FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
JUSTINA PAKAŠIŪTĖ
FOLIO RŪGŠTIES, CIANOKOBALAMINO IR GELEŽIES
ĮVERTINIMAS DAUGIAKOMPONENČIO ANTIANEMINIO
VAISTINIO PREPARATO SUDĖTYJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS
FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalijus Briedis
Data
FOLIO RŪGŠTIES, CIANOKOBALAMINO IR GELEŽIES
ĮVERTINIMAS DAUGIAKOMPONENČIO ANTIANEMINIO
VAISTINIO PREPARATO SUDĖTYJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Justina Pakašiūtė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Anemija ... 10
1.2. Anemijų klasifikacija ... 10
1.3. Anemijos epidemiologija ... 11
1.4. Kraujodarą veikiantys vaistai ... 12
1.4.1. Hemopoeziniai augimo faktoriai ... 12
1.4.2. Antianeminiai preparatai ... 13
1.4.2.1. Folio rūgštis ... 13
1.4.2.2. Cianokobalaminas ... 14
1.4.2.3. Geležis ... 16
1.3. Vandenyje tirpių vitaminų atskyrimo metodikos ... 18
1.3.1 Folio rūgšties identifikavimo ir kiekio nustatymo metodai ... 19
1.3.2 Cianokobalamino identifikavimo metodai ... 20
1.3.3. Geležies (FeII) kokybinis ir kiekybinis nustatymas ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo planavimas ... 23
2.2. Tyrimo objektas ... 23
2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 23
2.3.1. Aparatūra ir priedai ... 23
2.3.2. Reagentai ... 23
2.3.3. Standartinių tirpalų paruošimas ... 24
2.3.4. Vaistinio preparato tirpalo paruošimas tyrimui ... 24
2.3.5. Analizė... 24
2.4. Geležies identifikavimo reakcijos ... 25
2.5. Geležies spektrofotometrinė analizė... 26
2.5.1. Naudota aparatūra ir reagentai ... 26
2.5.2. Standartinių tirpalų paruošimas ... 26
2.5.4. Spektrofotometrinė tiriamosios medžiagos analizė ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Geležies identifikavimas ... 28
3.1.1. Reakcija su kalio heksacianoferatu (III) ... 28
3.1.2. Reakcija su amonio hidroksidu ... 28
3.2. Geležies kiekybinis nustatymas ... 28
3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimas ... 30
3.4. Metodikos validacija ... 30
3.4.1. Specifiškumas ... 31
3.4.2. Tiesiškumas ... 34
3.4.3. Glaudumas ... 34
3.4.4. Ribos ... 35
3.5. Metodikos pritaikymas vaistinio preparato Ferro-folgamma tyrimui ... 36
3.5.1. Folio rūgšties ir cianokobalamino atskyrimas, ir identifikavimas ... 36
3.5.2. Folio rūgšties kiekio nustatymas ... 37
3.5.3. Geležies kokybinis ir kiekybinis įvetinimas ... 37
4. IŠVADOS ... 38
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
SANTRAUKA
J. Pakašiūtės magistro baigiamasis darbas; Magistro baigiamojo darbo vadovas prof. dr. L. Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas – išvystyti analitinę metodiką tinkamą geležies sulfato, folio rūgšties ir
cianokobalamino įvertinimui jiems esant daugiakomponenčio vaistinio preparato sudėtyje.
Uždaviniai: surinkti informaciją apie anemiją ir medicinoje vartojamus antianeminius
preparatus; apžvelgti plačiausiai naudojamus folio rūgšties, cianokobalamino ir geležies tyrimo metodus; pasirinkta metodika atlikti daugiakomponenčio preparato Ferro-folgamma komponentų atskyrimą; pasirinktais metodais identifikuoti cianokobalaminą, folio rūgštį, geležies sulfate; atlikti folio rūgšties ir geležies kiekybinę analizę.
Metodai: efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija.
Tyrimo objektas – vaistinis preparatas “Ferro-folgamma”, kurio vienoje kapsulėje yra 100 mg
bevandenio dvivalentės geležies sulfato (atitinka 37 mg geležies), 5 mg folio rūgšties, 10 μg cianokobolamino.
Tyrimo rezultatai. ESC su diodų matricos detektoriumi metodika atliktas folio rūgšties ir
cianokobalaminio atskyrimas ir nustatymas. Vitaminų atskyrimas pasiektas naudojant 150×4.6 mm 3 µm ACE18 kolonėlę, judriąją fazę fluoracto rūgštį (0.1 proc.) ir acetonitrile, judrios fazės tekmės greičiui esant 1.0 ml/min. Folio rūgšties detekcija atlikta prie 287 nm ilgio bangos, nustatyta aptikimo riba – 0.04 µg/ml, kiekybinio nustatymo riba – 0.13 µg/ml. Cianokobalamino detekcija atlikta prie 360 nm bangos ilgio, nustatyta aptikimo riba – 0.474 µg/ml, kiekybinio nustatymo riba – 1.57 µg/ml. Spektrofotometriškai kiekybiškai nustatyta geležis prie 423 nm bangos ilgio.
Išvados. Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą atrinktos analitinės metodikos tinkamos
numatytam daugiakomponenčio preparato veikliųjų medžiagų įvertinimui. Optimizuota ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika. Validuota ESC metodika atliktas komponentų – folio rūgšties, cianokobalaminio – atskyrimas ir identifikavimas. ESC metodika atliktas folio rūgšties kiekybinis nustatymas. Atliktas geležies identifikavimas ir spektrofotometrinis jos kiekio nustatymas.
Raktiniai žodžiai: efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, anemija, geležis,
SUMMARY
Aim – to develop an analytical method that would be suitable for evaluating iron sulphate, folic acid and cyanocobalamin in the multicomponental drug.
Objectives: gather information about anemia and antianemic drugs used in medicine; review the most
often used methods of folic acid, cyanocobalamin and iron; carry out the separation of “Ferro-folgamma” components; identify cyanocobalamin, folic acid and iron sulphate; carry out a quantitive determination of folic acid and iron.
Methods: high-performance liquid chromatography, spectrophotometry.
Object: preparation “Ferro-folgamma” containing 100 mg anhydrous iron sulphate (37 mg of iron), 5
mg folic acid and 10 μg cyanocobalamin.
Results: Identification and determination of folic acid and cyanocobalamin in pharmaceutical
preparation was developed using HPLC with photodiode array detector (PDA). Folic acid and cyanocobalamin were separated on a ACE18 column (150×4.6 mm, 3 µm particle size) with a gradient elution of mobile phase consisting of 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile. The separation was achieved with a flow rate of 1.0 ml/min. Detection of folic acid was performed at 287 nm wavelength, limit of detection – 0.04 µg/ml, limit of quantification – 0.13 µg/ml. Detection of cyanocobalamin was performed at 360 nm wavelength, limit of detection – 0.474 µg/ml, limit of quantification – 1.57 µg/ml. The absorbance of the iron complex was measured spectrophotometrically at 423 nm.
Conclusions: HPLC/PDA method for estimation of active substances in antianemic drug was optimised and validated. Separation and identification of folic acid and cyanocobalamin was performed. Determination of folic acid, identification of iron and spectrophotometric iron determination was carried out.
Key words: high-performance liquid chromatography, spectrophotometry, anemia, iron, folic acid,
SANTRUMPOS
PSO – pasaulio sveikatos organizacija Fe – geležis
Hb – hemoglobinas
PC – plonasluoksnė chromatografija ESC – efektyvioji skysčių chromatografija vit. – vitaminas
ĮVADAS
Anemija – svekatos problema, apimanti turtingas ir neturtingas valstybes. Liga gali pasireikšti bet kurio amžiaus žmonėms dėl įvairių priežasčių. Dažniausiai serga nėščiosios ir vaikai, o pagrindinė anemijos priežastis – geležies trūkumas, kuris daugeliu atvejų pasireiškia kartu su mitybos sutrikimais, hemoglobinopatijomis, infekcijomis, maliarija, vėžiu ar kitomis ligomis. Padidinti riziką susirgti anemija gali vitamino A, vitamino B12, folio rūgšties, riboflavino ir vario trūkumas. Nustatyta, kad visame pasaulyje anemija serga apie 1,62 milijardo žmonių, o tai sudaro apie 24,8 proc. visos populiacijos. Apie 50 proc. visų anemijų sudaro geležies stokos anemijos. Išsivysčiusiose šalyse apie 20 proc. gyventojų nustatoma vitamino B12 trūkumas, kuris sąlygoja megaloblastinės anemijos vystymąsi. Ligotų senyvo amžiaus žmonių, slaugomų ligonių tarpe cianokobalamino trūkumas siekia net 30–40 proc. populiacijos. Kita megaloblastinės anemijos priežastis – folio rūgšties stoka. Folio rūgšties stokos anemija dažnai serga nėščiosios. Lietuvoje anemija kasmet diagnozuojama maždaug 30 tūkstančių žmonių, iš jų dažniausiai vaikams. [11, 14, 34, 1]
Dėl didelio sergamumo plačiai vartojami įvairūs antianeminiai preparatai, kurių kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams reikalingi efektyvūs ir patikimi metodai, todėl buvo atliekamas antianeminio vaistinio preparato Ferro-folgamma kokybinis ir kiekybinis tyrimas. Preparatas yra skirtas gydyti kombinuotam geležies, folio rūgšties ir vitamino B12 trūkumui organizme. Kadangi preparato sudėtyje yra visi trys pagrindiniai mikroelementai, kurių trūkumas sąlygoja anemijos atsiradimą, preparatas turi daug indikacijų. Vaistinis preparatas gali būti vartojamas esant sutrikusiai geležies, vitamino B12, folio rūgšties rezorbcijai, nepakankamai maitinantis, vegetarizmo atveju, augimo metu padidėjus šių elementų poreikiui, geležies stokai, atsiradusiai dėl nukraujavimo, anemijoms susijusioms su lėtiniu alkoholizmu, profilaktiškai gydyti geležies stokos anemiją ir megaloblastinę anemiją nėštumo metu ir žindymo laikotarpiu. [21]
Antianeminio preparato analizei pasirinkti efektyviosios skysčių chromatografijos ir spektrofotometrijos tyrimo metodai. Tyrimo tikslas – išvystyti analitinę metodiką tinkamą geležies sulfato, folio rūgšties ir cianokobalamino įvertinimui jiems esant daugiakomponenčio vaistinio preparato sudėtyje.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas – išvystyti analitinę metodiką tinkamą geležies sulfato, folio rūgšties ir
cianokobalamino įvertinimui jiems esant daugiakomponenčio vaistinio preparato sudėtyje.
Uždaviniai:
1. Surinkti informaciją apie anemiją ir medicinoje vartojamus antianeminius preparatus;
2. Apžvelgti plačiausiai naudojamus folio rūgšties, cianokobalamino ir geležies tyrimo metodus; 3. Pasirinkta metodika atlikti daugiakomponenčio preparato “Ferro-folgamma” komponentų
atskyrimą;
4. Pasirinktais metodais identifikuoti cianokobalaminą, folio rūgštį, geležies sulfatą. 5. Atlikti folio rūgšties ir geležies kiekybinę analizę;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Anemija
Kraujas – jungiamasis audinys, kurį sudaro kraujo ląstelės ir kraujo plazma. Cirkuliuodamas kraujagyslėmis jis aprūpina organizmo ląsteles maisto medžiagomis ir deguonimi. Deguonį ir anglies dioksidą perneša eritrocituose esantis baltymas hemoglobinas, kuris sudaro didžiąją dalį jų masės. Patologinė būklė, kai sumažėja eritrocitų ar juose esančio hemoglobino kiekis vadinama anemija arba mažakraujyste [2,38] Remiantis pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis anemiją galima diagnozuoti atsižvelgiant į hemoglobino kiekį, kurio norma priklauso nuo žmogaus amžiaus ir lyties. Nėštumo metu šiek tiek mažesnis hemoglobino kiekis kraujyje yra laikomas norma.
Pagal PSO anemiją galima diagnozuoti, kai hemoglobino kiekis: a. Vaikų, jaunesnių nei 5 m. < 110 g/l
b. Vaikų nuo 5 iki 12 m. < 115 g/l c. Vaikų nuo 12 iki 15 m. < 120 g/l d. Moterų (≥ 15m.) < 120 g/l
e. Nėsčių moterų < 110 g/l f. Vyrų (≥ 15 m.) < 130 g/l [14]
Moterų sergamumas anemija yra didesnis nei vyrų, o anemiją salygoja trys pagrindiniai procesai: ūmus ar lėtinis kraujavimas, nepakankama eritrocitų gamyba ir padidėjusi eritrocitų destrukcija.
1.2. Anemijų klasifikacija
Anemijos pagal ją sukėlusią priežastį:
1. Anemija dėl ūmaus kraujavimo
2. Anemija dėl sumažėjusios eritrocitų gamybos (hipoproliferacinė anemija)
1) Aplazinė anemija
2) Pirmtakinių eritropoezės ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos sutrikimas (dėl lėtinio inkstų funkcijos nepakankamumo, endokrininių liaukų ligų ar badavimo)
3) Besivystančių kraujodaros ląstelių diferenciacijos ir brendimo sutrikimas
Megaloblastinė anemija (dėl vitamino B12 stokos, folio rūgšties stokos arba purinų ir pirimidinų metabolizmo sutrikimo);
Hemosintezės sutrikimai (dėl lėtinių kraujavimų, geležies trūkumo maiste, sutrikusios geležies rezorbcijos)
4) Neaiškus ar sudėtingas anemijų išsivystymo mechanizmas
Dėl kaulų čiulpų infiltracijos (hemoblastozės, epitelinės navikų MTS, uždegiminės granulomos ar mielofibrozės)
Dėl lėtinių uždegiminių procesų (autoimuninių, imunokompleksinių ar infekcinių) Dėl piktybinių navikų
Mielodisplazijos sindromas [38]
3. Anemija dėl padidėjusios eritrocitų destrukcijos (hemolizinė anemija)
1.3. Anemijos epidemiologija
Pagal 1993-2005 metų PSO duomenis (1 lentelė) sergamumas anemija siekė net 24,8 proc. visos populiacijos. Didžiausia sergančiųjų grupė – moterys (nesilaukiančios). Mažiausias sergamumas pastebėtas tarp suaugusių vyrų, didžiausias – ikimokyklinio amžiaus vaikų. Ikimokyklinio amžiaus vaikų sergamumas bendroje populiacijoje siekė net 47,4 proc. Daugiausia sergančių vaikų Afrikos valstybėse, Brazilijoje, Indijoje, o mažiausias sergamumas pastebėtas Jungtinėse Amerikos valstijose, Lietuvoje sergamumas tuo laikotarpiu siekė 20-39.9 proc. (1pav). [14]
1 lentelė. Sergamumas anemija pagal PSO duomenis [14]
Populiacijos grupė Anemijos paplitimas Anemija sergantys gyventojai Procentai Skaičius (milijonai)
Iki mokyklinio amžiaus vaikai 47.4 293
Mokyklinio amžiaus vaikai 25.4 305
Nėščios moterys 41.8 56
Moterys (ne nėščios) 30.2 468
Vyrai 12.7 260
Vyresnio amžiaus žmonės 23.9 164
1 pav. Ikimokyklinio amžiaus vaikų sergamumas anemija 1993-2005 m. [14]
1.4. Kraujodarą veikiantys vaistai
Kraujodara – kraujo ląstelių (eritrocitų leukocitų ir trombocitų) gamyba iš nediferencijuotų kamieninių ląstelių. Suaugusio sveiko žmogaus kaulų čiulpuose kasdien pagaminama daugiau nei 200 milijardų naujų ląstelių. Kraujo ląstelių gamybai butina geležis, cianokobalaminas, folio rūgštis ir hemopoeziniai augimo faktoriai. Dėl įvairių priežasčių gali sumažėti šių medžiagų kiekis ir sutrikti kraujodara. Gydymui vartojami kraujodarą veikiantys vaistai, kuriems priklauso vaistai anemijoms gydyti ir homopoeziniai augino faktoriai. [7,25]
1.4.1. Hemopoeziniai augimo faktoriai
Hemopoezės augimo faktoriai – glikoproteinai, kurie veikdami per ląstelių “taikinių” membranoje esančius specifinius receptorius reguliuoja kamieninių kaulų čiulpų ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, kai kurių kraujo ląstelių funkcinį aktyvumą.
Šios rūšies preparatai: 1. Eritropoetinas
2. Mieloidiniai augimo faktoriai
g. G-KSF – granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius
h. GM-KSF – granuliocitų, makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius 3. Trombocitopoezės stimuliatoriai
i. Interliaukinas-11 j. Trombopoetinas [7]
1.4.2. Antianeminiai preparatai
Žmogaus raudonojo kraujo gamybai yra būtini trys pagrindiniai elementai: geležis (Fe), cianokobalaminas ir folio rūgštis. Dėl jų trūkumo pasireiškusios anemijos gydymui skiriami specialūs vaistai gydyti anemijoms.
Antianeminius preparatus galima skirstyti taip: 1. Geležies preparatai
Geriamieji vaistai Parenteriniai vaistai
2. Vaistai megaloblastinei anemijai gydyti: Vitaminas B12
Folio rūgštis [7]
1.4.2.1. Folio rūgštis
Folio rūgštis – kofermentas, vitaminas B9 (1 pav.), dar vadinamas vitaminu M ar B11, priklausantis vandenyje tirpių vitaminų grupei, sudarytas iš pteridino žiedo, paraminobenzoinės rūgšties ir glutamo rūgšties. Folio rūgštį 1933 m. atrado Lucy Wills. Pirmą kartą ji buvo išskirta iš špinato lapų [37, 24, 13].
1 pav. Vitamino B9 struktūrinė formulė [13]
Fiziko-cheminės savybės. Gelsvi ar oranžiniai kristaliniai milteliai, beveik netirstantys
vandenyje ir daugumoje organinių tirpiklių. Tirpūs praskiestų šarmų ir rūgščių tirpaluose. Tirpsta praskiestose rūgštyse ir šarminiuose tirpaluose. [18]
Nedidelius folio rūgšties kiekius sintetina žarnyno bakterijos. Organizmui reikiamą vitamino kiekį žmogus gauna su maistu. Pagrindiniai maisto šaltiniai: kepenys, inkstai, šparagai, grybai, mielės, brokoliai, lapiniai kopūstai ir kitos žalialapės daržovės. [2]
Tai kofermentas reikalingas DNR, RNR sintezei. Vitaminas būtinas kraujo forminių elementų atsinaujinimui ir funkcionavimui. Esant vitamino B9 trūkumui didėja rizika susirgti megaloblastine anemija, vėžiu, Alzhaimeriu, širdies ir kraujagyslių ligomis. Tai vienas iš dažniausiai pasireiškiančių vitaminų trūkumų vyresniame amžiuje, kurį galima įtarti pasireiškus nepaaiškinamai anemijai ar makrocitozei. Priežastys: nepakankamas vitamino kiekis maiste, padidėjęs poreikis (kūdikystė, nėštumas), ligos, susijusios su greitu ląstelių dalijimusi, malabsorbcija, taip pat trūkumas sąlygotas vartojamų vaistų (antiepilepsinių, per os vartojamų kontraceptikų, sulfazalino, metotreksato). Vitaminas vartojamas jo stokos gydymui ir profilaktikai. Minimali folio rūgšties dozė, kuri padeda išvengti jos trūkumo yra 0.4 mg/d, esant trūkumui rekomenduojama vartoti 5 mg/d per os. [7,24,26,31,33]
Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai: Ferro-folgamma kapsulės (Worwah pharma)
(geležies sulfatas, folio rūgštis ir cianokobalaminas).
1.4.2.2. Cianokobalaminas
Cianokobalaminas (kobalaminas) – vitaminas B12 (2 pav.). Vėliausiai atrastas B grupės vitaminas. 1948 metais Karl Folkers ir Alexander Todd šį vitaminą išskyrė iš kepenų. [39]
Tai kofermentas, dalyvaujantis riebalų ir angliavandenių metabolizme, baltymų sintezėje ir kitose organizmo medžiagų apykaitos reakcijose. Vitaminas B12 yra būtinas augimui, ląstelių dalijimuisi, kraujo elementų formavimuisi, nukleoproteinų ir mielino sintezei, labai svarbus metionino, folinės ir maloninės rūgšties metabolizmui. [11]
Fiziko-cheminės savybės. Tamsiai raudoni kristaliniai milteliai ar tamsiai raudoni kristalai,
sunkiai tirpstantys vandenyje ir alkoholyje (96 proc.), praktiškai netirpstantys acetone. Bevandenė medžiaga labai higroskopiška. Turi specifinį optinį sukimo kampą praskiestuose vandeniniuose tirpaluose [18].
2 pav. Vitamino B12 struktūrinė formulė [39]
Pagal atliktų epidemiologinių tyrimų duomenis vitamino B12 trūkumas išsivysčiusiose šalyse yra nustatomas apie 20 proc. gyventojų. Dažniausio jo trūkumas nustatomas vyresnio amžiaus žmonėms. Nustatyta, kad klinikiniai trūkumo simptomai atsiranda tik po 5-10 metų [11].
Vitaminą sintetina žarnyno bakterijos. Kita dalis reikiamo vitamino kiekio gaunama su maistu. Pagrindiniai maisto šaltiniai: kepenys, pienas, mėsa, kiaušiniai, žuvis, austrės, moliuskai, todėl didesnė avitaminozės tikimybė vegetarams [28].
Vitamino trūkumas gali išsivystyti dėl įvairių pasiavinimo sutrikimų (2 lentelė). Dažniausiai pasireiškia nervų, virškinimo ir kraujodaros sistemos sutrikimo požymiais. Dažniau serga senyvo amžiaus žmonės dėl vitamino malabsorbcijos iš maisto. Gali atsirasti parestezijos, ataksija, demencija ar psichozė [33,8].
2 lentelė. Kobalamino pasisavinimo etapai ir jį sutrikdančios priežastys [11] Pasisavinimo etapas Sutrikimo priežastys
Kobalamino suvartojimas su maistu Griežtas vegetarizmas Virškinimo procesas:
• Skrandžio sulčių sekrecija • Vidinis faktorius
• Kasos sulčių ir tulžies sekrecija • Enterohepatinis ciklas
Gastrektomijos Piktybinė anemija
Kobalamino malabsorbcija, sutrikus maisto pasisavinimui Klubinės žarnos rezekcija ir malabsorbcija
Kiti pasisavinimo sutrikimai
Transkobolaminų transportas Įgimtas transkobolamino II trūkumas Viduląstelinis metabolizmas - fermentai Įgimtas fermentų trūkumas
Rekomenduojama paros dozė suaugusiam žmogui - 2,4 μg per dieną, o nėštumo metu - 2,6–2,8 μg per dieną. Apie 3-30 μg vitamino B12 gauname kasdien su maistu. Trūkumo sukeltų sutrikimų
(megaloblastinei anemija, nervų ligoms) gydymui vartojami vitamino B12 preparatai. Gydoma skiriant 6 dozes po 1000 µg per 1-3 sav. Sergant nepagydoma vitamino B12 malabsorbcija vaisto skiriama po 1000 µg kas 1-3 mėnesius visą gyvenimą. Taip pat gali būti vartojami geriamieji preparatai, kurie skiriami vartoti kartu su folio rūgštimi [7,11,8].
Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai: injekcinis tirpalas Cianokobalaminas (Sanitas),
Ferro-folgamma kapsulės (Worwah pharma) (geležies sulfatas, folio rūgštis ir cianokobalaminas).
1.4.2.3. Geležis
Geležis – tai būtinas žmogui mikroelementas, kurio pagrindinės funkcijos organizme yra deguonies transportas ir apykaita per hemoglobiną ir mioglobiną, dalyvavimas metabolizmo
reakcijose, dezoksiribonukleorūgšties (DNR) sintezėje ir atsinaujinime, taip pat svarbi ląstelių augimui ir proliferacijai [9].
Džiovinto geležies (II) sulfato (3 pav.) fiziko-cheminės savybės. Žalsvai balti milteliai. Tirpūs
vandenyje, labai tipūs karštame vandenyje, beveik netirpūs etanolyje (96 proc.). Ore oksiduojasi, įgauna rudą spalvą [17].
3 pav. Bevandenio geležies (II) sulfato cheminė formulė [37]
Geležies žmogus gauna kartu su maistu. Jos yra augaliniame ir gyvuliniame maiste. Pagrindiniai šaltiniai: mėsa, kepenys, žuvis, kiaušinio trynys, austrės, krevetės, ankštiniai augalai, avižos, riešutai, tamsiai žalios daržovės. Geležis geriau pasisavinama iš mėsos (iki 30 proc.), nei iš augalinės kilmės
produktų (iki 10 proc.) [10].
Geležis gali būti dviejų formų: Fe2+
ir Fe3+. Laisva geležis yra kenksminga, patekusi į organizmą skrandyje ji jungiasi su baltymu apoferitinu. Absorbcija vyksta dvylikapirštėje žarnoje, kur subrendę žarnyno enterocitai per dieną absorbuoja apie 1-2 mg geležies. Geriau rezorbuojasi Fe2+, todėl geležis
geriau pasisavinama iš dvivalentės geležies preparatų. Didžioji dalis geležies esančios žmogaus organizme įeina į hemoglobino sudėtį. Nepanaudota geležis kaupiama feritino pavidalu. Jis kaupiamas
kepenyse, kaulų čiulpuose, limfinėje sistemoje, raumenyse. Atsargose esanti geležis sudaro apie 25 proc. visos organizme esančios geležies (3pav.) [2,4].
3 pav. Geležies pasiskirstymas žmogaus organizme [4]
Geležies stoka – vienas dažniausių mitybos trūkumų pasaulyje. Dažniau pasireiškia vaikams ir nėščiosioms moterims. Geležies stokos anemijos priežastys yra nepakankamas jos kiekis maiste, absorbcijos sutrikimai, lėtinis kraujavimas, intravaskulinė hemolizė ir hemoglobinurija. [6]
Pagrindiniai simptomai yra alpimas, galvos svaigimas, suprastėjusi dėmesio koncentracija, hipotenzija, padažnėjęs kvėpavimas, lūžinėjantys nagai, silpni plaukai, nuovargis, odos ir gleivinių blyškumas, bendras silpnumas [2, 10].
Trūkumo gydymui ir profilaktikai yra vartojami geležies preparatai. Pagrindinę dalį sudaro geriamieji geležies preparatai, nes tai pigus, veiksmingas, saugus ir patogus gydymo būdas. Parenteriniai geležies preparatai – rezerviniai vaistai, kuriais gydoma tik tuo atveju kai gydyti geriamaisiais preparatais neįmanoma dėl rezorbcijos sutrikimų ar netolerancijos. Paros dozė nesant geležies trūkumui priklauso nuo amžiaus, lyties ir kitų faktorių (nėštumo, laktacijos) (3 lentelė.). Geležies trūkumo anemijos gydymui suaugusiems rekomenduojama 2 mg/kg/d, vaikams – 3-6 mg/kg/d. Į preparatų sudėtį dažnai įeina askorbo rūgtis, nes šis vitaminas gerina geležies absorbciją [7,30].
3 lentelė. Rekomenduojama geležies paros norma [30]
Rekomenduojama geležies paros norma atsižvelgiant į lytį ir amžių Amžiaus grupė Gyvenimo etapas Geležis (mg/d)
Kūdikiai 0 – 6 mėnesių 0.27 7 – 12 mėnesių 11 Vaikai 1 – 3 m. 7 4 – 8 m. 10 Vyrai 9 – 13 m. 8 14 – 18 m. 11 >19 m. 8 Moterys 9 – 13 m. 8 14 – 18 m. 15 19 – 50 m. 18 >51 m. 8
Nėščios moterys 14 – 50 m. 27
Žindančios moterys 14 – 18 m. 10
19 – 50 m. 9
Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai:
Geležies (II) sulfatas: Ferro-folgamma kapsulės (Worwah pharma) (geležies sulfatas, folio rūgštis ir cianokobalaminas), Ferro-Gradumet (Abbott Laboratories), Tardyferon (Orivas).
Geležies chloridas: Ferretab comp. (Lanacher), Iron complex (Interpharm) (geležies fumaratas, gliukonatas ir aminochelatas).
Geležies gliukonatas: Ascofer (Espefa), Tot’Hema (Innotech International) (geležies gliukonatas, magnio gliukonatas ir vario gliukonatas).
Geležies hidroksido (III) – poliizomaltozės kompleksas: Ferrum Lek (Lek). Geležies (III) hidroksido – sacharozės kompleksas: Venofer (Alloga France).
1.3. Vandenyje tirpių vitaminų atskyrimo metodikos
Vandenyje tirpių vitaminų atskyrimui naudojami įvairūs chromatografiniai metodai: plonasluoksnė chromatografija (PC), efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), micelių elektrokinetinė chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, jonų mainų chromatografija [12, 20,23,26,32].
Chromatografija – cheminės analizės metodas, paremtas veikliųjų medžiagų pasiskirstymu tarp dviejų fazių. Chromatografinės analizės metodikos naudojamos medžiagų atskyrimui, identifikavimui ir kiekio nustatymui.
Plonasluoksnė chromatografija – chromatografijos rūšis, kai judrioji fazė juda inertiniu paviršiumi, padengtu plonu sorbento sluoksniu. Metodas palyginus su ESC yra pigus, paprastas, tačiau mažiau jautrus metodas [3].
2009 m. mokslininkų atliktas vandenyje tirpių vitaminų - tiamino, cianokobalamino ir askorbo rūgšties - atskyrimas plonasluoksne chromatografija, naudojant sorbentą silikagelį, kuriuo buvo impregnuotas inertinis paviršius. Tai pirmas tyrimas, kurio metu pirmą kartą buvo panaudotas dvigubai distiliuotas vanduo kaip judrioji fazė. Tai paprasčiausia, labai švari, netoksiška ir nebrangi judančiosioji faze. Metodas tinkamas ne tik medžiagų atskyrimu, bet ir identifikavimui. Nustatytos aptikimo ribos: cianokobalaminas ir tiaminas – 0.5 μg, vitaminas C – 1.0 μg. Analizės metodas selektyvus, tinkamas vitaminų atskyrimui ir gali būti naudojamas vitaminų (B1, B12, C) identifikavimui vaistiniuose preparatuose [12].
Kitas plačiai taikomas analizės metodas, vienas iš dažnai taikomų vitaminų atskyrimui - efektyvioji skysčių chromatografija. Pagrindiniai metodo privalumai: jautrumas, trumpas analizės laikas ir plačios pritaikomumo galimybės.
Atliktas devynių vandenyje tirpių vitaminų (B1, C, PP, B6, B5, B9, B12, B2 ir B8) atskyrimas ir identifikavimas naudojant atvirkštinių fazių efektyviąją skysčių chromatografiją ir diodų matricos spektrofotometro detektorių. Medžiagų atskyrimui panaudota YMC-Pack Pro C18 kolonėlė (250 mm × 4.6 mm, dalelių dydis 5 µm). Judrioji fazė - trifluoracto rūgšties (0.025 proc.) ir acetonitrilo mišinys, injekcijos tūris – 20 µl. Analičių atskyrimas pasiektas per 17 min., esant 0.8 ml/min mobilios fazės tėkmės greičiui. Detekcija atlikta 210 - 275 nm bangų ribose. Vitamino B12 detekcija atlikta prie 210 nm bangos ilgio, o vitamino B9 – prie 275 nm [23].
1.3.1 Folio rūgšties identifikavimo ir kiekio nustatymo metodai
Folio rūgšties identifikavimui gali būti naudojami šie metodai: poliarimetrija, plonasluoksnė chromatografija, mikrobiologinė analizė, skysčių chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, micelinė elektrokinetinė chromatografija, atvirkštinių fazių efektyvioji skysčių chromatografija [18,16].
Folio rūgštis yra optiškai aktyvi medžiaga, kurios identifikavimas pagal Europos farmakopėją gali būti atliekamas poliarizaciniu metodu poliarimetrija, kuris yra pagrįstas optinio sukimo matavimu – medžiagos gebėjimu sukti poliarizacijos plokštumą, pro ją pereinant poliarizuotai šviesai. 0.25 g bevandenio vitamino ištirpinama 0.1 M natrio hidroksido (NaOH) tirpalo, praskiedžiama tuo pačiu tirpalu iki 25 ml. Folio rūgšties savitasis poliarizacijos plokštumos sukimo kampas yra nuo +18 iki +22 [α]D20 (α – savitasis poliarizacijos sukimo kampas, D – bangos ilgis atitinkanti geltonąją natrio spektro liniją (λ – 589,3 nm), 20 C – matavimai atliekami esant 20 C temperatūrai [18,5].
Folio rūgšties identifikavimui ir kiekio nustatymui validuota ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika. Atlikta vitamino analizė farmaciniuose preparatuose. Kaip mobilioji fazė naudotas metano rūgšties (0.1 proc.) ir acetonitrilo (80:20) mišinys, tėkmės greitis - 0.3 ml/min. Vitamino detekcija atlikta prie 285 nm bangos ilgio. Metodo privalumai: metodas jautrus ir greitas, analizei reikalingi nedideli tirpiklio kiekiai [16].
Atliktas folio rūgšties kiekio nustatymas multivitaminų tabletėse naudojant izotopinio skiedimo skysčių chromatografiją kartu su masių spektrometrija (LC/MS/MS). Metodoas specifiškas ir greitas. Nustatyta aptikimo riba 0.02 ng (on-column), kiekybinio nustatymo riba – 0.06 ng (on-column).
Metodo tikslumas ≥95 proc., santykinis standartinis nuokrypis 1 proc. Metodas validuotas ir sertifiluotas folio rūgšties nustatymui farmaciniuose preparatuose [31].
1.3.2 Cianokobalamino identifikavimo metodai
Cianokobalaminui identifikuoti gali būti naudojami šie metodai: mikrobiologinė analizė, radioizotopinė analizė, spektrofotometrija, fluorimetrija, atominės absorbcijos spektrometrija, chemiliuminescencinis (CL) metodas, efektyvioji skysčių chromatografija, aukštos kokybės kapiliarinė elektroforezė, imunofermentinė analizė, taip pat gali būti atliktas biojutiminis tyrimas pagal kūno paviršiaus plazmonų rezonansą [28,29].
Pagal Europos farmakopėją vitaminas B12 identifikuojamas naudojant spektrofotometrinį metodą. Tiriamasis tirpalas ruošiamas 2.5 mg cianokobalamino ištirpinant 100 ml vandens. Optinio tankio matavimai atlikti 260-610 nm intervale. Nustatyti absorbcijos maksimumai prie 278 nm, 361 nm, ir nuo 547 nm iki 559 nm. Sugerties koeficientai: A361/A547-559 = 3.15 - 3.45, A361/A278 = 1.70 -
1.90 [18].
Mokslininkų atliktas vitamino B12 nustatymas multivitaminų tabletėse efektyviąja skysčių chromatografija ir fluorescenciniu detektoriumi. Analizėje panaudota atvirkštinių fazių mBondapak C18 (300 × 33.9 mm I.D., 10 µm, Waters) kolonėlė. Kaip mobilioji fazė naudotas metanolio ir vandens mišinys (30:70), judrios fazės tėkmės greitis - 0.80 ml/min. Tiriamoji medžiaga buvo tirpinama fosfatinio buferio tirpale (pH 7.0), tiriamojo tirpalo injekcijos tūris - 20 µl. Cianokobalamino detekcija atlikta prie 275 nm bangos ilgio. Nustatytas metodo jautrumas - 1×10 -4 µg/ml. Šis vitamino B12 identifikavimo metodas yra jautresnis nei liepsnos atominė absorbcijos spektrometrinis metodas, atominė absorbcijos spektrometrija, ESC naudonat UV detektorių, indukciniu būdu sujungtos plazmos masės spektrometrija, kapiliarinė elektroforezė, spektrofotometrija ir chemiliuminescencija [29]. Po kelerių metų atliktas naujas mokslinis tyrimas su cianokobalaminu, validuota jautresnė chemiliuminescencijos metodika, kuria pasiektas net 5 pg/ml jautrumas [27].
4 lentelė. Įvairių metodų jautrumas vitamino B12 nustatymui [28]
Metodas Jautrumas Pritaikymas
Mikrobiologinė analizė 30.03 µg/100 g džiovintų ląstelių
Valgomieji melsvadumbliai
Aphanizomenon flos-aqua
Radioizotopinė analizė 5 ng/ml Kraujo mėginys
Spektrofotometrija 35 µg/ml Sintetiniai mišiniai ir vit. B12
injekcijos
ESC 40 ng/ml Multivitaminų preparatai
multivitaminų tabletėse ESC su elektropurkštuvine jonizacija ir
masių spektrometrija
2 ng/g Pieno milteliai
Daugiafunkcinė ESC 25 ng B grupės vitaminų kompleksas
ESC su atominės absorbcijos spektrometrija
42 µg/ml Mėsa ir kepenys
Fluorimetrija 0.1 ng/ml Farmaciniai preparatai
Aukštos kokybės kapiliarų elektroforezės
20 µg/ml Korinoidų atskyrimas ir nustatymas
Kapiliarinis elektroforezės-indukciniu būdu sujungtos plazmos masės
spektrometrija
50 ng/ml Multivitaminų preparatai
Chemiliuminescencija 5 pg/ml Farmaciniai produktai
Imunofermentinė analizė 0.09 µg/100 g maisto Maisto produktai Biojutiminis tyrimas pagal kūno
paviršiaus plazmonų rezonansą
2 µg/100 g Kūdikių pieno mišinys
Lyginant metodus tarpusavyje (4 lentelė) kaip jautriausius galima išskirti chemiliuminescenciją, mikrobiologinę analizę ir fluorimetriją. CL metodas yra vienintelis galintis aptikti vitaminą B12 ties pikogramų riba, tačiau abejotinas šio metodo specifiškumas tiriamoje terpėje esant metalo jonams [28]. Mikrobiologinė analizė – daug laiko atimantis metodas [29].
1.3.3. Geležies (FeII) kokybinis ir kiekybinis nustatymas
Geležies analizei gali būti naudojami šie metodai: potenciometrija, chemiliuminescencinis metodas, atominės absorbcijos spektrometrija (AAS) (liepsnos ir nadojant grafitinę krosnį), fluorimetrinė analizė, anodinė inversinė voltamperometrija, tūrių analizė, spektrofotometrija, kolorimetrija, izotopų skiedimo metodas, branduolinio rezonanso spektroskopija, taip pat spalvinės identifikavimo reakcijos [35].
Remiantis Europos farmakopėjos duomenimis geležes (II) jonus galima identifikuoti ištirpusius vandenyje ar kitame tirpale. Į maždaug 10 mg Fe(II)/1ml tipalo dedama 1 ml K3(Fe(CN)6) tirpalo.
Susidaro mėlynos spalvos kompleksas, kuris netirpsta 5 ml praskiestoje vandenilio chlorido rūgštyje (HCl) [17].
Vienas iš tikslių ir paprastų geležies analizės metodų yra spektrofotometrija. Metodas pagrįstas monochromatinės spinduliuotės absorbcija. Metodas tinkamas kiekybiniam Fe (II) nustatymui. Pagal absorbuotos šviesos kiekį apskaičiuojama optiškai aktyvios medžiagos koncentracija. Spektrofotometriniam geležies nustatymui gali būti naudojami įvairūs kompleksadariai: 1,10-fenantrolinas, 2-2-dipiridinas, acetilacetatas, indolo acto rūgštis, ksilenolio oranžinis ir antranilo rūgštis [19].
Atliktas mokslinis tyrimas - srauto įpurškimo spektrofotometrinė geležies (FeII) analizė multivitaminų preparatuose naudojant 1, 10-fenantroliną kaip kompleksinį junginį sudarantį agentą. Metodas paremtas reakcija tarp 1, 10-fenantrolino ir geležies (II), jos metu susidaro raudonai oranžinės spalvos kompleksas, kurio absorbcijos maksimumas nustatytas prie 512 nm bangos ilgio. Validuotos metodikos Fe (II) aptikimo riba - 18 µg/l. Palyginus su kitais metodais, spektrofotometrija yra labai paprastas, patikimas ir pigesnis geležies identifikavimo metodas [35].
Pagal Europos farmakopėją kiekybinis geležies sulfato nustatymas gali būti atliekamas pagal šią metodiką: 2.5 g natrio vandenilio karbonato ištirpinamas 150 ml vandens ir 10 ml sieros rūgšties mišinyje. Kai tirpalas nustoja burbuliuoti dedama 0.140 g bevandenio geležies sulfato, kuris ištirpinamas švelniai purtant. Pridedama 0.1 ml feroino ir titruojama 0.1 M amonio cerio nitratu iki raudona spalva išnyksta. Medžiagos kiekis skaičiuojamas pagal ekvivatentą: 1 ml 0.1 M amonio cerio nitrato atitinka 15.19 mg geležies sulfato [17].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo planavimas
Remiantis moksline literatūra vitaminų B9 ir B12 atskyrimui, identifikavimui ir folio rūgšties kiekio nustatymui pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, kadangi metodas yra tikslus, greitas, tinkamas medžiagų atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui. Geležies identifikavimą pasirinkta atlikti pagal Europos farmakopėją, o kiekybiniam nustatymui pasirinkta spektrofotometrija.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas - receptinis vaistinis antianeminis preparatas Ferro-folgamma, kurio vienoje kapsulėje yra 100 mg bevandenio dvivalentės geležies sulfato (atitinka 37 mg geležies), 5 mg folio rūgšties ir 10 μg cianokobolamino. Pagalbinės medžiagos, esančios užpilde: askorbo rūgštis, sojų lecitinas, kietieji riebalai, rafinuotas rapsų aliejus.
2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
2.3.1. Aparatūra ir priedai
• ESC chromatografas: Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, USA)
• ESC kolonėlė: 150 × 4,6mm, 3 µm ACE18 kolonėlė (Advanced Chromatography Technologies, Scotland)
• Detektorius: fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Waters Corporation, Milford, USA) • Programinė įranga: Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford,
USA)
2.3.2. Reagentai
Acetonitrilas (grynumas ≥ 99.9 proc., Sigma-Aldrich Corporation, Germany)
Dejonizuotas vanduo, kuris gaminamas laboratorijoje (Millipore, USA)
Smailių identifikavimui eksperimente buvo naudojami vitamin B9 ir B12 sausieji ekstraktai: Cianokobalaminas (grynumas ≥ 98.5 proc., Sigma-Aldrich Corporation, Germany)
Folio rūgštis (grynumas ≥ 97 proc., gamintojas - Sigma Aldrich Corporation, Germany)
2.3.3. Standartinių tirpalų paruošimas
Atsveriama po 5 mg cianokobalamino ir folio rūgšties sausųjų ekstraktų, jie perkeliami į 25 ml tūrio kolbutes. Medžiagos ištirpinamos įpylus nedidelį kiekį dejonizuoto vandens nuolat maišant. Kiekvienoje kolbutėje tirpalai skiedžiami dejonizuotu vandeniu iki žymės. Prieš injekuojant į ESC sistemą tirpalai filtruojami pro 0.22 µm nailoninius švirkštinius filtrus (diametras - 13 mm, Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany).
2.3.4. Vaistinio preparato tirpalo paruošimas tyrimui
Tyrimui imama 3 kapsulių turinys (1.5388 g). Masė tirpinama 25 ml vandens, nes visos veikliosios medžiagos, esančios preparate, tirpsta vandenyje. Vaistinės medžiagos ekstrahuojamos iš riebalinio pagrindo ultragarso vonelėje, nuolat palaikant 250
C temperatūrą. Gauta emulsija filtruojama pro popierinį filtrą. Prieš injekuojant į ESC sistemą tirpalas filtruojamas pro 0.22 µm nailoninį švirkštinį filtrą (diametras - 13 mm, Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany).
2.3.5. Analizė
Vaistinio preparato analizė atliekama Waters 2695 chromatografu ir fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (4 pav.). Medžiagų atskyrimui naudota 150 mm ilgio, 4.6 mm skersmens, 3 µm dalelių dydžio ACE18 kolonėlė. Termostate nuolat palaikoma 25º C temperatūra. Analizėje naudotas injekcijos tūris - 10 µl tiriamojo tirpalo. Judrios fazės tėkmės greitis - 1.0 ml/min. Taikyta dviejų eliuentų gradientinė sistema: acetonitrilas (A) ir trifluoracto 0.1 proc. rūgšties tirpalas (B).
Gradientinė eliucija:
Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laikų bei UV absorbcijos spektrų 210 – 400 nm ribose sutapimus. Analičių detekcija atlikta prie 360 nm ir 287 nm bangų ilgių.
4 pav. Efektyviosios skysčių chromtografijos schema [39]
2.4. Geležies identifikavimo reakcijos
Tiriamosios medžiagos tirpalo paruošimas
Kadangi geležies sulfato druska yra gerai tirpstanti vandenyje, vaisto vienos kapsulės turinys, kuriame yra 37 mg geležies (II), tirpinamas 50 ml distiliuoto vandens. Kad Fe (II) jonai iš aliejinės vaisto formos pereitų į tirpalą vaistinė medžiaga 30 min. sonifikuojama ultragarso vonelėje. Gauta emulsija filtruojama pro popierinį filtrą.
Laikas (min.) Judrios fazės tėkmės greitis Acetonitrilas (A) Trifluoracto rūgštis (0.1 proc.) (B)
0 1 ml/min 80 20
15 1 ml/min 30 70
16 1 ml/min 10 90
17 1 ml/min 10 90
Geležies identifikavimo spalvinė reakcija su kalio heksacianoferatu (III)
Į mėgintuvėlį įlašinama keletas lašų pasigaminto tiriamosios vaistinės medžiagos tirpalo. Parūkštinus pora lašų vandenilio chlorido rūgties įlašinama du lašai kalio heksacianoferato (III) tirpalo. Susidaro tamsiai mėlynos nuosėdos, kurios įlašinus vandenilio chlorido rūgšties neištirpsta.
Geležies identifikavimo spalvinė reakcija su amonio hidroksidu
Į mėgintuvėlį įlašinama keletas lašų pasigaminto tiriamosios vaistinės medžiagos tirpalo ir keli lašai amonio hidroksido (10 proc.). Susidaro žalsvos geležies (II) nuosėdos, kurios po truputį ruduoja dėl sąlyčio su ore esančiu deguonimi. Nuosėdos ištirpsta 0.1 N acto rūgštyje.
2.5. Geležies spektrofotometrinė analizė
2.5.1. Naudota aparatūra ir reagentai
Aparatūra:
Spektrofotomeras (Dynamica Halo DB-20 UV-Visible Double Beam) Standartinė kiuvetė 1cm
Reagentai:
Vandenilio chlorido rūgštis (HCl) (1:2) (Sigma-Aldrich Corporation, Germany) Sulfosalicilo rūgštis (C7H6O6S) (10 proc.) Sigma-Aldrich Corporation, Germany)
Amonio hidroksidas (NH4OH) (10 proc.) (Sigma-Aldrich Corporation, Germany)
Distiliuotas vanduo
2.5.2. Standartinių tirpalų paruošimas
Atsveriama 100 mg geležies (II) sulfato hidrato druskos (FeSO4•7H2O) ir maišant ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens. Gaunamas 1 mg/ml koncentracijos geležies druskos tirpalas, kuriame geležies (II) koncentracija - 0,201 mg/ml. Iš gauto tirpalo ruošiami aštuoni skirtingų koncentracijų etaloniniai tirpalai (0.002 mg/ml, 0.004 mg/ml, 0.006 mg/ml, 0.008 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.012 mg/ml, 0.014 mg/ml, 0.016 mg/ml) Etalonai ruošiami atitinkamai į aštuonias 10 ml tūrio kolbutes patalpinant atitinkamai po 0.1 ml, 0.2 ml, 0.3 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml, 0.7 ml ir 0.8 ml paruošto geležies (II) sulfato druskos tirpalo. Į kiekvieną kolbutę lašinama po 1 ml HCl (1:2) ir po 1 ml sulfosalicilo rūgšties
tirpalo. Į kiekvieną ruošiamą etaloną po truputį lašinamas NH4OH (10 proc.) tirpalas iki nekintančios
geltonos spalvos. Visos kolbutes užpildomos iki žymės lašinant distiliuotą vandenį.
2.5.3. Vaistinio preparato tirpalo paruošimas tyrimui
Vienos kapsulės masė, kurioje yra 100 mg bevandenio geležies sulfato (37 mg Fe(II)) 40 min. tirpinama 100 ml vandens, šildant ultragarso vonelėje ir nuolat maišant. Emulsija filtruojama pro popierinį filtrą. 0.4 ml paruošto tirpalo patalpinama į 10 ml tūrio kolbutę. Pilama 1 ml HCl (1:2) ir 1 ml 10 proc. sulfosalicilo rūgšties (5 pav.). Lašinamas NH4OH (10proc.) tirpalas iki nekintančios
geltonos spalvos. Po to lašinamas distiliuotas vanduo iki žymės.
5 pav. Sulfo salicilo rūgštis
2.5.4. Spektrofotometrinė tiriamosios medžiagos analizė
Analizėje naudota 10 mm kiuvetė. Šviesos filtras parenkamas matuojant vidutinės koncentracijos etaloninio tirpalo optinį tankį. Matuojama 360-500 nm intervale. Kaip lyginamasis tirpalas naudotas distiliuotas vanduo. Parenkamas šviesos filtras prie kurio optinis tankis yra didžiausias – 423 nm. Pasirinktas gradavimo grafiko kiekybinis analizės metodas. Matuojamas paruoštų etaloninių tirpalų optinis tankis. Gradavimo grafikas sudaromas brėžiant optinio tankio priklausomybę nuo tirpalų koncentracijos. Tada matuojamas tiriamosios medžiagos tirpalo optinis tankis ir iš gradavimo grafiko nustatoma medžiagos koncentracija tiriamąjame tirpale.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Geležies identifikavimas
3.1.1. Reakcija su kalio heksacianoferatu (III)
Dvivalentės geležies identifikavimas atliktas remiantis Europos farmakopėjos straipsnyje 01/2008:20301 aprašoma Fe2+
reakcija su kalio heksacianoferatu (K3Fe(CN)6). Susidaręs mėlynos
spalvos netirpus rūgštyse kompleksinis junginys – Berlyno mėlynojo nuosėdos – įrodo Fe2+
buvimą tirpale.
Geležies (II) oksidacija: Fe2+
+ [Fe(CN)6]3- → Fe3+ + [Fe(CN)6]4- Nuosėdų susidarymas: Fe3+
+ K+ + [Fe(CN)6]4- → KFe[Fe(CN)6]↓
3.1.2. Reakcija su amonio hidroksidu
Geležies tapatybės patvirtinimui atlikta antra identifikavino reakcija su amonio hidroksidu. Geležies tapatybę patvirtina susidarę žalsvos nuosėdos, ruduojančios ore dėl geležies (II) savybės greitai oksiduotis, kurios tirpsta organinėse rūgštyse.
Nuosėdų susidarymas: Fe2+
+ 2OH- → Fe(OH)2↓ Oksidacija: 4Fe(OH)2 + O2 + 2H2O → 4Fe(OH)3↓
Nuosėdų tirpinimas acto rūgštyje: Fe(OH)2 + 2H+ → Fe2+ + 2H2O
3.2. Geležies kiekybinis nustatymas
Geležies kiekis nustatytas atlikus spektrofotometrinę analizę, remiantis geležies savybe sudaryti spalvotą kompleksinį junginį su sulfosalicilo rūgštimi, kuris pasižymi optiniu aktyvumu (6 pav.) [41] Geležies kiekis nustatytas pagal tirpalo optiškai aktyvių dalelių gebėjimą absorbuoti UV šviesą. Matuojant tiriamos medžiagos optinį tankį 360-500 nm bangų intervale nustatyta, kad optinis tankis yra didžiausias prie 423 nm bangos (7 pav.).
6 pav. Geležies ir sulfosalicilo rūgšties kompleksas
Iš paruoštų skirtingos koncentracijos standartinių tirpalų sudaryto gradavimo grafiko (6 pav.) pagal absorbuotą UV šviesos kiekį nustatoma optiškai aktyvios medžiagos koncentracija. Sudarytas geležies kalibracinis grafikas (8 pav.) iš kurio apskaičiuotas geležies kiekis mėginyje – 0.0139 mg/ml, t.y nustatyta, kad vaiste yra 34.75 mg geležies.
7 pav. Geležies kompeksinio junginio absorbcijos spektras
Koreliacijos koeficientas (R2) – 0.9994. Kadangi koeficientas didesnis nei 0.99 metodika tvirtinama kai tinkama kiekybiniam įvertinimui.
8 pav. Geležies (II) kalibracinė kreivė
3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimas
Folio rūgšties ir cianokobalamino atskyrimui, identifikavimui ir kiekio nustatymui pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Pradinės sąlygos pasirinktos remiantis atlikta folio rūgšties kokybinės ir kiekybinės analizės mtodika [15]. Naudotas diodų matricos detektorius, kolonėlės temperatūra 25 C, judrios fazes tėkmės greitis – 1 ml/min. Keisti parametrai: kolonėlė, gradientinė sistema, injekcijos tūris. Medžiagų atskyrimui 25 cm, 5 µm C18 pakeista į 150 mm ilgio, 4.6 mm pločio ir 3 µg dalelių dydžio ACE18 kolonėlę. Visiškas analičių atsiskyrimas pasiektas naudojant gryno acetonitrilo ir fluoracto rūgšties (0.1 proc.) gradientinę sistemą. Optimizuotas injekcijos tūris – 10 µl.
3.4. Metodikos validacija
Validacija - eilė veiksmų, kuriais įrodomas metodikos tinkamumas tiriamam objektui. Metodika validuota remiantis mokslinėse gairėse esančiais reikalavimais pagal šiuos pasirinktus validacijos parametrus:
• specifiškumas
• glaudumas (rezultatų pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas) • tiesiškumas
• aptikimo riba
3.4.1. Specifiškumas
Metodikos specifiškumas – tai gebėjimas vienareikšmiškai įvertinti analitės buvimą, užtikrinti jos identifikavimą [22]. Kiekviena chromatografinė smailė atitinka tam tikrą cheminį junginį. Specifiškumas vertinamas pagal standartinių tirpalų ir tiriamų tirpalų chromatogramas, analičių sulaikymo laikus ir spektrinius sutapimus.
Vaistinės medžiagos ir standartinių tirpalų chromatogramos pateikiamos 4 – 7 paveiksluose.
4 pav. Vaistinio preparato Ferro-folgamma chromatograma prie 287 nm bangos 1 – folio rūgštis, 2 – cianokobalaminas.
5 pav. Vaistinio preparato Ferro-folgamma chromatograma prie 360 nm bangos 1 – folio rūgštis, 2 – cianokobalaminas.
6 pav. Etaloninio junginio chromatograma prie 360 nm ilgio bangos (cianokobalaminas)
7 pav. Etaloninio junginio chromatograma prie 287 nm ilgio bangos (folio rūgštis)
Palyginant tiriamojo mėginio ir standartinių tirpalų chromatogramas matyti, kad junginių sulaikymo laikai sutampa. Cianokobalaminio sulaikymo trukmė – 10.296 min. Folio rūgšties sulaikymo laikas – 9.505 min.
Metodikos specifiškumas įvertintas palyginus analizės metu gautus vitaminų UV spektrus su atlikto mokslinio tyrimo gautais vitaminų B9 ir B12 spektrais [23]. Cianokobalamino ir folio rūgšties spektrai pateikiami 8 ir 9 paveiksluose.
8 pav. Folio rūgšties UV spektrų palyginimas (A – tyrimo metu gautas folio rūgšties spektras, B – mokslinės literatūros šaltinyje [23] pateiktas folio rūgšties spektras)
9 pav. Cianokobalamino UV spektrų palyginimas (A – tyrimo metu gautas cianokobalamino spektras, B – mokslinės literatūros šaltinyje [23] pateiktas cianokobalamino spektras)
Tyrimo metu užrašytame cianokobalamino spektre matomi du maksimumai: prie 209.7 ir 359.6 nm bangos ilgių. Folio rūgšties spektre nustatytas maksimumas prie 287 nm bangos ilgio. Lyginajame cianokobalamino spektre maksimumas užfiksuotas prie 210 nm, o folio rūgšties spektre maksimumas nustatytas prie 275 nm bangos ilgio.
Palyginus junginių spektrus matyti, kad spektrai sutampa, todėl galima teigti, kad metodika pakankamai specifiška vaistinio preparato tyrimui.
3.4.2. Tiesiškumas
Tiesiškumas - tai gebėjimas gauti tokius rezultatus, kurie tiesiogiai proporcingi junginio koncentracijai, t.y. analitės smailės ploto tiesioginę priklausomybę nuo analitės koncentracijos. Tiesiškumo įvertinimui sudaroma kalibracinė kreivė, kurioje turi būti bent penki skirtingų koncentracijų taškai.
8 pav. Folio rūgšties kalibracinė kreivė
Folio rūgšties kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas yra didesnis nei 0.99, todėl galima teigti, kad kiekybinio nustatymo metodikos tiesiškumas atitinka nustatytus reikalavimus ir tinka vaistinio preparato tyrimui. (5 lentelė)
5 lentelė. Folio rūgšties kalibracinės kreivės charakteristikos
Analitės pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Folio rūgštis 9.505 0.9992 Y=2.18×107x+2.55×104 0.126 – 0.0504
3.4.3. Glaudumas
Metodikos glaudumas nustatomas įvertinus metodikos pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą. Remiantis mokslinėmis gairėmis atliekama to paties mėginio analizė iš eilės keletą kartų tomis pačiomis sąlygomis ir skaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis.
Pakartojamumas parodo vieną po kitos, tomis pačiomis sąlygomis atliktų analizių rezultatų
tikslumą. Atliekamos kelios tiriamojo mėginio injekcijos tą pačią dieną. Pakartojamumas vertinamas pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN), kuris dar vadinamas variacijos koeficientu. Vertinamas
smailės plotas ir sulaikymo laikas atlikus penkias injekcijas. Variacijos koeficientas yra metodo tinkamumo kriterijus, kuris neturėtų viršyti 5 proc. Iš lentelėje pateiktų duomenų (7 lentelė.) galima teigti, kad metodas yra tinkamas, nes variacijos koeficientas svyruoja intervale 0.3 – 1.2 proc.
7 lentelė. Analičių variacijos koeficientai (proc.) sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.)
Folio rūgštis 0.3 1.2
Cianokobalaminas 0.3 0.4
Tarpinis preciziškumas įvertinamas atliekant analizę skirtingomis dienomis. Variacijos
koeficientas neturėtų būti didesnis nei 10 proc., tačiau farmaciniams preparatams rekomenduojamas ne didesnis kaip 5 proc. Pagal lentelės duomenis (8 lentelė) galime teigti, kad metodas yra tinkamas, nes SSN yra intervale 0.3-1.5.
8 lentelė. Analičių variacijos koeficientai (proc.) sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.)
Folio rūgštis 0.3 1.5
Cianokobalaminas 0.3 0.5
Įvertinus pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą galima teigti, kad metodikos glaudumas atitinka nustatytus reikalavimus ir metodika tinkama tiriamajam preparatui.
3.4.4. Ribos
Apskaičiuojamos analizės metu tirtų junginių aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos, kurios parodo metodikos jautrumą.
Aptikimo riba (angl. Detection Limit) – tai mažiausia analitės koncentracija mėginyje, kuri gali
būti statistiškai pagrįstai identifikuota. Tai tokia analitės koncentracija, kurios smailė viršija triukšmo lygį bent du kartus.
Nustatymo riba (angl.Quantitation Limit) – tai mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti
įvertintas kiekybiškai.
9 lentelė. Aptikimo ir nustatymo ribos
Analitė Aptikimo riba (µg/ml) Nustatymo riba (µg/ml)
Folio rūgštis 0.04 0.13
3.5. Metodikos pritaikymas vaistinio preparato Ferro-folgamma tyrimui
3.5.1. Folio rūgšties ir cianokobalamino atskyrimas, ir identifikavimas
Validuotas ESC metodas, naudojant diodų matricos detektorių ir pritaikytas preparato Ferro-folgamma tyrimui. Taikant šį metodą atliktas vitaminų B9 ir B12 atskyrimas (8 pav.) ir identifikavimas lyginant su etaloniniais tirpalais (9 pav.).
8 pav. Vitaminų atskyrimas vaistiniame preparate Ferro-folgamma (1-folio rūgštis, 2-cianokobalaminas)
9 pav. Vitaminų atskyrimas standartinių tirpalų mišinyje (1-folio rūgštis, 2-cianokobalaminas)
3.5.2. Folio rūgšties kiekio nustatymas
Optimizuota ir validuota metodika apskaičiuotas folio rūgšties kiekis. Nustatytas folio r. kiekis kapsulėje – 4.73 mg. Tai sudaro 94.6 proc. vaiste nurodytos dozės.
3.5.3. Geležies kokybinis ir kiekybinis įvetinimas
Vaistiniame preparate Ferro-folgamma patvirtinta geležies tapatybė specifinėmis identifikavimo reakcijomis. Spektrofotometriškai nustatytas geležies kiekis – 34.75 mg. Tai sudaro 93.92 proc. nurodyto geležies kiekio preparate.
4. IŠVADOS
1. Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą atrinktos analitinės metodikos tinkamos numatytam daugiakomponenčio preparato veikliųjų medžiagų įvertinimui.
2. Optimizuota ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika.
3. Validuota ESC metodika atliktas komponentų – folio rūgšties, cianokobalaminio – atskyrimas ir identifikavimas.
4. ESC metodika atliktas folio rūgšties kiekybinis nustatymas.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Metodika gali būti taikoma analizuoto vaistinio preparato kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui, folio rūgšties preparatų kokybinei ir kiekybinei analizei, B grupės vitaminų atskyrimui ir vitaminų B9 ir B12 identifikavimui.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Babravičienė R., Anemija – pavasario palydovė, Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos
ministerija, 2012;
2. Jaskovikienė V., Geležies trūkumo požymiai ir jo gydymas, Farmacija ir laikas, 2005, Nr.9 3. Kazlauskienė D., Ivanauskas L., Marksienė R., Chromatografiniai analizės metodai, Kaunas,
KMU, 2008;
4. Kiudelienė R., Geležies stokos diagnostikos ypatumai ankstyvojo amžiaus vaikams, Daktaro
disertacija, Kaunas, 2009;
5. Marksienė R., Optiniai analizės metodai, Mokomoji knyga, Kaunas, 2008;
6. Naumavičienė R., Anemijos vyresniame amžiuje, Farmacija ir laikas, 2011, Nr 8;
7. Pečeliūnas V., Kraujodaros bei krešėjimo sistemas veikiantys vaistai. Gydymo menas.
Farmakoterapija. Apžvalgos ir aktualijos (I) 2005, p. 66-67;
8. Praškevičius A., Burneckienė J, Ivanovienė L., Fermentai ir vitaminai, Kaunas, 2002;
9. Ragelienė L., Rascon J., Antrinės hemosiderozės etiopatogenezė, diagnostika ir gydymas,
Medicinos teorija ir praktika 2011 - T. 17 (Nr. 3), 344–354;
10. S. Bučytė. Geležis ir jos trūkumas, Farmacija ir laikas, 2005 Nr.5;
11. Šapoka V, Vitamino B12 trūkumas ir jo korekcija injekuojamu cianokobalaminu, Internistas
3(99), 2010, 17-20;
12. Ali M., Zehra A., Simultaneous separation and identification of cyanocobalamin, thiamine, and ascorbic acid on polyoxyethylene sorbitan monooleate-impregnated silica layers with water as mobile phase. JPC-Journal of Planar Chromatography-Modern TLC 22, no. 6 (2009): 429-433.
13. Aurora-Prado M., S., Silva C., A., Tavares M. F.,M., Altria F., D., Determination of folic acid in tablets by microemulsion electrokinetic chromatography, Journal of Chromatography A, 1051 (2004) 291–296;
14. Benoist, B., McLean E., Egli I., Cogswell M., Worldwide prevalence of anaemia 1993-2005:
WHO global database on anaemia. World Health Organization, 2008.
15. Breithaupt D.,E., Determination of folic acid by ion-pair RP-HPLC in vitamin-fortified fruit juices solid-phase extraction, Food Chemistry 74 (2001) 521–525;
16. Deconinck E., Crevits S., Baten P., Courselle P., De Beer J. A validated ultra high pressure liquid chromatographic method for qualification and quantification of folic acid in pharmaceutical preparations. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 54.5 (2011): 995-1000.
17. European Pharmacopoeia 7th Edition, Volume 1, France, 2010, p. 108, 1294 – 1295.
19. Farrukh M., A., Siraj N., Rehman A.,U., Naqvi I., I., Comparative study of spectroscopic techniques for the estimation of iron in apple and vegetables, Journal of Saudi Chemical Society, Volume 14, Issue 2, 2010, 209–212;
20. Fotsing L., Fillet M., Bechet I., Hubert Ph, Crommen J., Determination of six water-soluble vitamins in a pharmaceutical formulation by capillary electrophoresis, Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, Volume 15, Issue 8, May 1997, Pages 1113–1123;
21. Ghinea M. M., Treatment of iron deficiency anemia with ferro-folgamma. Romanian journal of
internal medicine 2004, vol. 42, no 1, p. 225-230;
22. Guideline, ICH Harmonized Tripartite., Q2B validation of analytical procedures: methodology. Fed. Regist 62 (1997);
23. Heudi O., Kilinc T.¸ Fontannaz P., Separation of water-soluble vitamins by reversed-phase
high performance liquid chromatography with ultra-violet detection: Application to polyvitaminated premixes, Journal of Chromatography A, 1070 (2005) 49–56;
24. Hoffbrand V. A., Weir, G., D., The history of folic acid, British Journal of Haematology Volume 113, Issue 3, pages 579–589, June 2001
25. Katzung B., G., Bendroji klinikinė farmakologija, Vilnius, 2007, 525-538;
26. Klejdus B., Petrlová J., Potěšil D., Adam V., Mikelová R., Vacek J., Kizek R., Kubáň V.,
Simultaneous determination of water- and fat-soluble vitamins in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection, Analytica Chimica Acta Volume 520, Issues 1–2, 23 August 2004, Pages 57–67;
27. Kumar S., S., Chouhan R., S., Thakur M., S., Enhancement of chemiluminescence for vitamin B12 analysis, Analytical Biochemistry 388 (2009) 312–316;
28. Kumar, S., S., Chouhan, S., R., Thakur, S., M., Trends in analysis of vitamin B12, Analytical
Biochemistry 398 (2010) 139–149;
29. Li H., B.,Chen F., Jiang Y, Determination of vitamin B in multivitamin tablets and 12 fermentation medium by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection,
Journal of Chromatography A, 891 (2000) 243–247;
30. Looker A., C., Dallman P., R, Carroll M., D., Gunter E. W., Johnson C., L., Prevalence of iron deficiency in the United States. Jama 277, no. 12 (1997): 973-976;
31. Nelson B., C., Sharpless K., E., Sander L., C., Quantitative determination of folic acid in multivitamin/multielement tablets using liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Journal of
Chromatography A, 1135 (2006) 203–211;
32. Ong C., P, Ng C.L., Lee H., K., Li S., F., Y, Separation of water- and fat-soluble vitamins by micellar electrokinetic chromatography, Journal of Chromatography A Volume 547, 28 June 1991, Pages 419–428;
33. Snow C., F., Laboratory diagnosis of vitamin B12 and folate deficiency: a guide for the primary care physician. Archives of internal medicine 159.12 (1999): 1289-1298;
34. Stoltzfus R., J., Iron deficiency: Global prevalence and consequences, Food and Nutrition
Bulletin, vol. 24, no. 4 (supplement) 2003, The United Nations University.
35. Tesfaldet O., Z., Van Staden, F., J., Stefan I., R., Sequential injection spectrophotometric determination of iron as Fe(II) in multi-vitamin preparations using 1,10-phenanthroline as complexing agent, Talanta 64, 2004, 1189–1195;
36. Williams R., C., Baker D., R, Schmit J., A, Analysis of Water-Soluble Vitamins by High-Speed Ion-Exchange Chromatography, Oxford JournalsMathematics & Physical Sciences, Journal of
Chromatographic Science, Volume 11, Issue 12, 1973, p. 618-624;
37. Iron (II) sulfate. Prieiga per internet: <http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.22804.html>
38. Iron Deficiency Anaemia Assessment, Prevention and Control. A guide for programme managers. Prieiga per internetą:
http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/66914/1/WHO_NHD_01.3.pdf?ua=1
39. Chromatography in Bioactivity Analysis of Compounds. Prieiga per internetą:
<http://www.intechopen.com/books/column-chromatography/chromatography-in-bioactivity-analysis-of-compounds>
40. Bützer P., Dynamik von Vitamin B12, Cobalamin, 2008;
41. Гурецкий ИЯ, Кузнецов ЛБ, Кузнецовa BB, Кучкарев ЕА, Самрукова ОЛ, Свирщевская
ГГ, Колососян ЛБ, Рогатинский СЛ. Практикум по физикохимическим методам анализа. Издательство “Xимия” 1987. Ст 70-72
