5. MATERIALI E METODI
5.1 METODICHE DI CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Sono stati deposti su carta da filtro “Whatman FTA cards” (Whatman) 96 campioni clinici (sangue periferico, siero, lavaggio bronco alveolare e urine), pervenuti al Laboratorio dell’U.O. complessa di Virologia dell’Università di Pisa, Azienda Universitario-Ospedariera Pisana, per la ricerca di infezioni da virus a DNA e risultati positivi per il virus HBV (Virus dell’Epatite B), virus di EBV (Epstein Barr Virus, HHV4), o CMV (Citomegalovirus, HHV5).
Un volume di 50µl di campione è stato applicato direttamente su carta da filtro “WHATMAN FTA CARDS” (Whatman) e lasciato ad asciugare a temperatura ambiente per 24 ore. Successivamente i campioni “spottati” sono stati conservati in sacchetti di plastica a bassa permeabilità.
Gli stessi campioni clinici sono stati trattati con la metodica standard di riferimento in uso nel laboratorio per la diagnosi delle infezioni virali prese in esame, in modo da permettere il confronto dei risultati ottenuti utilizzando le due diverse metodiche di raccolta e conservazione dei campioni biologici, valutare se la carica virale di partenza rimane inalterata in seguito allo “spottaggio” su carta da filtro in previsione di poter utilizzare la “filter paper” come metodica routinaria di raccolta e conservazione di campioni biologici nei paesi in via di sviluppo.
5.2 ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI VIRALI
ELUIZIONE DEL CAMPIONE BIOLOGICO DALLA CARTA DA FILTRO
Su ciascuno spot sono stati caricati 50 µl di campione. IL campione è stato eluito dalla carta da filtro (Figura 20. 1,2,3) mediante l’incisione della cartina (1), il dischetto ottenuto è stato trasferito in una provetta contenente 1100 µl Buffer Tris-EDTA (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA pH 8.0) (2) e lasciato “overnight” in agitazione. Successivamente è stato incubato a 56° per 30’ (3) (Bereczky et al.,2005 ; Leruez-Ville M. et al., 2010). L’eluato è stato recuperato pronto per il successivo passaggio di purificazione.
1 2 3 Figura 21 : Step di eluizione del campione dalla carta da filtro.
ESTRAZIONE DEL GENOMA VIRALE DA CAMPIONI CLINICI APPLICATI SU CARTE DA FILTRO
I genomi virali sono stati analizzati con la metodica utilizzata per le diagnosi di infezioni virali validata di “routine”.
- La purificazione del DNA virale del Virus di EBV e CMV è stata effettuata utilizzando il kit commerciale “QIAamp DNA Mini kit: Protocol: DNA Purification from Blood or Body Fluids” (QIAgen, Chatsworth, CA).
PROTOCOLLO
1. Addizionare 20 µl di Proteinase K e 200 µl di Buffer AL ( per lisare le cellule) 2. Incubare a 56°C per 10 min
3. Addizionare 200 µl di etanolo (96-100%) (per far precipitare il DNA)
4. Trasferire la miscela in una QIAamp Mini spin column, inserita in un tubino da 2mL 5. Centrifugare per 1 min 8000 rpm
6. Gettare l’eluato e trasferire la QIAamp Mini spin column in un nuovo tubino da 2 mL 7. Addizionare 500 µl di Buffer AW1
8. Centrifugare per 1 min 8000 rpm 9. Ripetere il passaggio 5/6
10.Addizionare 500 µl di Buffer AW2 11.Centrifugare a massima velocità per 3 min 12.Ripetere passaggio 6
13.Addizionare 50 µl di Buffer AE
14.Centrifugare a 8000 rpm per 1 min per eluire il DNA
- La purificazione del DNA virale del Virus dell’Epatite B è stata eseguita con estrazione automatizzata tramite COBAS® AmpliPrep (Roche).
QUANTIFICAZIONE DELLA CARICA VIRALE
La Real Time PCR o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), permette il monitoraggio della reazione di amplificazione durante il suo svolgimento ed i dati che si ottengono a fine ciclo possono essere utilizzati per effettuare una quantificazione relativa del frammento amplificato, questo è possibile tramite l’impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR. La curva di amplificazione che deriva da una PCR è solo teoricamente di tipo esponenziale; in realtà, dopo la prima fase esponenziale in cui nessuno dei componenti della reazione è limitante, tende ad assumere un andamento di tipo lineare e dopo un certo numero di cicli, raggiunge un plateau, per questo motivo la misurazione della reazione in fase finale non risulta direttamente connessa con l'ammontare iniziale di DNA “target” mentre al momento del ciclo soglia (Ct), tutti i campioni, indipendentemente dalla quantità di DNA di partenza, sono amplificati con la stessa efficienza. La fluorescenza emessa in seguito ad uno specifico irraggiamento da parte della sorgente luminosa del termociclatore viene quindi misurata in tempo reale da una telecamera CCD (charge-coupled device). Tutte le operazioni relative alle misurazioni avvengono sotto il controllo di un software gestito da computer. La Real Time PCR si può realizzare mediante l’impiego di coloranti intercalanti oppure con sonde ad ibridazione specifiche, marcate con molecole fluorescenti. La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che come i primer della PCR, viene disegnata per essere complementare alla sequenza bersaglio del gene da amplificare. Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “reporter” ed all’estremità 3’ una molecola “quencher”. In una configurazione di questo tipo la molecola “quencher” impedisce l’ emissione di fluorescenza da parte del “reporter”. Nel corso della fase di espansione di ogni ciclo di PCR, quando l’enzima Taq Polimerasi incontra l’estremità 5’ della sonda effettua il distacco del reporter. In questo modo il fluoroforo va in soluzione, non subisce più l’inibizione del “quencher” ed emette fluorescenza. In base a questo
meccanismo l’intensità della fluorescenza aumenta in funzione della concentrazione dell’amplificato specifico della reazione. Per la quantificazione sono stati preparati degli standard o calibratori, che contengono plasmidi con sequenza uguale al target di amplificazione a concentrazione nota e scalare mediante i quali il software costruisce la retta di taratura. Lo standard ideale è costituito da una molecola di DNA che presenta una zona di amplificazione del tutto analoga a quella che sarà oggetto di studio. In questo modo si ha una relazione diretta tra la curva di amplificazione degli standard e quella della molecola target e sarà quindi possibile risalire alla concentrazione di quest’ultima (Figura 21).
- QUANTIFICAZIONE DNA VIRALE (EBV e CMV)
Gli estratti di DNA virale del Virus EBV e CMV sono stati analizzati con la metodica utilizzata per la diagnosi di routine, rtq-PCR (Roche, Light Cycler 2.0) (Figura 22).
La tecnologia Light Cycler, prevede lo svolgimento della reazione in capillari di vetro che vengono alloggiati in un rotore all’interno di un termociclizzatore fornito di una lampada UV e di un analizzatore di fluorescenza. Nella miscela di reazione oltre ai primer vengono inseriti anche il “reporter’ e un “quencher” (Lee L.G. et al.1993). Esistono vari tipi di sonde ma in tutte, quando intatte, la fluorescenza del reporter è spenta dalla vicinanza del “quencher”, secondo la legge di Forster, mentre quando il “reporter” ed il “quencher” vengono allontanati l’attività dei fluorocromi viene rilevata. Esistono diversi tipi di “reporter”, per esempio: FAM (6- carbossifluoresceina), TET (tetracloro-6-carbossifluoresceina), JOE (2,7- dimetossi-4,5-dicloro-6-carbossifluoresceina) e HEX (esacloro-6- carbossifluoresceina), mentre come quencher viene utilizzato TAMRA (6-carbossitetrametilrodamina). Il DNA amplificato da reazioni a catena della DNA-polimerasi, viene quantificato ad ogni ciclo di reazione comparando il ciclo a cui viene emessa fluorescenza nel campione da quantificare e in un campione detto standard che contiene un numero di copie di sequenze uguali al target noto detto standard. Le sonde utilizzate per la
rilevazione della carica virale sono di tipo “FRET” in cui il terminale 3’ di una sonda è coniugato con un fluoroforo donatore, mentre il terminale 5’ di una sonda adiacente è marcato con un fluoroforo accettore (Figura 23).
Figura 23: Sonda FRET per REAL-TIME PCR.
L’impiego della RT-PCR in ambito virologico permette una quantificazione dettagliata della carica virale, avendo un “range” dinamico molto ampio (1-1milione di copie rilevate), inoltre l’utilizzo delle sonde permette il controllo della specificità del prodotto amplificato mediante la valutazione della temperatura di Melting. Alla fine di tutti i cicli di amplificazione il termociclizzatore rileva la fluorescenza ad un temperatura uguale a quella di “annealing” delle sonde e durante l’innalzamento graduale della temperatura. Perché il prodotto di amplificazione sia specifico con completa complementarietà con le sonde la fluorescenza deve scomparire ad una temperatura che permette la rottura di tutti i legami tra sonda e target, detta temperatura di “Melting”, specifica per ogni sonda. Se la temperatura alla quale viene rilevata la fluorescenza non è corretta il prodotto amplificato è aspecifico.
VIRUS LOD(Limite di rilevamento) in 200µl di plasma LOD(Limite di rilevamento) in 200µl di sangue Range Quantitativo EBV 229 Cp/ml 359 Cp/ml 1.0x103 – 2.0x107 Cp/ml CMV 235 Cp/ml 392 Cp/ml 1.0x103 – 2.0x107 Cp/ml
Tabella 3 : Caratteristiche prestazionali LightCycler 2.0
Poiché dobbiamo confrontare valori estratti da volumi diversi, successivamente alla quantificazione, è stata effettuata la normalizzazione del volume per quanto riguarda l’analisi dei campioni essiccati su carte da filtro: infatti per i campioni della routine sono stati purificati 200 µl di campione mentre per l’eluato dei dischi si purificano 50 µl di campione.
- QUANTIFICAZIONE DNA VIRALE (HBV)
Gli estratti di DNA virale del Virus dell’Epatite B sono stati quantificati tramite TaqMan (Roche) (Figura 24).
Figura 24: COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HBV versione 2.0, Roche
Il Test COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HBV versione 2.0 è un test di amplificazione dell’acido nucleico in vitro per la quantificazione del DNA del virus dell’epatite B (HBV) nel plasma umano e nel siero tramite lo strumento COBAS Ampliprep per la preparazione automatizzata dei campioni e tramite l’analizzatore COBAS TaqMan per l’amplificazione e la rilevazione automatizzate.
La quantificazione del DNA virale viene eseguita con l’ausilio dello standard di quantificazione (QS) dell’HBV, un costrutto di DNA non infettivo contenente delle sequenze di HBV con siti di legame per il primer identici a quelli del DNA target dell’HBV e un’unica regione di legame per la sonda che consente all’amplicon dello standard (QS) di essere distinto dall’amplicone dell’HBV. Il test prevede l’uso della tecnologia della PCR in tempo reale.(27/28). L’uso di sonde fluorescenti a doppia etichetta permette di rilevare in tempo reale l’accumulo dei prodotti di PCR tramite monitoraggio dell’intensità di emissione dei coloranti fluorescenti del reporter rilasciati durante il processo di amplificazione. Le sonde dell’HBV e dello standard di quantificazione (QS) dell’HBV sono etichettate con fluorocromi reporter diversi. In questo modo l’amplificazione del DNA di HBV e del DNA
del QS di HBV viene misurata indipendentemente a lunghezze d’onda diverse. Questo processo viene ripetuto per un certo numero di cicli. Il ciclo di PCR in cui una curva di crescita innesca una crescita esponenziale è correlato alla quantità di materiale di partenza all’inizio della PCR. I titoli virali sono espressi in Unità Internazionali (IU/mL). Il test è quantitativo in un intervallo dinamico piuttosto ampio compreso tra 20 IU/mL e 1.7E+08 IU/mL.
I risultati ottenuti dall’analisi dei campioni applicati su carta da filtro, sono stati normalizzati per raggiungere il valore di paragone in quanto il volume di partenza di siero di routine che viene caricato nello strumento è 1100 µl mentre il volume di partenza applicato su carta da filtro è notevolmente inferiore, 50 µl.
5.3 ANALISI STATISTICA
L’analisi statistica è stata effettuata, utilizzando il Programma per calcoli statistici “R”, mediante Test di Correlazione e Regressione lineare semplice al fine di valutare la correlazione tra l’analisi di routine e quella effettuata su carta da filtro per quanto riguarda il “range” quantitativo compreso tra 103
e 108 IU/ mL considerato nella rilevazione del virus dell’epatite B.
