra tokia fazė, kai pačiame silose vyrauja anaerobinė mikroflora (27). Fermentacijos faze laikoma teisinga, kai joje sėkmingai dauginasi pienarūgštės bakterijos (27). Pienarūgštės bakterijos yra atsparios dideliam rūgštingumui, bei žemam pH. Padidėjęs pieno rūgšties kiekis silose priklauso nuo pienarūgščių bakterijų didelės populiacijos. (27). Greitas siloso rūgštėjimas dėl bakterijų dauginimosi ir pakankamai didelė pieno rūgšties koncentracija užtikrina pH stabilumą silose (7).
1.4. Kukurūzų siloso higieninės sanitarinės kokybės gerinimas
1.4.1. Eteriniai aliejai (EO) ir jų antigrybinis poveikis kukurūzų silosuiEteriniai aliejai (EO) yra natūralūs įvairių maisto produktų ir gėrimų komponentų visuma. Eteriniai aliejai įeina į bendrą daržovių, vaisių ir mėsos sudėtį. Jie jau ilgą laiką yra naudojami maisto pramonėje, kosmetikoje ir farmacijoje kaip natūralios, aplinkai nekenksmingos medžiagos, veikiančios bakterijas, mikroorganizmus, mikotoksinus ir mieles (28) (29) (30) (31). Silose yra išskirtos biojunginių grupės. Viena iš jų yra terpenoidai, jie pasižymi antibakteriniu, antigrybiniu, ir antivėžiniu veikimu (31).
1.4.2. Eterinių aliejų antibakterinės savybės siloso gerinimui
Mokslininkai teigia, kad gramneigiamos (GRAM-) bakterijos yra atsparesnės eterinių aliejų poveikiui silose, nei gramteigiamos (GRAM+), kadangi pastarųjų bakterijų membranos komplekso struktūra yra mažesnė. Taip pat yra ištirta, kad karvakrolis yra pagrindinė sudedamoji medžiaga paprastajame Raudonėlyje (Origanum vulgare), kuri veikia stipriai antibakteriškai (32). Vertindami mažiausią slopinamąją raudonėlių bei jo sudedamųjų dalių timolio ir karvakrolio koncentraciją, mokslininkai pastebėjo, kad prieš Staphylococcus aureus ir Pseudomonas aeruginosa, šie junginiai veikia antibakteriškai stipriau kartu nei po vieną atskirai. (33). Distiliuotų frakcijų antibakterinis aktyvumas yra stipresnis, nei nepaveiktų eterinių aliejų. 1-oje lentelėje pateikta ištirtų augalų antibakteriniu poveikiu pasižyminčios medžiagos. (34)
17 1 lentelė. Antibakteriniu poveikiu pasižyminčios tirtos augalų medžiagos (34).
Augalo pavadinimas Augalo dalis Antibakteriniu poveikiu pasižyminti medžiaga Paprastasis raudonėlis
(Origanum vulgare) Visas augalas
Fenoliai (40 proc. seskviterpenai, 12,5 proc. laisvi alkoholiai, iki 5 proc. geranolio acetatas) Vaistinis čiobrelis
(Thymus vulgaris) Žiedai Timolis
1.4.3. Priešgrybinis augalinių ekstraktų poveikis kukurūzų silosui
Fitopatogeniniai grybai gali sukelti gyvuliams vietinius ar bendrus simptomus tokius kaip augimo sutrikimas arba gali daryti didelį priešgrybinį poveikį kukurūzų silosui. Aspergillus ir
Fusarium genties pavyzdžiai yra plačiai žinomi kaip fitopatogeniniai grybai, kurie yra kenksmingi
toksinų gamintojai, ir gausiai kaupiasi silose. (35). Keli in vitro atlikti tyrimai parodė stiprų antibakterinį augalų ekstraktų poveikį prieš gramteigiamas (GRAM+) ir gramneigiamas (GRAM-) bakterijas (36). Žolinių augalų šaknyse esančios fungitoksinės medžiagos atlieka apsauginę funkciją. Jos apsaugo augalus nuo pavojingų grybų susidarymo augalų stiebuose bei žieduose. Daugiau nei dvidešimt medžiagų, priklausančių izoflavanoidų grupei, buvo išimta iš Baltojo lubino šaknų. Daugelis augaluose esančių mikroelementų veikia antigrybiškai. Jie taip pat buvo išgryninti iš Persea borbonica (redbay) šaknų (36). Vieni iš visų pagrindinių augalo medžiagų - fitoaleksinai, išsiskiriantys į aplinką tuomet, kai augalą pradeda veikti patogeninis mikroorganizmas. Išsiskyrę fitoaleksinai apsaugo augalą nuo grybelio (36). Dėl savo veikimo augalų ekstraktai yra tinkamiausi vartoti grybelio naikinimui pašaruose bei yra geri biokonservantai maiste ir pašaruose. (37)
1.5. Augalai, pasižymintys antimikrobiniu veikimu
Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare) ir Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris) stipriai veikia silose esančius grybus antifungicidiškai. Jie pasižymi anktioksidantėmis ir antibakterinėmis savybėmis prieš mikroskopinius grybus, bei bakterijas. (38).
1.5.1. Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare)
Mokslininkai yra atradę, kad raudonėlis yra aprašytas lieteratūroje gana plačiai, išskirtos net 38 rūšys (39). Raudonėlis yra pirmiausia atrastas Pietų Europoje, o šiais laikais aptinkamas jau
18 visoje Europoje iki pat Skandinavijos, Centrinėje bei Šiaurės Amerikoje. Daugiausiai paplitęs rytinėje Lietuvos dalyje ir yra dažniausiai aptinkamas sausose pievose ir saulėtuose šlaituose, retuose miškuose, pamiškėse, kalvose, kalkinguose ir pakankamai derlinguose dirvožemiuose. Aptinkamas beveik visoje Lietuvoje. (40). Raudonėlio žolėje yra 0,12-1,2 proc. eterinio aliejaus, kurio 40proc. sudaro fenoliai o iš fenolių sudaro: 12,5proc, laisvi alkoholiai ir iki 5 proc. geraniolio acetatas, taip pat juose yra rauginių medžiagų, lapuose - 565, žiedynuose - 166, ir stiebuose - 58 mg% askorbino rūgšties. Paprastajame raudonėlyje yra flavonoido (apigeninas) junginio, kuris pasižymi antivėžiniu veikimu. Sėklose yra iki 28 proc. greitai džiūstančio aliejaus, kurio pagrindinę dalį sudaro fenoliai (iki 40 proc.) ir seskviterpenai (12,5 proc.) (41).
Paprastasis raudonėlis taip pat pasižymi antimikrobiniu poveikiu. Atlikti Vakarų Kentukio Universiteto mokslininkų tyrimai įrodė, kad raudonėlis stipriai fungicidiškai veikia Candida ir antibakteriškai C. neoformans bakterijas (41).
1.5.2. Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris)
Lūpažiedžių (Labiatae) šeimos daugiametis augalas, kilęs iš Viduržemio jūros vakarinių sričių, auga kalnuose. Augalo stiebas stačias arba kylantis, gausiai šakotas, sumedėjęs, 15-20 cm aukščio. Vaistinis čiobrelis gerai auga atviroje, saulėtoje vietoje ir pakankamai kalkingoje, drėgnoje puveningoje dirvoje. Dauginasi sėklomis. Sėklos būna daigingos 2-3 metus. Žolėje yra nuo 1,5 iki 2,5proc. eterinio aliejaus (pagrindiniai komponentai – timolis ir karvakrolis), taip pat yra rauginių, karčiųjų, mineralinių medžiagų, rūgščių ir saponinų, vitamino C (42). Taip pat pasižymi stipriu priešgrybiniu veikimu prieš Candida, Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, Fusarium ir Cryptococcus genties mikroorganizmus bei taip pat veikia antibakteriškai kitas bakterijas. Buvo nustatyta, kad vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris) eterinis aliejus pasižymi antibakteriniu, priešgrybiniu ir antitoksiniu veikimu (43).
1.5.3. Etanolinių ekstraktų ir eterinių aliejų poveikis galvijų organizmui
Eterinių aliejų poveikis galvijams buvo tirtas daugelį metų, siekiant pagerinti siloso higieninę sanitarinę kokybę ir ištirti, kaip jie veikia galvijų prieskrandžio bakterijas. Kadangi EO turi stiprias antimikrobines savybes, todėl jie buvo naudojami kaip pašarinis papildas, kaip priedas siloso sudėtyje. (44).
Didžiajame karvių prieskrandyje yra anaerobinė mikroflora. Eteriniai aliejai gali slopinti gaminančių bakterijų veikimą didžiajame prieskrandyje dėl to sumažėja ir amino rūgščių deamininimas (45) (46) (47). Pastebėta, kad eteriniai aliejai slopina augimą, bei kai kurių amoniaką gaminančių bakterijų dauginimąsi. Mokslininkai tirdami pastebėjo, kad didžiojo prieskrandžio
19 pirmuonys ir juos veikiantis EO ir jo (karvakrolis, timolis, p-Cimenas, ƴ-terpeninas) mišinio maži kiekiai, melžiamų karvių pašare prieskrandžio blakstienuotųjų pirmuonių antibakteriškai neveikė. (47)
1.6. Mikotoksinų poveikis organizmo ląstelėms
Mikotoksinai, patekę į gyvulių organizmą, su pašarais, sąlygoja įvairius nuostolius, iš kurių labai svarbūs yra vidaus organų funkcijos sutrikimas, sistemų pažeidimai, infekcinių susirgimų paūmėjimas. Susidarydami mikotoksinai naudoja grūduose esančias maisto medžiagas ir taip trukdo virškinamojo trakto funkcijas (48). Hidroksisteroidas yra toks steroidas, kuris dalyvauja steroidų metabolizme, jis taip pat yra naudojamas ZEA pavertimui zearalenoliu kepenyse. Šis steroidas lieka atrajotojams kaip kepenų sutrikimo priežastis, kai iš pradžių steroido pavertimas buvo atliktas skrandyje. (3). Zearalenonas tiesiogiai veikia kepenis, pažeidžia jas, didindamas aspartato (AST) ir alanino aminotransferazės ( ALT) aktyvumą bei šarminės fosfatazės (ALP) ir bilirubino lygį (49). Didelė zearalenono koncentracija gali sukelti vaginitą, sumažėjusias reprodukcines funkcijas, ryškius pieno liaukos patikitimus telyčioms (3). Taip pat ZEA gali sukelti estrogeninius susirgimus pieniniams galvijams, didelėmis dozėmis gali sukelti net abortus. (50).
20
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimų objektai
Magistrinis Tiriamasis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Gyvūnų gerovės tyrimų laboratorijoje.
Tyrimai atlikti 2015 – 2017 metais. Jų metu buvo nustatyta vaistinių augalų, t.y. paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) ir vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris) etanolinių ekstraktų panaudojimo galimybės siloso higieninei kokybei pagerinti. Taip pat mikotoksino DON poveikis ir augalinių etanolinių ekstraktų poveikis galvijų sveikatingumui in vitro, panaudojant ląstelių linijas.
1 pav. Tyrimo schema
Siloso gamyba su etanoliniais ekstraktais laboratorijoje
In vitro
Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų nustatymas Bendro mikroorganizmų skaičiaus nustatymas Mikotoksinų koncentracijų nustatymas Eksperimentas in vitro: Nustatytas mikotoksino DON poveikis bei etanolinių ekstraktų poveikis BHK – 21(inkstų) ir MH ląstelių (kepenų) linijoms. Etanolinių ekstraktų ruošimas Pienarūgščių bakterijų skaičiaus nustatymas Mielių skaičiaus nustatymas
21
2.2. Žaliavų ir iš jų gamintų silosuotų pašarų
higieninių rodiklių nustatymas
Bendro mikroorganizmų skaičiaus nustatymas. Bendras mikroorganizmų skaičius (toliau BMS) smulkinta kukurūzų žaliava prieš silosavimą (n = 2) ir kukurūzų silosas (n = 10) buvo nustatytas vadovaujantis Bendro mikroorganizmų skaičiavimo metodo pagalba. 1 dalis. Kolonijų skaičiavimas 30 °C temperatūroje, taikant užpylimo būdą lėkštelėse (ISO 4833-1:2013).
Bendro mezofilinių pieno rūgšties (pienarūgščių) bakterijų kolonijų vienetų skaičiaus nustatymas. Nustatyta smulkinta kukurūzų žaliava prieš silosavimą (n = 2) ir kukurūzų silosas (n = 10) pagal ISO 15214:2009 pašarų ir maisto mikrobiologiją. Apskaičiuotas bendras mezofilinių pieno rūgšties bakterijų kiekis pagal skaičiavimo metodą. Kolonijų skaičiavimo 35 °C temperatūroje. Naudota MRS agaro terpė (MRS/agar with Tween 80, Biolife, Italija). 10 g siloso ar kukurūzų siloso žaliavos mėginio sumaišyta su 90 ml fiziologiniu tirpalo (0,9 proc.). Iš gautos suspensijos yra paruošti nuo 10-2 iki 10-8 skiediniai, kurie yra pasėti į Petri lėkšteles su MRS agaru. Lėkštelės su mėginiais 72 val. buvo laikytos 35 °C temperatūroje anaerobinėmis sąlygomis. Apskaičiuotos katalazei neigiamos bakterijų kultūros.
Mikroskopinių grybų ir mielių išskyrimas bei identifikavimas. Mikroskopinių grybų išskyrimui (kukurūzų žaliava (n = 2), silosas (n = 10) buvo naudojamos agarizuotos Sabourand Dextrose Agar (OXOID, UK) (SA) su chloramfenikoliu (50mg/ml). Žaliavoje ir silosuotame pašare mikroskopinių grybų, sudarančių kolonijas, skaičius (ksv/g) nustatytas vadovaujantis Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis mielių ir pelėsinių grybų skaičiavimo metodas. 1 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas produktuose, kurių vandens aktyvumas didesnis kaip (tapatus ISO 21527-1:2008).
Mielių (kukurūzų žaliava (n = 2), silosas (n = 10) kiekybiniam užterštumui nustatyti naudota SA su chloramfenikoliu (50mg/ml)
Sausųjų medžiagų kiekis nustatytas (smulkinta kukurūzų žaliava prieš silosavimą (n = 2), kukurūzų silosas (n = 10)) svorio metodu.
pH rodiklis. (smulkinta kukurūzų žaliava prieš silosavimą (n = 2), kukurūzų silosas (n = 10) buvo nustatytas elektrometriniu metodu, naudojant WTW®inoLab pH 720 (Vokietija) prietaisą (9).
22
2.3. Augalinių ekstraktų, kaip profilaktinių priemonių,
panaudojimas siloso higieninei kokybei pagerinti
Bandymai atlikti laboratorinėmis sąlygomis.Tyrimams naudota: Čiobrelio žolė (Thymi herba) ir Raudonėlio žolė (Origani herba) (kilmės šalis Lietuva, gamintojas „Švenčionių vaistažolės“).
Augalinių ekstraktų gamyba skirtingo poliškumo tirpalais. Ekstraktai buvo pagaminti maceracijos būdu, naudojant etanolinį tirpiklį pagal Handa ir kt, bei Tayel ir kt. metodikas. Sudžiovinti augalai buvo susmulkinti, po 25,0 g ir 50,0 g smulkintos augalų masės buvo sumaišyta su 200,0 ml ir 70 proc. maistiniu etilo alkoholiu, taip pat buvo uždengta ir palikta 24 val. kambario temperatūroje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Po 24 val. perfiltruota per Whatman Nr.1 filtrą. Pagamintas ekstraktas buvo iškart įterpas į silosuojamą kukurūzų žaliavą.
Tyrimams kaip žaliava buvo pasirinktas kukurūzas. Nupjauta ir susmulkinta masė buvo gerai ir atidžiai išmaišyta, suslėgta ir silosuota 3 litrų mini-siloso talpose, pasirinkus tokį santykį: 20 ml augalų ekstraktų – 1 kg žaliavos (kiekvienam ekstraktui atskirai).
Augalų ekstraktų paruošimas:
R-EE-50 – 20,0 ml raudonėlio etanolinis ekstraktas (50 g raudonėlio ir 200,0 ml 70,0 proc. maistinio etilo alkoholio);
R-EE-25 – 20,0 ml raudonėlio etanolinis ekstraktas (25 g raudonėlio ir 200,0 ml 70,0 proc. maistinio etilo alkoholio);
C-EE-50 – 20,0 ml čiobrelio etanolinis ekstraktas (50 g čiobrelio ir 200,0 ml 70,0 proc. maistinio etilo alkoholio);
C-EE-25 – 20,0 ml čiobrelio etanolinis ekstraktas (25 g čiobrelio ir 200,0 ml 70,0 proc. maistinio etilo alkoholio);
Taip pat tokiu pat principu buvo pagamintas ir kontrolinis silosas (K), nieko neįterpiant. Kiekvienam ekstraktui ir kontrolei buvo pagaminta po 2 mini-siloso talpas. Siloso talpos buvo hermetiškai uždarytos ir laikomos +20 °C temperatūroje 90 dienų imtinai. Silosavimo metodika buvo atlikta laboratorinėmis sąlygomis, taip pat atlikta remiantis pakoreguotomis Tayel ir kt., Jatkauskas ir kt. metodikomis.
Atidarius siloso talpas, buvo paimti siloso mėginiai (n = 10) cheminei analizei, fermentacijos parametrams, mikrobiologinei būklei ir mikotoksinų koncentracijoms nustatyti pagal 2.2–2.5 skyriuose pateiktas metodikas.
23
2.4. Kristalinio mikotoksino DON ir etanolinių ekstraktų ląstelių proliferacijai
įvertinimas in vitro
Kristalinio mikotoksino DON, (SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH, Vokietija) poveikio ląstelių proliferacijai įvertinti pasirinktos organų taikinių ląstelių linijos: BHL-21, MH-22A.
Ląstelių linijos: BHK-21 pelių inkstų linija – Sirijos žiurkėno, vienos dienos amžiaus individo inkstų ląstelės (baby hamster kidney fibroblasts), MH-22A (pelės hepatomos ląstelių linija). Ląstelės gautos iš VU Biochemijos instituto.
Ląstelės buvo augintos DMEM (su L-gliutaminu, be natrio piruvato, gliukozė 4,5 g/l, BIOWEST SAS, Prancūzija) terpėje (Sigma-Aldrich, Vokietija), su 10 proc. FVS (fetalinis veršelio serumas) (Sigma-Aldrich, Vokietija) ir 1 proc. antibiotikų (10000 vnt./ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino) (Sigma-Aldrich, Vokietija), specialiuose 75 cm3 tūrio ląstelių auginimo induose, (TPP, Švedija), termostate su 5 proc. CO2 koncentracija, 98 proc. santykiniu drėgniu, 37 °C temperatūroje.
Ląstelių linijos augintos monosluoksniu, persėjant kas 3-4 dienas. Atliktas kristalinio mikotoksino DON ląstelių proliferacijai įvertinimas. Šis mikotoksinas atskiestas DMSO, o skiedimas iki reikiamos koncentracijos – ląstelių augimo terpėse. Atliktas etanolinių ekstraktų (čiobrelio ir raudonėlio) skirtingomis koncentracijomis ląstelių proliferacijai įvertinimas. Atliktas DON + etanolinis ekstraktas (skirtingomis kocentracijomis) ląstelių proliferacijai įvertinimas.
Testavimas. Ląstelių suspensijos augimo fazėje išpilstytos į 96 šulinėlių plokšteles.
Į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilta 100 µl ląstelių suspensijos su joms tinkančia augimo terpe. Po 24 val. ląstelėms pradėjus daugintis, mitybinė terpė pakeičiama nauja terpe su skirtingomis koncentracijomis augalų ekstraktų ir DON toksino koncentracija. Plokštelės su ląstelių linija bei tiriamaisiais mėginiais laikytos termostate su 5 proc. CO2 koncentracija, 98 proc. santykiniu drėgniu, 37 °C temperatūroje, 24 val.
Ląstelių proliferacijos nustatymas. Ląstelių proliferacija nustatyta MTT metodo pagalba, panaudojus 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidą (Sigma, Vokietija). Ląstelės paveikiamos MTT, kuris yra nuo NADPH priklausomos oksidoreduktazės substratas. Susidariusio netirpaus metabolito (formazano) kristalų kiekis, yra tiesiogiai proporcingas gyvų ląstelių skaičiui. Po 24 val. nupylus nuo ląstelių terpę, į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilta po 20 µl 0,5 mg/ml MTT fosfatiniame buferyje esančio tirpalo. Iš viso inkubuota 3 val. 37 °C temperatūroje. Po to į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilta po 100 µl 96° etanolio ir išmaišoma pipetuojant - pipetės pagalba. Ląstelių mitochondrijose yra dehidrogenazės fermentas, kuris MTT dažą redukuoja į formazaną, kuris yra spalvotas ir ištirpinamas. Ląstelių proliferacija buvo nustatyta išmatuojant
24 tirpalo optinį tankį, esant bangos ilgiui – 540 nm ir 580 nm, spektrofotometru Multiskan MS (Suomija).
2.5. Statistinis duomenų įvertinimas
Tyrimų duomenys apdoroti „IBM SPSS Statistic 22.0“ statistiniu duomenų paketu ir „Microsoft Excel 2010“ programa. Buvo apskaičiuoti duomenų aritmetiniai vidurkiai (Xv), vidurkių paklaidos (SE), santykinis standartinis nuokrypis (SSN). Taip pat ryšiui tarp kintamųjų rodiklių įvertinti buvo skaičiuotas Pirsono koreliacijos koeficientas (r). Taip pat skirtumui tarp grupių patikimumo kriterijui (p) nustatyti buvo taikytas Stjudento daugybinio palyginimo metodas. Skirtumai laikyti statistiškai reikšmingi, kai p < 0,05.
25
3. TYRIMO REZULTATAI
Pirmuoju tyrimų etapu buvo nustatyta ir įvertinta vaistinių augalų: paprastojo čiobrelio (Thymus vulgaris) ir paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) etanolinių ekstraktų panaudojimo galimybės, užtikrinant ir pagerinant silosuojamų pašarų higieninę kokybę. Tyrimo metu iš viso buvo tirta 10 siloso mėginių. kuriuose buvo įterpta (įmaišyta) vaistinių augalų paprastojo čiobrelio (Thymus vulgaris) ir paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) skirtingų koncentracijų etanoliniai ekstraktai, gauti duomenys palyginti tarpusavyje ir su kontrolės mėginiais.
3.1. Kukurūzų žaliavos po fermentacijos higieninė kokybė
Atliekant tyrimą buvo nustatytas sausųjų medžiagų kiekis procentais ir siloso pH. Ištiriant siloso mėginius sausųjų medžiagų kiekis svyravo nuo 46 proc. iki 56 proc. Mažiausias ištirtų siloso mėginių sausųjų medžiagų kiekis – 46,91 proc., o didžiausias – 56,79 proc.
Tyrimo metu buvo nustatytas ir įvertintas, 90 dienų po siloso sudėjimo, mikrobiologiniai siloso rodikliai bei mikotoksinų kncentracija tiriamajame silose.
Tirtuose skirtinguose siloso mėginiuose mažiausias pH rodiklis buvo nustatytas – 3,72, o didžiausias pH rodiklis–– 4,13.
3.1.1. Mikotoksinų koncentracija silose
Nustatytos mikotoksinų AFL B1, ZEA, DON koncentracijos siloso mėginiuose 90 d. po
fermentacijos su paprastojo čiobrelio (Thymus vulgaris) ir paprastojo raudonėlio (Origanum
vulgare) etanoliniais ekstraktais ir palyginta su kontrole.
2 pav. Zearalenono koncentracija silose
165± 35 385± 85 380± 80 335± 165 435±35 0 100 200 300 400 500 600 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
(µ g/ kg ) Zearalenonas
26 Didžiausia mikotoksino ZEA koncentracija buvo nustatyta kontroliniame siloso mėginyje, t.y. 435±35 µg/kg. Mėginiai su etanoliniais čiobrelio ir raudonėlio ekstraktais (2 pav.) buvo mažesnės koncentracijos ir svyravo nuo 165±35 iki 385±85 µg/kg.
Labiausiai ZEA koncentracija sumažėjo siloso mėginyje (RE 50), lyginant su kontrole, net 2,6 karto. (p<0,05). Silpniausiai ZEA veikė (RE 25) ekstraktas t.y. apie 20 proc. (p>0,05)
3 pav. Aflatoksino B1 koncentracija silose
Didžiausia mikotoksino Aflatoksino B1 koncentracija buvo nustatyta kontroliniame siloso
mėginyje t.y. 5±2 µg/kg. Mėginiai su kitais raudonėlio ir čiobrelio etanoliniais ekstraktais (3 pav.) buvo mažesnės koncentracijos ir svyravo nuo 0,7±0,07 iki 4±1,4 µg/kg.
Labiausiai AFL B1 koncentracija sumažėjo siloso mėginyje su (CE 50) ekstraktu, lyginant su
kontrole net 7,14 karto (p<0,05). Silpniausiai AFL B1 veikė siloso mėginyje su (RE 50) ekstraktu
apie 30 proc. (p>0,05)
4 pav. Deoksinivalenolio koncentracija silose
5± 2 4± 1,4 0.7± 0,07 1.7± 1 5± 2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
(µ g/kg ) AflatoksinasB1 240± 90 34± 10 250± 1 400± 50 425± 75 0 100 200 300 400 500 600 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
(µ
g/kg)
27 Didžiausia mikotoksino DONkoncentracija buvo nustatyta kontroliniame siloso mėginyje t.y. 425±75 µg/kg. Mėginiai su kitais raudonėlio ir čiobrelio etanoliniais ekstraktais (4 pav.) buvo mažesnės koncentracijos ir svyravo nuo 34±10 iki 400±50 µg/kg.
Labiausiai DON koncentracija sumažėjo siloso mėginyje su (RE 25) ekstraktu, lyginant su kontrole net 12,5 karto (p>0,05). Silpniausiai DON koncentracijąveikė siloso mėginyje su (CE 25) apie 3 proc. (p>0,05)
5 pav. T-2 koncentracija silose
Didžiausia mikotoksino T-2koncentracija buvo nustatyta kontroliniame siloso mėginyje t.y. 230±30 µg/kg. Mėginiai su kitais raudonėlio ir čiobrelio etanoliniais ekstraktais (5 pav.) buvo mažesnės koncentracijos ir svyravo nuo 50±17 iki 100±50 µg/kg.
Labiausiai T-2 koncentracija sumažėjo siloso mėginyje su (CE 25) ekstraktu, lyginant su kontrole net 4,6 kartus (p>0,05). Silpniausiai T-2 koncentracijąveikė siloso mėginyje su (RE 50) ekstraktu apie 2 proc. (p>0,05)
3.1.2. Mikrobiologiniai siloso rodikliai
6 pav. Pienarūgščių bakterijų skaičius silose
100± 50 75± 11 50± 50 50± 17 230± 30 0 50 100 150 200 250 300 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
(µ g/ kg )
T-2 4.14± 0,04 4.11± 0,1 4.22± 0,03 4.2± 0,09 4.12± 0,22 4 4.05 4.1 4.15 4.2 4.25 4.3 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
lo
g
ks
v/
g
28 Didžiausias pienarūgščių bakterijų skaičius nustatytas siloso mėginiuose su čiobrelio ekstraktu (CE 50) 4,22 log ksv/g. Tai yra 1,02 karto nustatytas didesnis pienarūgščių bakterijų skaičius, nei sioloso mėginyje (CE 25) ,(p>0,05). Įterpus raudonėlio skirtingomis koncentracijomis etanolinius ekstraktus į silosuojamą masę (RE 50) ir (RE 25) tarp jų nustatytas labai mažas skirtumas ir tai rodo, kad (RE 50) padidino pienarūgščių bakterijų skaičių, nei (RE 25) tik 0,73 proc. (p>0,05)
Lyginant su kontrole čiobrelio ekstraktą, siloso (CE 50) mėginyje nustatyta, 2,42 proc. (p>0,05) didesnis pienarūgščių bakterijų skaičius nei kontroliniame mėginyje.
7 pav. Mikroskopinių grybų skaičius silose
Didžiausias mikroskopinių grybų skaičius nustatytas siloso kontrolės mėginiuose t.y. 12 proc daugiau nei siloso mėginyje (CE 25) (p>0,05) ir tai rodo, kad čiobrelio etanolis ekstraktas yra efektyvus mikroskopinių grybų veikimui silose.
Mažiausia mikroskopinių grybų koncentracija buvo nustatyta siloso mėginyje su (CE 25) ekstraktu, lyginant su kontrole 1,13 karto (p<0,05). Mėginiuose su augaliniais ekstraktais, didžiausias mikroskopinių grybų skaičius nustatytas siloso mėginyje (RE 25) t.y. 5,88 proc. daugiau nei (CE 25) siloso mėginyje.
3.94± 0,06 4± 0,01 3.94± 0,04 3.74± 0,26 4.25± 0,18 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ l og ks v/ g
29
8 pav. Mielių skaičius silose
Didžiausias mielių skaičius nustatytas siloso mėginiuose su raudonėlio ekstraktu (RE 25) t.y. daugiau 17 proc. nei mėginiuose (RE 50) (p>0,05). Įterpus čiobrelio skirtingomis koncentracijomis etanolinius ekstraktus į silosuojamą masę nustatytas poveikio skirtumas mielių skaičiui tik 0,96 proc. (p>0,05).
Nustatytas mažiausias mielių skaičius siloso mėginyje su raudonėliu (RE 50) tačiau tai yra 1,68 karto (p>0,05) daugiau nei kontrolės mėginyje.
9 pav. Bendras mikroorganizmų skaičius silose
Didžiausias bendras mikroorganizmų skaičius buvo nustatytas kontrolės siloso mėginiuose. Siloso mėginiuose su augaliniais etanoliniais ekstraktais, didžiausias bendras mikroorganizmų skaičius nustatytas siloso mėginyje (RE 25), tačiau t.y. 1,09 karto (p>0,05) karto mažiau nei kontrolės mėginyje. Mažiausias BMS nustatytas (RE 50) mėginyje, lyginant su kontrole net 1,19 karto (p<0,05). 3.47± 0,07 4.19±0,13 4.13± 0,22 4.09± 0,22 2.06±0,2 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
lo g ks v/ g Mielės 4.4± 0,09 4.78± 0,18 4.74± 0,04 4.62± 0,02 5.24±0,16 0 1 2 3 4 5 6 Raudonėlio etanolinis
ekstraktas 50 Raudonėlio etanolinis ekstraktas 25 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 50 Čiobrelio etanolinis ekstraktas 25 KONTROLĖ
lo
g
ks
v/
g
30
3.2. Mikotoksino DON ir etanolinių ekstraktų ląstelių proliferacijai poveikis in
vitro
Antrajame tyrimų etape buvo nustatyta ir įvertinta mikotoksino DON bei etanolinių ekstraktų poveikio ląstelių proliferacijai in vitro. Šiam tyrimui buvo pasirinktos dvi ląstelių linijos BHK - 21 pelių inkstų linija – Sirijos žiurkėno, vienos dienos amžiaus individo inkstų ląstelės (baby hamster kidney fibroblasts), ir MH - 22A (pelės hepatomos ląstelių linija)
10 pav. MH – 22A ląstelės, paveiktos čiobrelio etanolionio ekstrakto skirtingomis koncentracijomis ir DON
Nustatyta, kad paveikus MH – 22A ląstelių liniją kristaliniu DON (10 µg/ml) MH ląstelių proliferacija sumažėjo 20 proc.
Čiobrelio etanolinis ekstraktas, 30 µl koncentracijos, pasižymėjo didžiausiu poveikiu MH – 22A lastelių proliferacijai t.y. ją sumažindamas 20 proc., lyginant su CS 20 µl ir CS 10 µl koncentracijomis (p>0,05).
Paveikus ląsteles čiobrelių etanolinių ekstraktų skirtingomis koncentracijomis + DON - nustatytas didžiausias poveikis proliferacijai paveikus jas CS 30 µl + DON (10 µg/ml). Lyginat su kontrole ląstelių proliferacija sumažėjo 35 proc. (p>0,05).
0 20 40 60 80 100 120 140 CS 30,00 µl CS 30 µl + DON (10 µg/ml) S.K. CS 20 µl CS 20 µl + DON (10 µg/ml) S.K. CS 10 CS 10 µl + DON (10µg/ml) S.K. DON (10µg/ml) K ląste lių gyv ybing um as (pr oc .)
MH - 22A ląstelės
31
11 pav. BHK – 21 ląstelės, paveiktos čiobrelio etanolinio ekstrakto skirtingomis koncentracijomis ir DON.
Nustatyta, kad paveikus BHK - 21 ląstelių liniją kristaliniu DON (10 µg/ml) ląstelių proliferacija sumažėjo apie 30 proc.
Čiobrelio etanolinis ekstraktas, 30 µl koncentracijos, turėjo nedidelį slopinantį poveikį BHK - 21 lastelių proliferacijai, lyginant su CS 10 µl 15 proc. mažiau (p<0,05)
Paveikus ląsteles etanolinių ekstraktų skirtingomis koncentracijomis + DON nustatytas didžiausias poveikis slopinantis proliferaciją paveikus jas CS 30 µl + DON (10 µg/ml) t.y. sumažėjo 35 proc. (p>0,05).
12 pav. BHK – 21 ląstelės, paveiktos raudonėlio etanolinio ekstrakto skirtingomis koncentracijomis ir DON.
Nustatyta, kad paveikus BHK - 21 ląstelių liniją kristaliniu DON (10 µg/ml) ląstelių proliferacija sumažėjo 42,26 proc.
Raudonėlio etanolinis ekstraktas, 30 µl koncentracijos, lastelių proliferaciją sumažino 17 proc. (p<0,05). 0 20 40 60 80 100 120 CS 30 µl CS 30 µl + DON (10 µg/ml) S.K. CS 20 µl CS 20 µl + DON (10 µg/ml) S.K. CS 10 µl CS 10 µl + DON (10 µg/ml) S.K. DON (10µg/ml ) K ląste lių gyv ybing um as (pr oc .)
BHK - 21 lastelės
0 20 40 60 80 100 120 RS 30 µl RS 30 µl + DON (10 µg/ml) S. K. RS 20 µl RS 20 µl + DON (10 µg/ml) S.K. RS 10 µl RS 10 µl + DON (10µg/ml) S. K. DON (10µg/ml) K ląste lių gyv ybing um as (pr oc .)BHK - 21 ląstelės
32 Paveikus ląsteles etanolinių ekstraktų skirtingomis koncentracijomis + DON nustatytas didžiausias poveikis proliferacijai paveikus jas RS 30 µl + DON (10 µg/ml) t.y. ląstelių proliferacija sumažėjo 33,57 proc. (p>0,05).
13 pav. MH – 22A ląstelės, paveiktos raudonėlio etanolinio ekstrakto skirtingomis koncentracijomis ir DON
Nenustatytas proliferaciją slopinantis poveikis mikotoksino DON tirtai ląstelių linijai.
Raudonėlio etanolinis ekstraktas, 30 µl koncentracijos, pasižymėjo didžiausiu slopinančiu poveikiu MH – 22A lastelių proliferacijai t.y. ją sumažindamas 9 proc. (p>0,05).
Paveikus ląsteles etanolinių ekstraktų skirtingomis koncentracijomis + DON nustatytas didžiausias poveikis proliferacijai paveikus jas RS 30 µl + DON (10 µg/ml). Lyginat su kontrole t.y. 12,27 proc. mažesnė proliferacija (p>0,05).
0 20 40 60 80 100 120 RS 30 µl RS 30 µl + DON (10 µg/ml) S. K. RS 20 µl RS 20 µl + DON (10 µg/ml) S.K. RS 10 µl RS 10 µl + DON (10µg/ml) S. K. DON (10µg/ml) K ląste lių gyv ybing um as (pr oc .)
MH - 22A ląstelės
33
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Tiek Lietuvoje, tiek visame pasaulyje siloso užkrėtimas mikotoksinais stipriai paplitęs ir yra didėjanti problema iki šiol. Šis siloso užkrėstumas gyvulių augintojams sukelia didelius ekonominius bei finansinius nuostolius, taip pat sukelia nemažai susirgimų, ligų galvijų tarpe.
Mikotoksinai yra mikroskopinių grybų antriniai metabolitai, kurie yra stipriai toksiški galvijų sveikatingumui, mikotoksinų sukeltos ligos galvijams – mikotoksikozės. Remdamasi atliktu tyrimu buvo nustatyta, kad tirtuose siloso mėginiuose daugiausiai buvo rasta mikroskopinių grybų:
Aspergillus spp., Penicillum spp. ir Fusarium spp., genčių. Taip pat tuose pačiuose mėginiuose
buvo nustatyta šių genčių mikromicetai: Mucor spp., Cladosporium spp., Rhizopus spp. bei
Acremoniella spp. Remiantis nagrinėtos literatūros duomenimis, išsiaiškinta, kad daugiausiai
mikotoksinų išskiria Aspergillus spp., Penicillum spp., ir Fusarium spp. genčių mikroskopiniai grybai. (35). Iki šių dienų yra ištirta ir nagrinėta daugiau nei 300 rūšių mikotoksinų, bet populiariausi bei svarbiausi iš jų, kurie ir buvo aprašyti, tai – aflatoksinai, ochratoksinai, deoksinivalenolis, zearalenonas, fumonizinai ir T-2 toksinas.
Mokslininkų teigimu, atlikus tam tikrus tyrimus teigta, kad mikotoksinai pasižymi kancerogeniniu, teratogeniniu, mutageniniu, neurotoksiniu bei imunotoksiniu poveikiu galvijams (6). Galvijams didelį poveikų turi mikotoksinų kiekis, jis gali sumažinti galvijų produktyvumą, susilpninti imuninę sistemą, paveikti nervų sistemą, sukelti žalingą poveikį kepenims, inkstams, turėti didelę įtaką virškinimo trakto ligų atsiradimui bei pakenkti reprodukcijos organams (51).
Atliktame tyrime buvo nustatytos zearalenono, aflatoksino B1, deoksinivalenolio, T-2
mikotoksinų koncentracijos tirtuose siloso mėginiuose. Atliktuose mėginiuose ZEA koncentracija siekė nuo 165 (µg/kg) iki 435 (µg/kg), AFL B1 – nuo 0,7 (µg/kg) iki 5 (µg/kg), DON – nuo 34
(µg/kg) iki 425 (µg/kg), mikotoksino T-2 – nuo 50 (µg/kg) iki 230 (µg/kg). Tyrimo metu taip pat buvo atlikta pienarūgščių bakterijų, mikroskopinių grybų skaičiaus, mielių, bendro mikroorganizmų skaičiaus koncentracijos ištirtuose siloso mėginiuose. Pienarūgščių bakterijų skaičiaus koncentracija siekė nuo 4,11 x 103 (ksv/g) iki 4,22 x 103 (ksv/g), mikroskopinių grybų – nuo 3,74 x103 (ksv/g) iki 4,25 x103 (ksv/g), mielių – nuo 2,06 x 103 (ksv/g) iki 4,19 x103 (ksv/g), bendro mikroorganizmų skaičiaus – nuo 4,4 x 103 (ksv/g) iki 5,24 x 103 (ksv/g).
Nuo senų laikų iki dabar mokslininkai vis ieško būdų, aktyvių medžiagų, kaip sumažinti mikotoksinų kiekį gyvulių silose, pagerinti pašarų kokybę, užtikrinti higieninius sanitarinius rodiklius. Įvairios medžiagos, jų sudedamieji elementai, vaistinių augalų aliejai pasižymi biocidiniu, antigrybiniu poveikiu prieš daugelį bakterijų, mikroskopinių grybų, pirmuonių, pelėsių, virusų dauginimuisi (52). Nuo fenolinių junginių kiekio priklauso pašaro kokybė – tai yra aromatingumas,
34 maistingumas, antimikrobinis aktyvumas, taip pat vaistinių augalų vertė (53). Čiobrelio sudėtyje yra daugiau nei 60 medžiagų, kurios puikiai veikia antibakteriškai, taip pat kaip antioksidantas. Stipriausiai bei veiksmingiausiai pasižymi čiobrelio eteriniame aliejuje esančios medžiagos – timolis (44 – 60 proc.), bei karkvamolis (2,2 – 4,2 proc.) Taip pat timolis ir karkvamolis yra vieni iš pagrindinių fenolių raudonėlio sudėtyje, kurie sudaro 78-85 proc. raudonėlio eterinių aliejų ir yra atsakingi už raudonėlio antimikrobinį poveikį. (54). Remdamiesi įvairiais moksliniais straipsniais, literatūra, nutarėme atlikti bandymą su čiobrelio ir raudonėlio etanoliniais ekstraktais, kuriuos įterpėme į augalų žaliąją masę prieš silosavimą. Mūsų atliktame tyrime didžiausi mikotoksinų kiekiai pašaruose buvo deoksinivalenolio ir zearalenono. Įvairių mokslininkų teigimu, aflatoksinai nėra didžiausia problema tarp mikotoksinų kaupimosi pašaruose. Vis dažniau daugiausiai pašaruose kaupiasi deoksinivalenolis, zearalenonas bei ochratoksinas A. Jų galima rasti netgi įvairių pašarų sudedamose dalyse. Jie sukelia ne tik daugelį jau išvardintų susirgimų galvijų tarpe, bet gali kauptis ir piene, kiaušiniuose bei sukelti dauguma ligų žmonių tarpe (55).
Lyginant gautų tyrimų rezultatus su mokslininkų literatūra, buvo nustatyta, kad čiobrelio ir raudonėlio etanoliniai ekstraktai panaudoti silosavimo metu veikė priešgrybiškai ir antimikrobiškai. Stipriausiu poveikiu pasireiškė čiobrelio ir raudonėlio etanoliniai ekstraktai. Mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis buvo nustatyta, kad raudonėlis, čiobrelis, cinamonas ir citrinžolė turi stiprų poveikį prieš kai kuriuos plataus veikimo spektro mikroorganizmus, mikotoksinus, kurie sukelia produktų gedimą, bei per maistą plintančius ligos sukėlėjus (56).
Atliktas tyrimas bandant įvertinti silose aptinkamų mikroskopinių grybų išskiriamų mikotoksinų poveikį BHK – 21 ląstelių linijai bei MH ląstelių linijai buvo ištirti siloso mėginiai. Citotoksinis siloso mėginių poveikis tyrime buvo įvertintas IC50 didžiausiu mėginio kiekiu, kuris
sukėlė ląstelių žūtį. IC50 teigiamas tyrime yra teisingas tuomet, kai ląstelių žūtis yra didesnė nei 50
proc.
Iš ištirtų siloso mėginių citotoksinį poveikį ląstelių gyvybingumui (BHK – 21 ląstelių linijai) sukėlė šie 3 siloso mėginiai:, taip pat čiobrelio SE su 10µl DON, bei čiobrelio SE 20µl su 10µl DON. Mažiausias IC50 – buvo čiobrelio RE su 10µl DON.
Didelės mikotoksinų koncentracijos pašaruose gali paveikti tiesiogiai galvijų organizmą, pažeidžiant įvairius galvijų organus ir audinius, tokius kaip kepenis, inkstus, nervų sistemą, koordinacijos sistemą bei burnos ir skrandžio gleivinę, pažeisti reprodukcijos organus.
35
IŠVADOS
1. Iš panaudotų dviejų vaistinių augalų etanolinių ekstraktų, tiriamojo siloso mėginiuose, stipriausiu mikotoksinus mažinančiu poveikiu pasižymėjo RE. DON koncentraciją stipriausiai mažino RE 25, net 12,5 karto. (p>0,05). ZEA koncentraciją stipriausiai veikė (RE 50), o T-2 ir AFL B2 – CE 50.
2. Etanoliniai čiobrelio ir raudonėlio ekstraktai turėjo įtakos higieniniams sanitariniams rodikliams, t.y. padidino pienarūgščių bakterijų skaičių, sumažino mikroskopinių grybų ir bendo mikroorganizmų skaičių, tačiau neturėjo poveikio mielių skaičiui:
2.1. Didžiausias pienarūgščių bakterijų skaičius (4,22 log ksv/g) nustatytas siloso mėginiuose su abiejų koncentracijų čiobrelių etanoliniais ekstraktais. (p>0,05) 2.2. Daugiausiai mikroskopinių grybų skaičius 12 proc. (p<0,05) sumažėjo silose su CE
25, o bendras mikroorganizmų skaičius 16 proc. (p<0,05) sumažėjo silose su RE 50. 3. Čiobrelio ir raudonėlio etanoliniai ekstraktai, 30 µl koncentracijos, pasižymėjo stipriausiu proliferaciją slopinančiu poveikiu. Inkstų BHK-21 linijos ląstelės pasižymėjo didžiausiu jautrumu kristalinio mikotoksino DON (10 µg/ml) poveikiui.
36
REKOMENDACIJOS
Norint pagerinti higieninę sanitarinę siloso kokybę, po atliktų tyrimų rekomenduojama naudoti vaistinių augalų: paprastojo čiobrelio (Thymus vulgaris) ir paprastojo raudonėlio (Origanum
vulgare) etanolinius ekstraktus, kurie atlikto tyrimo metu stipriai paveikė mikotoksinų dauginimąsi
silose bei sumažino bakterijų ir mikroskopinių grybų dauginimąsi siloso mėginiuose. Čiobrelio etanolinis ekstraktas pasižymi stipriu priešgrybiniu veikimu prieš Candida, Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium, Fusarium ir Cryptococcus genties mikroorganizmus bei taip pat veikia antibakteriškai
kitas bakterijas. Taip pat šių augalų etanoliniai ekstraktai naudojami silose gali pagerinti galvijų sveikatingumą, naudojant juos kaip ekologišką pašarinį papildą.
