FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
AUŠRINĖ SAKALAUSKAITĖ
DIHIDROKVERCETINO
TIEKIMO Į ODĄ SISTEMŲ
BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Vitalis Briedis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
DIHIDROKVERCETINO TIEKIMO Į ODĄ SISTEMŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Vitalis Briedis Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Aušrinė Sakalauskaitė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Odos pažeidimų priežastys ir jų prevencija ... 11
1.2. Dihidrokvercetinas ... 12
1.2.1. Paplitimas ... 12
1.2.2. Struktūra ir antioksidacinis aktyvumas ... 12
1.2.3. Dihidrokvercetino poveikis odoje ... 14
1.3. Veikliųjų medžiagų skvarba į odą ir skvarbą įtakojantys faktoriai ... 15
1.4. Geliai ... 17
1.5. Mikroemulsijos ... 17
1.6. Cheminių skvarbos skatintojų apžvalga ... 18
2. METODIKA ... 22
2.1. Tyrimo objektas ... 22
2.2. Medžiagos ir įranga ... 22
2.2.1. Medžiagos ... 22
2.2.2. Įranga ... 23
2.3. Dihidrokvercetino kiekybinio nustatymo metodika ... 23
2.4. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto ... 23
2.5. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumo vertinimas ... 24
2.6. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumo vertinimas ... 24
2.7. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu gamyba ... 24
2.7.2. Mikroemulsijų gamybos metodika ... 25
2.8. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas ... 26
2.8.1. Eksperimentinių formuluočių fizikinių savybių nustatymas ... 26
2.8.2. Eksperimentinių mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas ... 27
2.8.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš eksperimentinių gelių in vitro tyrimai ... 27
2.9. Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą tyrimai ex vivo ... 27
2.10. Statistinė duomenų analizė ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Dihidrokvercetino ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija ... 29
3.2. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto ... 31
3.3. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumas ... 33
3.4. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumas ... 33
3.5. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas ... 35
3.5.1. Gelių fizikinės savybės ... 35
3.5.2. Mikroemulsijų fizikinės savybės ir termodinaminis stabilumas ... 36
3.5.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in vitro ... 37
3.6. Dihidrokvercetino skvarba į žmogaus odą tyrimuose ex vivo ... 41
3.6.1. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš eksperimentinio gelio ... 41
3.6.2. Cheminių skvarbos skatintojų ir raginio sluoksnio įtaka dihidrokvercetino skvarbai į odą .. 42
3.6.3. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš mikroemulsijų ... 49
3.6.4. Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatų apibendrinimas ... 50
IŠVADOS ... 52
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 53
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 54
TYRIMŲ REZULTATŲ SKLAIDA ... 61
SANTRAUKA
DIHIDROKVERCETINO TIEKIMO Į ODĄ SISTEMŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS A. Sakalauskaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. V. Briedis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas - įvertinti dihidrokvercetino ir jo tiekimo į odą sistemų biofarmacines charakteristikas. Darbo uždaviniai: pritaikyti ir įteisinti analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą; pagaminti eksperimentines dihidrokvercetino formuluotes – gelius ir mikroemulsijas – bei įvertinti jų kokybę; ištirti dihidrokvercetino skvarbą iš eksperimentinių formuluočių į žmogaus odą ex vivo; įvertinti skvarbos skatintojų įtaką dihidrokvercetino skvarbai į žmogaus odos sluoksnius.
Metodai. Dihidrokvercetino kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti naudotas validuotas ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš gelių tyrimai in vitro atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes. Dihidrokvercetino skvarbos iš eksperimentinių formuluočių į žmogaus odą ex vivo tyrimai atlikti naudojant modifikuotas Bronaugh tipo pratakias difuzines celes.
Rezultatai. Atpalaiduotas dihidrokvercetino kiekis iš gelių formuluočių in vitro buvo nuo 0,75 mg/cm2 (26,62 proc.) iki 2,17 mg/cm2 (76,66 proc.). Dihidrokvercetino atpalaidavimui iš gelių įtakos turėjo gelifikuojančios medžiagos karbomero 980 koncentracija bei skvarbą skatinančios medžiagos. Iš 1 proc. karbomero gelių formuluočių į žmogaus odos epidermį įsiskverbė nuo 0,9882 ± 0,1854 µg/mg iki 3,2074 ± 0,2392 µg/mg, o į dermą – nuo 0,0028 ± 0,007 µg/mg iki 0,0242 ± 0,0066 µg/mg dihidrokvercetino. Pušies ir eglės spyglių eteriniai aliejai statistiškai reikšmingai (p < 0,05) pagerino dihidrokvercetino skvarbą į odos sluoksnius. Nustatyti eglės ir pušies spyglių eterinių aliejų skatinamieji santykiai į epidermį – 2,68 ir 1,86, o į dermą – 7,49 ir 3,05. Dietilenglikolio monoetilo eteris bei PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai nepagerino dihidrokvercetino skvarbos. Iš 5:1, 6:1 bei 7:1 surfaktanto ir kosurfaktanto (S:KoS) santykių mikroemulsijų į epidermį įsiskverbė nuo 0,0762 ± 0,0087 µg/mg iki 0,0906 ± 0,0166 µg/mg dihidrokvercetino. Dermos sluoksnyje bei akceptorinėje terpėje aptiktas dihidrokvercetinas buvo žemiau kiekybinio nustatymo ribos. S:KoS santykis bei dinaminė klampa neturėjo reikšmingos įtakos dihidrokvercetino skvarbai iš mikroemulsijų (p > 0,05).
Išvados. In vitro atpalaidavimo tyrimų rezultatai patvirtino sumodeliuotų gelių tinkamumą dihidrokvercetino tiekimui į odą. Skvarbos ex vivo tyrimų rezultatai parodė, kad dihidrokvercetino skvarba į žmogaus odą iš gelių buvo nuo 10 iki 35 kartų efektyvesnė nei iš mikroemulsijų (p < 0,05). Veiksmingiausias skvarbos skatintojas buvo eglės spyglių eterinis aliejus (p < 0,05).
SUMMARY
BIOPHARMACEUTICAL EVALUATION OF DIHYDROQUERCETIN TOPICAL DELIVERY SYSTEMS
A. Sakalauskaitė Master thesis/ scientific supervisor prof. dr. V. Briedis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim: to evaluate biopharmaceutical characteristics of dihydroquercetin topical delivery systems. Tasks: to develop and validate ultra-high performance liquid chromatography method; to prepare experimental dihydroquercetin formulations – gels and microemulsions – and evaluate their quality; to assess dihydroquercetin penetration from experimental formulations into human skin ex vivo; to evaluate the influence of penetration enhancers on dihydroquercetin penetration into human skin layers.
Methods. Validated ultra-high performance liquid chromatography method was used for identification and quantification of dihydroquercetin. In vitro release studies were performed using modified Franz type diffusion cells. Dihydroquercetin skin penetration experiments ex vivo were carried out using full-thickness human skin in modified Bronaugh type flow-through diffusion cells.
Results. Dihydroquercetin release from gel formulations in vitro ranged from 0.75 mg/cm2 (26.62 proc.) to 2.17 mg/cm2 (76.66 proc.). Dihydroquercetin release was influenced by the concentration of carbomer 980 and the presence of chemical penetration enhancers. Dihydroquercetin amounts penetrated from 1% dihydroquercetin gels ranged from 0.9882 ± 0.1854 µg/mg to 3.2074 ± 0.2392 µg/mg in epidermis and from 0.0028 ± 0.007 µg/mg to 0.0242 ± 0.0066 µg/mg in dermis. Pine needle oil and spruce needle oil enhanced dihydroquercetin penetration into skin layers at statistically significant level (p<0.05). Enhancing ratios for spruce needle oil and pine needle oil were determined: epidermis – 2.68 and 1.86, dermis – 7.49 and 3.05, respectively. Diethylene glycol monoethyl ether and PEG-8 caprylic/capric glycerides were not effective as penetration enhancers. Dihydroquercetin amounts detected in epidermis from 5:1, 6:1 and 7:1 surfactant and cosurfactant ratios (S:CoS) microemulsions (MEs) ranged from 0.0762 ± 0.0087 µg/mg to 0.0906 ± 0.0166 µg/mg. Dihydroquercetin was identified both in dermis and acceptor medium below the limit of quantification. S:CoS ratios and dynamic viscosity did not demonstrated significant influence on dihydroquercetin penetration from MEs.
Conclusions. In vitro release studies confirmed the suitability of gel formulations for topical delivery of dihydroquercetin. Results demonstrated that dihydroquercetin penetration into human skin was more effective from gels compared to microemulsions (p<0.05). Spruce needle oil was the most effective penetration enhancer (p<0.05).
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, pagalbą ir patarimus rengiant mokslinį darbą nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui, Klinikinės farmacijos katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui.
Už pagalbą bei patarimus atliekant mokslinius tyrimus nuoširdžiai dėkoju Klinikinės farmacijos katedros doktorantui Vyčiui Čižinauskui, lekt. dr. Modestui Žiliui ir visam katedros kolektyvui.
SANTRUMPOS
A/V – aliejus vandenyje
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
DMPD – N,N-dimetil-p-fenilendiaminas DHK – dihidrokvercetinas
DEGEE – dietilenglikolio monoetilo eteris EA – eterinis aliejus
LOD – kokybinio nustatymo riba LOQ – kiekybinio nustatymo riba
LogP – n-oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficientas SN – bazinės linijos triukšmas
S:KoS – surfaktanto ir kosurfaktanto santykis ME – mikroemulsija
MeOH - metanolis
PDI – polidispersiškumo indeksas
PEG-8 KG – PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai P6I – poligliceril-6-izostereatas
SS – skatinamasis santykis
UESC – ultra-efektyvioji skysčių chromatografija UV – ultravioletinė spinduliuotė
ĮVADAS
Žmogaus oda yra išorinis organas, saugantis organizmą nuo įvairių aplinkos faktorių. Vienas iš pagrindinių faktorių, sukeliančių odos pažeidimus, yra saulės ultravioletinė (UV) spinduliuotė. Intensyvus UV spinduliuotės poveikis skatina oksidacinio streso procesus odoje, todėl didina odos uždegimo, pigmentacijos ar odos vėžio riziką [1]. Siekiant apsisaugoti nuo oksidacinio streso sukeltų odos pažeidimų, aktuali veiksmingų apsauginių priemonių paieška. Tyrėjai didelį dėmesį skiria veiksmingų natūralių antioksidantų paieškai [1,2].
Dihidrokvercetinas yra augalinės kilmės junginys, flavonoidas. In vitro bei in vivo mokslinių tyrimų rezultatai patvirtina dihidrokvercetino antioksidacinį, priešuždegiminį, odos regeneraciją skatinantį, odos pigmentaciją slopinantį poveikį [3–6]. Dihidrokvercetinas galėtų būti pritaikytas UV spinduliuotės sukeltų odos pažeidimų prevencijai, todėl aktualu sumodeliuoti dihidrokvercetino tiekimo į odą sistemas.
Veikliųjų medžiagų, tarp jų ir dihidrokvercetino, skvarba į odą yra ribota dėl odos barjerinių savybių. Odos paviršiuje esantis raginis sluoksnis (stratum corneum) yra pagrindinis barjeras, trukdantis medžiagoms patekti į gilesnius odos audinius bei sisteminę kraujotaką. Raginio sluoksnio barjerines savybes lemia sudėtinga korneocitų bei lipidų matricos struktūra. Veikliosios medžiagos skvarba į odą priklauso ne tik nuo jos fizikinių-cheminių savybių, tačiau ir nuo formuluočių savybių [7], todėl yra svarbu tinkamai jas sumodeliuoti. Siekiant pagerinti veikliosios medžiagos skvarbą pro raginį sluoksnį, kuriami įvairūs skvarbos skatinimo metodai. Vienas iš plačiausiai taikomų skatinimo metodų yra cheminiai skvarbos skatintojai [8]. Šie junginiai, įterpti į formuluotes, gali padidinti veikliosios medžiagos tirpumą raginio sluoksnio lipiduose ar keisti lipidų matricos struktūrą, taip pagerindami medžiagos skvarbą. Veiksmingų skvarbos skatintojų paieška yra aktuali modeliuojant vietinio ar sisteminio poveikio preparatus.
Tyrimams atlikti pasirinktas skvarbos į žmogaus odą ex vivo biofarmacinis modelis. Remiantis skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatais, galima parinkti veikliajai medžiagai tinkamiausią formuluotę ir jos sudėtį, įvertinti skvarbą skatinančių medžiagų poveikį bei prognozuoti suformuoto preparato poveikį in vivo sąlygomis [9]. Publikuotų mokslinių tyrimų duomenų apie dihidrokvercetino skvarbą į žmogaus odą ex vivo nebuvo aptikta. Šio darbo tikslas buvo įvertinti dihidrokvercetino ir jo tiekimo į odą sistemų biofarmacines charakteristikas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti dihidrokvercetino ir jo tiekimo į odą sistemų biofarmacines charakteristikas. Darbo uždaviniai:
1. Pritaikyti ir įteisinti analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą;
2. Pagaminti eksperimentines dihidrokvercetino formuluotes – gelius ir mikroemulsijas – bei įvertinti jų kokybę;
3. Ištirti dihidrokvercetino skvarbą iš eksperimentinių formuluočių į žmogaus odą ex vivo; 4. Įvertinti skvarbos skatintojų įtaką dihidrokvercetino skvarbai į žmogaus odos sluoksnius.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Odos pažeidimų priežastys ir jų prevencija
Dėl didelio paviršiaus ploto ir lengvo prieinamumo oda gali būti pažeidžiama įvairių išorinių faktorių. Vienas iš pagrindinių faktorių, sukeliančių odos pažeidimus, yra saulės ultravioletinė (UV) spinduliuotė [2,10]. UV spinduliuotė, kuri pasiekia žemės paviršių, yra sudaryta iš maždaug 95 proc. UVA (320–400 nm) ir 5 proc. UVB (290–320 nm) spindulių. Apie 70 proc. UVB spinduliuotės yra absorbuojama raginiame sluoksnyje, 20 proc. gyvybingame epidermyje, o 10 proc. paveikia dermos sluoksnį [11]. Tuo tarpu UVA efektyviau paveikia gilesnį odos dermos sluoksnį [11]. UV spinduliuotė gali pažeisti odą tiesiogiai veikdama ląstelių DNR struktūrą, skatindama laisvųjų radikalų susidarymą ir uždegiminius procesus odoje [2]. Laisvųjų radikalų susidarymą skatina ir kiti išoriniai faktoriai, tokie kaip karštis, rūkymas, tarša [12,13].
Laisvieji radikalai - tai reaktyvūs cheminiai junginiai, turintys nesuporuotą vieną ar kelis elektronus [14]. Laisvieji radikalai skirstomi į reaktyvias deguonies formas (superoksido anijono radikalas, hidroksilo radikalas, vandenilio peroksidas, singletinis deguonis) bei reaktyvias azoto formas (azoto oksido radikalas, azoto dioksido radikalas, peroksinitrito anijonas). Žmogaus oda turi endogeninę apsauginę sistemą, sudarytą iš fermentinių ir nefermentinių antioksidantų [15]. Kai laisvųjų radikalų susidarymas tampa itin intensyvus, endogeninė antioksidacinė sistema nepajėgia jų neutralizuoti ir pasireiškia oksidacinis stresas. Manoma, kad oksidacinis stresas yra vienas iš odos ligų patogenezės faktorių.Oksidacinis stresas gali skatinti odos senėjimo, pigmentacijos, eritemos bei vėžio vystymasį [1,15,16]. Odos antioksidacinės sistemos gebėjimas apsisaugoti nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio mažėja senstant organizmui, todėl aktualu naudoti papildomas apsaugines priemones [1].
Viena iš galimų strategijų siekiant užkirsti kelią odos pažeidimų vystymuisi yra antioksidantų vartojimas. Antioksidantai – tai medžiagos, kurios neutralizuoja laisvuosius radikalus, sudarydamos stabilius netoksiškus junginius. Padidėjęs tyrėjų susidomėjimas natūralios kilmės antioksidantais [1,2,17]. Plačiai išnagrinėtas resveratrolio, silimarino, propolio, kvercetino ar kitų natūralių antioksidantų poveikis odos pažeidimų prevencijai [2,17,18]. Vykdoma naujų veiksmingų antioksidantų paieška. In vitro bei in vivo mokslinių tyrimų rezultatai patvirtina augalinės kilmės junginio - flavonoido dihidrokvercetino antioksidacines savybes bei priešuždegiminį, odos pigmentaciją slopinantį, odos regeneraciją skatinantį poveikį [3,6,19].
1.2. Dihidrokvercetinas
1.2.1. Paplitimas
Dihidrokvercetinas (DHK), mokslinėje literatūroje dar vadinamas taksifolinu, yra flavonoidų grupei priklausantis junginys, dihidroflavonolis. Augalai, kurių cheminėje sudėtyje aptinkamas DHK, yra šie: pajūrinė pušis (Pinus pinaster), sibirinis maumedis (Larix sibirica), daūrinis maumedis (Larix gmelini), didžioji pocūgė (Pseudotsuga menziesi) [19–21]. Nedideliais kiekiais DHK kaupiamas tikrąjame margainyje (Silybum marianum) ir yra sudėtinė silimarino komplekso dalis [19]. Pastaraisiais metais šis junginys nustatytas ir vynuogių, greipfrutų, apelsinų, svogūnų cheminėje sudėtyje [22].
1.2.2.
Struktūra ir antioksidacinis aktyvumas
Dihidrokvercetino (DHK) molekulė turi flavonoidų cheminę struktūrą. Struktūra sudaryta iš benzeno žiedo A, kondensuoto su šešianariu žiedu C, kuris 2-oje padėtyje turi prijungtą fenilo grupę B. 3, 5, 7, 3’, 4’ padėtyse yra prijungtos hidroksilo grupės, 4 padėtyje - keto grupė (1 paveikslas).
1 Pav. struktūrinė dihidrokvercetino formulė [23]
Flavonoidų antioksidacinis poveikis priklauso nuo molekulinės struktūros ir hidroksilo grupių išsidėstymo [24]. Yra išskirti trys pagrindiniai struktūriniai kriterijai, kurie lemia antioksidacinį flavonoidų poveikį [19,23,25,26]:
2. 2,3-dvigubasis ryšys C žiede;
3. hidroksilo grupės 5-oje ir 7-oje padėtyse bei keto grupė 4-oje padėtyje.
DHK atitinka 1-ąjį ir 3-ąjį kriterijus. Tai patvirtina galimas DHK antioksidacines savybes [19,25– 27]. Svarbiausias struktūrinis fragmentas, lemiantis DHK antioksidacines savybes, yra B žiedas su 3‘ ir 4‘ hidroksilo grupėmis (katecholo grupė), tuo tarpu A žiede esančios 7 ir 5 hidroksilo grupės yra mažiau reikšmingos [25,26,28]. Antioksidacinis poveikis pagrįstas vandenilio atomo perdavimo ar elektrono perdavimo reakcijomis laisvąjam radikalui. Įvykus reakcijai, DHK neutralizuoja radikalą ir sudaromas stabilus junginys [26,29].
DHK antioksidacinį aktyvumą pagrindžia in vitro tyrimų duomenys. 2015 m. atliktas DHK ir standartinių antioksidantų antiradikalinio aktyvumo tyrimas [14]. Nustatyta, kad DHK sumažina lipidų peroksidaciją efektyviau nei α-tokoferolis. DMPD•+, ABTS•+, O2•-, ir DPPH• radikalų inaktyvavimo metodais nustatytos efektyvios DHK koncentracijos (EC50): 231,04µg/ml, 0,834 µg/ml, 9,91 µg/ml, 77µg/ml [14]. Tyrimai patvirtino, kad DHK suriša ABTS•+ ir O2•- radikalus efektyviau nei antioksidantai α-tokoferolis, troloksas, butilhidroksianizolis, butilhidroksitoluenas. DPPH• inaktyvavimo metodu nustatyta, kad DHK yra stipresnis antioksidantas nei butilhidroksianizolis ir butilhidroksitoluenas. 2013 m. atliktas palyginamasis silimarino komplekso bei atskirų jo komponentų antiradikalinio poveikio tyrimas. Nustatyta, kad DHK yra du kartus efektyvesnis antioksidantas nei pats silimarino kompleksas [30]. Įdomu tai, kad silimarine aptinkama tik apie 3,5 proc. dihidrokvercetino, tačiau dėl stiprių antioksidacinių savybių jis gali įtakoti didžiąją dalį silimarino antioksidacinio poveikio[30]. Janeiro ir kt. nustatė, kad DHK antioksidacinį aktyvumą keičia aplinkos pH. Antioksidacinio poveikio maksimumas pasiekiamas neutralioje terpėje, o rūgštinėje ir šarminėje aplinkoje sumažėja [23].
Vykdoma DHK farmakologinių poveikių paieška. Ištirtas DHK poveikis hemolizei bei trombocitų agregacijai. In vitro AAPH• radikalo sukelta žmogaus eritrocitų hemolizė sumažėjo nuo 63,5±3,9 proc. iki 32,5±5,6 proc [31]. Kostyuk ir kt. atlikti tyrimai patvirtino, kad DHK slopina mažo tankio lipoproteinų oksidaciją žmogaus kraujo serume in vitro [32]. 2015 m. atlikti tyrimai in vitro ir in vivo patvirtino, kad DHK slopina angiotenzino-II kardiomiocitų hipertrofiją, sumažina oksidacinį stresą bei laisvųjų radikalų susidarymą, todėl mažina širdies hipertrofijos riziką [33]. Sun ir kt. nustatė, kad in vivo ir in vitro DHK sumažina diabetinės kardiomiopatijos riziką slopindamas oksidacinį stresą bei ląstelių apoptozę [34]. In vitro ir in vivo tyrimai patvirtina, kad DHK mažina lipidų peroksidacijos procesus kepenų ląstelėse [35,36]. In vitro ir in vivo tyrimai prognozuoja DHK, kaip stipraus antioksidanto, pritaikymo galimybes.
1.2.3. Dihidrokvercetino poveikis odoje
Publikuoti tyrimai suteikia pirminius duomenis apie DHK taikymo perspektyvas odos ligų gydyme. In vitro ląstelių kultūrose atlikti tyrimai patvirtino, kad DHK slopina α-melanocitus stimuliuojančiojo hormono (α-MSH) veikimą, todėl slopina melanogenezės procesą ir veikia taip pat efektyviai kaip antipigmentacinis preparatas arbutinas [4]. Atlikus tyrimus su B16F10 ląstelių linijomis, nustatyta, kad DHK konkurenciškai didino tirozinazės koncentraciją ir tiesiogiai inhibavo tirozinazės katalizuojamą l-dihidroksifenilalanino (L-DOPA) oksidacijos reakciją [4]. Nustatytas DHK antiuždegiminis poveikis in vitro bei in vivo. Tyrimai su HaCaT ląstelių (imortalizuotų keratinocitų) linija parodė, kad DHK mažina imunoglobulino ICAM-1 ekspresiją. ICAM-1 yra atsakingas už odos epidermio sluoksnyje vykstančius uždegiminius procesus. Taip pat nustatyta, kad DHK slopina interferono-γ (IFN-γ) sukeltą ICAM-1 ekspresiją žmogaus odos epidermio modelyje (EpiDerm®). Autoriai teigia, kad priešuždegiminis poveikis pasireiškia dėl Jurkat T-ląstelių adhezijos slopinimo [5]. 2014 m. atliktas in vivo tyrimas su NC/Nga pelėmis, kurioms buvo sukeltos atopinio dermatito žaizdos. Nustatyta, kad vietiškai paskirtas DHK glikozidas slopino pagrindinius atopinio dermatito patogenezės faktorius: Th2-citokinus ir imunoglobuliną E (IgE), taip pat nustatytas vizualinis žaizdų būklės pagerėjimas [6]. Tyrimai in vivo patvirtina DHK odos regeneraciją skatinančias savybes. Shubina ir kt., Naumov ir kt. nustatė, kad liposominiai DHK ar DHK-metalo (geležies, vario) komplekso preparatai skatina greitesnį cheminių ir terminių odos pažeidimų gijimą [3,37–39]. Atlikus histologinius tyrimus, paaiškėjo, kad nudegusios žiurkių odos srityje pilnai regeneravosi epitelinis sluoksnis, dermos srityje – plaukų folikulai ir riebalų liaukos, odos morfologija buvo panaši į nepažeistos odos [3,37]. Nustatyta, kad liposominiai DHK preparatai stabilizuoja endogeninę antioksidacinę sistemą, mažina uždegimą ir skatina proliferacinius procesus epidermyje[38,39].
Nustatyta, kad DHK mažina kologenazės MPP1 aktyvumą in vitro efektyviau nei retinoidinė rūgštis, todėl galėtų būti taikomas UV spinduliuotės skatinamo odos senėjimo prevencijai [40]. Atlikus tyrimus su B16F10 ląstelių linija, nustatyta, kad DHK sąveikavo su epiderminio augimo faktoriaus receptoriais (EAFR) ir fosfoinozitido-3-kinazėmis (PI3K), mažino kinazinį aktyvumą, todėl slopino UV sukeltą odos karcinogenezę [20].
DHK galėtų būti taikomas odos pažeidimų prevencijai ne tik dėl antioksidacinių, tačiau ir dėl priešuždegiminių, odos pigmentaciją slopinančių, odos regeneraciją skatinančių savybių. Todėl aktualu tęsti tyrimus, siekiant ištirti DHK poveikio odoje mechanizmus bei taikinius. Šiuo metu dar trūksta tyrimų duomenų, kurie leistų spręsti apie DHK poveikį žmogaus odoje. Tačiau tam, kad DHK galėtų veikti odoje,
pirmiausiai turi pasiekti veikimo vietą. Veikliųjų medžiagų, tarp jų ir DHK, skvarba į odą yra ribota dėl odos barjerinių savybių bei kitų fiziologinių ir fizikinių-cheminių faktorių.
1.3. Veik
liųjų medžiagų skvarba į odą ir skvarbą įtakojantys faktoriai
Odos paviršiuje esantis raginis sluoksnis (stratum corneum) yra pagrindinis barjeras, ženkliai ribojantis veikliųjų medžiagų patekimą į odą [41,42]. Siekiant suprasti veikliųjų medžiagų molekulių skvarbą į odą, skvarbą skatinančių medžiagų poveikį bei teisingai interpretuoti DHK skvarbos tyrimų rezultatus, yra svarbu išnagrinėti žmogaus odos raginio sluoksnio struktūrą.
Raginis sluoksnis yra plonas, 10 - 20 µm storio hidrofobinis audinys, sudarytas iš negyvųjų ląstelių korneocitų bei lipidų ir baltymų. Korneocitai yra užpildyti vandeniu ir keratinu, o jų apvalkalas sudarytas iš kryžmiškai sujungtų baltymų filagrino, lorikrino ir involukrino [43,44]. Kiekvienas korneocitas tarpusavyje jungiasi baltyminėmis struktūromis – desmosomomis [45]. Lipidų matrica sudaryta iš ilgų grandinių keramidų, cholesterolio, cholesterolio sulfato, laisvųjų riebalų rūgščių, sterolio ir vaško esterių [46,47]. Lipidai raginiame sluoksnyje yra išsidėstę bisluoksniais. Paprastai korneocitų ir lipidų išsidėstymas yra apibūdinamas ,,plytų ir cemento“ modeliu. Remiantis šiuo modeliu, korneocitai yra sluoksniais išsidėsčiusios plytos, o lipidai – tai cementas, apjungiantis korneocitus. Yra keletas teorijų, apibūdinančių lipidų struktūrą raginiame sluoksnyje. Nustatyta, kad raginio sluoksnio lipidai gali egzistuoti trimis skirtingomis fazėmis, priklausomai nuo temperatūros bei raginio sluoksnio gylio (2 paveikslas) [48].
2 pav. Raginio sluoksnio lipidų fazės tipai [48]
(pagal Marie-Alexandrine Bolzinger, Stéphanie Briançon, Jocelyne Pelletier, Yves Chevalier) Eksperimentinių tyrimų metu nustatyta, kad didinant temperatūrą nuo 32 iki 90 °C, lipidai išsidėsto sekančiai: orto-rombinė fazė (gelis) šešiakampė fazė (gelis) skystų lipidų fazė [49]. In vivo sąlygomis žmogaus odos paviršiaus temperatūra yra 32 °C, todėl turėtų dominuoti orto-rombinė fazė. Tačiau
mokslininkai siūlo skirtingus struktūrinius modelius. Swartzenduber teigia, kad lipidai yra išsidėstę ,,sumuštinio“ principu, centre esant skystam kristaliniam sluoksniui, kuris apsuptas dviejų orto-rombinių kristalinių gelio fazių. Tuo tarpu Norlen teorija nusako, kad lipidai yra išsidėstę vientisa šešiakampe gelio faze [48].Tačiau vieningos išvados dėl raginio sluoksnio lipidų struktūros šiuo metu nėra. Dėl sudėtingos struktūros bei į gelį panašios konsistencijos, raginis sluoksnis skiriasi nuo kitų biologinių membranų ir riboja visų medžiagų patekimą į odą. Po raginiu sluoksniu toliau yra išsidėstęs hidrofilinis gyvybingas epidermis, o po šiuo sluoksniu – hidrofilinė derma [46]. Epidermis ir derma dėl savo sandaros ir savybių taip pat gali riboti medžiagų skvarbą.
Galimi veikliosios medžiagos patekimo per raginį sluoksnį keliai: intraląstelinis, tarpląstelinis bei odos intarpai (plaukų folikulai, prakaito liaukos) [47,48,50]. Manoma, kad hidrofilinės medžiagos skverbiasi intraląsteliniu keliu (per raginio sluoksnio korneocitus), tuo tarpu hidrofobinės medžiagos – tarpląsteliniu keliu (per lipidų matricą) [46]. Tačiau atsižvelgiant į raginio sluoksnio ,,plytų ir cemento“ struktūrą, hidrofilinės medžiagos, difunduodamos iš vieno korneocito į kitą, turi pereiti ir tarp korneocitų išsidėsčiusią lipidų matricą. Dėl šios priežasties hidrofilinių medžiagų skvarba į odą yra labai ribota. Lipofilinės medžiagos tirpsta raginio sluoksnio lipiduose, todėl turėtų efektyviau pereiti odos barjerą [51]. Tačiau lipofilinių medžiagų skvarba į gilesnius odos audinius (epidermį ir dermą) yra ribota dėl šių audinių hidrofiliškumo [48,51]. Todėl galima teigti, kad ne tik raginis sluoksnis, bet ir gilesni odos audiniai sudaro barjerą vaistinių medžiagų skvarbai. Šiuo metu manoma, kad pagrindinis veikliųjų medžiagų patekimo į raginį sluoksnį kelias yra lipidų matrica [46].
Nors raginis sluoksnis yra heterogeninė, sudėtingos sandaros membrana, literatūroje pateikiami supaprastinti matematiniai modeliai, apibūdinantys skvarbos į odą procesą [52,53]. Remiantis šiais modeliais, medžiagos skvarba priklauso nuo [53]:
• koncentracijos (C);
• pasiskirstymo koeficiento (K); • difuzijos koeficiento (D);
• difuzijos kelio/raginio sluoksnio storio (h).
Veikliosios medžiagos skvarba į odą priklauso nuo jos fizikinių-cheminių savybių. Teigiama, kad skvarbai į odą ideali molekulė turi pasižymėti maža molekuline mase (<500 Da), vidutiniu lipofiliškumu (logP = 1 – 3), pakankamu tirpumu riebaluose ir vandenyje, sąlyginai mažu tirpumu nešiklyje, žema lydymosi temperatūra [43,52,54]. Molekulės, kurių logP reikšmė yra 1 – 3 intervale, yra tirpios lipidų matricoje, tačiau tuo pačiu yra ir pakankamai hidrofiliškos, todėl gali difunduoti į raginio sluoksnio korneocitus bei pereiti į gilesnius hidrofilinius odos audinius. Nuo molekulinės masės priklauso difuzijos
greitis, kuris lėtėja, didėjant molekulinei masei [52]. Tik maža dalis veikliųjų medžiagų molekulių atitinka šiuos reikalavimus [51]. Labai svarbios ir odos savybės. Pavyzdžiui, odos pralaidumas medžiagoms ženkliai padidėja, padidėjus vandens kiekiui odoje ar tam tikrų odos ligų atveju [52]. Taip pat svarbi odos lokalizacija, amžius, temperatūra, paviršiaus plotas, kontakto su preparatu laikas, hidratacijos laipsnis [43,47,55].
Šiuo metu nėra publikuotų DHK skvarbos į žmogaus odą tyrimų ex vivo rezultatų. Prognozuoti apie DHK skvarbą galima pagal fizikines-chemines savybes. DHK pasiskirstymo vandenyje-oktanolyje reikšmė logP yra 0,95, molekulinė masė - 304,25 Da, lydymosi temperatūra – 216 – 220 °C. Atsižvelgiant į šias savybes, DHK turėtų difunduoti į raginį sluoksnį. Tačiau DHK skvarbai įtakos turės ir tiekimo į odą sistemų savybės, todėl yra svarbu tinkamai jas sumodeliuoti.
1.4. Geliai
Europos farmakopėja gelį apibrėžia kaip puskietę vaisto formą, sudarytą iš skysčio, gelifikuoto tam tikromis medžiagomis. Išskiriamos dvi gelių kategorijos: lipofiliniai ir hidrofiliniai geliai [56]. Hidrogeliai – tai trimačiai hidrofiliniai polimerų tinklai, galintys absorbuoti didelius kiekius vandens [57]. Hidrogelių gamyboje naudojami natūralios, pusiau sintetinės ar sintetinės kilmės polimerai: tragakantas, natrio alginatas, celiuliozė ar jos dariniai, karbomerai, polivinilo alkoholis ir kiti. Paprastai geliai modeliuojami siekiant paviršinio poveikio ar poveikio gilesniuose odos sluoksniuose, tačiau galima ir transderminė vaistų pernaša į sisteminę kraujotaką [58]. Lyginant su tepalais arba kremais, geliai, kaip puskietė vaisto forma, pasižymi šiais privalumais: dėl didelio vandens kiekio, būdingas efektyvesnis veikliosios medžiagos atpalaidavimas; drėkina odą, todėl skatina vaisto skvarbą; paprasta gamybos technologija; stabilumas [59,60]. Siekiant efektyvesnės veikliųjų medžiagų skvarbos, į gelių sudėtį gali būti įterptos skvarbą skatinančios medžiagos [61,62]. Dėl šių savybių geliai yra patraukli dermatologinė vaisto forma.
1.5. Mikroemulsijos
Mikroemulsijos (ME) – tai skaidrios sistemos, sudarytos iš dviejų tarpusavyje nesimaišančių skysčių, stabilizuotų paviršine surfaktanto ar jo mišinio su kosurfaktantu plėvele [63,64]. ME yra sudarytos iš 3 – 5 komponentų: vandeninės fazės, aliejinės fazės, surfaktanto, kosurfaktanto, elektrolito [64]. ME gali būti skirstomos į 3 kategorijas: aliejus vandenyje (A/V), vanduo aliejuje (V/A) ir biištisinės mikroemulsijos [65]. Svarbu pabrėžti, kad emulsijos ir mikroemulsijos nėra ta pati sistema. Mikroemulsijas nuo emulsijų skiria šie požymiai: termodinamiškai stabilios; skaidrios; nereikalinga didelė energija gamybos metu;
mažesnė klampa; dalelių dydis 10 – 200 nm. ME apibrėžiamos kaip sunkiai tirpių medžiagų tirpumą gerinančios sistemos [66]. ME yra spontaniškai susidarančios sistemos, todėl jų gamybai nereikalinga papildoma energija [67]. ME susiformuoja, kai surfaktantas ar jo mišinys su kosurfaktantu sumažina paviršiaus įtempimą tarp aliejinės bei vandeninės fazių. Paviršiaus įtemptis sumažinama iki itin mažų reikšmių (10-3mN/m-1) [64].
Mikroemulsijos, kaip vaisto forma, pasižymi šiais privalumais: termodinamiškai stabilios; gerina tiek lipofilinių, tiek hidrofilinių medžiagų tirpumą; dispersinės fazės dalelės yra mažesnės nei 0,22 µm, todėl gali būti sterilizuojamos filtracijos būdu; į tą pačią ME galima įterpti ir lipofilines, ir hidrofilines medžiagas; paprasta gamybos technologija [65].
ME yra nagrinėjamos kaip medžiagų skvarbą į/pro odą skatinančios sistemos [8,68,69]. Manoma, kad ME gerina veikliųjų medžiagų skvarbą dėl sudėtyje esančių surfaktantų ir kosurfaktantų, kurie gali veikti kaip skvarbos skatintojai. ME taip pat pagerina veikliosios medžiagos tirpumą ir pasiskirstymą raginiame sluoksnyje [68]. ME skvarbą skatinantį poveikį patvirtina atliekami ex vivo skvarbos tyrimai [68,70,71].
1.6.
Cheminių skvarbos skatintojų apžvalga
Siekiant pagerinti veikliųjų medžiagų skvarbą per raginio sluoksnio barjerą, kuriami įvairūs skvarbos skatinimo metodai. Skvarbos skatinimo metodai gali būti išskirti į dvi pagrindines grupes [50,72]: • Pasyvūs/cheminiai metodai: provaistai, nešiklių sistemos (vezikulės, mikroemulsijos, liposomos),
cheminiai skvarbos skatintojai;
• Aktyvūs/fizikiniai metodai: elektriniai metodai (jontoforezė, sonoforezė, elektroporacija), mechaniniai metodai (mikroadatos, purkštuviniai injektoriai) bei kiti (ultragarsas, lazeris).
Vienas iš plačiausiai taikomų skvarbos skatinimo metodų yra cheminiai skvarbos skatintojai. Cheminiai skvarbos skatintojai – tai medžiagos, kurios įterptos į nešiklius pagerina veikliosios medžiagos difuziją, tirpumą bei sumažina odos rezistentiškumą, todėl veiklioji medžiaga gali efektyviau skverbtis į odos sluoksnius [47]. Mokslinėse publikacijose yra nurodomi pagrindiniai kriterijai, kuriuos turi atitikti idealus skvarbos skatintojas [72–74]: nedirgina odos; veikia greitai bei nuspėjamai; nesijungia su organizme esančiais receptoriais ir nesukelia farmakologinio efekto; suderinamas su nešiklių sudėtinėmis dalimis; bekvapis, beskonis, bespalvis, kosmetiškai priimtinas; pasižymi pakankamu tirpumu odoje.
Praktikoje naudojami skvarbos skatintojai nėra idealūs. Dažnai skvarbą skatinančios savybės tiesiogiai koreliuoja su odą dirginančiu poveikiu [50].
Remiantis Shan ir kt. teorija, cheminiai skvarbos skatintojai gali veikti šiais mechanizmais: skatina veikliosios medžiagos difuziją (D) į odą; tirpdo raginio sluoksnio lipidų matricą; didina vaisto termodinaminį aktyvumą nešiklyje ir odoje; sukuria vaisto rezervuarą odoje; keičia vaisto pasiskirstymo koeficientą [45]. Remiantis Barry lipidų - baltymų pasiskirstymo teorija, skatintojai veikia sąveikaudami su tarpląsteliniais lipidais, korneocituose esančiu keratinu bei didindami veikliosios medžiagos pasiskirstymą į raginį sluoksnį [75]. Skatintojai gali keisti raginio sluoksnio lipidų struktūrinį išsidėstymą, veikliosios medžiagos tirpumą bei atverti intraląstelinį kelią, pavyzdžiui, keisdami korneocituose esančio keratino konformaciją [52]. Paprastai skvarbos skatintojams būdingas daugiau nei vienas veikimo mechanizmas.
Cheminiai skvarbos skatintojai klasifikuojami į chemines grupes. 1 lentelėje pateiktos pagrindinės grupės bei jų atstovai [8,45,62]:
1 lentelė. Skvarbos skatintojų cheminės grupės ir jų atstovai
Cheminė grupė Atstovai
Alkoholiai • Trumpos grandinės: etanolis,
izopropilo alkoholis
• Ilgos grandinės: heksanolis, laurilalkoholis
Glikoliai Propilenglikolis, dipropilenglikolis,
1,2-butilenglikolis
Glikolių eteriai Dietilenglikolio monoetilo eteris
Terpenai, terpenoidai ir eteriniai aliejai • Monoterpenai: eugenolis, limonenas, mentolis
• Seskviterpenai: farnesolis, neridolis • Įvairūs eteriniai aliejai (eukalipto,
baziliko, pipirmėtės)
Riebalų rūgštys Oleino rūgštis, linoleno rūgštis, palmitino rūgštis, stearino rūgštis
Sulfoksidai Dimetilsulfoksidas, decilmetilsulfoksidas
Pirolidonai N-metil-2-pirolidonas, 2-pirolidonas
Amidai Azonas
Surfaktantai • Anijoniniai: natrio laurilsulfatas
• Katijoniniai:
alkildimetilbenzilamonio
halogenidai, alkiltrimetilamonio halogenidai
• Nejoniniai: Tween-80, Brij 36-T, PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai
Aktualūs tyrimai su skvarbos skatintojais, kurie yra pripažinti kaip nesukeliantys toksinio, odą dirginančio poveikio bei yra saugūs vartoti [46]. Žemiau pateikta tyrimams pasirinktų skvarbos skatintojų grupių apžvalga.
Glikolių eteriai. Dietilenglikolio monoetilo eteris (DEGEE). DEGEE yra farmacijos pramonėje naudojamas tirpiklis, pasižymintis tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių medžiagų tirpumą gerinančiomis savybėmis [76]. DEGEE naudojamas gelių, kremų, emulsijų, mikroemulsijų sudėtyje. DEGEE, kaip skvarbą skatinančios medžiagos, veikimo mechanizmas yra pagrįstas veikliosios medžiagos tirpumo raginiame sluoksnyje gerinimu, tačiau ne difuzijos skatinimu [8,51,77]. DEGEE gali absorbuoti vandenį iš odos, padidinti vandens kiekį raginiame sluoksnyje ir brinkinti lipidų matricą, nepakeisdamas jų struktūros. Tokiu būdu DEGEE sumažina raginio sluoksnio pasipriešinimą veikliųjų medžiagų difuzijai [61]. Skvarbą skatinančias savybes pagrindžia atliekami tyrimai. Nustatyta, kad DEGEEefektyviai skatina flavonoido kvercetino, kuris yra struktūrinis dihidrokvercetino analogas, skvarbą į kiaulės pilvo srities odą. Nustatyta, kad DEGEE skatino transderminę kvercetino pernašą į akceptorinę terpę bei mažino kumuliaciją odos sluoksniuose [70]. DEGEE efektyvumą patvirtina Osmalek ir kt. tyrimai, kurių metu nustatyta, kad naprokseno skvarba iš karbomero gelio per žmogaus odos modelį į akceptorinę terpę buvo nuo 2,5 iki 4,5 karto didesnė nei iš gelio su kitu komerciniu skvarbos skatintoju, naudojant analogiškas koncentracijas [78]. DEGEE įterpimas į karbomero gelį lėmė padidėjusią klonazepamo skvarbą į triušio ausies odą. Klonazepamo skvarba tiesiogiai priklausė nuo DEGEE koncentracijos gelyje [52]. 2016 m. Balazs ir kt. ištyrė DEGEE poveikį ibuprofeno skvarbai per žmogaus odos epidermio sluoksnį. Nustatyta, kad 10 proc. DEGEE įvedimas į gelį nepagerino skvarbos į akceptorinę terpę. Autoriai teigia, kad DEGEE kaip stiprus tirpiklis sukelia raginio sluoksnio lipidų brinkimą, todėl ibuprofenas yra stipriau sulaikomas lipidų fazėje. Todėl DEGEE nėra tinkamas transderminei ibuprofeno pernašai, o veikia sudarydamas veikliosios medžiagos depą viršutiniuose odos sluoksniuose [79]. Šiuos rezultatus patvirtina ir 2011 m. atliktas Czismazia ir kt. tyrimas, kurio metu taip pat tirta DEGEE įtaka ibuprofeno skvarbai iš gelio bei gautas analogiškas rezultatas [61].
Surfaktantai. Surfaktantai dėl paviršinio aktyvumo naudojami tokių sistemų kaip emulsijos ar mikroemulsijos stabilizavimui [63]. Surfaktantai savo struktūroje turi hidrofobines uodegėles ir hidrofilines galvutes, todėl yra amfifiliniai. Skirstomi į anijoninius, katijoninius, nejoninius bei amfoterinius surfaktantus. Nejoniniai surfaktantai yra mažiausiai toksiški ir dirginantys odą, todėl plačiausiai nagrinėjami kaip skvarbą skatinančios medžiagos [51]. Nejoniniai surfaktantai veikia tirpdydami bei ekstrahuodami raginio sluoksnio lipidus [80,81]. Surfaktantų poveikis priklauso ir nuo hidrofilinio-lipofilinio balanso
(HLB) bei anglies atomų grandinės ilgio [81]. Vienas iš nejoninių surfaktantų, plačiai naudojamas mikroemulsijų gamyboje - PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai (PEG-8 KG). Nustatyta, kad PEG-8 KG skatina tokių veikliųjų medžiagų kaip flukonazolo, fluoksetino skvarbą į odą [82,83].
Eteriniai aliejai. Eteriniai aliejai (EA) yra natūralūs, aliejinės konsistencijos, aromatingi skysčiai, sudaryti iš terpenų, terpenoidų ir fenilpropanoidų mišinio [62]. EA plačiai tyrinėjami kaip skvarbos skatintojai tiek hidrofilinėms, tiek lipofilinėms medžiagoms [84]. Skvarbą skatinantį poveikį lemia EA sudėtyje esantys terpenai ir jų dariniai. Terpenai keičia raginio sluoksnio lipidų struktūrą, didindami veikliųjų medžiagų difuziją bei pasiskirstymą į odą [85]. Vashisth ir kt. nustatė, kad terpenai veikia ekstrahuodami raginio sluoksnio lipidus [86]. Skvarbą skatinantį poveikį įtakoja terpenų fizikocheminės savybės: struktūra, lipofiliškumas, molekulės dydis bei virimo temperatūra [87]. Hidrofilinių molekulių skvarbą labiau pagerina terpenai, kurie turi polines funkcines grupes, tuo tarpu lipofilinių – angliavandeniliniai terpenai [87,88]. EA skvarbą skatinantis poveikis pragrįstas in vitro bei ex vivo moksliniais tyrimais. Nustatyta, kad eukaliptų aliejus skatina chlorheksidino diglukonato skvarbą į žmogaus epidermio bei dermos sluoksnius. 2 proc. chlorheksidino diglukonato, 10 proc. eterinio aliejaus ir 70 proc. izopropilo alkoholio mišinys reikšmingai pagerino skvarbą jau po 2 min, lyginant su izopropilo alkoholio ir chlorheksidino diglukonato mišiniu be skatintojo [89]. Nielsen ir kt. nustatė, kad pipirmėtės aliejus 0,1 ir 1,0 proc. koncentracijomis skatina benzoinės rūgšties skvarbą į žmogaus odą [90]. Nustatyta, kad baziliko aliejus efektyviai skatina labetololio hidrochlorido skvarbą į pilno storumo žiurkės odą. Baziliko aliejus buvo veiksmingesnis nei pavieniai terpenai – kamparas, geraniolis, timololis. Transderminė skvarba į akceptorinę terpę buvo 46,52 karto didesnė lyginant su kontrole [91]. 2015 m. atlikto tyrimo metu nustatyta, kad eteriniai aliejai reikšmingai skatina transderminę ibuprofeno pernašą į akceptorinę terpę. Įterpus 3 proc. eterinių aliejų į ibuprofeno gelių formuluotes, skvarba padidėjo 3,5 – 3,7 karto. EA veikė efektyviau nei sintetinis skvarbos skatintojas azonas [62]. Das ir kt. tyrimai parodė, kad paprastojo pankolio, eukalipto, citrinžolių ir mėtų aliejus skatina trazodono hidrochlorido skvarbą į pelės epidermį [92]. Nustatyta, kad losartano skvarbą į odą gerina arbatmedžio, kumino, rožių bei alavijo eteriniai aliejai [86].
Šiuo metu apie DHK skvarbą į odą duomenų nėra, tačiau yra paskelbti struktūriškai į DHK panašaus junginio kvercetino skvarbos į odą ex vivo tyrimų rezultatai [70,93]. Kvercetino cheminė struktūra skiriasi 2,3 dvigubuoju ryšiu. Kvercetinui yra būdingos panašios fizikinės-cheminės savybės (molekulinė masė – 302,24 Da, lydymosi temperatūra – 316,5 °C, logP – 1,5). Tyrimų rezultatai patvirtina, kad kvercetino skvarba į odą yra ribota, todėl vykdoma skvarbos skatinimo metodų paieška [93]. Dėl panašių fizikinių-cheminių savybių, analogiška problema gali būti būdinga ir DHK, todėl aktualu ištirti pasirinktų cheminių skvarbos skatintojų poveikį šio junginio skvarbai į odą.
2. METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Eksperimentinės dihidrokvercetino formuluotės: • Geliai
• Mikroemulsijos
2.2. Medžiagos
ir įranga
2.2.1. Medžiagos
Dihidrokvercetino ekstraktas, UAB ,,Rokiškio pragiedruliai“, Rokiškis, Lietuva
(+)-dihidrokvercetino standartas (90,44 proc.), HWI Analytik GmbH, Rülzheim, Vokietija Acetonitrilas (≥ 99,9 proc.), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija
Skruzdžių rūgštis (≥ 98 proc.), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Metanolis (≥ 99,9), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija
Etanolis, 96 proc. (v/v), AB ,,Stumbras“, Lietuva Karbomeras 980, Fagron BV, Rotterdam, Olandija
Trietanolaminas, 98 proc., Sigma - Aldrich, Saint Louis, JAV
Propilenglikolis (≥ 99,5), Kollisolv PG, BASF SE, Ludwigshafen, Vokietija Etilo oleatas, 70 proc., Alfa Aesar GmbH & Co KG, Karlsruhe, Vokietija
PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai (Labrasol®), Gattefosse, Saint-Priest, Prancūzija Poligliceril-6-izostereatas (Plurol isostearique®), Gattefosse, Saint-Priest, Prancūzija Dietilenglikolio monoetilo eteris (Transcutol P®), Gattefosse, Saint-Priest, Prancūzija Eglės spyglių eterinis aliejus, Biolat, Latvija
Pušies spyglių eterinis aliejus, Biolat, Latvija
Natrio chloridas, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija Natrio azidas, POCh, Gliwice, Lenkija.
2.2.2.
Įranga
Ultra-efektyvusis skysčių chromatografas: Waters Acquity UPLC System, Waters, MA, JAV.
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKAMAG C-MAG HS7, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija pHmetras: ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija
Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija Ultragarsinė vonelė: USC1200THD, VWR, USA
Modifikuotos Bronaugh pratakios difuzinės celės sujungtos su cirkuliacine vandens vonele Grant GD120 (Grant Instruments Ltd.,UK), peristaltiniu siurbliu (Masterflex L/S) bei daugiakanale siurblio galva (Cole-Parmer Instrument Co., Ilinojus, JAV)
Viskozimetras: Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija Konduktometras: Cond 3110 SET 1, Vokietija
Dinaminės šviesos sklaidos analizatorius: Zetasizer Nano ZS, Malvern, Didžioji Britanija Termostatinė spinta su purtymo funkcija: GEL, Vokietija
2.3. Dihidrokvercetino kiekybinio nustatymo metodika
Dihidrokvercetino kiekybinė analizė atlikta naudojant Waters Acquity ultra-efektyvųjį skysčių chromatografą (Waters, MA, USA) sujungtą su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo endogeninių odos matricos komponentų buvo vykdomas Acquity UPLC BEH C18 kolonėlėje (10 cm, 1,7 µm dalelės, 2,1x50 mm). Mobilioji fazė sudaryta iš 0,2 proc. skruzdžių rūgšties (tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B). Mobilios fazės gradientas: nuo 10 proc. iki 33 proc. tirpiklio B per 4 minutes. Mobilios fazės tėkmės greitis – 0,7 ml/min, injekcijos tūris – 1,0 µl. Kolonėlės temperatūra - 30 ºC. Dihidrokvercetino detekcijos UV bangos ilgis - 290 nm. Metodas validuotas remiantis ICH Q2 (R1) gairių rekomendacijomis [94].
2.4. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto
Dihidrokvercetino tirpalai buvo paveikti žemiau nurodytomis sąlygomis ir analizuoti UESC metodu.
Natūralios sąlygos. 10 µg/ml DHK ekstrakto tirpalai metanolyje laikyti kambario temperatūroje, natūralioje šviesoje bei 4 °C, tamsoje. Tirpalai analizuoti po 3 dienų.
Stresinės sąlygos. Tyrimai atlikti remiantis ICH Q1A (R2) gairių rekomendacijomis [95]. 10 µg/ml DHK ekstrakto tirpalai 40 proc. etanolyje paveikti temperatūra, rūgštimi bei šarmu:
1. Temperatūra. DHK tirpalai šildomi 1 valandą vandens vonelėse, kuriose palaikoma 50 ± 1°C, 60 ± 1 °C bei 70 ± 1 °C temperatūra.
2. Rūgštinė ir šarminė aplinka. DHK tirpalai parūgštinami 1M HCl iki 2 pH arba pašarminami 0,1 N NaOH iki 8 pH reikšmių ir paliekami tamsioje aplinkoje 24 val.
2.5. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumo vertinimas
Ekstrakto grynumas vertintas nustatant procentinį dihidrokvercetino kiekį sausąjame dihidrokvercetino ekstrakte. Atsveriami 3 mg DHK ekstrakto ir ištirpinama 10 ml metanolio. Atliekami skiedimai iki vidurinio kalibracinio taško (3,15 µg/ml) ir vykdoma UESC analizė.
2.6. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumo vertinimas
Paruošiami prisotinti dihidrokvercetino ekstrakto tirpalai vandenyje, 5, 10, 20, 30, 40 proc. etanolyje bei 5 ir 10 proc. propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose. Į mėgintuvėlius, apsaugotus nuo šviesos, įpilama 10 ml tirpiklio ir dedamas DHK ekstrakto perteklius. Prisotinti tirpalai purtomi 24 valandas termostatinėje spintoje su purtymo funkcija. Tyrimas atliekamas +37 ± 1 °C temperatūroje. Po 24 val. tirpalai filtruojami pro membraninį filtrą. Vykdomi skiedimai ir atliekama analizė UESC metodu.
2.7.
Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu gamyba
2.7.1.
Gelių gamybos metodika
Gaminami 1 proc. dihidrokvercetino geliai. Kaip gelifikuojanti medžiaga pasirinktas karbomeras 980. Neutralizavimui naudojamas 98 proc. trietanolaminas [62]. Eksperimentinių gelių su DHK sudėtys pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Eksperimentinių gelių su dihidrokvercetinu sudėtys Gelis Komponentai, proc. Karbomeras 980 DHK ekstraktas 40 proc.
etanolis DEGEE PEG-8 KG
Eglės spyglių EA Pušies spyglių EA G1 0,50 1,54 97,96 - - - - G2 0,75 1,54 97,71 - - - - G3 1,00 1,54 97,46 - - - - G4 0,50 1,54 87,96 10,00 - - - G5 0,75 1,54 87,71 10,00 - - - G6 1,00 1,54 87,46 10,00 - - - G7 0,50 1,54 87,96 - 10,00 - - G8 0,75 1,54 87,71 - 10,00 - - G9 1,00 1,54 87,46 - 10,00 - - G10 1,00 1,54 94,46 - - 3,00 - G11 1,00 1,54 94,46 - - - 3,00 G12 1,00 1,54 89,46 5,00 - 3,00 - G13 1,00 1,54 89,46 - 5,00 3,00 - G14 1,00 1,54 89,46 5,00 - - 3,00 G15 1,00 1,54 89,46 - 5,00 - 3,00
Gelio gamyba. 40 proc. etanolyje ištirpinamas DHK. Tirpalas maišomas magnetine maišykle. Į tirpalą suberiamas apskaičiuotas karbomero 980 kiekis. Mišinys parūgštinamas 0,1 M HCl rūgštimi, tęsiamas maišymas. Neutralizuojama 98 proc. trietanolaminu, kol susidaro reikiamos konsistencijos gelis ir pasiekiama 6 ± 0,1 pH reikšmė. Gelių gamybos metu kontroliuojamas maišymo greitis bei trukmė. Gelių gamyba su skvarbos skatintojais vykdoma analogiškai, skvarbos skatintojus įterpus į 40 proc. etanolį. Skvarbos skatintojų koncentracijos pasirinktos remiantis mokslinių tyrimų duomenimis [61,62,85].
2.7.2.
Mikroemulsijų gamybos metodika
Dihidrokvercetino mikroemulsijos formuluojamos remiantis Juškaitės V. ir kitų autorių straipsnyje pateiktomis optimizuotomis tuščių mikroemulsijų sudėtimis (3 lentelė) [71]. Gaminamos 1 proc. DHK mikroemulsijos.
3 lentelė. Eksperimentinių mikroemulsijų sudėtys ME
Komponentai, proc.
S:KoS Vanduo Aliejinė fazė
ME 5:1 57 38 5
ME 6:1 55,5 37,9 6,6
ME 7:1 56 37,6 6,4
Mikroemulsijų gamyba. Gaminamos skirtingų surfaktanto ir kosurfaktanto (S:KoS) santykių mikroemulsijos: ME 5:1, ME 6:1 ir ME 7:1. Kaip surfaktantas naudojami PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai (PEG-8 KG), kosurfaktantas - poligliceril-6-izostereatas (P6I), aliejinė fazė – etilo oleatas. ME gaminamos aliejinės fazės titravimo metodu. Apskaičiuotas reikiamas DHK kiekis ištirpinamas surfaktante maišant magnetine maišykle. Į vandeninę fazę įterpiamas surfaktantas su jame ištirpusiu DHK bei kosurfaktantas. Vykstant maišymo procesui, po lašą titruojama aliejinė fazė. Gamybos metu kontroliuojamas maišymo greitis ir trukmė. Mikroemulsija laikoma susiformavusia tada, kai gaunama skaidri formuluotė. Pagamintos mikroemulsijos paliekamos 24 valandų ekvilibracijos periodui.
2.8.
Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas
2.8.1.
Eksperimentinių formuluočių fizikinių savybių nustatymas
pH reikšmių nustatymas. Formuluočių pH nustatyta pH-metru (pH-meter 766 Calimatic, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija) su elektrodu Knick SE 104 N.
Dinaminės klampos nustatymas. Formuluočių dinaminė klampa nustatyta viskozimetru Vibro viscometer SV-10 (A&D Company ltd, Japonija).
Vidutinio dalelių dydžio (VDD) ir polidispersiškumo indekso (PDI) nustatymas. Mikroemulsijų dalelių dydžio vidurkis bei polidispersiškumo indeksas įvertintas dinaminės šviesos sklaidos metodu, naudojant Zetasizer Nano ZS analizatorių (Malvern, Didžioji Britanija).
Elektrinio laidumo nustatymas.Mikroemulsijų laidumas matuojamas konduktometru (Cond 3110 SET 1, Vokietija).
2.8.2.
Eksperimentinių mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas
Termodinaminio stabilumo tyrimai atlikti vykdant šildymo-šaldymo ir užšaldymo-atšildymo ciklus [71,96]. Mikroemulsijos laikytos skirtinguose temperatūriniuose režimuose šia seka: 4° C, 20° C, 32° C, 45° C (šildymo-šaldymo ciklas) ir −21° C, 4° C, 25° C (užšaldymo-atšildymo ciklas). Mikroemulsijos visose temperatūrose laikytos ne mažiau kaip 48 valandas. Homogeniškumas vertintas vizualiai kiekvienoje iš nurodytų temperatūrų.
2.8.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš e
ksperimentinių gelių in vitro tyrimai
Dihidrokvercetino atpalaidavimo tyrimai in vitro atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes. Į celės donorinę dalį įdedama donorinės fazės (gelio) begalinė dozė (~0,5 g). Donorinės dalies atvirasis galas uždengiamas celiuliozine membrana Cuprophan® (Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija). Prieš tyrimą celiuliozinė membrana yra laikoma išgrynintame vandenyje ne mažiau 1 val. Membranos difuzijos plotas – 1,77 cm2. Akceptorinė dalis užpildoma akceptorine terpe - 50 ml 5 proc. etanoliu. Donorinė fazė patalpinama į akceptorinę terpę. Akceptorinė terpė maišoma magnetine maišykle. Tyrimas atliekamas +37 ± 0,5° C temperatūroje. Akceptorinės terpės mėginiai imami po 0,25, 0,5, 1, 2, 4 valandų. Imamas 1 ml akceptorinės terpės ir grąžinamas toks pats tūris šviežios akceptorinės terpės. Mėginiai analizuojami UESC metodu. Atpalaiduotas DHK kiekis išreiškiamas srautu (mg/cm2) bei procentais nuo donorinėje fazėje esančio DHK kiekio. Atpalaidavimas iš kiekvienos formuluotės tiriamas 5 kartus.
2.9.
Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą tyrimai ex vivo
Skvarbos į žmogaus odą tyrimams ex vivo atlikti naudotos modifikuotos Bronaugh tipo pratakios difuzinės celės. Difuzinės celės su jose patalpintais žmogaus odos mėginiais pritvirtinamos ant šildomo metalinio bloko, kuriame palaikoma +37 ± 1° C temperatūra. Odos difuzijos plotas celėse – 0,64 cm2. Akceptorinė terpė sudaryta iš 0,9 proc. natrio chlorido bei 0,005 proc. natrio azido. Akceptorinės terpės tėkmės greitis - 0,6 ml/min. Akceptorinės terpės tūris – 5 ml. Akceptorinė terpė cirkuliuojama po oda naudojant peristaltinį siurblį su daugiakanale siurblio galva. Tyrimams naudota plastinių operacijų metu pašalinta baltaodžių moterų (25–40 metų amžiaus) oda. Prieš atliekant tyrimus, oda buvo laikoma –20° C temperatūroje ne ilgiau kaip šešis mėnesius.
Vykdoma ekvilibracijos fazė, kurios metu akceptorinė terpė cirkuliuoja po oda. Ekvilibracijos periodas – 0,5 val. Po ekvilibracijos, ant odos paviršiaus (raginio sluoksnio) užnešama donorinės fazės (1 proc. dihidrokvercetino metanolinio tirpalo, gelio arba mikroemulsijos) begalinė dozė (~ 0,2 ml arba 0,2 g) ir paliekama 6 valandoms, sandariai uždengus celes. Po 6 valandų donorinė fazė pašalinama nuo odos paviršiaus, odos paviršius nuplaunamas 2 kartus 96 proc. etanoliu ir 3 kartus 0,9 proc. natrio chloridu [97]. Skvarba iš kiekvienos formuluotės tiriama 3 kartus.
Atlikus skvarbos tyrimus, vykdomas odos sluoksnių atskyrimas. Epidermis nuo dermos atskiriamas sauso karščio metodu [98]. Odos mėginiai ekstrahuojami 1 ml metanolio 30 min. ultragarso vonelėje, kambario temperatūroje. Odos mėginių ekstraktai bei akceptorinė terpė filtruojami membraniniais filtrais ir vykdoma analizė validuotu UESC metodu.
Vertinant raginio sluoksnio įtaką dihidrokvercetino skvarbai, atlikta raginio sluoksnio pašalinimo procedūra. Raginis sluoksnis pašalintas lipnių juostų metodu, naudojant Scotch® Crystal (3M) juostą. Toliau vykdomas analogiškas skvarbos į odą ex vivo tyrimas.
2.10.
Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir IBM SPSS 22 programas. Apskaičiuoti tyrimų duomenų vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, santykiniai standartiniai nuokrypiai. Duomenų analizei pritaikytas blokuotųjų duomenų analizės modelis ANOVA naudojant LSD kriterijų. Nustatytas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas. Statistinis duomenų reikšmingumas nustatytas kai p < 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Dihidrokvercetino ultra-efektyviosios
skysčių chromatografijos metodo
validacija
Metodo specifiškumas vertintas analizuojant tuščius epidermio ir dermos ekstrakcijos mėginius bei DHK išgavas, išekstrahuotas iš epidermio ir dermos. Į UESC sistemą injekuota po 4 epidermio ir 4 dermos ekstrakcijos mėginius su ir be DHK. Endogeninių odos matricos komponentų sulaikymo laikai palyginti su DHK sulaikymo laiku (3 pav.).
3 pav. (+)-dihidrokvercetino standarto (A), dihidrokvercetino mėginio su dermos komponentais (B), epidermio (C) ir dermos mėginio (D) chromatograma 290 nm bangos ilgyje: 1 – dihidrokvercetinas; * -
odos komponentai
Nustatytas DHK sulaikymo laikas – 1,642 min, epidermio komponento sulaikymo laikas - 0,449 min, dermos komponentų - 0,453 min ir 1,394 min. Išekstrahuoti epidermio ir dermos komponentai netrukdė DHK analizei.
Kokybinio ir kiekybinio nustatymo ribos (LOD ir LOQ) apskaičiuotos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu (SN). Nustatyti 0,25, 0,5 ir 1,0 μg/ml standartų tirpalų LOD ir LOQ bei išvesti jų vidurkiai. Atsižvelgiant į kiekybinio nustatymo ribą (LOQ), sudaryta kalibracinė kreivė. Paruošti 0,35, 1,05, 3,15, 9,45, 28,35 µg/ml standarto tirpalai metanolyje ir injekuoti į UESC sistemą 3 kartus. Analitėms suteikta regresijos lygtis, kur y – smailės ploto dydis, x – analitės kiekis. Sudarytas chromatogramos ploto priklausomybės nuo koncentracijos grafikas. Kalibracinės kreivės tiesiškumas įvertintas pagal nustatytą koreliacijos koeficientą (R²). Rezultatai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. Dihidrokvercetino kalibracinės kreivės parametrai Regresijos lygtis R² LOD, µg/ml LOQ, µg/ml
Koncentracijų intervalas,
µg/ml y = 5690x - 138 0,99995 0,07 0,23 0,35 - 28,35
Nustatytas koreliacijos koeficientas (R2) patvirtino kalibracinės kreivės tiesiškumą.
Metodo tikslumas ir glaudumas vertintas vykdant pakartojamumo (dienos) ir atkuriamumo (tarp dienų) validaciją. Ruošiamos ir analizuojamos 1, 3 ir 5 kalibracinio grafiko taškų 3 tirpalų serijos tą pačią dieną (pakartojamumas) ir 3 tirpalų serijos trimis skirtingomis dienomis (atkuriamumas) (5 lentelė).
5 lentelė. Ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacijos rezultatai Konc.,
µg/ml
Pakartojamumas Atkuriamumas
Tikslumas, proc. Glaudumas, proc. Tikslumas, proc. Glaudumas, proc.
0,35 103,05 3,90 103,52 4,53
3,15 107,52 1,49 103,94 0,54
28,35 110,22 2,07 95,46 4,70
Nustatytas metodo tikslumas buvo nuo 95,46 iki 110,22 proc., o glaudumas ne didesnis kaip 4,70 proc. Metodas validuotas.
4 pav. Dihidrokvercetino ekstrakto chromatograma: 1 – dihidrokvercetinas, 2 – ekstrakto komponentas Gauti validacijos rezultatai patvirtino metodo tinkamumą kokybinei ir kiekybinei DHK ekstrakto analizei tolimesniuose in vitro bei ex vivo biofarmaciniuose tyrimuose (4 pav.).
3.2. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto
Vystant analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodą, įvertinta metodo geba atskirti DHK nuo susidariusių papildomų produktų. DHK ekstrakto 10 µg/ml tirpalai buvo paveikti šiomis sąlygomis:
• natūrali šviesa, kambario temperatūra; • tamsa, 4 °C temperatūra;
• stresinės sąlygos: rūgštis (pH = 2), šarmas (pH = 8), temperatūra (50 °C, 60 °C, 70 °C). Tyrimų sąlygos detaliau aprašytos 2.4 skyriuje. DHK tirpalai analizuoti UESC metodu.
Šviesa ir kambario temperatūra. Tyrimų rezultatai parodė, kad laikant DHK tirpalą kambario temperatūroje, šviesoje, po 3 dienų susidaro papildomas produktas, kuris nebuvo nustatytas analizuojant šviežią DHK tirpalą (5 pav.).
5 pav. DHK chromatograma po 3 d. laikymo šviesoje ir kambario temperatūroje: 1 – DHK, 2 – papildomas produktas, 3 – ekstrakto komponentas
DHK chromatografinės smailės plotas po 3 dienų sumažėjo 34,53 proc. DHK tirpalą laikant 3 dienas 4 °C temperatūroje, tamsioje aplinkoje, pakitimų nenustatyta.
Stresinės sąlygos. Po 1 valandos DHK tirpalų šildymo 50 °C, 60 °C ir 70 °C temperatūroje, nustatytas susidaręs papildomas produktas, kurio nebuvo analizuojant stresinėmis sąlygomis nepaveiktą DHK tirpalą (6 pav.).
6 pav. DHK chromatograma po šildymo 50 °C temperatūroje: 1 – DHK, 2 – papildomas produktas, 3 – ekstrakto komponentas
Nustatyta, kad paveikus DHK tirpalą 50 °C temperatūra, chromatografinės smailės plotas sumažėja 7,41 proc. o 60 ir 70 °C temperatūra - sumažėja atitinkamai 15,17 proc. ir 13,63 proc.
DHK tirpalą parūgštinus iki pH 2, chromatogramoje pakitimų nenustatyta. Tačiau susidaręs papildomas produktas identifikuotas DHK tirpalą paveikus silpnai šarmine (pH=8) aplinka. DHK chromatografinės smailės plotas sumažėjo 10,99 proc.
Visais atvejais nustatyta skiriamoji geba (Rs) buvo 2,58, todėl pasiektas efektyvus DHK atskyrimas nuo susidariusio papildomo produkto. Remiantis gautais tyrimų rezultatais, DHK formuluočių gamybos metu buvo kontroliuojamas papildomo produkto susidarymas. Mokslinių tyrimų duomenų apie DHK skilimo produktus nebuvo aptikta. Susidariusio papildomo produkto identifikavimas nebuvo šio tiriamojo darbo tikslas. Siekiant nustatyti, koks produktas susidaro veikiant DHK tirpalus aprašytomis sąlygomis, reikalinga tęsti tyrimus.
3.3. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumas
Atlikus dihidrokvercetino ekstrakto 3,15 µg/ml tirpalų analizę UESC metodu, nustatyta DHK koncentracija. Lyginant su standarto tirpalu, apskaičiuotas ekstrakto grynumas (6 lentelė).
6 lentelė. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumas DHK standarto
tirpalo konc., µg/ml
DHK konc. ekstrakto tirpale,
µg/ml Vidurkis, µg/ml Vidurkis, proc. 1 2 3 3,15 1,99 2,23 1,91 2,04 64,82
Nustatytas DHK kiekis analizuojamo 3,15 µg/ml ekstrakto tirpale – 2,04 ± 0,14 µg/ml (64,82 proc.). Atsižvelgiant į ekstrakto grynumą, buvo gaminamos eksperimentinės formuluotės su 1 proc. DHK arba 1,54 proc. DHK ekstrakto.
3.4. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumas
DHK yra sunkiai tirpus vandenyje junginys [22]. Dėl prasto tirpumo vandenyje iškilo papildomų iššūkių siekiant įterpti DHK į formuluotes. Todėl įvertintas DHK ekstrakto tirpumas pasirinktuose tirpikliuose. DHK ekstrakto tirpumas vertintas pagal ištirpusį DHK kiekį (7 pav.).
7 pav. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumas vandenyje, vandeniniuose etanolio ir propilenglikolio tirpaluose
Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas lyginant DHK tirpumą vandenyje su visais tirpikliais (p < 0,05). Nustatyta statistiškai reikšminga tiesioginė koreliacija tarp etanolio koncentracijos ir ištirpusio DHK kiekio (r = 0,981, p < 0,05). Lyginant DHK tirpumą 5 ir 10 proc. propilenglikolyje statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p > 0,05).
Remiantis tyrimų rezultatais, buvo siekiama parinkti tinkamiausią tirpiklį 1 proc. DHK gelių formulavimui. Rezultatai patvirtino, kad į vandenį įterpus iki 10 proc. etanolio arba propilenglikolio, DHK tirpumas išlieka mažesnis nei 1 mg/ml, todėl nėra pakankamas ištirpinti 1 proc. DHK. Pakankamas DHK tirpumas pasiekiamas tirpinant ne mažesnės kaip 30 proc. koncentracijos etanolio tirpale. Siekiant užtikrinti, kad DHK į gelį bus įvestas tirpalo formoje, pasirinktas 40 proc. etanolis. Tolimesnių tyrimų eigoje DHK tirpumo problema buvo sprendžiama įterpiant į medžiagų tirpumą gerinančiomis savybėmis pasižyminčią sistemą – mikroemulsiją.
In vitro atpalaidavimo tyrimams kaip akceptorinė terpė pasirinktas 5 proc. etanolis dėl mažesnės nugaravimo tikimybės atliekant tyrimus + 37° C temperatūroje. Reikalingas terpės tūris apskaičiuotas atsižvelgiant į DHK tirpumo rezultatus.
0,529 0,639 0,805 2,613 13,616 36,945 0,671 0,757 0 5 10 15 20 25 30 35 40
5 proc. 10 proc. 20 proc. 30 proc. 40 proc. 5 proc. 10 proc.
vanduo etanolis propilenglikolis
K o n c. , mg /ml Tirpiklis
3.5.
Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas
3.5.1. G
elių fizikinės savybės
Dihidrokvercetino gelių kokybės vertinimui pasirinkti pH ir dinaminės klampos reikšmių nustatymai.
pH reikšmių nustatymas. Gamybos metu buvo siekiama pagaminti gelius, kurių pH būtų 6 ± 0,1 intervale. pH reikšmių rezultatai parodė, kad visų gelių pH svyruoja nuo 5,94 iki 6,10. Pagamintų gelių pH reikšmės yra tinkamos vartojimui ant odos [99].
Dinaminės klampos nustatymas. Dinaminė gelių klampa gali turėti įtakos DHK atpalaidavimui iš gelio pagrindo. Todėl atliktas tuščių gelių ir gelių su DHK bei skvarbos skatintojais dinaminės klampos vertinimas. Rezultatai pateikti 8 paveiksle.
8 pav. Dihidrokvercetino (DHK) gelių dinaminės klampos reikšmės. Čia DEGEE – dietilenglikolio monoetilo eteris, PEG-8 KG – PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai
Tyrimų rezultatai parodė, kad gelių dinaminė klampa didėja, didėjant gelifikuojančios medžiagos koncentracijai. Į 0,5, 0,75 bei 1 proc. karbomero gelių sudėtį įterpus 1 proc. DHK, dinaminė klampa atitinkamai sumažėjo 7,14 proc., 18,35 proc., 29,94 proc.
Įvertinta skvarbos skatintojų įtaka DHK gelių klampai. Į. DHK gelio sudėtį įterpus 10 proc. DEGEE, 0,5 proc. karbomero gelio klampa padidėjo 45,84 proc., o 0,75 proc. karbomero gelio klampa –
0,56 1,09 1,57 0,52 0,89 1,10 0,96 0,98 1,12 0,37 0,62 1,07 1,11 1,10 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
0,5 proc. 0,75 proc. 1,00 proc.
D ina m inė kl am pa , Pa *s
Karbomero koncentracija gelyje
Gelis be DHK ir skvarbos skatintojų Gelis su DHK
Gelis su DHK ir DEGEE Gelis su DHK ir PEG-8 KG
10,11 proc. Nustatyta, kad į gelius įterpus 10 proc. PEG-8 KG, 0,5 ir 0,75 proc. karbomero DHK gelių klampa sumažėjo atitinkamai 28,85 proc. ir 30,33 proc. Gelių formuluotės su PEG-8 KG pasižymėjo skystesne konsistencija. Analizuojant 1 proc. karbomero DHK gelius su ir be skvarbos skatintojais, nustatyta, kad dinaminės klampos reikšmės varijuoja 1,07 – 1,12 Pa*s intervale ir tarpusavyje skiriasi tik ± 1,5 proc. Statistinė duomenų analizė neparodė reikšmingo skirtumo tarp šių formuluočių klampos reikšmių (p > 0,05). Galima teigti, kad formuluotėje esant 1 proc. karbomero koncentracijai, skvarbos skatintojai neturi įtakos dinaminei gelių klampai.
3.5.2. M
ikroemulsijų fizikinės savybės ir termodinaminis stabilumas
Vizualinis vertinimas. Pagamintos 1 proc. DHK mikroemulsijos (ME) įvertintos vizualiai. ME yra skaidrios, nėra matoma išsisluoksniavimo, drumstumo ar iškritusių nuosėdų.
Termodinaminis stabilumas. Termodinaminio stabilumo tyrimų metu, atlikti šildymo-šaldymo bei užšaldymo-atšildymo ciklai, naudojant skirtingus temperatūrinius režimus. Viso tyrimo metu suformuotos 5:1, 6:1 ir 7:1 ME, sudėtyje su 1 proc. DHK, išliko skaidrios, nebuvo pastebėta fazių atsiskyrimo, iškritimo į nuosėdas, susidrumstimo. Vertinant vizualiai, buvo patvirtintas ME termodinaminis stabilumas, todėl pagamintos ME buvo tinkamos tolimesniam fizikinių savybių vertinimui.
Fizikinių savybių vertinimas. Suformavus 5:1, 6:1 ir 7:1 S:koS santykių mikroemulsijas su 1 proc. DHK, atliktas jų fizikinių savybių nustatymas. ME kokybė vertinta nustatant šiuos parametrus: vidutinį dalelių dydį (VDD), polidispersiškumo indeksą (PDI), pH, elektrinį laidumą bei klampą [65,67] (7 lentelė).
7 lentelė. Dihidrokvercetino mikroemulsijų fizikinės savybės
Mikroemulsija VDD, nm PDI pH elektrinis
laidumas,µS/cm klampa, mPa·S ME 5:1 83,52 ± 0,665 0,342 ± 0,035 6,85 ± 0,017 99,83 ± 0,386 83,4 ± 0,1 ME 6:1 83,06 ± 0,495 0,290 ± 0,003 6,77 ± 0,005 91,43 ± 0,899 70,8 ± 0,2 ME 7:1 82,22 ± 0,181 0,284 ± 0,002 6,75 ± 0,008 77,37 ± 0,189 76,5 ± 0,2
VDD ir PDI nustatymas. Nustatytas vidutinis dalelių dydis 5:1, 6:1 bei 7:1 S:KoS santykių mikroemulsijoms atitinkamai buvo 83,52 ± 0,665, 83,06 ± 0,495, 82,22 ± 0,181 nm. VDD buvo mažesnis nei 200 nm, todėl dalelių dydis atitiko mikroemulsijai keliamus reikalavimus [66]. Suformuotų
