MATERIALI E METODI
I materiali utilizzati nello studio sono: HBT e acido violurico della Fluka; ABTS della Applichem; MnSO4 della Carlo Erba; H2O2 della
Riedel; spettrofotometro Beckman modello DU7. Per le prove di citotossicità è stata utilizzata una linea cellulare epiteliale umana (WISH), il mezzo di coltura è RPMI, il siero fetale bovino (FBS), antibiotici, trypan blue e tripsina sono della Cambrex Bio Science. I bagni di tintura LanasolR Nero ottenuto da una miscela di coloranti e Lanasol Blu 3G (vedi tabella A) sono stati forniti dal centro tecnotessile di
Prato, in base alla ricetta fornita dalla Tintoria Colle.
RICETTA COLORE BLU REATTIVO
Descrizione Ausiliari % base KOLLASOL LO-BD 0.5 SETAVIN RE 2.0 ACIDO ACETICO 80% 1.5 Tabella A
Preparazione dei campioni dalla paglia.
E’ stata pesata una quantità di paglia utilizzata come substrato nella coltivazione di funghi commestibili del genere Pleurotus, circa 18 g e lavata con 20 ml di soluzione salina:0,9% NaCl contenente solfato di rame 0,1 mM a due diversi ph 5 e 7; il mezzo raggiunge il ph desiderato
COLORANTE % base
mezzo tamponato. Successivamente viene pre incubata in una soluzione salina in presenza ed in assenza del colorante a diversi tempi. L’incubazione con il colorante viene effettuata in agitazione o in
statica. La soluzione così ottenuta è stata centrifugata a 10000 rpm per 20 minuti (Beckman Model J2-21 Centrifuge; Rotore: JA-20). Il sovranatante è considerato il mio campione.
Metodo utilizzato per la valutazione del
contenuto proteico.
Per valutare la concentrazione proteica dei campioni è stato utilizzato il metodo di Bradford (Bradford, 1976). Il saggio è eseguito aggiungendo a 800 μl di campione proteico, 200 μl di soluzione colorante fornita dalla Biorad Protein Assay. Dopo agitazione della soluzione su vortex e incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente, viene misurata l’assorbanza della soluzione a 595 nm. Al valore ottenuto viene sottratto quello relativo ad un campione preparato sostituendo il campione proteico con 800 μl di H2O.La concentrazione proteica viene
valutata mediante una retta di taratura, ottenuta usando come standard una soluzione di albumina di siero bovino (BSA) (0,1mg/ml) in
Dosaggio dell’attività enzimatica della
laccasi utilizzando ABTS come substrato.
Il dosaggio dell’attività della laccasi viene effettuato alla temperatura di 37°C in una miscela di reazione che contiene, in tampone sodio acetato 100 mM pH 5, il campione proteico contenente laccasi, e l’ABTS 0,4 mM come substrato. Il volume finale della miscela è di 500μl. L’attività viene misurata valutando l’aumento di assorbanza a 420 nm dovuto alla formazione di un composto color verde in seguito all’ossidazione dell’ABTS. Da questo valore viene sottratto quello relativo ad una miscela di saggio priva del substrato. Una unità enzimatica è la quantità di enzima che catalizza l’ossidazione di una μmole di ABTS al minuto, nelle condizioni di saggio descritte, utilizzando per l’ABTS un coefficiente di estinzione pari a 36000 M-1 cm-1.Dosaggio dell’attività enzimatica della
manganese perossidasi.
Il dosaggio dell’attività della manganese perossidasi viene effettuato alla temperatura di 37°C in una miscela di reazione che contiene, in tampone sodio malonato 50 mM pH 4,5, il campione proteico contenente manganese perossidasi, ABTS 1mM, MnSO4 1 mM e H2O2
viene misurata valutando l’aumento di assorbanza a 420 nm dovuto alla formazione di un composto color verde in seguito all’ossidazione dell’ABTS. Da questo valore viene sottratto quello relativo ad una uguale miscela di saggio priva dell’H2O2. In questo modo si sottrae
l’attività della laccasi dall’attività totale, discriminando l’attività della manganese perossidasi. In queste condizioni di saggio una unità enzimatica è la quantità di enzima che catalizza l’ossidazione di una μmole di ABTS al minuto, utilizzando per l’ABTS un coefficiente di estinzione pari a 36000 M-1 cm-1. In alternativa l’attività della
manganese perossidasi può essere valutata alla temperatura di 37°C in una miscela di reazione che contiene, in tampone sodio malonato 50 mM pH 4,5, il campione proteico contenente manganese perossidasi, MnSO4 1 mM e H2O2 50 x 10-3 mM. Il volume finale della miscela è di
600 μl. L’attività viene misurata valutando l’aumento di assorbanza a 270 nm dovuto alla formazione di un complesso tra gli ioni Mn3+ ed il
malonato (ε270 = 7800 M-1 cm-1).
Dosaggio dell’attività enzimatica della
lignina perossidasi.
Il dosaggio dell’attività della lignina perossidasi viene effettuato alla temperatura di 21°C in una miscela di reazione che contiene, in tampone sodio tartrato 100 mM pH 3, il campione proteico contenente
lignina perossidasi, alcool veratrilico 2 mM e H2O2 0,4 mM. Il volume
finale della miscela è di 500 μl. Viene valutato il cambiamento
di assorbanza a 310 nm. Una unità enzimatica è definita come la quantità di enzima che forma 1 μmole di veratraldeide per minuto (ε 310
= 9300 M-1 cm-1).
Prove di decolorazione del bagno di
tintura nero LanasolR incubato con
campioni di coltura dinamica e statica.
Vengono preparate delle miscele contenenti 300ul di campione, 100ul di LanasolR, mediatori (HBT,ABTS e acido violurico) 250uM in tampone sodio acetato 100mM pH 5 per un volume finale di 1ml. Le incubazioni sono state effettuate a temperatura ambiente ed in agitazione.
Prove di citotossicità.
Le prove di citotossicità vengono eseguite su una linea cellulare epiteliale umana (WISH). Le cellule WISH sono state fatte crescere a 37°C in un atmosfera umidificata e CO2 al 5% in un mezzo standard
formato da RPMI con il 10% di siero fetale bovino e antibiotici (penicillina 100 IU/ml e streptomicina 100 µg/mL). Le cellule vengono
piastrate in 10 ml di mezzo standard in piastre di 10 cm di diametro e lasciate crescere in genere per circa 72h, fino alla formazione di
un monostrato di cellule attaccato al substrato della piastra. Per il mantenimento della coltura cellulare, le piastre le cui cellule hanno raggiunto la confluenza subiscono un processo di tripsinizzazione mediante il quale il monostrato cellulare aderente al supporto viene convertito in una sospensione di cellule vive e libere che possono essere opportunamente diluite e ripiastrate per mandare avanti la coltura o per eventuali esperimenti. Per le prove di citotossicità, le cellule vengono fatte crescere in 3 ml di mezzo standard in piastre da 35mm di diametro per circa 72h in modo da raggiungere il numero di circa 1.000.000 di cellule per piastra, condizione ideale per i successivi trattamenti sperimentali. Per contare le cellule, venivano tripsinizzate una o due piastre e dopo un’opportuna diluizione, la sospensione ottenuta veniva utilizzata per la conta in una camera Burker.
Una volta trascorse le 72h, le cellule sono state incubate, a vari tempi, in presenza di LanasolR,LanasolRosso e LanasolBlu diluiti 1:10 oppure 1:5 nel mezzo di coltura. Per ogni colorante sono utilizzate 6 piastrine, 3 verranno utilizzate per il saggio del Trypan Blue e 3 per l’analisi della carica energetica all’HPLC.
a) saggio del Trypan Blue.
sono stati eseguiti tre lavaggi con PBS è stata aggiunta la tripsina
(0.5 ml 0,25%) e le cellule sono state incubate per 5 minuti; in seguito per misurare il numero totale di cellule aderenti, la sospensione cellulare è stata diluita in un volume appropriato di RPMI e le cellule contate al microscopio in una camera Burker. Per misurare la percentuale di cellule morte, tra quelle aderenti alla piastra, la sospensione cellulare è stata sottoposta a 2 centrifughe: dopo la prima centrifuga è stato aspirato il sovranatante ed il pellet è stato lavato con PBS (6,5ml) per allontanare il siero; è seguita una seconda centrifuga dopo la quale è stato recuperato il sovranatante ed è stata aggiunta una opportuna quantità di PBS (2,5 o 1,5ml secondo il numero di cellule), per risospendere le cellule; dopo la seconda centrifuga è stata prelevata un’aliquota (0,5ml) e messa in un eppendorf con 0,5 mL del colorante Trypan blue, che viene assunto dalle cellule morte visibili al microscopio; successivamente è stata calcolata la percentuale di cellule morte per ogni piastrina.
b) analisi pool adenilato all’HPLC.
Alla fine dell’incubazione, le piastrine subiscono due lavaggi con 2 ml di soluzione fisiologica fredda e con aggiunta di 0,1 ml di PCA freddo 0,6 N al monostrato cellulare. La raccolta delle cellule dalle piastre cosi’ trattate porta ad ottenere una sospensione che viene centrifugata
per 5 minuti a 10000 RPM in una centrifuga da tavolo Eppendorf Microfuge in modo da ottenere un sovranatante da prelevare e neutralizzare con 15 microlitri di K2CO3 freddo 3,5 M con una seconda
centrifugazione in analoghe condizioni; il sovranantante ottenuto viene prelevato per l’analisi del pool della’denilato all’HPLC. Le analisi vengono eseguite con un’apparecchiatura Beckman (San Ramou,CA) System Gold, composta da due pompe HPLC, una camera di miscelamento, un rivelatore UV a serie di diodi. Viene usata una colonna (Beckman) Ultrasphere C-18 (4,6 x 250mm, particelle 5μm di diametro). L’eluizione dei componenti viene effettuata secondo quanto descritto da Micheli et al. (1999).
Esecuzione degli spettri per la
valutazione dei risultati
Per ciascun campione vengono effettuati degli spettri di assorbimento con uno spettrofotometro Beckam modello DU7 in modo da valutare il cambiamento di assorbanza alla lunghezza d’onda di 588 nm al tempo 0 e dopo 5 giorni dall’inizio dell’incubazione in presenza ed in assenza dei diversi mediatori.
