LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

(1)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

EDVINAS KOZAK

KAPSAICINO, KURKUMINO IR PIPERINO KIEKIO POKYČIŲ

KAITINANT TYRIMAS PRIESKONIŲ ŽALIAVOSE TAIKANT

EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. dr. Daiva Kazlauskienė

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:

KAPSAICINO, KURKUMINO IR PIPERINO KIEKYBĖS POKYČIŲ

KAITINANT TYRIMAS PRIESKONIŲ ŽALIAVOSE TAIKANT

EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. dr. Daiva Kazlauskienė

Darbą atliko Magistrantas

Edvinas Kozak

Data:

Recenzentas

Vardas, pavardė, parašas

(3)

TURINYS

TURINYS...3 SANTRAUKA...5 SUMMARY...6 SANTRUMPOS...7 ĮVADAS...8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI...9

1. LITERATŪROS APŽVALGA...10 1.1. PIPERINAS...10 1.1.1. Cheminės savybės...10 1.1.2. Farmakologinis poveikis...10 1.1.3. Antioksidacinis poveikis...11 1.1.4. Ekstrakcija...12

1.1.5. Kokybinis ir kiekybinis nustatymas...15

1.2. KURKUMINAS...17

1.2.1. Cheminės savybės...17

1.2.2. Farmakologinis poveikis...17

1.2.3. Antioksidacinis poveikis...18

1.2.4. Ekstrakcija...18

1.3. KAPSAICINAS...20

1.3.1. Cheminės savybės...20

1.3.2. Farmakologinis poveikis...20

1.3.3. Antioksidacinis poveikis...21

1.3.4. Ekstrakcija...22

2. TYRIMO METODIKA...24

2.1. Tyrimo objektas ...24

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ...24

(4)

2.4. Mėginių paruošimas analizei...25

2.5. Reagentų paruošimas...25

2.6. Ultragarsinės ekstrakcijos sąlygų parinkimas...25

2.6.1. Piperino ekstrakcija ultragarsu...26

2.6.2. Kapsaicino ultragarsė ekstrakcija...27

2.6.3. Kurkumino ultragarsė ekstrakcija...28

2.7. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika...30

2.7.1. Naudota aparatūra...30

2.7.2. Piperino chromatografijos sąlygos...30

2.7.3. Kapsaicino chromatografijos sąlygos...31

2.7.4. Kurkumino chromatografijos sąlygos...31

2.8. Kokybinis ir kiekybinis ekstraktų įvertinimas...31

2.9. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH radikalų surišimą...32

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...33

3.1. Piperino efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija...33

3.1.1. Specifiškumas...33

3.1.2. Tiesiškumas...34

3.1.3. Nustatymo ribos...35

3.1.4. Glaudumas...35

3.2. Kapsaicino, piperino ir kurkumino kiekio kitimas ekstraktuose iš prieskonių, juos kaitinant...36

3.3. Antioksidacinio poveikio kitimo kaitinant nustatymas...38

3.4 Ryšio tarp antioksidacinio poveikio ir kapsaicino, piperino ir kurkumino kiekio pokyčių įvertinimas...40

4. IŠVADOS...42

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...43

(5)

SANTRAUKA

Edvino Kozak magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. Daiva Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. — Kaunas.

Pavadinimas: Kapsaicino, kurkumino ir piperino kiekio tyrimas kaitinant prieskonių žaliavose taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.

Tyrimo objektas ir metodai: šio tyrimo objektas — juodųjų pipirų, aitriosios paprikos, ciberžolės prieskonių milteliai. Veikliosioms medžiagoms išskirti iš prieskonių žaliavų pasirinkta ultragarsinė ekstrakcija. Kapsaicino, kurkumino ir piperino kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas. Antioksidaciniam poveikiui įvertinti naudota spektrofotometrinė analizė.

Tyrimo tikslas: nustatyti kapsaicino, kurkumino, piperino kiekio pokyčius prieskoninėse žaliavose jas kaitinant 100 ºC temperatūroje 10, 20, 30, 40 min. Palyginti gautus kiekybinius rezultatus su antioksidacinio poveikio gebos pokyčiais.

Tyrimo uždaviniai: 1) Pritaikyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas kapsaicino, kurkumino ir piperino junginių ekstrahavimui iš prieskoninių žaliavų mėginių; 2) Pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką piperino nustatymui, esančiame juodųjų pipirų ekstrakte, kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimams; 3) Nustatyti kapsaicino, kurkumino ir piperino ekstraktų kokybinę ir kiekybinę sudėtį, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą; 4) Palyginti kapsaicino, kurkumino ir piperino kiekybinius ir antioksidacinės gebos pokyčius kaitinant.

Tyrimo rezultatai ir išvados: atlikus kokybinius prieskonių ekstraktų tyrimus buvo identifikuoti kapsaicinas, kurkuminas ir piperinas. Validuota piperino chromatografijos metodika. Eksperimentiškai nustatytos tinkamiausios ultragarsinės ekstrakcijos sąlygos. Atlikus kiekybinį tyrimą nustatyta: 3,202 (±0,046) mg/g piperino, 1,708 (±0,030) mg/g kapsaicino, 6,960 (±0,078) mg/g kurkumino.Atlikus ekstraktų kaitinimą nustatyta: piperino didžiausias koncentracijos sumažėjimas įvyksta per pirmąsias 10 kaitinimo minučių (24,2 % ±0,8 %); kapsaicino didžiausias koncentracijos sumažėjimas įvyksta per pirmąsias 10 minučių (15,2 % ±1,5 %); kaitinant kurkumino ekstraktą koncentracija palaipsniui mažėja per 30 minučių (10min – 10,8 % ±0,9 %, 20 min – 23,3 % ±1, 30 min – 32,1 % ±1,2 %). Nustačius kaitintų ekstraktų antioksidacinę DPPH surišimo gebą buvo pastebėta, kad mažėjant veikliosios medžiagos koncentracijai mažėja ir antioksidacinė ekstrakto geba. Naudojantis eksperimentiškai gautais duomenimis, buvo įvertintas koreliacinio ryšio stiprumas tarp kiekybinių ekstraktų pokyčių ir jų antioksidacinės gebos. Gauti skaičiavimai parodė stiprius koreliacinius ryšius tarp koncentracijos mažėjimo ir antioksidacinio poveikio mažėjimo, (piperino r=0,902, p<0,05), ( kurkumino r=0,813, p<0,05), (kapsaicino r=0,865, p < 0,05).

(6)

SUMMARY

The final master‘s thesis/research prepared by Edvinas Kozak and supervised by assoc. prof. Daiva Kazlauskiene; Department of Analytical and Toxicological chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas.

The name: The investigation of quantitive changes of piperine, capsaicine and curcumine spice extracts in domestic cooking using high performance liquid chromatography.

The aim: to examine quantitative changes of capsaicine, curcumine and piperine in spice extracts when heated at 100 ºC for 10, 20, 30, 40 minutes, also to assess antioxidant activity changes of heated extracts.

The objectives of the study: 1) To optimize the extraction conditions of capsaicine, curcumine and piperine from spice powder. 2) To validate HPLC method for qualitive and quantitative examination of piperine. 3) To evaluate quantitative changes of piperine, capsaicine and curcumine in domestic cooking at 100 ºC for 10, 20, 30, 40 minutes.4) To determine correlation between quantitative changes of extracted materials and values of their antioxidant activity.

Research metodology: The study was performed using samples of black pepper, chilli pepper and tumeric spice powder aquired at local super market. The extraction of spice principles was carried out using ultrasonic assisted extraction. High performance liquid chomatography method was applied to evaluate qualitative and quantitative properties of spice extracts. Antiradical activity of piperine, capsaicine and curcumine was assessed by spectrophotometric DPPH radical binding method. Correlation between quantitative changes of extracted materials and values of their antioxidant activity was carried out using IBM SPSS Statistics 22.0 program.

Results and conclusions: Validated HPLC method of qualitative and quantitative piperine determination. Optimisation of UAE conditions were carried out for individual spice extract. The determined amount of extracted spice principles were: piperine – 3,202 mg/g (± 0,046 mg/g), capsaicine 1,708 mg/g (± 0,030 mg/g), curcumine 6,960 mg/g (± 0,046 mg/g). Simulated domestic cooking of extracts at 100ºC showed a significant concentration loss of piperine at first 10 minutes of cooking (24,2 % ±0,8 %), capsaicine reacted to heat as piperine, its biggest loss of concentration was registered at 10 minutes reaching (15,2 % ±1,2 %). Tumeric extract showed constant loss of curcumine measured at approximately 10,7 % from first 10 minutes of heat treatment through 30 minutes of heating, totaling in (32,1 % ±1,2 %) of concentration loss. Spectrophotometrically evaluated DPPH radical scavenging activity showed that decrease of concentration in active spice principles resulted in reduction of DPPH activity. This assumption was approved by calculating correlation between quantitative changes of extracted materials and values of their antioxidant activity (piperine - 0,902 p<0,05); (capsaicine - 0,865 p<0,05); (curcumine - 0,813 p<0,05).

(7)

SANTRUMPOS

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas.

EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija. ESC - efektyvioji skysčių chromatografija.

ICH - Tarptautinė derinimo taryba, angl. (International Council for Harmonisation).

IUPAC - cheminių junginių vardinimo sistema, sukurta Tarptautinės Grynosios ir Taikomosios chemijos sąjungos.

MTL – mažo tankio lipoproteinai.

(8)

ĮVADAS

Žolelės ir prieskoniai turi ilgai besitęsiantį ryšį su kulinarija ir medicina. Ciberžolė, juodieji pipirai ir čili pipirai yra plačiai paplitę prieskoniai, turintys ilgą naudojimo istoriją [1]. Malonus skonis, kvapas bei sveikatai naudą suteikiančios prieskonių savybės juos pavertė neatskiriama maisto dalimi. Be to, šie prieskoniai rado savo vietą farmakologiniame panaudojime, kai buvo pastebėtos jų gydomosios savybės. Kapsaicino, kurkumino ir piperino svarba medicinoje drastiškai pasikeitė mokslininkams atradus jų antioksidacinį, priešuždegiminį, nuskausminantį bei kitus farmakologinius poveikius. Antioksidantai – junginiai, gebantys slopinti ar net apsaugoti nuo oksiduojančių medžiagų degradacinio poveikio taip užkirsdami kelią senėjimo procesams, onkologiniams susirgimams, lėtinėms ligoms. Piperinas – juoduosiuose pipiruose randamas alkaloidas. Esant mažoms piperino koncentracijoms jis veikia kaip hidroksilo radikalų „medžiotojas“ - inhibitorius[13]. Apsaugo žmogaus mažo tankio lipoproteinus (MTL) nuo oksidacijos [15]. Tyrimuose su žiurkėmis pastebėta, kad į dietą įtraukiant piperiną, sumažėja smegenų, inkstų ir širdies raumens audinių oksidacinė pažaida [16]. Kapsaicinas – polifenolinis junginys, randamas raudonosiose čili paprikose, kurios plačiai naudojamos kaip prieskoniai, suteikiantys maistui aštrumo pojūtį, taip pat pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Atliktuose tyrimuose stebimas kapsaicino gebėjimas sumažinti žmogaus mažo tankio lipoproteinų oksidaciją vario jonais [68] bei dvivalentės geležies sukeltą lipidų peroksidaciją pelių kepenyse [69]. Tyrimuose pastebėta tendencija, kad net trumpalaikis ir nepastovus kapsaicino vartojimas gali sumažinti oksidacinį stresą organizme [70]. Kurkuminas – junginys, kaupiamas dažinės ciberžolės (Curcuma longa L.) šaknyje. Jis pasižymi plačiu farmakologinio pritaikomumo spektru. Įrodyta, kad kurkuminas geba slopinti lipidų peroksidaciją ir gali būti naudojamas gerinti tiek vėžio sukeltus padarinius, tiek tam tikrų chroninių ligų simptomus [49, 50]. Šie trys populiarūs ir plačiai naudojami visame pasaulyje prieskoniai, vartojant juos kulinarijos tikslais, dažnai yra veikiami temperatūros. Norint gauti kuo didesnę farmakologinę naudą, būtina išsaugoti kuo didesnę veikliosios medžiagos koncentraciją prieskonio žaliavoje. Žinoma, kad didelė temperatūra keičia baltymus, riebalus ir angliavandenius. Tačiau kaip yra paveikiami prieskoniai, pasižymintys žmogaus sveikatai itin svarbiu antioksidaciniu poveikiu, - tokių tyrimų duomenų nerasta itin daug.

(9)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Nustatyti kapsaicino, piperino ir kurkumino, išekstrahuotų iš prieskonių,

koncentracijos kitimą kaitinimo metu ir įvertinti antioksidacinio aktyvumo priklausomybę nuo veikliųjų medžiagų kiekio.

Darbo uždaviniai:

1. Pritaikyti tinkamas ekstrakcijos sąlygas kapsaicino, kurkumino ir piperino junginių ekstrahavimui iš prieskoninių žaliavų mėginių;

2. Pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką piperino nustatymui, esančiame juodųjų pipirų ekstrakte, kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimams;

3. Nustatyti kapsaicino, kurkumino ir piperino koncentracijos pokyčius ekstraktuose, juos kaitinant.

4. Palyginti kapsaicino, kurkumino ir piperino antioksidacinio aktyvumo priklausomybę nuo veikliųjų medžiagų kiekio pokyčių kaitinant ekstraktus.

(10)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Piperinas

Žolelės ir prieskoniai turi ilgai besitęsiantį ryšį su kulinarija ir medicina. Malonus skonis, kvapas bei sveikatai naudą suteikiančios prieskonių savybės juos pavertė neatskiriama maisto dalimi. Daug prieskonių naudojami kaip maisto papildai, netgi vaistai. Bene plačiausiai ir labiausiai visame pasaulyje naudojamas „prieskonių karalius“ - juodasis pipiras. Tai turbūt vienintelis prieskonis, be kurio nėra įsivaizduojami daugelis dabartinių patiekalų. Visais laikais jis buvo labai populiarus, ir nėra priežasčių, dėl ko jo vartojimas turėtų sumažėti.

1.1.1. Cheminės savybės

Juodasis pipiras yra populiarus dėl juslinių savybių, kurias jam suteikia natūraliai kaupiamas alkaloidas piperinas bei kai kurie lakieji eteriniai aliejai. Eteriniai aliejai sudaro nuo 0,4 iki 7 % juodojo pipiro kaupiamų medžiagų, jie yra atsakingi už specifinį pipiro kvapą [1]. Piperinas yra pagrindinis alkaloidas, suteikiantis būdingą pipirų skonio aštrumą. Piperino kiekis gali kisti nuo 2 iki 9 %, priklausomai nuo augimvietės, gamtinių sąlygų [2, 3]. Piperinas yra dažniausiai randamas alkaloidas juoduosiuose pipiruose. Pirmą kartą sėkmingai jo ekstrakciją atliko Hans Christian Orsted 1819 metais. Piperinas buvo ekstrahuotas kaip geltona kristalinė medžiaga, kurios lydimosi temperatūra nuo 128° C iki 130° C. Cheminė junginio struktūra buvo vėliau apibūdinta kaip piperoil-piperidinas, cheminė formulė C17H19NO3, kartu su IUPAC pavadinimu 1-(5-[1,3-benzodioksol-5-yl]-1-okso-2,4-pentadienilo) piperidinas. Piperinas pasižymi silpnomis bazinėmis savybėmis, paveiktas rūgščių ar šarminės hidrolizės, suyra į degų bazinį piperiną, dar kitaip žinomą kaip piperidiną (C5H11N) ir piperino rūgštį (C12H10O4) [4, 3].

1.1.2. Farmakologinis poveikis

Senovės kinų ir indų medicinoje juodasis pipiras buvo naudojamas kaip natūralus vaistas nuo skausmo, reumato, temperatūros. Pipirų arbata buvo vartojama palengvinti migreną, skaudančią gerklę, prastą virškinimą. Taipogi pipirai buvo vartojami pagerinti kraujo apytaką, padidinti seilėtekį ir gerinti apetitą [4]. Dabartiniai tyrimai parodė, kad piperinas pasižymi priešvėžinėmis, antioksidantinėmis, prieuždegiminėmis, antimikrobinėmis, imunomoduliacinėmis bei kitomis savybėmis [5, 6]. Piperinas

(11)

geba didinti vaistinių medžiagų, pvz., rifampicino, sulfadiazino, tetraciklino ir fenitoino bioprieinamumą, didindamas jų absorbciją ar lėtindamas metabolizmą [7, 8]. Yra pastebėtas piperino radioprotekcinis poveikis, taigi jis gali būti skiriamas pacientams prieš spindulinės terapijos procedūras [2]. Buvo nustatyta, kad piperinas žymiai padidina kasos lipazės aktyvumą ir stimuliuoja amilazės, tripsino, chemotripsino išsiskyrimą [9]. Neseniai atlikti tyrimai rodo, kad piperinas atlieka svarbų vaidmenį mažinant kraujo cholesterolio, trigliceridų ir gliukozės kiekius [10]. Nepaisant puikių piperino farmakologinių savybių, jis yra mažai tirpus vandenyje (40 mg/l 18° C temperatūroje) [11]. Mažas tirpumas vandenyje sąlygoja mažesnį piperino bioprieinamumą ir pasisavinimą.

1.1.3. Antioksidacinis poveikis

Radiacijos ir aplinkos teršalų poveikis, audinių pažaida, infekcijos ir autoimuniniai procesai gali sukelti laisvųjų radikalų gamybą organizme. Daug laisvųjų radikalų „medžiotojų“ - natūraliai organizme esančių antioksidacinių medžiagų - geba sumažinti šių išorinių veiksnių žalą audiniams. Įvairūs moksliniai darbai parodė, kad dažniausiai kulinarijoje vartojami prieskoniai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Yra nustatyta, kad piperinas in vivo eksperimentuose pasižymėjo antioksidacinėmis ir lipidų peroksidaciją stabdančiomis savybėmis [13]. Esant mažoms piperino koncentracijoms jis veikia kaip hidroksilo radikalų „medžiotojas“ (inhibitorius), bet didesnėmis koncentracijomis aktyvuoja Fentono reakciją, kuri sukelia didesnę hidroksilo radikalų gamybą. Reddy ir Lokesh (1992) [14] savo tyrimu parodo, kad piperinas turi tik dalinį aktyvumą, mažinant askorbato/Fe2+ lipidų sukeltą oksidacinę pažaidą, lyginant su kitais antioksidantais, pvz., vitaminu E ar t-butilhidroksitoluenu.

Piperinas yra efektyvus antioksidantas, jis apsaugo žmogaus MTL (mažo tankio lipoproteidai) nuo oksidacijos. Tai įrodyta atliekant tyrimą su žmogaus MTL, sukeliant lipidų peroksidaciją su vario jonais ir matuojant piperino antioksidacinį aktyvumą pagal susidariusios tiobarbitūrinės rūgšties kiekį ir MTL elektroforetinį judrumą ant agarozės gelio [15]. Naudojant diabetą kaip oksidacinės pažaidos modelį, Rausgher ir kiti (2000) [16] tyrė, ar streptozocino sukelto diabeto žiurkių gydymas piperinu (10mg/kg/24h 14 dienų) apsaugos žiurkių audinius nuo diabeto sukelto oksidacinio streso. Tyrimo rezultatai parodė, kad visi diabetu sergančių žiurkių audiniai pasižymėjo oksidacinės sistemos sutrikimais, lyginant su kontroliniais tiriamaisiais. Gydymas piperinu sumažino smegenų, inkstų ir širdies raumens audinių oksidacinę pažaidą, bet neveikė kepenų audinių. Taigi galima teigti, kad 14 dienų subkutaninis piperino paskyrimas dalinai efektyvus kaip antioksidantas prieš diabeto sukeltą oksidacinę pažaidą.

(12)

Selvendiran ir kiti (2004) [17] ištyrė piperino dirbtinai benzo-alfa-pirenu sukeltai mitochondrijų antioksidacinės sistemos ir lipidų peroksidacijos poveikį plaučių karcinogenezei. Skiriant piperiną per os (50 mg/kg) tiriamiesiems gyvūnams, buvo stebimas žymus mitochondrinis lipidų peroksidacijos sumažėjimas kartu su viduląstelinių natūralių antioksidacinių medžiagų padidėjimu, lyginant su kontroliniais gyvūnais. Šie duomenys leidžia teigti, kad piperinas gali būti naudojamas priešvėžiniam gydymui ir antioksidacinės sistemos koregavimui.

Vijayakumar ir kiti (2004)[18] nustatė piperino poveikį žiurkėms, kurioms buvo taikoma daug riebalų turinti dieta. Maisto racionas buvo sudarytas iš 20 % kokosų aliejaus, 2 % cholesterolio ir 0,125 % žarnyno druskų ir 0,5 mg/kg piperino. Tyrimo trukmė - 10 savaičių. Tyrimo rezultatai parodė, kad tokia dieta sukėlė didelį lipidų peroksidacijos laipsnį (nustatoma su tiobarbitūrine rūgštimi) bei kitų gyvybinių rodiklių suprastėjimą, lyginant su kontroline grupe. Tyrimo grupė, maitinta piperinu, pasižymėjo daug mažesniu lipidų peroksidacijos laipsniu ir kitais gyvybiškai svarbiais rodikliais, kurie buvo panašūs į kontrolinės žiurkių grupės.

1.1.4. Ekstrakcija

Juodieji pipirai yra sudaryti iš 2 pagrindinių dalių: degiųjų eterinių aliejų ir aštrumą suteikiančių medžiagų. Šios medžiagos yra atsakingos už pipirų būdingą aromatą bei skonį. Pipirų aliejus, kuris yra išskiriamas atliekant garų distiliaciją iš sudžiovintų pipirų, savyje neturi aštrumą suteikiančių medžiagų, o tik atspindi pipirų aromatinę sudėtį. Dėl savo būdingo kvapo pipirų aliejus yra naudojamas kvepalų gamybos pramonėje [19]. Alkaloidai, esantys juodajame pipire, yra tirpikliais ekstrahuojamos medžiagos, sudarančios nuo 6 % iki 13 % juodųjų pipirų masės, jos pasižymi būdingu pipirams kvapu bei skoniu. Organoleptinės savybės yra nustatomos pagal eterinių aliejų bei piperino kiekį. Šie rodikliai gali kisti priklausomai nuo ekstrakcijai panaudoto metodo, tirpiklio, žaliavos rinkimo laiko ar jos augimvietės. Dažniausiai parduodami pipirų ekstraktai turi nuo 15 % iki 20 % eterinių aliejų ir nuo 35 % iki 55 % piperino [4, 20].

Ideali ekstrakcijos metodika turėtų būti greita, paprasta ir efektyvi. Kai kuriais atvejais ekstrakcijos kaina gali siekti 50 – 90 % viso gaminio kainos. Taigi tinkamos ekstrakcijos metodikos pasirinkimas apibrėžia ekstrakto kainą [21]. Naudojant piperino ekstrakcijai alifatinius ir chloruotus hidrokarbonatinius tirpiklius yra pasiekiamas mažas našumo laipsnis dėl tirpiklių mažo selektyvumo piperinui. Atliekant ekstrakciją farmaciniams tikslams, ekstrakto grynumas turi atitikti 95 % – 98 % piperino galutiniame produkte [2]. Tradicinės ekstrakcijos tirpikliais metodai yra mirkymas, maceracija ir Soksleto ekstrakcija. Šie metodai dažniausiai reikalauja ilgo ekstrakcijos laiko ir didelės tirpiklio temperatūros, kuri įtakoja termolabilių junginių ir žemą virimo temperatūrą turinčių tirpiklių praradimą

(13)

proceso metu [22]. Šiuolaikiškesnės piperino ekstrakcijos metodikos yra superkritinė CO2 ekstrakcija, ultragarsinė ekstrakcija ir mikrobangų ekstrakcija.

Soksleto metodika ekstrahuojant naudingas biologiškai aktyvias medžiagas turi ilgą istoriją. Ši metodika jau nebenaudojama praktikoje, bet ji praverčia, norint įrodyti naujų ekstrakcijos metodikų pranašumą [23]. Soksleto ekstrakcijos metu mėginys talpinamas į popierinę kapsulę, pro kurią kontaktuoja su šviežio tirpiklio porcijomis, tai pagreitina ekstrakcijos laiką. Po šios ekstrakcijos nėra būtina gauto ekstrakto filtracija dėl mėginio (ekstrahuojamos medžiagos) patalpinimo į kapsulę, pagamintą iš filtrinio popieriaus. Nors šiai metodikai reikalinga įranga yra paprasta, ji reikalauja didelių tirpiklio kiekių ir ilgo atlikimo laiko [22]. Subramanian ir kiti (2011) naudojo modifikuotą Soksleto metodiką ekstrahuoti piperinui, jų rezultatai parodė, kad į Soksleto sistemą pridedant antrąjį nutekėjimo kanalą ir ekstrakcijos ciklą sutrumpinant pusiau (nuo 16 min. iki 8 min.), lyginant su kontroline metodika, gauta piperino išeiga yra vienoda, bet ekstrakcijos laikas sutrumpėja nuo 22 h iki 12 h. Rajopadhye ir kiti (2012)[24] išskyrė piperiną iš pipiro šaknies, naudodami metanolį kaip tirpiklį, ektrakcija truko 8 h, gautas piperino kiekis buvo 9,56 +/-0,83 mg/g. Yamaguchi ir kiti (2011) [25] naudodami Soksleto metodiką, išskyrė piperiną iš džiovintų pipirų. Kaip tirpiklis naudotas metileno chloridas, ekstrakcija truko 20 h, gautas piperino kiekis - 52,7 mg/g.

Ultragarsinė ekstrakcija

Siekiant įveikti Soksleto ir paprastosios skysčių ekstrakcijos metodų trūkumus, buvo sukurtos įvairios metodikos, ultragarsinė ekstrakcija yra viena iš jų. Šios metodikos mechanizmas yra pagrįstas kavitacijos (tuščių erdvių tirpale ir jų subliuškimu į savo centrą) fenomenu ir šiluminiais efektais, susidarančiais ekstrakcijos metu, kurie pagerina tirpiklio ir išskiriamos medžiagos maišymąsi tarpusavyje [26]. Garso bangų dažnis, akustinė galia, hidrostatinis slėgis, tirpiklio temperatūra, ultragarsinės vonelės forma - visi šie faktoriai daro įtaką ekstrakcijos našumui. Dėl specifinio ekstrahuojamosios medžiagos suardymo būdo ultragarsinės ekstrakcijos našumas yra mažiau veikiamas panaudoto tirpiklio trūkumo ar netinkamo jo santykio, nei skysčių ar Soksleto ekstrakcijos metodikos. Bandant panaudoti ultragarsinę ekstrakciją, išskiriant piperiną, Rathod ir Rathod (2014) [27] naudojo skirtingus tirpiklius: acetoną, etanolį ir heksaną. Didžiausia išeiga buvo naudojant acetoną – 4,53 mg/g, etanolinės ekstrakcijos išeiga – 4,32 mg/g ir heksano – 4,08 mg/g. Nors acetonas ir etanolis pasižymi panašiu poliškumo santykiu, didesnė ekstrakcijos išeiga buvo pasiekta su acetonu dėl geresnės acetono skvarbos į ekstrahuojamą medžiagą ir mažesnio skysčio klampumo. Dėl nedidelio produkto išeigos skirtumo tarp acetono ir etanolio, sudėtingumo dirbant su acetonu ir tirpiklių kainos, tinkamiausiu piperino ekstrakcijai tirpikliu buvo pasirinktas etanolis. Taip pat Rathod ir Rathod (2014) [27]

(14)

eksperimentavo keisdami tirpiklio ir medžiagos santykį nuo 1 (kietosios medžiagos dalis) :2,5 (tirpiklio dalys) iki 1:40. Gauti rezultatai teigė, kad ištraukos išeiga didėjo, didinant tirpiklio - medžiagos santykį iki 1:10. Jie taip pat nustatė, kad ekstrakcijos išeiga eksponentiškai didėjo iki 18-tos ekstrakcijos minutės, tolesnis išeigos didėjimas buvo lėtas ir nežymus. Labiausiai tinkamas ultragarsinės vonelės vieno ciklo darbo laikas – 1 min., esant 48 sek. įjungtai ir 12 sek. išjungtai vonelei, ties 125 W galia ir 50° C temperatūra. Pagal nustatytą tinkamiausią ekstrakcijos metodiką, gauta piperino išeiga buvo lygi 5,8 mg/g žaliavos.

Mikrobangų ekstrakcija

Elektromagnetinio lauko spektre mikrobangų radiacija yra tarp infraraudonųjų ir radijo bangų dažnių. Mikrobangos turi elektrinius ir magnetinius laukus, kurių svyravimai yra priešingi vienas kitam, jų skleidžiamų bangų dažnis yra tarp 0,3 ir 300 GHz. 2011 [28] Chan ir kiti pranešė, kad pastaruoju metu mikrobangų ekstrakcija yra pradėta taikyti įvairių eterinių aliejų ir biologiškai aktyvių medžiagų išskyrimui iš gamtinių žaliavų. Mikrobangų ekstrakcija yra laikoma pakankamai selektyvia medžiagų išskyrimo metodika dėl mikrobangų tiesiogiai sukeliamo karščio į norimas ekstrahuoti medžiagas ar jas kaupiančias ląsteles. Dėl esamos molekulių dielektrinės konstantos yra galimas jų selektyvus veikimas mikrobangomis [29]. Veikimo mechanizmas susidaro iš dviejų dalių, t.y., selektyvus cheminės medžiagos/žaliavos ląstelės veikimas mikrobangomis ir sukeliamas karštis ir/arba tirpiklio esančio aplink ekstrahuojamą medžiagą veikimas, kuris kaitina žaliavą. Žaliavos kaitinimas sukelia padidėjusį slėgį viduląstelinėje terpėje ir ląstelės sienelę sudarančių medžiagų degradaciją. Dėl per didelio slėgio ląstelėje ir/arba ląstelės sienelės medžiagų pažaidos, sienelė plyšta ir esamas tirpiklis gali lengvai pasiekti reikalingas medžiagas, jas ištirpdyti. Raman ir Gaikar 2002 [2] naudojo šią metodiką išskirti piperinui. Pirmoji metodologijos pastaba iškilo stebint ekstrakcijos išeigos padidėjimą, nepriklausomą nuo tirpiklio, esant 4 h trukmės piperino mirkymui vandenyje prieš atliekamą ekstrakciją. Mokslininkai eksperimentavo su įvairaus poliškumo tirpikliais, t.y., etanoliu, dichlormetanu, toluenu, heptanu, petroleteriu. Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad nepoliniai tirpikliai, tokie kaip petroleteris davė didžiausią ekstrakcijos išeigą – 94 %, o grynumas 85 %. Nors naudojant tokius polinius tirpiklius kaip etanolis ar dichlormetanas, ekstrakcijos išeiga buvo tik 75 -80 %, o grynumas nuo 60 iki 72 %. Mokslininkai teigė, jog tokie rezultatai yra dėl polinio tirpiklio mikrobangų absorbcijos. Gautas išeigų skirtumas grindžiamas pipiro žaliavos mikrobangų kiekio absorbcija, turint omenyje, kad nepolinis tirpiklis neabsorbuoja mikrobangų ir jų dauguma audrina žaliavos ląsteles, o ne tirpiklį, taip gerindami ekstrakcijos našumą [30].

(15)

Lentelė 1. Ekstrakcijos metodikų palyginimas Metodas Ekstrakcijos

laikas

Privalumai Trūkumai Šaltinis

Modifikuota Soksleto e.

12h +/- 1h Paprasta, lengva darbo metodika. Didelis tirpiklio sunaudojimas, ilgas ekstrakcijos laikas. Subramanian ir kiti 2011[31]

Ultragarsinė e. 18 min. Trumpas ekstrakcijos laikas, didesnė išeiga ir geresnė tyrimo sąlygų kontrolė, lyginant su Soksleto metodika. Reikalauja gero pavyzdžio susmulkinimo ir gautos išeigos filtravimo. Rathod ir Rathod 2014 [32]

Mikrobangų e. 2 min. Trumpiausias ekstrakcijos laikas, didelė išeiga, labiau selektyvi, lyginant su ultragarsine ekstrakcija. Reikalauja kruopštesnės filtracijos nei ultragarsinei ekstrakcijai, reikia laukti, kol

medžiaga ir

tirpiklis atvės.

Raman ir Gaikar 2002b [30]

1.1.5. Kokybinis ir kiekybinis nustatymas

Yra įvairių analizės metodų, skirtų nustatyti piperiną: Kjeldalio metodas, kolorimetrinio tyrimo metodikos, dujų chromatografija, ultravioletinė (UV) spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC).

Kjeldalio metodikoje matuojamas visas azoto kiekis, šis tyrimas suteiktų klaidingai per didelius koncentracijos parodymus, nes nėra pakankamai selektyvus tik piperinui, o atpažįsta ir chaviciną, piperitiną bei kai kurias laisvąsias aminorūgštis. [19] UV spektrofotometrinis metodas yra pagrįstas piperino absorbcijos maksimumu, esant 343 nm bangos ilgio šviesai. Šis metodas yra greitas ir paprastas bei nesuteikia klaidingų duomenų, nes nėra selektyvus piperino izomerams. [33] Dujų chromatografija geba atskirti pipirų ištraukoje esančius alkaloidus bei gali suteikti tam tikrų žinių apie piperino degradacijos būseną [34]. Pastaruoju metu ESC tapo dažna metodika, norint nustatyti piperino koncentraciją augalo dalyse ar vaisiuose. Be ESC, yra taikoma patobulinta plonasluoksnės chromatografijos metodika, vadinama efektyviąja plonasluoksne chromatografija (EPC). EPC pasižymi geresniu tiriamųjų medžiagų atskyrimu nei paprasta plonasluoksnė chromatografija [35].

Toliau pateikiamas trumpas tyrimo metodikų aprašymas.

(16)

Lentelė 2. Kolorimetrijos metodikos

Metodas Procedūra Šaltinis

Nitrato rūgšties metodas

Piperinas koncentruotoje nitrato r. suformuoja nestabilų geltonos spalvos junginį. Paveiktas šarmu ir tiouratu, geltonos spalvos junginys virsta į stabilų raudonos spalvos junginį, atpažįstamą 490 nm bangos ilgio šviesa.

Graham 1965c [39]

Kamarovskio metodas

Piperiną kaitinant su p-hidroksibenzaldehidu, tiouratu ir koncentruota sulfato rūgštimi, susidaro violetinės spalvos junginys, identifikuojamas 570 nm bangos ilgio šviesoje.

Graham 1965a [37]

Fosfato rūgšties metodas

Piperiną kaitinant su 85 proc. fosfato r. 100°C temperatūroje 8 min., susidaro stabilus melsvai žalios spalvos junginys, identifikuojamas 635 nm bangos ilgio šviesoje.

Graham 1965b [38]

UV SPEKTROFOTOMETRIJA

Piperino analizė atliekama piperiną ištirpinant etanoliniame ar metanoliniame tirpale ir absorbcija matuojama 343 nm bangos ilgio šviesa.

CHROMATOGRAFIJA

Lentelė 3. Chromatografijos metodikos

Metodika Kolonėlė Mobili fazė UV

bangos ilgis (nm) Tekmės greitis (ml/min) Šaltinis ESC C18 Acetonitrilas:Vanduo (90:10) 343 1,5 Rathod ir Rathod 2014[32] ESC C18 Dichlormetanas:Metanolis (100:4) 343 0,6 Raman ir Gaikar 2002 [2] ESC C18 Acetonitrilas:Vanduo:Acto r.(60:39,5:0,5) 340 1 Upadhyay ir kiti 2013[36] EPC - Toluenas:Etilacetatas (70:30) 343 - Raman ir Gaikar 2002[30] EPC - Benzenas:Etilacetatas:Dietileteris (60:30:10) 343 - Vyas ir kiti 2013 [35]

(17)

1.2. Kurkuminas

Kurkuminas - medžiaga, išskiriama iš dažinės ciberžolės šaknies. Ji yra viena iš kelių daug žadančių natūralių medžiagų, kurios yra nuodugniai tiriamos tiek iš biologinės, tiek iš cheminės pusės. Moksliniai tyrimai atlikti per pastaruosius 40 metų įrodė, kad kurkuminas pasižymi įvairiomis farmakologinėmis savybėmis ir gali būti naudojamas gerinti tiek vėžio sukeltus padarinius, tiek tam tikrų chroninių ligų simptomus. Kurkuminas turi bene 200 metų besitęsiančią mokslinių tyrimų istoriją, pradedant nuo 1815, kai pirmą kartą buvo išskirtas grynas kurkuminas iš ciberžolės šaknies [40]. Iki 1970 metų apie kurkuminą buvo žinoma nedaug, 1990 metais atlikti tyrimai teigė, kad kurkuminas turi potencialą gydyti vėžį, nuo to laiko iki dabar tyrimo greitis stipriai padidėjo ir šiuo metu yra skaičiuojama daugiau nei 14 000 kurkumino citatų [41].

1.2.1. Cheminės savybės

Dažinė ciberžolė Cucurma longa yra kultyvuojama tropiniuose ir subtropiniuose regionuose. Didžiausias ciberžolės gamintojas yra Indija, joje jis vartojamas kaip natūrali vaistinė medžiaga jau daugelį metų. Priklausomai nuo augalo kilmės ir augymvietės ciberžolė savyje kaupia nuo 2 iki 9 proc. kurkuminoidų [42]. Kurkuminoidai tai junginių grupė tokių kaip: kurkuminas, demetoksikurkuminas, bisdemetoksikurkuminas ir ciklinis kurkuminas. Iš šių junginių daugiausiai yra kurkumino, o mažiausiai - ciklinio kurkumino. Pats kurkuminas yra simetrinė molekulė, taipogi žinoma kaip diferuloil-metanas. Pagal IUPAC kurkuminas vadinamas (1E,6E)-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1,6-heptadien-3,5-dionas, žymimas C21H20O6, bei molekulinė jo masė yra 368,38 g/mol. Savo struktūroje kurkuminas turi: dvi aromatines žiedų sistemas, savyje turinčias o-metoksi fenolines grupes, kartu sujungtas 7 anglies atomų tilteliu, turinčiu alfa ir beta padėtyse du pakaitus [42].

Kurkuminas buvo pirmą kartą atrastas dviejų Harvardo mokslininkų dar prieš 200 metų. Ši natūraliai ciberžolės gaminama medžiaga dėl savo įvairių farmakologinių savybių yra plačiai tiriama [43]. Dar 1949 metais buvo nustatyta, kad kurkuminas veikia antibakteriškai [44]. Nuo to laiko buvo atrasta kitų kurkumino poveikių žmogaus organizmui: hipoglikeminis, antioksidacinis, žaizdas gydantis poveikis. Per pastaruosius tris dešimtmečius atlikti ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad kurkuminas pasižymi plačiu terapiniu spektru [45]. Nors terapinis ciberžolės šaknies miltelių panaudojimas pirmą kartą buvo užregistruotas dar 1748 metais, pirmasis mokslinis straipsnis, susijęs su kurkumino farmakologiniu poveikiu kasos funkcijai, buvo paskelbtas tik 1937 metais [46]. Nuo 2012 liepos yra

(18)

paskelbti net 67 klinikiniai tyrimai, susiję su kurkuminu bei dar virš trisdešimties yra toliau tęsiami. Saugumas, tolerancija ir mažas kurkumino toksiškumas, esant didelėms dozėms, klinikiniu atžvilgiu yra gerai ištirtas [43]. Nepaisant daugelio farmakologinių tyrimų, kurkuminas taip pat pasižymi hepatoprotekciniu, alkoholio intoksikaciją mažinančiu poveikiu. Tyrimuose kurkuminas buvo naudotas kaip viena medžiaga arba kartu su kvercetinu, gemcitabinu, piperinu, docetakseliu, bioperinu, sulfasalazinu, prednizonu, pentoprazolu, N-acetilcisteinu ir kitais [47].

Geltoni milteliai, gaunami iš ciberžolės šakniastiebio, pasižymi antioksidacinėmis, piešuždegiminėmis ir bioprotekcinėmis savybėmis. Pirmasis apie kurkumino antioksidacinį poveikį paskelbė Sharma (1976) [48]. Keleto tyrimų duomenys parodė, kad kurkuminas geba slopinti lipidų peroksidaciją, toliau pateikiami tyrimai, įrodantys šį teiginį: žmogaus eritrocitų membranų lipidų peroksidacijos slopinimas in vitro, dirbtinai Fe2+ /askorbato sukeltos lipidų peroksidacijos žiurkių mikrosomose nuo kurkumino dozės priklausomas slopinimas [49, 50]. Superoksidų gaminimosi ksantino-ksantino oksidazės sistemoje 40 % slopinimas 75 mikromolinės koncentracijos kurkumino tirpalu su 50 mikromolinės koncentracijos tirpalu buvo pasiektas 76 procentų superoksidų gamybos slopinimas ir Fe2+ oksidacijos slopinimas Fentono reakcijoje. Kiti du kurkuminoidai, esantys ciberžolėje (demetoksikurkuminas ir bis-demetoksikurkuminas), yra taip pat puikūs antioksidantai [51]. Šis tyrimas siūlo daryti išvadą, kad metoksi- ir fenolinės grupės mažai prisideda prie antioksidacinio aktyvumo. Kai kurie tyrimai parodė, kad visi trys kurkuminoidai reaguoja su Fe2+, taigi geležies sukelta lipidų peroksidacija galbūt yra slopinama dėl susidarančio chelatinio junginio tarp metalo ir kurkuminoido. Kurkuminas, demetoksikurkuminas ir bis-demetoksikurkuminas buvo palyginti gebėjimu slopinti superoksidus ir laisvuosius radikalus, naudojant DPPH (1,1-difenil2-pikril-hidrazilą). Gauti rezultatai parodė, kad didžiausią antioksidacinį poveikį turi kurkuminas, po to demetoksikurkuminas ir galiausiai bis-demetoksikurkuminas. Šie rezultatai parodo, kad fenolinė grupė, esanti kurkumino cheminėje struktūroje, yra būtina laisvųjų radikalų slopinimui bei metoksi- grupės buvimas cheminėje struktūroje dar labiau didina antioksidacinį poveikį [52].

Nors ekstrakcija ir kurkumino atskyrimas nuo ciberžolės miltelių pirmą kartą buvo atliktas 1815 metais, nauji ir vis tobulesni ekstrakcijos metodai kuriami net praėjus dviems šimtams metų. Ekstrakcija skysčiais kartu naudojant chromatografavimo kolonėlę yra bene populiariausias metodas išskriti

(19)

kurkuminą, naudojami tirpikliai yra įvairūs, tiek poliniai tiek nepoliniai: heksanas, etilacetatas, acetonas, etanolis ir kiti. Iš organinių tirpiklių, etanolis yra dažniausiai naudojamas atliekant ekstrakciją. Nors chlorinti tirpikliai taip pat gerai išskiria kurkuminą iš žaliavos, jie yra nenaudojami dėl toksiškumo ir gauto produkto netinkamumo vartoti maisto pramonėje [53]. Soksleto ekstrakcija, ultragarsė ekstrakcija ir mikrobangų ekstrakcija yra dažniausiai naudojamos metodikos, atliekant kurkumino išskyrimą. (Šių metodologijų veikimo mechanizmai ir detalesnis aprašymas yra piperino ekstrakcijos skiltyje 1.1.4.). Su didėjančiu kurkuminoidų panaudojimu maisto pramonėje ir vaistinių papildų sudėtyje, mokslininkai bando atrasti našią, greitą ekstrakcijos metodiką, kuri naudotų valgiui tinkamų tirpiklių sistemas [54]. Taipogi naši ekstrakcijos metodika yra naudojant superkritinį anglies dioksidą [55]. Metodikos parametrai yra: slėgis tarp 25-30 Mpa ir 318 K temperatūra. Ši metodika yra labai naši dėl gauto produkto kokybės ir trumpo ekstrakcijos laiko. Atlikti superkritinę CO2 ekstrakciją trunka vos keletą minučių ir gautas produktas nereikalauja tolesnio apdirbimo. Lyginant šiuos parametrus su anksčiau minėtomis metodologijomis, ši ekstrakcija yra labai naši ir laiką taupanti. Taip pat esti ir fermentinės ekstrakcijos. Ši metodika skirta apdirbti žaliavą prieš atliekant ekstrakciją, naudojant tokius fermentus kaip alfa-amilazę ar gliukoamilazę. Dėl šio priešekstrakcinio žingsnio labai padidėja gauto produkto išeiga, deja, tai yra brangi metodika ir pramonėje ji yra nenaudojama [56].

Dažniausiai naudojamos metodikos nustatyti kurkumino kiekiui ir tapatybei yra plonasluoksnė ar efektyvioji skysčių chromatografijos. Kurkuminas gali būti atskiriamas iš mišinio naudojant kolonėlinę chromatografiją absorbuojant medžiagas ant silicio gelio nejudriosios fazės naudojant tirpiklių sistemas: dichlormetanas/acto r. arba metanolis/chloroformas. Tokiu būdu yra gaunamos trys skirtingos tirpiklių frakcijos. Dažniausiai kaip nejudri fazė naudojamos atvirkštinių fazių C18 kolonėlės ir acetonitrilas/vanduo arba chloroformas/metanolis tirpiklių sistemos kaip mėginio nešiklis [57]. Identifikuojant kurkuminą, dažniausiai matuojama šviesos absorbcija ties 350-450 nm šviesos bangos ilgiu arba UV šviesos spektre ties 250-270 nm. Efektyvioji skysčių chromatografija kartu su diodų matricos ir fluorescentine atpažinimo metodika yra naudota atpažįstant kurkuminą. Taip pat galima ir skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija. Iš visų šių metodikų pati jautriausia yra fluorescentinė atpažinimo metodika, esant 400-450 nm bangos ilgio šviesai. Efektyvioji skysčių chromatografija, skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija yra naudojamos atpažinti mažus tiriamosios medžiagos kiekius biologiniuose skysčiuose, tai padeda įvertinti kurkumino farmakokinetiką, biologinį praeinamumą, metabolizmą [58].

(20)

1.3. Kapsaicinas

Kapsaicinas yra veiklioji medžiaga, kaupiama raudonųjų čili pipirų, kurie priklauso Capsicum augalų genčiai. Čili paprikos yra plačiai naudojamos kaip prieskoniai, suteikiantys maistui aštrumo pojutį. Šis kapsaicinoidas, sukeliantis aštrumo pojūtį valgant, taip pat yra dirgiklis, sukeliantis deginimo jausmą, esant kontaktui su oda. Kapsaicinas bei keletas kitų jam giminingų junginių yra vadinami kapsaicinoidais, jie sintetinami čili paprikose kaip antriniai metabolitai, skirti atbaidyti ir apsaugoti nuo žolėdžių gyvūnų bei kai kurių rūšių grybelių [59]. Kapsaicino vartojimo saugumas yra pakankamai kontraversiškas dėl įvairių tyrimų gautų rezultatų, bet 1982 metais Sambaiah ir kt. atlikto tyrimo duomenimis, pastovus kapsaicino vartojimas indų populiacijoje nedaro įtakos žmogaus augimui, organų svoriui, azoto balansui organizme bei kraujo sudėčiai [60]. Remiantis gyvūnų tyrimais yra daroma išvada, kad kapsaicinas nesukelia pastebimų mutageninių procesų [60].

1.3.1. Cheminės savybės

Pagrindinis kapsaicinoidas, kaupiamas čili paprikų, yra kapsaicinas, kartu su dihidrokapsaicinu, nordihidrokapsaicinu ir homokapsaicinu. Kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas sudaro apie 90 % visų čili paprikos kaupiamų kapsaicinoidų [61 ,62, 63]. Šie du junginiai sukelia dvigubai stipresnį aštrumo pojūtį valgant nei kiti kapsaicinoidai. Aštrumas valgant yra matuojamas Scoville vienetais, kurie yra nustatomi skaičiumi medžiagos skiedimo kartų iki kol aštrumo pojūtis yra nebejaučiamas. Scoville skalėje kapsaicino skiedimų skaičius yra 16*106

, o dihidrokapsaicino – 15*106 [59]. Kapsaicinas nuo dihidrokapsaicino skiriasi tik acilo grupės įsotinimu. Kapsaicinas (trans-8-metil-N-vanilil-6-nonamidas) yra kristalinis, lipofilinis, bespalvis ir bekvapis alkaloidas, kurio molekulinė formulė – C18H27NO3. Molekulinis svoris - 305,40 g/mol, tirpsta riebaluose, alkoholyje ir aliejuose. Gryno kapsaicino lydymosi temperatūra yra tarp 62 ir 65 laipsnių Celsijaus, virimo temperatūra varijuoja tarp 210 ir 220 laipsnių Celsijaus, bei didžiausias UV šviesos bangų absorbcijos spektras yra tarp 227 nm ir 281 nm šviesos bangos ilgių. Pirmą kartą kapsaicinas buvo kristalizuotas 1876 metais Tresh, kuris jam ir suteikė dabar žinomą pavadinimą, bet molekulinė kapsaicino struktūra buvo išnagrinėta tik 1919 metais mokslininkų Nelson ir Dawson [63]. Kapsaicinas pasižymi cis/trans izomerizacija, nes struktūroje esanti dviguba jungtis trukdo junginio vidinei rotacijai. Dažniausiai kapsaicinas yra randamas kaip trans izomeras [62].

Kapsaicinas yra plačiai tiriamas dėl savo farmakologinių savybių. Jis pasižymi antidiabetinėmis, akmenų susidarymą mažinančiomis, priešuždegiminėmis, nuskausminamosiomis, priešvėžinėmis savybėmis [59]. Kapsaicinoidai gali sukelti farmakologinį atsaką organizme dviem būdais, t.y., per

(21)

selektyvų kasaicinoidų receptorių TRPV1 bei ne su receptoriumi susijusiu poveikiu. Taipogi kapsaicinas pasižymi ir priešopiniu poveikiu, mažindamas rūgščių išsiskyrimą į skrandį, stimuliuodamas šarmų ir gleivinės apsauginio sluoksnio sintezę. Kapsaicinas pasižymi įvairių vėžinių ląstelių augimo slopinimu. Jis geba sąveikauti su mikrosomomis, metabolizuojančiomis ksenobiotikus graužikų organizme, inhibuodamas CYP450 bei kitomis šio fermento izoformomis, jungdamasis su jomis negrįžtamai. Ši savybė slopinti mikrosominę monooksigenazę yra susijusi su priešvėžiniu šio junginio potencialu. 2012 metais Anandakumar ir kt. atlikto tyrimo duomenimis, kapsaicinas pasižymėjo antivėžiniu poveikiu, susijusiu su benzopireno sukeltu vėžiu graužikams [64]. Kasdienės 10 mg/kg kapsaicino dozės benzopirenu sukeltu plaučių vėžiu sergantiems graužikams žymiai sumažino ir sulėtino vėžio sukeliamus simptomus bei eigą. Antidiabetinis kapsaicino potencialas buvo įrodytas Razavi ir kt. 2006, atlikus tyrimą su graužikais, turinčiais genetinę predispoziciją sirgti 1 tipo diabetu [65]. Šiame tyrime kapsaicinas buvo skiriamas injekcijomis į paodį, siekiant visam laikui pašalinti kasoje esančių juntamųjų neuronų pogrupį gaminantį TRPV1+ baltymą. Yra manoma, kad šis baltymas yra atsakingas už 1 tipo diabeto vystymąsi, nes jis atakuoja patogenines T-limfocitų ląsteles, kurios savo ruožtu sukelia kasos beta ląstelių žūtį. Skiriant kapsaiciną, TRPV1+ baltymas yra inhibuojamas ir sustabdomas 1 tipo diabeto vystymasis. Kapsaicinas išoriškai gali būti naudojamas kaip analgeziją sukelianti medžiaga. Šiuo metu jis yra naudojamas išoriškai kaip tepalas arba didelės koncentracijos pleistras, siekiant numalšinti periferinius neuropatinius skausmus, sukeltus sergant juostine pūsleline [66]. Naudojamų tepalų koncentracija gali būti tarp 0,025 % ir 0,075 %; jie skiriami trumpalaikiam raumenų, sąnarių skausmui malšinti. Nereceptiniai kapsaicino tepalai ar pleistrai, parduodami vaistinėse, pasižymi vidutiniu arba silpnu skausmo malšinimo poveikiu. Šis poveikio susilpnėjimas, lyginant su atliktais klinikiniais tyrimais, gali būti susijęs su per maža kapsaicino koncentracija farmacinėje priemonėje, prasta sorbcija pro odą bei kitais faktoriais. Esant didelėms kapsaicino dozėms pleistre (8 %) ir laikant jį priklijuotą 60 min., galima pasiekti neuropatinio skausmo malšinimo net iki 12 savaičių [66].

Dar 1996 m. fenoliniai junginiai patraukė mokslininkų dėmesį kaip potencialūs antioksidantai, galintys apsaugoti žmogaus ląsteles nuo laisvųjų radikalų formavimosi ir jų sukeliamos oksidacijos, esant natūraliam aerobiniam metabolizmo procesui [67]. Atliekant tyrimus, yra įrodyta, kad kapsaicinas geba sumažinti dirbtiniu būdu sukeltą žmogaus mažo tankio lipoproteidų oksidaciją vario jonais [68]. Kapsaicinas labiau sumažina dvivalentės geležies sukeltą lipidų peroksidaciją pelių kepenyse, lyginant jį su gerai žinomu antioksidantu alfa-tokoferoliu [69]. Taipogi kapsaicinas pasižymi DPPH radikalų surišimu tiek žiurkių kepenų ląstelių membranų išorėje, tiek pačiose membranose. Kapsaicinas, maitintas pelėms po 3 mg/kg dozėmis tris dienas iš eilės, sumažino oksidacinį stresą kepenyse, plaučiuose ir

(22)

inkstuose (lyginant oksidacijos lygį malonaldehido kiekiu kepenyse). Iš šio tyrimo rezultatų galima daryti prielaidą, kad net trumpalaikis ir nepastovus kapsaicino vartojimas gali sumažinti oksidacinį stresą organizme [70]. Kapsaicinas (0,015 %), skiriamas kartu su pašaru žiurkėms, sumažino eritrocitų oksidacinį stresą. Tai buvo nustatyta, matuojant natūralių antioksidacinių medžiagų kiekius tiek pačiuose eritrocituose, tiek kepenyse, be to, pastebėtas sumažėjęs lipidų peroksidų lygis [71]. Taipogi buvo pastebėta, kad, skiriant kapsaiciną kaip maisto papildą, yra tausojama ir dalinai greitinama regeneracija natūralių antioksidacinių sistemų bei jas sudarančių cheminių medžiagų. Skiriant kapsaiciną hipercholesteroleminėms pelėms, dalinai atsistatė kepenų tiolių koncentracijos bei padidėjo kepenų superoksido dismutazės, GSH reduktazės ir transferazės cheminiai aktyvumai [72].

Paprikų genties atstovai yra vieninteliai žinomi augalai, gaminantys kapsaicinoidus. Pagrindinis ir labiausiai aktyvus čili paprikų kapsaicinoidas yra kapsaicinas [73]. Procentaliai kapsacinas užima 69 %, dihidrokapsaicinas 22 %, nordihidrokapsaicinas 7 %, homodihidrokapsaicinas 1 % visų kaupiamų kapsaicinoidų [74]. Remiantis dauguma tyrimų, kapsaicinoidai šviežių paprikų vaisiuose kaupiasi placentoje, dalis šių antrinių metabolitų gali pereiti į sėklas dėl artimo kontakto su placenta [75]. Tyrimas, atliktas Cisneros ir kt. 2007 parodo, kad kapsaicinoidų koncentracija skiriasi tiek skirtinguose genties atstovuose, tiek jų augimvietėse [76]. Kapsaicinoidų ekstrakcijai dažniausiai naudojami organiniai tirpikliai, ekstraktų išeigos gali skirtis dėl ekstrakcijai naudojamų žaliavų ir žaliavų paruošimo metodikos. Dar 1987 metais Attuquayefio ir Buckle atliktame tyrime buvo nustatyta, kad atliekant ekstrakciją organiniais tirpikliais, tokiais kaip: acetonas, chloroformas, metanolis ar acetonitrilas gaunama didelė kapsaicinoidų išeiga [77]. Tyrėjai taipogi pamini, kad didžiausia kapsaicinoidų išeiga buvo pasiekta, naudojant acetoną, esant susmulkintai ir išdžiovintai čili paprikų žaliavai. Ieškant efektyviausio ekstrakcijai naudotino tirpiklio buvo nustatyta, kad iš acetono, etanolio ir acetonitrilo, tinkamiausias sutrintiems ir išdžiovintiems paprikų milteliams ekstrahuoti yra acetonas. Norint išskirti kapsaicinoidus iš šviežios žaliavos labiau tinkami naudoti tirpikliai yra etanolis ar acetonitrilas [78]. Tuo tarpu Nwokem ir kiti 2010 renkasi etanolį kaip labiausiai tinkamą ekstrakcijai tirpiklį dėl didelės ekstrakto išeigos ir pakankamo grynumo, turint omenyje mažą pigmentų, organinių aliejų ir kitų pašalinių medžiagų koncentraciją ekstrakte, lyginant su jau anksčiau aptartais ekstrahentais [79]. Taigi remiantis anksčiau aptartais straipsniais, galima daryti prielaidą, kad labiausiai tinkamas ekstrakcijai tirpiklis yra etanolis. Ekstrakcijos metodo pasirinkimas yra tiek pat svarbus kaip ir ekstrakcijai naudojamo tirpiklio. Ultragarsinė ekstrakcija, atlikta Barbero ir kt. 2008 metais, gebėjo per 10 minučių iš žaliavos išskirti pakankamą kapsaicino kiekį, leidžiantį šią metodiką naudoti rutiniškai nustatant kapsaicino kiekį tiriamosiose žaliavose [80]. Chuichulcherm ir kt. 2013 m. lygino ultragarsinę ir

(23)

mikrobangų ekstrakciją su labiau tradicine ir gerai žinoma Soksleto ekstrakcijos metodika [81]. Ekstrakcijai buvo naudoti susmulkinti ir išdžiovinti čili pipirų vaisiai, etanolis kaip ekstrahentas. Atsižvelgiant į gautas kapsaicino koncentracijas: 5,28 mg/g naudojant mikrobangų ekstrakciją ir 4,01 mg/g naudojant ultragarsinę ekstrkaciją, galima manyti, jog mikrobangų ekstrakcija yra naudingesnė dėl didesnės kapsaicino išeigos, bet, atlikus tyrimą, gauti duomenys parodė, kad mažiausiai resursų (t.y. elektros energijos ir darbo laiko) sunaudojanti ir bendrai vertinant našiausia metodologija yra ultragarsinė ekstrakcija.

Yra manoma, kad efektyvioji skysčių chromatografija patikimiausia kapsaicinoidų tyrimo ir nustatymo metodika, jei mėginys prieš tyrimą yra išvalomas ir išgryninamas. Taipogi nustatymui yra naudojamos ir plonasluoksnė bei kolonėlinė chromatografijos. 2011 metais Gahungu ir kiti ekstrahavo kapsaicinoidus, naudodami kolonėlinę ekstrakciją, o gautos ištraukos kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui panaudojo atvirkštinių fazių efektyviąją skysčių chromatografiją kartu su fotodiodų matricos detektoriumi [82]. Nustatyti kapsaicino (47,632 mg/g) ir dihidrokapsaicino (23,096 mg/g) kiekiai. Tais pačiais metais atliktas Al Othman ir kt. eksperimentas, naudojant tą pačią chromatografijos metodologiją, skirtą atskirti bei kokybiškai ir kiekybiškai ištirti penkis skirtingus Capsicum L. genties augalų pavyzdžius [83]. Rezultatai parodė, kad daugiausiai kapsaicino kaupia čili pipirai (4,249 mg/g), mažiausiai žalieji čili pipirai (0,001 mg/g). 2013 Ida Musfiroh ir kiti ekstrahavo įvairius Capsicum L. genties vaisius ir tyrė juos ESC metodu [84]. Optimalios tyrimo salygos buvo pasiektos, atliekant tyrimą atvirkštinių fazių kolonėle, esant 1,0ml/min tekmės greičiui, acetonitrilo ir 2% acto r. 6:4 mobilios fazės santykiui, nustatant kapsaiciną ties 280 nm bangos ilgio šviesa, naudojant spektrofotometrinį detektorių. Tyrime, atliktame 2015 metais, Zamora ir kt. bandė nustatyti, ar tiesioginis kapsaicino kokybinis ir kiekybinis nustatymas spektrofotometru gali prilygti efektyviajai skysčių chromatografijai [85]. Pagamintų ekstraktų mėginiai buvo tiriami ties 280 nm šviesos bangos ilgiu. Tyrimo rezultatai teigia, kad tiesioginis spektrofotometrinis tyrimo metodas gali būti naudojamas greitai rutininei bendro kapsaicinoidų mišinio nustatymui, nes koncentracijų paklaida nuo ESC metodikos skiriasi iki 9 %. Deja, tiesioginį spektrofotometrinį tyrimą galima atlikti tik kapsaicinoidų mišiniui įvertinti, nes tiriant mėginio absorbciją ties 280 nm bangos ilgiu šviesą absorbuoja ir kapsaicino derivatai, t.y., dihidrokapsaicinas, monodihidrokapsaicinas bei kiti kapsaicinoidai.

(24)

2.TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – sausi sumalti prieskoniai, savo sudėtyje turintys dažinių ciberžolių, juodų pipirų, aitriosios paprikos miltelių, randami maisto prekių parduotuvėse. Tirti 3 gryni prieskoniai, savo sudėtyje neturintys kitų prieskonių ar konservantų. Visos trys prieskonių rūšys gaminamos ir parduodamos Lietuvoje.

2.2. Naudotos medžiagos ir reagentai

DPPH reagentas (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, Vokietija); Etanolis (96 % Marie brizard wine and spirits, Lietuva);

Kurkuminas (98,0%, Sigma-Aldrich, Vokietija); Kapsaicinas (98,0%, Sigma-Aldrich, Vokietija); Piperinas (98,0 %, Acros organics, Kinija); Acetonitrilas (99,9 %, Roth, Vokietija);

Trifluoracto rūgštis (≥99.0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija).

2.3. Naudota aparatūra

Kurkumino, kapsaicino ir piperino kokybinis ir kiekybinis įvertinimas ekstraktuose, išgautuose iš prieskonių miltelių, buvo vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos būdu. Tyrimo metu naudotas Waters 2695 (Milford, JAV) skysčių chromatografas. Prieskoniuose esančioms medžiagoms atskirti naudota ACE C18 kolonėlė (ilgis 250 mm, vidinis diametras 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5 μm). Su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (Milford, JAV) vykdyta analičių detekcija prie 340 nm (piperinui), 420 nm (kurkuminui) ir 280 nm (kapsaicinui) šviesos bangų ilgių. Tiriamųjų objektų ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje Bandelin Sanorex Digital 10P (Vokietija). Ekstraktai centrifuguoti su Centurion Scientific C2 Series (Anglija) centrifuga. Prieš chromatografiją ekstraktai filtruoti 0,45 μm dydžio filtru. Kaitinant prieskonių ekstraktus naudota kaitinimo vonelė Heidolph MR Hei-Standard (Vokietija) Vertinant antioksidacinį ekstraktų poveikį pagal DPPH radikalų surišimą naudotas spektrofotometras „Agilent Technologies“ (Cary 60, USA).

(25)

2.4. Kapsaicino, kurkumino, piperino ekstraktų paruošimas

Kapsaicino ekstraktas buvo ruošiamas užpilant tikslų 1,25 g prieskonio svėrinį 25 ml (1:20) etanolio, tada laikoma 15 min. ultragarsinėje vonelėje 50° C (+-2° C) temperatūroje. Kurkumino ekstraktas buvo ruošiamas užpilant tikslų 1,25 g prieskonio svėrinį 25 ml (1:20) 96 % etanolio, veikiamas 30 min. ultragarsinėje vonelėje 30 min. 35° C (+-2° C) temperatūroje. Piperino ekstraktas buvo ruošiamas užpilant tikslų 2,5 g prieskonio svėrinį 25 ml (1:10) etanolio, veikiamas 20 min. ultragarsinėje vonelėje 50° C (+-2° C) temperatūroje. Gauti ekstraktai centrifuguojami 5 min. 300 apsisukimų per minutę greičiu. Tirpalai atskiriami nuo nuosėdų ir filtruojami per 0,45 μm dydžio filtrą, išvalyti ekstraktai paliekami tolesniems tyrimams šaldytuve.

2.5. Reagentų paruošimas

Kiekvieną kartą atliekant analizę ruošiamas šviežias 6 x 10-5

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) tirpalas ir laikomas prieš panaudojant tamsaus stiklo butelyje bei tamsoje saugant nuo saulės spindulių. Sveriama 0,00118 g DPPH reagento ir tirpinama 50 ml 96 % etanolyje, stipriai suplakama ir paliekama 60 min. tamsoje.

2.6. Ultragarsinės ekstrakcijos sąlygų parinkimas.

Siekiant įveikti Soksleto ir paprastosios skysčių ekstrakcijos metodų trūkumus buvo pasirinkta ultragarsė ekstrakcija. Naudota ultragarsė Bandelin Sanorex Digital 10P (Vokietija) vonelė. Šios metodikos mechanizmas yra pagrįstas kavitacijos (tuščių erdvių tirpale ir jų subliuškimu į savo centrą) fenomenu ir šiluminiais efektais, susidarančiais ekstrakcijos metu, kurie pagerina tirpikio ir išskiriamos medžiagos maišymąsi tarpusavyje [26]. Garso bangų dažnis, akustinė galia, tirpiklis, tirpiklio temperatūra - visi šie faktoriai daro įtaką ekstrakcijos našumui. Analizuojant mokslinę literatūrą ir remiantis moksliniais straipsniais, nagrinėjančiais kapsaicino, kurkumino ir piperino ultragarsinę ekstrakciją, tyrimui pasirinktas tirpiklis yra etanolis dėl didesnės nei acetono ar metanolio virimo temperatūros bei mažesnės balastinių medžiagų ekstrakcinės galios. Gaminant prieskonių ekstraktus, kiekvienam iš junginių ekstrakcijos salygos optimizuojamos individualiai siekiant gauti kuo didesnę medžiagų išeigą su kuo mažesnėmis tirpiklio, laiko ar temperatūros sąnaudomis. Pradinės ekstrakcijos sąlygos pasirinktos remiantis moksliniais straipsniais

(26)

2.6.1. Piperino ultragarsinės ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Lentelė 4. Tinkamo tirpiklio santykio nustatymas

TIRPIKLIO SANTYKIO PASIRINKIMAS

Tyrimo sąlygos: Vonelės temperatūra: 40°C (+-2°C); Ekstrakcijos laikas: 10 min.

1:2 1,935 mg/g (+-0,080 mg/g) 1:5 2,304 mg/g (+-0,101 mg/g) 1:10 2,502 mg/g (+-0,091 mg/g) 1:15 2,550 mg/g (+-0,123 mg/g) 1:20 2,697 mg/g (+-0,106 mg/g) 1:25 2,158 mg/g (+-0,114 mg/g) 1:30 3,789 mg/g (+-0,106 mg/g)

Lentelė 5.Tinkamos temperatūros nustatymas

TEMPERATŪROS PASIRINKIMAS

Tyrimo sąlygos: Tirpiklio santykis: 1:10; Ekstrakcijos laikas: 10 min.

20°C 1,399 mg/g (+-0,148 mg/g)

30°C 1,806 mg/g (+-0,116 mg/g)

40°C 2,476 mg/g (+-0,060 mg/g)

50°C 2,796 mg/g (+-0,108 mg/g)

60°C 2,887 mg/g (+-0,072 mg/g)

Lentelė 6.Tinkamo laiko nustatymas

LAIKO PASIRINKIMAS

Tyrimo sąlygos: Vonelės temperatūra: 50°C (+-2°C); Tirpiklio santykis 1:10.

10 min. 2,790 mg/g (+-0,109 mg/g)

15 min. 3,067 mg/g (+-0,062 mg/g)

20 min. 3,209 mg/g (+-0,091 mg/g)

(27)

30 min. 3,556 mg/g (+-0,100 mg/g)

40 min. 3,702 mg/g (+-0,073 mg/g)

50 min. 3,865 mg/g (+-0,041 mg/g)

Atlikus piperino ultragarsinės ekstrakcijos optimizavimą, nustatytos tinkamiausios sąlygos yra:

Tirpiklio ir žaliavos santykis: 1(žaliava):10(tirpiklis); Temperatūra: 50°C; Ekstrakcijos laikas: 20 min.

2.6.2. Kapsaicino ultragarsinės ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Tyrimo sąlygos: Vonelės temperatūra: 40°C (+-2°C); Ekstrakcijos laikas: 10min.

Lentelė 8. Tinkamos temperatūros nustatymas

Tyrimo sąlygos: Tirpiklio santykis: 1:20; Ekstrakcijos laikas: 10 min.

20°C 0,809 mg/g (+-0,091 mg/g)

30°C 0,930 mg/g (+-0,087 mg/g)

40°C 1,194 mg/g (+-0,076 mg/g)

50°C 1,451 mg/g (+-0,061 mg/g)

(28)

Lentelė 9. Tinkamo laiko nustatymas

LAIKO PASIRINKIMAS

10 min 1,535 mg/g (+-0,091 mg/g) 15 min 1,708 mg/g (+-0,083 mg/g) 20 min 1,775 mg/g (+-0,099 mg/g) 25 min 1,898 mg/g (+-0,100 mg/g) 30 min 2,002 mg/g (+-0,089 mg/g) 40 min 2,042 mg/g (+-0,103 mg/g) 50 min 2,100 mg/g (+-0,107 mg/g)

Atlikus kapsaicino ultragarsinės ekstrakcijos optimizavimą, nustatytos tinkamiausios salygos yra:

Tirpiklio ir žaliavos sąntykis: 1(žaliava):20(tirpiklis); Temperatūra: 50°C; Ekstrakcijos laikas: 15 min.

2.6.3. Kurkumino ultragarsinės ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Tyrimo sąlygos: Vonelės temperatūra: 40°C (+-2°C); Ekstrakcijos laikas: 10 min.

(29)

Lentelė 11. Tinkamos temperatūros nustatymas

Tyrimo sąlygos: Tirpiklio santykis: 1:20; Ekstrakcijos laikas: 10min.

20°C 4,027 mg/g (+-0,451 mg/g)

30°C 4,493 mg/g (+-0,368 mg/g)

40°C 5,179 mg/g (+-0,235 mg/g)

50°C 5,400 mg/g (+-0,103 mg/g)

60°C 5,433 mg/g (+-0,604 mg/g)

Lentelė 12. Tinkamo laiko nustatymas

LAIKO PASIRINKIMAS

10 min 5,209 mg/g (+-0,100 mg/g) 15 min 5,694 mg/g (+-0,098 mg/g) 20 min 5,820 mg/g (+-0,087 mg/g) 25 min 6,501 mg/g (+-0,093 mg/g) 30 min 6,960 mg/g (+-0,067 mg/g) 40 min 7,046 mg/g (+-0,081 mg/g) 50 min 7,050 mg/g (+-0,079 mg/g)

Atlikus kurkumino ultragarsinės ekstrakcijos optimizavimą, nustatytos tinkamiausios salygos yra:

Tirpiklio ir žaliavos santykis: 1(žaliava):20(tirpiklis); Temperatūra: 50°C; Ekstrakcijos laikas: 30 min.

2.7. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodika

(30)

Kokybinis ir kiekybinis įvertinimas ekstraktuose, gautuose iš prieskoninių žaliavų, buvo vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos būdu. Tyrimo metu naudotas Waters 2695 (Milford, JAV) skysčių chromatografas. Kapsaicinui, kurkuminui ir piperinui nustatyti naudota ACE C18 kolonėlė (ilgis 250 mm, kolonėlės skersmuo 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5 μm). Naudojant fotodiodų matricos detektorių Waters 996 (Milford, JAV), vykdytas analičių atpažinimas 200-600 nm šviesos bangų ilgio diapazone.

2.7.2. Piperino chromatografijos sąlygos

Ekstrakte esančioms medžiagoms atskirti pasirinktas gradientinis eliuavimas. Mobili fazė sudaryta iš eliuento A (0,05 proc. vandeninė trifluoracto rūgštis) ir eliuento B (100 proc. acetonitrilas).

Lentelė 13. Mobilios fazės sudėtis atžvelgiant į laiką

Laikas (min.) Eliuentas A (% V/V) Eliuentas B (% V/V)

0 45 55

12 45 55

13 5 95

18 5 95

19 45 55

ACE C18 kolonėles temperatūra — 25º C;

 Mobilios fazės tekėjimo greitis — 1,0 ml/min.;

 Nustatymas — kurkumino aptikimui naudotas 340 nm šviesos bangos ilgis;

 Injekcijos tūris — 10 μL;

 Sulaikymo laikas — ~8,02 min;

 Naudota programinė įranga duomenų analizei — Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV)

(31)

2.7.3. Kapsaicino chromatografijos sąlygos

Ekstrakte esančioms medžiagoms atskirti pasirinktas gradientinis eliuavimas. Mobili fazė sudaryta iš eliuento A (0,05 proc. vandeninė trifluoracto rūgštis) ir eliuento B (100 proc. acetonitrilas) (lent. 13).

ACE C18 kolonėles temperatūra — 25ºC;

 Mobilios fazės tekėjimo greitis — 1,0 ml/min;

2.7.4. Kurkumino chromatografijos sąlygos

Ekstrakte esančioms medžiagoms atskirti pasirinktas gradientinis eliuavimas. Mobili fazė sudaryta iš eliuento A (0,05 proc. vandeninė trifluoracto rūgštis) ir eliuento B (100 proc. acetonitrilas). (Lentelė 13).

ACE C18 kolonėles temperatūra — 25º C;

 Mobilios fazės tekėjimo greitis — 1,0 ml/min;

2.8. Kokybinis ir kiekybinis ekstraktų įvertinimas

Tirtų ekstraktų chromatografinių smailių nustatymas atliktas lyginant gautos analitės ir etaloninio junginio sulaikymo laikus kolonėlėje bei junginių ultravioletinės šviesos spinduliuotės absorbcijos spektrinius ypatumus. Kiekybiniam piperino, kapsaicino, kurkumino nustatymui buvo sudarytos kalibracinės kreivės. Tuomet tyrimo objektų kiekiai apskaičiuoti pagal sudarytus kalibracinius grafikus. Piperino kiekis apskaičiuotas, esant 340 nm šviesos bangos ilgiui. Kapsaicino kiekis apskaičiuotas,

(32)

esant 280 nm šviesos bangos ilgiui. Kurkumino kiekis apskaičiuotas, esant 420 nm šviesos bangos ilgiui. Atliekant kokybinį ir kiekybinį kapsaicino ir kurkumino chromatografinį tyrimą naudotos jau iš anksto validuotos metodikos.

2.9.Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH metodu

Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui taikomas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalų surišimo metodas. 50 μl tiriamojo etanolinio ekstrakto kiuvetėje sumaišoma su 2 ml 6×10-5 M DPPH tirpalo. Taip pat paruošiamas tuščias bandinys su 50 μl etanolio ir 2 ml 6×10-5 M DPPH tirpalo. Spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydžio mažėjimas 515 nm bangos ilgyje, kol pasiekiama pusiausvyra (60 min.). Siekiant tikslesnių rezultatų, kiekvienas ekstraktas matuojamas po tris kartus. Palyginamasis tirpalas – etanolis.

Antioksidacinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:

DPPH surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] × 100%;

Ab– tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min.);

(33)

3.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Piperino efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija

Norint patvirtinti piperino ESC metodikos tinkamumą praktikoje buvo atlikta tyrimo metodo validacija. Remiantis ICH gairėmis, buvo vertinti šie parametrai:

Specifiškumas

 Pakartojamumas

Tiesiškumas

 Nustatymo ribos

3.1.1. Specifiškumas

Specifiškumas yra metodikos geba atskirti tyrimo objekto analitę nuo kitų į reikiamą analitę panašių ir tiksliai analizei trukdančių junginių, tokių kaip balastinių junginių priemaišos ar įvairūs degradacijos produktai. Metodikos specifiškumas - svarbiausias validacijos parametras. Naudojamo metodo specifiškumui pagrįsti palygintos etaloninio piperino tirpalo ir tiriamųjų ekstraktų chromatogramos. Palygintas piperino etalono ir tiriamojo ekstrakto ultravioletinės šviesos absorbcijos spektras bei sulaikymo laikai.

(34)

2 paveikslėlis. Piperino ekstrakto chromatograma ir UV sugerties spektras

Etaloninio piperino tirpalo sulaikymo trukmė 8,02 min, gautų ekstraktų sulaikymo trukmių vidurkis – 8,025 min. Daroma prielaida, kad sulaikymo laikai sutampa. Tiriamųjų ekstraktų UV šviesos absorbcijos spektrai sutapo su etaloninio piperino UV spektru. Sutampant etalono bei tiriamųjų_{̨ preparatų} sulaikymo trukmėms ir UV šviesos absorbcijos spektrams, galima manyti, kad metodas atitinka specifiškumo kriterijų.

3.1.2. Tiesiškumas

Tai yra metodikos geba gauti tikslius tyrimo rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi analičių koncentracijai tiriamuosiuose mėginiuose. Tiesiškumas vertintas, nustatant skirtingų koncentracijų kurkumino standarto tirpalus ir pagal gautus duomenis sudarant atitinkamas kalibracines kreives. Piperino kalibracinis grafikas sudarytas 3,02 – 104,82 μg /ml ribose. Gauta tiesinė priklausomybė su koreliacijos koeficientu R = 0,9999. Piperino sulaikymo laikas – 8,02 min.