LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMJA
Veterinarijos fakultetas
Gintarė Kasperavičiūtė
Vaistinių augalų ekstraktų panaudojimo galimybės,
siloso higieninei sanitarinei kokybei pagerinti, siekiant
užtikrinti galvijų sveikatingumą
Medicinal plant extracts usability, to improve the silage
hygienic sanitary quality, to ensure the health of cattle
Veterinarijos medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Violeta Baliukonienė
2
DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Vaistinių augalų ekstraktų panaudojimo
galimybės, siloso higieninei sanitarinei kokybei pagerinti, siekiant užtikrinti galvijų sveikatingumą“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 111.1. Žoliniai pašarai galvijams ... 11
1.2. Pašarų silosavimas ... 11
1.3. Siloso sanitarinė higieninė kokybė ... 13
1.3.1. Mikroorganizmai aptinkami silose ... 14
1.3.2. Aptinkamos bakterijos silose ... 14
1.3.3. Mielių paplitimas... 16
1.3.4. Mikroskopinių grybų paplitimas jų antrinių metabolitų gamyba ... 17
1.4. Prevencinės priemonės ir būdai apsaugančios nuo mikotoksinų ... 20
1.4.1. Didžiausios leistinos mikotoksinų koncentracijos galvijų pašaruose ... 20
1.4.2. Mikotoksinų detoksikavimo būdai ... 20
1.5. Vaistinių augalų eteriniai ekstraktai ir jų panaudojimas ... 21
1.5.1. Vaistinių augalų eteriniai ekstraktai ... 21
1.5.2. Vaistiniai augalai ... 22
1.5.3. Eterinių ekstraktų antigrybinis ir antibakterinis poveikis ... 22
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 23
2.1. Tyrimo objektai ... 23
2.2. pH ir sausųjų medžiagų nustatymas ... 24
2.3. Vandeninių ir etanolinių ekstraktų gamyba ... 24
2.4. Siloso gamyba su eteriniais ekstraktais laboratorinėmis sąlygomis ... 24
2.5. Bendras mikroorganizmų skaičiaus nustatymas ... 25
2.6. Pienarūgščių bakterijų nustatymas ... 25
2.7. Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičiaus nustatymas ... 25
4
2.9. Mielių skaičiaus nustatymas ... 26
2.10. Mikotoksinų koncentracijos silose nustatymas ... 26
2.11. Siloso mėginių citotoksiškumo nustatymo metodika ... 27
2.12. Statistinis duomenų įvertinimas ... 29
3. TYRIMO REZULTATAI ... 30
3.1. Siloso, pagaminto iš skirtingų augalų rūšių, sausųjų medžiagų kiekis ir pH ... 30
3.2. Bendras mikroorganizmų skaičius silose ... 31
3.3. Pienarūgščių bakterijų kiekis ... 33
3.4. Mikroskopinių grybų kiekis silose ... 34
3.5. Mielių kiekis silose ... 36
3.6. Mikotoksinų koncentracija silose ... 38
3.6.1. Zearalenono koncentracija silose ... 38
3.6.2. Deoksinivalenolio koncentracija silose ... 40
3.6.3. T-2 koncentracija silose ... 42
3.6.4. Aflatoksino B1 koncentracija silose ... 43
3.7. Ląstelių jautrumo nustatymas ... 45
3.7.1. Ląstelių gyvybingumo nustatymas ... 45
3.7.2. Ląstelių proliferacijos nustatymas ... 47
4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 51
IŠVADOS ... 53
PADĖKA ... 55
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 56
5
SANTRAUKA
Vaistinių augalų ekstraktų panaudojimo galimybės, siloso higieninei sanitarinei kokybei pagerinti, siekiant užtikrinti galvijų sveikatingumą
Gintarė Kasperavičiūtė Magistro baigiamasis darbas
Magistro baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti vaistinių augalų (Origanum vulgare ir Thymus vulgaris) ekstraktų panaudojimo galimybes skirtingų žolių siloso kokybei pagerinti bei nustatyti siloso mėginių su skirtingomis mikotoksinų koncentracijomis citotoksinį poveikį (eksperimentas in vitro). Laboratorinėmis sąlygomis buvo užkonservuoti varpinių žolių, mėlynžiedės liucernos ir raudonojo dobilo siloso mėginiai su raudonėlio ir čiobrelio vandeniniais ir etanoliniais ekstraktais. Tyrimo metu siloso mėginiuose nustatytas sausųjų medžiagų kiekis procentais, pH, bendras mikroorganizmų skaičius, gyvybingų mikroskopinių grybų, mielių ir pienarūgščių bakterijų skaičius, išskirtos ir identifikuotos mikroskopinių grybų gentys, nustatytos toksinų AFL B1, ZON, DON ir T-2 koncentracijos bei įvertintas skirtinguose silosuotuose pašaruose esančių mikotoksinų poveikis ląstelių kultūrai BHK - 21 (eksperimentas in vitro). Didžiausias bendras mikroorganizmų skaičius buvo nustatytas varpinių žolių siloso mėginyje su raudonėlio VE, mažiausias - mėlynžiedės liucernos siloso mėginyje su komerciniu preparatu X. Tyrimo metu tirtuose siloso mėginiuose vyravo Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Chromelosporium spp. ir Mucor spp. mikroskopinių grybų gentys, stipriausiu poveikiu prieš mikroskopinius grybus pasižymėjo raudonėlio vandeninis ekstraktas. Iš panaudotų vaistinių augalų vandeninių ir etanolinių ekstraktų siloso mėginiuose, stipriausiu poveikiu mikotoksinų AFL B1, ZON, DON ir T-2 koncentracijoms pasižymėjo raudonėlio etanolinis ekstraktas. Stipriausiu citotoksiniu poveikiu BHK - 21 linijos ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai pasižymėjo raudonųjų dobilų siloso mėginys su čiobrelio vandeniniu ekstraktu. Remiantis gautais atlikto tyrimo rezultatais, galima teigti, jog vaistinių augalų vandeninius ir etanolinius ekstraktus galima panaudoti siloso higieninei sanitarinei kokybei pagerinti, įvertinus jų poveikį galvijų sveikatingumui.
6
SUMMARY
Medicinal plant extracts usability, to improve the silage hygienic sanitary quality, to ensure the health of cattle
Gintarė Kasperavičiūtė Master‘s Thesis
The aim of the master's thesis was to evaluate medicinal plants (Origanum vulgare, Thymus vulgaris) extracts usability to improve the different plants silage quality and to evaluate silage samples with different concentrations of mycotoxins cytotoxic effect. During the current study in laboratorial conditions, perennial ryegrass, blue alfaalfa and red clover silage samples has been conserved with oregano and thyme aqueous and ethanol extracts and commercial inoculants X and Y. Dry matter, pH, total microbial contamination, viable fungi, yeast and lactic acid bacteria counts and AFL B1, ZON, DON, T-2 toxin concentrations were evaluated in silage samples. In vitro investigated cytotoxic effects of mycotoxins (separated from silage samples) on the cell line hamster kidney. The higher total microbial contamination has been established in the grass silage sample with oregano aqueous extract, the lower - lucerne silage sample with commercial inoculant X. In the all silage samples dominated Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Chromelosporium spp. ir Mucor spp. fungi genera. The aqueous extract of oregano and ethanolic extract of oregano showed strongest activity respectively against fungi count mycotoxins AFL B1, ZON, DON and T-2 concentrations. The red clover silage sample with an aqueous extract of thyme showed strongest cytotoxic effect on the cell line hamster kidney. The present study suggests that medicinal plants aqueous and ethanol extracts can be used to improve the silage hygienic sanitary quality, to ensure the wellness of cattle.
7
SANTRUMPOS
AFL B1 – aflatoksinas B1
ATCC – Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American Type Culture Collection, ATCC) BHK – 21 ląstelių linija – Sirijos žiurkėno vienos dienos amžiaus individo inkstų ląstelės (angl. baby hamster kidney fibroblasts)
CO2 – anglies dvideginis DNR – deoksiribonukleorūgštis DON – deoksinivalenolis EE – etanolinis ekstraktas g – gramai
IC50 – mėginio koncentracija, sukelianti pusės (50 proc.) ląstelių biologinių ar biocheminių funkcijų netekimą
kg – kilogramai
Ksv/g – kolonijas sudarantys vienetai grame KV – kristalvioletinis dažas
mg/kg – miligramai kilograme mg/ml – miligramai mililitre ml – mililitrai
MTT – 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromidas ng – nanogramai NH3 – amoniakas nm – nanometrai p - patikimumo kriterijus pav – paveikslas pH – vandenilio potencialas
ppb – milijardinė dalis (part per billion μg kg-1) ppm –milijoninė dalis (part per million mg kg-1) proc – procentai
PSCh – plonasluoksnė chromatografija SM – sausosios medžiagos
spp – rūšis, įeinanti į aukštesnį taksoną T–2 – T-2 toksinas
9
ĮVADAS
„Pieno ūkis – prioritetinis, į vidaus ir užsienio rinką orientuotas, konkurencingas sektorius, gamintojams užtikrinantis pajamas, o vartotojams – geros kokybės pieno produktus. Žinoma, kad nuo pašaro kokybės priklauso ne tik produkcijos kiekis, bet ir mėsos, pieno savybės, sudėtis, t. y. kokybė.
Daugelyje šalių silosas yra ypač vertinamas pašaras. Vienas trūkumų šeriant silosu yra didelis jo kokybės ir fermentacijos rodiklių įvairavimas. Žolių siloso maistinę vertę lemia įvairūs veiksniai: genotipas, klimato sąlygos, silosavimo ypatumai, augalo brandos tarpsnis ir kt. Genotipo įtaka yra reikšminga tiek derliaus, tiek jo kokybės elementams“ (1).
Silosas yra vienas iš pagrindinių atrajotojų pašarų komponentų pasaulyje. Kuris gali sudaryti apie 50 – 80 proc. melžiamų karvių raciono dalies žiemos laikotarpiu (2). Silosas yra gaunamas kai žolės ar kitos augalinės kultūros su pakankamai dideliu drėgmės kiekiu yra konservuojamos anaerobinės fermentacijos būdu. Dažniausiai silosuojamos varpinės žolės, kukurūzai ir ankštiniai augalai. Kaip ir daugelis kitų žemės ūkio produktų, silosas taip pat gali būti užterštas toksiškais mikroskopinių grybų antriniais metabolitais – mikotoksinais, kurie pašaruose atsiranda pažeidus silosavimo technologinius procesus.
Mikroskopiniai grybai yra plačiai paplitę, dažniausiai nustatomos Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Claviceps spp. ir Alternaria spp. gentys. Mikroskopiniai grybai, esant tam palankios sąlygoms, gali produkuoti antrinius metabolitus - mikotoksinus. Šiomis dienomis jau yra nustatyta daugiau nei 400 žinomų mikotoksinų ir apie 30 000 jų derivatų. Tarp kurių labiausiai ištirti ir didžiausią reikšmę pramonei turi aflatoksinai, fumonizinai, ochratoksinas A, T-2 toksinas, deoksivalenolis (vomitoksinas) ir zearalenonas (3).
Mikotoksinai – antriniai mikroskopinių grybų metabolitai galintys sukeliantys mikotoksikozes (4). Šie junginiai gali turėti neigiamos įtakos gyvūnų sveikatai ir produktyvumui, taip pat jiems patekus į maistą, gali sukelti žalingą poveikį žmonių sveikatai (5). Galvijams suėdus pašarų, kuriuose yra, kad ir nedideli mikotoksinų kiekiai, šie gali sukelti kancerogeninį, nefrotoksinį ir teratogeninį poveikį, reprodukcijos sutrikimus (abortas, nevaisingumas), kepenų pažeidimus, imunosupresiją, taip pat viduriavimą ir vėmimą (6).
10 savybių. Atliktais tyrimais buvo nustatyta, jog eteriniai aliejai gauti iš aromatinių augalų, pasižymi teigiamu poveikiu galvijų mitybai (9).
Ląstelių citotoksinio poveikio tyrimo tikslas buvo nustatyti skirtinguose silosuotuose pašaruose esančių mikotoksinų poveikį BHK - 21 linijos žiurkėnų inkstų ląstelių kultūrai (eksperimentas in vitro). Atlikus tyrimą su BHK - 21 žiurkėnų inkstų ląstelių kultūra in vitro buvo nustatytas pašarų su skirtingomis mikotoksinų (AFL B1, DON, ZON, T-2 toksino) koncentracijomis poveikis šių ląstelių proliferaciniam aktyvumui ir gyvybingumui.
Darbo tikslas: Įvertinti vaistinių augalų (Origanum vulgare ir Thymus vulgaris) ekstraktų
panaudojimo galimybes skirtingų žolių siloso kokybei pagerinti bei nustatyti siloso mėginių su skirtingomis mikotoksinų koncentracijomis citotoksinį poveikį.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti silosuojamų, ankštinių ir varpinių augalų kultūrų, žaliavų higieninę sanitarinę kokybę.
2. Nustatyti Origanum vulgare ir Thymus vulgaris vandeninio ir etanolinio ekstraktų poveikį silose esantiems mikroorganizmams.
3. Nustatyti dviejų komercinių siloso inokuliantų poveikį siloso fermentacijos procesui.
4. Įvertinti ir palyginti vaistinių augalų ekstraktų ir siloso inokuliantų panaudojimo galimybes, užtikrinant siloso saugą.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Žoliniai pašarai galvijams
”Žoliniai pašarai – tai daugiametės ir vienmetės pašarinės žolės, kukurūzai ir kiti silosiniai augalai. Lietuvoje didžiąją žalienų plotų dalį užima ganyklos, daugiametės žolės ir pievos. Pašarams auginami dobilai ir jų mišiniai, liucerna ir kiti silosiniai augalai. Kukurūzai auginami siloso gamybai, dalis suvartojami kaip žaliasis pašaras, vis didesni jų plotai paliekami iki vėlyvo rudens.
Žolynus sudaro miglinės ir pupinės žolės. Jų mišinyje gali būti iki 6 skirtingų žolių. Žolynai yra trumpalaikiai, vidutinės trukmės ir ilgalaikiai“ (10).
„Jaunos žolės sausosios medžiagos energinė vertė ir maistinių medžiagų kiekis esantis joje – panašus į koncentruotųjų pašarų, tačiau biologinė vertė didesnė. Žolėje daug provitamino A (karotino), vitaminų D, E ir kt. Joje gausu biologiškai aktyvių medžiagų. Galvijai dažniausiai ganomi kultūrinėse ganyklose, nes jos daug derlingesnės nei natūralios pievos, kadangi jų žolynus sudaro geresnės miglinės ir pupinės žolės. Kultūrinių pievų ir ganyklų žolę galvijai noriai ėda, lengvai virškina ir gerai pasisavina jų maisto medžiagas. Labai produktyvios karvės per dieną gali suėsti net 80–90 kg žolės“ (11).
Žoliniai pašarai yra pagrindinė galvijų raciono dalis, o didžiausią galvijų raciono dalį sudaro silosas. Nuo žolinių pašarų kokybės priklauso galvijų sveikatingumas ir produktyvumas.
Silosas yra pagrindinis atrajotojų racionų komponentas visame pasaulyje (2). „Geros kokybės silosas karvių paros racione turėtų sudaryti 40–50 proc. visų sultingųjų pašarų. Gyvulius geriausia šerti daugiamečių žolių ir ankštinių vienmečių žolių silosu“ (12). Siloso populiarumas šiuolaikinėje ūkininkavimo sistemoje išaugo dėl mažų gamybos sąnaudų ir aukštos maistinės vertės (2).
1.2. Pašarų silosavimas
„Vienas pagrindinių galvijų pašarų yra silosas. Jis gali būti gaminamas įvairiais būdais: tranšėjose, kaupuose ir ritiniuose, bokštuose iš nevytintos ar vytintos žolės, ankštinių ir varpinių javų mišinio, kukurūzų, runkelių lapų“ (12).
„Gali būti silosuojami ir nepilnai pribrendę varpinių ir ankštinių augalų grūdai. Cukrinių runkelių gręžinių, kukurūzų tarkių ir kitų perdirbamosios pramonės šalutinių produktų silosavimas yra geras jų konservavimo būdas.
12 ir kuomet neužtenka žolės net ir nedidelei tranšėjai užpildyti. Hermetiški siloso bokštai Lietuvoje beveik nebenaudojami“ (13).
Norint pagaminti geros kokybės silosą būtina:
Įsitikinti ar tvarkinga siloso saugykla.
Stengtis augalus pjauti, vytinti ir silosuoti esant geram orui.
Žalius augalus pjauti esant tinkamam vegetacijos laikotarpiui.
Tinkamai susmulkinti silosuojamą masę.
Naudoti silosavimo priedus, pagreitinančius siloso fermentacijos procesus.
Saugyklą, tranšėją ar kaupą prikrauti per 1-3 d.
Gerai paskirstyti, išlyginti ir suslėgti silosuojamą masę.
Uždengti plėvele ir gerai prislėgti.
Gaminant ritininį silosą būtina gerai sureguliuoti žolės presą, apvynioti specialia plėvele ir saugoti ją nuo įtrūkimų, pradūrimų ar įplyšimų.
Silosavimas yra pašarinių žolių konservavimo būdas grindžiamas pieno rūgšties fermentacija anaerobinėmis sąlygomis (14). „Pieno rūgštis yra efektyviausia siloso fermentacijai ir greičiausiai sumažinanti siloso pH. Kuo greičiau fermentacija baigiama, tuo daugiau maistinių medžiagų išlieka silose.
Siloso fermentacijai didelės įtakos turi augalų buferingumas. Ankštinių žolių, ypač liucernų, buferingumas didelis (daug baltymų ir mažai cukraus), o kukurūzų vegetacinės masės – labai mažas (daug cukraus ir mažai baltymų). Kad silosuojamos masės pH rodiklis sumažėtų iki reikiamo lygio, liucernų silose turi pasigaminti daug daugiau organinių rūgščių negu kukurūzų silose. Todėl liucernos priskiriamos prie sunkiai, o kukurūzai – prie lengvai silosuojamų augalų.
Labai svarbus rodiklis lemiantis silosavimo sėkmę yra sausųjų medžiagų kiekis. Jei silosuojamų augalų masė labai sausa, ją sunku tinkamai suslėgti ir pašalinti orą. Be to, per ilgai vytintoje žolėje susidaro nepalankios sąlygos pieno rūgšties bakterijoms augti ir veikti, dėl to sumažėja fermentacijos intensyvumas (rūgimo procesas vyksta lėtai, pasigamina nedidelis kiekis organinių rūgščių, pašaras gali pradėti pelyti).
Jei silosuojamų augalų masė labai drėgna, susidaro palanki terpė nepageidaujamiems mikroorganizmams (klostridijoms) daugintis. Pastarosios sukelia pašaro baltymų irimą, labai padidina sausųjų medžiagų nuostolius ir gamina toksinus. Jei oro sąlygos palankios, silosuojamas žoles reikia pavytinti iki 30–35 proc. sausųjų medžiagų, kad būtų nuslopinta klostridijų veikla, nes šie mikroorganizmai nemėgsta sausesnės terpės“ (15).
13 propiono rūgštis. Jei oro sąlygos nepalankios fermentacijai, kontrolės įstaiga gali leisti siloso gamybai naudoti pieno, skruzdžių, propiono ir acto rūgštis“ (12).
1 lentelėje pateikti pagrindiniai geros ir blogos kokybės siloso rodikliai. 1 lentelė. Siloso kokybės rodikliai (16)
Geros kokybės silosas Blogos kokybės silosas
Saldžiai rūgštus kvapas
Nedidelis kiekis paviršinių pelėsių
Žalios/chaki spalvos
Lapų ir stiebų dalys aiškiai matomos
Silosas drėgnas, bet ne šlapias
pH<4,5.
Pelėsiais atsiduodantis, rūgštus ar amoniako kvapas
Didelis pelėsių kiekis paviršiuje ir gilesniuose sluoksniuose
Juodos, tamsiai rudos spalvos
Lapų ir stiebų dalys neaiškios
Silosas atrodo riebus, glitus, paėmus į saują galima išspausti vandens
pH>6,0.
1.3. Siloso sanitarinė higieninė kokybė
”Žodis „silosas“ kilęs iš graikų kalbos žodžio – „siros“. Jis reiškia požeminį maisto sandėlį, kuriame nedaug oro“ (11).
„Silosas – tai anaerobinėse (be deguonies) sąlygose fermentuoti žali augalai, kai mikroorganizmų veiklos pasėkoje, augaluose esantis cukrus fermentuojamas į organines rūgštis iš kurių svarbiausia yra pieno rūgštis. Kad užtikrinti tinkamą fermentacijos procesą ir pagaminti gerą silosą, reikia prisilaikyti tokių pagrindinių elementų: tinkama silosuojamos masės drėgmė, pakankamas cukraus kiekis augaluose, greitas anaerobinių sąlygų sudarymas gerai suslegiant ir sandariai uždengiant“ (13).
„Silosas gaminamas iš įvairių augalų žolės: kukurūzų, kultūrinių pievų ir ganyklų, dobilų, motiejukų, rapsų, vikių, avižų ir kt.
Siloso cheminę sudėtį, jo pašarinę vertę lemia augalai, iš kurių jis gaminamas, augalų vegetacijos tarpsnis pjovimo metu, vytinimo trukmė, masės fermentacija ir kt. Fermentacijos sėkmę nustato siloso kokybės pagrindiniai rodikliai – pH, pieno ir sviesto rūgšties kiekiai, amoniakinio azoto kiekis ir kt.
Silosuoti žalius pašarus galima nuo pavasario iki vėlyvo rudens. Geros kokybės silosas gali išsilaikyti kelerius metus. Taigi silosas yra vienas iš geriausių pašarų žiemos laikotarpiu. Geros kokybės siloso melžiama karvė gali suėsti 30 – 40 kg, penimas prieauglis 20 – 30 kg“ (11).
14 metu, silosuojamos masės susmulkinimo, silosinės tipo, jos užpildymo trukmės ir žaliavos suslėgimo, uždengimo plėvele ir užsandarinimo kokybės bei oro sąlygų silosavimo metu“ (15).
1.3.1. Mikroorganizmai aptinkami silose
Norint užtikrinti gerą galvijų sveikatos būklę ir aukštą produktyvumo lygį, būtina gaminti aukštos maistinės vertės silosą, kuris atitinka siloso higienos reikalavimus. Silosas turi būti neužterštas patogeniniais mikroorganizmais, tokiais kaip Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes ir Escherichia coli O15, mikroskopiniais grybais ir jų antriniais metabolitais (mikotoksinais), kurie gali sukelti neigiamą poveikį ūkinių gyvulių sveikatingumui ir produktyvumui (17).
Be pienarūgščių bakterijų ant augalų antžeminės dalies yra ir daugiau ar mažiau pašaro gedimą sukeliančių mikroorganizmų (klostridijų, mielių, pelėsinių grybų pradų), kurie kartu su silosuojamais augalais patenka į silosą ir gali pagaminti gana daug žalingos sviesto rūgšties, alkoholio ir sukelti pašaro pelijimą. Dėl to nukenčia jo kokybė ir patiriami dideli maisto medžiagų nuostoliai. Rūgščioje terpėje, kurioje nėra deguonies, sustabdoma žalingų mikroorganizmų (klostridijų, mielių, pelėsių) veikla. Įrūgęs pašaras užsikonservuoja ir gali būti saugomas ilgą laiką. Norint sustabdyti ar sumažinti žalingų mikroorganizmų veiklą, reikia laikytis dviejų pagrindinių sąlygų: silosuojamoje masėje kuo greičiau sudaryti anaerobines sąlygas ir sumažinti pH.
Nekontroliuojamas kenksmingų mikroorganizmų augimas silose gali ne tik padidinti pašaro maisto medžiagų nuostolius, bet ir pakenkti gyvūnų sveikatai. Siloso kaitimas ir besikaupiantys žalingi mikroorganizmai turi įtakos pašaro saugumui vėlesnėse stadijose ir sumažina pieno ir mėsos produktų laikymo (saugojimo) terminą, jei gyvūnai buvo šeriami nekokybišku silosu (16).
1.3.2. Aptinkamos bakterijos silose Pienarūgštės bakterijos
Pieno rūgšties bakterijos yra Gram teigiamos, katalazei neigiamos, nejudrios, negaminančios sporų bakterijos (18). Pienarūgštės bakterijos priklauso epifitiniams mikroorganizmams, kurie dažniausiai aptinkami pašarinių augalų žemutinėse dalyse (19).
15 pieno rūgštį, etanolį (arba acto rūgštį), CO2, kad dar galėtų fermentuoti pentozę sudarydamos pieno ir acto rūgštis.
Optimalus pH pienarūgščių bakterijų augimui yra apie 5,0 iki 6,0, nors daugelis iš jų gali augti ir pH esant 4,0, tačiau ne mažiau kai pH - 3,5 (19). Taip pat pienarūgščių bakterijų augimui reikalingos įvairios aminorūgštys ir vitaminai (21).
Pienarūgštės bakterijos yra neproteolitiniai mikroorganizmai, todėl jos prisideda prie labiliųjų baltymų ir laisvųjų aminorūgščių išsaugojimo pašaruose (20).
Enterobakterijos
Enterobakterijos yra anaerobiniai fakultatyviniai mikroorganizmai. Dauguma silose esančių enterobakterijų yra laikomos nepatogeninėmis (20). Jų buvimas silose yra nepageidaujamas, dėl sacharolitinių ir proteolitinių enterobakterijų savybių, kurių dėka, jos konkuruoja su pienarūgštėmis bakterijomis. Tai atsitinka dažniausiai fermentacijos pradžioje, prieš pieno rūgšties bakterijoms pradedant dominuoti fermentacijos procese. Enterobakterijos naudoja du sachrolitinius fermentus angliavandenių skaidymui. Mišriajai fermentacijai yra būdinga pieno rūgšties, acto rūgšties, gintaro rūgšties ir skruzdžių rūgšties gamyba. Ši fermentacija vyksta silose, kuomet pH didesnis nei 6,3. Tačiau, enterobakterijos yra jautrios žemam pH – 4,5 (19).
Klostridijos
Klostridijos yra anaerobinės bakterijos formuojančios endosporas. Daugelis iš jų gali fermentuoti angliavandenius ir baltymus. Jie sumažina siloso maistingumo vertę ir taip pat, kaip ir enterobakterijos gamina biogeninius aminus, kurie dažniausiai sukelia įvairias problemas. Be to, klostridijų buvimas keičia pieno kokybę, nes jų sporos gali išgyventi visose gyvūnų virškinamojo trakto dalyse. Klostridijos gali būti randamos išmatose ir kai tešmuo yra nešvarus tiesiogiai ar netiesiogiai užteršti pieną.
Yra skiriamos dvi klostridijų grupės: sachrolitinė grupė (Clostridium butyricum, Cl. tyrobutyricum) ir proteolitinė grupė (Cl. bifermentants, Cl. sporogenes, Cl. perfringens). Pirmoji grupė skaido pieno rūgštį į acto rūgštį, todėl yra didinamas siloso pH. Tuo tarpu antroji grupė fermentuoja aminorūgštis į sviesto rūgštį ir acto rūgštį, aminus, CO2 ir NH3, taip pat didindamos siloso pH. Kai kurios klostridijų rūšys gali sukelti rimtų sveikatos problemų, pati svarbiausia rūšis pieno pramonėje C. tyrobutiricum. Dažniausiai silosas, kuriame yra klostridijų, pasižymi dideliu kiekiu sviesto rūgšties ir aukštu pH, amoniaku ir aminais (20).
16 mirtimi. Taip pat įvairios klostridijų rūšys gali sukelti galvijams stabligę, botulizmą, piktybinę edemą, enterotoksemiją ar „juodąją koją“, tai Clostridium chauvoei toksinų sukelta liga, stipriai pažeidžianti galvijų kojų raumenis (23).
Listerijos
Listeria monocytogenes yra fakultatyvinis anaerobinis organizmas patogeniškas keletui gyvūnų rūšių, taip pat ir žmonėms. Jis yra plačiai paplitęs aplinkoje ir gali užteršti galvijų pašarus. Nėščios patelės ir naujagimiai yra ypač jautrūs L. monocytogenes sukeliamoms infekcijoms. Listeriozės susirgimų padidėjimas tarp galvijų ir avių yra siejamas su didelių siloso rulonų naudojimu, kai silosas juose yra nepakankamai tankus, todėl siloso fermentacija yra ribojama, o L. monocytogenes gali juose laisvai daugintis. Listerijų augimas ir išgyvenimas silose yra apibrėžiamas, kaip nepakankamų anaerobinių sąlygų išlaikymas ir siloso pH pokyčiai. L. monocytogenes toleruoja žemą pH lygį ir gali augti ilgą laiką, kuomet pH yra tarp 3,8 ir 4,2 (20).
Galvijai dažniausiai turi mažas žaizdeles ir įbrėžimus savo burnoje dėl matinimosi šiurkščiais pašarais. Todėl jiems ėdant listerijomis užterštą silosą ar kitus pašarus, bakterijos per įbrėžimus gali nervais nukeliauti į galvos smegenis. Dažniausiai listerijos galvijams sukelia nervų sistemos susirgimus ir abortus (24).
Bacilų bakterijos
Bacilus spp. yra gramteigiami, sporas formuojantys mikroorganizmai. Jos savo savybėmis augti anaerobinėmis sąlygomis skiriasi nuo klostridijų. Fakultatyvinės anaerobinės bacilos gali fermentuoti įvairius angliavandenius, gaminti etanolį, glicerolį ir organines rūgštis. Šių bakterijų produktų gamyba nėra tokia veiksminga, kaip, kad pieno rūšties bakterijų, kurių reikia vengti norint išvengti bakterijų paplitimo silose (19). Bacilų veikla anaerobinėmis sąlygomis užima santykinai žemą svarbą, nes jų veikla sparčiausia, kuomet silosas yra veikiamas deguonimi (21).
1.3.3. Mielių paplitimas
„Mielės dažnai laikomos visiškai nekenksmingomis ir kartais jų specialiai pridedama į pašarus, nes tai labai vertingas gyvulių ir paukščių raciono baltymų bei vitaminų šaltinis, didinantis pašarų biologinę vertę. Naudojantis jomis kartais sprendžiama ir mikotoksinų detoksikavimo pašaruose problema. Nustatyta, kad mielės gali būti ne tik naudingos, bet ir žalingos. Kai kurių rūšių mielės gali neigiamai veikti silosuotų pašarų kokybę, nes skaido silose esančią pieno rūgštį ir skatina siloso kaitimą bei vertingų medžiagų irimą. Pagrindinis veiksnys, lemiantis mielių paplitimą silose, yra cukraus kiekis augalinėje žaliavoje. Paprastai silosuotuose pašaruose, turtinguose baltymų, mielių yra mažiau nei tuose, kur cukraus yra daugiau“ (25).
17 Aerobinėje aplinkoje kai kurių mielių fermentacija vyksta, bet daug lėčiau. Mielės sugeba augti pH esant 3,5, tai gerokai mažesnis, nei daugumos siloso pH (21).
1.3.4. Mikroskopinių grybų paplitimas ir jų antrinių metabolitų gamyba
Mikotoksinai yra natūralus, mažos molekulinės masės produktai, tai toksiški mikroskopinių grybų antriniai metabolitai, galintys sukelti toksišką poveikį žmonių ir gyvūnų sveikatai. Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Claviceps spp. ir Alternaria spp. – tai mikroskopinių grybų gentys gaminančios mikotoksinus. Viena mikroskopinių grybų rūšis gali gaminti daug įvairių mikotoksinų, tačiau tie patys mikotoksinai gali būti gaminami ir kelių rūšių mikroskopinių grybų (26). 2 lentelėje pateiktos pagrindinės mikroskopinių grybų rūšys gaminančios mikotoksinus. Mikotoksinų gamyba gali prasidėti pašarų augimo ar derliaus nuėmimo metu, taip pat pašarus sandėliuojant ar apdorojant, ir visa tai dažniausiai priklauso nuo aplinkos sąlygų (27).
2 lentelė. Pagrindiniai mikotoksinai ir jų gamintojai (26)
Mikotoksinai Mikroskopinių grybų rūšis
Aflatoksinai Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. tamarii, A. pseudotamarii, A. bombycis, A. ochraceoroseus Trichotecenai Fusarium, Stachybotrys, Trichothecium, Trichoderma,
Memnoniella, Phomopsis, Myrothecium spp. Ochratoksinai Aspergillus ochraceus, A. carbonarius, Penicillium
verrucosum.
Fumonizinai F. verticillioides, F. proliferatum
Zearalenonai F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti, F. crookwellense
Skalsių alkaloidai Claviceps purpurea
Aflatoksinai
Aflatoksinai yra vieni stipriausių mikotoksinų gaminamų Aspergillus flavus ir A. parasiticus mikroskopinių grybų. Yra šešios pagrindinės aflatoksinų rūšys: aflatoksinas B1, B2, G1, G2, M1 ir M2 (26). Aflatoksinai B1 ir M1 yra randami galvijų piene ir pašaruose. Aflatoksinas M1 yra randamas karvių piene, nes karvių pašaruose dažniausiai randamas aflatoksinas B1. Aflatoksinas B1 yra greitai absorbuojamas karvių virškinamajame trakte, tuomet kepenų fermentų metabolizuojamas į aflatoksiną B1, kuris randamas karvių piene ir šlapime (3). Aflatoksinas B1 yra vienas iš labiausiai žinomų mikotoksinų pasižymintis labai stipriomis hepatotoksinėmis ir kancerogeninėmis savybėmis (27). Aflatoksinai gali sukelti ūmų ir lėtinį poveikį sveikatai, slopinti imuninę sistemą, lėtinti augimą, sukelti vežinius susirgimus ir net mirtį (26).
18 Aflatoksinams labiau jautrūs yra veršeliai lyginant su vyresnio amžiaus gyvūnais. Aflatoksinai sukelia kancerogeninį, teratogeninį, hepatotoksinį ir mutageninį poveikį galvijams, taip pat slopina imuninę sistemą (29). Gali sukelti kepenų pažeidimus, vėžinius susirgimus, pieno gamybos sumažėjimą, imunosupresiją ir anemiją (30). Aflatoksinas M1 piene neturėtų viršyti 0,5 ppm, o aflatoksino B1 pašaruose netūrėtų būti daugiau nei 20 ppm (31).
T-2 toksinas
Tai toksinis antrinis metabolitas, priklausantis trichotecenų grupei. Toksinas yra gaminamas šių rūšių mikroskopinių grybų: Fusarium acuminatum, F. poae ir F. sporotrichioides. Šis toksinas dažniausiai randamas kviečiuose, kukurūzuose, miežiuose, avižose, rugiuose ir perdirbtuose grūduose.
Įvairūs tyrimai parodė, jog T-2 toksinu užkrėsto maisto ir pašarų vartojimas gali sukelti žmonių ir gyvūnų susirgimus (32). Pieninėms karvėms T-2 toksinas gali sukelti gastroenteritą, žarnyno hemoragijas, apetito pablogėjimą, bei pieno gamybos sumažėjimą. Jis taip pat sumažina veršelių imuninį atsaką. Esant T-2 toksino kiekiui pašaruose daugiau nei 640 ppb, gali būti sukeliamas enteritas su kraujo priemaišomis, šliužo dislokacija bei skrandžio opos, kurios gali pasibaigti mirtimi. Taip pat slopina imunitetą ir baltymų sintezę, pasižymi toksiniu poveikiu inkstams, limfoidiniam audiniui ir kaulų čiulpams (31).
T-2 toksinas yra stiprus citotoksinis mikotoksinas, kuris gali sukelti apoptozę įvairių rūšių ląstelėms, pavyzdžiui imuninės sistemos ląstelėms, kiaušidžių grūdėtosioms ląstelėms, taip pat gali sukelti toksinį poveikį motinos ir vaisiaus organizmams (33). T-2 toksinas slopina makrofagų fagocitozę (34). Taip pat T-2 toksinas gali sukelti skrandžio gleivinės, skrandžio liaukų ir žarnyno kriptų epitelinių ląstelių apoptozę (35).
Deoksinivalenolis arba Vomitoksinas
Deoksinivalenolis yra antrinis Fusarium graminearum ir Fusarium culmorum gaminamas metabolitas. Labai didelė šio mikotoksino koncentracija yra randama grūduose, šiauduose, kukurūzų silose, žolėje, taip pat šienainyje. Deoksinivalenoliu užteršto maisto vartojimas sukelia mikotoksikozes žemės ūkio gyvuliams, taip pat ir žmonėms. Šis toksinas gali sukeli vėmimą, viduriavimą, anoreksiją, neuroendokrininius ir imunologinius pokyčius, leukocitozę, hemoragiją, kraujo apytakos sutrikimus ir net mirtį (36).
Deoksinivalenolis prisijungia prie ribosomų ir slopina jų baltymų sintezę, taip pat ir DNR sintezę (37).
19
Zearalenonas
Zearalenonas yra Fusarium spp. išskiriamas mikotoksinas, kuris savo chemine struktūra yra labai panašus į estrogeną ir gali sukelti estrogeninį atsaką gyvūnams (35). Toksinas yra plačiai randamas kukurūzuose, miežiuose, kviečiuose, avižose, sorgų ir sezamo sėklose, taip pat šieno ir kukurūzų silose, kurie yra pagrindiniai ingredientai daugelyje maisto produktų žmonėms ir gyvūnams (4).
ZON pasyviai pereina ląstelių membranas ir konkurencingai rišasi prie citozolinių estrogeno receptorių. Moksliniais tyrimais buvo įrodyta, jog ZON gali sukelti neurotoksinį poveikį, taip pat sumažinti limfocitų, IgG, IgM, B ląstelių, T ląstelių ir priešuždegiminių citokinų kiekius organizme (35).
Zearalenonas sukelia vaginitą, sumažėjusias reprodukcines funkcijas, diarėją ir pieno liaukos pokyčius telyčioms (35). Zearalenonas veikia genotoksiškai, jungiasi prie estradiolio receptorių, skatina lipidų peroksidaciją, sukelia ląstelių mirtį, slopina baltymų ir DNR sintezę (37). Mažomis dozėmis zearalenonas imituoja moteriško hormono estrogeno poveikį, didesnės dozės gali sukelti ankstyvą pieno liaukų ir lytinių organų brendimą. Zearalenonas sukelia estrogeninį atsaką pieniniams galvijams, didelėmis dozėmis sukelia abortus. Pieniniams galvijams sumažėja pašaro suvartojimas, sumažėja pieno produkcija, prasideda vaginitas, padaugėja makšties išskyrų, suprastėja reprodukcinės funkcijos, telyčioms padidėja pieno liaukos. Rekomenduojama, jog zearalenonas neviršytų 250 ppb galvijų racione (38).
Pašaruose esant didesniam zearalenono kiekiui nei 660 ppb gali pablogėti maisto įsisavinimas, sumažėti pieno gamyba, pasireikšti viduriavimas ir lytinių takų infekcijos (31).
Ochratoksinas A
Ochratoksinas A yra nefropatinis ir kancerogeninis mikotoksinas, gaminamas Penicillium verrucosum šaltose klimato sąlygose ir Aspergillus spp., kaip A. ochraceus, A. melleus, A. carbonarius ir A. niger šiltesnėse ir tropinėse klimato sąlygose.
Imunosupresiniui ochratoksino A aktyvumui yra būdingas gyvybinių imuninių organų sumažėjimas, tokių kaip čiobrialiaukė, blužnis, limfiniai mazgai, taip pat antikūninio atsako sumažėjimas, imuninių ląstelių skaičiaus ir funkcijos pokyčiai. Ochratoksino A imunotoksinė veikla susidaro dėl ląstelių degeneracinių pokyčių ir mirties dėl nekrozės ir apoptozės bei imuninių ląstelių baltymų sintezės slopinimo (39). Ochratoksinas A pasižymi baltymų sintezės slopinimu, taip pat genotoksiniu ir kancerogeniniu poveikiu (40).
20 3 lentelėje pateiktas pagrindinių mikotoksinų sukeliamas toksinis poveikis gyvūnų organizme. 3 lentelė. Mikotoksinų sukeliamas toksinis poveikis (42)
Toksininis poveikis Mikotoksinai
Kancerogeninis Aflatoksinas B1, B2, G1, Aflatoksinas M1, Ochratoksinas A, Fumonizinas B1,
Sterigmatocistinas, toksinas iš F. moniliforme Hepatotoksiškas Aflatoksinas B1, Sterigmatocistinas
Nefrotoksiškas Ochratoksinas A, Citrininas
Imunotoksiškas Aflatoksinas B1, Ochratoksinas A, Trichotecenai Neurotoksiškas Skalsės, Fumonisinas B1, Citreoviridinas
Sukeliantis tremorą Trichotecenai Estrogeninis Zearalenonas
Kardiotoksinis Citreoviridinas, Penicilinė rūgštis Teratogeninis Aflatoksinas B1, Ochratoksinas A,
1.4. Prevencinės priemonės ir būdai apsaugantys nuo mikotoksinų
1.4.1. Didžiausios leistinos mikotoksinų koncentracijos galvijų pašaruose
Atsižvelgiant į mikotoksinų patekimo į pieną būdus ir rizika susijusia vartojant pieno produktus bei daromu neigiamu poveikiu gyvūnų sveikatai maždaug 45 pasaulio šalys nustatė didžiausias leistinas mikotoksinų koncentracijas pašaruose. Didžiausios leistinos mikotoksinų koncentracijos pašaruose Europoje, Jungtinėse Amerikos Valstijose ir Kanadoje yra pateiktos 1 priede. Galima pastebėti, jog JAV – AFL B1 gyvūnų pašaruose leidžiama 6 kartus daugiau nei Europoje, taip pat JAV leidžiama 10 kartų daugiau AFL M1 piene nei Europoje (42).
2 ir 3 priede pateikiamos Europos Sąjungoje rekomenduojamos mikotoksinų: aflatoksino B1, deoksinivalenolio ir zearalenono orientacinės vertės pašaruose mg/kg (ppm).
1.4.2. Mikotoksinų detoksikavimo būdai
„Mikotoksinais užteršti pašarai gyvulių augintojams daro didelius ekonominius nuostolius. Svarbiausias uždavinys ūkiuose – kaip detoksikuoti mikotoksinais užterštus pašarus. Reikia atlikti daug įvairių darbų:
• suardyti, inaktyvuoti arba pašalinti mikotoksinus.
• panaudojus chemines (ir fizikines) priemones, reikia neleisti susidaryti naujiems toksiškiems junginiams.
• detoksikuoti taip, kad nenukentėtų pašaro vertė.
21 • parinkti lengvai įterpiamas, nebrangias ir nekenksmingas aplinkai detoksikavimo priemones“ (43). Pašarų detoksikavimas gali būti atliekamas fizikiniais, cheminiais ir biologiniais metodais (4 lentelė).
4 lentelė. Pašarų detoksikavimo metodai (43)
Prieš šeriant Šėrimo metu
Fizikiniai: mechaniniai apdorojimas karščiu poveikis spinduliais Absorbcija: aktyvuota anglis bentonitas ceolitai it kt. Cheminiai: amoniakas monometylaminas kalcio hidrochloridas - Biologiniai: poveikis mikroorganizmais poveikis enzimais -
1.5. Vaistinių augalų eteriniai ekstraktai ir jų panaudojimas
1.5.1. Vaistinių augalų eteriniai ekstraktai
Vaistinių augalų eteriniai ekstraktai – tai skystos konsistencijos koncentruoti preparatai, dažniausiai gaunami iš sausos (išdžiovintos) fitožaliavos medžiagos. Ekstraktai priklauso preparatams, kurie gaunami ekstrahuojant augalinę žaliavą ir gautą ištrauką toliau apdorojant įvairiais metodais. Vaistinių augalų eterinių ekstraktų gamyboje kaip ekstrahentai, dažniausiai naudojamas distiliuotas vanduo ir įvairios konsentracijos etanolis.
Eteriniai aliejai yra aromatiniai eteriniai ekstraktai, gaunami iš tokių augalų dalių kaip lapai, žiedai, vaisiai, žievė, šaknys, šakniastiebiai ir mediena (44). Eteriniai aliejai yra aromatiniai aliejingi skysčiai išgauti iš augalinių medžiagų fermentacijos, dažniausiai, distiliacijos metodais (45).
22
1.5.2. Vaistiniai augalai
Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare) - tai Lamiaceae šeimos prieskoninė žolė,
auganti nuo 20-80cm. aukščio. Šis augalas kilęs iš Vakarų ir Pietvakarių Eurazijos ir Viduržemio jūros regiono. Pagrindinės sudedamosios dalys yra fenoliniai junginiai: karvakrolis ir timolis (7). Aromatiniai raudonėlio ekstraktai palengvina virškinimo trakto sutrikimus, sumažina gliukozės ir cholesterolio kiekį kraujyje, pasižymi slopinamuoju poveikiu navikams (47). Paprastasis raudonėlis pasižymi antioksidacinėmis ir antibakterinėmis savybėmis prieš mikroskopinius grybus ir bakterijas (48). Taip pat šis prieskoninis augalas plačiai naudojamos kulinarijos pramonėje.
Paprastasis čiobrelis (Thymus vulgaris) - mažas krūminis augalas su stipriai aštriu skoniu ir
kvapu. Šis augalas gimęs iš pietų Europos, Viduržemio jūros regiono ir dabar yra plačiai auginamas Jungtinėse Amerikos Valstijose. Pagrindinės čiobrelio sudedamosios dalys yra eteriniai aliejai - karvakrolis, timolis, linalolis, taip pat yra randama taninų, flavanoidų ir saponinų. Eteriniai aliejai ir ekstraktai iš šviežių lapų ir žiedų gali būti naudojami kaip aromatiniai priedai maisto produktuose, taip pat farmacijos ir kosmetikos produktų gamyboje. Vaistinis čiobrelis turi antispazminių, atsikosėjimą lengvinančių bei raminamųjų savybių, taip pat gerina virškinimą ir mažiną vidurių pūtimą. Jis yra dažnai naudojamas gerklės ir bronchų problemų, įskaitant ūminį bronchitą, laringitą, taip pat viduriavimo, lėtinio gastrito ir apetito praradimo gydymui. Čiobrelio ekstraktai turi stiprų antimikrobinį poveikį, taip pat gali stiprinti tetraciklino veiksmingumą kovojant su antibiotikams atspariu Staphylococcus aureus (48).
1.5.3. Eterinių ekstraktų priešgrybinis ir antibakterinis poveikis
Įvairūs augalų produktai, tokie kaip augaliniai ekstraktai, eteriniai aliejai ir dervos turi įtakos biologiniui aktyvumui in vitro ir in vivo ir yra naudojami kaip natūralios priešgrybinės medžiagos. Pagrindinės priežastys, dėl kurių eteriniai aliejai yra naudojami kaip priešgrybinės medžiagos, yra tai, jog jie yra natūralūs ir sukelia nedidelę tikimybę patogenų atsparumo vystymuisi (49).
23
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimo objektai
Tiriamasis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Gyvūnų gerovės tyrimų laboratorijoje. Tyrimai atlikti 2014 – 2016 metais. Tyrimų metu nustatytas vaistinių augalų vandeninių ir etanolinių ekstraktų bei komercinių inokuliantų X ir Y priešgrybinis poveikis mikroskopiniams grybams išskirtiems iš siloso. Tyrimo metu siloso mėginiuose nustatytas sausųjų medžiagų kiekis procentais, pH, bendras mikroorganizmų skaičius, gyvybingų mikroskopinių grybų, mielių ir pienarūgščių bakterijų skaičius, išskirtos ir identifikuotos mikroskopinių grybų gentys, nustatytos toksinų AFL B1, ZON, DON ir T-2 koncentracijos bei įvertintas skirtinguose silosuotuose pašaruose esančių mikotoksinų poveikis ląstelių kultūrai BHK - 21 (eksperimentas in vitro).
1 pav. Tyrimo schema
Vandeninių ir etanolinių ekstraktų
ruošimas
Siloso gamyba su eteriniais ekstraktais laboratorinėmis sąlygomis Bendras mikroorganizmų skaičiaus nustatymas Mielių skaičiaus nustatytas SM ir pH nustatymas Pienarūgščių bakterijų skaičiaus nustatytmas Gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičiaus nustatymas Mikroskopinių grybų kultūrų identifikavimas Eksperimentas in vitro: nustatytas skirtinguose silosuotuose pašaruose esančių
mikotoksinų poveikis BHK - 21 linijos žiurkėnų inkstų
ląstelių kultūrai Mikotoksinų
24
2.2. pH ir sausųjų medžiagų nustatymas
pH nustatymas
Tiriamieji siloso mėginiai susmulkinami iki 1 – 2 cm ilgio gabalėlių. 25 g mėginio užpilama 250 ml distiliuoto vandens. Mėginiai maišomi maišykle 30 min. ir gautas ekstraktas nufiltruojamas per popierinį filtrą. Tuomet 50 ml ekstrakto supilama į cheminę stiklinaitę ir pH metru„InoLab ph 720“ (Vokietija) išmatuojama pH. Suradus pastovią vertę, pH nustatomas remiantis skalės rodmenimis, mažiausiai 0,05 pH vieneto tikslumu.
Sausųjų medžiagų nustatymas
Siloso mėginiai susmulkinami iki 4 cm dydžio gabalėlių, sudedami į paruoštus iškaitintus indus ir pasveriami. Mėginiai džiovinami džiovinimo spintoje iki pastovaus svorio 65°C 12 val. (arba 55°C – 24 val.). Indai su mėginiais išimami, atvėsinami ir pasveriami.
2.3. Vandeninių ir etanolinių ekstraktų gamyba
Savo tyrime eterinių ekstraktų gamybai naudojome vaistinius augalus: paprastąjį raudonėlį (Origanum vulgare) ir paprastąjį čiobrelį (Thymus vulgaris). Remiantis išanalizuotos literatūros duomenimis, vaistinio čiobrelio ir paprastojo raudonėlio ekstraktai pasižymi priešgrybiniu ir antibakteriniu poveikiu (48).
Vandeninio ekstrakto gamyba
Vaistiniai augalai: paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare L.) ir paprastasis čiobrelis (Thymus vulgaris L.) buvo smulkiai sumalti. 25 g smulkiai sumaltos atskiros vaistinių augalų masės buvo užpilamos 100,0 ml vandens. Mišinys 60 min. maišomas maišykle, po to 15 min. pašildomas 60°C temperatūroje. Po maišymo mišinys filtruojamas per Whatman Nr. 1 filtrą.
Etanolinio 70 proc. ekstrakto gamyba
Pirmiausiai vaistiniai augalai: paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare L.) ir paprastasis čiobrelis (Thymus vulgaris L.) smulkiai sumalami. 25 g sumaltos atskiros vaistinių augalų masės buvo užpilamos 100,0 ml 70 proc. etanoliu. Vaistinių augalų ir spirito mišinys 60 min. maišomas maišykle. Po maišymo filtruojamas per popierinį filtrą. Nuosėdos dar kartą užpilamos 50,0 ml 70 proc. etanoliu. Maišoma maišykle 30 min. ir filtruojama per Whatman Nr. 1 filtrą. Nufiltruotas ekstraktas tiksliai pamatuojamas ir garinamas garinimo spintoje 60°C, kol gaunama apie 50 proc. vaistinių augalų ekstrakto.
25 inokuliantais X ir Y pagal gamintojo instrukcijas bei 1 kg varpinių žolių, raudonųjų dobilų ir mėlynžiedės liucernos siloso mėginiai neįterpiant nieko. Tuomet žalia mėginių masė sudėta į stiklines 0,003 m3 talpas ir sandariai uždaryta. Laboratorinėmis sąlygomis silosas laikomas vėsioje patalpoje apie 3 – 5°C temperatūroje.
Po 96 dienų talpos buvo atidarytos. Siloso mėginiai įvertinti organoleptiškai bei sanitariniu higieniniu atžvilgiu.
2.5. Bendras mikroorganizmų skaičiaus nustatymas
Bendras mikroorganizmų skaičius (KSV/g) pašaruose nustatomas skiedimo metodu, sėjant į Petri lėkšteles, naudojant mitybinį agarą PLT (Plate Count Agar) pagal LST EN ISO 4833:2003. Buvo atsveriama 10 g mėginio, sudedama į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens ir maišoma maišykle 20 min. Buvo atliekami mėginių skiedimai iki – 1x103. Gavus reikiamą praskiedimą, imama 1 ml skiedinio ir sėjama į Petri lėkštelę – užpylimo būdu. Petri lėkštelės buvo laikomos termostate 30°C temperatūroje 24 val. Bendras mikroorganizmų skaičius (KSV/g) silose buvo vertinamas praėjus 24 val.
2.6. Pienarūgščių bakterijų nustatymas
Bendrasis mezofilinių pieno rūgšties bakterijų kolonijų skaičiaus (KSV/g) nustatymas buvo atliekamas skiedimo metodu, sėjant į Petri lėkšteles, naudojant MRS (Man, Rogosa, Sharpe) agarą pagal LST ISO 15214: 2009. Buvo atsveriama 10 g mėginio, sudedama į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens ir maišoma maišykle 20 min. Buvo atliekami mėginių skiedimai iki – 1x103. Gavus reikiamą praskiedimą, imama 1 ml skiedinio ir sėjama į Petri lėkštelę – užpylimo būdu, panaudojant MRS agarą. Petri lėkštelės buvo laikomos termostate 35°C temperatūroje 72 val. Pienarūgščių bakterijų skaičius buvo vertintas praėjus 72 val.
26
2.8. Mikroskopinių grybų kultūrų identifikavimas
Išaugusios mikroskopinių grybų kultūros buvo identifikuotos pagal kultūrinius ir morfologinius požymius šviesinės mikroskopijos metodu. Mikroskopinių grybų gentys buvo identifikuotos remiantis įvairiais apibūdintojais.
2.9. Mielių skaičiaus nustatymas
Tyrimai buvo atlikti vadovaujantis Lietuvos standartu LST ISO 7954:1998E. Mikrobiologija. Mielių ir pelėsinių grybų skaičiavimas. Bendrieji nurodymai. Kolonijų skaičiaus nustatymas 25°C temperatūroje. Bendrasis mielių skaičiaus (KSV/g) nustatymas buvo atliekamas skiedimo metodu. Sėjant į Petri lėkšteles ir naudojant Sabūro agarą. Buvo atsveriama 10 g mėginio, sudedama į kolbutę su 90 ml sterilaus distiliuoto vandens ir maišoma maišykle 20 min. Buvo atliekami mėginių skiedimai iki – 1x103. Gavus reikiamą praskiedimą, imama 1 ml skiedinio ir sėjama į Petri lėkštelę – užpylimo būdu, panaudojant Sabūro agarą. Petri lėkštelės buvo laikomos termostate 25°C temperatūroje 74 val. Mielių skaičius buvo vertintas praėjus 74 val.
2.10. Mikotoksinų koncentracijos silose nustatymas
Plonasluoksne chromatografija (PSCh) buvo nustatomos mikotoksinų: aflatoksino B1, zearalenono, deoksinivalenolio ir T-2 toksino koncentracijos pagal aprobuotas Romer Labs. Inc. (Austrija) metodikas. Išdžiovinti iki pastovios masės pašarų mėginiai (250 g) buvo sumalami malūnu. Tyrimui surenkama smulkiausia mėginio frakcija. 25 g mėginio ekstraguota 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu, kratant 3 min. Mėginio ekstraktas perfiltruotas per celiuliozinį filtrą.
Nustatant ZON ir AFL B1 mikotoksinų koncentracijas, ekstrakto valymui panaudotos MycoSep® 226 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija). 2 ml išvalyto ekstrakto perkelta į mėgintuvėlį ir išgarinta, panaudojant Romer® Evap sistemą. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos 300 µl 97/3 toluolo/acetonitrilo mišinyje. Esant 60°C temperatūrai, Romer Labs PSCh autospoteriu (autospotter) ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (Romer Labs. Inc., Austrija) su specialiais mikrošvirkštais užnešama AFL B1 (2 µg/ml acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) ar ZON (100 µg/ml acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) standartų 10, 20, 40, 80 µl ir 80 µl mėginio. Rezultatų išryškinimui plokštelė įmerkiama į 9/1 chloroformo/acetono mišinio vonelę. Laikoma, kol tirpalas pakyla iki 1 cm plokštelės viršaus. Plokštelė išdžiovinama ore. Toksinų koncentracijos įvertinamos ultravioletinių spindulių (UV) fone. AFL B1 švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,45, ZON švyti žaliai, kai Rf ≈ 0,9. Mikotoksino koncentracija paskaičiuojama µg/kg: ant PSCh plokštelės kiekvienas toksinas tiriamajame mėginyje matomas ng, mėginio ekvivalentas 0,15 g. ppb=X÷0,15,
27 Nustatant DON ir T-2 toksino koncentracijas mėginiuose PSCh metodu, mėginių paruošimas toks pat, kaip nustatant ZON ir AFL B1. Mėginio ekstrakto valymui panaudotos MultiSep® 216 ir MycoSep® 227 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija). 13 ml išvalyto ekstrakto išgarinta Romer® Evap sistema. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos 320 µl 97/3 tolueno/acetonitrilo mišinyje. Į specialius mikrošvirkštus pritraukus 10, 20, 40, 80 µl DON ar T-2 toksino standartų (100 µg/ml acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) ir 80 µl tiriamo mėginio, PSCh autospoteriu (autospotter) užnešamas standartas ir tiriamasis mėginys ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (Romer Labs. Inc., Austrija) 60°C temperatūroje. Rezultatų išryškinimui DON plokštelė įmerkiama į 1/2 toluolo/acetono mišinio vonelę, T-2 toksino - 25/15/1 metanolio/vandens/acto rūgšties mišinio. DON plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje, T-2 toksino - 10 proc. sieros rūgšties metanolyje. Plokštelė išdžiovinama ore. Toksino koncentracija įvertinama pakaitinus plokštelę 150°C temperatūroje 5 min. ultravioletinių spindulių (UV) fone (360 nm). DON ir T-2 švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,5. Toksino koncentracija tiriamajame mėginyje matomas ng, mėginio ekvivalentas 0,2 g. ppb=X÷0,2,
kur ppb – toksino koncentracija mėginyje (µg/kg); X – mikotoksino koncentracija ant plokštelės ng; 0,2 – mėginio ekvivalentas (0,2 g).
Aptikimo riba – DON – 10 ppb, T-2 toksino – 10 ppb.
2.11. Siloso mėginių citotoksiškumo nustatymo metodika
Siloso ekstraktų paruošimas
In vitro tyrimais įvertinta 24 siloso mėginių. Tyrimams atrinktuose mėginiuose mikotoksinų AFL B1, DON, ZON, T-2 koncentracijos nustatytos PSCh metodais. Iki tyrimo pradžios mėginiai buvo laikomi -20°C temperatūroje.
25 g sumalto tiriamo mėginio ekstraguota 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu, kratant 3 min. Mėginio ekstraktas perfiltruotas per popierinį Whatman Nr. 1 filtrą. Tiriamųjų mėginių, užterštų DON ir T-2 toksinais, ekstraktų valymui panaudotos MultiSep® 216 ir MycoSep® 227 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija), užterštų AFL B1 ir ZON mėginių ekstraktų valymui, panaudotos MycoSep® 226 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija). 7 ml išvalyto ekstrakto (10 ml ekstrakto atitinka 2,5 g mėginio) perkelta į mėgintuvėlį ir išgarinta, panaudojant Romer® Evap sistemą.
Ląstelių linija
28 specialiuose plastikiniuose 75 cm3 tūrio nepilnai uždengtuose induose (TPP, Švedija), kurie laikomi 37°C temperatūroje, 98 proc. santykiniu drėgniu ir 5 proc. CO2 termostatuose.
Ląstelių linija auginta monosluoksniu, persėjama kas 3 – 4 dienas. Ląstelių monosluoksniui nuimti naudotas 0,025 proc. tripsino/EDTA fosfatiniame buferyje (PBS) tirpalas (Sigma-Aldrich, Vokietija). Tyrimui panaudota 2,5x105 iki 3,0x105 ląstelių/ml suspencija. Ląstelių tankis skaičiuotas Neubauerio hemocitometru (Neubauer improved, Heinz Herenz Medizinalbedarf, Vokietija).
Citotoksiškumo nustatymas
Tiriamųjų mėginių paruošimas: kiekvienas tiriamasis mėginys ištirpintas 1 ml DMSO ir skiedžiami ląstelių augimo terpėje. Tiriamųjų mėginių tirpalai nufiltruoti aseptinėmis sąlygomis per baktericidinį filtrą (0,22 µm).
Testavimas
Ląstelių suspensijos augimo fazėje išpilstomos į 96 šulinėlių audinių kultūrų plokšteles. Plokštelės užpildytos pagal pasirinktą schemą (2 pav.):
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R R R R R R R R R R R R B R TM TM TM TM LK TM TM TM TM LK R C R R D R R E R R F R R G R R H R R R R R R R R R R R R
2 pav. Plokštelių užpildymo principas (R – rėmelis, skaičiavimui nenaudotas; TM – tiriamasis mėginys; LK – ląstelių kultūros kontrolė)
1) Į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilta 100 µl ląstelių suspensijos.
2) Po 24 val. atlikti dukartiniai mėginių skiedimai su DMEM, į atitinkamus šulinėlius įpilta 50 µl tiriamojo mėginio.
29
Ląstelių apoptozės nustatymas
Ląstelių gyvybingumas nustatytas po 24 val., dažant kristaliniu violetiniu (KV) (Carl Roth GmbH, Vokietija). Metodas pagrįstas KV dažo prisijungimu prie baltymo. Atšokusios, negyvybingos ląstelės nupiltos, likusios ląstelės praplautos 0,9 proc. fiziologiniu tirpalu, 10 min. fiksuotos 96° etanoliu ir dažytos 40 µl 0,05 proc. kristalinio violetinio tirpalo 20 ml etanolyje. Po 20 min. dažas nupiltas, 5 – 7 kartus praplauta vandeniu ir eliujuota 50 µl 0,1 proc. acto rūgšties vandeniniu tirpalu 50 ml etanolyje. Gyvybingų ląstelių skaičius nustatytas išmatuojant tirpalo optinį tankį, esant bangos ilgiui – 540 nm ir 620 nm, spektrofotometru Multiskan MS (Suomija).
Ląstelių proliferacijos nustatymas
Metabolitinis gyvų ląstelių aktyvumas nustatytas MTT metodu, panaudojus 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromidą (Sigma, Vokietija). Ląstelės paveikiamos MTT, kuris yra nuo NAD(P)H priklausomos oksidoreduktazės substratas. Susidariusio netirpaus metabolito (formazano) kristalų kiekis yra tiesiogiai proporcingas gyvų ląstelių skaičiui. Po 24 val. nupylus nuo ląstelių terpę, į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilta po 20 µl 0,5 mg/ml MTT fosfatiniame buferyje tirpalo. Inkubuota 3 val. 37°C temperatūroje. Po to į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilta po 100 µl 96° etanolio ir išmaišoma pipetuojant. Ląstelių mitochondrijose yra dehidrogenazės, kurios MTT dažą redukuoja į formazaną, kuris yra spalvotas ir ištirpinamas. Metabolitinis gyvų ląstelių aktyvumas nustatytas išmatuojant tirpalo optinį tankį, esant bangos ilgiui – 540 nm ir 580 nm, spektrofotometru Multiskan MS (Suomija).
Siloso citotoksinis poveikis įvertintas, lyginant tiriamųjų mėginių ir testavimui panaudotų grynų ląstelių kultūrų duomenis – IC50 verte. IC50 laikoma teigiama, kai ląstelių žūtis didesnė negu 50 proc.
2.12. Statistinis duomenų įvertinimas
30
3. TYRIMO REZULTATAI
Atliktame tyrime buvo siekiama išsiaiškinti ir įvertinti vaistinių augalų: paprastojo čiobrelio (Thymus vulgaris) ir paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) vandeninių ir etanolinių ekstraktų panaudojimą, užtikrinant ir pagerinant silosuojamų pašarų saugą ir kokybę. Tyrimo metu tirti siloso mėginiai, į kuriuos buvo įterpti (įmaišyti) vaistinių augalų vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai, gauti duomenys palyginti tarpusavyje ir su kontroliniais mėginiais.
3.1. Siloso, pagaminto iš skirtingų augalų rūšių, sausųjų medžiagų kiekis ir pH
Sausosios medžiagos – tai procentinė pašaro dalis, kurioje nėra vandens. Drėgmės kiekis pašaruose priklauso nuo pasėlių rūšies, augalo fiziologinės būklės ir sezono (20). Gaminant silosą iš viso augalo, svarbu jį nupjauti tokiu tarpsniu, kad būtų sukaupęs nuo 27 iki 37 proc. SM (1).pH – tai parametras geriausiai nusakantis siloso kokybę, taip pat siloso fermentavimo ir konservavimo kokybę (20). Siloso fermentacijos kokybės rodikliai, pH, bendrasis rūgščių ir atskirų rūgščių kiekis priklauso nuo siloso gamybos technologijos (1). Geros fermentacijos silose pH tūrėtų būti nuo 3,7 – 4,5 (13).
5 lentelė. Siloso mėginių sausųjų medžiagų kiekis ir pH
Žolių siloso mėginys SM, proc. pH
Varpinės žolės - kontrolė 21 6,12
Varpinės žolės - raudonėlio VE 33 6,68
Varpinės žolės - raudonėlio EE 33 4,82
Varpinės žolės - čiobrelio VE 31 5,06
Varpinės žolės - EE 32 4,35
Varpinės žolės - komercinis preparatas X 37 4,47
Varpinės žolės - komercinis preparatas Y 36 4,48
Raudonasis dobilas - kontrolė 30 4,37
Raudonasis dobilas - raudonėlio VE 30 4,65
Raudonasis dobilas - raudonėlio EE 38 4,13
Raudonasis dobilas - čiobrelio VE 28 5,05
Raudonasis dobilas - čiobrelio EE 57 5,43
31 5 lentelės tęsinys.
Žolių siloso mėginys SM, proc. pH
Raudonasis dobilas - komercinis preparatas Y 39 4,09
Mėlynžiedė liucerna - kontrolė 27 4,90
Mėlynžiedė liucerna - raudonėlio VE 56 4,30
Mėlynžiedė liucerna - raudonėlio EE 50 4,42
Mėlynžiedė liucerna - čiobrelio VE 37 4,53
Mėlynžiedė liucerna - čiobrelio EE 36 3,88
Mėlynžiedė liucerna - komercinis preparatas X 53 5,28 Mėlynžiedė liucerna – komercinis preparatas Y 46 3,68
Tyrimo metu buvo nustatytas sausųjų medžiagų kiekis procentais ir siloso pH. Tirtuose mėginiuose sausųjų medžiagų kiekis svyravo nuo 21 proc. iki 57 proc. Mažiausias sausųjų medžiagų kiekis – 21 proc. buvo nustatytas varpinių žolių kontroliniame mėginyje, o didžiausias – 57 proc. raudonųjų dobilų siloso mėginyje su čiobrelio EE.
pH tirtuose mėginiuose svyravo nuo 3,68 iki 6,68. Mažiausias pH buvo nustatytas mėlynžiedės liucernos mėginyje su komerciniu preparatu Y – 3,68, didžiausias – varpinių žolių mėginyje su raudonėlio VE – 6,68 (6 lentelė).
3.2. Bendras mikroorganizmų skaičius silose
Tyrimo metu buvo nustatytas siloso mėginiuose esantis bendras mikroorganizmų skaičius. 3, 4 ir 5 pav. grafiškai pavaizduotas siloso mėginiuose su vaistinių augalų vandeniniais ir etanoliniais ekstraktais nustatytas bendras mikroorganizmų skaičius, nurodytas kolonijas sudarančių vienetų grame (ksv/g).
3 pav. Bendras mikroorganizmų skaičius varpinių žoliu silose 0 100 200 300 400 500 600 700 Kontrolė Raudonėlio vandeninis ekstraktas Raudonelio etanolinis ekstraktas Čiobrelio vandeninis ekstraktas Čiobrelio etanolinis ekstraktas Komercinis preparatas X Komercinis preparatas Y 234 308 442 652 310 262 207 x1 0³ K sv /g
32 Atlikto tyrimo metu didžiausias mikroorganizmų skaičius nustatytas varpinių žolių siloso mėginyje, panaudojus čiobrelio VE, jis siekė 652x103 ksv/g. Mažiausias bendras mikroorganizmų skaičius buvo nustatytas mėginyje įterpus komercinį preparatą Y – 207x103 ksv/g. Siloso mėginyje su čiobrelio VE buvo nustatyta 64,2 proc. (p<0,05) daugiau mikroorganizmų lyginant su kontroliniu siloso mėginiu.
Mėginyje su raudonėlio VE mikroorganizmų skaičius siekė 308x103 ksv/g, tai yra 30,3 proc. (p>0,05) mažiau lyginant su mėginyje panaudotu raudonėlio EE – 442x103 ksv/g (3 pav.).
4 pav. Bendras mikroorganizmų skaičius raudonųjų dobilų silose
Didžiausias mikroorganizmų skaičius buvo nustatytas raudonųjų dobilų siloso kontroliniame mėginyje – 241x103 ksv/g. Lyginant su kontroliniu mėginiu, siloso mėginyje su raudonėlio EE buvo nustatytas 9,2 proc. (p<0,05) mažesnis mikroorganizmų skaičius.
Mėginyje su čiobrelio EE buvo nustatytas mažiausias mikroorganizmų skaičius – 37x103 ksv/g, lyginant su kontroliniu mėginiu, 84,7 proc. (p>0,05) mažesnis (4 pav.).
5 pav. Bendras mikroorganizmų skaičius mėlynžiedės liucernos silose 0 50 100 150 200 250 Kontrolė Raudonėlio vandeninis ekstraktas Raudonelio etanolinis ekstraktas Čiobrelio vandeninis ekstraktas Čiobrelio etanolinis ekstraktas Komercinis preparatas X Komercinis preparatas Y 241 107 219 63 37 141 107 x1 0³ K sv /g
Bendras mikroorganizmų skaičius
0 20 40 60 80 100 120 Kontrolė Raudonėlio vandeninis ekstraktas Raudonelio etanolinis ekstraktas Čiobrelio vandeninis ekstraktas Čiobrelio etanolinis ekstraktas Komercinis preparatas X Komercinis preparatas Y 45 19 50 76 101 10 119 x1 0³ K sv /g
33 Siloso mėginyje su įterptu komerciniu preparatu Y buvo nustatytas didžiausias mikroorganizmų skaičius – 119x103 ksv/g, mažiausias - įterpus komercinį preparatą X – 10x103 ksv/g. Panaudojus raudonėlio VE buvo nustatytas sumažėjęs mikroorganizmų skaičius, jis siekė 19x103 ksv/g, tai yra 2,4 (p<0,05) karto mažiau palyginus su kontroliniu siloso mėginiu – 45x103 ksv/g (5 pav.).
3.3. Pienarūgščių bakterijų kiekis
6 pav. Varpinių žolių silose esantis pienarūgščių bakterijų kiekis
Didžiausias pienarūgščių bakterijų kiekis buvo nustatytas varpinių žolių silose mėginyje panaudojus raudonėlio EE – 111x103ksv/g. Mažiausias kiekis nustatytas mėginyje įterpus komercinį preparatą Y – 33x103 ksv/g.
Lyginant su kontroliniu siloso mėginiu – 83x103 ksv/g, mažiausias kiekis pienarūgščių bakterijų buvo rastas dviejuose mėginiuose: silosą veikiant raudonėlio VE – 57x103 ksv/g (p>0,5) ir čiobrelio EE – 56x103 ksv/g (p>0,5) (6 pav.).
34 Atlikus tyrimą buvo nustatyta, jog didžiausias pienarūgščių bakterijų kiekis nustatytas kontroliniame siloso mėginyje – 230x103ksv/g. Pienarūgščių bakterijų kiekis lyginant su kontroliniu siloso mėginiu ženkliai sumažėjo – 92,6 proc. (p<0,05) panaudojus raudonėlio EE.
Panaudojus čiobrelio EE lyginant su čiobrelio VE, pienarūgščių bakterijų kiekis sumažėjo 1,3 karto (p>0,05) (7 pav.).
8 pav. Mėlynžiedės liucernos silose esantis pienarūgščių bakterijų kiekis
Mėlynžiedės liucernos silose įterpus čiobrelio EE buvo nustatytas didžiausias pienarūgščių bakterijų kiekis – 113 x103ksv/g. Mažiausias kiekis buvo rastas mėginyje panaudojus raudonėlio VE – 20x103ksv/g, lyginant su kontroliniu siloso mėginiu – 72 x103ksv/g, pienarūgščių bakterijų kiekis sumažėjo 72,3 proc. (p>0,05).
Pienarūgščių bakterijų kiekį mėlynžiedės liucernos siloso mėginiuose sumažino raudonėlio VE – 20x103ksv/g ir raudonėlio EE – 23x103ksv/g (8 pav.).
3.4. Mikroskopinių grybų kiekis silose
35 Varpinių žolių siloso mėginyje įterpus komercinį preparatą Y buvo nustatytas didžiausias gyvybingų mikroskopinių grybų kiekis – 12x103 ksv/g, šiame silose vyravo Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Rhizopus spp. ir Mucor spp. genčių mikroskopiniai grybai. Dvigubai mažesnis mikroskopinių grybų kiekis buvo nustatytas mėginyje panaudojus raudonėlio EE – 6x103 ksv/g, buvo nustatyti Penicillium spp., Apergilus spp., Rhizopus spp. ir Acremomilla spp. genčių mikroskopiniai grybai.
Atlikus tyrimą trijuose varpinių žolių siloso mėginiuose: kontroliniame, mėginyje su įterptu raudonėlio VE ir čiobrelio EE mikroskopiniųgrybų nebuvo nustatyta (9 pav.).
10 pav. Raudonųjų dobilų siloso mėginiuose nustatytas gyvybingų mikroskopinių grybų kiekis Didžiausias mikroskopinių grybų kiekis buvo nustatytas mėginyje su čiobrelio EE ir mėginyje su įterptu komerciniu preparatu Y, juose buvo nustatyti Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Rhizopus spp. Cladosporium spp. ir Mucor spp. genčių mikroskopiniai grybai.
Mėginyje su raudonėlio VE mikroskopinių grybų nebuvo nustatyta (10 pav.).
36 Mėlynžiedžių liucernų siloso mėginyje su čiobrelio EE buvo nustatytas didžiausias mikroskopinių grybų skaičius, buvo nustatyti Aspergillus sp., Fusarium spp., Penicillium spp., Rhizopus spp., Chromelosporium spp. ir Mucor spp. genčių mikroskopiniai grybai.
Mėginiuose panaudojus komercinį preparatą Y bei raudonėlio VE ir EE mikroskopinių grybų nebuvo nustatyta (11 pav.).
3.5. Mielių kiekis silose
12 pav. Varpinių žolių silose nustatytas mielių kiekis
Atlikus tyrimą, didžiausias mielių kiekis buvo nustatytas varpinių žolių silose su raudonėlio EE, jis siekė 29x103 ksv/g, mažiausias kontroliniame siloso mėginyje – 1x103ksv/g. Mėginiuose su raudonėlio VE ir čiobrelio EE mielių nebuvo nustatyta (12 pav.).
13 pav. Raudonųjų dobilų silose nustatytas mielių kiekis
Didžiausias mielių kiekis buvo nustatytas raudonųjų dobilų silose su komerciniu preparatu Y – 75x103 ksv/g. Mažiausias kontroliniame siloso mėginyje - 1x103 ksv/g.
