LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Artūras Stumbras
KAULINIO AUDINIO REGENERACIJOS
SKATINIMO AUGIMO FAKTORIAIS
GAUSIA PLAZMA IR RIEBALINIO
AUDINIO KAMIENINĖMIS
LĄSTELĖMIS TYRIMŲ REZULTATAI
Daktaro disertacijaMedicinos ir sveikatos mokslai, odontologija (M 002)
Disertacija rengta 2015–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Veido ir žandikaulių chirurgijos klinikoje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Gintaras Juodžbalys (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002).
Konsultantas
prof. habil. dr. Ričardas Kubilius (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos odontologijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
prof. dr. Eglė Slabšinskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002)
Nariai:
prof. dr. Edgaras Stankevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biologija – N 010);
doc. dr. Eglė Aida Bendoraitienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002);
prof. dr. Vygandas Rutkūnas (Vilniaus universitetas, medicinos ir svei-katos mokslai, odontologija – M 002);
dr. Mohammad Hamdan Alkhraisat (Regeneracinės medicinos ir dantų implantologijos universitetinis institutas (Ispanija), medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002).
Disertacija ginama viešajame Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Me-dicinos akademijos Odontologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. rugpjūčio 21 d. 14:00 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Naujausių farmacijos ir sveikatos technologijų centro A–205 auditorijoje.
Disertacijos gynimo vietos adresas: Sukilėlių pr. 13, LT-50162 Kaunas, Lietuva.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Artūras Stumbras
RESULTS OF STIMULATING
REGENERATION OF BONE TISSUE
WITH PLASMA RICH IN GROWTH
FACTORS AND ADIPOSE-DERIVED
STEM CELLS
Doctoral Dissertation Medical and Health Sciences,Odontology (M 002)
Dissertation has been prepared at the Department of Maxillofacial Surgery of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2015–2020.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Gintaras Juodžbalys (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Science, Odontology – M 002).
Consultant
Prof. Habil. Dr. Ričardas Kubilius (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Science, Odontology – M 002).
Dissertation is defended at the Odontology Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Eglė Slabšinskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Science, Odontology – M 002).
Members:
Prof. Dr. Edgaras Stankevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Science, Biology – N 010);
Assoc. Prof. Dr. Eglė Aida Bendoraitienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Science, Odontology – M 002);
Prof. Dr. Vygandas Rutkūnas (Vilnius University, Medical and Health Science, Odontology – M 002);
Dr. Mohammad Hamdan Alkhraisat (University Institute for Regenerative Medicine and Oral Implantology (Spain), Medical and Health Science, Odontology – M 002).
Dissertation will be defended at the open session of the Odontology Research Council on the 21st of August 2020 at 2:00 p.m. in the auditorium
No. A-205 of the Centre for Advanced Pharmaceutical and Health Technologies of Lithuanian University of Health Sciences.
TURINYS
PAGRINDINĖS SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS... 9
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
2. MOKSLINIO DARBO NAUJUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 12
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
3.1. Alveolinės ataugos atrofija po danties(-ų) rovimo ... 14
3.2. Alveolinės ataugos rekonstrukcija iki implantacijos ... 15
3.3. Kaulinio audinio rekonstrukcijoje naudojamų medžiagų savybės ... 16
3.4 Kaulo transplantatų biologiniai aspektai ... 18
3.5. Trombocitų koncentratų įtaka audinių regeneracijoje ... 19
3.6. Leukocitų svarba audinių gijimui aktyvuojant trombocitų koncentratais ... 21
3.7. Kamieninių ląstelių panaudojimas kaulinio audinio regeneracijoje ... 22
3.8. Kaulo transplantatų aktyvavimas riebalinio audinio kamieninėmis ląstelėmis ... 23
3.9. PRGF panaudojimas kaulinio audinio regeneracijoje ... 24
3.10. Alveolinės ataugos išsaugojimas po danties rovimo ... 25
3.11. PRGF panaudojimas siekiant išsaugoti alveolės tūrį po danties rovimo ... 28
3.12. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 29
4. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 31
4.1. Eksperimentiniai In vivo tyrimai ... 32
4.1.1. Eksperimentiniai gyvūnai ... 32
4.1.2. Riebalinio audinio kamieninių ląstelių išskyrimas ir kultivacija ... 33
4.1.3. Kraujo paėmimas ir PRGF paruošimas ... 34
4.1.4. Kaulo transplantatų bioaktyvavimas PRGF ... 35
4.1.5. Kaulo transplantatų bioaktyvavimas iš riebalinio audinio išskirtomis kamieninėmis ląstelėmis ... 35
4.1.6. Chirurginės procedūros kaukolės skliauto kaulo defektams suformuoti ... 35
4.1.7. Kaukolės skliauto kaulo defektų biopsijų paėmimas ... 37
4.1.8. Histomorfometrinė analizė ... 37
4.1.9. Statistinė analizė ... 37
4.2. Klinikiniai tyrimai ... 38
4.2.1. Indikacijos poekstrakcinės alveolės išsaugojimui / augmentacijai ... 38
4.2.2. Poekstrakcinės alveolės regeneracijos kokybinė analizė ir dimensinių pokyčių vertinimas gyjant natūraliai ir po alveolės
išsaugojimo naudojant regeneracines medžiagas ... 38
4.2.2.1. Tyrimo tipas ... 38
4.2.2.2. Danties rovimo operacija ... 41
4.2.2.3. Pooperacinis periodas ... 42
4.2.2.4. KPKT analizė ... 43
4.2.2.5. Histomorfometrinė analizė ... 45
4.2.2.6. Imties dydžio skaičiavimas ... 45
4.2.2.7. Statistinė analizė ... 46
5. REZULTATAI ... 47
5.1. Eksperimentinių In vivo tyrimų rezultatai ... 47
5.1.1. Histomorfometrinė analizė ... 47
5.1.2. Naujai susidaręs kaulas ... 48
5.1.3. Kaulo transplantato ir naujai susidariusio kaulo santykis ... 49
5.1.4. Naujai susidaręs nemineralizuotas audinys ... 51
5.1.5. Nerezorbuotas kaulo transplantatas ... 52
5.2. Išrauto danties alveolės gyjimo kokybinė ir kiekybinė analizė ... 53
5.2.1. Histomorfometrinė regeneruoto kaulo analizė ... 54
5.2.2. KPKT analizė ... 59
5.3. Indikacijos postekstrakcinės alveolės išsaugojimui / augmentacijai ... 63
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 65
6.1. In vivo tyrimų rezultatų aptarimas ... 65
6.2. Poekstrakcinės alveolės išsaugojimo / augmentacijos indikacijų aptarimas... 71
6.3. Poekstrakcinės alveolės regeneracijos kokybinės analizės aptarimas... 73
6.4. Poekstrakcinės alveolės dimensinių pokyčių aptarimas ... 76
IŠVADOS ... 80
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 81
SUMMARY ... 82
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 120
MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ... 140
PRIEDAI ... 210
CURRICULUM VITAE ... 212
PAGRINDINĖS SANTRUMPOS
BMP – kaulo morfogenetinis baltymas (angl. bone morphogenetic protein) PRGF – augimo faktorių gausi plazma
RKL – riebalinio audinio kamieninės ląstelės V/Ž – viršutinis žandikaulis
A/Ž – apatinis žandikaulis
RKR – reguliuojamoji kaulo regeneracija
FDBA – liofilizuotas alogeninės kilmės kaulo transplantatas (angl. freeze-dried bone allograft)
DFDBA – demineralizuotas liofilizuotas alogeninės kilmės kaulo
transplantatas (angl. demineralized freeze-dried bone allograft) ABBM – deproteinizuotas jaučio kaulo mineralinis užpildas
(angl. anorganic bovine bone mineral) AKT – alogeninės kilmės kaulo transplantatas KKT – ksenogeninės kilmės kaulo transplantatas HA – hidroksiapatitas
β-TCP – β trikalcio fosfatas PRP – trombocitų gausi plazma
L-PRF – leukocitų ir trombocitų gausus fibrinas L-PRP – leukocitų ir trombocitų gausi plazma PRF – trombocitų gausus fibrinas
PDGF – trombocitų išskirtas augimo faktorius TGF-β – beta transformuojantysis augimo faktorius EGF – epidermio augimo faktorius
VEGF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius IGF-I – insulino augimo faktorius
bFGF – fibroblastų augimo faktorius HGF – hepatocitų augimo faktorius
PMN – polimorfiniai nukleariniai (sin. daugiabranduoliai) leukocitai KL – kamieninės ląstelės
MKL – mezenchiminės kamieninės ląstelės
BBM – ksenogeninės kilmės kaulo transplantatas (angl. bovine bone mineral)
SVF – stromos vaskuliarinė frakcija
DMEM – Dulbecco modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecco’s Modified – Eagle’s Medium)
FBS – fetalinis veršelio serumas (angl. fetal bovine serum) EDTA – etilendiamino tetraacto rūgštis
p – reikšmingumo lygmuo KM – kolageninė membrana
KPKT – kūginio pluošto kompiuterinė tomografija
WR – horizontalioji alveolės rezorbcija (angl. width reduction) HR – vertikalioji alveolės rezorbcija (angl. height reduction) NSK – naujai susidaręs kaulas
NKT – nerezorbuotas kaulo transplantatas
ĮVADAS
Šiuolaikinėje odontologijoje bei veido ir žandikaulių chirurgijoje viena iš aktualiausių problemų yra kaulinio audinio atkūrimas po dantų netekimo, traumų arba onkologinių ligų. Literatūros duomenimis, alveolinė atauga vertikaliai rezorbuojasi 11–22 proc., o horizontalioji rezorbcija svyruoja tarp 29–63 proc. po danties rovimo praėjus 6–7 mėnesiams [1]. Traumos ir onko-loginės ligos veido ir žandikaulių srityje gali lemti didelių kaulo defektų atsi-radimą, todėl reikalinga didelės apimties alveolinės ataugos ar žandikaulių rekonstrukcija [2, 3].
Alveolinės ataugos atrofija greitėja netekus dantų ir yra natūralus senėjimo procesas, todėl papildoma alveolinės ataugos rekonstrukcija reikalinga dau-giau nei 50 proc. visų atliekamų implantacijų, o viršutiniame žandikaulyje, estetinėje zonoje, papildomai atkurti prarastą kaulą reikia iki 77 proc. atvejų [4, 5]. Todėl raunant dantį labai svarbu išsaugoti kuo daugiau alveolinės ataugos tūrio – tokiu būdu sumažinti išrauto danties alveolės rezorbciją ir alveolės atrofiją [6]. Tuo tikslu pasiūlyta keletas metodikų alveolei išsaugoti po danties rovimo [7, 8]. Implanto ilgaamžiškumui ir osteointegracijai užtik-rinti svarbu ne tik išsaugotas pakankamas kaulo tūris, tačiau ir regeneravusio kaulo kokybė [9]. Dėl to, siekiant išsaugoti išrauto danties alveolės tūrį, svarbu atsižvelgti ir į kokybinius sugijusios alveolinės ataugos parametrus.
Kaulinis audinys rekonstruojamas keliais skirtingais gydymo metodais [10, 11]. Kauliniams defektams regeneruoti naudojama skirtingos kilmės kaulas arba pakaitalinės kaulo medžiagos [12-14]. Autogeninės kilmės kaulo naudojimas kaulinio audinio rekonstrukcijai yra laikomas „aukso standartu“, kuriam būdingos osteogeninės, osteoindukcinės ir osteokondukcinės savybės [15–18]. Tačiau dėl padidėjusios komplikacijų rizikos, susijusios su papil-doma donorine sritimi, nekontroliuojamos kaulo rezorbcijos ir riboto auto-transplantato kiekio [19, 20], yra atliekami tyrimai–ieškoma audiniams rege-neruoti tinkamos alternatyvios kaulo plastinės medžiagos. Dažniausiai kaulo pakaitalai turi osteokondukcinių savybių ir naudojami kaip karkasas naujo kaulinio audinio regeneracijai. Vienintelis demineralizuotas liofilizuotas alo-geninis kaulas turi osteoindukcinių savybių ir pats stimuliuoja naujo kaulinio audinio susidarymą. Tačiau nėra bendros nuomonės ir alogeninio kaulo savybės kinta ir priklauso nuo audinių banko, donoro amžiaus ir sveikatos būklės [21, 22]. Todėl siekiama sukurti plastinę kaulo medžiagą, kuri ne tik būtų kaip karkasas kaulinio audinio regeneracijoje, tačiau ir turėtų osteoin-dukcinių savybių.
Siekiant pagerinti kaulo plastinės medžiagos savybes galima naudoti re-kombinantinius kaulo morfogenetinius baltymus (BMP), autogeninės kilmės kamienines ląsteles arba augimo faktoriais gausią kraujo plazmą (PRGF).
Kaulo morfogenetiniai baltymai skatina osteoprogenitorinių ląstelių di-ferenciaciją į osteoblastus ir skatina naujo kaulinio audinio susidarymą [23]. Tačiau šio tipo baltymų naudojimas kauliniam audiniui regeneruoti nėra moksliškai pagrįstas ir literatūroje yra aprašoma šalutiniai požymiai, pvz., kaulų navikų susidarymas [24]. Iš riebalinio audinio išskirtos kamieninės ląstelės (RKL) gali būti naudojamos kaip alternatyva siekiant pagerinti rege-neracines kaulo pakaitalų savybes. RKL yra daugiagalės (sin. multipo-tentinės) ląstelės ir gali diferenciuoti į įvairių rūšių, tarp jų – ir kaulines ląs-teles. Šios rūšies kamieninės ląstelės yra puiki kaulinio audinio regeneracijos alternatyva, nes yra nesudėtinga ir neinvazyvi riebalinio audinio paėmimo metodika, riebalinis audinys greit atsinaujina, jo panaudojimas nėra ribo-jamas dėl bioetinių priežasčių, taip pat šios ląstelės mažai imunogeniškos [25, 26]. Kaulo pakaitalų naudojimas kartu su RKL būtų naudingas esant kaulo defektams turintiems nepakankamą kraujotaką, esant potrauminiams kaulo defektams, arba pacientams, kurių sutrikusi kaulo metabolizmą reguliuo-jančių hormonų pusiausvyra. Kaip alternatyvus pasirinkimas RKL, siekiant pagerinti kaulo pakaitalų savybes, gali būti naudojama įvairūs trombocitų koncentratai. Aktyvinti trombocitai ir leukocitai išskiria augimo faktorius, kurie stimuliuoja kaulinio audinio regeneraciją bei vaskuliarizaciją, mažina uždegimą, taip pat veikia antibakteriškai [27, 28]. Kai kurie autoriai pasiūlė pašalinti leukocitus iš trombocitų koncentratų dėl jų žalojamojo poveikio augimo faktoriams [29, 30]. Literatūros apžvalgoje [31] aprašyta, kad esant leukocitams, trombocitai silpniau stimuliuoja ląstelių prolifereraciją bei diferenciaciją, taip pat dėl padidėjusio citokinų išsiskyrimo leukocitai lemia ilgiau išliekančią uždegimo fazę. PRGF technologija, priešingai nei kiti trombocitų koncentratai, savo sudėtyje neturi leukocitų [30]. PRGF naudojant kartu su kaulo pakaitalais, trombocitų išskirti augimo faktoriai suriša ir fik-suoja kaulo granules, apsaugo nuo minkštųjų audinių įaugimo bei kaulo granulių migravimo į minkštuosius audinius.
1.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslai – histomorfometrijos metodais įvertinti PRGF ir riebalinio
audinio kamieninių ląstelių poveikį kaulinio audinio regeneracijai ir augimo faktorių įtaką kamieninių ląstelių osteodiferenciacijai in vivo modelyje; ištirti skirtingų regeracinių medžiagų, įvestų į paciento išrauto danties alveolę, įtaką regeneruoto kaulo kokybei bei žandikaulių alveolinės ataugos rezorb-cijos ypatumams.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti riebalinio audinio kamieninių ląstelių įtaką kaulinio audinio re-generacijai, atliekant histomorfometrinį regeneruoto Naujosios Zelandijos triušių kaukolės skliauto defektų kaulo tyrimą.
2. Nustatyti augimo faktorių, išskirtų iš trombocitų, įtaką kamieninių ląstelių osteodiferenciacijai, atliekant regeneruotų kaulo defektų histomorfomet-rinę analizę, Naujosios Zelandijos triušių kaukolės skliauto defektų mode-lyje.
3. Kūginio pluošto kompiuterinės tomografijos metodu ištirti skirtingų rege-neracinių medžiagų, įvestų į paciento išrauto danties alveolę, įtaką žan-dikaulių alveolinės ataugos rezorbcijos ypatumams.
4. Atlikti histomorfometrinę regeneruoto išrauto danties alveolės kaulo analizę.
5. Įvertinti PRGF įtaką paciento kaulinio audinio regeneracijai ir alveolės matmenų išsaugojimui po danties rovimo estetinėje zonoje.
6. Įvertinti optimaliausią išrauto danties alveolės užpildymo metodiką verti-nant alveolinės ataugos ir skruostinės alveolės sienelės rezorbcijos ir re-generavusio kaulo santykį.
7. Suklasifikavus išrauto danties alveolę sukurti ir pagrįsti (sin. validuoti) sprendimų medį bei indikacijas išrauto danties alveolei išsaugoti / aug-mentuoti.
2. MOKSLINIO DARBO NAUJUMAS IR
PRAKTINĖ REIKŠMĖ
Šiuolaikinėje odontologijoje, pradėjus aktyviai atkurti prarastus dantis dantų implantais, neišvengiamai susiduriame su būtinybe atkurti prarastą kaulą. Kaulinio audinio rekonstrukcija išlieka vienu didžiausių iššūkių veido ir žandikaulių chirurgijoje. Kaip „aukso standartas“ kaulinio audinio rekons-trukcijoje naudojamas autogeninės kilmės kaulas, turintis osteogeninių, osteoindukcinių ir osteokondukcinių savybių. Dėl padidėjusios komplikacijų rizikos, susijusios su papildoma donorine sritimi, nekontroliuojamos kaulo rezorbcijos ir riboto autotransplantato kiekio [19, 20], yra atliekami tyrimai – audiniams regeneruoti iešoma alternatyvios kaulo plastinės medžiagos. Tačiau donorinio kaulo naudojimas yra ribojamas dėl teisinių aspektų, riboto ilgalaikio stabilumo ir infekcinių ligų transmisijos rizikos [32]. Dažniausiai klinikinėje praktikoje naudojami ksenogeninės kilmės ir sintetiniai kaulo pakaitalai. Šioms kaulo plastinėms medžiagoms būdingas inertiškumas ir jos turi tik osteokondukcines savybes [33]. Siekiant pagerinti šių kaulinių medžiagų savybes, pastaruoju metu klinikinėje praktikoje dažnai naudojami tam tikri trombocitų koncentratai. Šiame tyrime naudojama augimo faktoriais gausi plazma (PRGF), kuri, priešingai nei kiti trombocitų koncentratai, savo sudėtyje neturi leukocitų. Tyrimais įrodyta, kad esant leukocitams, trombo-citai silpniau stimuliuoja ląstelių proliferaciją bei diferenciaciją, taip pat dėl padidėjusio citokinų išsiskyrimo leukocitai lemia ilgiau išliekančią uždegimo fazę [31]. Autogeninės kilmės riebalinio audinio kamieninės ląstelės yra daug žadanti alternatyva siekiant pagerinti kaulo pakaitalo savybes ir suteikti kaulo transplantatui osteogeniškumo bei osteoinduktyvumo. RKL puikiai tinka kauliniam audiniui regeneruoti, nes yra nesudėtinga ir neinvazyvi riebalinio audinio paėmimo metodika, riebalinis audinys greitai atsinaujina, jo pa-naudojimas nėra ribojamas dėl bioetinių priežasčių, taip pat šios ląstelės mažai imunogeniškos. Šiame tyrime in vivo tyrimais buvo ištirta PRGF įtaka kaulo pakaitalo regeneracinėms savybėms bei riebalinio audinio kamieninių ląstelių osteodiferenciacijai, taip pat – RKL įtaka kaulo regeneracijai. Taip pat klinikiniame tyrime buvo ištirta PRGF veiksmingumas siekiant išsaugoti išrauto danties alveolės matmenis bei PRGF reikšmė alveolės kaulo rege-neracijai. Sukurta ir validuota klinikinis sprendimų medis bei indikacijos išrauto danties alveolės išsaugojimui / augmentacijai.
Šio tyrimo rezultatai leis plačiau vertinti autogeninės kilmės kamieninių ląstelių panaudojimo galimybę kauliniam audiniui rekonstruoti, suteiks žinių apie kaulo transplantatų bioaktyvavimą RKL bei autogeninės kilmės augimo faktoriais ir padės pagrindą tolesniems tyrimams. Šio darbo rezultatai leis
įvertinti kompleksinį RKL ir PRGF poveikį audiniams, kaulo regeneraci-niams procesams. Taip pat leis įvertinti augimo faktoriais gausios plazmos (PRGF) be leukocitų panaudojimo galimybę kauliniam audiniui regeneruoti ir alveolei išsaugoti po danties rovimo.
3.
LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Alveolinės ataugos atrofija po danties (-ų) rovimo
Alveolinis kaulas yra priklausomas nuo jame esančių dantų, todėl netekus dantų vyksta greita alveolinės ataugos atrofija. Skirtingų autorių duomenimis, alveolinė atauga vertikaliai rezorbuojasi 11–22 proc., o horizontalioji re-zorbcija svyruoja tarp 29–63 proc. po danties rovimo praėjus 6–7 mėnesiams [1]. Literatūros duomenimis, didžiausia alveolinės ataugos atrofija įvyksta per pirmuosius tris mėnesius po danties rovimo [6, 34]. Didžiausia alveolinio kaulo atrofija vyksta horizontalia kryptimi ir labiau rezorbcijos yra pavei-kiama skruostinė išrauto danties alveolės sienelė. Viršutiniame (V/Ž) ir apa-tiniame (A/Ž) žandikauliuose priekinių dantų srityje skruostinė sienelė yra plonesnė už liežuvinę bei gomurinę sieneles ir yra daugiausia sudaryta iš apydančio kaulo (angl. bundle bone), kuris netekus dantų visiškai atrofuojasi [35]. Literatūros duomenimis, apydančio kaulo storis kinta tarp 0,1–0,4 mm [36]. Klinikiniai tyrimai su gyvūnais parodė, kad išrauto danties alveolės koronaliai esantis kaulas yra sudarytas vien tik iš apydančio kaulo [35]. Januario kartu su bendaautoriais [37] atliktame tyrime nustatyta, kad V/Ž priekinių dantų srityje beveik pusės dantų skruostinės sienelės storis yra plo-nesnis nei 0,5 mm. Remiantis literatūros apžvalga [38], daugiausia sunkumų atkurti prarastus dantis dantų implantais kyla V/Ž priekinių dantų srityje dėl didelės alveolinio kaulo rezorbcijos po danties (-ų) rovimo. Literatūroje apra-šoma hipotezė, kad vienmomentė išrauto danties implantacija gali sumažinti alveolinio kaulo atrofiją ir užtikrinti kraštinio kaulo stabilumą [39]. Tačiau atlikti tyrimai parodė, kad vienmomentė implantacija neturi įtakos mažesnei alveolinio kaulo rezorbcijai po danties rovimo [35, 40–43]. Tyrimais nusta-tyta, kad šalia esantys dantys užtikrina skruostinės alveolės sienelės kraujo-taką, todėl didėjant raunamų dantų skaičiui proporcingai didėja alveolinės ataugos atrofija [44–46]. Alveolinės ataugos rezorbciją po danties rovimo lemia daug veiksnių: kraštinio ir viršūninio apydančio patologija, danties rovimo metodika, alveolės kaulinių sienelių ir minkštųjų audinių biotipas, kaulo metabolizmą reguliuojančių hormonų pusiausvyra bei funkcinė alveo-linės ataugos perkrova [47, 48]. Šio darbo autorius kartu su bendraautoriais yra aprašęs ir išpublikavęs išrauto danties klasifikaciją ir klinikinį sprendimų medį alveolinės ataugos išsaugojimui/augmentacjai (3.9.1 lentelė) [80], bei atlikęs klinikinius kokybinės išrauto danties alveolės regeneracijos [261] ir dimensinių alveolinės ataugos pokyčių po danties rovimo estetinėje V/Ž zonoje tyrimus.
3.2. Alveolinės ataugos rekonstrukcija iki implantacijos
Šiuolaikinėje odontologijoje, pradėjus aktyviai atkurti prarastus dantis dantų implantais, neišvengiamai susiduriame su būtinybe atkurti prarastą kaulą. Siekiant užtikrinti dantų implanto ilgaamžiškumą ir aplinkinių audinių stabilumą būtina atkurti prarastus audinius. Alveolinės ataugos rekonstruk-cijai naudojamos įvairios technikos: kaulo bloko persodinimo operacija, re-guliuojamoji kaulo regeneracija (RKR), alveolinės ataugos skėlimas bei vertikalioji distrakcinė osteogenezė [4, 49].
Reguliuojamoji kaulo regeneracija yra dažniausiai naudojama metodika alveolinės ataugos rekonstrukcijoje ir kaulo defektams atkurti [50–53]. RKR principas – panaudojant kaulo plastinę medžiagą ir barjerines membranas atkurti prarastą kaulą. Kaulo plastinė medžiaga naudojama kaip karkasas naujo kaulinio audinio regeneracijoje, o barjerinių membranų funkcija yra atskirti regeneruojamą kaulą nuo greitai proliferuojančių epiteliocitų bei fibroblastų ir leisti vykti lėtesnei osteoprogenitorinių ląstelių proliferacijai į osteoblastus ir formuoti naują kaulinį audinį [54]. Besirezorbuojančių mem-branų trūkumas yra greitesnė rezorbcija nei osteogenezės procesas bei stabilumo, reikalingo tūriui išlaikyti, nebuvimas [55]. Siekdamas išsaugoti išrauto danties alveolės kaulą, Lekovic’o kartu su bendraautoriais [56] atlik-tas klinikinis tyrimas parodė, kad praėjus 6 mėn. po alveolės išsaugojimo, naudojant besirezorbuojančias barjerines membranas, susidarė toks pats kiekis naujai regeneravusio kaulo kaip ir naudojant nesirezorbuojančias bar-jerines membranas. Esant dideliems arba vertikaliems kaulo defektams, kai reikalinga ilgalaikis regeneruojamo kaulo stabilumas ir jungiamojo audinio eliminacija, naudojamos nesirezorbuojančios barjerinės membranos. Naudo-jant nesirezorbuojančią membraną, reikalinga papildoma operacija membra-nai išimti. Taip pat literatūroje aprašoma didesnė komplikacijų dėl nesire-zorbuojančios membranos atsidengimo rizika [52, 57]. Kaulo regeneraciniam potencialui ir RKR panaudojimo galimybėms gerinti literatūroje aprašomi kaulo transplantato aktyvinimo augimo faktoriais metodai [58–63].
Esant didelei vertikaliajai alveolinės ataugos rezorbcijai ir siekiant atkurti prarastą vertikalų alveolinės ataugos kaulo aukštį gali būti taikoma vertika-lioji distrakcinė osteogenezė. Ilizarov’as [64, 65] pirmasis aprašė, kad spe-cialiu aparatu tolinant atskirtą kaulo fragmentą nuo kito, tarp jų vyksta rege-neracija ir susidaro naujas kaulinis audinys. Atliekiant distrakcinę osteoge-nezę kaulas gyja taip pat kaip kaulo lūžimo atveju. Literatūros duomenimis [66], atliekant vertikaliąją distrakcinę osteogenezę galima pailginti alveolinę ataugą vidutiniškai apie 6,5 mm. Tačiau vertikalioji alveolinės ataugos aug-mentacija, taikant distrakcinės osteogenezės metodą, atliekama retai dėl
sudėtingos ir invazyvios operacinės metodikos, galimos netaisyklingos kau-linio audinio regeneracijos, žandikaulio lūžio arba infekcijos rizikos.
Alveolinės ataugos rekonstrukcija panaudojant kaulo bloką, gali būti atliekama esant horizontaliajai alveolinės ataugos atrofijai, esant nedideliam aukščio trūkumui arba mišriam kaulo defektui (vertikali ir horizontali atro-fija). Kaip alveolinės ataugos rekonstrukcijos „aukso standartas” naudojamas autogeninės kilmės kaulo blokas [67]. Literatūroje plačiai aprašoma kaulo bloko transplantacija iš apatinio žandikaulio retromoliarinės (sin. užkrūmi-nės) srities ir šakos bei A/Ž parasimfizialinės srities [68, 69]. Tačiau dėl padidėjusios komplikacijų rizikos, susijusios su papildoma donorine sritimi, nekontroliuojamos kaulo rezorbcijos ir riboto autotransplantato kiekio pasta-ruoju metu greitai populiarėja vertikalių ir mišrių kaulo defektų rekonstruk-cija, panaudojant smulkintą kaulo transplantatą kartu su nesirezorbuojan-čiomis barjerinėmis membranomis [69].
Po dantų netekimo greitai vykstanti alveolinės ataugos atrofija dažniausiai pasireiškia horizontaliąja alveolės rezorbcija, kai prarandama 3,8–6,1 mm per 3–12 mėnesių po danties rovimo [34]. Norint pasiekti sėkmingų ilgalaikių rezultatų, danties implantą turi supti 1–1,5 mm kaulo [34]. Todėl planuojant implantaciją, būtina pasirinkti 3,5–4 mm skersmens implantą, kad alveolinės ataugos plotis būtų 6–7 mm [70–73]. Esant horizontaliam kaulo defektui ir siaurai alveolinei ataugai, kaip kaulo rekonstrukcijos kaulo bloku ar RKR alternatyva gali būti atliekama alveolinės ataugos skėlimas. Šio metodo prin-cipas yra išilginis alveolinės ataugos padalijimas į dvi dalis ir skėlimas di-dėjančio skersmens osteotomais arba kaulo plėtikliais sukeliant žaliosios šakelės lūžį [74]. Alveolinės ataugos skėlimo pranašumas prieš kitus žan-dikaulių rekonstrukcijos metodus – kartu su kaulo plėtimu gali būti atliekama dantų implantacija bei sukuriamas pakankamas kaulo plotis aplink danties implantą.
Žandikaulių rekonstrukcijos metodai yra plačiai ištirti, tačiau siekiant sumažinti pooperacinių komplikacijų riziką, pagerinti regeneruojamos srities osteogeniškumą bei pagreitinti gijimą, tikslinga atlikti daugiau autogeninių augimo faktorių bei kamieninių ląstelių įtakos kaulo regeneracijai klinikinių tyrimų [75, 76].
3.3. Kaulinio audinio rekonstrukcijoje naudojamų medžiagų savybės
Daugybę metų kaulinio audinio rekonstrukcija veido ir žandikaulių chi-rurgijoje išlieka vienu didžiausių iššūkių. Rekonstruotas kaulas daugiausiai yra sudarytas iš nerezorbuoto kaulo pakaitalo, nemineralizuoto kaulinio au-dinio ir naujai susidariusio gyvybingo kaulo. Todėl augmentuotas kaulas iš-lieka gyvo ir nekrotinio kaulo mišinys. Autogeninės kilmės kaulo naudojimas
kaulinio audinio rekonstrukcijai yra laikoma „aukso standartu“, kuriam bū-dingos osteogeninės, osteoindukcinės ir osteokondukcinės savybės [15–18]. Autogeninės kilmės kaulo transplantatas savo sudėtyje turi gyvybingų osteo-geninių ląstelių ir augimo faktorių. Augimo faktoriai ir osteogeninės ląstelės yra svarbios kaulinio audinio regeneracijoje, tačiau didelė dalis jų žūsta po kaulo transplantato persodinimo į recipientinę ložę [77]. Tačiau dėl padidė-jusios komplikacijų rizikos, susipadidė-jusios su papildoma donorine sritimi, nekont-roliuojamos kaulo rezorbcijos ir riboto autotransplantato kiekio [19, 20], at-liekami tyrimai – ieškoma audiniams regeneruoti tinkamos alternatyvios kau-lo plastinės medžiagos. Akau-logeninės kilmės kaukau-lo transplantatai plačiai naudo-jami odontologijoje [78, 79], traumatologijoje [80, 81], veido ir žandikaulių chirurgijoje [82, 83]. Yra skiriami du alogeninės kilmės kaulo transplantatų tipai: liofilizuotas alogeninis kaulas (FDBA) ir demineralizuotas liofilizuotas alogeninis kaulas (DFDBA). Alogeninis kaulas pasižymi osteokondukcinė-mis savybėosteokondukcinė-mis, tačiau DFDBA papildomai turi osteoindukcinių savybių ir pats stimuliuoja naujo kaulinio audinio susidarymą [84]. Osteoindukcinės demineralizuoto alogeninio kaulo transplantato savybės išlieka dėl kaulo su-dėtyje esančio kaulo morfogenetinio proteino (BMP), kuris siunčia biochemi-nius signalus ir stimuliuoja osteoprogenitorinių ląstelių diferenciaciją į osteo-blastus [85]. Tyrimas, lyginęs šešis skirtingų gamintojų DFDBA transplanta-tus ištyrė, kad implantavus DFDBA laboratorinėms pelėms į raumenį daugu-ma kaulo transplantatų sukėlė ektopinį kaulo fordaugu-mavimąsi, o kai kurių gamin-tojų kaulo transplantatai visai nestimuliavo naujo kaulo susidarymo [21]. Kaulo morfogenetiniai proteinai esantys DFDBA sudėtyje gali būti aktyvūs arba neaktyvūs ir priklauso nuo audinių banko, donoro amžiaus ir sveikatos būklės [21, 22]. Taip pat donorinio kaulo naudojimas yra ribojamas dėl tei-sinių aspektų, riboto ilgalaikio stabilumo ir infekcinių susirgimų transmisijos rizikos.
Kaulinio audinio rekonstrukcijoje plačiai naudojami ksenogeninės kilmės (jaučių, arklių, kiaulių) kaulo transplantatai. Literatūroje plačiausiai aprašytas deproteinizuotas jaučio kaulo mineralinis užpildas (ABBM). ABBM išlaiko porėtą kaulo granulių struktūrą, kuri yra reikalinga ląstelių proliferacijai, mig-racijai ir naujo kaulinio audinio revaskuliarizacijai [86–88]. ABBM pasižymi osteokondukcinėmis savybėmis ir tarnauja kaip karkasas naujo kaulo susida-ryme. Šio tipo kaulo pakaitalai lėtai rezorbuojasi ir pasižymi ilgalaikiu aug-mentuoto kaulo stabilumu. Klinikiniai tyrimai parodė, kad geriausiomis rege-neracinėmis savybėmis ksenogeninės kilmės kaulo pakaitalas pasižymi nau-dojant kartu su autogeninės kilmės kaulu ar trombocitais gausia plazma [89, 90].
pagrindą sudaro kalcio fosfatas, hidroksiapatitas (HA) ar β trikalcio fosfatas (β-TCP) [86]. Sintetiniai kaulo transplantatai pasižymi osteokondukcinėmis savybėmis ir yra tinkama matrica kaulinio audinio regeneracijoje, tačiau dėl mažesnio porėtumo ir mažo porų diametro pasižymi lėtesne transplantato revaskuliarizacija [91].
Vertinant visus kaulo transplantatus, kaip „aukso standartas“ išlieka auto-geninės kilmės kaulas. Natūralios kilmės ar sintetiniai kaulo transplantatai pasižymi tik osteokondukcinėmis savybėmis ir naujo kaulinio audinio rege-neracijos neskatina. Literatūroje aprašoma geresni klinikiniai rezultatai atkuriant kaulo defektus taikant kaulo bioinžinerinius modelius panaudojant kamienines ląsteles [91, 92]. Geresnė kaulo regeneracija, naudojant kaulo pakaitalus kartu su autogeninės kilmės kaulu ar trombocitų koncentratais, parodo augimo faktorių ir osteogeninių ląstelių svarbą kaulo regeneracijoje [89, 90]. Kaulo regeneracinės savybės pagerėja jo atstatymui naudojant kaulo pakaitalus kartu su autogeninės kilmės kaulu ar trombocitų koncentratais ir patvirtina augimo faktorių ir osteogeninių ląstelių svarbą. Augimo faktorių koncentratai (PRP, PRGF, L-PRF) padidina kaulo transplantatų biologinį aktyvumą [26, 61, 90, 93–95].
3.4. Kaulo transplantatų biologiniai aspektai
Pagal biologinę funkciją yra skiriamos šios kaulo transplantatų savybės: osteokondukcija, osteoindukcija ir osteogenezė [96].
Osteokondukcija – tai universali kaulo transplantatų savybė atliekanti kar-kaso funkciją naujo kaulinio audinio regeneracijoje. Osteoblastai, osteoge-ninės ląstelės iš kaulo defekto naudoja kaulo transplantatą kaip matricą ląstelių migracijai, proliferacijai ir ląstelių osteodiferenciacijai naujo kaulo susidaryme [33].
Osteoindukcija yra kaulo transplantato savybė stimuliuoti osteoprogeni-torines ląsteles diferencijuoti į osteoblastus. Šio tipo kaulo transplantatai ne tik atlieka karkaso funkciją kaulinio audinio regeneracijoje, bet ir stimuliuoja naujo kaulo susidarymą ir pagreitina kaulo transplantato integraciją. Osteo-indukcininėmis savybėmis, be autogeninės kilmės kaulo transplantatų, pasi-žymi demineralizuotas liofilizuotas alogeninis kaulas, kuris stimuliuoja kau-linio audinio susidarymą. Alogeninio kaulo savybėms turi įtakos audinių ban-kas, donoro amžius ir sveikatos būklė [21, 22].
Osteogenezė – tai kaulinio transplantato savybė stimuliuoti naują kaulinį audinį. Osteogeniškumu pasižymintys kaulo transplantatai turi gyvybingų osteogeninių ląstelių, kurios gali suformuoti naują kaulinį audinį. Vienintelis autogeninės kilmės kaulo transplantatas pasižymi osteogeninėmis savybėmis ir gali stimuliuoti naujo kaulo susidarymą (3.4.1 lentelė).
3.4.1 lentelė. Kaulo transplantatų savybės [97]
Transplantatai Osteokondukcija Osteoindukcija Osteogenezė
Ksenogeniniai + – –
Alogeniniai + –/+ –
Aloplastiniai + – –
Autogeniniai + + +
3.5. Trombocitų koncentratų įtaka audinių regeneracijoje
Kaulo transplantatų regeneraciniam potencialui gerinti literatūroje aprašo-mi kaulo transplantato aktyvinimo augimo faktoriais metodai [58–63]. Grei-ta vaskuliarizacija yra pagrindinis faktorius lemiantis sėkmingą regeneruo-jamos srities gijimą. Tyrimais įrodyta, kad trombocitų išskirti augimo fakto-riai turi teigiamos įtakos greitai regeneruojamos srities vaskuliarizacijai ir audinių gijimui [27]. Yra keletas skirtingų trombocitų koncentratų tipų: a) trombocitų gausi plazma (PRP), b) leukocitų ir trombocitų gausi plazma (L-PRP), c) trombocitų gausus fibrinas (PRF), d) leukocitų ir trombocitų gau-sus fibrinas (L-PRF) ir e) augimo faktoriais gausi plazma (PRGF). Pagrin-dinis šių koncentratų skirtumas yra skirtingas augimo faktorių ir leukocitų skaičius (3.4.1 lentelė).
Augimo faktoriai yra baltymai, kurie reguliuoja ląstelių funkciją, augimą, proliferaciją ir sąlygoja naujo audinio susidarymą. Daugybė studijų aprašo teigiamą autogenininės kilmės augimo faktorių įtaką kaulinio audinio ir minkštųjų audinių regeneracijai [27, 30, 94, 98]. Augimo faktoriai kaulo gijimą skatina stimuliuojant osteoprogenitorinių ląstelių diferenciaciją į osteoblastus, stimuliuodami angiogenezę bei skatindami endotelinių ir osteo-progenitorinių ląstelių migraciją ir diferenciaciją [99]. Trombocitai išskiria daugybę skirtingų augimo faktorių, kurie yra kaupiami alfa granulėse: trom-bocitų išskirtas augimo faktorius (PDGF), transformuojantysis beta augimo faktorius (TGF-β), epidermio augimo faktorius (EGF), kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF), insulino augimo faktorius (IGF-I), fibroblastų augimo faktorius (bFGF) ir angiopoetinas-1 [93]. Ypatingai daug trombocitai išskiria VEGF, kuris, vykstant angiogenezei, yra svarbiausias augimo fakto-rius stimuliuojantis endotelinių ląstelių migraciją, proliferaciją ir diferen-ciaciją [100]. Savo sudėtyje trombocitai taip pat kaupia baltymus, kurie pasižymi antibakteriniu veikimu. Šie baltymai yra vadinami trombocidinais (angl. thrombocidines) ir veikia prieš daugelį bakterijų rūšių [107]. Leu-kocitai taip pat turi aktyvių intraląstelinių augimo faktorių. Pastarieji išskiria PDGF, VEGF, TGF-β, IGF ir bFGF [101–103]. Šie biologiškai aktyvūs baltymai atlieka svarbų vaidmenį audinių regeneracijoje: PDGF skatina
ka-formuojant ekstraląstelinį matriksą [106], VEGF daugiausia yra atsakingas už angiogenezės procesus [107], o EGF – už fibroblastų migraciją ir proli-feraciją bei stimuliuoja osteoprogenitorinių ląstelių diferenciaciją į osteo-blastus [108]. Trombocitų koncentratų sudėtyje esantis fibrinas skatina ląs-telių adheziją, jų proliferaciją ir yra svarbus formuojant ekstraląstelinį mat-riksą. Fibrinas taip pat atsakingas už angiogenezės procesus ir dalyvauja susidarant naujam kapiliarų tinklui [109]. Visi šie biologiniai veiksniai turi teigiamos įtakos audinių bei kaulinio audinio regeneracijai.
3.5.1 lentelė. Pagrindiniai trombocitų koncentratų skirtumai
Koncentrato
tipas Leukocitų kiekis Aktyvacija Paruošimo protokolas
PRP Nedidelė leukocitų koncentracija Antikoaguliantas – citrato dekstrozė; Aktyvatorius – Trombinas / CaCl2 [125–128] 1-as centrifūgavimas – 160 g 10 min; 2-as centrifūgavimas – 250 g 15 min [127, 128]. 800 g 10 min [126]. L-PRP Didelė leukocitų koncentracija Antikoaguliantas – citrato dekstrozė; Aktyvatorius – Trombinas / CaCl2 [125]
1-as centrifūgavimas – 400 g 10 min; 2-as centrifūgavimas – 400 g 10 min [128].
1-as centrifūgavimas – 400 g 10 min; 2-as centrifūgavimas – 2000 g 3 min [126].
1-as centrifūgavimas – 100 g 8 min; 2-as centrifūgavimas – 1500 g 15 min [129]. PRF Nedidelė leukocitų koncentracija Antikoaguliantas – trinatrio nitratas; Aktyvatorius – CaCl2
1-as centrifūgavimas – 1100 g 6 min; 2-as centrifūgavimas – 4500 g 25 min [130, 131]. L-PRF Didelė leukocitų koncentracija – 400 g 12 min [132]. PRGF Leukocitų
nėra Antikoaguliantas – natrio citratas; Aktyvatorius – CaCl2
580 g 8 min [133].
Daugybė tyrimų aprašo teigiamą autogeninės kilmės augimo faktorių įtaką trofinių opų gijimui, gydant didelius kaulo defektus, atliekant krūtų rekons-trukciją, gydant odos ir plaukų ligas [110–114]. Klinikinės studijos parodė, jog trombocitų koncentratų injekcijos į pažeistus sąnarius reikšmingai su-mažino skausmą, stimuliavo tenocitų diferenciaciją ir kolageno sintezę [115, 116]. Naudojant trombocitų koncentratus kartu su smulkinta kremzle ar kaulo transplantatu, augimo faktoriai skatina vaskuliarizaciją, kamieninių ląstelių migraciją, chondrocitų bei osteoblastų proliferaciją [117–121]. Literatūroje
aprašoma teigiamas PRP regeneracinis poveikis atliekant plaukų transplan-taciją [114, 122–124]. Trombocitų koncentratai yra puiki alternatyva siekiant pagerinti audinių regeneracines savybes kadangi yra nebrangi bei minimaliai invazyvi technologija.
3.6. Leukocitų svarba audinių gijimui naudojant trombocitų koncentratus
Vertinant leukocitų įtaką audinių regeneracijai, vieningos nuomonės nėra. Leukocitai, kaip ir trombocitai, išskiria augimo faktorius, kurie skatina audi-nių regeneraciją ir gijimą [101–103], tačiau yra autorių, teigiančių apie leuko-citų žalingą poveikį audinių gijimui dėl išskiriamų interleukinų (IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, MMP-1 and MMP-9) ir laisvųjų radikalų [31,134-136].
Tyrimai parodė, kad leukocitai išskiria svarbiausią angiogenezės augimo faktorių (kraujagyslių endotelio augimo faktorius – VEGF), tačiau trombo-citai pasižymi tuo pačiu ir papildomai išskiria daugybę kitų regeneracijai svarbių faktorių [93]. Kyla klausimas – ar didesnis VEGF kiekis yra nau-dingas audinių regeneracijai. Literatūroje aprašoma, kad neadekvati angio-genezė gali įtakoti nepakankamą žaizdų gijimą ir neigiamai veikti regene-racinius procesus [93]. Taip pat yra teigiama, kad leukocitai yra atsakingi už pernelyg didelį kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) kieko išskyrimą [129, 133]. Per daug didelis VEGF kiekis gali neigiamai veikti vaskuliarizaciją dėl trombocitų išskiriamų angiogenezės inhibitorių [137].
Dėl leukocitų išskiriamų interleukinų (IL-1β, MMP-1) vykstant audinių regeneracijai suaktyvėja kataboliniai procesai. Paprastai, leukocitai yra pir-moji gynybos linija – pirmosios imuninės ląstelės reaguojančios į audinių vientisumo suardymą. Uždegimo metu vyrauja polimorfiniai nukleariniai (sin. daugiabranduoliai) leukocitai (PMN), kurie išskiria matrikso metalo proteinazes, kurios trukdo vykti regeneraciniams procesams. PMN yra atsa-kingi už tarpląstelinio jungiamojo audinio ardymą, už laisvųjų radikalų bei reaktyviųjų deguonies junginių susidarymą, kurie gali lemti aplinkinių audinių pažeidimą [264]. Užsitęsus uždegimui, vyksta tolimesnė PMN mig-racija, todėl nevyksta tolimesnės proliferacijos ir regeneracijos fazės [94, 138]. Sisteminė literatūros apžvalga, vertinanti leukocitų įtaką audinių rege-neracijai, patvirtino [31], kad užsitęsusi uždegiminė fazė turi neigiamą įtaką audinių regeneracijai. Nors leukocitai išskiria augimo faktorius, nėra žinoma ar tai turi teigiamą poveikį audinių gijimui. Todėl kyla klausimas – ar leukocitai trombocitų koncentratuose yra reikalingi. Šio darbo autorius kartu su bendraautoriais yra parašęs sisteminę literatūros apžvalgą, vertinant leu-kocitų poveikį audinių regeneracijai [31].
3.7. Kamieninių ląstelių panaudojimas audinių regeneracijoje
Kamieninių ląstelių (KL) terapija atsirado kaip alternatyvus gydymo meto-das siekiant atstatyti prarastus audinius ir gydant įvairias ligas. KL (proge-nitorinės ląstelės) yra apibūdinamos kaip ląstelės, turinčios neribotą atsinauji-nimo funkciją arba kaip ląstelės, gebančios gaminti dukterines ląsteles ir diferenciuoti į kitos rūšies ląsteles [139]. Tarp visų KL tipų dažniausiai nau-dojamos mezenchiminės kamieninės ląstelės (MKL), kurios yra labiausiai moksliškai pagrįstos, yra nesudėtingai išskiriamos, greit atsinaujina, jų pa-naudojimas nėra ribojamas dėl bioetinių priežasčių, taip pat šios ląstelės mažai imunogeniškos [25, 26, 140, 141]. MKL postnataliniu laikotarpiu aptinkamos daugelyje organų ir audinų: kaulų čiulpuose, riebaliniame audi-nyje, smegenyse, odoje, dantyse, širdyje, skersaruožiuose raumenyse [141– 143]. Iš visų audinių, kuriuose aptinkamos MKL, daugiausiai potencialo turi riebalinis audinys. Šiame audinyje yra vienas didžiausių kamieninių ląstelių šaltinių visame kūne, riebalinis sluoksnis yra prieinamas daugelyje kūno vietų, riebalų nusiurbimo metodika gali būti atliekama vietinėje nejautroje taip sumažinant operacijos invazyvumą ir pooperacinį diskomfortą pacientui. Riebalinio audinio kamieninės ląstelės (RKL) yra daugiagalės (sin. multipo-tencinės) ir gali diferencijuoti į įvairias skirtingas ląstelių rūšis: osteoblastus, chondrocitus, miocitus, adipocitus ar epitelines ląsteles. Literatūros duomeni-mis, RKL išskiria kaulinio audinio regeneraciją stimuliuojančius augimo fak-torius: hepatocitų augimo faktorių (HGF), bFGF bei IGF-I [144]. Taip pat yra tyrimų, teigiančių, kad RKL išskiria kraujagyslių endotelio augimo faktorių (VEGF), kuris stimuliuoja endotelinių ląstelių migraciją, proliferaciją, dife-renciaciją ir yra atsakingas už angiogenezės procesus [145]. RKL naudoja-mos kaulinio audinio inžinerijoje ir aprūpina audinius osteogeninėmis ląste-lėmis, kurios skatina osteoindukciją ir osteoprogenitorinių ląstelių diferencia-ciją į osteoblastus [146, 147]. Autogeninės kilmės RKL pagerina kaulo pakai-talo savybes suteikdamos šiems osteogeninį potencialą. Mehrabani’s kartu su bendraautoriais [148] išanalizavo autologinio fibrino ir RKL gydomąjį po-veikį triušio apatinio žandikaulio defektams ir įrodė padidėjusį naujai susi-dariusio kortikalinio kaulo storį, palyginti su kontroline grupe. Kitas kliniki-nis tyrimas aprašė teigiamą fibrino ir RKL poveikį kaulinio audinio regene-racijai rekonstruojant didelius kaukolės skliauto kaulo defektus [149]. Litera-tūroje aprašoma sėkmingi rezultatai rekonstruojant žandikaulių defektus panaudojant skirtingus kaulo transplantatus, aktyvintus RKL [150]. Taip pat literatūroje randama duomenų apie RKL teigiamą poveikį kaulinio audinio regeneracijai rekonstruojant porezekcinius žandikaulių defektus [151].
Gentile’as kartu su bendraautoriais [110, 111] aprašė gerus krūtų rekons-trukcijos operacijos rezultatus naudojant riebalinio audinio autotransplantatą
kartu su RKL bei trombocitų koncentratais. Nustatyta, kad RKL pagerina riebalinio audinio integraciją ir ilgalaikį stabilumą išlaikant krūtų tūrį [152]. RKL regeneracinis potencialas aiškinamas ankstyvu kapiliarų tinklo susida-rymu ir angiogenezės procesų stimuliacija, tai užtikrina regeneruojamos srities mitybą bei metabolitų apykaitą [110]. Tyrimais nustatyta, kad žmogaus plaukų folikulų kamieninės ląstelės padidina plaukų tankį po plaukų trans-plantacijos ir turi teigiamą poveikį gydant androgenetinę alopeciją [153]. Gydant androgenetinę alopeciją, naudojant žmogaus plaukų folikulų kamie-ninių ląstelių injekcijas, nustatyta didesnis naujai susidariusių plaukų ir plaukų folikulų skaičius [154].
Regeneracinis kamieninių ląstelių potencialas galėtų būti panaudojamas siekiant atstatyti potrauminius ar pooperacinius kaulo defektus, taip pat at-liekant kaulo rekonstrukcijos operacijas pacientams, sergantiems sisteminė-mis ligosisteminė-mis ar esant kaulo metabolizmą reguliuojančių hormonų disbalansui.
3.8. Kaulo transplantatų aktyvavimas riebalinio audinio kamieninėmis ląstelėmis
Dėl riboto kaulų transplantatų panaudojimo kaulinio audinio regenera-cijoje, riebalinio audinio kamieninės ląstelės (RKL) gali būti naudojamos siekiant pagerinti regeneracines kaulo pakaitalų savybes. Kaulo pakaitalų savybės gali būti gerinamos praturtinant osteokondukcines transplantatų savybes osteogeninėmis RKL savybėmis. RKL sumaišius su kaulo pakaitalu, šios kolonizuoja kaulo plastinės medžiagos paviršių, migruoja į kaulo gra-nulių poras ir dėka savo osteogeniškumo skatina kaulinio audinio regene-raciją [147]. Šiandieninėje klinikinėje praktikoje mezenchiminės kamieninės ląstelės dažniausiai išskiriamos iš riebalinio audinio arba kaulo čiulpų. Studijos, lyginančios mezenchimines ląsteles išskirtas iš riebalinio audinio ir kaulo čiulpų, neaprašo reikšmingų skirtumų vertinant ląstelių adheziją, proliferaciją, diferenciacijos potencialą ir replikacijos pajėgumą [155, 156]. Riebaliniame audinyje mezenchiminių ląstelių yra tarp 1–5 proc. visų ląstelių, todėl išskyrus ląsteles iš riebalinio audinio aspirato yra nereikalingas ląstelių kultivavimas [157–159]. Riebalinis sluoksnis yra prieinamas daugelyje kūno vietų, riebalų nusiurbimo metodika gali būti atliekama vietinėje nejautroje taip sumažinant invazyvumą ir pooperacinį diskomfortą pacientui [160, 161]. Ikiklinikiniai eksperimentiniai tyrimai su gyvūnais patvirtino kaulo trans
-plantatų biologinę darną (sin. biosuderinamumą) ir teigiamą kaulinio audinio regeneracinį potencialą naudojant kaulo transplantatą kartu su kamieninėmis ląstelėmis. Tyrimai su triušiais, regeneruojant kaulo defektus naudojant kaulo transplantatus bioaktyvuotus mezenchiminėmis kamieninėmis ląstelėmis,
greitesnę kaulo mineralizaciją [162–165]. Yra tyrimų, aprašančių teigiamą trombocitų koncentratų poveikį kamieninių ląstelių adhezijai, proliferacijai, išgyvenamumui, aktyvacijai ir diferenciacijai [166–169]. Šio darbo autorius kartu su bendraautoriais yra parašęs ir išpublikavęs ikiklinikinio tyrimo su triušiais rezultatus [265], vertinant riebalinio audinio kamieninių ląstelių ir PRGF įtaką kaulinio audinio regeneracijai.
3.9. PRGF panaudojimas kaulinio audinio regeneracijoje
Kaulinio audinio regeneracijai yra reikalingi trys komponentai: osteogeni-nės ląstelės, biologiniai mediatoriai (citokinai ir augimo faktoriai) ir biosu-derinamas karkasas, kuris tarnauja kaip matrica naujo kaulo regeneracijoje [170]. Augimo faktoriai taip pat reikalingi vaskuliarizacijai ir regeneruojamo kaulinio audinio mitybai užtikrinti. Ne mažiau svarbus komponentas kaulinio audinio regeneracijoje yra biologiškai suderinamas karkasas, kuris tarnauja kaip ekstraląstelinė matrica ir pritraukia osteogenines ląsteles bei augimo faktorius.
Augimo faktoriai yra svarbūs siekiant reguliuoti kaulo regeneracinius pro-cesus. Tai signalinės molekulės, atliekančios daugybę biologinių funkcijų: reguliuoja ląstelių diferenciaciją, proliferaciją, migraciją ir apoptozę [171].
Regeneracinis PRGF potencialas priklauso nuo dviejų pagrindinių kompo-nentų:
1. Trombocitų gausi plazma ir augimo faktoriai, kurie reguliuoja pagrin-dinius audinių regeneracinius procesus.
2. Fibrino matriksas, kuris tarnauja kaip ekstraląstelinis karkasas kaulinio audinio regeneracijoje ir reguliuoja augimo faktorių išskyrimą [172]. Be regeneracinio potencialo, PRGF taip pat pasižymi priešuždegiminiu ir antibakteriniu poveikiu [22]. Savo sudėtyje trombocitai kaupia medžiagas, turinčias antibakterinį poveikį (trombocidinai). Šie baltymai priklauso anti-mikrobinių peptidų (defensinų) grupei ir yra įgimtos imuninės sistemos dalis. Jie pasižymi plačiu antimikrobiniu poveikiu, turi tam tikrą antivirusinį, prieš-grybelinį poveikį [173]. Dėl išskiriamų autogeninių augimo faktorių ir tan-kaus fibrino matrikso PRGF panaudojimas regeneracinėje medicinoje pri-taikomas siekiant atstatyti įvairius kaulo defektus burnos, veido ir žandikaulių chirurgijos srityje. Alveolinės ataugos rekonstrukcijai naudojamos įvairios technikos: kaulo bloko persodinimo operacija, reguliuojamoji kaulo regene-racija, alveolinės ataugos skėlimas bei vertikalioji distrakcinė osteogenezė [4, 49]. Anitua su bendraautoriais [174] atlikto tyrimą, kuriame vertino al-veolinės ataugos skėlimą ir plėtimą kartu panaudojant PRGF. Autoriai nu-statė, kad minkštieji audiniai geriau gyja nesant dantenų uždegimo ir krauja-vimo zonduojant, palyginti su kontroline grupe, kurioje PRGF nebuvo
naudota. Taip pat šio tyrimo metu implantų prigijimas buvo 100 proc. Kitas tyrimas [175] vertino PRGF reikšmę titaninio tinklelio atsidengimui po kaulo augmentacijos. Grupėje, kur buvo naudojamas PRGF, titaninis tinklelis sugi-jus minkštiesiems audiniams neatsidengė, o kontrolinėje grupėje tinklelio atsidengimas buvo stebimas 28,5 proc. atvejų. Rentgenologiniai tyrimai taip pat patvirtino, kad regeneruoto kaulo tūris taip pat išliko didesnis PRGF grupėje. Vertinant kaulo regeneraciją po viršutinio žandikaulio ančio (sinus maxillaris) dugno pakėlimo, histomorfometrinė analizė parodė, kad kartu panaudojant PRGF regeneruotame kaule buvo daug daugiau naujai susida-riusio kaulo [89]. Klinikinis tyrimas [27], vertinęs PRGF poveikį audinių regeneracijai po viršutinio žandikaulio ančio (sinus maxillaris) dugno pakė-limo atviruoju būdu, parodė, kad kontrolinės grupės (be PRGF) tiriamiesiems atsirado didesnis pooperacinis skausmas ir tinimas. Imunohistocheminė analizė parodė intensyvesnį vaskuliarizacijos procesą regeneruotame kaule, naudojant PRGF (1 mm2 jungiamojo audinio nustatyta 116 kraujagyslių
PRGF grupėje, kontrolinėje grupėje – 7). Tyrimai pacientų, vartojančių bifos-fonatų grupės vaistus, atskleidė teigiamą PRGF poveikį mažinant riziką susirgti bifosfonatų sukelta žandikaulių osteonekroze po dantų rovimo [176]. Mokslinėje literatūroje aprašomi klinikiniai tyrimai parodė teigiamą PRGF įtaką kaulinio audinio regeneracijoje. PRGF turi teigiamą priešuždegiminį poveikį, skatina naujo kaulo susidarymą bei vaskuliarizaciją.
3.10. Alveolinės ataugos išsaugojimas / augmentacija po danties rovimo
Šiuolaikinėje odontologijoje, pradėjus aktyviai atstatinėti prarastus dantis dantų implantais, neišvengiamai susiduriame su būtinybe atkurti prarastą kaulą. Dantų implantų osteointegracija ir ilgaamžiškumas priklauso nuo al-veolinės ataugos kaulo kiekio ir nuo kaulinio audinio kokybių savybių (porė-tumas, tankis, mineralizuoto kaulo kiekis). Literatūros duomenimis, alveoli-nės ataugos atrofija prasideda iš karto po danties rovimo ir praėjus 2 metams vidutiniškai vertikaliai ir horizontaliai rezorbuojasi 40–60 proc. alveolinės ataugos kaulo [1]. Didžiausi alveolinės ataugos dimensiniai pokyčiai įvyksta per pirmuosius tris mėnesius po danties rovimo [6, 34]. Alveolinės ataugos atrofija po danties rovimo gali įtakoti dantenų recesijos atsiradimą gretimų dantų srityje ir turėti neigiamos įtakos dantų implantacijai bei lemti papil-domą kaulo augmentaciją implantacijos metu. Plona skruostinė išrauto dan-ties alveolės sienelė turi įtakos didelei alveolinės ataugos rezorbcijai po danties rovimo [34, 177]. Kūginio pluošto kompiuterinės tomografijos ana-lizė parodė, kad beveik 50 proc. atvejų viršutinio žandikaulio priekinių dantų skruostinės sienelės yra iki 0,5 mm storio [37]. Klinikinis tyrimas, tyręs
sugijusią alveolę nustatė, kad implantacijos ložės, kada skruostinės sienelės plotis buvo ne mažesnis nei 1,8 mm, pasižymėjo stabiliu alveoliniu kaulu be atrofijos [178]. Januario kartu su bendraautoriais [37] atliko tyrimą, kurio metu nustatė, kad V/Ž priekinių dantų srityje mažiau nei 1 proc. tiriamųjų skruostinės sienelės storis yra didesnis nei 1,5 mm. Skruostinės sienelės svar-bą alveolinės ataugos dimensiniams pokyčiams patvirtina klinikinės studijos [178–180], kurios teigia, kad mažėjant skruostinės sienelės storiui didėja alveolinės ataugos rezorbcija. Plona skruostinė sienelė taip pat neigiamai įtakoja ir minkštųjų audinių dimensinius pokyčius ir gali lemti dantenų rece-sijų atsiradimą [181, 182]. Už skruostinės sienelės vaskuliarizaciją yra atsa-kingas greta esantį dantį supantis kaulas, todėl daugiau nei vieno danties rovimas lemia didesnę alveolinės ataugos atrofiją [44]. Klinikiniai tyrimai patvirtino koreliaciją tarp alveolinės ataugos rezorbcijos ir raunamų dantų skaičiaus [45, 46]. Viršutiniame žandikaulyje, šoninių dantų srityje, po
dan-ties rovimo vyksta alveolinės ataugos atrofija kartu su viršutinio žandikaulio ančio (sinus maxillaris) pneumatizacija ir sukelia vertikalaus kaulo aukščio sumažėjimą, kuriam atstatyti reikalinga viršutinio žandikaulio ančio dugno pakėlimo operacija [34]. Sėkmingai implanto osteointegracijai pasiekti ir im-planto ilgaamžiškumui užtikrinti reikalinga pakankamas kaulo bei keratini-zuotos dantenos kiekis aplink implantą ir palanki implanto kryptis krūvio perdavimui ašine kryptimi [183]. Todėl siekiant užtikrinti palankias sąlygas implantacijai ir implanto ilgaamžiškumui tikslinga iki implantacijos išsaugoti kiek įmanoma daugiau alveolinės ataugos kaulo [6]. Didžiausia alveolinės ataugos rezorbcija po danties rovimo vyksta kai raunamas dantis yra pažeistas kraštinio ar viršūninio periodonto patologijos. Taip pat po danties netekimo patyrus traumą ar grubaus rovimo metu, kuomet yra pažeidžiama skruostinė alveolės sienelė [184, 185]. Atliktas tyrimas, vertinantis alveolės išsaugojimą viršūninio ir kraštinio periodontito pažeistose alveolėse. Nustatyta, kad paša-linus infekcijos pažeistus audinius sėkmingą alveolės išsaugojimą pavyko pasiekti 99,3 proc. atvejų [186].
Alveolinės ataugos išsaugojimas ar augmentacija yra rekomenduojama siekiant sumažinti alveolinės ataugos rezorbciją po danties rovimo ar atstatyti alveolinės ataugos tūrį esant pažeistoms kaulinėms sienelėms [6, 22, 19, 185]. Alveolės išsaugojimo procedūros sumažina alveolinės ataugos rezorbciją po danties rovimo, tačiau metodikų, leidžiančių visiškai sustabdyti alveolės atrofiją, nėra. Siekiant išsaugoti alveolinės ataugos kaulą ir minkštuosius audinius, aprašomos metodikos panaudojant kaulo transplantatą kartu su minkštųjų audinių (dantenų) augmentacija [187–190]. Jung’as kartu su bendraautoriais [187] naudodami ksenogeninės kilmės kaulo pakaitalą kartu su kolagenine membrana arba minkštųjų audinių transplantatu gavo statistiškai reikšmingai mažesnę alveolinės ataugos ir minkštųjų audinių
rezorbciją lyginant su alveolėmis gyjančiomis natūraliu būdu. Keletas autorių [191, 192], siekiant sumažinti alveolinės ataugos atrofiją, po danties rovimo pasiūlė vienmomentiškai atlikti danties implantaciją. Tačiau klinikiniai tyrimai parodė, kad vienmomentė implantacija nesumažina alveolinės ataugos rezorbcijos [185, 193, 194].
Autoriai pasiūlė išsaugoti išrauto danties alveolę, jei skruostinės sienelės defektas yra ne didesnis nei 50 proc., o esant daugiau nei pusei pažeistos sie-nelės – atlikti alveolės augmentaciją. Išrauto danties alveolės išsaugojimas taip pat indikuotinas esant plonai skruostinei sienelei (< 0,5 mm) [38, 183, 195]. Šio darbo autorius kartu su bendraautoriais yra aprašęs išrauto danties klasifikaciją ir klinikinį sprendimų medį alveolinės ataugos išsaugojimui ir augmentacjai (3.10.1 lentelė) [38].
3.10.1 lentelė. Sprendimų medis alveolinės ataugos išsaugojimui ir
augmen-tacjai
Priežastys ir indikacijos alveolės išsaugojimui /
augmentacijai Estetinė zona Ne estetinė zona
Estetinės
Neįmanoma pasiekti gero
estetinio rezultato Raunamo danties srityje minkštųjų audinių defektas Skruostinės sienelės de-fektas > 50 proc. Visos skruostinės sienelės defektas Horizontali alveolės
re-zorbcija ˃ 2 mm Horizontali alveolės rezorb-cija ˃ 3 mm Funkcinės
Neįmanoma pasiekti pirminio implanto stabilumo
Periapikaliai šaknies vir-šūnės esantis kaulas ˂ 3 mm, neįmanoma implanto fiksacija alveolėje
Periapikaliai šaknies viršū-nės esantis kaulas ˂ 3 mm, nėra tarpšakninio kaulo Susiję su rizika
Rizika dėl alveolinio kaulo
rezorbcijos Daugiau nei vieno danties rovimas kuomet skruostinės sienelės storis < 2 mm ir plonas dantenų biotipas (˃ 1 mm)
Atidėta arba nerekomenduojama implantacija Periapikalinio periimplantito
išsivystymas Raunamo danties srityje yra apieviršūninis (sin. periapi-kalinis) židinys ˃ 5 mm Rizika perforuoti žandinio
an-čio gleivinę ir siekiant išvengti viršutinio žandikaulio ančio dugno pakėlimo operacijos
Danties šaknų viršūnės protrūduoja viršutinio žandi-kaulio antį
Rizika perforuoti nosies dugną ir siekiant išvengti nosies dugno pakėlimo operacijos
3.11. PRGF panaudojimas siekiant išsaugoti alveolės tūrį po danties rovimo
Po danties rovimo vykstantis alveolės gijimo procesas lemia dimensinius alveolinės ataugos bei regeneruoto kaulo struktūrinius pokyčius. Traumatinis danties rovimas gali turėti įtakos alveolinės ataugos kaulo praradimui ar nepakankamam mineralizuoto kaulo susidarymui ir lemti alveolinės ataugos rekonstrukciją atstatant prarastą kaulinį audinį.
Išrauto danties alveolės išsaugojimas panaudojant PRGF yra tikslingas siekiant sumažinti pooperacinį skausmą, diskomfortą bei stimuliuoti kaulinio audinio ir minkštųjų audinių regeneraciją. Atlikti tyrimai patvirtina PRGF svarbą audinių regeneracijoje mažinant pooperacinį skausmą, uždegimą ir stimuliuojant regeneracinius procesus [27, 89, 172, 174, 175]. Be regene-racinio potencialo, PRGF taip pat pasižymi priešuždegiminiu, antibakteriniu poveikiu ir mažina alveolito atsiradimo riziką [22]. PRGF dalyvauja išskiriant audinių regeneracijai svarbius augimo faktorius bei formuojant fibrino matriksą, kuris išrauto danties alveolėje stimuliuoja hemostazę ir reguliuoja augimo faktorių išsiskyrimą [172]. Allisa R. kartu su bendraautoriais [196] atliko klinikinį tyrimą, kuriame vertino trombocitų gausios plazmos (PRP) įtaką pooperacinio skausmo kontrolei, minkštųjų audinių ir kaulo regene-racijai. Pacientai, kuriems išrauto danties alveolės buvo užpildytos PRP, vartojo mažiau nesteroidinių vaistų nuo uždegimo, buvo stebimas geresnis minkštųjų audinių bei alveolinės ataugos kaulo gijimas. Autoriai taip pat pažymėjo, kad PRP grupėje nebuvo stebima pooperacinių komplikacijų, o kontrolinėje grupėje kai kuriems pacientams išsivystė alveolitas. PRP teigia-mą įtaką pooperacinio skausmo kontrolei taip pat patvirtino studija, tyrusi alveolių gijimą po operacinio protinių dantų rovimo [197]. Literatūroje pla-čiai aprašyta teigiamas PRP poveikis alveolės gijimui po dantų rovimo [176, 198, 199]. Tyrimai su pacientais, vartojančiais bifosfonatų grupės vaistus, parodė teigiamą PRGF poveikį išsaugant išrauto danties alveoles ir suma-žinant riziką susirgti bifosfonatų sukelta žandikaulių osteonekroze [176, 200]. Randomizuota klinikinė, burnos padalijimo (angl. split-mouth) metodu, atlik-ta studija [201], vertinanti retinuotų A/Ž protinių dantų operacinį rovimą, parodė, kad L-PRF pagerino minkštųjų audinių gijimą, sumažino pooperacinį skausmą, veido tinimą ir sumažino alveolito išsivystymo riziką. Klinikinė studija, kurios metu buvo tiriamas PRGF poveikis išrauto danties alveolės regeneracijai pacientams sergantiems cukriniu diabetu, parodė teigiamą PRGF įtaką alveolės gijimui palengvinant pooperacinį laikotarpį ir suma-žinant komplikacijų riziką [202].
3.12. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Norint pasiekti gerus ilgalaikius dantų implantacijos rezultatus, yra svarbu užtikrinti pakankamą alveolinės ataugos kaulo kiekį [9]. Alveolinės ataugos atrofija greitėja netekus dantų ir yra natūralus senėjimo procesas. Po danties rovimo vykstantis alveolės gijimo procesas lemia dimensinius alveolinės ataugos bei regeneruoto kaulo struktūrinius pokyčius. Per pirmuosius 2 metus po danties rovimo vidutiniškai alveolinė atauga rezorbuojasi 40–60 proc. tūrio vertikalia ir horizontalia kryptimis [1]. Alveolinės ataugos išsaugojimas ar augmentacija yra rekomenduojama siekiant sumažinti alveolinės ataugos kaulo atrofiją po danties rovimo ar atstatyti alveolinės ataugos tūrį esant pa-žeistoms išrauto danties alveolės kaulinėms sienelėms [6, 19, 22, 185].
Klinikinėje praktikoje autogeninės kilmės kaulo naudojimas kaulinio au-dinio rekonstrukcijai yra „aukso standartas“, kuriam būdingos osteogeninės, osteoindukcinės ir osteokondukcinės savybės [15–18]. Tačiau dėl padidėju-sios komplikacijų rizikos, susijupadidėju-sios su papildoma donorine sritimi, nekont-roliuojamos kaulo rezorbcijos ir riboto autotransplantato kiekio, yra atliekami tyrimai ieškant alternatyvios kaulo plastinės medžiagos audinių regenera-cijoje [19, 20]. Paprastai dauguma kaulo transplantatų pasižymi osteokon-dukcinėmis savybėmis ir tarnauja kaip karkasas naujo kaulinio audinio rege-neracijoje nestimuliuodami naujo kaulo susidarymo. Norint rekonstruoti ir atkurti didelius ar mišrius (sin. kombinuotus) kaulo defektus, pacientams ser-gant sisteminėmis ligomis arba pacientams, kurių sutrikusi kaulo metaboliz-mą reguliuojančių hormonų pusiausvyra, yra labai svarbu gerinti kaulo trans-plantato osteogeniškumą. Siekiant pagerinti regeneracines kaulo transplan-tatų savybes, jų panaudojimas gali būti derinamas kartu su augimo faktoriais ar kamieninėmis ląstelėmis [27, 33, 64–66, 89, 96, 97, 162–171, 174].
Iš riebalinio audinio išskirtos kamieninės ląstelės (RKL) gali būti naudo-jamos siekiant pagerinti regeneracines kaulo pakaitalų savybes. RKL yra daugiagalės (sin. multipotencinės) ląstelės ir gali diferencijuoti į įvairių rūšių, tarp jų – ir kaulines ląsteles. Šios rūšies kamieninės ląstelės yra puiki kaulinio audinio regeneracijos alternatyva, nes yra nesudėtinga ir neinvazyvi riebali-nio audiriebali-nio paėmimo metodika, riebalinis audinys greit atsinaujina, jo pa-naudojimas nėra ribojamas dėl bioetinių priežasčių, taip pat šios ląstelės mažai imunogeniškos [25, 26]. Kaip alternatyvus pasirinkimas RKL, siekiant pagerinti kaulo pakaitalų savybes, gali būti naudojama įvairūs trombocitų koncentratai. Aktyvuoti trombocitai ir leukocitai išskiria augimo faktorius, kurie stimuliuoja kaulinio audinio regeneraciją bei vaskuliarizaciją, mažina uždegimą, taip pat veikia antibakteriškai [27, 28]. PRGF technologija, prie-šingai nei kiti trombocitų koncentratai, savo sudėtyje neturi leukocitų [30].
PRGF naudojant kartu su kaulo pakaitalais, trombocitų išskirti augimo fak-toriai reguliuoja ląstelių diferenciaciją, proliferaciją, migraciją ir apoptozę [171], suriša ir fiksuoja kaulo granules, apsaugo nuo minkštųjų audinių įau-gimo bei kaulo granulių migravimo į minkštuosius audinius.
4. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
Mokslinis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos Odontologijos fakulteto Veido ir žandikaulių chirur-gijos klinikoje, bendradarbiaujant su LSMU Gyvūnų tyrimų centru, moks-linių tyrimų laboratorija „Froceth“, Biotechnologijų Institutu (angl. Bio-technology Institute, Vitorija, Ispanija). Moksliniams tyrimams gautas Vals-tybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas (Nr. G2-62), Kauno regio-ninio biomedicininių tyrimų komiteto ir LSMU Bioetikos centro leidimas (Nr. BE-2-27).
Mokslinį darbą sudaro eksperimentinė ir klinikinė dalys. A. Eksperimentinės tyrimo dalies schema:
1. Tyrimai in vivo:
a) Ksenogeninės kilmės kaulo pakaitalu regeneruotų kaulo defektų histomorfometrinė analizė Naujosios Zelandijos triušių kaukolės skliauto defektų modelyje.
b) PRGF bioaktyvuotu ksenogeninės kilmės kaulo pakaitalu regene-ruotų kaulo defektų histomorfometrinė analizė Naujosios Zelandijos triušių kaukolės skliauto defektų modelyje.
c) RKL bioaktyvuotu ksenogeninės kilmės kaulo pakaitalu regeneruotų kaulo defektų histomorfometrinė analizė Naujosios Zelandijos triu-šių kaukolės skliauto defektų modelyje.
d) PRGF ir RKL bioaktyvuotu ksenogeninės kilmės kaulo pakaitalu re-generuotų kaulo defektų histomorfometrinė analizė Naujosios Ze-landijos triušių kaukolės skliauto defektų modelyje.
2. Statistinė analizė
B. Klinikinės tyrimo dalies schema:
1. Poekstrakcinės alveolės išsaugojimo / augmentacijos indikacijų sukū-rimas.
2. Poekstrakcinės alveolės dimensinių pokyčių vertinimas gyjant natūra-liai ir po alveolės išsaugojimo naudojant ksenogeninės ir alogeninės kilmės kaulo pakaitalą bei PRGF. Statistinė analizė.
3. Išrauto danties alveolės gijimo kokybinė analizė vertinant regeneravusį kaulą gyjant natūraliai ir po alveolės išsaugojimo naudojant kseno-geninės ir alokseno-geninės kilmės kaulo pakaitalą bei PRGF. Statistinė analizė.
4.1. Eksperimentiniai in vivo tyrimai
Tyrimai in vivo: regeneruotų kaulo defektų histomorfometrinė analizė Naujosios Zelandijos triušių kaukolės skliauto defektų modelyje.
4.1.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Šiame tyrime buvo tirta 20 suaugusių Naujosios Zelandijos triušių (3,5– 4,0 kg svorio). Gyvūnai buvo laikomi jiems skirtuose narvuose ir nuolat ste-bimi veterinarijos gydytojo. Kiekvienam gyvūnui buvo suformuota keturi standartizuoti ovalo formos (6,5 mm skersmens ir 2,0 mm gylio) kaukolės skliauto defektai. Ypatingas dėmesys kaukolės defektų formavimo metu buvo skirtas siekiant išsaugoti nepažeistą kietąjį smegenų dangalą (lot. dura mater cranialis). Kaulo defektai atsitiktine tvarka buvo priskirti vienai iš penkių grupių: I grupės defektai buvo palikti gyti natūraliai per kraujo krešulį (n1 = 16) ir buvo laikoma kontroline grupe, II grupės defektai užpildyti
kseno-geninės kilmės kaulo pakaitalu (BBM) (n2 = 16), augimo faktoriais gausia
plazma (PRGF) aktyvuotas kaulo transplantatas buvo panaudotas regeneruo-jant III grupės (BBM/PRGF) kaulo defektus (n3 = 16), IV grupės kaukolės
skliauto defektai regeneruoti naudojant ksenogeninės kilmės kaulo transplan-tatą aktyvavus kamieninėmis ląstelėmis išskirtomis iš riebalinio audinio (BBM/RKL) (n4 = 16), tuo tarpu V grupės defektai užpildyti ksenogeninės
kilmės kaulo transplantatą aktyvavus RKL ir PRGF (BBM/RKL/PRGF) (n5 = 16). Kaulo defektų atsitiktinės atrankos randomizacijai buvo panaudota
atviro kodo kompiuterinė programa (http://www.randomization.com). Pooperaciniu laikotarpiu gyvūnai galėjo laisvai judėti savo narvuose, buvo kontroliuojamas dienos šviesos ir temperatūros ciklas. Maistas ir vanduo buvo prieinamas ad libitum. Pooperacinei skausmo kontrolei pirmas tris paras skirtos buprenorfino injekcijos. Eksperimentiniai gyvūnai priskirti trims skirtingiems tyrimo laikotarpiams: 2, 4 ir 8 savaitės (4.1.1.1 pav.).
4.1.1.1 pav. In vivo tyrimo eigos schema
4.1.2. Riebalinio audinio kamieninių ląstelių išskyrimas ir kultivacija
Riebalinis audinys 30–50 min. buvo skaidomas kolagenaze ir išgauta stro-mos vaskuliarinė frakcija (SVF), kuri buvo centrifuguota 10 min. 600 g rėžimu. Ląstelės plautos jas suspenduojant mitybine terpe (DMEM, Sigma-Aldrich, Co) kartu su 10 proc. fetaliniu veršelio serumu (FBS, angl. fetal bovine serum) ir pasėtos į naujus flakonus 1,5 × 104 ląstelių/cm2 tankiu.
Kuomet kultivuojamos ląstelės padengė 80 proc. flakono dugno ploto, jos buvo persėjamos naudojant 0,25 proc. tripsino – 0,5 mM etilendiamino tetraacto rūgšties (EDTA) tirpalą (Sigma-Aldrich, Co.) ir DMEM kartu su FBS 10 proc. terpę. Pakartotinai centrifugavus, ląstelės suspenduotos mity-bine terpe ir pasėtos į naujus flakonus (T75) 1,5 × 104 ląstelių/cm2 tankiu.
Ląstelių morfologija kasdien buvo tirta invertuotu fazės mikroskopu (Nikon). Ląstelių fenotipas buvo vertinamas citometrinės analizės metodu (Becton, Dickinson & Co.).
