LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Aistė Krugelevičienė
TOKSIKOGENINIAI MIKROMICETAI IR JŲ
GAMINAMI MIKOTOKSINAI ARBATOSE
TOXICOGENIC FUNGI AND THEIR MYCOTOXINS
IN TEA
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: doc. dr. Violeta Baliukonienė
2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas: TOKSIKOGENINIAI MIKROMICETAI IR JŲ GAMINAMI MIKOTOKSINAI ARBATOSE
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(data) (katedros vedėjo/jos vardas pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Arbata ir jos cheminė sudėtis ... 10
1.2 Arbatos klasifikacija ... 12
1.3 Vaistažolės ... 12
1.3 Arbatos gamyba ... 18
1.3.1 Juodosios arbatos gamyba ... 18
1.3.2 Vaistažolių džiovinimas ... 19
1.4 Mikromicetai ... 21
1.4.1 Pagrindinių mikromicetų genčių apibūdinimas... 21
1.4.2 Dažniausiai arbatose aptinkami mikromicetai ... 23
1.5 Mikroskopinių grybų antriniai metabolitai – mikotoksinai ... 24
1.5.1 Pagrindiniai mikotoksinai ... 24
1.5.2 Arbatose randami mikotoksinai ... 27
1.5.3 Mikotoksinų leistinos normos ... 30
2. TYRIMO METODIKA ... 31
2.1. Tyrimo objektai ... 31
2.2 Mikroskopinių grybų gyvybingų sporų skaičiaus (kolonijas sudarančių vienetų) nustatymas skiedimo metodu ... 32
2.3 Mikotoksikologinis tyrimas ... 32
2.4 Statistinis duomenų įvertimas ... 34
3. TYRIMO REZULTAI ... 35
3.1 Juodųjų ir vaistažolių arbatų užkrėstumas mikromicetais ... 35
3.1.1 Lietuvoje auginamų vaistažolių užsikrėtimas toksikogeniniais mikromicetais ... 35
3.1.2 Mikromicetų įvairovė Lietuvoje realizuojamose arbatose (juodosiose ir vaistažolių) ... 38
3.2 Juodųjų ir vaistažolių arbatų užterštumas mikotoksinais ... 41
3.2.1 Aflatoksino B1 koncentracija (µg/kg) arbatose (juodosiose ir vaistažolių) ... 41
3.2.2 Zearalenono koncentracija (µg/kg) arbatose (juodosiose ir vaistažolių) ... 42
3.2.3 Deoksinivalenolio koncentracija (µg/kg) arbatose (juodosiose ir vaistažolių) ... 43
4
3.2.5 Ochratoksino A koncentracija (µg/kg) arbatose (juodosiose ir vaistažolių) ... 44
4.TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 45
IŠVADOS ... 47
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49
5
SANTRUMPOS
AFL – aflatoksinai (bendrai)
AFL B1 – aflatoksinas B1 DON – deoksinivalenolis FB – fumonizinai (bendrai) OTA – ochratoksinas A OT – ochratoksinai (bendrai) T–2 – T-2 toksinas ZEN – zearalenonas
6
SANTRAUKA
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Veterinarijos akademija
Veterinarijos fakultetas
TOKSIKOGENINIAI MIKROMICETAI IR JŲ GAMINAMI
MIKOTOKSINAI ARBATOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: doc. dr. Violeta Baliukonienė
Apimtis: 52 puslapiai, 15 paveikslų, 5 lentelės, 2 priedai.
Darbo tikslas: įvertinti Lietuvoje auginamų vaistažolių bei realizuojamų juodųjų ir vaistažolių arbatų užsikrėtimą toksikogeniniais mikromicetais ir jų užterštumą mikotoksinais.
Eksperimento metu buvo atliktas gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičiaus (kolonijas sudarančių vienetų) nustatymas skiedimo metodu bei mikotoksikologinis tyrimas. 22 mėginiai buvo paimti iš prekybos centrų ir vaistinių: 9 - juodosios arbatos mėginiai (birios ir pakeliuose), 13 – vaistažolių arbatų mėginiai (birios ir pakeliuose). Atlikus tyrimus, nustatyta, kad Lietuvoje auginamų vaistažolių arbatose vyravo toksikogeniniai Aspergillus spp., Penicilium spp. ir
Mucor spp. genčių mikromicetai. Labiausiai Aspergillus spp. genties mikromicetais užkrėsta melisų
biri arbata - 4,0x103 KSV/g, mažiausiai – ramunėlių arbata pakeliuose, biri mėtų arbata ir biri medetkų arbata - 0,5x103
KSV/g, 0,5x103 KSV/g, 0,5x103 KSV/g, atitinkamai. Penicilium spp. genties mikromicetais labiausiai užkrėsta čiobrelių biri arbata - 2,5x103
KSV/g, mėtų, aviečių lapų, ir liepų žiedų biriose arbatose šios genties mikromicetų nebuvo nustatyta. Mucor spp. genties mikromicetais labiausiai užkrėsta aviečių lapų biri arbata – 9,5x103
KSV/g, mėtų ir liepų žiedų biriose arbatose šios genties mikromicetų nebuvo nustatyta.
Lietuvoje realizuojamose juodosiose arbatose nustatyta vyraujanti Aspergillus spp. mikromicetų gentis. Realizuojamose vaistažolių arbatose vyravo Aspergillus spp. ir Penicilium spp. gentys.
Vaistažolių arbatos bei juodosios arbatos užterštos aflatoksino B1, zearalenono, deoksinivalenolio, T-2 tokino, ochratosino A mikotoksinais. Didžiausia koncentracija nustatyta zearalenono (ZON) ir deoksinivalenolio (DON) mikotoksinų (didžiausia ZON koncentracija nustatyta melisų arbatoje pakeliais - 1000 µg/kg, didžiausia DON koncentracija nustatyta juodojoje arbatoje – „Madras“ - 800 µg/kg).
7
SUMMARY
Lithuanian University of Health Science Veterinary Academy
Faculty of Veterinary
TOXICOGENIC FUNGI AND THEIR MYCOTOXINS IN TEA
Master's thesis
Supervisor: Assoc. Dr. Violeta Baliukoniene Volume: 52 pages, 15 pictures, 5 tables, 2 affixes.
The aim of the study: to evaluate the herbs grown in Lithuania and disposed of black and herbal teas toxicogenic fungal infection and mycotoxin contamination.
During the experiment was carried out viable fungi spores (colony forming units) setting dilution method and mycotoxicological study. 22 samples were collected from supermarkets and pharmacies: 9 - black tea samples (bulk and tea bags), 13 - herbal tea samples (bulk and tea bags). It was determined that herbal teas grown in Lithuania prevailed toxicogenic Aspergillus spp., Penicillium spp. and Mucor spp. fungi. The highest
Aspergillus spp. contaminated in lemon balm bulk tea - 4.0x103 cfu/g, at least - chamomile tea bags, mint bulk tea and marigold bullk tea - 0.5x103 cfu/g, 0.5x103 cfu/g, 0.5x103 cfu/g, respectively. The highest Penicillium spp. contaminated in thyme bulk tea - 2.5x103 cfu/g, mint, raspberry leaf, linden blossom bulk teas this genus fungi were not found. Mucor spp. most contaminated in raspberry leaf bulk tea - 9.5x103 cfu/g, mint and linden blossom bulk teas this genus fungi were not found.
In Lithuania realizing black teas established the prevailing Aspergillus spp., herbal teas dominated by Aspergillus spp. and Penicillium spp.
Herbal teas and black teas contaminated with aflatoxin B1, zearalenone, deoxynivalenol, T-2 toxin, ochratoxin A. The highest concentration was zearalenone (ZEA) and deoxynivalenol (DON) mycotoxins (the highest ZEA concentration was found in lemon balm tea bags - 1000 µg/kg, the highest DON concentration was found in black tea – “Madras” - 800 µg/kg).
8
ĮVADAS
Arbata yra vienas iš populiariausių gėrimų visame pasaulyje, tai antras po vandens dažniausiai vartojamas gėrimas. Išskiriamos trys pagrindinės arbatos rūšys - žalioji, Ulongo ir juodoji. Visos jos pasižymi skirtingu aromatu, skoniu, spalva ir išvaizda. Juodoji arbata pupuliaresnė Vakarų šalyse, nei žalioji ar Ulongo arbata (Parmar Namita et al., 2012).
Arbatoje randama polifenolių, alkaloidų, chlorofilų, lakiųjų organinių junginių, taip pat yra vertingų maisto medžiagų (angliavandenių, baltymų, amino rūgščių, mineralinių medžiagų, vitaminų ir kt.). Polifenoliai pasižymintys savo antioksidacinėmis savybėmis, mažina širdies ir kraujagyslių ligų riziką, padeda apsisaugoti nuo vėžio, aterosklerozės, įvairių uždegimų, diabeto. Todėl arbatos ekstraktai, ypač vaistažolių yra plačiai naudojami vaistiniuose preparatuose. Vaistažolės perdirbamos į eterinius aliejus, kvapiąsias medžiagas, ekstraktus ir naudojama farmacijos pramonėje, kvepalų, kosmetikos, interjero ir maisto gamyboje (Moré et al., 2007). Vaistažolių arbatos, nuovirai dažniausiai naudojamos sutrikus sveikatai, pavyzdžiui virškinimo sutrikimams padeda mėtos, melisos, peršalus – čiobreliai, liepų žiedai, aviečių lapai. Dilgėlės pasižymi kraujavimą stabdančiu poveikiu, didina hemoglobino kiekį. Priešuždegimiškai veikia ramunėlės, medetkos. Mėtos, čiobreliai paskanina įvairius valgius, desertus.
Arbatose be minėtų medžiagų aptinkama ir visai nepageidaujamų komponentų, tokių kaip mikromicetai ir jų gaminami mikotoksinai. Dažniausiai arbatose randami mikromicetai priklauso
Aspergillus spp., Penicillum spp., Mucor spp. bei Fusarium spp. gentims. Iš Aspergillus spp. genties
labiausiai paplitusios Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus
carbonarius, iš Penicillum spp. - Penicillium verrucosum rūšys. Dažniausiai išskiriami
mikotoksinai tai aflatoksinai (AFL), ochratoksinai (OT) bei fumonizinai (FB1, FB2). Šie gali sukelti infekcijas žmonėms ir gyvūnams, pavyzdžiui, kai kurios Aspergillus rūšys sukelia išorinės ausies uždegimus, odos pažeidimus, opas. Ochratoksinas yra toksiškas kepenims ir pasižymi slopinančiomis savybėmis imuninei sistemai. Fumonizinai gali sukelti stemplės vėžį ar sukelti kepenų pažeidimus. Pavojingiausiais pripažinti mikotoksinai - aflatoksinas B1 ir ochratoksinas A.
Žinoma, kad sudžiovintose arbatžolėse ar vaistažolėse mikromicetų ir mikotoksinų kiekis yra žymiai mažesnis nei žalioje žaliavoje, o užplikius arbatą jų kiekiai dar sumažėja. Tačiau vis vien arbatų gėrimai turėtų būti vartojami saikingai ir geriausia išgerti iki dviejų puodelių arbatos per dieną. Kad išvengti didesnio mikromicetų dauginimosi, arbatžolės tūtėtų būti laikomos ne ilgiau kaip vienerius metus, vėsioje, sausoje, tamsioje vietoje.
9 Darbo tikslas: įvertinti Lietuvoje auginamų vaistažolių bei realizuojamų juodųjų ir vaistažolių arbatų užsikrėtimą toksikogeniniais mikromicetais ir jų užterštumą mikotoksinais.
Darbo uždaviniai:
1. Išaiškinti Lietuvoje auginamų vaistažolių užsikrėtimą toksikogeniniais mikromicetais; 2. Nustatyti, vyraujančių genčių mikromicetų įvairovę Lietuvoje realizuojamose juodosiose ir
vaistažolių arbatose;
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Arbata ir jos cheminė sudėtis
Arbata tai visžalis krūmas arba medis, kilęs iš Arbatmedinių šeimos, priklausantis Camelia genčiai, Camellia sinensis rūšiai. Gimtoji šalis Pietryčių Azija. Arbatos lapai yra tamsiai žalios spalvos, blizgūs, žiedai - dideli, balti, rožiniai arba raudoni ir vaisiai - maži ir rudi.
Dvi pagrindinės botanikos veislės apima: Kinų arbatos krūmą (Camelia sinensis) ir Indijos arbatmedį (Camelia assamica). Arbata yra auginama daugelyje šalių, tačiau daugiausia Kinijoje, Indijoje, Japonijoje ir Ceilone. Derliaus nuėmimas trunka ištisus metus. Arbatos lapų kokybę įtakoja metų laikas. Geriausia arbata yra iš taip vadinamos pavasario kolekcijos, nes tuomet ji aromatingiausia ir vadinama aukščiausios rūšies arbata. Arbatos rūšių gaminama daugiau nei tris šimtai. Trys pagrindinės arbatos rūšys - žalioji, Ulongo ir juodoji. Visos jos turi skirtingas kokybės charakteristikas, įskaitant aromatą, skonį, spalvą ir išvaizdą.
Pasaulyje pagaminama ir suvartojama 78 proc. juodosios arbatos, 20 proc. žaliosios ir mažiau nei 2 proc. Ulongo arbatos. Juodoji arbata daugiausia suvartojama Vakarų šalyse, kai kuriose Azijos šalyse, o žaliosios arbatos daugiausia suvartojama Kinijoje, Japonijoje, Indijoje ir kai kuriose Šiaurės Afrikos ir Artimųjų Rytų šalyse. Ulongo arbatos gamyba ir vartojimas yra tik pietryčių Kinijoje ir Taivane. Kukicha (šakelių arbata) taip pat yra nuskinama nuo C. sinensis, tačiau naudojamos šakelės ir stiebai, bet ne lapai (Parmar Namita et al., 2012).
11
C šaltinis (Mukhtar, H. and N. Ahmad, 2000). Polifenoliai oksidacijos apdorojimo metu jungiasi į katechinų ir galo rūgšties kompleksus, tokius kaip teaflavinai, teaflavininės rūgštys, tearubiginai ar į proantocianidinius polimerus (Lee et al., 2008). Juodoji arbata yra laikoma antioksidantų šaltiniu, tokių kaip teaflavino ir tearubigino kartu su neoksiduotais katechinais. Arbatoje yra daug amino rūgščių. Teaninas yra labiausiai paplitęs ir jis sudaro 50 proc. visų amino rūgščių. Arbatoje taip pat yra angliavandenių, vitaminų A, E, K, P, PP, B grupės vitaminų ir vitamino C. Mineralinės medžiagos sudaro apie 4-9 proc., randama fluoro, kalio, aliuminio, jodo, seleno, nikelio ir mangano. Juodosios arbatos (sausosios medžiagos) cheminės sudėties tyrimas parodė, jog joje yra 7,01 proc. drėgnio, 4,51 proc. žalų riebalų, 15,12 proc. žalių baltymų, 15,33 proc. ląstelienos, 4,86 proc. pelenų (1 lentelė). Mineralinės medžiagos juodojoje arbatoje pateiktos 2 lentelėje (Ali Imran et al., 2013).
1 lentelė. Juodosios arbatos cheminė sudėtis (Ali Imran et al., 2013)
Sudėtis Kiekiai (%) Drėgnis 7,01±0,20 Žali riebalai 4,51±0,06 Žali baltymai 15,12±0,51 Ląsteliena 15,33±1,52 Pelenai 4,86±0,08 Viso alkaloidų 2,55±0,05
2 lentelė. Juodojoje arbatoje esančios mineralinės medžiagos (Ali Imran et al., 2013)
Mineralinės medžiagos (mg/100g) Kalis 1892,5±75,77 Kalcis 330,53±19,65 Natris 7,67±0,38 Magnis 66,90±3,83 Geležis 20,38±0,76 Cinkas 4,19±0,12
12
bendras alkaloidų kiekis įvairiose turkiškos juodosios arbatos mėginiuose siekia nuo 25,97 mg/g iki 26,26 mg/g. Alkaloidų kompoziciniai skirtumai juodojoje arbatoje svyruoja dėl įvairių sąlygų, tokių kaip klimato sąlygos, topografinės vietos ir agronominiai metodai. Be to, lapų laikymo terminas ir lapų skinimo etapas taip pat yra labai svarbūs veiksniai (Erol et al., 2010).
1.2 Arbatos klasifikacija
Arbata klasifikuojama pagal Kinijos ir Japonijos sistemas. Pagal kinišką sistemą, arbata skirstoma į šešias rūšis: Lu-cha (žalioji arbata), Huang-cha (geltonoji arbata), Hei-cha (juodos spalvos arbata, bet ne juodoji arbata), Bai-cha (baltoji arbata), Čing-cha (mėlynoji arbata) ir Hong-cha (raudonos spalvos arbata, numanoma juodoji arbata). Dėl perdirbimo metodo japonų sistema klasifikuoja arbatą į tris grupes: ne fermentuota arbata, pusiau fermentuota arbata ir fermentuota arbata (H. Takayanagi et al., 1985). Arbatos klasifikacija pateikta 3 lentelėje. Kituose šaltiniuose arbata klasifikuojama į: ne fermentuota (žalioji arbata), šiek tiek fermentuota (baltoji ir geltonoji arbatos), pusiau fermentuota (žalsvai mėlyna arbata), visiškai fermentuota (juodoji arba raudonoji arbatos) ir po fermentacijos (Pu-erh) (Jidong, 2009).
3 lentelė. Arbatų klasifikavimas pagal kinišką ir japonišką sistemas (H. Takayanagi et al., 1985)
Kiniška sistema Japoniška sistema
Žalioji arbata ne fermentuota arbata
Geltonoji arbata pusiau fermentuota arbata
Juodos spalvos arbata fermentuota arbata
Baltoji arbata Mėlynoji arbata
Juodoji arbata
1.3 Vaistažolės
13 Ramunėlės (Vaistinė ramunė lot. – Matricaria recutita L.)
Ramunėlė (sinonimai: Chamomilla recutita (L.)) – vaistinis augalas, kuris žydi gegužės – rugpjūčio mėnesiais. Nuo seno žinoma, kad šio augalo žiedai skirti ir vidaus ligoms, ir išoriniams negalavimams gydyti. Ji dar gali būti vadinama remulė, marūna ar tiesiog vaistinė ramunėlė.
Beveik pagrindinė ramunėlės vartojimo sritis – ūminiai ir lėtiniai skrandžio ir dvylikapirštės žarnos negalavimai. Ramunėlės slopina uždegimą, atpalaiduoja spazmus ir mažina dujų susikaupimą organizme. Taip pat skatina prakaito išsiskyrimą, padeda esant kepenų ar tulžies ligoms. Ramunėlių kompresai dezinfekuoja žaizdas, slopina uždegimus. Ramunėlių nuovirai naudingi ir grožio srityje – stabdo odos senėjimą, gydo rankų odą, naikina pleiskanas, stiprina plaukų šaknis. Žiedynai kaupia eterinį aliejų, flavonoidus, gleives, kumarinus, choliną, salicilio rūgštį ir kt. Pagrindinė eterinio aliejaus sudedamoji dalis yra mėlyną spalvą suteikiantis angliavandenilis azulenas (chamazulenas), taip pat yra ir kitų medžiagų, tokių kaip bisabalolis, bisabo oksidas, vitaminų A, B, C, ir karotino. Ramunėlės organizmą teigiamai veikia dėl savo gydomųjų medžiagų komplekso, o ne dėl kurios nors vienos medžiagos, kurią būtų galima išskirti.
Vartojama natūralių žiedų galvučių arbata ar ramunėlių ekstraktas
(http://www.366.lt/index.php?option=com_content&view=article&id=371 prieiga per internetą 2015 – 02 - 17).
Mėtos (lot. Mentha)
14 Melisos (lot. Melissa officinalis)
Melisa – medingas ir vaistinis, daugiametis, 30-80 cm aukščio žolinis augalas. Būdingas citrinos kvapas. Stiebas keturbriaunis, status, šakotas, padengtas plaukeliais. Lapai kotuoti, priešiniai, apvaliai rombiški arba kiaušiniški, negausiai plaukuoti. Žiedai po 3-12 sukrauti viršūninių lapų pažastyse, balti ar rausvi. Žydi liepos-rūgpjūčio mėn. Vaisius – riešutėlis. Lapuose yra nuo 0,02-0,3 proc. eterinio aliejaus (citralis, citronelalis, linalolis, geraniolis), askorbo rūgšties, karotino, apie 5 proc. rauginių medžiagų, organinių rūgščių, flavonoidų. Vartojami užpilai, nuovirai, sirupai bei naudojamos aromatinės vonios. Melisos įeina į virškinimą gerinančių, raminančių vaistažolių mišinių sudėtį. Taip pat jos ektraktai įeina į raminančių vaistų formų sudėtį. Melisa pasižymi raminančiu, skausmą mažinančiu, silpnu antibakteriniu, kraujagysles plečiančiu ir kraujospūdį mažinančiu poveikiu. Gerina apetitą, virškinamojo trakto veiklą, atpalaiduoja žarnyno spazmus, skatina tulžies išsiskyrimą, slopina pykinimą ir vėmimą.
Melisos preparatai vartojami nuo nemigos, padidintam dirglumui gydyti, šalina stiprų galvos skausmą. Jais taip pat gerinamas širdies darbas ir gydomi širdies veiklos sutrikimai. Užpilais ir nuovirais skalaujama burnos ertmė esant dantenų uždegimui ar skaudant dantis. Kompresai dedami esant neuralginiams ir reumatiniams skausmams, gydomos sunkiai gyjančios žaizdos (http://www.e-vaistine.lt/vaistazoles/vaistiniai-augalai/vaistine-melisa prieiga per internetą 2015 – 02 - 17).
Čiobreliai (Paprastasis čiobrelis lot. – Thymus serpyllum L.)
15 Medetkos (Vaistinė medetka lot. - Calendula officinalis)
Tai vienmetis žolinis augalas, užaugantis iki 50 cm aukščio. Turi liemeninę šaknį. Stiebas stačias, šakotas. Lapai pražanginiai, lygiais kraštais, lancetiški. Kraštiniai žiedai geltonos spalvos, o viduriniai - oranžinės, susitelkę graižo formos žiedyne. Žydi birželio-spalio mėnesiais. Augalas kultivuojamas Lenkijoje, Egipte, vengrijoje, Lietuvoje. Vaistinė augalinė žaliava – medetkos žiedai. Kuo daugiau liežuviškų žiedų, tuo žaliava geresnė. Žiedai renkami iki 18 kartų per vasarą. Jose, esantys flavanoidai skatina tulžies išsiskyrimą, todėl šiam tikslui geriami medetkos užpilai ir nuovirai. Šis augalas naudojamas gydyti konjunktyvitą. Medetkos priešuždegiminis ir antibakterinis veikimas ne tik sumažina patinimą, bet ir nužudo kenksmingas bakterijas akį supančioje membranoje. Priešuždegiminis poveikis yra labai svarbus gydant uždegimines virškinimo sistemos ligas: gastritą, opaliges, storosios žarnos uždegimą. Užpilais bei nuovirais skalaujama gerklė sergant angina, faringitu, stomatitu. Medetkos žiedai stimuliuoja kolageno sintezę, kuris veiksmingas prieš raukšles. Triterpeniniai junginiai lemia baktericidinį – žaizdų gijimą skatinantį poveikį. Tepalais ir tinktūromis išoriškai gydomos sunkiai gyjančioms žaizdos, nudegimai. Medetkų arbata turi silpną estrogeninį poveikį, todėl mažina menstruacijų skausmus ir gausų kraujavimą (http://www.infomed.lt/lt/2/Infomed_plius/vaistazoliu_katalogas,id,b0bccfceb3 prieiga per internetą 2015 – 02 – 17).
Liepų žiedai (lot. Tilia cordata)
Mažalapė liepa – daugiametis iki 30 m aukščio medis. Lapai anksti nukrintančiais prielapiais, pražanginiai, ilgakočiai, 2–8 cm ilgio ir maždaug tokio pat pločio, tamsiai žalia apatine puse, kiek blizgantys, pliki arba tiktai prie gyslų su vienu kitu plaukeliu, kiaušiniški arba beveik apskriti, širdišku, dažnai nesimetrišku pamatu, nusmailėjusia viršūne, su ilgais lapkočiais. Žiedai šviesiai geltoni, kvapūs, sukrauti po 5–15 į pusiauskėtiškus žiedynus, su ilgais žiedkočiais, kurie suaugę į vieną bendrą žiedkotį. Kiekvienas žiedynas turi ilgą, pliką, žalsvai gelsvą pažiedlapį (skristuką), kurio pagalba prinokę vaisiai gali nuskristi toliau nuo medžio. Žydi birželio–liepos mėn. Vaisius – rutulio formos riešutėlis. Liepa pražysta apyktiksliai 20–ais savo gyvenimo metais. Gyvena 500– 600 metų. Tai medingas, dekoratyvus ir vaistinis medis. Liepa mėgsta derlingas, drėgnas priesmėlio ir priemolio dirvas. Auga miškuose, pakelėse, sodybose, parkuose. Kitos Lietuvoje augančios Tilia genties rūšys: gauruotoji liepa (Tilia argentea Desf.), plikoji liepa (Tilia
glabra Vent.), plaukuotoji liepa (Tilia pubescens), grakščioji liepa (Tilia euchlora Koch), didžialapė
16
nukarpyti daugiau kaip trečdalį vieno medžio žydinčių šakų), nešamos į pavėsį ir rankomis kartu su pažiedlapiais nuskinami žiedai. Žaliavą sudaro išsiskleidę žiedai, neišsivystę žiedai – butonai ir nesunokę vaisiai – riešutėliai. Džiovinama greitai pavėsyje, gerai vėdinamoje patalpoje ar džiovykloje ne aukštesnėje kaip 35 ºC temperatūroje. Negalima perdžiovinti. Išdžiūvusių žiedų kvapas silpnas, malonus, skonis saldokas, silpnai sutraukiantis. Kartais vartojama ir žievė (Tiliae
cortex). Iš 1 kg žalių žiedų gaunama apie 300 g sausų. Tinka vartoti ne ilgiau kaip 2 metus. Liepos
žieduose yra iki 0,05 proc. eterinio aliejaus, kurio sudėtyje yra alkoholio farnezolio, flavoninio glikozido hesperidino, glikozido tiliacino, saponinų, gleivių, rauginių medžiagų, organinių rūgščių, cukraus, 21 mg% karotino, iki 580 mg% vitamino C. Lapuose yra fitoncidinių medžiagų (http://www.366.lt/index.php?option=com_content&view=article&id=156 prieiga per internetą 2015 – 02 – 17).
Paprastoji avietė (lot. Rubus idaeus)
Paprastoji avietė – daugiametis 60–120 cm aukščio krūmas su dvimečiais stiebais. Stiebas status, apvalus, dygliuotas. Lapai neporiškai plunksniški: apatiniai iš 5–7 lapelių, viršutiniai trilapiai. Lapeliai kiaušiniški, smailūs, nelygiai dantyti, apatinė pusė padengta baltais pūkeliais, viršutinė – plika, tamsiai žalia. Žiedai balti, smulkūs, susitelkę į žiedynus. Žydi birželio-liepos mėn. Vaisiai subręsta liepos–rugpjūčio mėn. Vaisius (uoga) sudėtinis, sudarytas iš smulkių, sultingų, šviesiai raudonų kaulavaisių. Auga drėgnesniuose miškuose, pamiškėse, ypač kirtimuose, paplitusi visoje Lietuvoje. Mėgsta šviesias vietas, derlingus ir drėgnus dirvožemius. Labai dažna. Taip pat soduose auginamos kultūrinės aviečių veislės, tačiau vaistinei žaliavai geriau tinka laukinės. Kitos Lietuvoje augančios Rubus L. genties rūšys: kvapioji avietė (Rubus odoratus L.), šiaurinė avietė (Rubus articus L.), tekšė (Rubus chamaemorus L.), katuogė (Rubus saxatilis L.), gervuogė (Rubus
caesius L.), lazdynlapė avietė (Rubus carylifolius Smith) ir kitos. Prisirpusios aviečių uogos
renkamos (Rubi idaei fructus) liepą–rugpjūtį, lapai (Rubi idaei folium) – birželį–rugsėjį. Uogos džiovinamos paskleistos plonu sluoksniu ant retos medžiagos ar sietų apvytinamos atvirame ore, saulėje, po to džiovinamos krosnyje arba džiovykloje 50 °C temperatūroje. Išdžiūvusios uogos suspaustos saujoje nesukimba ir nenudažo rankos, turi būti be žiedsosčio ir taurelės, 0,75–1,2 cm diametro, kvapios ir saldžios. Iš 1 kg nedžiovintų uogų gaunama 160–180 g sausų. Tinka vartoti 2 metus. Uogas taip pat galima laikyti šaldiklyje –18 °C temperatūroje. Aviečių lapai (Rubi idaei
folium; ankstesnis: Folium Rubi idaei) skinami birželio–rugsėjo mėnesiais, pasirinktinai, augalo
17
rūgšties, karotino, fitosterinų, flavonoidų. Lapuose kaupiamų veikliųjų medžiagų sudėtis panaši. Avietės pasižymi prakaito ir šlapimo išsiskyrimą skatinančiu, karščiavimą ir skausmą mažinančiu, antibakteriniu, priešuždegiminiu, sutraukiančiu poveikiu, mažina cukraus kiekį kraujyje. Aviečių preparatai vartojami sergant peršalimu, gripu, angina, sloga, bronchitu. Dėl kaupiamų rauginių medžiagų pasižymi sutraukiančiomis ir vidurius kietinančiomis savybėmis ir todėl vartojama nuo viduriavimo ir dizenterijos. Taip pat naudojamos prakaito ir šlapimo išsiskyrimui skatinti, apetitui gerinti, virškinamojo trakto veiklai reguliuoti, vėmimui ir kraujavimui stabdyti, gausių menstruacijų atveju, fiziniam ir protiniam aktyvumui skatinti. Kompresai dedami ant negyjančių odos opų, nudegimų, išsiplėtusių venų mazgų. Avietės stiprina organizmą, veikia tonizuojančiai. Aviečių šakelių viršūnės su lapais vartojamos nuo tų pačių ligų, kaip ir uogos. Liaudies medicina avietės uogomis gydo mažakraujystę, aterosklerozę, hipertoniją, virškinamojo trakto ir odos (išbėrimai, spuogai, dermatitas) ligas (http://naturalus.sveikas.lt/lt/naturalus-vaistai/vaistazoles/aviete_paprastoji/prieiga per internetą 2015 – 02 – 17).
Pu-erh
Pu Erh - vaistas nuo įvairių ligų. Pu-erh arbata atrasta Junanio provincijoje.
Pagal tradicinę kintiečių mediciną Pu-erh arbata gerina žmogaus sveikatą, natūraliai valo organizmą, šalina riebalų perteklių, tuo pačiu aprūpindama organizmą reikalingais mineralais, skatina lieknėjimą. Taip pat ji padeda sumažinti cholesterolio kiekį kraujyje. Pu-erh, dėl skonio ir kvapo pagerinimo, gali būti laikoma kelis metus. Kinijoje, Junanio provincijoje, terminu „Pu-erh“ vadinama subrendusi arbatos forma. Dažnai arbata yra ilgą laiką mirkoma ar net verdama (tibetiečiai verda ją per naktį). Kinijoje Pu-erh laikoma medicinine arbata. Pu-erh arbata padeda įveikti viršsvorį, mažina cholesterolio kiekį kraujyje, tonizuoja medžiagų apykaitą kepenyse, greičiau pašalinamas alkoholis, padeda virškinti riebų maistą, šalina šlakus, stiprina imuninę sistemą. Taip pat yra pastebėta, kad ši arbata gali būti geriama infekcinių ligų profilaktikai, ji turi bakteriostatinį poveikį. Pu-erh arbata yra http://www.sveikatosstilius.lt/lt/arbata/pu-erh prieiga per internetą 2015 – 02 – 17).
Dilgėlės (Urtica dioica L.)
18
plaukelis įsminga į odą, nulūžta ir deginantis jo turinys išsilieja į žaizdelę. Ant stiebo daug prisitvirtinusių priešinių, širdiškai kiaušiniškų, nusmailėjusiais galais, dantytų lapų. Lapų pažastyse sukrauti vyriški ir moteriški žiedai, kurie susitelkę į šluoteles. Žydi liepos-spalio mėnesiais. Vaisius - vienasėklis riešutėlis. Lietuvoje labai dažnas augalas. Auga kaip įkyri piktžolė patvoriuose, krūmuose, šiukšlynuose, drėgnesniuose miškuose. Mėgsta derlingus dirvožemius. Be didžiosios dilgėlės Lietuvoje savaime auga dar viena dilgėlių rūšis - gailioji dilgėlė (Urtica urens L.) bei auginama kanapinė dilgėlė (Urtica cannabina L.). Lapuose kaupiami flavonoidai, karotinoidai, chlorofilas, vitaminai (C, K, B grupės), mineralinės medžiagos (kalis, natris, magnis, geležis), organinės rūgštys, aminai. Šakniastiebiuose yra vitamino C, mineralinių medžiagų, raugų, polisacharidų, fenilpropanų. Preparatai iš dilgėlių lapų vartojami kaip polivitamininė žaliava. Taip pat pasižymi kraujavimą stabdančiu poveikiu, didina hemoglobino kiekį (tinka mažakraujystei gydyti), skatina šlapimo išsiskyrimą (http://www.e-vaistine.lt/vaistazoles/vaistiniai-augalai/didzioji-dilgele prieiga per internetą 2015 – 02 – 17).
1.3 Arbatos gamyba
1.3.1 Juodosios arbatos gamyba
Pagal skirtingą fermentacijos būdą arbata skirstoma į tris tipus: ne fermentuota (žalioji), pusiau fermentuota (Ulongo), visiškai fermentuota (juodoji).
Arbatos gamybos procesas, priklausomai nuo jos rūšies susideda iš keturių pagrindinių etapų: lapų surinkimo ir vytinimo, lapų skrudinimo inaktyvuotais oksiduojančiais fermentais, susukimo, džiovinamo ir rūšiavimo. Arbatos skonis ir spalva priklauso nuo surinktų arbatos lapų kokybės, klimato kaitos ir kvalifikuoto arbatos lapų perdirbimo. Juodosios arbatos gamybos procesas yra sudėtingesnis, nei žaliosios. Lapams taip pat taikomas vytinimas per kurį atsiranda pirmieji fermentacijos procesai. Toliau, jie yra suvyniojami ir atliekama fermentacija. Fermentuoti lapai skrudinami, kol tampa tamsiai rudos arba juodos spalvos, bei atsiranda tinkamas aromatas. Skrudinant sustabdoma fermentacija, taip blokuojama fermentų (polifenolio oksidazės ir glikozidazės) veikla (Chu et al., 1997; Lin et al., 1998).
Juodosios arbatos gamybos etapai susideda iš: skinimo, vytinimo, valcavimo, fermentacijos, džiovinimo, sijojimo, atrinkimo ir rūšiavimo, sandėliavimo ir pakavimo.
19
Vytinimas. Ką tik nuskinti arbatos lapai yra paskleidžiami sluoksniais ant didelių sietų. Ventiliatoriais oras nuolat teka per sieto lovelius taip, kad arbatos lapai vystų, taptų minkšti ir lankstūs. Paliekama 12 - 16 val., kol išgaruoja vanduo(maždaug 50 proc. drėgnio).
Valcavimas. Arbatos lapai, valcuojami tarp besisukančių metalinių plokštelių tam skirtomis mašinomis, kurios skaido ląstelių branduolį.
Fermentacija. Po valcavimo, arbata paliekama atvirame ore nuo vienos iki dviejų valandų ant fermentacijos lentelių. Oksidacija įtakoja skonį ir arbatos spalvą. Arbatos lapai vis dar lieka drėgni ir oksiduojasi, kol susiduria su deguonimi, dėl to arbata puodelyje tampa tamsiai rausvai rudos spalvos. Tam tikras fermentacijos laipsnis nusprendžia arbatos spalvos intensyvumą. Kai arbatos lapai yra veikiami ilgo oksidacijos proceso, gaunama labai stipri ir labai tamsios spalvos arbata. Jei norima gauti šviesios spalvos arbatą ar pusiau fermentuotą Ulongo arbatą, oksidacijos procesas nutraukiamas labai ankstyvoje stadijoje.
Džiovinimas. Fermentacijos procesas yra sustabdomas džiovinant arbatos lapus džiovyklose, maždaug 90 °C temperatūroje.
Sijojimas arba rūšiavimas. Mašinos turi pašalinti visus stiebus ir lapų gyslas iš arbatos lapų. Nuo rūšiavimo proceso priklauso arbatos pavadinimas ir tipas. Išskiriami 5 tipai: 1 tipas - lapinė arbata, tam tikros rūšies arbata Kinijoje turi pavadinimą, pavyzdžiui VP, FOP, GFOP, TGFOP, FTGFOP, SFTGFOP, 2 tipas - Pekoe, FBOP, Black Qucha, Black Gunpowder ir t.t., 3 tipas – susmulkinta arbata (GFBOP, GBOP, BOP ir t.t.), 4 tipas - arbata pakeliuose (Fannings, BOPF), 5 tipas - arbatos dulkės (BOPD, PD ir t.t.).
Gamybos išlaidos visų penkių rūšiavimo tipų yra tos pačios. Tačiau 1 tipo arbata kainuoja daugiausiai, o 5 tipo - mažiausiai. 1 tipo arbatos pasižymi stipresniu skoniu.
1.3.2 Vaistažolių džiovinimas
Džiovinimas yra dažniausias ir pagrindinis metodas, norint išsaugoti vaistinius augalus, bei jų vaistines savybes. Džiovinant tam tikras vaistažoles, kurių drėgnis siekia 80 proc., jį pašalinus iš 4 kg žaliavos, išgaunama 1 kg sausosios medžiagos su 11 proc. drėgnio (Joachim Muller and Albert Heindl, 2006).
20
atskiriamos lapų ir kotelių dalys. Lapų dalelės yra džiovinamos, tiesiogiai prijungiant konvejerinę džiovyklą. Mažesnis dalelių dydis - didesnis džiovinimo greitis ir džiovinimo kainos vienetas bei didesnis energijos poreikis vandens pašalinimui. Perdirbimo įmonės naudojančios konvejerines džiovyklas turi daug didesnes investicines sąnaudas nei, kad naudojančios plokščiadugnes džiovyklas. Lapelių dalelių dydis paprastai yra tarp 10 ir 50 mm. Šaknų dalelių ilgis maždaug 10 mm. Žaliava turi būti išdžiovinta iš karto po nupjovimo, kad fermentiniai procesai, spalva ir veikliosios sudedamosios dalys, galėtų būti greitai nustatomos. Po džiovinimo, galima panaudoti sijojimo procesą, kad būtų pašalintos šakelių dalelės.
Skirtingų vaistinių augalų veikliosios medžiagos yra tam tikrose augalo dalyse, kaip pavyzdžiui, lapuose, žieduose, vaisiuose, žievėse ar šaknyse, todėl ir džiovinimo būdas turi būti specialiai tam parinktas. Džiovyklų konstrukcijos turi atitikti tas augalo dalis, kurios bus džiovinamos. Pavyzdžiui, pankolių sėkloms ar kmynams gali būti naudojama tipinė grūdų džiovykla. Žiedams, vaisiams ir šaknims - padėklo džiovyklos ar džiovinimui skirti diržų džiovintuvai.
Po derliaus nuėmimo, tokie procesai kaip žaliavos gabenimas transportu į ūkį ir džiovinimas, dažnai padidina vaistinių augalų užteršimą mikroorganizmais. Kai augalinės medžiagos dalys yra nevėdinamos ir vykdomas automatinis šildymas, dėl oro cirkuliacijos, temperatūros ir drėgmės susidaro palankios sąlygos mikroorganizmų dauginimuisi. Įrodyta, kad didžiausias mikroorganizmų skaičius yra iki derliaus nuėmimo (Graf et al. 2002). Džiovinant žaliavą konvejerine džiovykla sumažinamas pradinis mikroorganizmų skaičius. Bakterijų, pelėsių ir mielių skaičius nuolat mažėja jau džiovinimo metu, džiovinant plokščiadugne džiovykla mikroorganizmų skaičius gali būti sumažintas tik apatiniame sluoksnyje, o viršutiniame - mikroorganizmų skaičius gali būti didesnis (Joachim Muller and Albert Heindl, 2006).
Taip pat dažnai naudojami ir tokie džiovinimo būdai, kaip džiovinimas oru, džiovinimas kvarco smėliu, džiovinimas karštu oru, konvekcine krosnimi, mikrobangų džiovinimas, džiovinimas saulėje, džiovinimas šalčiu. Pirmiausia augalai prieš džiovinimą turėtų būti švarūs, juos reikėtų nuplauti šaltu tekančiu vandeniu ir nusausinti.
21
Džiovinimas kvarco smėliu dažniausiai naudojamas džiovinant žiedlapius. Šio džiovinimo principas - padengti smėliu visą žaliavą. Laikoma šiltoje patalpoje ir tai trunka nuo 2 iki 4 savaičių (James C. Schmidt and Dianne Noland http://www.gardenguides.com/530-harvesting-drying-herbs.html prieiga per internetą 2015 – 02 – 15).
Džiovinimas karštu oru yra žymiai greitesnis būdas išdžiovinti augalus. Šiuo būdu yra naudojamos krosnys, mikrobangų krosnelės. Džiovinama nuo 30 ºC iki 60 ºC ar aukštesnėje temperatūroje (James C. Schmidt and Dianne Noland http://www.gardenguides.com/530-harvesting-drying-herbs.html prieiga per internetą 2015 – 02 – 15).
Džiovinimo metodas, greitis ir temperatūra įtakoja kiekį ir kokybę, aktyvių ingredientų esančių vaistiniuose augaluose. Vis dėlto, džiovinant karštu oru, temperatūra turėtų būti pasirinkta tarp 50 °C ir 60 °C, taip būtų galima išdžiovinti didelį kiekį vaistinių augalų (Rocha R. P. et al., 2011).
1.4 Mikromicetai
1.4.1 Pagrindinių mikromicetų genčių apibūdinimas
Aspergillus spp.
Aspergillus spp. yra gentis, kurią sudaro keli šimtai rūšių, randamų įvairiose klimato zonose,
visame pasaulyje. Aspergillus rūšys yra aerobai ir randamos beveik visoje deguonimi prisotintoje aplinkoje. Paprastai grybai auga ant anglies turinčių substratų, tokių kaip monosacharidai (pavyzdžiui gliukozė) ir polisacharidai (pavyzdžiui amilozė). Aspergillus rūšys aptinkamos ant krakmolingų maisto produktų, tokių kaip duona, bulvės, taip pat ant augalų ir medžių.
Kai kurios Aspergillus rūšys gali sukelti infekcijas žmonėms ir gyvūnams. Tai galėtų būti išorinės ausies uždegimai, odos pažeidimai ir opos. Vienos rūšys yra svarbios komercinių mikrobų raugams, pavyzdžiui alkoholiniams gėrimams, kai netinka iš vynuogių ar salyklinių miežių. Tipiniai mikroorganizmai naudojami gaminant alkoholį, kai mielių Saccharomyces gentis, negali fermentuoti krakmolų. Aspergillus oryzae naudojama suskaidyti krakmolą į paprastesnius cukrus.
22
Penicillum spp.
Penicillium gentis paplitusi natūralioje aplinkoje, taip pat naudojama vaistų ir maisto produktų
gamyboje. Kai kurios gentys gamina penicilino molekulę, kuri yra naudojama kaip antibiotikas, kuris užmuša arba sustabdo tam tikrų rūšių bakterijų augimą. Kitos rūšys naudojamos sūrių gamyboje. Rūšių aptinkama daugiau nei 300.
Penicillium yra visur, ši gentis aptinkama vėsioje aplinkoje ir vidutinio klimato zonoje, dažnai
aptinkamos ten, kur prieinama organinė medžiaga. Tai viena iš pagrindinių priežasčių, maisto gedimui, ypač tokių rūšių kaip Subgenus Penicillium. Daugelis rūšių gamina labai toksiškus mikotoksinus. Kai kurios rūšys turi mėlyną spalvą, paprastai auga ant senos duonos ir suteikia jai mėlyną spalvą, pūkuotą tekstūrą. Penicillium rūšys turi įtakos vaisiams, jų gedimui, pavyzdžiui P.
expansum turi įtakos obuoliams ir kriaušėms, P. digitatum - citrusiniams vaisiams.
Penicillium rūšys į patalpų aplinką patenka iš oro ir dulkių. Šie mikromicetai gali lengvai
transportuotis iš lauko ir augti patalpose, kur yra statybinių medžiagų ar susikaupusio dirvožemio, bei taip gauti maistinių medžiagų, jų augimui (Pitt J. et al., 2000). Penicillium auga, net jei santykinė drėgmė yra maža ir tol, kol yra pakankamai drėgmės tam tikrame paviršiuje. Penicillium rūšys daro žalą mašinoms, degioms medžiagoms, tepalams. Pavyzdžiui, P. chrysogenum, P. steckii,
P. notatum, P. cyclopium ir P. nalgiovensis daro įtaką kurui, P. chrysogenum, P. rubrum ir P. verrucosum gali sugadinti alyvą ir tepalus, P. regulosum daro žalą optiniam ir apsauginiui stiklui.
Mucor spp.
Mucor genties randama maždaug 6 rūšių formų, kurios dažniausiai vyrauja dirvožemyje,
virškinimo sistemoje, augalų paviršiuje ir supuvusiose augalinės kilmės medžiagose. Šios genties kolonijos paprastai yra baltos spalvos ir sparčiai augančios. Terpėje kolonijos gali augti iki kelių centimetrų aukščio. Vyresnio amžiaus kolonijos tampa nuo pilkos iki rudos spalvos dėl sporų vystymosi. Mucor sporos arba sporangiosporos gali būti paprastos arba šakotas.
Mucor rūšis galima atskirti nuo pelėsių genčių, tokių kaip Albsidia, Rhizomucor ir Rhizopus.
23
Fusarium spp.
Fusarium yra didelės genties siūlinių mikromicetų grupė, dažnai vadinama hifomicetai, plačiai
pasiskirstę dirvožemyje ir susiję su augalais. Dauguma rūšių yra nekenksmingos. Kai kurios rūšys gamina mikotoksinus grūdinėse kultūrose, kurios gali turėti įtakos žmonių ir gyvūnų sveikatai, jei jie patenka į maisto grandinę. Pagrindiniai toksinai gaminami Fusarium rūšių yra fumonizinai ir trichotecenai (Howard D. et al., 2003).
Fusarium graminearum dažniausiai užkrečiami miežiai, jei sezono pabaigoje vis dar yra
lietingas periodas. Fusarium miežiams gali sukelti amarą, taip miežiai gali tapti rausvi. F.
graminearum taip pat gali sukelti šaknų puvinį ir sėjinukų amarą.
Fusarium cubense yra augalų patogenai, kurie sukelia taip vadinamą Panamos ligą bananams,
taip pat žinoma kaip bananų fuzariozė.
1.4.2 Dažniausiai arbatose aptinkami mikromicetai
Mikromicetai, paprastai auga nuo 10 °C iki 40 °C temperatūroje, pH 4-8, bei vandens aktyvumas (aw) 0,70, kartais gali augti ant labai sauso paviršiaus. Augimo sąlygos konkrečių mikromicetų rūšių gali skirtis. Mikromicetai gamina antrinius metabolitus – mikotoksinus, kurie sukelia mikotoksikozes.
Nagrinėjant Pu-erh arbatą, kuri gaminama Yunnan provincijoje, pietvakarinėje Kinijoje. Tačiau populiari ir kitose šalyse, kaip funkcinis gėrimas. Teigiama, kad Pu-erh arbata mažina cholesterolio ir lipidų kiekį, taip pat pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Aspergillus niger - pagrindiniai fermentacijos mikromicetai Pu-erh arbatos gamyboje. Fermentacija trunka 48 dienas. Dar ši fermentacija vadinama "Aspergillus fermentacija“. Nustatyta, kad mikromicetų skaičius 16 tradiciškai gaminamų (neekologiškose) biriose Pu-erh arbatose, svyravo nuo 1,0×101
KSV/g iki 2,6×106 KSV/g. 9 ekologiškose biriose arbatose mikromicetų skaičius svyravo nuo 1,0×101 KSV/g iki 5,3×103 KSV/g. 11 arbatos mėginiuose pakeliais mikromicetų skaičius, palyginti nustatytas mažas nuo 1,0×101
KSV/g iki 2,0×102 KSV/g. Arbatos mėginiuose (29 iš 36, 80,5 %) dauguma rasta ‘’juodų aspergilli’’. Labiausiai paplitusi rūšis, nustatyta Aspergillus acidus. Aspergillus
tubingensis, rasta 6 mėginiuose (16,7 %) ir A. niger rasta tik vienoje arbatoje (2,8 %).
Termotolerantinis mikromicetas Aspergillus fumigantus buvo išskirtas gana dažnai iš Pu-erh arbatos mėginių (19; 52,8 %). Kitos Aspergillus rūšys išskirtos iš Pu-erh arbatos mėginių buvo Aspergillus
reptans (2; 5,6 %), taip pat Aspergillus versicolor, Aspergillus ochraceus, Aspergillus penicillioides
24
Egipte atliktas juodosios arbatos tyrimas parodė, kad labiausiai paplitusios gentys yra
Aspergillus, Penicillum ir Eurotium. Nustatytos trisdešimt dvi rūšys, priklausančios 9 gentims.
Labiausiai užteršta arbata, nustatyta „Tayseer“, „Blue Tea Pot“ ir „El-Balabel“. Mažiausia užteršta arbata – „Khan el-Khallily“, „Yaquot“ ir „El-Arosa‘. Nustatyta, kad bendras mikromicetų skaičius arbatose didėjo, didėjant drėgmei. Aflatoksino gamyba iš A. flavus užfiksuota visose arbatos rūšyse po 20 dienų laikymo (45% drėgnis ir 28 °C temperatūra). Didžiausias aflatoksino kiekis nustatytas „Al-Fares“, „Eži-Nasser“, „Lipton‘ ir „Tayseer“ arbatose, mažiausias - „Khan El-Khallily“ ir „Massgeed“ arbatose (H. A. H. Hasan et al., 1993).
Rramunėlių, chrizantemų, apynių, jazminų ir apelsinų žiedų, mairūnų, šaltmėtės, čiobrelių, papajos-mėtų arbatose mikromicetų skaičius siekė 5,8×105 KSV/g. Nustatyta labiausiai užkrėsta ramunėlių arbata - 5,8×105 KSV/g, mažiausiai jazminų - 1,0x105. KSV/g Dažniausiai aptikti mikromicetai vaistažolių arbatose buvo Aspergillus niger, Penicillium spp., Eurotium rubrum, El.
chevalieri, A. flavus, Fusarium spp., Alternaria alternata, ir mielės (V.H. Tournas et al., 2008).
Analizuojant mikromicetų užterštumą Nigerijos vaistažolių arbatose, iš dvidešimt šešių mėginių, iš penkių skirtingų vaistažolių arbatų tipų: nuo viduriavimo, maliarijos, liekninanti, antihipertenzinė ir antidiabetinė, nustayta, kad mikromicetų skaičius svyravo nuo 1,1x102 KSV/g iki 4,5x105 KSV/g. Vyraujančios rūšys - Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium expansum,
Rhizopus stolonifer ir Fusarium solanii. Aspergillus niger pasižymėjo labiausiai (100%), mažiausiai
- Rhizopus stolonifer (10%) (Omogbai, Barry Aigbodion, 2013).
Vaistiniuose augaluose ir vaistažolių arbatose labiausiai dominuojančios mikromicetų gentys, nustatyta: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Absidia, Alternaria, Cladosporium ir
Trichoderma (M. Halt, 1998).
1.5 Mikroskopinių grybų antriniai metabolitai – mikotoksinai 1.5.1 Pagrindiniai mikotoksinai
Mikotoksinai – tai antriniai mikroskopinių grybų metabolitai, kuriuos išskiria mikroskopiniai grybai, kaip reakcija į augalų junginius (dikumarolį) ar pakitusias aplinkos sąlygas (Yiannikouris et al., 2002). Svarbiausi mikotoksinai yra aflatoksinas (AFL), ochratoksinas A (OTA), zearalenonas (ZEN), deoksinivalenolis (DON), T-2 toksinas ir fumonizinai. AFL gamina Aspergillus genties (ypač A. flavus, A. parasiticus, A. nomius) mikromicetų grupė. OTA daugiausia gamina Penicillium
verrucosum, Aspergillus ochraceus ir Aspergillus carbonarius, o ZEN, DON, fumonizinai ir T-2
25
teratogeninį poveikį imuninei sistemai. Pripažinta apie 400 skirtingų mikotoksinų. Du pagrindiniai mikotoksinai keliantys riziką žmonių sveikatai yra aflatoksinas B1 ir ochratoksinas A.
Mikotoksinai kelia pavojų žmonių sveikatai, vartojant grūdus ir gyvūnų maistą, kaip pavyzdžiui, pieną, mėsą ir kiaušinius. Mikotoksinai gali slopinti žmogaus imuninė sistemą ir kraujodaros sistemas, gali kilti neuroendokrininiai sutrikimai, gali būti sutrikdoma kepenų ir inkstų veikla. Mikotoksinai taip pat gali sukelti endemines ligas. Įrodyta, kad mikotoksinai, gali sukelti vėžį, genų mutageninį poveikį (Jin-Yin Wu et. al., 2014).
Aflatoksinai (AFL)
Aflatoksinai yra policiklinių steroidų junginiai. Šiuos toksinus išskiria Aspergillus flavus ir
Aspergilus parasiticus. Pagrindiniai mikotoksinai yra aflatoksinas B1 ir aflatoksinas B2, aflatoksinas
G1 ir G2 ir aflatoksinas M1 yra oksiduoti metabolitai iš aflatoksino B1 (Gallo, 2007). Yra žinoma,
kad aflatoksinas B1 yra hepatotoksiškas, labiausiai pasižymi teratogeniniu veikimu, imunotoksiniu,
genotoksiniu. Aflatoksinai yra labai kenksmingi mutagenai ir kancerogenai (Milita et al., 2010). Tai dažniausiai iššaukia kepenų vėžį (Liu ir Wu, 2010).
Po aflatoksino B1 toksiškumo toliau seka M1> G1> B2> G2. Toksikokinetinė analizė AFLB1 atskleidė, kad jis gali būti lengvai absorbuojamas virškinimo trakte ir pilvaplėvėse. Kinijoje, AFB1 koncentracija grūduose (pvz. kukurūzuose) ir jų produktuose turėtų būti ne daugiau kaip 5 x 10-3 mg/kg (Jin-Yin Wuet al., 2014).
Aflatoksinų kiekis žolelių preparatuose: gamybos metu buvo aptikta aflatoksinų (AFB1), kurie buvo pagaminti iš 20 Aspergillus flavus padermių, kiekiai svyravo tarp 0,09 ir 0,88 mg/kg. Roy ir kiti mokslininkai taip pat aptiko aflatoksinų, kurie užteršė vaistinius augalus. Iš 15 analizuotų mėginių, 14 buvo teigiami, aflatoksinų kiekiai svyravo nuo 0,09 µg/g Acacia katechu ir 1,20 µg/g Piper nigrum.
Deoksinivalenolis (DON)
26
Didwania ir Manisha Joshi,2013).
DON užterštas maistas gali sukelti ūmaus apsinuodijimo simptomus, pavyzdžiui anoreksiją, vėmimą, viduriavimą, karščiavimą, žmogus tampa nestabilios būklės, uždelsiamas reagavimas. Manoma, kad DON gali tiesiogiai sukelti DNR pažeidimus ir ląstelių apoptozę. Kinijoje, DON kiekis turėtų būti ne daugiau kaip 1 mg/kg kviečiuose ir kukurūzuose (Jin-Yin Wu et al., 2014).
T–2 toksinas
T–2 toksinas yra vienas toksiškiausių trichotecenų tipo toksinas (Biomin Gmbh, 2008). A grupės trichotecenai yra toksiškesni už B grupės trichotecenus (Hope, Aldred, Magan, 2005).
Svarbiausi A grupės yra T-2 ir HT-2 toksinai, kuriuos sintetina Fusarium equiseti, F. langsethiae,
F. poae, F. sporotrichioides. Šios rūšies grybų produkuojami mikotoksinai gali sukelti žmonių ir
gyvūnų mikotoksikozes. Daugiausia šio toksino gaminama vidutinėse ir šaltose vietose ir yra susijęs su grūdais, kurie paliekami lauke peržiemot. Svarbiausias poveikis T-2 toksino ir kitų trichotecenų, tai imunosupresinis aktyvumas, kuris buvo aiškiai įrodytas, eksperimentiniams gyvūnams. T-2 toksino poveikis imuninei sistemai susijęs su slopinamuoju poveikiu, dėl šio toksino makromolekulių biosintezės. Taip pat yra pakankamai įrodymų, kad T-2 toksinas gali būti kancerogeniškas gyvūnams.
Zearalenonas (ZEN)
Zearalenonas yra Fusarium spp. išskiriamas mikotoksinas. ZEN ir zearalenolis yra estrogeninio resorcilinės rūgšties laktonų junginys, gaminamas Fusarium rūšių. Vaikai labiausiai nukenčia dėl ZEN suvartojimo užterštais maisto produktais, daugiausia tai grūdai ir grūdiniai maisto produktai (Sunčica et al., 2013). Kiti Fusarium genties toksinai, tokie kaip nivalenolis ir fumonizinai dažnai priklauso nuo keleto veiksnių, pavyzdžiui, genotipo, klimato sąlygų, derliaus nuėmimo ir laikymo sąlygų. Nepaisant to, atlikti tyrimai rodo, kad kukurūzai turi didžiausią riziką užsiteršti, tuo tarpu nustatyta, kad kviečiai, avižos ir sojos užteršiamos retai.
Ochratoksinas A (OTA)
Ochratoksinas A yra nefrotoksinis ir kancerogeninis mikotoksinas, kurį gamina Penicillium
verrucosum ir Aspergillus spp., genties rūšys - A. ochraceus, A. melleus, A. carbonarius ir A. niger
27
OTA dažniausiai aptinkamas sandėliuojant šviežią produkciją, tai - grūdus, kavą, kakavą, džiovintus vaisius, prieskonius, taip pat kiaulieną. Jis taip pat gali būti aptiktas, kai kuriuose gyvūnų vidaus organuose (ypač kraujyje ir inkstuose), kurie šeriami užterštais pašarais. Įrodyta, kad OTA taip pat atrandamas, obuolių ir vynuogių sultyse, kurį sintetina Aspergillus carbonarius. OTA yra labai paplitęs raudoname vyne, nei lyginant su rožiniu ir baltuoju vynais. Pagal geografinę vietovę ochratoksino A paplitimas aptinkamas Vokietijoje, Italijoje, Graikijoje, Portugalijoje ir Čilės vynuogynuose.
Fumonizinai (FB)
Fumonizinai dažniausiai yra gaminami Fusarium verticillioides, F. proliferatum rūšių. Fumonizinai yra žinomi dėl vėžį sukeliančių savybių. Dažniausiai fumonizinai randami tam tikruose žemės ūkio produktuose, pavyzdžiui, kukurūzuose, kukurūzų miltuose, džiovintose maltose kukurūzų frakcijose, džiovintose figose, žolelių arbatose, vaistiniuose augaluose, galvijų piene, ir kituose. Fumonizinai slopina keramidų veiklą ir trukdo nervų apvalkalo amoniako alkoholio lipidų biosintezę. Taip pat FB1 gali sukelti oksidacines reakcijas inkstų ląstelėms, kurios, savo ruožtu, gali sukelti žalą ląstelėms ir DNR. FB1 gali sukelti kepenų pažeidimus ir kraujagyslių disfunkciją bei stemplės vėžį. Korėjoje ir Pietų Afrikoje, FB1 koncentracija kukurūzuose ir jų produktuose turėtų būti ne daugiau kaip 7,9 mg/kg. Švedijoje FB1 maisto produktuose - ne daugiau kaip 1 mg/kg (Jin-Yin Wu et al., 2014).
1.5.2 Arbatose randami mikotoksinai
Vaistiniai augalai gali būti užteršti įvairių formų toksikogeniniais mikromicetais, auginimo, tvarkymo, surinkimo, transportavimo ir laikymo metu. Mikotoksinais užterštų vaistažolių vartojimas gali prisidėti prie neigiamo poveikio sveikatai. Atliktas tyrimas su įvairiais vaistiniais augalais (alyvuogių lapais, citrinžolėmis, kaktusais, alijošiais, bazilikais, raugerškiu, saldymedžiu, aguonomis) iš Chaiber Pachtunchva provincijos Pakistane, parodė, kad iš 30 mėginių buvo aptikta 30 % aflatoksinų ir 26,7 % ochratoksino A. Bendras mikotoksinų užteršimas siekė 43,3 % mėginių. Dominuojančios mikromicetų rūšys – Aspergillus flavus, A. niger, A. parasiticus ir Penicillium spp. (Bashir Ahmad et al, 2014).
28
vienu metu. Nustatyta, kad mikotoksikologinė tarša neapsiriboja tik vienos grupės mikotoksinais (Liliana Santos, 2009).
Michelangelo Storari mokslininkas nustatė, kad „juodų aspergilli“ gentis yra tarp vyraujančių grybelinių formų, randamų vaistažolių arbatose. Šveicarijoje atliktas tyrimas, nustatė „juodų aspergilli“ užteršimą 16 iš 22 mėginiuose, nuo 10 iki 3500 ksv/g. Dažniausiai išskirtos rūšys buvo
Aspergillus niger, Aspergillus acidus, Aspergillus avamoris ir Aspergillus tubingensis. Fumonizinai
buvo pagaminti iš 76 % A. niger ir 37 % A. Avamoris izoliatų. 12 iš 22 mėginių buvo nustatyta, kad yra užteršta juodų aspergilli ir gali gaminti mikotoksinus.
Atliktas tyrimas su pu-erh arbata nustatė, kad nė vienas iš tirtų arbatos mėginių nepasižymėjo AFL koncentracija virš nustatymo ribos (1,7 µg/kg), išskyrus šešis mėginius (teigiamos kontrolės) jų koncentracija siekė 20 µg/kg AFL. Fumonizinų B1 ir B2 reikšmės buvo žemiau aptikimo ribos (10 g/kg) iš visų tirtų mėginių. FB3 taip pat nebuvo aptiktas tirtuose mėginiuose. OTA buvo teigiamas keturiuose mėginiuose 94,7, 14,8, 0,65 ir 0,65 μg/kg, atitinkamai. Visi kiti mėginiai buvo žemiau aptikimo ribos 0,5 μg/kg. 2 arbatose (5,6 %) koncentracija buvo šiek tiek aukščiau aptikimo ribos (0,5μg/kg,) ir 2 mėginių koncentracija - 14,8 μg/kg ir 94,7 μg/kg, atitinkamai. Nė vienoje iš šių arbatų nebuvo A. ochraceus, OTA gamintojo. 2 arbatose su didesniu OTA kiekiu buvo rasta
Penicillium rūšies, o arbata su didžiausiu OTA kiekiu nebuvo rasta A. acidus, tai rodo, kad ši arbata
buvo netinkamai fermentuota ir tokiu būdu suteikia augimą OTA gaminantiems mikromicetams (Doris Haas et. al, 2013).
Fumonizinai yra mikotoksinai, kuriuos sintetina įvairių rūšių Fusarium gentis ir yra pavojingos žmonių ir gyvūnų sveikatai. Atlikus tyrimą su vaistažolių arbatomis (anyžių, bazilikų, juodosios arbatos su rozmarinais, kardamono, ramunėlių, žaliosios arbatos su čiobreliais, chrizantemų, cinamono, gvazdikėlių, kaktusų, žaliosios arbatos su kmynais, citrinžolių, šalavijų, žaliosios arbatos su mėtom), kurias vartoja Saudo gyventojai, nustatyta, kad fumonizino B1 (FB1) koncentracija svyravo nuo 0,0 g/kg iki 266 g/kg. Rezultatai parodė, vyraujančią mikoflorą iš 13 genčių, atstovaujamų 25 rūšims. Iš šių genčių pasižymėjo Aspergillus, Penicillium ir Fusarium. (Fardos M. Bokhari et al., 2013).
Aspergillus niger dažnai siejama su juodąja arbata. Aspergillus niger, A. acidus, A. Avamoris, A. tubingensis, ir A. carbonarius, randama ir vaistažolių arbatose (Šveicarijos rinkoje). Atliktas
tyrimas patvirtino, kad 7 % A. niger izoliatų vaistažolių arbatose gali pagaminti OTA (Frantisek Malir, 2014). Čekijoje, Aspergillus flavus buvo aptikta juodojoje arbatoje. Kitas atliktas tyrimas Čekijoje, nustatė 81 mikromicetų rūšį juodojoje, žaliojoje ir vaistažolių arbatose. Aspergillus niger ir Aspergillus ochraceus buvo labiausiai pasižymėjusios rūšys.
29
tyrime analizuojant OTA paplitimą, kai kuriose vaisių ir juodojoje arbatose (Frantisek Malir et al., 2014) (OTA kiekio įvertinimas su kiekybinio įvertinimo riba (LOQ) 0,35 ng/g), nustatyta, kad šio mikotoksino kiekis svyravo nuo kiekybinio įvertinimo ribos iki 250 ng/g juodojoje arbatoje ir iki 104 ng/g vaisių arbatoje. Iš dvylikos, keturiuose grynos žaliavos juodosios arbatos mėginiuose (25 %), OTA koncentracija buvo daugiau 0,35 ng/g. OTA koncentracija mėginiuose: 1,85, 56,7, 86,6 ir 250 ng/g, atitinkamai. Keturiuose iš dvylikos vaisių arbatos mėginiuose (25%), esanti OTA koncentracija siekė daugiau nei 0,35 ng/g. OTA koncentracija mėginiuose: 1.1, 1.4, 1.8 ir 104 ng/g, atitinkamai (Frantisek Malir et al., 2014). Apie 152,3 ng OTA/250 ml, galima rasti juodosios arbatos puodelyje, kuri pagaminta iš labiausiai užteršto mėginio. Panašus procentas OTA buvo gautas iš mažiausiai užterštos juodosios arbatos (koncentracija 1,85 ng/g). OTA koncentracija vaisių arbatoje, kuri buvo labiausiai užteršta (104 ng/g) buvo daug mažesnis - 7,5 ng/250 ml. Mažesnis OTA kiekis vaisių arbatose galėjo būti dėl mažėjančio pH arba dėl, kai kurių junginių trukdančių šį toksiną perduoti į arbatos gėrimą. Suaugęs žmogus (60 kg kūno svorio) iš vieno arbatos puodelio (250 ml), kuris pagamintas iš labiausiai užterštos juodosios arbatos, gaus 2,5 ng OTA/kg kūno svorio, kuris atitinka pusę saugios dozės. Vienas puodelis labiausiai užterštos vaisinės arbatos - 0,125 ng OTA/kg kūno svorio, kuris gali būti laikomas nereikšmingu. Dažnai per dieną išgeriamas ne vienas puodelis arbatos, todėl šiame tyrime paskaičiuotas dviejų puodelių suvartojimas bei OTA koncentracija (ng/kg kūno svorio/per parą) juodojoje arbatoje – 1,1 ir 8,3; vaisių arbatoje - 0,3 ir 3,46, atitinkamai ir leistina paros norma (mažiausia ir didžiausia norma) juodojoje arbatoje - 7 % ir 59 %; vaisių arbatoje - 2 % ir 24 % (Frantisek Malir et al., 2014).
Atliktas tyrimas, kuriame buvo naudojamos tokios vaistažolės, kaip pipirmėtės, šalavijai, kraujažolės, juodoji arbata, melisos, parodė didelį užsikrėtimą skirtingomis mikromicetų rūšimis kaip pavyzdžiui, Aspergillus avamoris, A. lovaniensis, A. niger, A. Phoenicus, A. repens, A.
restrictus, A. sydowii, A. versicolor, Eurotium amstelodami E. chevalieri, E. herbariorum, Penicillium chrysogenum, ir Scopulariopsis brevicaulis. Jų kiekis šiose vaistažolėse svyravo nuo
1,84 iki 4,55 ksv/g. Dažniausios rūšys nustatytos Aspergillus ir Eurotium genčių. Vaistažoles užplikius karštu, steriliu, distiliuotu vandeniu, nustatyta, kad sumažėjo mikromicetų skaičis (nuo 1,0 KSV/g iki 2,02 KSV/g) taip pat jų kiekį sumažėjo ir filtruojant arbatą (nuo 0,70 KSV/g iki 1,84 KSV/g). Tačiau Aspergillus avamoris rūšis buvo atspari ir nustatyta šešiuose fltruotose arbatos mėginiuose, Aspergillus niger - viename mėginyje ir Penicillium chrysogenum - viename mėginyje. (Škrinjar Marija M. et al., 2011).
30
kukurūzų šilkas). Fumonizinų tiek FB1 ir FB2 aptikimo riba siekė 20 µg/kg. FB1 buvo aptikta 55 (65,5 %) iš 87 mėginiuose. Nustatytas didžiausias kiekis teigiamų mėginių juodosios arbatos (88,8 %), koncentracija siekė nuo 80 iki 280 µg/kg. Palyginti su vaistiniais augalais, apelsinų medžio lapuose aptikta didesnė FB1 koncentracija (350-700 µg/kg), liepų žieduose (20-200 µg/kg). Kukurūzų šilko ir ramunėlių mėginiuose FB1 koncentracija buvo mažesnė 50-150 µg/kg, ir 20-70 µg/kg, atitinkamai. Nė vienas iš tirtų mėginių nebuvo užterštas FB2 (Martins M. et al., 2001).
Tiriant aflatoksino B1 (AFB1), fumonizino B1 (FB1), deoksinivalenolo (DON), ir T-2 toksino koncentraciją Pu-erh arbatoje, nustatyta, kad visi arbatos mėginiai buvo saugūs dėl FB1 ir T-2 toksino (saugi riba - 1 mg/kg ir 0,1x10-3 mg/kg, atitinkamai). Tai įrodo, kad Pu-erh arbatoje nesidaugina Fusarium genties mikromicetai, kurie gali gaminti T-2 toksiną. Vis dėlto, 8 iš 70 mėginių parodė didesnę AFB1 koncentraciją, lyginant su saugia riba (5 x 10-3
mg/kg). 63 iš 70 mėginių viršijo saugią DON ribą (1 mg/kg) (Jin-Yin Wu et al., 2014).
1.5.3 Mikotoksinų leistinos normos
Europos Sąjungoje yra nustatyti teisiniai apribojimai, tačiau nėra oficialių teisės aktų vaistažolių užteršimui. Lietuvoje nėra nustatyta leistinos koncentracijos arbatose.
31
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektai
Tiriamasis darbas buvo pradėtas 2014 metais kovo mėnesį, LSMU, Veterinarijos akademijoje, gyvūnų gerovės tyrimų laboratorijoje.
Tyrimams buvo naudotos juodosios ir vaistažolių arbatos (jų kilmės šalis - Lietuva ir Lenkija), ištirta 22 mėginiai (4 ir 5 lentelės). Tyrimas buvo atliekamas dviem etapais. Pirmame etape nustatytas mikroskopinių grybų sporų skaičius, antrame etape nustatytas mikotoksinų kiekis tirtose arbatose.
4 lentelė. Juodosios arbatos mėginiai
Juodosios arbatos pavadinimas Kilmės šalis
1-Posti (pakeliais) Lenkija
2-Saga (pakeliais) Lenkija
3-Impra (biri) Šri Lanka
-Madras (biri) Lenkija
5-Gera (pakeliais) Lietuva
6-Maiski (pakeliais) Rusija
7-Junanio (biri) Kinija
8-Dilmah (biri) Šri Lanka
9-Lipton (pakeliais) Didžioji Britanija
5 lentelė. Vaistažolių arbatos mėginiai
Vaistažolių arbatos pavadinimas Kilmės šalis
10-Pu-erh (biri) Kinija
11-Mėtų (pakeliais) Lenkija
12-Melisų (pakeliais) Lenkija
13-Čiobrelių (pakeliais) Lenkija
14-Ramunėlių (pakeliais) Lenkija
15-Ramunėlių (pakeliais) Lietuva
16-Dilgėlių (pakeliais) Lenkija
17-Čiobrelių (biri) Lietuva
18-Melisų (biri) Lietuva
19-Mėtų (biri) Lietuva
20-Aviečių lapų (biri) Lietuva
21-Liepų žiedų (biri) Lietuva
32 2.2 Mikroskopinių grybų gyvybingų sporų skaičiaus (kolonijas sudarančių vienetų)
nustatymas skiedimo metodu
Kiekybinis užterštumo mikromicetų gyvybingomis sporomis nustatymas atliktas skiedimo metodu. Atsveriama po 5 g, sumalama, talpinama į 50 ml distiliuoto vandens kolbutę ir maišoma 20
min. Atliekami mėginio skiedimai iki 1:10-3
.
Gavus reikiamą praskiedimą, imamas 1 ml ekstrakto ir sėjama į Petri lėkšteles su Čapeko terpe (Czapec Dox agar) (Liofilchem, Italija) užpylimo būdu. Kiekvienam mėginiui sėjimai atliekami 5-iose Petri lėkštelėse. Lėkštelės su užkrėsta terpeinkubuotos termostate 26±2oC temperatūroje 7 parom. Augančios mikroskopinių grybų kolonijos buvo skaičiuojamos 7, 10 vystymosi parą. Mikroskopinių grybų gyvybingų sporų skaičius įvertintas pagal LST ISO 6611:2004.
2.3 Mikotoksikologinis tyrimas
Mikotoksinų koncentracijos nustatymas. Plonasluoksne chromatografija (PSCh) buvo nustatomos mikotoksinų koncentracijos pagal aprobuotas Romer Labs. Inc. (Austrija) metodikas. PSCh metodu buvo nustatomos aflatoksino B1 (AFL B1), zearalenono (ZEN), deoksinivalenolio
(DON), T-2, ochratoksino A (OTA) koncentracijos. Arbatos mėginiai buvo sumalami malūnu. Tyrimui surenkama smulkiausia mėginio frakcija – 12,5 g mėginio ekstraguota 44 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu, kratant 3 min. Mėginio ekstraktas perfiltruotas per celiuliozinį filtrą (porų dydis 20 µm).
33
Nustatant DON, T-2 mikotoksinų koncentracijas mėginiuose PSCh metodu, mėginių paruošimas toks pat, kaip nustatant ZEN ir AFL B1. Mėginio ekstrakto valymui panaudotos MultiSep® 216 ir MycoSep® 227 valymo kolonėlės (Romer Labs. Inc., Austrija). 13 ml išvalyto ekstrakto išgarinta Romer® Evap sistema. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos 400 µl 2/1 acetono/metanolio mišinyje. Į specialius mikrošvirkštus pritraukus 10 µl, 20 µl, 40 µl, 80 µl DON standarto (100 µg ml-1 acetonitrilo) (Romer Labs. Inc., Austrija) ir 80 µl tiriamo mėginio, PSCh autospoteriu užnešamas standartas ir tiriamasis mėginys ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (Romer Labs. Inc., Austrija) 60 oC temperatūroje. Rezultatų išryškinimui plokštelė įmerkiama į 1/2 toluolo/acetono mišinio vonelę. Plokštelė apipurškiama 15 % aliuminio chloridu metanolyje. Plokštelė išdžiovinama ore. Toksino koncentracija įvertinama, pakaitinus plokštelę 150 ºC temperatūroje 5 min. ultravioletinių spindulių (UV) fone (360 nm). DON švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,5. Toksino koncentracija tiriamajame mėginyje matomas nanogramais, mėginio ekvivalentas 0,2 g. ppb=x÷0.2, kur ppb - toksino koncentracija mėginyje (µg kg-1); X - mikotoksino koncentracija
ant plokštelės nanogramais; 0,2 – mėginio ekvivalentas (0,2 g).
OTA koncentracijos nustatytos imunofermentinės analizės metodu panaudojant RIDASCREEN® FAST Ochratoxin A (R-Biopharm AG, Vokietija) testą. Mėginių paruošimas toks pat, kaip nustatant ZEN, AFL B1, DON. Pilama po 50 l paruošto mėginio į mikroindelius. Į kiekvieno mikroindelio dugną pilama po 50 l fermento konjugato. Į kiekvieną mikroindelį pilama po 50 l ochratoksino A antikūnų. Atsargiai sumaišoma lengvai pamaišant plokštelę ir inkubuojama 10 min (+/- 1) kambario temperatūroje (20-25 oC). Išpilamas skystis iš mikroindelių ir apvertus energingai pastuksenama į sugeriamąjį popierių, kad iš indelių pasišalintų visas skystis. Į kiekvieną mikroindelį pripilama po 250 l distiliuoto ar dejonizuoto vandens ir vėl išpilama. Ši procedūra pakartojama dar du kartus. Į kiekvieną mikroindelį pilama po 100 l substrato/chromogeno. Sumaišoma purtant plokštelę ir inkubuojama 5 min. (+/- 0,5) kambario temperatūroje (20-25 o
C) tamsoje. Pilama po 100 l stop reagento. Gerai sumaišoma ir išmatuojama absorbcija bangos ilgiui esant 450 nm. Rezultatai turi būti gauti per 10 min po stop reagento įpylimo. Vidutinės gautos standartinių tirpalų ir mėginių absorbcijos reikšmės dalijamos iš nulinio standarto absorbcijos reikšmės ir dauginama iš 100. Tokiu būdu nulinė standarto reikšmė prilyginama 100 ir absorbcijos reikšmės gaunamos procentine išraiška. Apskaičiuotų standartinių tirpalų reikšmių priklausomybė nuo ochratoksino A koncentracijos (g/kg) pavaizduojama grafiškai semilogaritminiame popieriuje koordinačių sistemoje. Naudojantis kalibracine kreive pagal kiekvieno mėginio ekstinkciją sužinoma ochratoksino A koncentraciją g/kg. Aptikimo riba yra 5
34 2.4 Statistinis duomenų įvertimas
35
3. TYRIMO REZULTAI
3.1 Juodųjų ir vaistažolių arbatų užkrėstumas mikromicetais
3.1.1 Lietuvoje auginamų vaistažolių užsikrėtimas toksikogeniniais mikromicetais
Lietuvoje auginamų vaistažolių arbatose gyvybingų mikroskopinių grybų sporų skaičius svyravo nuo 1,0x103 KSV/giki 12,5x103 KSV/g. Labiausiai užkrėstas mėginys buvo aviečių lapų biri arbata, mažiausiai užkrėstas mėginys buvo mėtų biri arbata, atitinkamai 12,5x103 KSV/g ir 1,0x103 KSV/g (1 pav.). Palyginus tarpusavyje Lietuvoje ir ne Lietuvoje auginamas arbatas, Lietuvoje augintos vaistažolių arbatos buvo 100 % užkrėstos mikroskopinių grybų sporomis, o ne Lietuvoje augintos, kai kurios arbatos net nebuvo užkrėstos (66,6 %), pavyzdžiui tokios kaip melisų, čiobrelių, ramunėlių, dilgėlių (pakeliuose) (p<0,05) (1pav.).
1 pav. Vaistažolių arbatų užsikrėtimas toksikogeniniais mikromicetais (ksv/g). Pastaba: 10-Pu-erh
(biri, Kinija), 11-Mėtų (pakeliais, Lenkija), 12-Melisų (pakeliais, Lenkija), 13-Čiobrelių (pakeliais, Lenkija), 14-Ramunėlių
(pakeliais, Lenkija), 15-Ramunėlių (pakeliais, Lietuva), 16-Dilgėlių (pakeliais, Lenkija), 17-Čiobrelių (biri, Lietuva), 18-Melisų (biri, Lietuva), 19-Mėtų (biri, Lietuva), 20-Aviečių lapų (biri, Lietuva), 21-Liepų žiedų (biri, Lietuva), 22-Medetkų (biri, Lietuva).
Lietuvoje auginamose visose vaistažolių arbatose vyravo Aspergillus spp. genties mikromicetai. Labiausiai buvo užkrėstas melisų birios arbatos mėginys, mažiausiai – ramunėlių arbata pakeliuose, mėtų biri arbata ir medetkų biri arbata, atitinkamai 4,0x103
