LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
ONKOLOGIJOS IR HEMATOLOGIJOS KLINIKA
ONKOLOGIJOS SKYRIUS
SKRANDŽIO VĖŽIO MOLEKULINIŲ
ŽYMENŲ SĄSAJOS SU
MORFOLOGINIAIS IR KLINIKINIAIS
LIGOS YPATUMAIS
Baigiamasis mokslinis darbas
Darbą atliko: Rasa Augustauskaitė
Darbo vadovas: medicinos mokslų daktaras Viktoras Rudžianskas
2
Turinys
1. SANTRAUKA ... 4
2. PADĖKA ... 6
3. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6
5. SANTRUMPOS ... 7
6. SĄVOKOS ... 8
7. ĮVADAS ... 9
8. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 10
9. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
9.1 Skrandžio vėžio epidemiologiniai rodikliai ... 11
9.2 Skrandžio vėžio rizikos veiksniai ... 11
9.3 Skrandžio vėžio morfologija ... 12
9.4 Epigenetinių pokyčių svarba skrandžio vėžio onkogenezėje ... 14
9.5 DNR metilinimo įtaka onkogenezei ... 14
9.6 Histonų modifikacijų įtaka onkogenezei ... 15
9.7 Mikro-RNR vaidmuo onkogenezėje ... 16
9.8 hMLH1 geno funkcija ir jo promotoriaus metilinimo reikšmė onkogenezėje ... 16
9.9 MGMT geno funkcija ir jo promotoriaus metilinimo reikšmė onkogenezėje ... 17
10. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 18
11. TYRIMO REZULTATAI ... 21
11.1 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame audinyje sąsajos su demografiniais duomenimis ir morfologija ... 21
11.2 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame audinyje sąsajos su naviko lokalizacija ... 22
11.3 Geno hMLH1 promotoriaus metilinmo sąsajos su skrandžio vėžio klinikiniais simptomais ... 23
11.4 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su laiku iki atokiųjų metastazių bei lokalaus recidyvo vystymosi ... 23
3 11.6 Geno MGMT promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame audinyje sąsajos su
demografiniais duomenimis ir morfologija ... 26
11.7 Geno MGMT promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame audinyje sąsajos su naviko lokalizacija... 28
11.8 Geno MGMT promotoriaus metilinmo sąsajos su skrandžio vėžio klinikiniais simptomais ... 28
11.9 Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su laiku iki atokiųjų metastazių ir lokalaus recidyvo vystymosi ... 29
11.10 Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru išgyvenamumu ... 31
12. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33
13. IŠVADOS ... 36
4
1. SANTRAUKA
Skrandžio vėžio molekulinių žymenų sąsajos su morfologiniais ir klinikiniais
ligos ypatumais
Autorė: Rasa Augustauskaitė
Tyrimo tikslas - nustatyti molekulinių pokyčių skrandžio navikiniame audinyje sąsajas su
demografiniais rodikliais, morfologiniais ir klinikiniais skrandžio vėžio požymiais.
Tyrimo uždaviniai: įvertinti su DNR pažaidų atitaisymu susijusių MLH1, MGMT genų
metilinimo skrandžio navikiniame audinyje ryšį su morfologiniais ligos ypatumais; naviko vieta; klinikiniais simptomais ir demografiniais rodikliais; ligos bendru išgyvenamumu, lokalaus recidyvo ir atokiųjų metastazių vystymusi.
Metodai: tyrime dalyvavo 80 pacientų, kuriems Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno
klinikose 2010-2012 metais diagnozuota skrandžio adenokarcinoma. Tirti skrandžio vėžinio audinio biopsijos mėginiai. hMLH1, MGMT genų metilinimo statusui nustatyti naudodas DNA Methylation Gold Kit™ (Zymo Research) rinkinys. Pacientų duomenys tyrimui rinkti iš medicininės dokumentacijos.
Tyrimo rezultatai ir išvados: esant metilintam MGMT geno promotoriui, naviko augimo tipas
dažniau difuzinis (p = 0,03), statistiškai patikimas ryšys tarp hMLH1, MGMT metilinimo ir TNM kategorijų, diferenciacijos laipsnio nenustatytas, esant metilintam hMLH1 geno promotoriui, HER2 receptorių raiška dažniau neigiama (p = 0,04), MGMT – dažniau teigiama (p = 0,01). Esant metilintiems hMLH1, MGMT, navikas dažniau vystosi skrandžio apatiniame trečdalyje (hMLH1, p = 0,04, MGMT – 0,01). Pacientams, kuriems metilintas hMLH1, MGMT promotorius, dažniau pasireiškia disfagija, svorio kritimas > 5 kilogramai (hMLH1, p = 0,01,
MGMT – 0,02), o esant metilintam hMLH1 geno promotoriui, dažniau pasireiškia ir vėmimas
(p = 0,03); pacientai, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, dažniau yra vyriškos lyties (p = 0,03) bei skrandžio adenokarcinoma suserga > 65 metų amžiuje (p = 0,02), o kuriems metilintas MGMT – < 65 metų (p = 0,04). Statistiškai patikimo ryšio tarp hMLH1, MGMT metilinimo ir atokiųjų metastazių formavimosi dažnio, laiko iki atokiųjų metastazių, lokalaus recidyvo išsivystymo, bendro išgyvenamumo nėra (p > 0,05).
5
ABSTRACT
Gastric cancer molecular markers interfaces with morphological and
clinical features of the disease
Author: Rasa Augustauskaitė
The aim - to identify molecular changes in gastric tumor tissue interfaces with demographic
indicators, morphological and clinical signs of gastic cancer.
The objectives: to assess relationschip between DNA reparation related hMLH1, MGMT genes
methylation in gastric tumor tissue and morphological features of the disease; location of the tumor; clinical symptoms and demographic indicators; overall survival, local relapse and development of distant metastasis.
Methods: the study included 80 patients with gastric adenocarcinoma which was diagnosed in
Lithuanian University of Health Sciences Kaunas Clinics in 2010-2012. Gastric cancer tissue biopsy samples were investigated. hMLH1, MGMT gene methylation status was set by using DNA Methylation Gold Kit™ (Zymo Research). Data of the patients were collected from medical documentation.
Results and conclusions: MGMT promoter methylation is related with diffuse tumor growth
type (p = 0.03), statistically significant relationship between hMLH1, MGMT methylation and TNM categories, degree of differentiation has not been established. When hMLH1 promoter is methylated, expression of HER2 receptor is often negative (p = 0.04), MGMT - often positive (p = 0.01). hMLH1, MGMT promoter methylation is more often found in the lower third of the stomach (hMLH1, p = 0.04, MGMT - 0.01). Patients with methylated hMLH1, MGMT promoter, are more often suffering from dysphagia, weight loss >5 kilograms (hMLH1, p = 0.01, MGMT - 0.02), and those who have hMLH1 methylation, are suffering from vomiting as well (p = 0.03); hMLH1 promoter methylation is related with male gender (p = 0.03) and older age (> 65 years old) (p = 0.02) and MGMT methylation is related with junger age (<65 years old) (p = 0.04). Statistically reliable relationschip between hMLH1, MGMT methylation and distant metastasis formation rate, time to formation of distant metastasis, development of local relapse, overall survival was not been observed (p > 0.05).
6
2. PADĖKA
Dėkoju savo mokslinio darbo vadovui medicinos mokslų daktarui Viktorui Rudžianskui už pagalbą planuojant ir vykdant tyrimą. Taip pat nuoširdų padėkos žodį noriu tarti medicinos mokslų daktarei Ritai Kupčinskaitei-Noreikienei formuluojant darbo uždavinius, rengiant anketas, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Virškinimo sistemos tyrimų instituto klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorijos darbuotojoms, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno klinikų bei filialo Onkologijos ligoninės konsultacinės poliklinikos ir archyvo darbuotojoms renkant pacientų medicininę dokumentaciją.
3. INTERESŲ KONFLIKTAS
Rengiant darbą, interesų konflikto nebuvo.4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
2015 metų sausio 9 dienos Lietuvos sveikatos mokslų Bioetikos centro nutarimu pritarta tyrimo vykdymui. Nutarimo protokolo nr. BEC-MF-305. Tyrimo dalyviai savo sutikimą dalyvauti tyrime patvirtino pasirašydami asmens informavimo ir sutikimo formoje.
7
5. SANTRUMPOS
CpG – citozinas-fosfatas-guaninas DNR – deoksiribonukleorūgštis HATs – histonų aceltiltransferazės HDACs – histonų deacetilazė
hMLH1 – žmogaus mutL homologas 1, storosios žarnos vėžys, nepolipozinis tipas 2 (E.Coli) L – naviko peraugimas į limfagysles
MGMT – O6-metilguanino-DNR-metiltransferazė
miRNR – mikro-ribonukleorūgštis RNR – ribonukleorūgštis
8
6. SĄVOKOS
Adenokarcinoma – piktybinis liaukinio epitelio navikas.
CpG salos – citozino-fosfato-guanino sekomis turtingi židiniai, asimetriškai išsidėstę visame
genome.
DNR reparacija – procesas, kurio metu specifiniai fermentai taiso DNR replikacijos metu
atsiradusias klaidas arba mutageninių veiksnių sukeltas pažaidas.
Epigenetika – studijos, tiriančias keičiančius genų ekspresiją, bet nekeičiančius pirminės DNR
struktūros, mechanizmus.
Genas supresorius – genas, reguliuojantis nealelinių genų veikimą, tų genų lemiamų
požymių reiškimąsi organizme.
HER2 receptorius – žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorius 2.
Histonai – chromatino šerdinės dalies baltymai, apie kuriuos išsidėsčiusi DNR grandinė.
Lauren klasifikacija – skrandžio vėžio morfologinė klasifikacija, pagal kurią yra skiriami
žarninis, difuzinis ir mišrus naviko augimo tipai.
Mikro-RNR – trumpos, nekoduojančios RNR sekos, sudarytos iš 20-24 nukleotidų.
TNM klasifikacija – tarptautinė onkologinių ligų klasifikacijos sistema, skirta aprašyti
piktybinio naviko išplitimą ir stadiją (T – pirminis navikas, N – išplitimas į sritinius limgmazgius, M – atokiosios metastazės).
9
7. ĮVADAS
Skrandžio vėžys onkologinių ligų struktūroje išlieka vienu iš dažniausių vėžinių susirgimų ir mirties dėl onkologinių ligų priežastimi. Dėl specifinių ankstyvų klinikinių požymių stokos daugelis skrandžio vėžio atvejų nustatoma vėlyvoje stadijoje, kai jau negalimas efektyvus ar radikalus gydymas [3].
Šios ligos onkogenezėje svarbūs genetiniai ir epigenetiniai veiksniai. Pastaruoju metu atliekama daug mokslinių studijų, siekiant išsiaiškinti sudėtingų epigenetinių pokyčių svarbą skrandžio vėžio iniciacijai, vystymuisi bei progresavimui. Ateities tikslai yra epigenetinius pokyčius, kuriems priskiriamos DNR metilinimas, histonų modifikacijos ir nekoduojančios mikro-RNR pokyčiai [17], pritaikyti klinikinėje praktikoje kaip neinvazinius diagnostinius ir prognostinius veiksnius bei atliekant mokslinius tyrimus atrasti naujas, dar nežinomas jų pritaikymo onkologijoje galimybes.
Sudėtingame onkogenezės procese svarbus vaidmuo tenka mūsų darbe analizuotiems
hMLH1 ir MGMT genams bei jų promotorių metilinimui vykstant epigenetiniams procesams,
dėl kurių sutrinka minėtų genų funkcija DNR pažaidų atitaisyme.
Literatūroje nurodomi prieštaringi duomenys apie hMH1 ir MGMT genų promotorių metilinimo sąsajas su skrandžio vėžiu sergančių pacientų demografiniais rodikliais, morfologinėmis charakteristikomis bei naviko lokalizacija, trūksta duomenų apie šio epigenetinio pokyčio ryšį su klinikiniais simptomais, lokalaus recidyvo, atokiųjų metastazių formavimusi. Tai ir sieksime ištirti savo moksliniame darbe, tikėdamiesi, jog gauti duomenys papildys žinias apie skrandžio vėžį.
10
8. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Nustatyti molekulinių pokyčių skrandžio navikiniame audinyje sąsajas su demografiniais rodikliais, morfologiniais ir klinikiniais skrandžio vėžio požymiais.
Darbo uždaviniai
1. Įvertinti su DNR pažaidų atitaisymu susijusių MLH1, MGMT genų metilinimo navikiniame audinyje ryšį su morfologiniais ligos ypatumais
2. Įvertinti, ar genų MLH1, MGMT metilinimas skrandžio adenokarcinomos audinyje priklauso nuo naviko vietos.
3. Įvertinti genų MLH1 ir MGMT promotorių metilinimo sąsajas su skrandžio adenokarcinomos klinikiniais simptomais ir demografiniais rodikliais.
4. Įvertinti genų MLH1, MGMT metilinimo navikiniame audinyje įtaką skrandžio vėžio bendram išgyvenamumui, lokalaus recidyvo ir atokiųjų metastazių vystymuisi.
11
9. LITERATŪROS APŽVALGA
9.1 Skrandžio vėžio epidemiologiniai rodikliai
Skrandžio vėžys yra ketvirtas dažniausiai diagnozuojamas vėžys visame pasaulyje ir ir užima antrą vietą pagal mirtingumą nuo vėžinių ligų. [1]. Nors ligos dažnis per pastaruosius du dešimtmečius ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse buvo ženkliai sumažintas dėl taikomo efektyvaus gydymo, tačiau kiekvienais metais pasaulyje diagnozuojama daugiau nei vienas milijonas naujų šio susirgimo atvejų ir 850 000 mirčių dėl jo. Dėl specifinių ankstyvų klinikinių simptomų stokos, daugelis skrandžio vėžio atvejų nustatoma vėlyvoje stadijoje, kai jau negalimas efektyvus ar radikalus gydymas. [3]
Sergamumas skrandžio vėžiu yra skirtingas įvairiose geografinėse vietovėse, didžiausias sergamumas yra rytų Azijoje, ypač Pietų Korėjoje, Mongolijoje , Japonijoje ir Kinijoje. [2]
Remiantis Lietuvos vėžio regitro duomenimis, šalyje sergamumas skrandžio vėžiu mažėja: 2000 m. užregistruoti 1034, 2004 m. – 974, 2008 m. – 836 nauji skrandžio vėžio atvejai. 2011 metais iš 100 000 gyventojų skrandžio vėžys diagnozuotas 26,9 vyrų ir 21 moterų. Tačiau 45–48 % iš visų naujų atvejų nustatomi III-IV stadijos.
9.2 Skrandžio vėžio rizikos veiksniai
Manoma, kad vienas iš svarbiausių skrandžio vėžio rizikos veiksnių yra Helicobacter
Pylori (H.pylori) infekcija. H. pylori infekcijos patogenezę ir ligos pasekmes lemia sudėtinga
sąveika tarp bakterinių virulentiškumo faktorių, makroorganizmo ir aplinkos veiksnių. [3]. Kai
H.Pylori patenka į skrandį, yra keturi kritiškai svarbūs faktoriai, užtikrinantys sėkmingą
bakterijos kolonizaciją: 1) išgyvenamumas rūgštinėje skrandžio aplinkoje (bakterija skaido ureazę ir taip neutralizuoja skrandžio rūgščių poveikį); 2) judėjimas link epitelinių ląstelių dėl žiuželių veiklos; 3) prisitvirtinimas prie skrandžio ląstelių dėl adhezijos ir receptorinės sąveikos; 4) audinių žalojimas dėl toksinų išskyrimo (bakterija išskiria keletą efektorinių baltymų arba toksinų, tarp jų vakuolizuojantį citotoksiną A) . Pažeistas skrandžio epitelinis
12 sluoksnis inicijuoja imuninį atsaką, aktyvuojami neutrofilai, o tai lemia gastrito ir skrandžio opaligės vystymąsi [3].
Makroorganizmo ląstelių stresinis atsakas, įskaitant ir uždegiminį atsaką, glaudžiai susijęs su šios gramneigiamos bakterijos indukuojama skrandžio onkogeneze. Nustatyta, kad
H.Pylori indukuoja Lon proteazę-1, kuri reguliuoja metabolinį pertvarkymą mitochondrijų
lygmenyje, ekspresiją ir taip skatinama ląstelių proliferaciją [4]. Nors nustatytas svarbus
H.Pylori vaidmuo skrandžio vėžio patogenezėje, tačiau tik mažiau nei 0,5% infekuotų žmonių
išsivysto skrandžio adenocarcinoma. Papildomi faktoriai, didinantys krandžio vėžio vystymosi tikimybę, yra tabakas, alkoholio vartojimas ir gausus druskos vartojimas. [5]. Epstein–Barr virusas priežastiniu ryšiu yra susijęs su skrandžio vėžiu. Su šiuo virusu asocijuotas lėtinis gastritis yra apibrėžiamas kaip lėtinės Epstein-Barr infekcijos neoplastinėse ląstelėse buvimas [7].
Minėtas virusas nėra integruojamas į šeimininko ląstelių DNR, bet išlieka kaip episominė cirkuliuojanti forma infekuotų ląstelių branduolyje ir nepriverčią šeimininko ląstelių produkuoti viruso sudedamųjų dalių. Virusas sinchroniškai replikuojasi su šeimininko ląstelių chromosomomis jų dalijimosi metu [8]. Atlikus metaanlizę nustatyta, kad 8,7 proc.sergančių skrandžio vėžiu yra infekuoti šiuo virusu [6].
Patologinėmis ir epidemiologinėmis studijomis buvo įrodytas žmogaus skrandžio vėžio onkogenezės modelis pagal šią nuoseklią seką: lėtinis gastritis; atrofija; intestinalinė metaplazija; displazija ir skrandžio karcinoma [9].
9.3 Skrandžio vėžio morfologija
Remiantis 2010 metų Pasaulinės sveikatos organizacijos skrandžio vėžio histologine klasifikacija, yra išskiriami keturi pagrindiniai histologiniai skrandžio vėžio tipai: tubulinė, papilinė, mucininė ir blogai diferencijuota adenokarcinoma (įskaitant signetinių žiedinių ląstelių karcinomą) ir kiti retesni histologiniai variantai [10]. Prie retų skrandžio navikų priskiriama adenoskvamozinė karcinoma, plokščių ląstelių karcinoma, hepatoidinė adenocarcinoma, parietalinių ląstelių karcinoma, Paneto ląstelių karcinoma, mišri adenoneuroendoktininė karcinoma ir kitos karcinomos [11].
13 Pagal Lauren klasifikaciją, sukurtą 1965 metais, skrandžio vėžys klasifikuojamas į du pagrindinius tipus: intestinalinį ir difuzinį, bei rečiau pasitaikantį mišrų tipą.[12]. Šie skirtingi tipai turi keletą klinikinių ir molekulinių charakteristikų skirtumų, įskaitant etiologiją, onkogenezę, epidemiologiją ir progresavimą, mikro-ribonukleorūgščių ir/arba baltymų ekspresijos profilį, mikrosatelitų nestabilumą ir mutacijų profilį [13]. Žarninio tipo navikuose vėžinės ląstelės yra sukibusios ir formuoja tubulines arba liaukines struktūras, bei yra dažniau susijusios su žarnine metaplazija [12]. Šio skrandžio vėžio tipas pasižymi invazija į kraujagysles ir limfagysles ir dažniau pasireiškia vyresnio amžiaus vyrams, pažeidžia antruminę skrandžio dalį ir sietinas su geresne prognoze [14,15]. Dizufinio tipo skrandžio navike maligninės ląstelės prastai sukimba ir infiltruoja skrandžio stromą kaip pavienės ląstelės arba mažos subgrupės [14]. Dizufinis tipas siejamas su jaunesniu pacientų amžiumi ir moteriška lytimi [12]. Šis skrandžio vėžio histologinis tipas paprastai pažeidžia skrandžio kūną ir turi blogesnę prognozę palyginus su žarniniu tipu [14]. Lauren klasifikacijos sąsajos su Pasaulinės sveikatos organizacijos histologine skrandžio vėžio klasifikacija pateiktos 1 lentelėje [11].
1 lentelė. Skrandžio adenokarcinomų klasifikacija
(Bing Hu, Nassim El Hajj, Scott Sittler, Nancy Lammert, Robert Barnes, Aurelia Meloni-Ehrig)
Pasaulinė sveikatos organizacija (2010) Lauren klasifikacija (1965)
Papilinė adenokarcinoma Tubulinė adenokarcinoma Mucininė adenokarcinoma
Intestinalinis tipas
Signetinių-žiedinių ląstelių karcinoma
Kitos prastai kohezinės karcinomos Difuzinis tipas
14
9.4 Epigenetinių pokyčių svarba skrandžio vėžio onkogenezėje
Skrandžio vėžio inicijacijos pradžia ir progresavimas yra kontroliuojami genetinių ir epigenetinių veiksnių. Epigenetikos terminas 1942 metais buvo pirmą kartą pavartotas C.H.Waddingtono kaip „priežastinė sąveika tarp genų ir jų produktų, kuri leidžia egzistuoti fenotipui“, apimant chromatino struktūros ir jo įtakos genų funkcijai suvokimą [16].
Šiuo metu epigenetika apima studijas, tiriančias keičiančius genų ekspresiją, bet nekeičiančius pirminės DNR struktūros, mechanizmus. Epigenetiniai pakitimai, apimantys DNR metilinimą, histonų modifikavimą, nekoduojančios mikroRNR tyliuosius genetinius pokyčius, yra grįžtami ir paveldimi. Šios modifikacijos veikia kartu, keisdamos lokalią struktūrinę chromatino dinamiką, pirmiausiai reguliuojant jos prieinamumą ir kompaktiškumą, ir taip reguliuodamos genomo funkcionavimą. Epigenetinių procesų sutrikimas gali lemti pakitusią genų supresorių funkciją ir maligninę ląstelių transformaciją.[17].
9.5 DNR metilinimo įtaka onkogenezei
DNR metilinimas pirmiausiai apima metilo cheminės grupės (-CH3-) prijungimą,
veikiant fermentui DNR-metiltransferazei, prie 5’-gale esančio citozino anglies atomo, kaip metilo grupės donorą panaudojant S-adenosilmetioniną ir susidarant 5-metilcitozinui.
Citozino-fosfato-guanino (CpG) sekomis turtingi židiniai yra asimetriškai išsidėsčiusios
visame genome, dažniausiai susitelkę trumpais „CpG salomis“ vadinamais regionais, ir didelių pasikartojančių sekų, tokių kaip centromeriniai pasikartojimai, retrotransportinių elementų ir kitų struktūrų, regionais. CpG salose guanino ir citozino nukleotidai yra išsidėstę DNR linijinėje sekoje pagal schemą: 5’ – citozino nukleotidas – fosfatas – guanino nukleotidas – 3’ [19]. Ankstesnėse studijose nustatyta, kad apie 60 % žmogaus genų yra susiję su CpG salomis, iš kurių didžioji dauguma yra nemetilintos visų audinių tipų visose vystymosi stadijose [18].
Daug tyrimų įrodė, kad promotoriuose esančių CpG salų metilinimas vaidina svarbų vaidmenį onkogenezėje [20]. Padidėjęs DNR hipometilinimas yra būtinas veiksnys onkogenezėje, nes indukuoja chromosominius pertvarkymus, kurie sukelia genomo
15 nestabilumą [22]. DNR hipometilinimas skrandžio karcinomose yra susijęs su ląstelių proliferaciją skatinančiais genų, tokių kaip serino proteazės inhibitorius, aktyvacija [21].
Skirtingai nei DNR hipometilinimo atveju, CpG salų hipermetilinimas indukuoja onkogenezę nuslopinant genų supresorių ekspresiją. Tai gali būti pasiekta tiesiogiai slopinant naviko genus suprespresorius arba netiesiogiai slopinant naviko genų supresorių transkripcijos faktorius ir apsaugant nuo DNR reparacijos poveikio [23].
9.6 Histonų modifikacijų įtaka onkogenezei
Histonai yra oktameriniai chromatino šerdinės dalies baltymai, apie kuriuos išsidėsto iš 146 bazių porų sudarytas DNR superheliksas. Histono struktūroje išskiriamas sferinis C-galas ir nestruktūrinis N-C-galas [25]. Prie histonų modifikacijų yra priskiriami šie cheminiai kitimai: acetilinimas, fosforilinimas, metilinimas (lizino ir arginino aminiorūgščių) ir kitos modifikacijos (deiminacija, ribosilinimas, ubikvitinimas, sumoilinimas, histonų uodegos karpymas, histonų prolino izomerizacija) [26]. Kiekvieno histono modifikacija gali pakeisti bendrą chromatino struktūrą ir taip pat paveikti genų ekspresiją keičiant DNR kondensaciją arba veikiant efektorines molekules, kurios kontroliuoja genų ekspresiją. Skirtingai nei DNR metilino procese, histonų modifikacijos yra tiesiogiai susijusios tiek su genų aktyvacija, tiek su genų represija, atsirandant individualioms mutacijoms arba modifikuojant specifinius genomo regionus. [24].
Histonų acetilinimas yra vykdomas fermento histonų aceltiltransferazės (HATs), kurios yra skyriami A ir B tipai. Fermentas skaido acetil-CoA kaip kofaktorių ir katalizuoja acetilo grupės pernešimą prie amonorūgšties lizono ε-amino grupės. Dėl šios reakcijos neutralizuojamas lizino teigiamas krūvis, o tai susilpnina histonų ir DNR tarpusavio sąveiką [27].
Skirtingai nei acetilinimas, histonų metilinimas nesukelia histonų baltymų pasikeitimo [26]. Histonų deacetilazė (HDACs), kuri katalizuoja histonų deacetilinimą, yra svarbi genų ekspresijos epigenetinėje kontrolėje [28]. HDACs yra daugiau ekspresuojama įvairių susirgimų, tarp jų ir vėžinių, metu [29]. Kelios histonų metiltrasferazės, veikdamos DNR metiltrasferazes, gali tiesiogiai veikti DNR metilinimo procesą ir sukelti specifinius genomo
16 pokyčius [26]. Atliekami moksliniai tyrimai siekinat pritaikyti histonų deacetilazės inhibitotius įvairių vėžinių susirgimų gydyme.
9.7 Mikro-RNR vaidmuo onkogenezėje
Mikro-RNR (miRNR) yra trumpos, nekoduojančios ribonukleorūgščių (RNR) sekos, sudarytos iš 20-24 nukleotidų. Jos lemia daug su onkogeneze susijusių procesų, tokių kaip proliferacija, ląstelių dalijimosi ciklo kontrolė, apoptozė, diferenciacija, migracija ir metabolizmas [30]. Specifinės miRNR jungiasi su informacine RNR pagal komplementiškumo principus, dėl ko yra blokuojami transliacijos procesai genų ekspresijos metu [31]. Nustatyta, jog miRNR identifikavimas gali būti naudojamas kaip vėžinių susirgimų prognostinis faktorius, klasifikacijos kriterijus, prognostinis gydymo faktorius, neinvazinis vėžio
laboratorinis žymuo [32]. Nustatyta, kad onkogeninė miRNR yra gausiau ekspresuojama
daugelio vėžinių susirgimų metu, įskaitant krūties, plaučių, skrandžio vėžį ir tai siejama su blogesnėmis ligos išeitimis [33].
MiRNR ekpresijos raiška dažnai atspinti naviko embrioninę arba vystymosi kilmę, dėl ko vėžiniai susirgimai gali būti klasifikuojami atsižvelgiant į šio žymens ekspresiją [34].
Atliekamos studijos, siekinat plačiau pritaikyti miRNR klinikinėje praktikoje.
9.8 hMLH1 geno funkcija ir jo promotoriaus metilinimo reikšmė
onkogenezėje
Žmogaus mutL homologas 1, storosios žarnos vėžys, nepolipozinis tipas 2 (E.Coli)
(hMLH1) geno koduojamas baltymas yra vienas iš svarbiausių DNR reparacijoje dalyvaujančių baltymų, lokalizuotas 3p21.3 chromosomoje. hMLH1 geno produktas jungiasi su PMS2 baltymu, susidarant aktyviam DNR reparacijoje dalyvaujančių baltymų funkciją kordinuojančių baltymų kompeksui [35].
17
hMLH1 geno, dalyvaujančio DNR reparacijoje, promotoriaus CpG salų metilinimas
gali trikdyti geno promotoriaus ir transkripcijos faktorių susijungimą, kas skatina naviko formavimąsi [36].
Analizuojamo geno promotoriaus metilinimas gali būti svarbus molekulinis pokytis, lemiantis ankstyvą skrandžio vėžio progresavimą [37]. hMLH1 geno metilinimas skrandžio vėžio navikiniame audinyje siekia 24% [38].
9.9 MGMT geno funkcija ir jo promotoriaus metilinimo reikšmė
onkogenezėje
O6-Metilguanino-DNA-metiltransferazė (MGMT) geno koduojamas baltymas,
atsakingas už guanino O6
-pozicijoje esančios metilo grupės pašalinimą ir jos prijungimą prie savo 145 kodono, dėl ko reparuodamas guaniną inaktyvuoja pats save [39].
Alkilinantys kancerogenai, tokie kaip N-Nitrosodimetilaminas, metil-nitoso-šlapalas, lemia O6-metilguanino susidarymą, kuris indukuoja mutacijos guaninas:citozinas – adenozinas:timinas perėjimą ir vėžinio proceso vystymąsi [40].
18
10. TYRIMO METODIKA IR METODAI
Tyrime dalyvavo 80 pacientų, kuriems 2010-2012 metais diagnozuota skrandžio adenokarcinoma. Pacientai 2010-2015 metais gydyti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno klinikų onkologijos skyriuje ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto filialo Onkologijos ligoninės koncervatyviosios onkologijos skyriuje.
Skrandžio vėžinio audinio biopsijos mėginiai genetiniams tyrimams paimti atliekant fibroezofagogastroduodenoskopiją arba taikant chirurginį skrandžio vėžio gydymą. Skrandžio vėžinio audinio biopsijos mėginiai buvo padalinti į dvi dalis: skirta patohistologiniams tyrimams dalis fiksuota 10% formalino tirpalu ir siųsta tyrimams į Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Patologinės anatomijos kliniką, o skirta molekuliniams genetiniams tyrimams dalis buvo užšaldyta skystame azote ir iki genų promotorių metilinimo tyrimų inkubuota 800
C tempetarūroje. Molekuliniai genetiniai tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Virškinimo sistemos tyrimų instituto klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorijoje.
Atliekant molekulinius genetinius tyrimus, iš skrandžio vėžinio audinio biopsijos mėginio pirmiausiai išskirta deoksiribonukleorūgštis (DNR), kuri modifikuota natrio bisulfatu. Tiriamų genų promotorių statusui nustatyti naudotas DNA Methylation Gold Kit™ (Zymo Research) rinkinys. hMLH1 ir MGMT genų promotorių metilinimui tirti naudota metilimui jautri polimerazės grandininė reakcija. Jos metu gauti produktai atskirti pritaikius elektroforezės metodą. Teigiama kontrolė atlikta naudojant žmogaus DNR modifikuotą Sss I
metiltransferazę („New England Biolabs“, JK), neigiama – iš periferinio kraujo mėginio
leukocitų išskirtą DNR. Atliktas rezultatų vizualizavimas.
Pacientų duomenys tyrimui rinkti iš medicininės dokumentacijos Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno klinikų registratūros ir archyvo bei Lietuvos sveikatos mokslų universiteto filialo Onkologijos ligoninės registratūros ir archyvo.
Tiriamųjų amžiaus aritmetinis vidurkis 65,8 metais (pasiskirstymo intervalas 25-87 metai). Pacientų pasiskirstymas pagal amžių ir lytį pateiktas 2 lentelėje.
19
2 lentelė. Pacientų pasiskirstymas pagal demografinius duomenis
Demografinis duomuo Pacientų skaičius (N=80) Procentinė išraiška Amžius (metais) <65 20 25% >65 60 75% Lytis Vyras 50 62,5% Moteris 30 37,5%
Statistiškai patikimos priklausomybės tarp amžiaus ir lyties grupių nenustatyta (Fišerio testas, p = 0.51).
Duomenys apie pacientų pasiskirstymas pagal morfologines charakteristikas (TNM klasifikaciją, diferenciacijos laipsnį G, augimo tipą pagal Lauren klasifikaciją) bei naviko invazija į karujagysles ir limgafysles pateikti 3 lentelėje (p < 0.05). Tiriamiesiems dažniausiai buvo nustatomas T3 ir T4 kategorijos į sritinius limfmazgius išplitęs, be atokiųjų metastazių skrandžio vėžys. Didžiąjai daliai pacientų skrandžio adenocarcinoma buvo blogai diferencijuota (G2-G4 diferenciacijos laipsnio), peraugusi į kraujagysles ir limfagysles. Pagal
Lauren klasifikaciją tiriamųjų grupėje dažniausiai pasitaikantis augimo tipas buvo žarninis.
Šešiems pacientams buvo nustatytas mišrus tipas, tačiau dėl mažos imties jie buvo priskirti agresyvesniam difuziniam augimo tipui.
3 lentelė. Pacientų pasiskirstymas pagal morfologines charakteristikas bei naviko peraugimą į
kraujagysles ir limfagysles
Morfologinė charakteristika Pacientų skaičius (N=80) Pacientų skaičiaus procentinė išraiška T kategorija T1 8 10% T2 12 15% T3 35 43,75% T4 25 31,25% N kategorija N0 19 23,75% N1-3 61 76,25%
20 M kategorija M0 77 96,25% M1 3 3,75% Diferenciacijos laipsnis G G1 1 1,25% G2 34 42,5% G3 43 53,75% G4 2 2,5% Peraugimas į kraujagysles (V) V0 26 32,5% V1 54 67,5% Peraugimas į limfagysles (L) L0 19 23,75% L1 61 76,25%
Lauren klasifikacija Žarninis 41 51,25%
Difuzinis 39 48,75%
Tiriamųjų grupėje neigiama HER2 receptorių raiška nustatyta 53 pacientams (66,25%; N=80), teigiama raiška 27 (33,75%; N=80). Tiriamųjų grupėje HER2 receptorių raiška dažniau buvo neigiama (p < 0,05).
Iš 80 pacientų navikas lokalizuotas viršutiniame skrandžio trečdalyje 9, viduriniame – 38, apatiniame – 33 pacientams.
Matematinė ir statistinė duomenų analizei naudota “SSPS Statistics 23” kompiuterinė programa. Kiekybiniai duomenys aprašyti skaičiuojant aritmetinį vidurkį ir nurodant duomenų pasiskirstymo intervalo ribas bei skaičiuojant standartinį nuokrypį. Kintamųjų rodiklių priklausomumui nustatyti naudoti Chi kvadrato (χ2), Fišerio testai SSPS programoje. Išgyvenamumų analizėms vertinti naudotas Kaplan-Meier metodas, išgyvenamumų analizės tarp grupių palyginimui naudotas Long-rank testas.
21
11. TYRIMO REZULTATAI
11.1 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame
audinyje sąsajos su demografiniais duomenimis ir morfologija
Iš visų tiriamųjų (N=80) hMLH1 geno promotoriaus metilinimas nustatytas 24 pacientams (30% visų pacientų), iš jų 9 moterys ir 15 vyrų. Palyginus su grupe, kurioje geno promotorius nemetilintas, gautas statistiškai reikšmingas pasiskirstymas tarp lyčių – pacientai, kuriems nustatytas šis epigenetinis pokytis, dažniau yra vyriškos lyties (Fišerio testas, p = 0.03).
Iš 24 pacientų 22 susirgo būdami vyresni nei 65-erių metų ir 2 pacientai jaunesni nei 65-erių metų. Pacientai, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, dažniau suserga skrandžio vėžio adenokarcinoma vyresni nei 65-erių metų (Fišerio testas, p = 0.02).
4 lentelėje pateiktos tiriamųjų, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, morfologinės charakteristikos ir palyginimas su grupe, kurioje geno promotorius nemetilintas.
4 lentelė. Pacientų, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, pasiskirstymas pagal
morfologines charakteristika, peraugimą į kraujagysles,limfagysles ir palyginimas su grupe, kurioje genas nemetilintas
Morfologinė charakteristika Pacientų skaičius (N=24) Pacientų skaičiaus procentinė išraiška p reikšmė (palyginus su grupe, kurioje hMLH1 nemetilintas) T kategorija T1 1 4,17% 0.27 T2 3 12,5% T3 9 37,5% T4 11 45,83% N kategorija N0 5 20,83% 0.46 N1-3 19 79,17% M kategorija M0 23 95,83% 0.66
22 M1 1 4,17% Diferenciacijos laipsnis G G1 0 0% 0.58 G2 9 37,5% G3 15 62,5% G4 0 0% Peraugimas į kraujagysles (V) V0 8 33,33% 0.56 V1 16 66,67% Peraugimas į limfagysles (L) L0 6 25% 0.54 L1 18 75% Lauren klasifikacija Žarninis 11 45,83% 0.35 Difuzinis 13 54,17%
Vertinant gautus rezultatus, galima teigti, jog geno hMLH1 promotoriaus metilinimas neturi sąsajų su tirtomis morfologinėmis charakteristikomis (TNM kategorijomis, diferenciacijos laipsniu, augimo tipu pagal Lauren klasifikaciją) bei peraugimu į kraujagysles ir limfagysles (p > 0.05).
Pacientams, kuriems nustatytas epigenetinis pokytis, HER2 receptorių neigiamos raiškos skrandžio vėžio navikiniame audinyje dažnis 37,74%, teigiamos raiškos – 14,81%. Esant metilintam hMLH1 geno promotoriui, HER2 receptorių raiška dažniau neigiama (Fišerio testas, p = 0.04).
11.2 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame
audinyje sąsajos su naviko lokalizacija
Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame audinyje dažnis skrandžio viršutiniame trečdalyje 11,11% (hMLH1 metilintas 1 pacientui, N=9), viduriniame – 21,05% (hMLH1 metilintas 8 pacientams, N=38), apatiniame – 45,45% (hMLH1 metilintas 15 pacientų, N=33). Esant metilintam hMLH1 geno promotoriui, skrandžio adenokarcinoma dažniau vystosi skrandžio apatiniame trečdalyje (p = 0.04).
23
11.3 Geno hMLH1 promotoriaus metilinmo sąsajos su skrandžio vėžio
klinikiniais simptomais
Iš tiriamųjų medicininės dokumentacijos buvo rinkti duomenys apie penkis skrandžio vėžio klinikinius simptomus: dispensinius reiškinius, disfagiją, vėmimą, svorio kritimą (>5 kilogramai) ir palpuojamą navikinę masę. Dispensiniai reiškiniai nustatyti visiems tiriamiesiems, palpuojama navikinė masė – nei vienam. Gauti duomenys pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. Pacientų, kuriems nustatytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, klinikinių
simpromų palyginimas su pacientų, kuriems epigenetinis pokytis nenustatytas (kontrolinė grupė), klinikiniais simptomais
Skrandžio vėžio klinikinis požymis Pacientų, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, procentinė išraiška (N=24) Pacientų, kuriems nenustaytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, procentinė išraiška (N=25) p reikšmė (Fišerio testas) Disfagija 66,67% 8% 0.01 Vėmimas 62,50% 36% 0.03 Svorio kritimas >5 kilogramai 79,17% 40% 0.01
Disfagija, vėmimas ir svorio kritimas >5 kilogramai statistiškai reikšmingai dažniau pasireiškia pacientams, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius. Tačiau vertinant disfagijos pasireiškimą, reikia atisžvelgti į tai, jog daugelis pacientų tiriamųjų grupėje yra geriatrinio amžiaus (>65 metai), todėl šis klinikinis simptomas gali atsirasti ir dėl kitų priežasčių.
11.4 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su laiku iki atokiųjų
metastazių bei lokalaus recidyvo vystymosi
Atokiosios metastazės atsirado 16 pacientų (66,67%), kuriems nustatytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, ir 12 pacientų (42,86%) kontrolinėje grupėje. Matome, kad
24 pacientams su tiriamu epigenetiniu pokyčiu atokiosios metastazės atsiranda dažniau, tačiau palyginus abi grupes statistiškai reikšmingas skirtumas negautas (Fišerio testas, p = 0.15).
Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su atokiųjų metastazių lokalizacija pateiktos 6 lentelėje.
6 lentelė. Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su atokiųjų metastazių lokalizacija
Atokiųjų metastazių lokalizacija
Pacientų, kuriems metilintas
hMLH1 geno promotorius,
skaičius ir procentinė išraiška (N=24)
Pacientų, kuriems nenustaytas
hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, skaičius ir procentinė išraiška (N=25) Tarpuplaučio limfmazgiai 7 (29,17%) 7 (28%) Kepenys 4 (16,17%) 1 (4%) Pilvaplėvės limfmazgiai 3 (12,5%) 1 (4%) Krukenbergo metastazės 0 (0%) 1 (4%) Kaulai 2 (8,3%) 2 (8%)
Atokiosios metastazės dažniau lokalizuojasi tarpuplaučioo limfmazgiuose tiek pacientams, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, tiek tiems, kuriems geno promotorius nemetilintas. Tarp geno hMLH1 promotoriaus metilinimo ir atokiųjų metastazių formavimosi vietos statistiškai patikimo ryšio nėra (χ2
=4,97, laisvės laipsnių skaičius 5; p = 0.42).
Pacientams, kuriems nustatytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, laiko nuo diagnozės nustatymo iki atokiųjų metastazių išsivystymo aritmetinis vidurkis 16,37 mėnesiai (standartinis nuokrypis 12,42), kontrolinėje grupėje – 12,07 mėnesių (standartinis nuokrypis 10,04). hMLH1 geno promotoriaus metilinimas nelemia laiko nuo diagnozės nustatymo iki atokiųjų metastazių išsivystymo (χ2
=21,88; p = 0.59).
Iš pacientų, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, lokalus recidyvas išsivystė 3 (N=24), kontrolinėje grupėje – 5 pacientams (N=25).
Pacientams, kuriems nustatytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, laiko nuo diagnozės nustatyto iki lokalaus recidyvo išsivystymo aritmetinis vidurkis 26,17 mėnesiai
25 (standartinis nuokrypis 0,75), kontrolinėje grupėje – 20,2 mėnesiai (standartinis nuokrypis 7,42). Tiriamas epigenetinis pokytis neįtakoja laiko nuo diagnozės nustatytmo iki lokalaus recidyvo išsivystymo (p > 0,05)
11.5 Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru
išgyvenamumu
Iš pacientų, kuriems nustatytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas, tyrimo laikotarpiu (nuo 2010-01-01 iki 2015-11-01) mirė 17 pacientų (N=24), kontrolinėje grupėje – 19 pacientų (N=25). Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru išgyvenamumu pateiktos 7 lentelėje.
7 lentelė. Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru išgyvenamumu
Rodiklis Pacientų grupės Bendro išgyvenamumo aritmetinis vidurkis mėnesiais hMLH1 metilintas 57,17 (standartinis nuokrypis 6,3) hMLH1 nemetilintas 60,12 (standartinis nuokrypis 2,69) Bendro išgyvenamumo procentinė išraiška hMLH1 metilintas 29,17% hMLH1 nemetilintas 24%
Bendras išgyvenamumas didesnis grupėje, kurioje nenustatytas tiriamas epigenetinis pokytis, tačiau skirtumas statistiškai nereikšmingas (p > 0.05). Išgyvenamumo tikimybių palyginimas abiejose grupėse pateiktos 1 grafike.
26
1 grafikas. Išgyvenamumo tikimybių palyginimas abiejose grupėse.
Statistiškai patikimo skirtumo tarp pacientų bendro išgyvenamumo, kuriems hMLH1 geno promotorius metilintas, ir pacientų, kuriems tiriamas epigenetinis pokytis nenustatytas, nėra (Log-rank testas; χ2
=0,41, p = 0.52).
11.6 Geno MGMT promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame
audinyje sąsajos su demografiniais duomenimis ir morfologija
Iš visų tiriamųjų (N=80) MGMT geno promotoriaus metilinimas nustatytas 31 pacientui (32,26%), iš jų 21 moteriai ir 10 vyrų. Palyginus su grupe, kurioje geno promotorius nemetilintas, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp lyčių pasiskirstymo abiejose grupėse negauta. Geno MGMT promotoriaus metilinimas nepriklauso nuo lyties (Fišerio testas, p =
27 0.24). Iš 31 paciento, 16 susirgo būdami vyresni nei 65-erių metų ir 15 pacientų jaunesni nei 65-erių metų. Pacientai, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, dažniau suserga skrandžio vėžio adenokarcinoma jaunesni nei 65-erių metų (Fišerio testas, p = 0.04).
8 lentelėje pateiktos tiriamųjų, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, morfologinės charakteristikos, naviko peraugimas į kraujagysles, limfagysles ir palyginimas su grupe, kurioje geno promotorius nemetilintas.
8 lentelė. Pacientų, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, pasiskirstymas pagal
morfilogines charakteristikas ir palyginimas su grupe, kurioje genas nemetilintas
Morfologinė charakteristika Pacientų skaičius (N=31) Pacientų skaičiaus procentinė išraiška p reikšmė (palyginus su grupe, kurioje MGMT nemetilintas) Statistinis palyginimo metodas T kategorija T1-2 6 19,35% 0.81 Fišerio testas T3-4 25 80,65% N kategorija N0 5 16,13% 0.81 Fišerio testas N1-3 26 83,87% M kategorija M0 30 96,77% 0.6 Fišerio testas M1 1 3,23% Diferenciacijos laipsnis G G1 1 3,23% 0.39 χ2 =3, laisvės laipsnių skaičius 3 G2 12 38,71% G3 16 51,61% G4 2 6,45% Peraugimas į kraujagysles (V) V0 11 35,48% 0.38 Fišerio testas V1 20 64,52% Peraugimas į limfagysles (L) L0 8 25,81% 0,43 Fišerio testas L1 23 74,19% Lauren klasifikacija Žarninis 11 35,48% 0,03 Fišerio testas Difuzinis 20 64,52%
28 Vertinant gautus rezultatus, galima teigti, jog geno MGMT promotoriaus metilinimas neturi sąsajų su TNM kategorijomis, diferenciacijos laipsniu, peraugimu į kraujagysles, limfagysles (p > 0,05). Pacientams, kuriems metilintas geno MGMT promotorius, dažniau nustatomas difuzinis skrandžio adenokarcinomos augimo tipas pagal Lauren klasifikaciją (Fišerio testas; p = 0.03).
Pacientams, kuriems nustatytas šis epigenetinis pokytis, HER2 receptorių neigiamos raiškos dažnis 22,64%, teigiamos – 70,37%. Pacientams, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, dažniau nustatoma teigiama HER2 receptorių raiška (Fišerio testas, p = 0.01).
11.7 Geno MGMT promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio navikiniame
audinyje sąsajos su naviko lokalizacija
Geno MGMT promotoriaus metilinimo dažnis skrandžio vėžio navikiniame audinyje viršutiniame trečdalyje 22,22% (MGMT metilintas 2 pacientams, N=9), viduriniame – 28,95% (MGMT metilintas 11 pacientų, N=38, apatiniame – 57,58% (MGMT metilintas 19 pacientų, N=33). Esant metilintam MGMT geno promotoriui, skrandžio adenokarcinoma dažniau vystosi apatiname skrandžio trečdalyje (p = 0.01).
11.8 Geno MGMT promotoriaus metilinmo sąsajos su skrandžio vėžio
klinikiniais simptomais
Iš pacientų medicininės dokumentacijos surinkti duomenys apie tirtus klinikius skrandžio vėžio klinikinius simptomus (disfagiją, vėmimą, svorio kritimą >5 kilogramai) pateikti 9 lentelėje.
29
9 lentelė. Pacientų, kuriems nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas, klinikinių
simpromų palyginimas su pacientų, kuriems epigenetinis pokytis nenustatytas (kontrolinė grupė), klinikiniais simptomais
Skrandžio vėžio klinikinis požymis Pacientų, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, procentinė išraiška (N=31) Pacientų, kuriems nenustaytas MGMT geno promotoriaus metilinimas, procentinė išraiška (N=25) p reikšmė (Fišerio testas) Disfagija 64,52% 8% 0.02 Vėmimas 58,06% 36% 0.08 Svorio kritimas >5kg 80,65% 40% 0.02
Disfagija ir svorio kritimas daugiau nei 5 kilogramai statistiškai reikšmingai dažniau pasireiškia pacientams, kuriems metilintas MGMT geno promotorius (Fišerio testas, p < 0,05).
11.9 Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su laiku iki atokiųjų
metastazių ir lokalaus recidyvo vystymosi
Atokiosios metastazės atsirado 15 pacientų (48,39%), kuriems nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas, ir 12 pacientų (48%) kontrolinėje grupėje. Matome, kad pacientams su tiriamu epigenetiniu pokyčiu ir kontrolinėje pacientų grupėje atokiosios metastazės atsiranda beveik vienodai dažnai, statistiškai patikimo skirtumo tarp grupių nėra (Fišerio testas, p = 0.6).
Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su atokiųjų metastazių lokalizacija pateiktos 10 lentelėje
30
10 lentelė. Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su atokiųjų metastazių lokalizacija
Atokiųjų metastazių lokalizacija Pacientų, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, skaičius ir procentinė išraiška (N=31)
Pacientų, kuriems nenustaytas
MGMT geno promotoriaus metilinimas, skaičius ir procentinė išraiška (N=25) Mediastinumo limfmazgiai 4 (12,9%) 7 (28%) Kepenys 5 (16,13%) 1 (4%) Pilvaplėvės limfmazgiai 3 (9,68%) 1 (4%) Krukenbergo metastazės 0 (0%) 1 (4%) Kaulai 3 (9,68%) 2 (8%)
Matome, jog atokiosios metastazės, esant metilintam MGMT geno promotoriui, dažniau formuojasi kepenyse, vienodai dažnai pilvaplėvės limfmazgiuose ir kauluose. Tačiau tarp geno MGMT promotoriaus metilinimo ir atokiųjų metastazių formavimosi vietos statistiškai patikimo ryšio nėra (χ2=5,41, laisvės laipsnių skaičius 5; p = 0.37).
Pacientams, kuriems nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas, laiko nuo diagnozės nustatymo iki atokiųjų metastazių išsivystymo aritmetinis vidurkis 10,17 mėnesių (standartinis nuokrypis 16,52), kontrolinėje grupėje – 12,07 mėnesiai (standartinis nuokrypis 10,04). MGMT geno promotoriaus metilinimas nelemia laiko nuo diagnozės nustatymo iki atokiųjų metastazių išsivystymo (p > 0.05).
Iš pacientų, kuriems metilintas MGMT geno promotorius, lokalus recidyvas išsivystė 10 pacientų (N=31), kontrolinėje grupėje – 5 pacientams (N=25).
Pacientams, kuriems nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas, laiko nuo diagnozės nustatyto iki lokalaus recidyvo išsivystymo aritmetinis vidurkis 22,23 mėnesių (standartinis nuokrypis 14,13), kontrolinėje grupėje – 20,2 mėnesiai (standartinis nuokrypis 7,42). Tiriamas epigenetinis pokytis nelemia laiko nuo diagnozės nustatytmo iki lokalaus recidyvo išsivystymo (p > 0.05).
31
11.10 Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru
išgyvenamumu
Iš pacientų, kuriems nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas, tyrimo laikotarpiu mirė 21 pacientas (N=31), kontrolinėje grupėje – 19 pacientų (N=25). Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru išgyvenamumu pateiktos 11 lentelėje.
11 lentelė. Geno MGMT promotoriaus metilinimo sąsajos su bendru išgyvenamumu
Rodiklis Pacientų grupės Bendro išgyvenamumo aritmetinis vidurkis mėnesiais MGMT metilintas 59,52 (standartinis nuokrypis 7,32) MGMT nemetilintas 60,12 (standartinis nuokrypis 2,69) Bendro išgyvenamumo procentinė išraiška MGMT metilintas 32,26% MGMT nemetilintas 24%
Bendras išgyvenamumas didesnis grupėje, kurioje nenustatytas tiriamas epigenetinis pokytis, tačiau skirtumas statistiškai nereikšmingas (p > 0.05).
32
2 grafikas. Išgyvenamumo palyginimas abiejose grupėse.
Statistiškai patikimo skirtumo tarp pacientų, kuriems MGMT geno promotorius metilintas, ir pacientų, kuriems tiriamas epigenetinis pokytis nenustatytas, bendro išgyvenamumo nėra (Log-rank testas; χ2
33
12. REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimo metu analizavome, ar genų hMLH1 ir MGMT promotorių metilinimo statusas turi sąsajų su pacientų amžiumi ir lytimi. 2014 metais atlikto tyrimo duomenimis, hMLH1 geno promotoriaus metilinimas neturi statistiškai reikšmingų sąsajų su pacientų lytimi (p = 0.8) [41]. 2015 metais vykdytame turime, kuriame tirti 40 pacientų su nustatytu hMLH1 geno promotoriaus metilinimu, išsiaiškinta, kad šis epigenetinis pokytis neturi statistiškai reikšmingų sąsajų su pacientų lytimi (p > 0.05) [44]. Mūsų atliktame tyrime nustatyta, kad pacientai, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, dažniau yra vyriškos lyties (p = 0.03). 2005 metais atliktos studijos, kurioje dalyvavo 100 skrandžio vėžiu sergančių pacientų duomenimis, hMLH1 geno promotoriaus metilinimas dažniau nustatomas moterims [43]. Literatūros duomenimis, sąsajų tarp hMLH1 geno promotoriaus metilinimo statuso ir pacientų amžiaus nėra [41,44]. Kitoje literatūroje geno hMLH1 metilinimas siejamas su vyresniu pacientų amžiumi [45]. Mūsų atliktas tyrimas, kuriame nustatėme, kad tiriamas epigenetinis pokytis dažniau nustatomas geriatrinio amžiaus pacientams, neprieštarauja pastarojo tyrimo rezultatams. Remiantis literatūros duomenis, statistiškiškai patikimo ryšio tarp MGMT geno promotoriaus metilinimo bei pacientų pasiskirstymo tarp lyčių ir amžiaus nėra [41,47]. Savo tyrime nustatėme, kad MGMT geno promotoriaus metilinimas neturi sąsajų su pacientų pasiskirstymu pagal lytį, tačiau epigenetinis pokytis dažniau nustatomas jaunesnio nei geriatrinio amžiaus (<65 metai) pacientams (p = 0.04). Skirtumai galimi dėl mažos imties ir statistinei analizei naudotų metodų skirtumo.
Atlikę tyrimą, nustatėme, kad MGMT geno promotoriaus metilinimo statusas neturi įtakos lokaliam ir atokiajam skrandžio vėžio išplitimui bei T kategorijai. Šia tema tliktų tyrimų duomenys prieštaringi. Remiantis tyrimo, kuriame buvo tirti 283 skrandžio vėžiu sergantys pacientai su metilintais genų hMLH1 ir MGMT promotoriais, pacientams, kuriems nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas skrandžio vėžio navikiniame audyje, dažniau nustatomos lokalios metastazės limgmazgiuose bei atokiosios metastazės, ką patvirtina ir 2015 metais atliktas tyrimas [47], tačiau statististiškai patikimo ryšio tarp geno promotoriaus metilinimo ir T kategorijos nenustatyta [41]. Rezultatų skirtumas galimas dėl imčių dydžių skirtumo.
34 Tame pačiame ir kituose tyrimuose [47] nustatyta, kad hMLH1 promotoriaus metilinimo statusas neturi sąsajų su T, N ir M kategorijomis, ką nustatėme ir savo tyrimo metu. Tačiau ankstesnės analizės duomenimis, hMLH1 geno promotorius dažniau metilintas pacientams, kai liga yra neišplitusi į sritinius limfmazgius. Tyrime dalyvavo 49 pacientai [42], rezultatų skirtumai galimi dėl mažos imties.
Atlikus mokslines analizes, nustatyta, jog hMLH1 bei MGMT geno promotoriaus metilinimas nesusijęs su naviko augimo tipu pagal Lauren ir diferenciacijos laipsniu [41,44]. Senesnių tyrimų duomenimis, hMLH1 geno promotorius dažniau metilintas pacientams, kuriems nustatomas žarninis naviko augimo tipas pagal Lauren klasifikaciją [49] .Mes negavome statistiškai reikšmingo ryšio tarp šių charakteristikų tarp pacientų, kuriems nustatytas hMLH1 geno promotoriaus metilinimas (p > 0,05), tačiau nustatėme, kad esant metilintam geno MGMT promotoriui, naviko augimo tipas pagal Lauren klasifikaciją dažniau difuzinis.
Analizuojamų epigenetinių pokyčių nustatymo dažnis įvairių šaltinių duomenimis yra skirtingas. 2014 metais atlikto tyrimo, kuriame dalyvavo 70 skrandžio adenocarcinoma sergančių pacientų, duomenimis hMLH1 promotorius metilintas 22,9% pacientų, MGMT – 34,3% pacientų [46]. Praeitais metais atliktoje analizėje nustatyta, jog hMLH1 geno promotoriaus metilinimo dažnis skrandžio navikiniame audinyje 24% [47]. Atlikę tyrimą nustatėme, kad MGMT geno promotoriaus metilinimo dažnis skrandžio vėžio navikiniame audinyje yra 32,26%, hMLH1 - 30% atvejų.
Literatūroje duomenų apie nagrinėjamų DNR reparacijoje dalyvaujančių genų promotorių metilinimo sąsajas su naviko invazija į kraujagysle, limfagysles, klinikiniais simptomais, atokiųjų metastazių formavimosi lokalizacija rasti nepavyko.
Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog abu analizuojami epigenetiniai pokyčiai sergantiems skrandžio vėžiu pacientams yra glaudžiai susiję su maženiu išgyvenamumu [48]. Savo tyrime nustatėme, kad bendras išgyvenamumas, esant metilintiems DNR reparacijoje dalyvaujančių genų promotoriams, didesnis grupėje, kurioje nenustatytas tiriamas epigenetinis pokytis, tačiau skirtumas statistiškai nereikšmingas (p > 0.05). Skirtumas galimas dėl mažos pacientų imties.
Literatūroje publikuojami duomenys apie hMLH1 ir MGMT genų promotorių metilinimo ryšį su naviko lokalizacija, skirstant skrandį į viršutinį, vidurinį ir apatinį
35 trečdalius, yra prieštaringi. Vienų tyrimų duomenimis hMLH1 ir MGMT genų promotorių metilinimas neturi statistiškai reikšmingų sąsajų su naviko lokalizacija [41,44]. Tačiau kituose moksliniuose tyrimuose nurodoma, jog abiejų DNR reparacijoje dalyvaujančių genų promotorių metilinimo dažnis didesnis skrandžio apatiniame trečdalyje [50]. Mūsų atlikto tyrimo rezultatai, vertinant ryšį hMLH1 ir MGMT genų promotorių metilinimo, patvirtina pastarojo tyrimo rezultatus.
Duomenų apie hMLH1 ir MGMT genų promotorių metilinimo status ryšį su lokalaus recidyvo vystymusi bei laiku iki atokiųjų metastazių atsiradimo literatūroje nėra.
36
13. IŠVADOS
1. Tirtų genų promotorių metilinimo ryšys su skrandžio vėžio morfologinėmis charakteristikomis:
esant metilintam MGMT geno promotoriui, naviko augimo tipas pagal Lauren klasifikaciją dažniau difuzinis (Fišerio testas, p = 0.03), statistiškai patikimas ryšys tarp geno promotoriaus metilinimo ir TNM kategorijų (T ir N kategorijos p = 0.81, M – 0.6), naviko diferenciacijos laipsnio (p = 0.39) nenustatytas;
tarp geno hMLH1 promotoriaus metilinimo ir TNM kategorijų (T kategorijos p = 0.27, N – 0.46, M – 0.66), naviko diferenciacijos laipsnio (p = 0.58), naviko augimo tipo pagal Lauren klasifikaciją (p = 0.35) statistiškai patikimo ryšio nėra;
esant metilintam hMLH1 geno promotoriui, HER2 receptorių raiška dažniau neigiama (p = 0.04), MGMT – dažniau teigiama (p = 0.01).
2. Esant analizuojamų genų promotorių metilinimui, skrandžio adenokarcinoma dažniau vystosi skrandžio apatiniame trečdalyje (hMLH1, p = 0.04, MGMT – 0.01).
3. Gautas statistiškai patikimas ryšys tarp tirtų genų promotorių metilinimo ir kai kurių skrandžio vėžio klinikinių simptomų bei demografinių rodiklių:
pacientams, kuriems metilintas hMLH1, MGMT promotorius, dažniau pasireiškia disfagija ir svorio kritimas >5 kilogramai (hMLH1, p = 0.01, MGMT – 0.02), o esant metilintam hMLH1 geno promotoriui, dažniau pasireiškia ir vėmimas (p = 0.03).
pacientai, kuriems metilintas hMLH1 geno promotorius, dažniau yra vyriškos lyties (p = 0.03) bei skrandžio adenokarcinoma suserga vyresniame nei 65 metų amžiuje (Fišerio testas, p = 0.02), o pacientai, kuriems metilintas MGMT geno promotorius – jaunesniame nei 65 metų amžiuje (p = 0.04).
4. Statistiškai patikimo skirtumo tarp tirtų DNR reparacijoje dalyvaujančių genų promotorių metilinimo ir atokiųjų metastazių formavimosi dažnio (hMLH1, p = 0.15, MGMT – 0.6), laiko iki atokiųjų metastazių išsivystymo (hMLH1, p = 0.59, MGMT – p > 0,05), laiko iki lokalaus recidyvo atsiradimo (p > 0.05) ir bendro išgyvenamumo (hMLH1, p = 0.52,
37
14. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bou Kheir T, Futoma-Kazmierczak E, Jacobsen A, Krogh A, Bardram L, Hother C, Grønbæk K, Federspiel B, Lund AH, Friis-Hansen L. miR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer. Mol Cancer 2011; 10: 29.
2. Changwon Kang, Ji-Joon Song, Jaeok Lee, and Mi Young Kim. Epigenetics: An emerging player in gastric cancer. World J Gastroenterol 2014; 20(21): 6433–6447.
3. Cheng-Yen Kaoa, Bor-Shyang Sheub, Jiunn-Jong Wu. Helicobacter pylori infection: An overview of bacterial virulence factors and pathogenesis. Biomedical Journal 2016; 39: 14–23. 4. Luo B., Wang M., Hou N., Hu X., Jia G., Qin X., Zuo X., Liu Y., Luo K., Song W., Wang K.,
Pang M.. ATP-Dependent Lon Protease Contributes to Helicobacter pylori-Induced Gastric Carcinogenesis. Neoplasia 2016; 18(4): 242-52.
5. D.E. Guggenheim, M.A. Shah. Gastric cancer epidemiology and risk factors. Journal of Surgical Oncology 2013; 107(3): 230–236.
6. Gwen Murphy, Ruth Pfeiffer, M. Constanza Camargo, Charles S. Rabkin. Meta-analysis Shows That Prevalence of Epstein–Barr Virus-Positive Gastric Cancer Differs Based on Sex and Anatomic Location. Gastroenterology 2009; 137(3): 824–833.
7. Masashi Fukayama, Tetsuo Ushiku. Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma. Pathology - Research and Practice 2011; 207(9): 529–537.
8. Masashi Fukayama, Rumi Hino, Hiroshi Uozaki. Epstein–Barr virus and gastric carcinoma: virus–host interactions leading to carcinoma. Cancer Science 2008; 99(9): 1726–1733.
9. Correa P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial process--First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and Prevention. Cancer Res 1992; 52: 6735–6740.
10. Lauwers GY, Carneiro F, Graham DY. Gastric carcinoma. In: Bowman FT, Carneiro F, Hruban RH, eds. Classification of Tumours of the Digestive System. Lyon:IARC Press 2010. 11. Bing Hu, Nassim El Hajj, Scott Sittler, Nancy Lammert, Robert Barnes, Aurelia Meloni-Ehrig.
Gastric cancer: Classification, histology and application of molecular pathology. Journal of Gastrointest Oncol 2012; 3(3): 251–261.
38 12. Lauren P. The two histological main types of gastric carcinoma: Diffuse and so-called intestinal-type carcinoma. An attempt at a histo-clinical classification. Acta Pathol Microbiol Scand 1965; 64: 31–49.
13. Vauhkonen M, Vauhkonen H, Sipponen P. Pathology and molecular biology of gastric cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2006; 20: 651–674.
14. Qiu MZ, Cai MY, Zhang DS, Wang ZQ, Wang DS, Li YH, Xu RH. Clinicopathological characteristics and prognostic analysis of Lauren classification in gastric adenocarcinoma in China. J Transl Med 2013; 11:58.
15. Zheng H, Takahashi H, Murai Y, Cui Z, Nomoto K, Miwa S, Tsuneyama K, Takano Y. Pathobiological characteristics of intestinal and diffuse-type gastric carcinoma in Japan: An immunostaining study on the tissue microarray. J Clin Pathol 2007; 60: 273–277.
16. Waddington CH. The epigenotype. Endeavour. 1942; 1: 18–20.
17. Shikhar Sharma, Theresa K. Kelly, Peter A. Jones. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis 2010; 31(1): 27–36.
18. Antequera, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993; 90:11995–11999.
19. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes and Development 2002; 16(1): 6–21.
20. Baylin S B, Herman J G, Graff J R, Vertino P M, Issa J P. Adv Cancer Res 1998; 72: 141–196. 21. Wilson A. S., Power B. E., Molloy P. L. DNA hypomethylation and human diseases.
Biochimica et Biophysica Acta 2007; 1775(1): 138–162.
22. Jones P. A., Baylin S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nature Reviews Genetics 2002; 3(6): 415–428.
23. Greger V., Passarge E., Höpping W., Messmer E., Horsthemke B. Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression of retinoblastoma. Human Genetics 1989; 83(2): 155–158.
24. Nephew KP, Balch C, Zhang S, Huang THM. Epigenetics and ovarian cancer. Cancer Treat Res 2010; 149: 131–4610.
25. Karolin Luger, Armin W. Mäder, Robin K. Richmond, David F. Sargent1 & Timothy J. Richmond. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature 1997; 389: 251-260.
39 26. Andrew J Bannister, Tony Kouzarides. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell
Research 2011; 21(3): 381–395.
27. Parthun MR. Hat1: the emerging cellular roles of a type B histone acetyltransferase. Oncogene 2007; 26: 5319–5328.
28. P.A. Grant, L. Duggan, J. Cote, S.M. Roberts, J.E. Brownell, R. Candau, R. Ohba, T. Owen-Hughes, C.D. Allis, F. Winston, S.L. Berger, J.L. Workman, Genes Dev 1997; 11: 1640. 29. A.A. Lane, B.A. Chabner. Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy. J Clin Oncol 2009;
27(32): 5459-68.
30. Martin D. Jansson, Anders H. Lund. Molecular Oncology 2012; 6(6): 590–610.
31. Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 2009; 136: 642–55
32. Josie Hayes, Pier Paolo Peruzzi, Sean Lawler. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends in Molecular Medicine 2014; 20(8): 465-467.
33. Pan X., Wang ZX., Wang R. MicroRNA-21: a novel therapeutic target in human cancer. Cancer Biol Ther. 2010; 10(12): 1224-32.
34. Lu J., Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T, Horvitz HR, Golub TR. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005; 435(7043): 834-8.
35. Phenotypic mismatch repair hMSH2 and hMLH1 gene expression profiles in primary non-small cell lung carcinomas.Vageli D, Daniil Z, Dahabreh J, Karagianni E, Vamvakopoulou DN, Ioannou MG, Scarpinato K, Vamvakopoulos NC, Gourgoulianis KI, Koukoulis GK Lung Cancer 2009; 64(3): 282-8.
36. Gilsbach R, Preissl S, Grüning BA, Schnick T, Burger L, Benes V, Würch A, Bönisch U, Günther S, Backofen R, Fleischmann BK, Schübeler D, Hein L. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun 2014; 5: 5288. 37. Xiao XQ, Gong WD, Wang SZ, Zhang ZD, Rui XP, Wu GZ, Ren F. Polymorphisms of mismatch repair gene hMLH1 and hMSH2 and risk of gastric cancer in a Chinese population. Oncol Lett 2012; 3(3): 591-598.
38. Takayoshi Waki,Gen Tamura,Takashi Tsuchiya,Kiyoshi Sato,Satoshi Nishizuka, Teiichi Motoyama. Promoter Methylation Status of E-Cadherin, hMLH1, and p16 Genes in Nonneoplastic Gastric Epithelia. Am J Pathol 2002; 161(2): 399–403.
40 39. Pegg AE, Byers TL. Repair of DNA containing O6-alkylguanine. FASEB J. 1992; 6(6):
2302-10.
40. Chikan NA, Shabir N, Shaff S, Mir MR, Patel TN. N-nitrosodimethylamine in the Kashmiri diet and possible roles in the high incidence of gastrointestinal cancers. Asian Pac J Cancer Prev 2012; 13(3): 1077-9.
41. Jin J, Xie L, Xie CH, Zhou YF. Aberrant DNA methylation of MGMT and hMLH1 genes in prediction of gastric cancer. Genet Mol Res 2014; 13(2): 4140-5.
42. Hiraki M, Kitajima Y, Sato S, Mitsuno M, Koga Y, Nakamura J, Hashiguchi K, Noshiro H, Miyazaki K. Aberrant gene methylation in the lymph nodes provides a possible marker for diagnosing micrometastasis in gastric cancer. Ann Surg Oncol 2010; 17(4): 1177-86.
43. Hong SH, Kim HG, Chung WB, Kim EY, Lee JY, Yoon SM, Kwon JG, Sohn YK, Kwak EK, Kim JW. DNA hypermethylation of tumor-related genes in gastric carcinoma. J Korean Med Sci 2005; 20(2): 236-41.
44. Teng Y, Dai D, Shen W, Liu H. Effect of methylation of hMLH1 gene promotor on stage tumorigenesis and progression of human gastric cancer. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi 2015; 18(2): 166-70.
45. Kim KJ, Lee TH, Cho NY, Yang HK, Kim WH, Kang GH. Differential clinicopatho-logic features in microsatellite-unstable gastric cancers with and without MLH1 methylation. Hum Pathol 2013; 44(6): 1055-1064.
46. Guo H, Yan W, Yang Y, Guo M. Promoter region methylation of DNA damage repair genes in human gastric cancer. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2014; 94(28): 2193-6.
47. Li Y, Yang Y, Lu Y, Herman JG, Brock MV, Zhao P, Guo M. Predictive value of CHFR and MLH1 methylation in human gastric cancer. Gastric Cancer 2015; 18(2): 280-7.
48. Shi J, Zhang G, Yao D, Liu W, Wang N, Ji M, He N, Shi B, Hou P. Prognostic significance of aberrant gene methylation in gastric cancer. Am J Cancer Res 2012; 2(1): 116-29.
49. Alves MK, Ferrasi AC, Lima VP, Ferreira MV, de Moura Campos Pardini MI, Rabenhorst SH. Inactivation of COX-2, HMLH1 and CDKN2A gene by promoter methylation in gastric cancer: relationship with histological subtype, tumor location and Helicobacter pylori genotype. Pathobiology 2011; 78(5): 266-76.
50. Balassiano K1, Lima S, Jenab M, Overvad K, Tjonneland A, Boutron-Ruault MC, Clavel-Chapelon F, Canzian F, Kaaks R, Boeing H, Meidtner K, Trichopoulou A, Laglou P, Vineis P,
41 Panico S, Palli D, Grioni S, Tumino R, Lund E, Bueno-de-Mesquita HB, Numans ME, Peeters PH, Ramon Quirós J, Sánchez MJ, Navarro C, Ardanaz E, Dorronsoro M, Hallmans G, Stenling R, Ehrnström R, Regner S, Allen NE, Travis RC, Khaw KT, Offerhaus GJ, Sala N, Riboli E, Hainaut P, Scoazec JY, Sylla BS, Gonzalez CA, Herceg Z. Aberrant DNA methylation of cancer-associated genes in gastric cancer in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC-EURGAST). Cancer Lett 2011; 311(1): 85-95.
