1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS
BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTAS
ALINA RAMANAUSKIENĖ
INSULINO AUGIMO FAKTORIAUS (IGF) GENO ĮTAKA
GALVIJŲ PRODUKTYVUMO SAVYBĖMS
Gyvulininkystės technologijos magistro studijų baigiamasis darbas
Darbo vadovė: prof. dr. Ilona Miceikienė
2
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas – Insulino augimo faktoriaus (IGF) geno įtaka galvijų produktyvumo savybėms.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. 2013 03 28 Alina Ramanauskienė
(data) (autoriaus vardas ir pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
201303 28 Alina Ramanauskienė
(data) (autoriaus vardas ir pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
Prof. dr. Ilona Miceikienė
(data) (darbo vadovo vardas ir pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
Prof. dr. Ilona Miceikienė
(aprobacijos data) (katedros vedėjo/jos vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 91.1. Galvijų selekcija genetinių žymenų pagalba ... 9
1.2. Biologinis insulino augimo faktoriaus vaidmuo ... 9
1.2.1. IGF – 1 koncentracijos įtaka žmonių ir pelių augimui ... 12
1.2.2. IGF – 1 geno įtaka galvijų augimo ypatumams ... 13
1.3. Genų įtaka galvijų produktyvumo savybėms ... 15
1.3.1. Augimo hormono geno įtaka galvijų produktyvumui ... 15
1.3.2. Miostatino geno įtaka galvijų produktyvumui ... 15
1.3.3. Leptino geno įtaka galvijų produktyvumui ... 17
1.4. Tirtų galvijų veislių apibūdinimas ... 18
1.4.1. Šarolė veislės galvijai ... 18
1.4.2. Limuzinų veislės galvijai ... 19
1.4.3. Lietuvos juodmargiai galvijai ... 20
1.4.4. Lietuvos žalieji galvijai ... 21
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 22
2.1. Tyrimo schema ... 22
2.2. Tyrimo medžiaga ... 23
2.3. Tyrimo metodai ... 23
2.3.1. DNR išskirimas iš plauko svogūnėlio ląstelių ... 23
2.3.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas ... 23
2.3.3. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ... 23
2.3.4. Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas (PGR – RFIP) ... 24
2.3.5. Elektroforezė agarozės gelyje ... 24
2.3.6. Dažymas etidžio bromidu ... 24
2.3.7. Genotipavimas ... 24
2.3.8. Galvijų IGF – 1 geno tyrimo metodika ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI ... 27
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
IŠVADOS ... 33
4
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
bp – bazių pora
DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis GDF8 – augimo diferencijavimo veiksnys 8 GH – augimo hormonas
GHR – augimo hormono receptorius
GHRH – augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas
GHRHR – augimo hormoną atpalaiduojančio hormono receptorius IGF – insulino augimo faktorius
IGFR – insulino augimo faktorius receptorius IGFBP – insulino augimo faktoriaus baltymai iRNR – informacinė ribonukleino rūgštis LEP – leptinas
LI – Limuzinų veislė
LJ – Lietuvos juodmargių veislė LŽ – Lietuvos žalųjųveislė MSTN – miostatinas
mRNR – mitochondrinė ribonukleino rūgštis PGR – polimerazės grandininė reakcija QTL – kokybinių požymių lokusai
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas kDa – kilodaltonas
5
SUMMARY
Author: Alina Ramanauskienė
Title: The effect of insulin like growth factor (IGF) gene on production traits in cattle.
Supervisor: Prof. dr. Ilona Miceikienė
Place of work: The work was carried out at K. Janusauskas Laboratory of Animal Genetics of Veterinary Academy, Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2011 – 2013.
Size of Thesis: 39 pages, 12 figures, 8 tables.
Object and tasks of work: Collect and analyze scientific literature on IGF – 1 gene and examine
its effect on cattle production traits. Estimate genotype distribution and allelic frequencies at the IGF – 1 gene. Examine the effect of IGF – 1 gene on weight gain in cattle.
Research methodology: Analysis of scientific literature, scientific articles, and statistical data. The
practice part involved research of cattle IGF – 1 gene. Research findings and results were discussed using method of generalization. Theoretical analysis used scientific papers by different foreign and Lithuanian researchers. Different articles and research material offering information on the issue under consideration were used as the basis for the research.
Results and conclusions. The IGF – 1 gene located on chromosome 5 was found to be a factor that
regulates growth rate in cattle. Our research found that IGF – 1 gene has two alleles – A and B. Allele A frequency was 0.471, and allele B – 0.529. Allele A at its highest frequency of 0.708 was found in Lithuanian Black and White cattle breed, and allele B at its highest frequency of 0.711 – in Limousin cattle breed (see Table 2).
The following three different genotypes were found for IGF – 1 gene: AA, AB, and BB. AA genotype of IGF – 1 gene showed the lowest frequency and varied from 0.053 in Limousin cattle breed to 0.500 in Lithuanian Black and White cattle breed, whereas AB genotype showed its highest frequency and varied from 0.400 in Lithuanian Red cattle breed to 0.533 in Charolais cattle breed. BB genotype of insulin – like growth factor IGF – 1 gene showed frequency from 0.083 in Lithuanian Black and White cattle breed to 0.474 in Limousin cattle breed. The cattle group under investigation showed AA genotype at frequency of 0.235, AB genotype – at frequency of 0.471, and BB genotype – at frequency of 0.294 (see Table 4).
Analysis of data on cattle weight gains lead to conclusion that animals carrying BB genotype of IGF – 1 gene showed higher weight gains (see Table 6). According to our research, BB genotype with the highest frequency was found in Limousin cattle breed 47%. Our research allow claiming
6 that BB genotype can be considered as a superior, and animals carrying BB genotype of IGF – 1 gene are most valuable for production as they show higher weight gains.
Practical significance of the research. The discovered polymorphism in the insulin – like growth
factor IGF – 1 gene, and the effect of the gene on weight gain in cattle allows for selecting animals with the desired genotype and through marker assisted selection (MAS) improve livestock production.
7
ĮVADAS
Pastaraisiais metais padidėjo susidomėjimas galvijų selekcija, kurios yra pagrįstos genetinių technologijų pagalba. Intensyvios gyvulininkystės sąlygomis, kai pagrindinius reikalavimus diktuoja rinka, svarbu tinkamai pritaikyti selekcijos ir genetikos pasiekimus. Molekulinių genetinių metodų dėka atsiveria galimybės įvertinti gyvulį ir pilnai panaudoti jame slypinčias naudingas ūkines savybes. Naujausių molekulinių genetikos pasiekimų dėka galime identifikuoti genus, turinčius įtakos galvijų augimo spartai, raumeningumui, mėsos produkcijai ir jos kokybei. Yra nustatyta nemažai genų, kurie turi įtakos galvijų produktyvumui. Tai – insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) genas, augimo hormono (GH) genas, miostatino (MSTN) genas, leptino (LEP) genas (Bishop et al., 1991, Siadkowska et al., 2006; Miceikienė et al., 2006; Krasnopiorova et al., 2010). Šie genai yra svarbūs genai kandidatai, kadangi jų svarbus fiziologinis poveikis tiesiogiai susijęs su ekonominiais požymiais.
Vienas iš genų ypač domina tyrinėtojus – tai IGF – 1 arba insulino augimo faktoriaus genas. Insulino augimo faktorius (IGF – 1) į hormoną panašus polipeptidas, susijęs su keliais ekonominiu požiūriu svarbiais ypatumais, būtent su galvijų augimu ir vystymuisi (Spicer and Chamberlain, 1998). Nustatyta, kad IGF – 1 genas koduoja augimo faktorių, kuris yra susijęs su gyvulio svorio augimu (Froesch et al., 1985). Taip pat IGF – 1 genas turi įtakos raumenų vystymuisi (Baker et al., 1993). Šio mūsų darbo tikslas buvo ištirti insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno polimorfizmą ir jo poveikį galvijų produktyvumo savybėms.
Lietuvoje insulino augimo faktoriaus geno įtaka galvijų produktyvumo savybėms iki šiol nebuvo tyrinėta.
8
Darbo tikslas:
Ištirti insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno poveikį galvijų produktyvumo savybėms.
Darbo uždaviniai:
Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geną ir jo įtaką galvijų produktyvumo savybėms.
Nustatyti insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno alelių ir genotipų dažnius.
Įvertinti insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno įtaką galvijų priesvoriui.
Darbo naujumas:
Pirmą kartą Lietuvoje buvo ištirtas insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) genas bei nustatyta jo įtaka galvijų priesvoriui.
Darbo praktinė reikšmė:
Rastas insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno polimorfizmas bei nustatyta jo įtaka galvijų priesvoriui leidžia atrinkti gyvulius su pageidaujamu genotipu ir tokiu būdu, vykdant selekciją genetinių žymenų pagalba, gerinti galvijų priesvorį.
Darbo struktūra:
Darbą sudaro šie skyriai – santrauka anglų kalba, įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas. Darbe yra pateiktos 8 lentelės, 12 paveikslų. Darbo apimtis 39 puslapiai.
9
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.Galvijų selekcija genetinių žymenų pagalba
Pagrindiniai veislininkystės uždaviniai yra gyvulių veislių genetinio potencialo panaudojimas, produktyvumo didinimas ir ūkiškai naudingų savybių gerinimas. Vienas iš būdų pasiekti šiuos tikslus, yra genetinių žymenų panaudojimas ir pritaikymas selekcijoje (Malevičiutė ir kt., 2002). Genas ar genų grupė, lemianti tam tikrą požymį, yra vadinama genetiniu žymeniu. Šiuo atveju DNR seka, kuri patikrina geną, yra žinoma kaip žymuo, nes žymi chromosomos vietą, kuri nurodo požymį. Genai, atrandami tokiu būdu, yra žinomi kaip kiekybiniai požymių lokusai (QTL). Dauguma ekonomiškai svarbių požymių yra sąlygojami daugelio genų. Genetinių žymenų panaudojimas žemės ūkio gyvulių selekcijoje atveria galimybes įvertinti gyvulį iš vidaus ir pilnai panaudoti jame slypinčias naudingas ūkines savybes. Panaudojant genetinius žymenis, galima vykdyti selekciją tiek pagal vieną požymį, kurį lemia tik vienas genas, tiek pagal kelis požymius, kuriuos lemia genų grupė (Malevičiutė ir kt., 2002; Miceikienė ir kt., 2006).
Per pastarąjį dešimtmetį pasaulyje susidomėta galvijų kiekybinių požymių lokusais bei jų įtaka produktyvumo rodikliams. Galvijų genotipavimui naudojami specifiniai sintetiniai žymenys, kurie atpažįsta ir nustato tokius požymius kaip augimo greitis, mėsingumas, pieningumas, reprodukcinės savybės. Išvardinti rodikliai yra svarbūs atliekant galvijų genetinius tyrimus. Pagrindinis šių tyrimų tikslas yra identifikuoti norimą geną ar genus, atsakingus už produktyviąsias galvijų savybes (Polineni et. al., 2006).
Daugiau kaip prieš dešimtmetį didžiulė pažanga buvo padaryta genotipuojant ir apibūdinant galvijų genomą. 1992 metais buvo pradėtas galvijų genomo projektas (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/bovine). Nuo to laiko pasiektas didelis progresas galvijų genomo supratime. Gyvulių genomo genetiniai žemėlapiai buvo pritaikyti atliekant kelių lokusų sąsajų, lokusų ir genų, susijusių su galvijų ekonomiškai naudingais požymiais. Galvijų genomo duomenų bazėje yra daugiau nei 3800 genų ir daugiau nei 3600 genetinių žymenų (http://locus.jouy.inra.fr). Netolimoje ateityje visas galvijų genomas bus pilnai ištyrinėtas ir šie rezultatai bus svarbus žingsnis išnaudojant galvijų genomą, randant naudingų ūkinių savybių molekulinį pagrindą. Pilnas šių genų ištyrimas padės paspartinti žemės ūkio gyvulių selekcijos procesą.
1.2. Biologinis insulino augimo faktoriaus vaidmuo
Mokslininkai Salmon ir Daughaday (1957) in vitro sąlygomis iš žiurkių kraujo išskyrė „faktorių“, stimuliuojantį sulfato įsisavinimą kremzlių ląstelėse ir tą medžiagą pavadino
10 „sulfatacijos faktoriumi“. Vėliau buvo nustatyta, kad šis „sulfatacijos faktorius“ turi panašumą į insuliną ir stimuliuojantį poveikį ląstelių dauginimuisi ir diferenciacijai. 1989 metais mokslininkai Daughaday ir Rotwein šį faktorių pavadino „panašiais į insuliną augimo faktoriais“ (IGF), būtent dėl jiems būdingo ląstelių augimą stimuliuojančio poveikio ir struktūrinio panašumo į proinsuliną.
Insulino augimo faktorius – 1 yra į hormoną panašus polipeptidas. IGF sistema susidaro iš dvejų formų (IGF – 1 ir IGF – 2), IGF receptorių (IGF1R ir IGF2R tipų) ir šešių jungiamųjų baltymų IGFBP. Didesniu biologiniu veiklumu pasižymi trys iš šešių IGFBP. IGFBP – 1 ir IGFBP – 2 užtikrina IGF – 1 transportavimą per endotelines ląsteles, tuo tarpu IGFBP – 3 užtikrina jo cirkuliaciją kraujyje. IGF yra randamas dviejose formose (IGF – 1 ir IGF – 2), kurios skiriasi tarpusavyje keliomis amino rūgštimis. IGF – 1 ir IGF – 2 yra polipeptidas sudarytas 70 ir 67 amino rūgščių, o jų molekulinė masė yra 7,6 ir 7,4 kDa (1 pav.).
1 pav. Insulino augimo faktoriaus molekulės aminorūgščių seka http://www.peptidelabs.com/igf1.html
IGF polipeptidai turi penkias sritis (nuo A iki E). A ir B srityse yra 70 proc. homologijos, tokia pati kaip proinsulino amino rūgšties sekoje, o C sritis – skiriasi ir turi lemiamos reikšmės prisijungimui prie IGF receptoriaus. IGF receptorių randama daugelyje organų ir audinių. Tiek IGF – 1, tiek IGF receptoriai yra panašūs, ir tai byloja apie evoliucinę sąsają tarp šių molekulių (Zapf and Froesch, 1986).
Kiaulių IGF – 1 polipeptidai turi po pagrindinį peptidą („lyderį“), kuris yra sudarytas iš 25 amino rūgščių ir terminalinės grandininės struktūros, sudarytos iš 35 amino rūgščių, o tai reiškia,
11 kad polipeptidas prieš subręsdamas patiria reikšmingą apdorojimą (Tavakkol et al., 1988). Tiek IGF – 1, tiek IGF – 2 poveikį daro per savo receptorius. Insulino augimo faktoriaus 1 receptorius (IGF1R) yra dimeras, kuriam būdingi tam tikri panašumai į insuliną. Insulino augimo faktoriaus 2 receptorius (IGF2R) yra monomeras. IGF1R ir IGF2R atitinkamai dar yra vadinami pirmojo ir antrojo tipo receptoriais. Tiek IGF – 1, tiek IGF – 2 gali prijungti IGF1R, bet IGF – 1 negali prijungti IGF2R, arba prisijungia, bet labai silpnai. IGF – 1, IGF – 2, IGF1R, IGF2R aptinkami beveik visuose audiniuose, įskaitant raumeninį audinį ir riebalinio audinio ląsteles (Lee et al., 1993). IGF – 2 gali atlikti tam tikrą vaidmenį reguliuojant IGF – 1 veiklą, nes jis gali prijungti IGF1R. Apykaitoje galima aptikti laisvų (neprijungtų) IGF, bet dažniausiai jie aptinkami prisijungę prie insulino augimo faktorių jungiančių baltymų (IGFBP). IGF – 1 kraujyje yra ilgesnis negu GH, nes jis yra prijungtas prie jungiančių baltymų, kurių sintezė vyksta kepenyse ir yra pavaldi augimo hormonui. IGFBP gali veikti kaip IGF faktorių saugyklos. Jie reguliuoja IGF – 1 polipeptido prieigą prie jo tikslinių audinių. Žmonių organizmuose beveik 80 proc. IGF – 1 apykaitoje aptinkamas kaip tretinis kompleksas, apimantis IGF – 1, IGFBP3, ir ALS. ALS – tai molekulė, labai panaši ir gimininga kompleksams, kuriuos IGF – 1 molekulė sudaro su IGFBP3 arba IGFBP5. Ji saugo šiuos kompleksus nuo skilimo. IGF – 1 ir IGFBP3 koncentracijos pelių kraujyje, iš kurių organizmo buvo pašalinta ALS, atitinkamai buvo mažesnis 60 ir 90 proc., nors pelės augo normaliai (Boisclair et al., 2001). Sutrumpinta IGF – 1 forma prijungia mažiau IGFBP ir ląstelių dauginimosi stimuliavimo atžvilgiu yra 10 kartų stipresnė už normalų IGF – 1 (Ballard et al., 1996). GH reguliuoja ir IGF – 1, ir IGFBP3 koncentraciją apykaitoje. Kepenys yra pagrindinė vieta galvijų organizme, kur susidaro IGF – 1. Bulių kepenyse yra aptikta IGF – 1, IGF – 2, augimo hormono receptorių (GHR), bei IGFBP1, IGFBP2 ir IGFBP3 (Cordano et al., 2000). Kepenyse beveik visai nesigamina IGF1R iRNR, nes IGF – 1 reguliuoja IGF1R gamybą, o IGF – 1 koncentracija kepenyse yra pati didžiausia. Embriogenezės metu IGF1R galima aptikti beveik visų tipų audiniuose ir ląstelėse, o tai reiškia, kad IGF – 1 turi didelę reikšmę ankstyvojo embriono vystymosi stadijoje. GH augimą skatina tarpininkas IGF – 1. IGF – 1 sustiprina kremzlių, riebalinio audinio ir daugybės kitų audinių reakciją į GH poveikį.
Įvairiose gyvūnų organizmų sistemose pastebėtas sisteminis IGF – 1 poveikis paskatino mokslininkus pamėginti leisti IGF – 1 tiesiai į gyvūnų audinius ir stebėti, kokius pakitimus gali iššaukti apykaitoje padidėjusi IGF – 1 koncentracija. Mokslininkai Cottam su kolegomis (1992) aštuonias savaites leido avims IGF – 1. Jų organizmuose IGF – 1 koncentracija buvo dvigubai didesnė negu kontrolinės grupės avių. Injekcijos neturėjo jokios įtakos suvartojamo pašaro kiekiui, vilnos augimui, kaulų ilgiui, griaučių svoriui, bet turėjo įtakos padidintam gliukozės kiekiui kraujyje, lyginant su kontroline grupe. Autoriai padarė išvadą, kad IGF – 1 injekcijos avims neturi
12 jokios reikšmingos įtakos jų somatiniam augimui, bet iššaukia inkstų ir blužnies augimo pakitimus, ir atsiliepia gliukozės metaboliniams procesams. Augimo hormonų injekcijos karvėms didina pieno susidarymą, ir šis padidėjimas yra siejamas su didesne IGF – 1 koncentracija. Autoriai nurodo, kad amžius ir laktacija buvo svarbūs veiksniai, nuo kurių priklausė IGF – 1 koncentracija (Buskirk et al., 1996).
1.2.1. IGF – 1 koncentracijos įtaka žmonių ir pelių augimui
Žmogaus IGF – 1 genas randamas 12 chromosomoje (2 pav) (Tricoli et al., 1984). Genas turi 6 egzonus ir yra apie 90 kb ilgio.
2 pav. IGF – 1 geno vieta 12 žmogaus chromosomoje http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IGF1
Insulino augimo faktorius yra pagrindinis hormoninis kūno augimo mediatorius. Normaliomis sąlygomis augimo hormonas (GH) prisijungia prie savo receptoriaus kepenyse ir kituose audiniuose bei skatina IGF – 1 sintezę. Audiniuose taikiniuose 1 tipo IGF – 1 receptorius, kuris yra homologinis insulino receptoriui, yra aktyvuojamas IGF – 1 ir sukelia signalų tarp ląstelių perdavimą, stimuliuojantį įvairius procesus, sukeliančius kūno augimą. Metaboliniai IGF – 1 veiksmai yra iš dalies nukreipti skatinti gliukozės, riebiųjų rūgščių ir amino rūgščių įsisavinimą, ir tokiu būdu metabolizmas palaiko audinių augimą.
IGF – 1 yra būtinas, kad audiniai galėtų normaliai augti ir vystytis (Yakar et al., 2002). IGF – 1 įtaka yra reikšmingesnė pogimdyminiu laikotarpiu, o IGF – 2 daugiau reikšmės turi vaisiaus augimui ir vystymuisi. Ląstelių dauginimuisi ir diferenciacijai IGF – 1 turi didesnę įtaką vaisiaus, o ne suaugusiojo organizmo ląstelėse. IGF – 1 trūkumas embriono organizme nulemia reikšmingus augimo sutrikimus ir anomalijas, o tai įrodo, kad IGF – 1 yra būtinas, kad audiniai galėtų normaliai augti ir vystytis (Baker et al., 1993). Neseniai atliktų tyrimų duomenys byloja, kad šių esminių funkcijų reguliavimo atžvilgiu, vietiškai besigaminantis IGF – 1 gali būti svarbesnis už dalyvaujantį apykaitoje (Yakar et al., 1999). Genetiškai modifikuotos pelės, iš kurių organizmo buvo pašalinti IGF – 1 arba IGF – 2 genai, gimimo metu svėrė perpus mažiau nei kontrolinės (Baker et al., 1993). Pelės su pašalintu IGF1R gimimo metu nugaišo dėl kvėpavimo sutrikimo, o pelės su pašalintu
13 IGF2R nenukrypo nuo normų, nors vėliau po gimimo buvo stebimas sulėtėjęs augimas. IGF – 1 gali veikti beveik vien tik per IGF1R, nes bandymų su pelėmis, iš kurių organizmo pašalintas IGF1R ir IGF – 1, rezultatai yra labai panašūs. Larono sindromas, pasireiškiantis žmonių augimo sutrikimu, yra siejamas su GH receptoriaus geno mutacija, kuris slopina IGF – 1 apykaitą ir lėtina raumenų augimą. Kita vertus, jų GH koncentracija yra padidėjusi. Įdomu tai, kad eksperimentų būdu pelės, kurių IGF – 1 koncentracija buvo 75 proc. mažesnė nei kontrolinių, o GH kiekis – didesnis, augo normaliai (Yakar et al., 1999), kai tuo tarpu natūraliomis sąlygomis susiklosčius panašiam hormonų balansui žmonių organizme tai lėmė augimo sutrikimą. Šie tyrimai rodo, kad IGF – 1 įtaka žmonių ir pelių augimui gali būti skirtinga. Augimui, pogimdyminiu laikotarpiu apykaitoje dalyvaujantis IGF – 1, gali lemiamos reikšmės ir neturėti, bet GH koncentracija atsiliepia neigiamai (Cushman et al., 2000).
1.2.2. IGF – 1 geno įtaka galvijų augimo ypatumams
Gyvūnų augimas kontroliuojamas pagal sudėtingą sistemą, kurioje insulino augimo faktorius (IGF – 1) vaidina svarbų vaidmenį. Mokslininkai Lemal ir kt. (1989) telyčioms leido galvijų GH. Tyrimo eigoje IGF – 1 kiekis padidėjo, o vidutinė IGF – 1 koncentracija buvo susijusi su paros priesvoriu. Galvijai, kurių IGF – 1 koncentracija buvo mažesnė, svėrė daugiau ir priaugo daugiau svorio (Davis and Simmen, 1997). Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad patologinė būklė, kuriai būdingas didesnis svoris gimimo metu, ir ilgiau trunkantis karvių, išvestų klonuojant somatines ląsteles, nėštumas gali būti susijęs su IGF – 1 stokojančių šių gyvūnų organizmo sistema (Matsuzaki and Shiga, 2002). Klonuotų telyčių IGF – 1 ir IGFBP2 koncentracijos buvo didelės. Autoriai padarė išvadą, kad klonuotų veršelių IGF sistema neperėjo į subrendusio organizmo būseną ir tai tapo pastebėto nukrypimo nuo normos priežastis. Taip pat buvo pastebėta pakitusi klonuotų veršelių IGF1R apraiška (Lazzari et al., 2002). IGF1R geno pasireiškimo pakitimas taip pat gali būti laikomas nulėmusiu didelių palikuonių sindromą, pastebėtą tarp klonuotų veršelių.
Vienas iš svarbiausių faktorių, sąlygojančių spartų galvijų augimą – IGF – 1. Insulino augimo faktorius – 1 yra panašus į hormoną polipeptidas, susijęs su galvijų augimu ir vystymuisi (Spicer and Chamberlain, 1998). Galvijų IGF – 1 genas randamas 5 chromosomoje (3 pav.) (Bishop et al., 1991).
Galvijų IGF – 1 genas susideda iš šešių egzonų (4 pav.), 7,5 kDa molekulinės masės ir sudarytas iš 70 amino rūgščių (Bishop et al., 1991). IGF – 1 geno amino rūgščių seka yra įvairi ir priklauso nuo žinduolių rūšies. Nustatyta, kad žmogaus, galvijų, šunų ir kiaulių IGF – 1 amino rūgščių sekos yra identiškos, tačiau žiurkių ir pelių skiriasi nuo paminėtųjų (Nixon et al., 1999).
14 3 pav. Insulino augimo faktoriaus (IGF -1) geno vieta 5 galvijų chromosomoje http://locus.jouy.inra.fr/
Egzonų skaičius tarp rūšių yra labai skirtingas, pavyzdžiui ožkų, kiaulių ir avių IGF – 1 genas susideda 1 – 6 egzonų (Mikava et al., 1995). Žmonių ir žiurkių susideda 1 – 5 egzonų (Rotwein et al., 1986). Mokslininkai Wang su kolegomis (2003) nustatė, kad galvijų 4 ir 5 egzonai yra išreiškiami alternatyviai, dėl to susidaro įvairios informacinės ribonukleinorūgštys (iRNR).
4 pav. IGF – 1 genas yra sudarytas iš šešių egzonų
http://jcs.biologists. org/ content /123/6/960/F1.expansion.html
Nustatyta, kad IGF – 1 genas koduoja augimo faktorių, kuris yra susijęs su gyvulio svorio augimu (Clemmons et al., 1987). Taip pat IGF – 1 genas turi įtakos kaulų ir raumenų vystymuisi (Spicer et al., 2000). IGF – 1 genas skatina amino rūgščių sunaudojimą ir baltymo sintezę raumenyse bei kituose audiniuose (Baker et al., 1993). Dėl savo biologinės funkcijos, IGF – 1 genas yra laikomas kaip genas kandidatas, kuris yra susijęs su augimo ir mėsos kokybės rodikliais gyvūnų genetinio potencialo gerinimu (Machado et al, 2003).
Galvijų IGF – 2 genas randamas 29 chromosomoje. Galvijų IGF – 2 genas turi aštuonis egzonus (Goodall and Schmutz, 2007). IGF – 2 yra stipriai veikiantis ląstelių augimo ir diferenciacijos faktorius, todėl veikia ir žinduolių vystymąsi bei augimą. IGF – 2 pagrinde yra
15 sintezuojamas embrioniniu ir pogimdyminiu metu. Taigi yra manoma, kad jis yra embriono augimo ir diferenciacijos faktorius. IGF – 2 genas užtikrina specifinę išraišką kiekvieno audinio vystymosi atveju (Butler and LeRoith, 2001). IGF – 2 ir jo receptoriams būdingas motininis imprintingas (t.y., iš motinos paveldėtas alelis palikuonyse nepasireiškia). IGF1R aptinkamas visame kūne, o jo trūkumas yra siejamas su galvijų augimo anomalijomis (Kitagawa et al., 2001).
1.3. Genų įtaka galvijų produktyvumo savybėms
1.3.1. Augimo hormono geno įtaka galvijų produktyvumui
Augimo hormono geno ekspresijos kelias susideda iš skirtingų susijusių genų, tokių kaip GH (augimo hormonas), IGF – 1 (insulino augimo faktorius), GHR (augimo hormono receptorius), GHRH (augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas), GHRHR (augimo hormoną atpalaiduojančio hormono receptorius) ir kiti (Cogan and Phillips, 1998). Augimo hormonas turi dvejopą poveikį organizmui – tiesioginį, kai augimo hormonas tiesiogiai prisijungia prie ląstelių receptorių, ir netiesioginį – per insulino augimo faktorių.
Galvijų augimo hormono genas randamas 19 chromosomoje. Galvijų GH genas susideda iš 5 egzonų ir 4 intronų (Hediger et al., 1990). Augimo hormono genas yra 22 kDa molekulinės masės ir sudarytas iš 191 amino rūgšties. Augimo hormonas (GH) yra labai svarbus normaliam gyvūnų augimui ir vystymuisi (Chikuni, 1997). Augimo hormonas taip pat reguliuoja įvarius fiziologinius procesus, yra svarbus gyvūnų kūno augimui, kontroliuoja ląstelių augimą ir diferenciaciją (Neathery et al., 1991). Nustatyta, kad augimo hormono genas turi įtakos galvijų mėsinėms bei pieninėms savybėms (Krasnopiorova et al., 2012), taip pat nustatyta, kad augimo hormono genas veikia galvijų reprodukcines savybes (Kupstaitė ir kt., 2008).
Augimo hormono receptoriaus (GHR) genas turi įtakos mėsos produkcijos kokybei (Chikuni, 1997).
1.3.2. Miostatino geno įtaka galvijų produktyvumui
Miostatino genas randamas 2 galvijų chromosomoje. Galvijų miostatino genas sudarytas iš 2 intronų ir 3 egzonų (Jeanplong et al., 2001). Nustatyta, kad miostatino genas kontroliuoja raumeninių ląstelių kiekį bei veikia raumeninių skaidulų formavimąsi (McPherron and Lee, 1997). Galvijai, turintys daugiau raumeninių skaidulų, greičiau auga ir turi didesnę raumeninę masę. Taip yra dėl mutacijos, atsiradusios miostatino gene (Krasnopiorova ir kt., 2010).
16 Nustatytos miostatino geno mutacijos dvejose galvijų veislėse, kurios turi didesnį raumeningumą – tai Belgijos mėlynieji ir Pjedmonto veislės galvijai. Belgijos mėlynųjų galvijų veislė (5 pav.) yra paplitusi Belgijoje. Šie galvijai turi mažiau riebalų ir daugiau kaip 20 procentų raumenų (Shahin et al., 1985a). Galvijai užsiaugina labai didelius raumenis, dėl to jiems būna sunku judėti. Belgijos mėlynieji atveda didelius veršiukus, dėl to kartais reikia daryti cezario pjūvį (Dickman, 1997). Belgijos mėlynieji turi natūralią miostatino geno mutaciją. Tokį raumeningumą lemia miostatinas, dar žinomas kaip augimo diferencijavimo veiksnys 8 (GDF8), slopinantis raumeninio audinio augimą, t.y. didesnės miostatino koncentracijos organizme nulemia, kad individas turi mažiau išvystytus raumenis (McPherron and Lee, 1997). Daugiausia miostatino baltymo gaminama skeleto raumenų ląstelėse, jis cirkuliuoja kraujyje ir veikia raumenų audinius.
5 pav. Belgijos mėlynieji galvijai
http://www.ansi.okstate.edu/breeds/cattle/
Kita veislė Pjedmonto galvijai (6 pav.), turinti miostatino (MSTN) geno mutaciją. Pjedmonto galvijai yra kilę iš šiaurės Italijos. Galvijai yra išsivystę iš dviejų skirtingų veislių – stumbro ir zebu – evoliucionavusių natūralios selekcijos būdu ir tapusių Pjedmonto veisle.
Belgijos mėlynųjų miostatino sekoje 3 egzone yra 11 nukleotido delecija, kuri sukelia STOP kodono atsiradimą, ir tada baltymas praranda savo biologinę funkciją. Pjedmonto galvijų miostatino sekoje yra 3 egzono mutacija, lemianti pakeitimą cisteino į tiroziną. Ši mutacija sukelia visišką arba beveik visišką miostatino funkcijos praradimą (McPherron and Lee, 1997). Dviejų genų su neaktyviu miostatinu kopijomis, nulemia dideli galvijų raumeningumą.
Heterozigotiniai galvijai yra mažiau raumeningi, bet duoda 7 procentais daugiau jautienos nei galvijai, kurių miostatinas aktyvus. Taip yra todėl, kad jų skerdienoje yra 14 procentų mažiau riebalų (Hardin, 1999).
17 6 pav. Pjedmonto galvijai
http://www.ansi.okstate.edu/breeds/cattle/
Dvigubo raumeningumo galvijai turi keletą trūkumų: yra sumažėjęs patelių vaisingumas, mažesnis palikuonių gyvybingumas ir lytinės brandos vėlavimas. Padidėjusi galvijų raumenų masė labai kompensuoja šiuos trūkumus. Neaktyvi miostatino mutacija lemia, kad galvijai turi aukštos kokybės mėsą ir padidėjusią raumenų masę (McPherron and Lee, 1997).
1.3.3 Leptino geno įtaka galvijų produktyvumui
Leptino genas buvo aptiktas 1994 metais (Houseknecht et al., 1998). Leptino genas yra randamas 4 galvijų chromosomoje. LEP susideda iš 3 egzonų ir 2 intronų, yra 16 kDa molekulinės masės (Stone et al., 1996). Leptinas yra baltymas, kuris labai svarbus galvijų augimui ir vystymuisi. Šis baltymas išsiskiria riebaliniame audinyje, kuris reguliuoja kūno svorį, medžiagų apykaitos procesą, apetitą ir energijos balansą (Zhang, 1997).
Pastaraisiais metais atliekama nemažai tyrimų, kuriais norima išsiaiškinti leptino įtaką svorio reguliavimui. Leptinas yra išskiriamas į kraujotaką ir padeda reguliuoti riebalų kiekį organizme. Kai leptino daugiau kraujotakoje, tada padidėja energijos sąnaudos ir sumažėja maisto suvartojimas, o kai leptino mažiau, tada sumažėja energijos sąnaudos ir suvartojama daugiau maisto (Zhang, 1997). Leptinas veikia per savo receptorius Ob – R. Leptino receptoriai rasti pogumburyje, kurie priklauso citokinų receptorių šeimai. Pirmą kartą leptinas buvo aptiktas pelėse. Leptinas buvo atrastas nutukusių pelių organizme, kurios turėjo defektinį ob/ob geną. Nutukusioms pelėms, turinčioms defektinį ob/ob geną, leptino injekcijos mažino riebalų atsargas, nes pagreitėja riebalų skaidymas ir maisto suvartojimas mažėja. Leptino geno mutacijos ob/ob pasireiškimą pelėse skatina nutukimą (Jiang et al., 1999).
18 Galvijų leptinas bei kiti išvardinti genai, kurie yra susiję su galvijų augimo ypatumais, mėsingumu, raumeningumu ir kitomis produktyvumo savybėmis, yra svarbūs kaip genetiniai žymenys. Šių genų aptikimas ir panaudojimas yra ekonomiškai svarbūs požymiai. Molekulinių genetinių tyrimų pagalba galima atrinkti gyvulius su pageidaujamu genu, ir tokiu būdu vykdant selekciją, genetinių žymenų pagalba, gerinti galvijienos produkcijos savybes.
Genetinių žymenų panaudojimas žemės ūkio gyvūnų selekcijoje gali labai paspartinti selekcijos procesą, pagerinti žemės ūkio gyvulių produktyvumą, sumažinti gautos produkcijos savikainą bei padaryti produkciją konkurencinę užsienio rinkose. Išvardinti genai yra labai svarbūs genetiniai žymenys, nes jų fiziologinis poveikis tiesiogiai susijęs su ekonominiu požymiu.
1.4. Tirtų galvijų veislių apibūdinimas
1.4.1. Šarolė veislės galvijai
Šarolė veislės galvijai (7 pav.) yra sena ir viena populiariausių mėsinių galvijų veislė pasaulyje. Išvesta Prancūzijoje. Šios veislės gyvuliai stambūs, turi labai gerai išvystytus nugaros, juosmens ir užpakalinės kūno dalies raumenis, būdingas ilgas gilus liemuo, vidutinio ilgumo kojos. Spalva balta su gelsvu atspalviu. Nagai, ragai ir nosies veidrodėlis vaško spalvos.
7 pav. Šarolė veislės galvijai http://www.lmga.lt/
Šarolė galvijai ramūs, nekaprizingi, lengvai prisitaiko prie žmonių ir prie aplinkos. Gerai pasisavina pašarus ir greitai prisitaiko prie pakeistų pašarų. Anksčiau Šarolė veislės galvijai buvo naudojami žemės ūkio darbams. Vėliau mūsų protėviai pradėjo gerinti šios veislės galvijų mėsines
19 savybes ir suformavo puikias mėsines savybes turinčius ramius gyvulius. Bręsta ir kaupia riebalus vėlokai, todėl jų prieauglį mėsai realizuoja 600 – 700 kg ir didesnės masės. Karvės pieningos, todėl nujunkomi 7 – 8 mėn. amžiaus veršeliai būna gerai išsivystę ir didelės masės. Šarolė veislės galvijai priskiriami intensyvių veislių grupei. Pagrindiniai kūno matmenys: karvių aukštis ties ketera 134 – 147 cm, bulių – 150 – 165 cm, suaugusių karvių svoris 700 – 950 kg, bulių 1100 – 1350 kg. Pirmo veršiavimosi amžius 30 – 33 mėn. Gimusių veršelių svoris 41 – 46 kg. Svoris nujunkant (7 – 8 mėn.) 280 – 380 kg. 365 d. svoris 380 – 530 kg. (Jukna ir kt., 2004).
1.4.2. Limuzinų veislės galvijai
Iki XX amžiaus pradžios Limuzinai (8 pav.) buvo auginami pienui ir mėsai. 1900 m. veislė specializuota kaip mėsinė. Pagal biologinius ypatumus gyvuliai panašūs į Šarolė veislės galvijus, tik šios veislės gyvuliai kiek smulkesni. Paskutiniais metais Limuzinai vis labiau plito pasaulyje.
Tai gražaus kūno sudėjimo, ilgo gilaus liemens, švelnaus skeleto, gerai išvystytais raumenimis gyvuliai. Spalva žala į gelsvumą.
8 pav. Limuzinų veislės galvijai http://www.lmga.lt/
Pilvo, aplink akis ir nosies veidrodėlį plaukai šviesesnės spalvos. Pagal gausumą Prancūzijoje jie užima antrą vietą po Šarolė. Laikymo sąlygoms nereiklūs, karvės veršiuojasi lengvai. Įmitusio prieauglio skerdenos išeiga apie 63 – 64 proc. Limuzinai Lietuvoje veisiami gyvuoju veisimu ir naudojami kryžminimui su pieniniais ir mėsiniais galvijais. Ūkiuose, kur yra geros ir vidutinio derlingumo ganyklos, ši veislė yra perspektyvi. Nors Limuzinų kūno masė kiek mažesnė negu Šarole galvijų, tačiau ir jie priskiriami prie intensyvios gamybos veislių. Pagrindiniai rodikliai
20 tokie: karvių aukštis ties ketera 138 cm, bulių 147 cm. Karvių svoris 700 – 800 kg., bulių 1100 kg. Gimusių veršelių svoris 36 – 40 kg. Svoris nujunkant (7 – 8 mėn.) 230 – 310 kg. 365 d. svoris 370 – 480 kg. (Jukna ir kt., 2004).
1.4.3. Lietuvos juodmargiai galvijai
Lietuvos juodmargiai galvijai (9 pav.) yra viena iš seniausių galvijų veislių Lietuvoje. Iki XIX a. pabaigos Lietuvoje buvo auginami vietiniai juodmargiai, kurių produktyviųjų savybių gerinimui XVII a. pavienių dvarininkų buvo įvežami užsieninių veislių juodmargiai galvijai (Kuosa, 1980).
Lietuvos juodmargiai galvijai sukurti kryžminant vietinius galvijus iš pradžių su įvairių veislių, o vėliau su Olandijos juodmargiais, Ostfryzais bei Švedijos juodmargiais ir vėliau veisiant mišrūnus tarpusavyje. Pavienių Olandijos juodmargių veislės galvijų Lietuvoje buvo jau XVI-XVII amžiuje (Jukna, 1998).
9 pav. Lietuvos juodmargiai galvijai http://www.lgi.lt/
Suaugusių Lietuvos juodmargių karvių vidutiniai kūno matmenys yra tokie: aukštis ties ketera – 129 cm, krūtinės gylis 69 – 70 cm, jos plotis 48 – 50 cm, apimtis 197 – 199cm. Karvių svoris 550 kg ir daugiau, bulių 950 – 1000 kg. Šiuolaikiniai Lietuvos juodmargiai yra stiprios konstitucijos, proporcingo, bet neretai per daug kompaktiško kūno sudėjimo. Dėl trumpų kojų, gilios ir plačios krūtinės, plačios keteros, nugaros, juosmens, ilgo ir plataus užpakalio bei gerai įšsivysčiusių raumenų jie dažnai panašesni į pieninius – mėsinius galvijus. Lietuvos juodmargiai galvijai yra identifikuojami, registruojami, vykdoma jų produktyvumo kontrolė, leidžiamos kilmės knygos.
21
1.4.4. Lietuvos žalieji galvijai
Lietuvos žalųjų galvijų veislė (10 pav.) išvesta kryžminant vietinius galvijus su Danijos žalaisiais, kai kur buvo panaudoti su Anglerais, ir kai kur taikytas įterpiamasis kryžminimas su Švicais, Latvijos dvylaisiais, Švedijos žalmargiais ir net Simentaliais. Tačiau daugiausia įtakos besiformuojančiai Lietuvos žalųjų galvijų veislei turėjo Danijos žalieji galvijai (Jukna, 1998).
Lietuvos žalieji galvijai yra pieninio tipo: jų galva nedidelė, sausa, kaklas ilgas, neplatus, mažai raumeningas, be pagurklio, liemuo ilgas, gilus, krūtinė ilga, gili, didelės apimties; užkirtimas už menčių pasitaiko retai. Šios veislės galvijai žali, įvairaus atspalvio – nuo prinokusios vyšnios raudonumo iki dvylos spalvos.
Kūno matmenys yra tokie: Karvių aukštis ties ketera – 130 cm, svoris 520 – 550 kg, bulių 820 – 900 kg.
10 pav. Lietuvos žalieji galvijai http://www.lgi.lt/
Gimusių veršelių svoris 32 – 35 kg. Buliukų penėjimosi savybės geros, skerdenos išeiga 52 – 53 proc. Karvių pieningumas vidutiniškai 4000 kg pieno, 4,2 proc. riebumo ir 3,4 proc. baltymingumo (Jukna, 1998).
22
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimo schema
Tiriamasis darbas atliktas LSMU VA K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Tyrimo medžiaga
Mėginys: galvijų plaukai; 51 galvijų, kurie priklausė šiom veislėm: Lietuvos juodmargiai, Lietuvos žalieji, Limuzinai, Šarolė
Tyrimo metodai:
DNR išskyrimas DNR švarumo ir IGF – 1 geno padauginimas iš plaukų svogūnėlių koncentracijos nustatymas grandininės reakcijos metodu
(PGR)
Polimorfizmo indentifikavimas restrikcinių Frakcionavimas horizontalios elektroforezės ilgio polimorfiškumo tyrimo metodu metodu agarozės gelyje
(RFIP)
Gelio dažymas etidžio bromidu Polimorfizmų analizė
23
2.2. Tyrimo medžiaga
Galvijų mėginiai (plaukai su svogūnėliais) buvo imti po 10 – 20 vnt. ir sudėti į vienkartinius polietileno maišelius. Mėginiai tyrimams imti iš buliukų, laikomų UAB „Šilutės veislininkystė“. Insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno polimorfizmo tyrimai buvo atlikti 51 galvijų grupėje, kurie priklausė sekančioms veislėms – ŠA, LI, LJ, LŽ. Priesvorio duomenys gauti iš UAB „Šilutės veislininkystė“.
2.3. Tyrimo metodai
2.3.1. DNR išskirimas iš plauko svogūnėlio ląstelių
Nukerpami 4 – 5 plaukų svogūnėliai ir patalpinami į mėgintuvėlius. Paruošiamas lizavimo mišinys. Mėgintuvėlio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama Chelex - 200µl, Dithiotreitolio (DTT) 7,5 µl, Proteinazė K 10,7 µl). Mėgintuvėliai 30 s. maišomi maišyklės „Vortex” pagalba ir 10 s centrifuguojami. Pavyzdžiai inkubuojami 56oC temperatūroje, 30 min. Po
inkubacijos mėginiai 10 min. pakaitinami 94oC temperatūroje (inaktyvuojami – amplifikatoriuje) ir
atšaldomi iki kambario temperatūros (Miceikienė ir kt., 2002).
2.3.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genominės DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba. Buvo paruošiamas 100µl skiestos DNR tirpalas: 10µl koncentruotos DNR, kuri skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį prie 260 nm bangos ilgio.
DNR kokybė įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Optinių tankių santykis 260 nm/280 nm rodo DNR tirpalų švarumą. Švarių DNR tirpalų santykis buvo 1,8 – 2,0. Jei tirpale yra baltymų priemaišų, šis santykis bus mažesnis. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0,5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genominės DNR valymą (Miceikienė ir kt., 2002).
2.3.3. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra metodas, pavadintas pagal DNR polimerazę, fermentą, vykdantį DNR replikaciją ląstelėje. Tai yra nukleorūgščių sintezės in vitro metodas, kuriuo laboratoriniame mėgintuvėlyje gali būti specifiškai padauginti (amplifikuoti) atskiri DNR fragmentai. PGR metodas yra labai jautrus, todėl padauginti pasirinkta DNR atkarpa gali sudaryti
24 netgi vieną milijoninę bendro DNR pavyzdžio dalį. Naudojant PGR, galima amplifikuoti net vienintelį pasirinktą geną ar jo fragmentą (Miceikienė ir kt., 2002).
2.3.4. Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas (PGR - RFIP)
Tai vienas iš dažniausiai naudojamų genotipavimo metodų. Kai kirpimo fermento atpažinimo vietos DNR grandinėlėje yra pasikeitę, fermentas gali atpažinti alelių variantus duodamas skirtingus DNR fragmentus. Šis metodas naudojamas kartu su PGR ir agarozės gelio elektroforeze. Kai elektroforezės metu genetinis polimorfizmas suformuoja arba panaikina fermento kirpimo vietą, susidaro skirtingas vaizdas (Cohen and Levinson, 1988).2.3.5
.Elektroforezė agarozės gelyje
Elektroforezė – tai metodas, skirtas DNR fragmentų atskyrimui pagal dydį. Elektroforezės principas – veikiant elektros srovei, neigiamą krūvį turinčių DNR fragmentų judėjimo greitis gelyje priklauso nuo jų dydžio. DNR elektroforezė buvo atliekama horizontaliame 3,0 proc. agarozės gelyje, 100 V 35 min. Genominė DNR molekulinė masė yra didelė, todėl tokia DNR frakcionuojama mažesnės koncentracijos (0,8 – 1,0 proc.) agarozės gelyje. DNR fragmentų molekulinė masė yra mažesnė, todėl jie frakcionuojami didesnės koncentracijos (1,7 – 2,0 proc.) agarozės gelyje. Naudojant gelius su skirtingomis koncentracijomis, išsiskiria skirtingo dydžio DNR fragmentai. Didesnėje agarozės gelio koncentracijoje išsiskiria maži DNR fragmentai, o mažesnėje agarozės gelio koncentracijoje išsiskiria didesni DNR fragmentai (Miceikienė ir kt., 2002).
2.3.6. Dažymas etidžio bromidu
Gelis buvo dažomas etidžio bromidu 15 – 20 min. Etidžio bromidas – fluorescuojantis dažas, naudojamas DNR nustatymui (Miceikienė ir kt., 2002).
2.3.7. Genotipavimas
Rezultatų vertinamą atlikome UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm) „MiniBisPro“ videodokumentavimo prietaisu (Herolab).
2.3.8. Galvijų IGF – 1 geno tyrimo metodika
IGF – 1 geno pradmenys (Ge et al. 2001)Pirminis (5' – ATTACAAAGCTGCCTGCCCC – 3')
25 Naudojome sekantį mišinį PGR reakcijai (1 lentelė).
1 lentelė. PGR reakcijos mišinys IGF – 1 geno tyrimui
PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (μl)
Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O 2,4
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
MgCl2 1,5
dNTP 2,5
Pirminis pradmuo IGF1 2,5
Antrinis pradmuo IGF2 2,5
BSA 0,5
Taq polimerazė 0,6
PGR reakcija atlikome amplifikatoriuje (GeneAmp PCR System 2700, AB Applied Biosystems) sekančiu režimu:
PGR režimas – 950C, 3 min (pirminė denatūracija); 940C, 45 s (denatūracija); 620
C, 45 s (olinukleotidų prisijungimas); 720C, 45 s (DNR grandinės sintezė); 720C, sintezės užbaigimui 5
min. Laikyti: 40C. Reakcija atliekama 35 ciklus.
PCR produktas frakcionuojamas 3 proc. agarozės gelyje, 100 V, 35 min. Gelis dažomas etidžio bromido tirpale 15 – 20 min. ir analizuojamas UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm) Herolab video dokumentavimo sistema.
IGF – 1 geno variantų ištyrimas:
PGR produktas – 249 bp; DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentų Eco 105I
(Sna BI). A (alelis) – 223, 26 bp B (alelis) – 249 bp 249 bp 223 bp 26 bp A B ▬▬ ▬▬ ▬▬
26 12 pav. Galvijų insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno polimorfizmo tyrimas
1 – DNR žymuo; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 – PGR produktas; 9 – AA genotipas, 3, 11, 15, – BB genotipas; 5, 7, 13, 17 – AB genotipas.
27
3. TYRIMO REZULTATAI
Atrankinėje galvijų grupėje buvo ištirtas insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) genas. Paskaičiuoti galvijų IGF – 1 geno alelių ir genotipų dažniai kiekvienoje tirtoje galvijų veislėje. Nustatyta, kad insulino augimo faktoriaus genas turi du alelius (A ir B) visose tirtose veislėse. Insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno A alelio dažnis kito nuo 0,289 Limuzinų veislėje iki 0,708 Lietuvos juodmargių veislėje, o B alelio – nuo 0,292 Lietuvos juodmargių veislėje iki 0,711 Limuzinų veislėje. Tirtoje galvijų grupėje A alelis rastas 0,471 dažniu, o B alelis 0,529 dažniu (2 lentelė).
2 lentelė. IGF – 1 geno alelių dažniai tirtose galvijų veislėse Veislė Aleliai A B LI 0,289 0,711 LJ 0,708 0,292 LŽ 0,600 0,400 ŠA 0,467 0,533 Viso: 0,471 0,529
Sugrupavus veisles į mėsinių ir pieninių galvijų veisles nustatyta, kad insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno A alelio dažnis kito nuo 0,368 mėsinių galvijų veislėse iki 0,676 pieninių galvijų veislėse. Tuo tarpu B alelio dažnis kito nuo 0,324 pieninių galvijų veislėse iki 0,632 mėsinių galvijų veislėse (3 lentelė).
3 lentelė. IGF – 1 geno alelių dažniai mėsinių ir pieninių galvijų veislėse
Veislės Aleliai
A B
LI + ŠA (mėsiniai) 0,368 0,632
LJ + LŽ (pieniniai) 0,676 0,324
Insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno buvo nustatyti trys skirtingi genotipai – AA, AB ir BB. IGF – 1 geno AA genotipas pasižymėjo mažiausiu dažniu ir įvairavo nuo 0,053 Limuzinų galvijų veislėje, iki 0,500 Lietuvos juodmargių galvijų veislėje. Tuo tarpu AB genotipas pasireiškė didžiausiu dažniu ir įvairavo nuo 0,400 Lietuvos žalųjų galvijų veislėje iki 0,533 Šarolė galvijų
28 veislėje. Insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno BB genotipas pasižymėjo dažniu nuo 0,083 Lietuvos juodmargių galvijų veislėje, iki 0,474 Limuzinų galvijų veislėje. Tirtoje galvijų grupėje AA genotipas rastas 0,235 dažniu, AB genotipas 0,471 dažniu ir BB genotipas 0,294 dažniu (4 lentelė).
4 lentelė. IGF – 1 geno genotipų dažniai tirtose galvijų veislėse
Veislė Genotipas AA AB BB LI 0,053 0,474 0,474 LJ 0,500 0,417 0,083 LŽ 0,400 0,400 0,200 ŠA 0,200 0,533 0,267 Viso: 0,235 0,471 0,294
Sugrupavus veisles į mėsinių ir pieninių galvijų veisles nustatyta, kad insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno AA genotipas įvairavo nuo 0,118 mėsinių galvijų veislėse iki 0,471 pieninių galvijų veislėse. Tuo tarpu AB genotipas pasižymėjo didžiausiu dažniu nuo 0,412 pieninių galvijų veislėse iki 0,500 mėsinių galvijų veislėse. BB genotipas pasižymėjo žemesniu dažniu nuo 0,118 pieninių galvijų veislėse iki 0,382 mėsinių galvijų veislėse (5 lentelė).
5 lentelė. IGF – 1 geno genotipo dažniai mėsinių ir pieninių galvijų veislėse
Veislės Genotipas
AA AB BB
LI + ŠA (mėsiniai) 0,118 0,500 0,382
LJ + LŽ (pieniniai) 0,471 0,412 0,118
Nustatytas insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno polimorfizmas ir jo įtaka galvijų priesvoriui (6 lentelė).
Insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno AA genotipo galvijai pasižymėjo didesniu priesvoriu per 2 ketvirtį (1143,2±42,40 g) lyginant su AB (1036,6±64,27 g) genotipu. Tuo tarpu BB genotipo galvijai statistiškai patikimai pasižymėjo didesniu priesvoriu per 1 ketvirtį (1418,1±86,55 g; p<0,05), 3 ketvirtį (769,3±96,23 g; p<0,05), 4 ketvirtį (503,0±48,97g), taip pat priesvoriu per visą penėjimosi laikotarpį (865,9±46,22 g; p<0,05) (6 lentelė).
29 6 lentelė. IGF – 1 geno polimorfizmo įtaka galvijų priesvoriui
Geno-tipas n priesv_1ketv g priesv_2ketv g priesv_3ketv g priesv_4ketv g priesvoris per visą laikotarpį g AA 12 1133,8±38,95 a 1143,2±42,40 423,3±68,18 a 437,4±72,14 678,9±39,64 a AB 24 1397,8±67,83 b 1036,6±64,27 644,9±80,60 495,1±39,64 722,5±35,52 a BB 15 1418,1±86,55 b 1051,4±44,86 769,3±96,23 b 503,0±48,97 865,9±46,22 b a,b – vidurkiai, skirtingomis raidėmis pažymėti lentelės stulpelyje, statistiškai reikšmingai skiriasi tarpusavyje (p<0,05)
Siekiant išryškinti insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno įtaką galvijų priesvoriui, atlikta genetinių veiksnių analizė. Buvo ištirti atskiri veiksniai: veislė, genotipas bei kombinuotas veiksnys: veislė x genotipas ir jų įtaka galvijų priesvoriui. Veislė statistiškai reikšmingai turėjo didelę įtaką priesvorio įvairavimui per 1, 2 ir 4 ketvirtį. Genotipas statistiškai reikšmingai turėjo įtakos priesvoriui per visą penėjimosi laikotarpį (7 lentelė).
7 lentelė. Genetinių veiksnių įtaka priesvoriui, proc. Veiksniai priesv_1ketv proc. priesv_2ketp proc. priesv_3ketv proc. priesv_4ketv proc.
priesvoris per visą laikotarpį, proc.
Veislė 31,0*** 16,0* 14,6 16,7* 12,9
Genotipas 3,7 1,6 3,6 0,6 11,5*
Veislė x Genotipas 8,9 8,2 3,1 5,7 4,4
* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001
Sugrupavus veisles į mėsinių ir pieninių galvijų veisles, buvo nustatyti galvijų priesvorio vidurkiai pagal IGF – 1 geno genotipus. Mėsinių veislių galvijų insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno AA genotipo galvijai pasižymėjo didesniu priesvoriu per 2 ketvirtį (1221,8±68,11 g) lyginant su pienių veislių galvijų (1103,9±50,80 g) genotipu. AB genotipo mėsiniai galvijai pasižymėjo didesniu priesvoriu per 1 ketvirtį (1463,6±89,35 g) lyginant su pienių veislių galvijų (1237,9±52,47 g) genotipu, taip pat BB genotipo mėsiniai galvijai pasižymėjo didesniu priesvoriu per 1 ketvirtį (1469,7±91,29 g) lyginant su pienių veislių galvijų (1083,0±83,00 g) genotipu, nors duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi. Tuo tarpu statistiškai reikšmingai insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno BB genotipo mėsiniai galvijai pasižymėjo didžiausiu priesvoriu per visą penėjimosi laikotarpį (882,2±51,57 g; p<0,05) lyginant su pienių veislių galvijų (759,5±61,50 g) genotipu (8 lentelė).
30 8 lentelė. Priesvorio vidurkiai skirtingais ketvirčiais tarp mėsinių ir pieninių galvijų
veislių pagal genotipus
Laikotarpis
LI + ŠA (mėsiniai) LJ + LŽ (pieniniai)
AA AB BB AA AB BB 4 17 13 8 7 2 priesv_1ket g 1096,8±79,95 1463,6±89,35 1469,7±91,29 1152,3±45,38 1237,9±52,47 1083,0±83,00 priesv_2ket g 1221,8±68,11 993,00±86,62 1059,4±51,28 1103,9±50,80 1142,4±55,34 999,5±55,50 priesv_3ket g 569,3±161,02 674,8±104,42 793,8±108,34 350,3±55,83 572,3±116,25 610,5±166,50 priesv_4ket g 305,0±16,17 c 501,1±50,38 520,6±54,73 503,6±101,65 480,6±64,55 388,5±55,50 priesvoris per visą laikotarpį, g 756,5±43,71 742,2±44,41 a 882,2±51,57 b 640,1±51,48 674,7±57,23 759,5±61,50
31
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Pastaraisiais metais labai padidėjo susidomėjimas mėsinių ir pieninių galvijų selekcija, kuri yra pagrįsta genetinių technologijų pagalba. Vienas iš būdų, klasifikuojant gyvulius, būtų genetinių žymenų, susijusių su konkrečiu požymiu, radimas. Tokie kiekybiniai požymiai, kaip gyvulio augimo sparta bei kitos produktyvumo savybės yra kontroliuojamos sudėtinių lokusų chromosomose.
Vienas iš svarbesnių genų, turinčių įtakos galvijų produktyvumo savybėms, yra insulino augimo faktoriaus – 1 genas. IGF – 1 genas reguliuoja ląstelių dauginimąsi, gyvūnų augimą ir vystymąsi, todėl genas yra laikomas kaip galvijų augimo tempo rodiklis. Nustatyta, kad mėsinių Simentalių veislės galvijų kraujyje buvo aptiktas reikšmingai didesnis IGF – 1 kiekis negu pieninių Holšteino veislių karvių. Be to, abiejose veislėse pastebėta koreliacija tarp IGF – 1 kiekio kraujyje ir galvijų augimo tempo (Schlee et al., 1994). Ge ir kt. mokslininkai (2001) remdamiesi atliktais tyrimais nustatė neigiamą koreliaciją tarp IGF – 1 kiekio ir kūno svorio Angusų galvijų veislėse.
Remiantis atliktais tyrimais, buvo nustatytos dvi IGF – 1 polimorfinės sistemos, atsižvelgiant į mėsinių galvijų produkcijos savybes (Kirkpatrick, 1992). Tiriant Herefordų veislės galvijus nustatyta, kad IGF – 1 geno polimorfizmas yra susijęs su kūno svoriu gimimo metu ir atjunkymo metu, taip pat su augimo tempu (Moody et al., 1996).
Nustatyta, kad insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) genas, esantis 5 chromosomoje, reguliuoja galvijų augimo tempą (Siadkowska et al., 2006). Mūsų atlikti tyrimai rodo, kad insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno A alelis pasireiškė – 0,47 dažniu, o B alelis 0,53 dažniu. A alelis didžiausiu dažniu – 0,708 rastas Lietuvos juodmargių veislėje, o B alelis 0,711 – Limuzinų veislėje. Panašius rezultatus gavo ir kiti mokslininkai, nustatę, kad didžiausiu dažniu pasireiškė B alelis – 0,54, o A alelis pasireiškė – 0,46 dažniu (Reyna et al., 2010), tačiau kiti mokslininkai nustatė, kad A ir B alelių dažniai atitinkamai buvo 0,52 ir 0,48 (Siadkowska et al., 2006).
Įvertinus insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno genotipų dažnius, radome tris genotipus AA, AB ir BB. AB genotipą nustatėme didžiausiu 0,47 dažniu, tuo tarpu AA genotipas – 0,24, o BB – 0,29 dažniu. Mūsų gauti tyrimų rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų skelbtais duomenimis. Mokslininkai, tyrinėdami insulino augimo faktoriaus IGF – 1 geno polimorfizmą, nustatė, kad AA genotipas pasireiškė 0,29 dažniu, BB genotipas – 0,24 dažniu ir didžiausiu AB genotipas – 0,47 dažniu (Siadkowska et al., 2006).
Atlikus galvijų priesvorių duomenų analizę nustatėme, kad IGF – 1 geno BB genotipo galvijai pasižymėjo didesniu priesvoriu. Mūsų tyrimo duomenimis, BB genotipas didžiausiu dažniu
32 pasireiškė Limuzinų galvijų veislėje (0,474), o mažiausiu dažniu – Lietuvos juodmargių galvijų veislėje (0,083). AB genotipas didžiausiu dažniu pasireiškė Šarolė galvijų veislėje (0,533), o mažiausiu dažniu - Lietuvos žalųjų galvijų veislėje (0,400). AA genotipas didžiausiu dažniu pasireiškė Lietuvos juodmargių galvijų veislėje (0,500) ir mažiausiu – Limuzinų galvijų veislėje (0,053).
Anot Li ir kt. (2004), galvijų insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno BB genotipas pasižymėjo didesniu svoriu atjunkymo metu. Curi ir kt. mokslininkai (2005) genetiškai skirtingose galvijų grupėse aptiko reikšmingą IGF – 1 geno genotipų priklausomybę su kūno svoriu. Tyrimo metu BB genotipas pripažintas pranašesniu, nes BB genotipo bulių augimo tempas buvo didesnis (Curi et al., 2005).
Mūsų tyrimo rezultatai parodė, kad rasti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp genotipų. BB genotipo galvijų augimo tempas buvo didesnis (865,9±46,22 g; p<0,05), lyginant su AA (678,9±39,64 g; p<0,05) ir AB (722,5±35,52 g; p<0,05) genotipu. Mūsų gauti rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų darbais, kur BB genotipo gyvuliai pasižymėjo didesniu priesvoriu. Lenkijoje buvo atlikti tyrimai, ieškant koreliacijos tarp IGF – 1 geno polimorfizmo ir galvijų augimo tempo bei pieno primilžio ypatumų. Nustatyta, kad BB genotipo galvijų augimo tempas buvo didesnis nei AA ir AB genotipų. Tuo tarpu pieno primilžio rodikliai parodė, kad AB genotipo karvės buvo įvertintos geriau nei AA ir BB genotipų karvės. Tokią išvadą lėmė tai, kad AB genotipo karvių piene buvo daugiau riebalų ir baltymų (Siadkowska et al., 2006).
Mūsų tyrimai leidžia teigti, kad naudingiausia būtų auginti insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno B alelį turinčius gyvulius, nes šie gyvuliai pasižymėjo geresniu priesvoriu.
Žemės ūkio gyvulių selekcijos tikslas yra veisti ir auginti gyvulius, pasižyminčius aukštomis produktyvumo bei kitomis ūkiškai naudingomis savybėmis, mažinti gyvulininkystės produkcijos gamybos savikainą, bei gauti kokybiškus žemės ūkio produktus, tenkinančius vartotojų poreikius ir atitinkančius rinkos kokybės reikalavimus. Molekulinių genetinių metodų panaudojimas galvijų selekcijoje gali labai paspartinti selekcijos procesą, pagreitinti galvijų produkcijos kokybę, sumažinti savikainą bei padaryti produkciją konkurencingą užsienio rinkoje. Insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) genas yra svarbus genetinis žymuo, nes jo fiziologinis poveikis tiesiogiai susijęs su ekonominiu požymiu. Dėl savo biologinės funkcijos insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) genas laikomas genetiniu žymeniu, prognozuojančiu galvijų augimo tempo rodiklį.
33
IŠVADOS
1. Tirtoje galvijų grupėje insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno rasti du aleliai – A ir B. A alelis rastas 0,471 dažniu, o B alelis, didinantis galvijų priesvorį, rastas 0,529 dažniu.
2. Didžiausiu dažniu B alelis rastas Limuzinų galvijų veislėje (0,711).
3. Tirtoje galvijų grupėje insulino augimo faktoriaus (IGF – 1) geno rasti trys AA, AB ir BB genotipai. AA genotipą turėjo 24,0 proc. galvijų, AB genotipą turėjo 47,0 proc. galvijų, o BB genotipą, kuris didina galvijų priesvorį, turėjo 29,0 proc. galvijų.
4. Didžiausią kiekį, net 47 proc., BB genotipą turėjo Limuzinų veislės galvijai.
5. BB genotipo galvijai statistiškai reikšmingai turėjo didesnį priesvorį (865,9±46,22 g) nei AA genotipo (678,9±39,64 g) galvijai.
34
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Baker J., Liu P., Robertson E. J., Efstratiadis A. Role of insulin – like growth factors in embryonic and postnatal growth. Cell. 1993. Vol. 75. P. 73–82.
2. Ballard F. F., Wallace J. C., Francis G. L., Read L. C., Tomas F. M. IGF – 1: a truncated form of insulin – like growth factor – 1. Int. Journal of Biochemistry & Cell Biology. 1996. Vol. 28. P. 1085–1087.
3. Bishop M. D., Tavakkol A., Thereadgill D. W., Simmen F. A., Simmen R. C. M., Davis M. E., Womack J. E. Somatic cell mapping and restriction fragment length polymorphism analysis of bovine insulin – like growth factor 1. Journal of Animal Science. 1991. Vol. 69. P. 4306–4311. 4. Boisclair Y. R., Rhoads R. P., Ueki I., Wang J., Ooi G.T. The acid – labile subunit (ALS) of the 150
kDa IGF – binding protein complex: an important but forgotten component of the circulating IGF system. Journal of Endocrinology. 2001. Vol. 170. P. 63–70.
5. Buskirk D. D., Faulkner D. B., Hurley W. L., Kesler D. J., Ireland F. A., Nash T. G., Castree J. C., Vicini J. L. Growth, reproductive performance, mammary development, and milk production of beef heifers as influenced by prepubertal dietary energy and administration of bovine somatotropin. Journal of Animal Science. 1996. Vol. 74. P. 2649–2662.
6. Butler A. A., LeRoith D. Minireview: tissue–specific versus generalized gene targeting of the IGF – 1 and IGF1R genes and their roles in insulin – like growth factor physiology. Endocrinology. 2001. Vol. 142. P.1685–1688.
7. Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Fukumoto Y. Ozawa S. A simple method for genotyping thr bovine growth hormone gene. Animal Genetics. 1997. Vol. 28. P. 230.
8. Clemmons D. R., Dehoff M., McCusker R., Elgin R., Busby W. The role of insulin – like growth factor 1 in the regulation of growth. Journal of Animal Science. 1987. Vol. 65(2). P. 168–179. 9. Cogan J. D, Phillips J. A. Growth disorders caused by genetic defects in the growth hormone
pathway. J. Adv. Pediatr. 1998. Vol. 45. P. 337–361.
10. Cohen J. B., Levinson A. D. A point mutation in the last intron responsible for increased expression and transforming activity of the c – Ha – ras oncogene. Nature. 1988. Vol. 334. P. 119–124.
11. Cordano P., Hammon H. M., Morel C., Zurbriggen A., Blum J. W. mRNA of insulin – like growth factor (IGF) quantification and presence of IGF binding proteins, and receptors for growth hormone, IGF – 1, and insulin, determined by reverse transcribed polymerase chain reaction, in the liver of growing and mature male cattle. Domestic Animal Endocrinology. 2000. Vol. 19. P. 191-208.
35 12. Cottam Y. H., Blair H. T., Gallaher B. W., Purchas R. W., Breier B. H., McCutcheon S. N., Gluckman P. D. Body growth, carcass composition, and endocrine changes in lambs chronically treated with recombinantly derived insulin–like growth factor – 1. Endocrinology. 1992. Vol. 130. P. 2924–2930.
13. Curi R. A., Oliveira H. N., Silveira A. C., Lopes C. R. Association between IGF – 1, IGF – 1R and GHRH gene polymorphisms and growth and carcass traits in beef cattle. Livestock Production Science. 2005. Vol. 94. P. 159–167.
14. Cushman R. A., Hedgpeth V. S., Echternkamp S. E., Britt J. H. Evaluation of numbers of microscopic and macroscopic follicles in cattle selected for twinning. Journal of Animal Science. 2000. Vol. 78. P. 1564–1567.
15. Daughaday W. H. and Rotwein P. Insulin-like growth factors I and II. Peptide, messenger ribonucleic acid and gene structures, serum, and tissue concentrations. Endocrine Reviews. 1989. Vol. 10. P. 68–91.
16. Davis M. E. and Simmen R. C. Genetic parameter estimates for serum insulin – like growth factor 1 concentration and performance traits in Angus beef cattle. Journal of Animal Science 1997. Vol. 75. P. 317–324.
17. Dickman S. Gene Mutation Provides More Meat on the Hoof. Science. 1997. Vol. 278. P. 2037. 18. Froesch E. R., Schmid C., Schwander J., Zapf J. Actions of insulin – like growth factors. Annual
Review of Physiology. 1985. Vol. 47. P. 443–467.
19. Ge W., Davis M. E., Hines H. C., Irvin K. M., Simmen R. C. M. Association of genetic marker with blood serum insulin – like growth factor – 1 concentration and growth traits in Angus cattle. Journal of Animal Science. 2001. Vol 79. P. 1757–1762.
20. Goodall J. J., Schmutz S. M. IGF2 gene characterization and association with rib eye area in beef cattle. Animal Genetics. 2007. Vol. 38. P. 154–161.
21. Hardin B. Beef Leanness Gene Pinpointed Agricultural Research. Animal Genetics. 1999. Vol. 47. P. 6.
22. Hediger R., Johnson S. E., Barendse W., Drinkwater R. D., Moore S. S. Hetzel J. Assignement of the growth hormone gene locus to 19q22 – 26 ter in cattle and 11q25qter in sheep by in situ hybridization. Genomics. 1990. Vol. 8. P. 171–174
23. Houseknecht K. L., Baile C. A., Matteri R. L., Spurlock M. E. The biology of leptin: a review. Journal of Animal Science. 1998. Vol. 76. P. 1405–1420.
24. Yakar S., Liu J. L., Stannard B., Butler A., Accili D., Sauer B., LeRoith D. Normal growth and development in the absence of hepatic insulin – like growth factor 1. Proceedings National Academy of Sciences. 1999. Vol. 96. P. 7324–7329.
36 25. Yakar S., Rosen C. J., Beamer W. G., Ackert–Bicknell C. L., Wu Y., Liu J. L., Ooi G. T., Setser J., Frystyk J., Boisclair Y. R., LeRoith D. Circulating levels of IGF – 1 directly regulate bone growth and density. Journal of Clinical Investigation. 2002. Vol. 110. P. 771–781.
26. Jeanplong F., Sharma M., Somers W. G., Bass J., Kambadur R. Genomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene. Molecular and Cellular Biochemistry. 2001. Vol. 220. P. 31–37.
27. Jiang Z. H., Gibson J. P. Genetic polymorphisms in the leptin gene and their association with fatness in four pig breeds. Mammalian Genome. 1999. Vol. 10. P. 191–193.
28. Jukna Č. Galvijininkystė. Vilnius. Evalda. 1998. P. 26–47.
29. Jukna Č., Jukna V. Mėsinių galvijų auginimas. Kaunas. Terra Publika. 2004. P. 10–17.
30. Kirkpatrick B. W. Identification of a conserved microsatellite site in the porcine and bovine insulin – like growth factor – 1 gene 5’ flank. Animal Genetics. 1992. Vol. 23. P. 543–548.
31. Kitagawa H., Kitoh K., Ito T., Ohba Y., Nishii N., Katoh K., Obara Y., Motoi Y., Sasaki Y. Serum growth hormone and insulin–like growth factor – 1 concentrations in Japanese black cattle with growth retardation. Journal of Veterinary Medical Science. 2001. Vol. 63. P. 167–170.
32. Krasnopiorova N., Morkūnienė K., Baltrėnaitė L., Morkūnas P., Miceikienė I. Lietuvoje veisiamų galvijų miostatino geno polimorfizmo tyrimai. Žemės ūkio mokslai. 2010. Nr. 3–4. P. 93–96.
33. Krasnopirova N., Baltrėnaitė L., Miceikienė I. Growth hormone gene polymorphism and its influence on milk traits in cattle bred in Lithuania. Veterinarija ir zootechnika. 2012. T. 58 (80). P. 42–46.
34. Kupstaitė D., Indriulytė R., Krasnopiorova N., Baltrėnaitė L., Miceikienė I. Augimo hormone geno polimorfizmo įtaka bulių reprodukcinėms savybėms. Veterinarija ir zootechnika. 2008. T. 42 (64). P. 48–50.
35. Lazzari G., Wrenzycki C., Herrmann D., Duchi R., Kruip T., Niemann H., Galli C. Cellular and molecular deviations in bovine in vitro – produced embryos are related to the large offspring syndrome. Biology of Reproduction. 2002. Vol. 67. P. 767–775.
36. Lee P. D., Conover C. A., Powell D. R. Regulation and function of insulin–like growth factor– binding protein – 1. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1993. Vol. 204. P. 4–29.
37. Lemal D., Renaville R., Claes V., Ruelle L., Fabry J., Burny A., Underwood L. E., Ketelslegers J. M. Effect of pituitary somatotropin injections on plasma insulin – like growth factor 1 and somatotropin profiles in growing heifers. Journal of Animal Science. 1989. Vol. 67. P. 2715–2723.
