LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

KAUNAS, 2018

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TAUTVYDAS KAZLAUSKAS

DIAZEPAMO IR JO METABOLITŲ DUJŲ

CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ SPEKTROMETRIJOS PALYGINAMOJI BIOANALIZĖ

TAIKANT SKIRTINGĄ JONIZACIJĄ TEISMO TOKSIKOLOGIJOS

PRAKTIKOJE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas

_________ _______ (Parašas) (Data)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data

DIAZEPAMO IR JO METABOLITŲ DUJŲ

CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ SPEKTROMETRIJOS PALYGINAMOJI BIOANALIZĖ

TAIKANT SKIRTINGĄ JONIZACIJĄ TEISMO TOKSIKOLOGIJOS

PRAKTIKOJE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data) Kaunas, 2018 Darbą atliko Magistrantas Tautvydas Kazlauskas Data Recenzentas

Vardas Pavardė Parašas Data

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Apsinuodijimai benzodiazepinais Lietuvoje 2015-2016 metais ... 12

1.2 Benzodiazepinų struktūros ypatumai ... 14

1.3 Diazepamas ... 16

1.4. Diazepamo metabolizmas ... 18

1.5.1. Bioanalizės įvadas ... 19

1.5.2. Pagrindiniai diazepamo bioanalizės metodai ... 20

1.5.3. Kraujo mėginiai, jų savybės ir diazepamo nustatymo metodai ... 21

1.5.4. Šlapimo mėginiai, jų savybės ir diazepamo nustatymo metodai ... 22

1.6. Elektroninė ir cheminė jonizacija ... 22

1.7. Tyrime nagrinėtos dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS) metodo charakteristikos . 23 2. TYRIMO METODIKA ... 25

2.1. Tyrimo organizavimas ... 25

2.2. Tyrimo objektas ir reagentai ... 25

2.3. Įranga ... 26

2.4. Tyrimo metodai ... 26

2.5. Mėginių paruošimas ... 26

2.6. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo kokybinis ir kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodu ... 27

2.7. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo kokybinis ir kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodu ... 27

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29

3.1. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo specifiškumas ... 29

3.2. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo specifiškumas ... 32

3.3. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos

su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo glaudumas ... 34

3.4. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo glaudumas ... 35

3.5. Glaudumo palyginimas tarp metodų su skirtinga jonizacija ... 36

3.6. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo tiesiškumas ... 37

3.7. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo tiesiškumas ... 39

3.8. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos ... 40

3.9. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos ... 42

3.10. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo teisingumas ... 43

3.11. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo teisingumas ... 44

3.12. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo matricos efektų vertinimas ... 46

3.13. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo matricos efektų vertinimas ... 48

IŠVADOS ... 51

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 52

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 53

SANTRAUKA

T. Kazlausko magistro baigiamasis darbas “Diazepamo ir jo metabolitų dujų chromatografijos-masių spektrometrijos palyginamoji bioanalizė taikant skirtingą jonizaciją teismo toksikologijos praktikoje“ / mokslinis vadovas Doc. Dr. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Diazepamas, metabolitai, bioanalizė, dujų chromatografija, masių

spektrometrija, cheminė jonizacija

Darbo tikslas: Palyginti instrumentinės analizės metodus (dujų chromatografija-masių

spektrometrija) su skirtinga jonizacija (elektroninė jonizacija ir neigiamo jono cheminė jonizacija) nustatinėjant diazepamą ir jo metabolitus šlapimo mėginiuose ir įvertinti jonizacijos tipo įtaką bioanalizės rezultatams.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti mėginių paruošimą taikant fermentinę hidrolizę, skystis-skystis ekstrakciją bei derivatizaciją

2. Atlikti diazepamo ir jo metabolitų bioanalizę taikant dujų chromatografiją-masių spektrometriją su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS)

3. Atlikti diazepamo ir jo metabolitų bioanalizę taikant dujų chromatografiją-masių spektrometriją su elektronine jonizacija (GC-EI-MS)

4. Įvertinti jonizacijos tipo įtaką bioanalizės specifiškumui, glaudumui, tiesiškumui, aptikimo ir kiekybinio nustatymo riboms, teisingumui, matricos efektams.

Tyrimo objektas ir metodai: žmonių šlapimas su pridėtais etaloniniais vaistų standartais. Taikyta

skystis-skystis ekstrakcija, paskui mėginiai derivatizuoti naudojant MTBSTFA derivatizatorių. GC-NICI-MS analizė atlikta su AGILENT TECHNOLOGIES-7890A dujų chromatografu, prie kurio prijungtas 5975C NCI-MS detektorius, dujinis reagentas – metanas NICI režime. GC-EI-MS analizė atlikta su SHIMADZU GCMS-QP2010. Abiem atvejais analizės metu taikytas selektyvaus jono monitoringo (SIM) režimas, o dujinis nešiklis – helis.

Rezultatai ir išvados: Bendras chromatografinės analizės laikas buvo 4.9 min., taikant

GC-NICI-MS ir 17 min., taikant GC-EI-GC-NICI-MS. Analizė atlikta su neigiamo jono chemine jonizacija buvo ženkliai jautresnė ir greitesnė nei taikant elektroninę jonizaciją.

SUMMARY

Kazlauskas T. master thesis “Comparative gas chromatography-mass spectrometry bioanalysis of diazepam and its metabolites using different ionization in forensic toxicology practice” / research director Doc. Dr. A Ževžikovas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas.

Key words: Diazepam, metabolites, bioanalysis, gas chromatography, mass spectrometry, chemical

ionization

Aim: To make the comparative Gas chromatography-Mass spectrometry (GC-MS) bioanalysis of

classical benzodiazepine – diazepam, and its metabolites using electron impact (EI) and negative ion chemical ionization (NICI) and to evaluate the impact of ionization type on the analysis.

Objectives:

1. To prepare samples using enzymatic hydrolysis, liquid-liquid extraction and derivatization

2. To do bioanalysis of diazepam and its metabolites using gas chromatography-mass spectrometry with negative ion chemical ionization (GC-NICI-MS)

3. To do bioanalysis of diazepam and its metabolites using gas chromatography-mass spectrometry with electron impact ionization (GC-EI-MS)

4. To evaluate the impact of ionization type on the specificity, precision, linearity, limit of detection, limit of quantification, accuracy and matrix effects of bioanalysis

Objects and methods: Subject of study - the drug-free human urine and blood spiked with stock

standards of drugs. The concentration of internal standards oxazepam-D5, diazepam-D5, and clonazepam-D4 for these studies was 200 ng/ml. Enzymatic hydrolysis was done with β-glucuronidase from Escherichia

Coli (E.Coli). Afterwards, liquid-liquid extraction and derivatization with MTBSTFA were performed.

GC-NICI-MS analysis was carried out with an AGILENT TECHNOLOGIES-7890A gas chromatograph coupled to a detector 5975C NCI-MS. The chromatographic separation was performed using DB-5-HT capillary column (30 m x 0.320 mm I.D., 0.10 μm film thickness), methane was used as reagent gas in NICI mode. GC-EI-MS analysis was carried out with SHIMADZU GCMS-QP2010 Ultra with Rxi-5ms capillary column (30 m x 0.25 mm I.D., 0.25 μm film thickness). All quantitative analyses were performed in the selected ion monitoring (SIM) mode, and helium was used as the carrier gas.

Results and conclusions: Total chromatographic analysis time was 4.9 min. in GC-NICI-MS and

17 min. in GC-EI-MS analysis.

In conclusion, analysis done with negative ion chemical ionization was more sensitive, and resulted in faster analysis time than using electron impact ionization.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju Valstybinės Teismo Medicinos Tarnybos teismo ekspertams dr. Marijai Jakubėnienei, dr. Nerijui Karlonui, papildomos praktikos vadovei, VTMT Toksikologijos laboratorijos vedėjai dr. Zitai Minkuvienei, Ekstremalių situacijų biuro, apsinuodijimų skyriaus vedėjai gydytojai-toksikologei Laimai Gruzdytei, magistrinio darbo vadovui, Doc. dr. Andrejui Ževžikovui bei Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros kolektyvui už konsultacijas bei pagalbą padedant ruošti magistrinį darbą.

SANTRUMPOS

SIM – selektyvus jonų monitoringas

GABA – gama aminosviesto rūgštis

CNS – centrinė nervų sistema

BDZ – benzodiazepinas

Vd – pasiskirstymo tūris

MS – masių spektrometrija

GC-MS – dujų chromatografija-masių spektrometrija

EI-MS – elektroninės jonizacijos masių spektrometrija

NICI-MS – neigiamo jono cheminės jonizacijos masių spektrometrija

TCA – tricikliai antidepresantai

ADME – absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas, eliminacija

TVM – terapinis vaisto monitoringas

FDA – JAV maisto ir vaistų agentūra

EMA – Europos vaistų agentūra

ICH – Tarptautinis harmonizacijos komitetas

DBS (Dried Blood Spots) – džiovinti kraujo lašai

AIMS (Ambient Ionization Mass Spectrometry) – aplinkos jonizacijos masių spektrometrija

CBS-MS/MS (Coated Blade Spray-Mass Spectrometry) – dengto ašmens išpurškimo-masių

spektrometrija

DAS (Dilute and shoot) – mėginio paruošimo būdas praskiedžiant ir suleidžiant

DUS (Dried Urine Spots) – sausi šlapimo lašai

MSTFA – N-metil-n-(trimetilsilil)trifluoracetamidas

BSTFA – N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoracetamidas

TMCS - trimetilchlorosilanas

MTBSTFA – N-tert-butildimetilsilil-n-metiltrifluoracetamidas

TBDMS – Tert-butildimetilsililo eteris

DAD – diodų matricos detektorius

LC – skysčių chromatografija

MS/MS – tandeminė masių spektrometrija

TIC – pilna jonų chromatograma

ĮVADAS

Benzodiazepinai yra raminamųjų vaistų klasė, kurių vartojimas per pastarąjį dešimtmetį tik išaugo, nepriklausomai nuo finansinės krizės ar griežtesnės receptinių vaistų kontrolės taikant elektroninius receptus [1]. Tai yra ganėtinai saugūs, efektyvūs ir gerai ištirti vaistai, tačiau šie vaistai pasižymi narkotinėmis savybėmis, dėl kurių iškyla aibė problemų: piktnaudžiavimas, perdozavimai, savižudybės, kompulsyvios agresijos priepuoliai ar autoįvykiai keliuose [2].

Pasaulyje dažnai skiriamas per mažas dėmesys racionaliam gydymui benzodiazepinais, todėl neišvengiama farmakoterapinių problemų kaip pvz., išsivysčiusi priklausomybė, dėl per ilgo vartojimo. Vokietijoje 2017 metais atliktas tyrimas, kuriuo buvo siekta išsiaiškinti benzodiazepinų ir kitų psichotropinių vaistų receptų išrašymo dažnį, kuriuos išrašo gydytojai, kurie nėra psichiatrai, rezultatai parodė didelį dažnį, o tai neabejotinai prisideda prie netinkamo benzodiazepinų vartojimo, nes pvz., geras LOR gydytojas nebūtinai mokės racionaliai taikyti gydymą benzodiazepinais [3]. Benzodiazepinų vartojimas ypač didėja tarp senyvo amžiaus žmonių, todėl didėja rizika pasireikšti potencialiai pavojingam šalutiniam poveikiui, kadangi neretai vyresni pacientai vartoja daug vaistų, dėl ko pasireiškia polifarmacijos reiškinys, be to, dėl koordacinių sutrikimų, padidėja kritimų ir trauminių kaulų lūžių. Vokietijoje 2017 metais buvo tiriamas psichotropinių vaistų skyrimas senyvo amžiaus žmonėms, rezultatai parodė, kad dažniausiai vartojami psichotropai yra benzodiazepinai, o gausiausias jų vartojimas yra tarp vyresnių nei 65 metai gerontologinių bei chirurginių skyrių pacientų [4].

Diazepamas taip pat yra vaistas, kuriuo dažnai piktnaudžiaujama, pvz., 2016 metais Londone, Junginėje Karalystėje atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad diazepamas kartu su zet vaistais yra medžiaga, kuria dažniausiai piktnaudžiaujama naktiniuose klubuose [5]. Panašias tendencijas parodė ir 2017 metais Osle, Norvegijoje atliktas tyrimas, kurio rezultatuose diazepamas yra dažniausiai vartojamas, kartu su klonazepamu, amfetaminu ir heroinu tarp pacientų, kurie gydyti nuo apsinuodijimų psichotropinėmis medžiagomis [6]. 2016 metais Švedijoje buvo aptartas juodojoje rinkoje esantis naujosios kartos benzodiazepinas – flubromazolamas, kuris pasižymi labai stipriu sedaciniu poveikiu, greita veikimo pradžia, taip pat labai greitu priklausomybės išsivystymu, šios savybės vaistą daro itin pavojingu [7]. Į juodąją rinką ateina ir daugiau benzodiazepinaų kaip pvz., fonazepamas, nifoksipamas, fenazepamas, meklonazepamas, diklazepamas. Šie nauji junginiai kelia iššūkį tiek teismo toksikologams, tiek reguliacinėms institucijoms, kadangai pasižymi stipresniu poveikiu nei klasikiniai benzodiazepinai, bet tuo pačiu yra sunkiai aptinkami, išvengia nelegalaus statuso, todėl parsiduoda internetu, o tai priveda prie apsinuodijimų bei mirtinų intoksikacijų [8,9].

Piktnaudžiavimas ir neracionalus benzodiazepinų skyrimas iliustruoja, kad benzodiazepinų vartojimas išlieka aktualus, o naujų medžiagų atsiradimas yra dar viena priežastis, dėl kurios būtina nuolat vystyti, atnaujinti ir optimizuoti analitinius metodus, nes senesnis, mažiau specifiškesnis metodas neaptiks naujos kartos medžiagų, kaip flubromazolamas.

Neigiamo jono cheminės jonizacijos masių spektrometrija (NICI-MS) yra „švelni“ jonizacijos technika ir lyginant su elektroninės jonizacijos masių spektrometrija (EI-MS) gali ženkliai padidinti jautrumą nustatinėjant junginius su elektroneigiamomis grupėmis, taigi – Diazepamo, Nordazepamo, Oksazepamo bei Temazepamo [10].

Savo darbe pasirinkau tirti diazepamą ir jo metabolitus dujų chromatografijos-masių spektrometrijos bioanalizės metodu, nes jo indikacijos yra plačiausios. Diazepamas yra taikomas psichiatrijoje, toksikologijoje, gerontologijoje, gastroenterologijoje, radiologijoje, greitojoje medicinos pagalboje ir kitose srityse. Tai yra plačiausiai vartojamas benzodiazepinų grupės vaistas, todėl, manau, diazepamo ir jo metabolitų bioanalizė yra geras pagrindas vystyti analitinius metodus naujos kartos benzodiazepinų tyrimams ateityje, nes pagal apžvelgtus statistinius duomenis bei publikacijas, šios grupės vaistų aktualumas išliks dar ilgai.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Palyginti instrumentinės analizės metodus (dujų chromatografija-masių

spektrometrija) su skirtinga jonizacija (elektroninė jonizacija ir neigiamo jono cheminė jonizacija) nustatinėjant diazepamą ir jo metabolitus šlapimo mėginiuose ir įvertinti jonizacijos tipo įtaką bioanalizės rezultatams

Darbo uždaviniai:

01. Atlikti mėginių paruošimą taikant fermentinę hidrolizę, skystis-skystis ekstrakciją bei derivatizaciją

02. Atlikti diazepamo ir jo metabolitų nustatymą taikant dujų chromatografiją-masių spektrometriją su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS)

03. Atlikti diazepamo ir jo metabolitų nustatymą taikant dujų chromatografiją-masių spektrometriją su elektronine jonizacija (GC-EI-MS)

04. Įvertinti jonizacijos tipo įtaką bioanalizės specifiškumui, glaudumui, tiesiškumui, aptikimo ir kiekybinio nustatymo riboms, teisingumui, matricos efektams

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Apsinuodijimai benzodiazepinais Lietuvoje 2015-2016 metais

Sveikatos apsaugos ministerijos Ekstremalių sveikatai situacijų centro Apsinuodijimų informacijos biuro pateikti IS „Sveidra“ duomenys [11] rodo, kad Lietuvoje 2015 metais benzodiazepinais apsinuodijo pagal diagnozės kodą T42.4 „apsnuodijimas benzodiazepinais“ 491 žmogus, o 2016 metais – 419 (1 lentelė) , iš kurių buvo 174 vyrai ir 245 moterys (2 lentelė), daugiausia registruota Vilniaus miesto savivaldybėje (3 lentelė). Iš pateiktų duomenų matyti, kad bendras apsinuodijimų skaičius benzodiazepinais 2015-2016 metais mažėjo, tačiau skirtumas nėra didelis.

1 lentelė. Apsinuodijusių benzodiazepinais skaičius 2015-2016 metais

491

419

2015 metai 2016 metai

2. lentelė. Apsinuodijimai benzodiazepinais pagal lytį 2016 metais

3. lentelė. Apsinuodijimai benzodiazepinais skirtinguose Lietuvos regionuose 2016

metais

1.2 Benzodiazepinų struktūros ypatumai

Pav. 1. Benzodiazepinų farmakoforas

Diazepamas pagal cheminę klasifikaciją yra priskiriamas benzodiazepinams [12]. Šie junginiai turi kondensuotą sistemą, kurią sudaro benzeno žiedas ir septynianaris 1,4-diazepinas pav.1., o farmakoforas yra 5-fenil-1,4,-dibenzodiazepin-2-onas. Pirmojoje padėtyje gali būti mažo dydžio pakaitas pvz., metilas, kuris sąlygoja optimalų farmakologinį veikimą, taip yra diazepamo, temazepamo atveju, nordazepamas ir oksazepama šioje padėtyje metilo pakaito yra netekę, todėl ir jų farmakologinis poveikis yra silpnesnis nei diazepamo – žr. pav 2. Taip pat, šioje padėtyje azotas gali būti sujungtas su triazolo žiedu, kuris turi daug elektronų, ir dėl to padidėja junginio afiniškumas receptoriui, taigi ir sustiprėja poveikis, pagreitėja veikimo pradžia, be to, toks junginys pasižymi atsparumu oksidaciniam metabolizmui, tačiau, nebesusidaro aktyvūs metabolitai, ženkliai sutrumpėja poveikio trukmė. Aktyvūs metabolitai sąlygoja mieguistumą sekančią dieną[13]. Triazolamo žiedą turi pvz., alprazolamas (pav. 2), kuris JAV yra populiariausias benzodiazepinas, kuriuo piktnaudžiaujama svaiginimosi tikslais, jo populiarumą lemia tai, kad poveikis yra greitas, kainos skirtumo tarp orginalo ir generiko nebėra, todėl tabletės kaina gatvėje siekia vos 3-4 dolerius (2,5-3,24 eurų), didelę priklausomybę turintis asmuo gali per dieną suvartoti iki 30 tablečių [14]. Šį žiedą taip pat turi flubromazolamas (pav. 2), kuris be jo, savo sudėtyje turi dar ir fluorą bei bromą. Halogenai šiuo atveju sustiprina narkotines savybes, nes dėl didėjančio elektroneigiamumo, didėja ir aktyvumas [15], padidina junginio lipofiliškumą [16], fluoras yra klasikinis bioizosteras, dėl patvarios C-F jungties metabolitai yra patvarūs, todėl metabolizmas bus ilgesnis [17]. Dėl šių savybių flubromazolamo poveikis gali būti dar stipresnis, o veikimo pradžia greitesnė nei alprazolamo.

 Jei junginys turi hidroksilo grupę, yra labiau hidrofiliškas, pasišalins greičiau gliukuronido pavidale.

 Jei nėra, šalinsis lėčiau (ilgiau veiks) [13]

Hidroksilo grupes šioje padėtyje turi temazepamas ir oksazepamas, o diazepamas ir nordazepamas – neturi.

Pav. 2. Diazepamas ir jo metabolitai: oksazepamas, nordazepamas, temazepamas. JAV

populiariausias benzodiazepinas, kuriuo piktnaudžiaujama – alprazolamas. Naujosios

kartos benzodiazepinas – flubromazolamas.

1.3 Diazepamas

1.3.1 Bendrosios savybės

Molinė masė: 284,74 g/mol Tiksli masė: 284,0716407 Da Formulė: C16H13ClN2O

Sudėtis: C (67.49%), H (4.6%), Cl (12.45%), N (9.84%), O (5.62%)[18]

1.3.2 Pavadinimai

IUPAC: 7-chloro-1-metil-5-fenil-2,3-dihidro-1H-1,4-benzodiazepin-2-onas

Sinonimai: apaurin*, Relanium*, relium*, diazepeks*, diazepam-desitin*, diazepam Polta*,

seduxen*, atensine, atilen, alupram, antenex, benzopin, calmaven, diatran, dizac, diazepam-ratiopharm, elcion CR, euphorin P, evacalm, jinpanfan, nervium, nivalen, noan, notense, mandro, paranten, paxate, pomin, pms-diazepam, radizepam, saromet, sibazon, tranimul, trazepam, unisedil, vival, valeo, valium, zepaxid, zipan [18].

1.3.3 Fizikocheminės savybės

Fizikinis apibūdinimas: balti ar gelsvi kristaliniai milteliai. Praktiškai be kvapo. Iš pradžių

beskoniai, su karčiu poskoniu [21].

Tirpumas: Šiek tiek tirpsta vandenyje, tirpsta etanolyje [19]. pKa: 3.4 [12]

1.3.4 Klinikinės savybės

Farmacinė forma: per os (tabletės, geriamasis tirpalas), parenterinė (injekcijos), rektalinė

(žvakutės) [20]

Dozės: nuo 2 mg iki 10 mg (suaugusiesiems), nuo 1 mg iki 2,5 mg (vaikams) [21]

Dozių ekvivalentiškumas: Diazepamo 5 mg; lorazepamo 1 mg; bromazepamo 3 mg; alprazolamo

0.25 mg; zolpidemo 5 mg; klonazepamo 0.5 mg; midazolamo 7.5 mg [22].

Indikacijos: alkoholio abstinencijos sindromas, nerimas, sedacija, premedikacija prieš chirurginę

operaciją, endoskopines procedūras bei kardioversija, traukuliai, raumenų spazmas, status epilepticus, tetanusas [21], hipertenzija, tachikardija, esant chlorochino ar hidroksichlorochino intoksikacijai gali mažinti kardiotoksiškumą [20]

Farmakodinamika:

1. BDZ jungiasi prie GABA receptoriaus alfa subvieneto dalies, prisijungus, padidėja GABA afiniškumas receptoriui.

2. Kai BDZ prisijungia prie receptoriaus, padidėja GABA afiniškumas receptoriui.

3. Dėl padidėjusio GABA afiniškumo receptoriui, dažniau atsidarinėja joniniai chloro kanalai, padidėja chloro jonų srautas į ląstelę.

4. Įvyksta neurono hiperpoliarizacija, slopinama CNS.

5. BDZ dažnina kanalo atsidarymą, kai tuo tarpu barbitūrai ilgina atidaryto kanalo trukmę [13].

Farmakokinetika [21]:

 Vd: nuo 0,8 iki 1 L/kg

 Prisijungimas prie baltymų: nuo 95% iki 99.3%

 Metabolizmas: Kepenyse. Metabolitai – nordazepamas, temazepamas ir oksazepamas. Visi

metabolitai yra aktyvūs. Diazepamas yra substratas CYP3A4 ir 2C19 fermentams.

 Šalinimas: Pagrinde per inkstus, sumetabolizuotas. Bendras kūno klirensas 20-30 ml/min.

Dializė neefektyvi.

 Eliminacijos pusperiodis: iki 48 valandų, gali prailgėti dvigubai ar net penkiagubai, jei yra

Toksikologija ir pašaliniai reiškiniai:

 Priklausomybė: Jei vartojama didesnės dozės ilgesnį laikotarpį, išsivysto psichinė ir fizinė

priklausomybė, kuri pasireiškia absitencijos simptomais kaip nerimas, ažitacija, nemiga, įtampa ir kartais traukuliais. Kuo trumpesnis BZD pusperiodis, tuo greičiau išsivysto priklausomybė [23]. Priklausomybės reiškinys yra labai dažnas, o šios būklės diagnozė yra dažnai nenustatoma [24].

 Anterogradinė amnezija, mieguistumas, ataksija, dezorientacija [23]

 Imunotoksiškumas: 2017 metais publikuotas tyrimas atsikleidė, kad ilgalaikis diazepamo

vartojimas sukelia limfocitų DNR oksidacinio tipo žalą [25].

 Sąveika su kitomis vaistinėmis medžiagomis: Stiprėja poveikis vartojant kartu su kitomis

CNS slopinančiomis medžiagomis, pvz., vartojant su alkoholiu, opioidais, TCA, antihistamininiais preparatais, ar kitais hipnotikais gali pasireikšti stipri sedacija, kuri gali privesti prie nelaimingo atsitikimo ar sunkaus kvėpavimo slopinimo [26]. Šiuo metu vis labiau populiarėja jonažolės vartojimas depresijos simptomams gydyti, o pacientai, kurie serga depresija ar kenčia nuo jos epizodų, dažnai šalia antidepresantų vartoja benzodiazepinus, 2014 metais Vokietijoje buvo atliktas tyrimas, kuriuo buvo įrodyta, kad jonažolės preparatai, ypač ekstraktas, įtakoja diazepamo farmakokinetiką, nes skatina nordazepamo ir temazpeamo susidarymą [27].

 Agresija: Yra duomenų, kad diazepamas gali pacientui sukelti agresyvų, kompulsinį elgesį

[2,28]

 Priešnuodis: flumazenilis – stabdo CNS slopinantį poveikį, tačiau neveikia prislopinto

kvėpavimo [29]

1.4. Diazepamo metabolizmas

Diazepamas yra biotransformuojamas kepenyse, kur susidaro nordazepamas N-dealkilinimo būdu arba temazepamas hidroksilinimo būdu, o pastarieji gali būti verčiami į oksazepamą, kuris vėliau konjungacijos būdu sujungiamas su gliukurono rūgštimi ir pašalinamas per inkstus – žr. pav. 3. Nordazepamas yra pagrindinis metabolitas aptinkmas kraujyje, o šlapime randama visų trijų metabolitų: nordazepamo, temazepamo ir oksazepamo [30]. Visi trys metabolitai pasižymi farmakologiniu aktyvumu, taip pat, iš jų yra gaminami vaistai pvz., nozepam (oksazepamas) Lietuvoje [31], calmday (nordazepamas) Belgijoje [32] ar signopam (temazepamas) Lenkijoje [33].

Pav. 3. Diazepamo metabolizmas. Šaltinis:[13].

Nordazepamo eliminacijos pusperiodis yra apie 100 valandų, būtent šis junginys labiausiai sąlygoja ilgą diazepamo poveikį. Temazepamo pusperiodis yra vos 10 valandų, ir tai yra puikus pavyzdys, kuris parodo kaip stipriai gali pasikeisti junginio farmakokinetinės savybės atsiradus vienai hidroksilo grupei [34]. Oksazepamo eliminacijos pusperiodis yra maždaug 8 valandos [35].

1.5.1. Bioanalizės įvadas

Bioanalizė – tai cheminė analizė medžiagų, esančių biologiniuose mėginiuose. Atliėkant šio tipo analizę tiriamosios medžiagos koncentracija dažniausiai yra labai maža (ng/ml), be to, vaistinė medžiaga būna tarp įvairių endogeninių junginių, kurie natūraliai randasi biologinėje terpėje, todėl atliekant bioanalizę labai svarbus yra mėginio paruošimas bei ypač jautrios instrumentinės analizės pritaikymas. Pagrindinės sritys, kuriose atliekama farmacinių medžiagų bioanalizė yra farmacinių preparatų vystymas, kuriame atliekamas tiriamojo vaistinio preparato metabolitų identifikavimas. Atliekami farmakokinetikos tyrimai nustatinėjant specifinius ADME procesus, metabolizmo bei šalinimo greitį ar sudarant vaistinio preparato koncentracijos kraujyje priklausomybės nuo laiko kreives, taip pat atliekami toksikokinetikos tyrimai, kuriuose vertinamas toksiškumas.

Terapinis vaisto monitoringas yra sekanti sritis, kurioje yra taikoma bioanalizė tiriant vaistinius preparatus. Dažniausiai tiriamos kraujo koncentracijos su tikslu optimizuoti efektyvumą bei sumažinti nepageidaujamų reakcijų riziką. TVM rekomenduojamas dviem atvejais;

1. Vaistams, kurie skiriami profilaktikai, siekiant išvengti atitinkamos būklės (pvz., depresijos ar manijos epizodai, traukuliai, astmos atkryčiai, organo atmetimas ar širdies aritmija).

2. Siekiant išvengti toksiškumo skiriant mažo terapinio indekso vaistus (pvz., vaistai nuo epilepsijos, antidepresantai, digoksinas, teofilinas, ciklosporinas, ŽIV proteazės inhibitoriai, aminoglikozidų klasės antibiotikai) [36].

Šiuo metu į rinką patenka vis daugiau biopanašiųjų kategorijai priskiriamų biologinių vaistų [37], todėl ir TVM jiems tampa vis labiau aktualesnis gydant tokias ligas kaip psoriazė, išsėtinė sklerozė ar reumatoidinis artritas [38].

Bioanalizė labai svarbi atliekant dopingo kontrolę, čia tiriami kraujo ir šlapimo mėginiai, analizę atlieka laboratorijos, kurias akredituoja Pasaulinė antidopingo agentūra (angl. WADA).

Bioanalizė sudaro teismo toksikologijos pagrindą, kur tiriamos įvairios biologinės terpės siekiant aptikti narkotikus, nuodus ar vaistus, kuriais piktnaudžiaujama. Čia analitė yra nežinoma, todėl, mėginiui pirmiausiai atliekama skriningo analizė, o gavus teigiamą rezultatą atliekama patvirtinanti analizė kitu metodu. Dėl rimtų teisinių pasėkmių atliekant teismo ekspertizę, didelis dėmesys yra skiriamas bioanalitinio metodo kokybei bei patikimumui [36].

Tobulėjant instrumentams, taip pat atsiranda ir naujų problemų, pvz., matricos sukeltas jono užslopinimas analizės metu, todėl buvo sukurtos atskiros gairės, skirtos bioanalitinio metodo validacijai, kurias FDA išleido 2001 metais, tuo tarpu EMA – 2011 metais. Šiose gairėse nurodomas papildomas vertinimas tokių parametrų kaip mėginio stabilumas, matricos efektas ar mėginio užnešimas [39]. ICH šiuo metu taip pat ruošia gaires bioanaltinio metodo validacijai (M10), kurios bus priskirtos prie multidisciplininių gairių [40].

1.5.2. Pagrindiniai diazepamo bioanalizės metodai

Esminiai skirtumai ruošiant skirtingų biologinių terpių mėginius yra: baltymų šalinimas kraujo mėginių, fermentinė hidrolizė šlapimo mėginių bei buferinė inkubacija plaukų mėginių atvejais [10]. Mėginio paruošimas tiek kraujo, tiek šlapimo terpių yra panašus, dažniausiai taikoma skystis-skystis ekstrakcija (LLE) ir kietafzė ekstrakcija (SPE). Skystis-skystis ekstrakcijoje naudojami populiariausi tirpikliai yra butilo acetatas, chlorbutanas, chloroformas bei dietilo eteris. Taip pat, atliekama mėginių

derivatizacija atliekant GC-MS analizę, dėl derivatizacijos padidėja jautrumas bei terminis benzodiazepinų stabilumas, o smailės tampa siauresnės, nes ženkliai sumažėja smailių uodegėlių susidarymas (angl. peak

tailing). Populiariausi derivatizatoriai benzodiazepinų bioanalizei yra MSTFA, BSTFA, TMCS, MTBSTFA

ir TBDMS. Dažniauiai naudojami vidiniai standartai yra deuterizuoti benzodiazepinų analogai. Pagrindiniai analizės metodai yra GC-MS ir skysčių chromatografija (LC) su UV, DAD ar MS/MS detektoriais, iš kurių, auksiniu standartu išlieka GC-MS dėl savo atskyrimo efektyvumo, žemesnių kaštų, be to, metodas yra atsparesnis matricos efektams nei LC-/MS/MS [10,41].

1.5.3. Kraujo mėginiai, jų savybės ir diazepamo nustatymo metodai

Kraujas yra suspensija sudaryta iš eritrocitų, leukocitų, trombocitų, kraujo baltymų ir plazmos. Tiriant kraujo mėgnius, labai svarbu detalizuoti, koks tiksliai kraujo mėginys yra tiriamas, ar tai yra klinikoje paimtas kraujas laikantis sterilių sąlygų, ar tai yra kraujo mėginys paimtas autopsijos metu, kur jis būna hemolizuotas ar sukrešėjęs iki tam tikros ribos, tai sukelia netolygų medžiagos pasisskirstymą, šis reiškinys vadinamas pomirtiniu persiskirstymu, vadinasi, rezultatai gauti iš tokių mėginių gali ženkliai skirtis [42,43]. Teismo toksikologijoje kraujas yra vienas iš pagrindinių mėginių tipų, nes gautus rezultatus galima lyginti su didele duomenų baze, kur yra nustatyta tvirta koreliacija tarp koncentracijos ir terapinio, toksinio ar letalaus efekto [44]. Pagrindinis trūkumas tiriant kraujo mėginius yra tas, kad reikia prieš tai pašalinti kraujo plazmos baltymus. Baltymai gali būti šalinami filtravimo, cetrifugavimo būdu, ar pridedant riebalų rūgščių, kurios konkurencinu būdu atskiria benzodiazepinus nuo kraujo plazmos baltymų receptorių [10].

Su kiekviena nauja karta masių spektrometrų jautrumas tampa vis didesnis [45], todėl atsiranda galimybė efektyviai analizuoti naujo tipo biologinius mėginius, pvz., džiovintus kraujo lašus (DBS), šio tipo mėginio privalumas yra tas, kad išdžiovintą kraują lengviau transportuoti, nereikalingos ypatingos transportavimo sąlygos, supaprastėja logistika, sumažėja išlaidų kaštai. Buvo sukurtas ir validuotas GC-EI-MS metodas diazepamo bioanalizei išdžiovintuose kraujo lašuose, metodas pasižymi geru linijiškumu (r2=0.9983), aptikimo ribos (LOD) yra tarp 0,5-1 μg/ml, kiekybinio nustatymo riba (LOQ) - 1μg/ml [46]. Šiuo metu aktyviai vystoma aplinkos jonizacijos masių spektrometrija (AIMS), su kuria galima tiesiogiai analizuoti medžiagas, esančias biologinėse matricose [47]. Neseniai publikuotas sukurtas ir validuotas spartus kiekybinis kraujo ir plazmos lašų bioanalizės dengto ašmens išpurškimo-masių spektrometrijos (CBS-MS/MS) metodas, kurio diazepmo kiekybinio nustatymo riba (LOQ) yra 2,5 ng/mL, žemutinės koncentracijos variacijos koeficientas neviršijo 20%, o analizei užtenka vos 10 μL mėginio, mėginys plokštelėje, kambario temperatūroje išlieka stabilus 7 dienas, o užšaldytas – mažiausiai 30 dienų [48].

1.5.4. Šlapimo mėginiai, jų savybės ir diazepamo nustatymo metodai

Tai yra gelsvas, skaidrus, sterilus skystis, kurio sudėtis gali labai skirtis, priklausomai nuo to, kas yra valgoma, geriama, ar vartojama. Šlapimo pH yra maždaug 6, bet gali būti tarp 4, 6 ir 8 [42]. Šlapimas yra vienas dažniausiai naudojamų mėginių tipų teismo toksikologijoje, nes daugumos vaistų ar narkotinių medžiagų bei jų metabolitų kiekybinio nustatymo ribos yra didelės, be to, šių medžiagų aptikimo periodas yra ilgesnis šlapime nei kraujyje, taip pat galima analizuoti tiesiogiai, taikant DAS (angl. dilute and shoot) mėginio paruošimą [49]. Pagrindiniai trūkumai: nėra koreliacijos tarp medžiagos koncentracijos šlapime ir kraujyje, atliekant pomirtinius lavonų tyrimus šlapimo dažniausiai nebūna [44]. Benzodiazepinų nustatymui taikoma fermentinė hidrolizė, nes atliekant cheminę hidrolizę, benzodiazepinai hidrolizuojasi į kitą junginių klasę – benzofenonus. Mėginio paruošimui naudojamas fermentas gliukuronidazė, išgaunamas iš vynuoginės sraigės (Helix pomatia), Echerichia Coli (E.Coli) ar galvijų kepenų [10,34]. Buvo atliktas tyrimas, kurime nustatyta, kad gliukuronidazė, išgauta iš E.Coli bei vynuoginės sraigės, gali redukuoti oksazepamą į nordazepamą šlapimo mėginiuose, todėl vertinant rezultatus, ypač nordazepamo koncentraciją, reikia atsižvelgti į tai, ar buvo atliekama fermentinė hidrolizė [50]. Atsižvelgiant į naujoviškus mėginio paruošimo metodus, kaip džiovinti kraujo lašai, Vokietijoj taip pat buvo išvystytas ir sėkmingai validuotas sausų šlapimo taškų mėginio paršuosimas, skirtas LC-MS/MS skriningo analizei, diazepamo aptikimo riba – 20 ng/mL [51].

1.6. Elektroninė ir cheminė jonizacija

Elektroninė jonizacija yra dažniausiai naudojamo tipo jonizacija taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS) metodą. Jos metu analitę bombarduoja elektronai vakuume, chromatografijos-masių spektrometre, elektronus skleidžia renio ar volframo siūlelis, o įprastinė elektros srovė yra 70 elektronvoltų (eV), dėl didelės energijos vyksta intensyvi fragmentacija, o susidarę molekuliniai jonai yra visada teigiami ir dažniausiai nestabilūs. Elektroninės jonizacijos privalumai: dėl plačios fragmentacijos, masių spektras gali suteikti daugiau informacijos apie tiriamosios medžiagos struktūrą, tai gali būti naudinga vykdant farmacinį vystymą, kuriant naują vaistinę medžiagą, be to, elektroninės joizacijos masių spektrai mažai kinta prie 70 eV, todėl yra sudarytos didelės elektroninės jonizacijos masių spektrų duomenų bazės, kur galima patikimai palyginti gautus duomenis [52].

Cheminė jonizacija gali būti teigiamo ir neigiamo jono. Cheminės jonizacijos metu į jonų šaltinį papildomai yra leidžiamas dujinis reagentas, dažniausiai tai yra metano dujos, tačiau, gali būti naudojamas ir izobutanas ar amoniakas. Dujinio reagento kiekis būna žymiai didesnis (apie 1000-10000 kartų) nei analitės, to pasekoje, skleidžiami elektronai atsimuša ne į pačią analitę, o į metano dujas, ir jas jonizuoja, o susidarę dujinio reagento jonai jonizuoja analitę, šiuo būdu perduodama energija yra žymiai mažesnė (< 10eV), todėl fragmentacija junginio bus švelni, nes nėra energetinio pertekliaus, kuris susidaro elektroninės jonizacijos metu, be to, jonai yra stabilūs, todėl signalas irgi bus intensyvus. Junginiai, kurie turi elektroneigiamų atomų, pvz., diazepamas, temazepamas, oksazepamas ar nordazepamas, gali sudaryti didelį kiekį neigiamų jonų, todėl neigiamo jono cheminė jonizacija gali būti labai jautri ir specifiška analizuojant šiuos junginius [53].

1.7. Tyrime nagrinėtos dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS)

metodo charakteristikos

Pagal Europos Vaistų Agentūros rekomendacijas, kai bioanalitiniame metode yra naudojamas masių spektrometro detektorius, tai turėtų būti naudojamas vidinio standarto izotopas, pvz., deuterizuoti junginiai.

Specifiškumas. Tai yra metodo gebėjimas nustatyti tam tikrą medžiagą, išvengiant trikdžių bei

rezultato iškraipymo, kuriuos gali sukelti priemaišos, skilimo produktai ar matricoje esantys komponentai, pvz., kraujo plazmos baltymai. Įtvirtinant chromatografinį metodą, specifiškumo įrodymui reiktų pateikti chromatogramą, kurioje matytųsi pilnas tiriamųjų junginių atskyrimas, metodo specifiškumo užtvirtinimui galima pateikti papildomo analitinio metodo rezultatus pvz., masių spektrą, kurie patvirtintų junginių tapatybę.

Glaudumas. Glaudumas parodo, kaip tirtų junginių rezultatai, tirti apibrėžtomis sąlygomis, skiriasi

tarpusavyje, tai yra analitinio rezultato atsitiktinių klaidų matas. Glaudumas, kaip pakartojamumas, tikrinamas atliekant kartotinius tam tikros koncentracijos mėginių serijos matavimus, pvz., tiriant 7 mėginius po 1000 ng/ml. Glaudumas išreiškiamas per standartinį nuokrypį (SD) ir santykinį standartinį nuokrypį (RSD). Bioanalitinio metodo nuokrypiai dėl matricos įtakos būna didesni nei grynoms medžiagoms tirti taikomo metodo: žemutinės koncentrancijos didžiausias leidžiamas nuokrypis gali būti iki 20%, o kitų koncentracijų – 15%, tuo tarpu farmacinio preparato analizei rekomenduojama ≤1% riba. Aukšto lygio laboratorijose SD ir RSD yra maži, o prastesnėse – didesni.

Tiesiškumas. Tai yra metodo gebėjimas matavimo diapazone turėti atsako signalą, kuris būtų

būti atidėti mažiausiai 5 skirtingos koncentracijos taškai. Grafiškai X ašyje atidedama analitės koncentracija, o Y ašyje atidedamas instrumentinis atsakas, statistinė analizė atliekama su specifine duomenų apdorojimo programa, kurioje bus nubrėžta regresijos kreivė ir paskaičiuoti jos parametrai. Vertinant tiesiškumą reiktų pateikti regresijos lygtį ir koreliacijos koeficientą. Kuo daugiau devynetų seka po nulio vertinant koreliacijos koeficientą, tuo geresnis metodo tiesiškumas.

Aptikimo ir kiekybinio vertinimo ribos. Įteisinant metodą svarbu žinoti žemiausias ribas analitei

aptikti ar jai kiekybiškai nustatyti su pakankamu patikimumu. Aptikimo ribas galima nustatyti keliais metodais: vizualaus vertinimo, remiantis signalo-triukšmo santykiu ir remiantis standartiniu nuokrypiu. Signalo-triukšmo santykio atveju naudojami mažos, žinomos koncentracijos mėginiai, aptikimo ribos nustatymui taikomas 3:1 santykis, o kiekybinio vertinimo ribos nustatymui 10:1. Panašiai nustatomos ribos ir standartinio nuokrypio atveju, praleidžiama pvz., 10 nulinių mėginių ir išmatuojamas gauto signalo standartinis nuokrypis, tada padauginama iš 3.3, kiekybinio vertinimo ribos nustatymui standartinis nuokrypis yra padauginamas iš 10.

Teisingumas. Tai yra tikslumo parametras, kuris parodo ryšį tarp nustatytos ir tikrosios vertės.

Analitinio rezultato teisingumas gali būti jautrus įvairių sąlygų pokyčiams (analitės kiekis medžiagoje, matrica, ekstrahavimas, temperatūra ir kt.). Vertinant teisingumą rekomenduojama atlikti analizę su mažiausiai 9 mėginiais – trijų koncentracijų po tris replikas. Teisingumo vertinimo rezultatai gali būti pateikiami kaip apskaičiuota matavimo paklaida (angl. Bias) arba aptinkamoji dalis (angl. Recovery) išreikšta procentais.

Matricos efektai. Viena iš pagrindinių problemų, kurią gali sukelti matricoje esantys įvairūs

junginiai yra analitės jonų slopinimas, todėl validuojant bioanalitinį metodą svarbu įvertinti matricos efektus. Matricos efektų vertinimui sudaromos kalibracinės kreivės esant analitėms matricoje (biologinėje terpėje) ir be (vandenyje), ir vertinamas jų koreliacijos koeficientas, kuris negali viršyti 15% [54 ,55, 56].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo organizavimas

Tyrimo planą suskirstėmė į etapus:

1. Gautas LSMU bioetikos centro sutikimas.

2. Sudaryta trišalė sutartis papildomai praktikai tarp magistranto, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ir Valstybinės teismo medicinos tarnybos, per LSMU karjeros centrą.

3. Mėginių ruošimas taikant fermentinę hidrolizę, skystis-skystis ekstrakciją ir derivatizaciją. 4. Atliekamas identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas diazepamo, oksazepamo, nordazepamo, temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS).

5. Atliekamas identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas diazepamo, oksazepamo, nordazepamo, temazepamo dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu su elektronine jonizacija (GC-EI-MS).

6. Analizės rezultatų palyginimas.

2.2. Tyrimo objektas ir reagentai

Tyrimui buvo naudotas žmogaus šlapimas su pridėtais diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo standartiniais tirpalais, vidiniai standartai: deuterizuoti analogai – diazepamas-D5, oksazepamas-D5 ir klonazepamas-D4,kurių koncentracija mėginiuose buvo 200 ng/ml. Standartai gauti iš Lipomed (Arlezhaimas, Šveicarija). Derivatizatorius N-tert-butildimetilsilil-n-metiltrifluoracetamidas (MTBSTFA), metanolis (MeOH), n-butilacetatas, kalio fosforo rūgštis (H3PO4), kalio hidroksidas (KOH),

kalio-vandenilio fosfatas (K2HPO4) gauti iš Merck KgaA (Darmštatas, Vokietija), fermentas β

2.3. Įranga

Termoblokas Grant QBD4 (Grant Instruments, Jungtinė Karalystė), centrifuga Sigma 3-16L (Sigma, Vokietija), AGILENT TECHNOLOGIES-7890A (FOLSOM, JAV) dujų chromatografas sujungtas su 5975C NCI-MS detektoriumi ir Shimadzu GCMS-QP2010nc Ultra system (Shimadzu, Duisburgas, Vokietija) dujų chromatografas su masių spektrometrijos detektoriumi. Junginių struktūrų vizualizavimui buvo taikyta programa Chemicalize (ChemAxon,Vengrija)

2.4. Tyrimo metodai

Tyrimas atliktas panaudojant šiuos metodus:

1. Dujų chromatografiją-masių spektrometriją su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) 2. Dujų chromatografiją-masių spektrometriją su elektronine jonizacija (GC-EI-MS)

2.5. Mėginių paruošimas

Visi mėginiai buvo ruošiami VTMT Toksikologijos laboratorijos bazėje. Atlikta šlapimo mėginių fermentinė hidrolizė, naudojant β -gliukuronidazę iš E.Coli. Į mėgintuvėlį pridėta 0,5 ml šlapimo, tada pridėtas fosfatinis buferis (50 μl, pH 6.8) ir 25 μl β-gliukuronidazės. Mėgintuvėlis gerai užkimštas ir suplaktas, tada mėginys buvo perkeliamas į termobloką, kuriame yra laikytas apie 4 valandas, prie 37 ± 2 °C temperatūros, vėliau mėginys buvo ataušintas.

Po fermentinės hidrolizės buvo atliekama skystis-skystis ekstrakcija. Į mėgintuvėlį pridėta 0,2 ml mėginio mišinio, 0,1 ml kalio fosfatinio buferio (pH 9.2), 0,3 ml ekstrakcinio mišinio, sudaryto iš 200 ng/ml oksazepamo-D5, klonazepamo-D4 ir diazepamo-D5 n-butilacetate. Eksktrahuota kelias minutes, tada buvo atliktas centrifugavimas 5 minutes.

Po centrifugavimo buvo atlikta derivatizacija. 50 μl organinės fazės perkelta į chromatografinius buteliukus, pridėta po 10 μl derivatizatoriaus (MTBSTFA) ir išlaikyta termobloke pusvalandį 90 ± 2 °C temperatūroje. Po atvėsinimo mėginiai buvo paruošti chromatografinei analizei.

2.6. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo kokybinis ir kiekybinis

nustatymas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su chemine jonizacija

(GC-NICI-MS) metodu

Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo kiekybinei bioanalizei GC-NICI-MS metodu išskyrimui naudota DB-5-HT kapiliarinė kolonėlė (30 m ilgio, 0.320 mm vidinio diametro, 0.10 μm stacionariosios fazės plėvelės storio), kolonėlės temperatūra – 180 °C, dujinis nešiklis – helis (GC-MS grynumo, 99.9996%), dujinio nešiklio greitis – 3 ml/min, injekuotas mėginio tūris – 1 μl, buvo taikytas

splitless režimas, injektoriaus temperatūra – 250 °C [59]. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas

pateiktas 4 lentelėje.

NICI režimui naudotas dujinis reagentas – metanas (GC-MS grynumo, 99,9995 %). Analizė atlikta taikant selektyvaus jono monitoringo režimą (SIM). Analizės trukmė – 4.9 min.

4 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas

Temperatūros kėlimo

greitis (°C) Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)

- 180 (°C) 1.00

40 (°C)/min. 380 (°C) 1.00

Nustačius dujų chromatografo-masių spektrometro parametrus, buvo injekuotas diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo mišinio etanolinis tirpalas. Gauta GC-MS chromatograma, kurioje smailių sulaikymo trukmės ir masės – krūvio santykiai sutapo su etaloninių diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo trukmėmis ir masės – krūvio santykiais. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo koncentracija šlapime apskaičiuota pritaikius vidinio standarto kalibracijos metodą.

2.7. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo kokybinis ir kiekybinis

nustatymas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija

(GC-EI-MS) metodu

Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo kokybinė ir kiekybinė bioanalizė atlikta GC-EI-MS metodu. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo išskyrimui naudota Rxi-5ms kapiliarinė kolonėlė (30 m ilgio, 0.25 mm vidinio diametro, 0.25 μm stacionariosios fazės plėvelės storio),

kolonėlės temperatūra – 180 °C, dujinis nešiklis – helis, dujinio nešiklio greitis – 2 ml/min, injekuotas mėginio tūris - 1 μl, buvo taikytas splitless režimas, injektoriaus temperatūra – 260 °C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas pateiktas 5 lentelėje. Analizė atlikta taikant selektyvaus jono monitoringo režimą (SIM). Analizės trukmė – 17 min.

5 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas

Temperatūros kėlimo greitis

(°C) Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)

- 180 (°C) 1.00

17,5 (°C)/min. 320 (°C) 2.00

Nustačius dujų chromatografo-masių spektrometro parametrus, buvo injekuotas diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo mišinio etanolinis tirpalas. Gauta GC-MS chromatograma, kurioje smailių sulaikymo trukmės ir masės – krūvio santykiai sutapo su etaloninių diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo trukmėmis ir santykiais. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo koncentracija šlapime tirta pritaikius vidinio standarto kalibracijos metodą.

2.1 Statistinės analizės metodai

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo

specifiškumas

Analizė atlikta su 1000 ng/ml kontroliniu mėginiu, pilna jonų chromatograma (TIC) pateikta 4 pav., diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo jonų chromatogramos - 5 pav.

5 pav. Diazepamo nordazepamo, oksazepamo temazepamo pasirinktų jonų

chromatogramos

Pateiktoje chromatogramoje žymios interferencijos nesimato,o tiriamieji junginiai vienas nuo kito atsiskiria (diazepamo sulaikymo laikas – 2.044 min., nordazepamo sulaikymo laikas – 2.107 min., oksazepamo sulaikymo laikas – 2.473 min., temazepamo sulaikymo laikas – 2.572 min.).

Pateiktose pasirinktų jonų chromatogramose matosi, kad kiekvienos medžiagos, tiek pagrindinis jonas, tiek būdingi junginiui jonai turi specifinę smailę chromatogramoje (diazepamo pagrindinis jonas 284, specifiniai jonai - 286 ir 285; oksazepamo pagrindinis jonas - 268, būdingi jonai - 270, 269; temazepamo pagrindinis jonas - 414, būdingi jonai - 282, 416; nordazepamo pagrindinis jonas - 234, būdingi jonai - 384, 386). Taip pat buvo įvertinti tiriamųjų junginių NICI masių spektrai (ŽR. pav. 6.).

6 pav. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo NICI masių spektrai

Buvo nustatyti jonų masių ir krūvių santykiai, kurie padeda dar tiksliau identifikuoti diazepamą, nordazepamą, oksazepamą ir temazepamą. Diazepamo, oksazepamo masių spektre matyti švelnios jonizacijos fragmentacija, kuri yra būdinga taikant cheminės jonizacijos režimą, temazepamo ir nordazepamo matosi charakteringa Smith R.M. aprašyta fragmentacija, būdinga benzodiazepinui, kuris turi vieną chloro atomą molekulėje [57].

Apibendrinant, dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodas yra specifiškas.

3.2. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo specifiškumas

Analizė atlikta su 1000 ng/ml kontroliniu mėginiu, pilna jonų chromatograma (TIC) pateikta 7 pav., diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo masių spektrai - 8 pav.

7 pav. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo chromatograma

Pateiktoje chromatogramoje matyti, kad visi keturi tiriamieji junginiai atsiskiria, diazepamo sulakymo laikas – 10.45 min, nordazepamo sulaikymo laikas – 10.78 min., temazepamo sulaikymo laikas – 13.68 min., oksazepamo sulaikymo laikas – 14.32 min. Paskutinio sulaikyto junginio iš tirtų sulaikymo laikas yra 14.32 min. (oksazepamas), tuo tarpu chromatogramoje su neigiamo jono chemine jonizacija, paskutinio sulaikyto junginio (temazepamo) sulaikymo laikas yra 2.57 min., taigi, analizė taikant dujų chromatografija masių spektrometrija su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) yra gerokai spartesnė nustatinėjant diazepamą, oksazepamą, nordazepamą ir temazepamą.

8 pav. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazpamo masių spektrai

Diazepamas

Nordazepamas

Oksazepamas

Temazepamas

Tam, kad būtų dar tikslesnis diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo nustatymas, buvo nustatyti šių junginių masės ir krūvio santykiai, užrašyti elektroninės jonizacijos masių spektrai.

250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 0 25 50 75 100 % 283 357 258 329 376 514 464 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 0 25 50 75 100% ₃₂₇ 256 284 302 359 376 513 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 0 25 50 75 100% ₄₅₇ 514 327 376 302 357 256 283 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 0 25 50 75 100% ₃₅₇ 283 256 329 302 378 464 514

Diazepamo jonai – 283, 258, 256, nordazepamo jonai – 327, 328, 329, oksazepamo jonai – 457, 513, 514, temazepamo jonai – 357, 359. Masių spektruose matosi platesnė junginių fragmentacija, smailių aukštis, lyginant su cheminės jonizacijos masių spektro smailėmis – žemesnis, taip pat, taikant elektroninę jonizaciją, pavyko aptikti tik du temazepamo jonus.

Apibendrinant, dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodas yra specifiškas, nes pavyko sėkmingai nustatyti visus keturis junginius tiek chromatografiškai, tiek pagal jų masių spektrus, tačiau specifiškumas didesnis buvo taikant dujų chromatografiją-masių spektrometriją su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS).

3.3. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo

glaudumas

Glaudumo, kaip pakartojamumo, įvertinimui buvo atlikta analizė su 1000 ng/ml koncentracijos 7 kontroliniais mėginiais. Duomenys pateikti 6 lentelėje.

6 lentelė. Diazepamo, oksazepamo, temazepamo, nordazepamo atsikartojamumo

koncentracijos, standartinis nuokrypis (SD), vidurkis (x

_{̅ ), santykinis standartinis}

nuokrypis (RSD)

Diazepamas Oksazepamas Temazepamas Nordazepamas

N1 (ng/ml) 941 969 993 993 N2 (ng/ml) 1003 964 982 1045 N3 (ng/ml) 1006 963 997 1027 N4 (ng/ml) 946 955 990 1058 N5 (ng/ml) 960 962 986 994 N6 (ng/ml) 969 966 1007 1040 N7 (ng/ml) 955 966 1007 1002 SD (ng/ml) 26.18 4.43 9.74 26.44 x̅ (ng/ml) 968.57 963.57 994.57 1022.71 RSD (%) 2.7 0.45 0.97 2.58

Santykinis standartinis nuokrypis apskaičiuotas taikant formulę:

Diazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo mažiausias tarp visų tirtų analičių, rezultatai išidėstė tarp 941-1006 ng/ml. Tai atitinka rezultatų glaudumui keliamus reikalavimus, nes RSD neviršija 15%. Priežastis tokių rezultatų galėtų būti atsitiktinės klaidos, kurias gali sukelti tiek personalas, tiek įranga, atsitiktines klaidas galima sumažinti, bet neįmanoma pašalinti.

Oksazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo didžiausias iš visų tirtų junginių, rezultatai svyravo 955-969 ng/ml ribose. Tikėtina, kad tokius rezultatus sąlygojo sisteminės klaidos, nes nei vieno tirto mėginio nustatymo rezultatas nepasiekė 1000 ng koncentracijos. Sistemines klaidas gali sukelti tiek personalas, tiek įranga.

Temazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo šiek tiek mažesnis nei nustatant oksazepamą, nustatymo rezultatai svyravo ribose tarp 982-1007 ng/ml. Koncentracijos skirtumai tarp mėginių galimai yra dėl atsitiktinių klaidų, nes rezultatų yra < 1000 ng/ml ir >1000 ng/ml.

Nordazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo mažesnis nei temazepamo, bet didesnis nei diazepamo. Rezultatai išsidėstę tarp 993-1045 ng/ml. Rezultatų tarpusavio skirtumą galima būtų paaiškinti atsitiktinėmis klaidomis, kaip ir temazepamo atveju [58].

Apibendrinant, dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodas užtikrina pakankamai gerą rezultatų glaudumą, kaip pakartojamumą, ir atitinka Europos Vaistų Agentūros keliamus reikalavimus bioanalitiniam metodui.

3.4. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo glaudumas

Glaudumo, kaip pakartojamumo, vertinimui buvo atlikta analogiška analizė su 1000 ng/ml koncentracijos 7 kontroliniais mėginiais. Duomenys pateikti 7 lentelėje.

7 lentelė. Diazepamo, oksazepamo, temazepamo, nordazepamo atsikartojamumo

koncentracijos, standartinis nuokrypis (SD), vidurkis (x

_{̅ ), santykinis standartinis}

nuokrypis (RSD)

Diazepamas Oksazepamas Temazepamas Nordazepamas

N2 (ng/ml) 754 905 918 922 N3 (ng/ml) 1034 1002 867 1113 N4 (ng/ml) 831 1024 1134 1059 N5 (ng/ml) 918 1061 968 1083 N6 (ng/ml) 1056 956 968 1096 N7 (ng/ml) 1028 944 965 1097 SD (ng/ml) 120.09 75.52 95.31 68.62 x̅ (ng/ml) 921.71 1002.57 951.57 1070.4 RSD (%) 13.05 7.5 10.01 6.41

Diazepamo nustatymo rezultatai kito plačiausiose ribose, lyginant su kitomis analitėmis. Jie išsidėsė ribose tarp 831-1056 ng/ml, RSD vos atitiko leidžiamas ribas, klaidos - atsitiktinės, kadangi rezultatų buvo ir <1000 ir >1000 ng/ml.

Oksazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo didesnis nei diazepmo ir temazepamo, bet mažesnis nei nordazepamo. Rezultatai išsidėstė ribose 905-1126 ng/ml, leidžiamas paklaidų ribas atitiko, klaidos – atsitiktinės.

Temazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo didesnis nei diazepamo, bet mažesnis nei oksazepamo ir nordazepamo. Rezultatų nustatymo ribos – 841-1134 ng/ml, RSD atitiko reikalavimus, klaidos – atsitiktinės.

Nordazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo didžiausias iš visų tirtų junginių, rezultatai svyravo ribose 922-1123 ng/ml, klaidos – atsitiktinės.

Apibendrinant, dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodas užtikrina pakankamą tirtų analičių rezultatų pakartojamumą (glaudumą) ir atitinka Europos Vaistų Agentūros keliamus reikalavimus bioanalitiniam metodui.

3.5. Glaudumo palyginimas tarp metodų su skirtinga jonizacija

Abu šiame darbe tyrimams naudoti metodai atitiko Europos Vaistų Agentūros keliamas reikalavimus bioanalitiniam metodui vertinant glaudumą. 1000 ng/ml koncentracijos nustatymo maksimalus RSD yra 15%, tačiau VTMT Toksikologijos laboratorijoje dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu gautiems rezultatams leidžiama didžiausia paklaida yra 10%, todėl GC-EI-MS metodas, jau negalėtų būti taikomas teismo toksikologijoje, nustatinėjant diazepamą ar temazepamą, tačiau,

dar galima būtų nustatinėti oksazepamą ar nordazepamą, kadangi pastarųjų nustatymo rezultatų RSD buvo <10%.

Tiek GC-NICI-MS, tiek GC-EI-MS bioanalizės atveju mažiausias rezultatų glaudumas buvo gautas nustatinėjant diazepamą. Oksazepamo nustatymo rezultatų glaudumas buvo didžiausias taikant GC-NICI-MS, o nordazepamo – GC-EI-MS. Taikant GC-NICI-MS metodą SD ir RSD yra mažesni tiriant diazepamą, oksazepamą, temazepamą, nordazepamą, nei GC-EI-MS analizės atveju, todėl galima teigti, jog GC-NICI-MS metodas užtikrina geresnį rezultatų glaudumą t.y. jų pakartojamumą. Apibendrinantys duomenys pateikti 8 lentelėje.

8 lentelė. SD ir RSD metodų su skirtinga jonizacija palyginimas

GC-NICI-MS (SD,RSD) GC-EI-MS (SD,RSD)

Diazepamas 26.18 ng/ml / 2.7% 120.09 ng/ml / 13.05%

Oksazepamas 4.43 ng/ml / 0.45% 75.52 ng/ml / 7.5%

Temazepamas 9.74 ng/ml / 0.97% 95.31 ng/ml / 10.01%

Nordazepamas 26.44 ng/ml / 2.58% 68.62 ng/ml 6.41%

3.6. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo

tiesiškumas

Metodo tiesiškumui įvertinti buvo paruošti mėginiai su šiomis žinomomis koncentracijomis: 100 ng/ml, 200 ng/ml, 500 ng/ml, 750 ng/ml, 1000 ng/ml, 1500 ng/ml ir 2000 ng/ml ir sudarytos kalibracinės kreivės. X ašyje buvo atidėta analitės koncentracija C, o Y ašyje atidėtas instrumentinis atsakas į analites. Gautos kalibracinės kreivės pateiktos 9pav., kalibracinių kreivių parametrai apibendrinti 9 lentelėje.

9 pav. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo kalibracinės kreivės

9 lentelė. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo temazepamo koreliacijos koeficientas

(r2) ir regresijos linijos lygtis

Junginiai Koreliacijos koeficientas (r2₎ Regresijos linijos lygtis Diazepamas 0.997 Y=46.16x – 8362 Nordazepamas 0.999 Y=41.49x – 6714 Oksazepamas 0.998 Y=368x - 68153 Temazepamas 0.998 Y=56.71x - 10553

Visų keturių junginių Y(0) pakliūna į intervalą apie nulį, kas rodo matricinių efektų nebuvimą, o koreliacijos koeficientai yra artimi vienetui, kas rodo stiprią koreliaciją tarp kintamųjų. Todėl galima teigti, kad yra tiesinė priklausomybė tarp atsako signalo ir analitės koncentracijos ir dujų chromatografijos-masių

spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodu galima tiksliai nustatyti diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo koncentracijas šlapime koncentracijų diapazone nuo 100 iki 2000 ng/ml.

3.7. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo tiesiškumas

Metodo tiesiškumui įvertinti buvo paruošti mėginiai su šiomis žinomomis koncentracijomis: 100 ng/ml, 200 ng/ml, 500 ng/ml, 750 ng/ml, 1000 ng/ml, 1500 ng/ml ir 2000 ng/ml, sudarytos kalibracinės kreivės. X ašyje buvo atidėta analitės koncentracija C, o Y ašyje atidėtas instrumentinis atsakas į analites. Gautos kalibracinės kreivės pateiktos 10 pav., duomenys apibendrinti 10 lentelėje.

10 lentelė. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo temazepamo koreliacijos koeficientas

(r2) ir regresijos linijos lygtis

Junginiai Koreliacijos koeficientas (r2₎ Regresijos linijos lygtis Diazepamas 0.98 Y=2.570x – 946.1 Nordazepamas 0.991 Y=27.52x - 3309 Oksazepamas 0.986 Y=9.963x - 1433 Temazepamas 0.99 Y=4.015x – 274.9

Tiriant diazepamą GC-EI-MS metodu, instrumentinis atsakas buvo gautas mažiausiai diazepamo koncentracijai 500 ng/ml. Diazepamo regresijos kreivė eina toli nuo nulinio taško, kas rodo stiprius matricinius efektus. Didžiausias koreliacijos koeficientas tarp kintamųjų gautas atliekant nordazepamo kalibravimą. Metode su elektronine jonizacija junginių koreliacijos koeficientas yra arti vieneto, todėl galima teigti, kad su šiuo metodu galima tiksliai nustatyti diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo koncentracijas, tačiau metodo su elektronine jonizacija koreliacijos koeficientas yra žemesnis nei metodo su neigiamo jono chemine jonizacija, vadinasi, GC-NICI-MS metodas turi geresnius tiesiškumo parametrus nei GC-EI-MS ir su juo kiekybinė analizė bus tikslesnė.

3.8. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo aptikimo ir

kiekybinio nustatymo ribos

Ribų nustatymui buvo taikytas metodas atsižvelgiant į signalo-triukšmo santykį (S/N). Aptikimo ribos nustatytos 3:1 santykiu, o kiekybinio vertinio ribos taikant 10:1 santykį. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo signalo-triukšmo santykiai pateikti 11 lentelėje.

11. Lentelė. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo, temazepamo signalo-triukšmo

santykis

Pagal gautus duomenis, tirtų junginių aptikimo bei kiekybinio vertinimo ribos pateikos 12 lentelėje.

12. Diazepamo, nordazepamo, oksazepamo ir temazepamo aptikimo (LOD) ir kiekybinio

nustatymo (LOQ) ribos

Junginiai Aptikimo ribos (LOD)

(ng/ml)

Kiekybinio nustatymo ribos (LOQ) (ng/ml)

Diazepamas 489 1630

Nordazepamas 49.41 164.7

Oksazepamas 25.38 84.6

Temazepamas 12.9 43

Tirtų junginių tiek aptikimo, tiek kiekybinio vertinimo ribos ganėtinai skirtingos, ypatingai aukštos gavosi diazepamo aptikimo bei kiekybinio vertinimo ribos, tai rodo, kad dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su elektronine jonizacija (GC-EI-MS) metodo patikimumas kiekybiškai nustatinėjant diazepamo žemas (100-1500 ng/ml) koncentracijas nėra patikimas, nes patikimumas atsiranda tik nuo 1630 ng/ml, tuo tarpu kiti tirti junginiai gali būti nustatinėjami 100-1500 ng/ml ribose.

3.9. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo

aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos

Analičių aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribų nustatymui buvo taikytas standartinio nuokrypio apskaičiavimo metodas tiriant 11 nulinių mėginių. Gauti rezultatai apibendrinti 13 lentelėje.

13. Lentelė. Diazepamo, oksazepamo, temazepamo, nordazepamo mėginių koncentracijos,

vidurkis, standartinis nuokrypis (SD), aptikimo (LOD) ir kiekybinio nustatymo ribos

(LOQ)

ng/ml

Matavimo Nr. Diazepamas Oksazepamas Temazepamas Nordazepamas

1 0.98 0.72 0.9 1.04 2 0.76 0.75 0.96 1.18 3 8.86 6.97 8.04 5.71 4 2.24 1.93 2.17 1.39 5 1.14 1.36 1.33 0.95 6 0.94 0.88 1.05 0.8 7 1.02 1.32 1.17 1.59 8 1.25 1.41 1.39 1.58 9 2.16 1.05 1.43 1.26 10 0.71 0.8 1.01 0.79 11 1.39 0.98 0.95 0.21 Vidurkis 1.95 1.651 1.854 1.5 SD 2.24 1.8 2.08 1.45 Aptikimo riba 7.4 5.94 6.8 4.8 Kiek.nust.rib. 22.4 18 20.8 14.5

Visų tirtų jungnių tiek aptikimo ribos, tiek kiekybinio nustatymo ribos yra žemesnės nei metodo su elektronine jonizacija, be to, jos nėra taip skirtingai išsidėsčiusios, kaip elektroninės jonizacijos atveju, todėl galima teigti, kad dujų chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija

(GC-NICI-MS) metodo jautrumas tiriant diazepamą, oksazepamą, nordazepamą ir temazepamą yra didesnis ir patikimesnis nei taikant metodą su elektronine jonizacija, nes gali būti aptiktos ir nustatytos žymiai mažesnės analičių koncentracijos.

3.10. Diazepamo, oksazepamo, nordazepamo ir temazepamo dujų

chromatografijos-masių spektrometrijos su neigiamo jono chemine jonizacija (GC-NICI-MS) metodo

teisingumas

Teisingumo, kaip aptinkamosios dalies, vertinimo analizei buvo paruošta 12 mėginių: 500 ng/ml x 4, 1000 ng/ml x 4 ir 2000 ng/ml x 4. Gauti rezultatai apibendrinti 14 lentelėje.

14 lentelė. Diazepamo, oksazepamo, temazepamo, nordazepamo teisingumo vertinimo

duomenys

Teisingumas kaip aptinkamoji dalis, Glaudumas (500 ng/ml)

Matavimo nr. Diazepamas Oksazepamas Temazepamas Nordazepamas

1 475 474 492 510 2 451 462 476 428 3 479 472 490 458 4 467 476 498 514 Vidurkis 468 471 489 477.5 SD 12.38 6.21 9.3 41.7 Teisingumas (%) 93.6 94.2 97.8 95.5 Glaudumas (%) 2.64 1.32 1.9 8.73 1000 ng/ml

Matavimo nr. Diazepamas Oksazepamas Temazepamas Nordazepamas

1 941 973 988 883

2 961 972 1009 1034