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2. MATERIALI E METODI
2.1. Ceppi microbici utilizzati
Nell’ambito della presente tesi, è stato utilizzato il fungo micorrizico arbuscolare G. intraradices IMA6 mantenuto in collezione presso il Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-ambientali (Laboratori di Microbiologia) in pot-cultures seminate con trifoglio alessandrino e medica.
2.2. Analisi microbiologica dei batteri associati alle spore del
ceppo micorrizico
Allo scopo di analizzare la popolazione batterica associata alle spore di G. intraradices IMA6 sono state raccolte circa 200 spore in triplicato che sono state sottoposte a 15 lavaggi in condizioni di sterilità e successivamente omogenate in tubi eppendorf da 1,5 ml in 100 µl di soluzione fisiologica mediante macinatura con apposito pestello.
L’omogenato è stato sospeso in 3,5 ml di soluzione fisiologica rappresentante la soluzione tal quale (TQ). Da quest’ultima è stata prelevata un’aliquota di 1 ml e trasferita in una provetta contente 9 ml di fisiologica, ottenendo la diluzione 1:10 (10-1) del campione. Nelle piastre Petri, contenenti i diversi terreni di coltura, sono stati inoculati 100 µl di ciascuna sospensione e sono stati distribuiti uniformemente mediante semina per spatolamento. Al fine di ottenere un risultato statisticamente valido sono state allestite tre piastre per ciascuna diluizione.
32 2.2.1. Mezzi di coltura
Nell’ambito dell’analisi microbiologica sono stati preparati mezzi di coltura specifici per le diverse tipologie batteriche. Tali mezzi sono stati addizionati con antibiotici allo scopo di aumentare la loro selettività.
2.2.1.1. TSA
Il rilevamento di batteri eterotrofi coltivabili è stato effettuato mediante l’utilizzo del mezzo Tryptic soy agar (TSA), la cui composizione è di seguito riportata in Tabella 1.
Tabella 1: Composizione del mezzo microbiologico Tryptic
soy agar (TSA) (Fluka)
Il mezzo è stato preparato sciogliendo il reagente in acqua deionizzata e sterilizzato in autoclave a 121°C per 15 minuti. Successivamente, sono stati aggiunti 100 mg/l di Cicloesimide e 500 UI/ml di Nistatina, antibiotici che impediscono la crescita di eumiceti. Il mezzo è stato distribuito su piastre Petri sterili. Le piastre inoculate sono state incubate in termostato alla temperatura di 28°C per 2 giorni.
Per l’analisi di batteri appartenenti al genere Bacillus spp. i campioni sono stati preliminarmente sottoposti ad un trattamento termico a 80°C per 10 minuti, in modo da eliminare i microrganismi non termo-tolleranti. Le piastre inoculate sono state incubate in termostato a 28°C per 2 giorni.
Reagente Concentrazi
one
Tryptic soy broth 30 g/L Bacteriological agar 20 g/L
33 2.2.1.2. Waksman agar
Il rilevamento degli attinobatteri è stato effettuato mediante l’utilizzo del terreno microbiologico Waksman, la cui composizione è riportata in Tabella 2.
Tabella 2: Composizione del mezzo Waksman agar
Il mezzo è stato preparato sciogliendo i vari reagenti in acqua deionizzata. Dopo aver portato il pH a 7 e sterilizzato in autoclave a 121°C per 20 minuti, sono stati aggiunti 100 mg/l di Cicloesimide e 500 UI/ml di Nistatina per inibire lo sviluppo di eumiceti e 5 mg/l di Polimixina per inibire lo sviluppo di batteri Gram -. Successivamente il mezzo è stato distribuito su piastre Petri sterili.
Le piastre inoculate sono state incubate in termostato a 28°C per 5 giorni.
2.2.1.3. Mezzo minimo con chitina colloidale agar
I batteri chitinolitici sono stati rilevati mediante l’utilizzo del mezzo minimo con chitina colloidale (Souza et al., 2009), la cui composizione è di seguito riportata in Tabella 3.
Reagente Concentrazione
Glucosio 10 g/L
Cloruro di sodio 5 g/L Bacteriological Peptone (Oxoid) 5 g/L Estratto di carne Lab-lemco (Oxoid) 3 g/L Agar bacteriological N.3 (Oxoid) 20 g/L
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Tabella 3: Composizione del Mezzo minimo con chitina colloidale
Per la preparazione di questo mezzo i vari reagenti sono stati sciolti in acqua milliQ e, infine, il pH è stato portato a 7. Dopo sterilizzazione in autoclave a 121°C per 15 minuti, il mezzo è stato addizionato con 100 mg/l di Cicloesimide e 500 UI/ml di Nistatina.
In seguito il mezzo è stato distribuito su piastre Petri sterili.
Le piastre inoculate sono state incubate in termostato a 28°C per 5 giorni.
2.2.1.4. N-free Winogradsky medium
Il mezzo N-free Winogradsky (Tchan, 1984) è stato impiegato per l’arricchimento e l’isolamento di batteri azoto fissatori. La sua composizione è descritta in Tabella 4 e 5.
Tabella 4: Composizione del mezzo Nitrogen free mineral salts
Reagente Concentrazione Chitina colloidale 0,3 % (NH4)2SO4 1 g/L KH2PO4 0,2 g/L K2HPO4 1,6 g/L MgSO4∙7H2O 0,2 g/L NaCl 0,1 g/L FeSO4 7 H2O 0,01 g/L CaCl2 0,02 g/L
Agar nobile N.1 (Oxoid) 20 g/L
Reagente Concentrazione Soluzione stock salina 5 ml/L CaCO3 5,0 mg/L Agar Nobile N.1 20 g/L
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Tabella 5: Composizione della soluzione stock salina
È stata sterilizzata per filtrazione e mantenuta a temperatura ambiente.
Per la preparazione di questo mezzo di coltura è stata utilizzata l’acqua milliQ e il pH è stato portato a 7,2. La sterilizzazione in autoclave è stata condotta a 121°C per 15 minuti. Successivamente è stata aggiunta la soluzione zuccherina 100ml/l, la cui composizione è descritta in Tabella 6 e, come antibiotici, 100 mg/l di Cicloesimide e 500UI/ml di Nistatina.
Tabella 6: Composizione della soluzione zuccherina
È stata sterilizzata in autoclave a 115°C per 10 minuti.
In seguito il substrato è stato distribuito su piastre Petri sterili.
Le piastre inoculate sono state incubate a 28°C per una settima in condizioni di semi-anaerobiosi.
In seguito all’incubazione delle piastre inoculate, è stata effettuata la conta delle colonie sviluppatesi sui terreni nutritivi agarizzati, prendendo in considerazione solamente le diluizioni in cui il numero di colonie sviluppate era statisticamente valido ed era possibile distinguere una
Reagente Concentrazione KH2PO4 50 g/L MgSO4∙7H2O 25 g/L NaCl 25 g/L FeSO4∙7H2O 1 g/L MnSO4∙4H2O 1 g/L Na2MoO4∙2H2O 1 g/L Reagente Concentrazione Glucosio 10 g/100 mL
36 colonia dall’altra. Il risultato è stato espresso in Unità Formanti Colonia (UFC/ml), ricavato con l’equazione:
UFC/ml = n° colonie per piastra × 10n × 10
dove n rappresenta la diluizione seminata, presa in considerazione per la conta.
2.3. Isolamento di batteri in coltura pura
Dopo lo sviluppo in piastra delle colonie, alcune di queste sono state scelte in maniera casuale all’interno di ciascuna morfologia evidenziata ed isolate in coltura pura. In particolare, ciascuna colonia è stata strisciata per quattro volte sullo stesso tipo di mezzo da cui era stata isolata ed incubata nelle stesse condizioni di isolamento.
I microrganismi isolati in coltura pura sono stati inseriti nella collezione del Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-ambientali; laboratori di microbiologia, mantenuti a -80°C in glicerolo al 20% .
2.4. Screening dei batteri per la loro attività di promotori della
crescita (PGP)
Alcuni batteri isolati sono stati preliminarmente caratterizzati andando ad analizzare alcune proprietà che promuovono la crescita della pianta, in particolare:
1) Sintesi di fitormoni;
2) Solubilizzazione del fosforo; 3) Produzione di siderofori.
37 2.4.1. Sintesi di fitormoni: produzione dell’acido indolacetico (IAA)
L’acido indol-3-acetico (IAA), appartenete al gruppo della auxine, si forma dal triptofano che viene deaminato per via ossidativa o decarbossilato. Per analizzare la produzione dell’acido indolacetico è stato utilizzato come mezzo colturale il Luria-Bertani broth (LBB) (Bharadwaj et al., 2008), la cui composizione è di seguito riportata in Tabella 7.
Tabella 7: Composizione del mezzo
microbiologico Luria-Bertani broth
Reagente Concentrazione
Bacto-Tryptone 10 g/L Yeast Extract (Difco Ltd) 5 g/L NaCl 5 g/L
Il mezzo è stato ottenuto miscelando i vari reagenti elencati con acqua deionizzata. Dopo aver portato il pH a 7,5 si è proceduto a sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti.
Sono stati preparati:
La soluzione di triptofano (10 mg/ml):è stato pesato 1 g di triptofano e sciolto (in agitazione) in 100 ml di acqua deionizzata; la soluzione ottenuta è stata sterilizzata per filtrazione utilizzando un filtro da 0,2 µm. Questa soluzione è stata conservata a 4 °C. Il mezzo dove sono stati inoculati i ceppi da testare è stato preparato aggiungendo50 ml dello stock in 500 ml di LBB.
Il reagente di Salkowski: 1,2% di FeCl3 in H2SO4 al 37% (1,2 g/100 ml). È stato utilizzato un cilindro graduato di vetro e aggiunti in sequenza 62,3 ml di acqua e 37,7 ml di H2SO4 al 98% e infine 1,2 g di FeCl3. Deve essere conservato al buio.
38 I ceppi da testare sono stati inoculati in tubi falcon da 15 ml contenti 4 ml di Luria-Bertani broth e triptofano. Sono stati incubati a 20°C in agitazione (200 rpm) per 24 h i batteri da TSA, TSAT e Ch, per 5 gg gli attinobatteri e per 2 gg gli azoto fissatori. Dopo incubazione le colture sono state centrifugate a 7500 rpm per 10 minuti. Dalla sospensione ottenuta è stato prelevato1 ml di surnatante ,trasferito in piastre a pozzetti e addizionato con 2 ml di reagente di Salkowski. Tali piastre sono state messe ad incubare al buio per 30 minuti. Successivamente è stato osservato il viraggio del colore, da giallo a rosso in caso di presenza di IAA.
Come controllo negativo è stato utilizzato il mezzo non inoculato mentre per il controllo positivo una soluzione con IAA alla concentrazione di 66 µg/ml di EtOH TQ e la diluizione1:10.
2.4.2. Attività fosfatasica e fitasica
Il fosforo è generalmente presente nel suolo in due forme: i fosfati minerali componenti del suolo, mentre la seconda forma è costituita dal fosfato organico, rappresentato essenzialmente da fitati.
La capacità di solubilizzare il fosfato è stata analizzata mediante l’utilizzo del mezzo specifico National Botanical Research Institute’s Phosphate (NBRIP) (Nautiyal et al., 1999), la cui composizione è riportata in Tabella 8.
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Tabella 8: Composizione del mezzo National
Botanical Research Institute’s Phosphate (NBRIP)
Il pH è stato portato a 7 e la sterilizzazione in autoclave è stata condotta a 121°C per 15 minuti.
I ceppi batterici sono stati inoculati con l’aiuto di un’ansa per creare degli spot sulla piastra. Intorno allo spot dovrà crearsi una zona chiara che conferma la solubilizzazione del fosfato. Successivamente le piastre sono state incubate a 28°C per 2-5giorni. Dopo 14 giorni è stata effettuata la misurazione del diametro della colonia e dell’alone di inibizione mediante il calcolo dell’efficienza di solubilizzazione del fosfato (SE) (Rokhbakhsh-Zamin Farokh, 2011),con la formula:
SE= [Zona d’alone (z) / Diametro della colonia (n)] x 100
La capacità di mineralizzare il fosfato organico è stata valutata mediante la formazione di aloni di chiarificazione intorno alle colonie. Questa capacità è stata testata mediante l’impiego di tre terreni differenti:
1) Modified Phytate Specific Medium (MPSM) (Unno et al., 2005), è stato preparato con acqua milliQ. La composizione per litro è riportata in Tabella 9. Reagente Concentrazione Glucose 10 g/L Ca3(PO4)2 5,0 g/L MgCl2 6 H2O 5,0 g/L MgSO4 7H2O 0,25 g/L KCl 0,2 g/L (NH4)2SO4 0,1 g/L Agar bacteriological 15 g/L
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Tabella 9: Composizione del mezzo Modified Phytate Specific
Medium (MPSM)
* FeNa-EDTA 0.1 M :è stato preparato sciogliendo 3,67 g in 100 ml di H2O e, successivamente, aggiungendo 1 ml per 1 L di mezzo al fine di ottenere 0,01 g/L.
** Bromocresol green: da pH 3.8 (giallo) a pH 5.4 (blu). È stata preparata una soluzione stock (100 mg in 10 ml di EtOH al 98%) ed è stato aggiunto 1 ml per 1 L di mezzo al fine di ottenere 0,01 g/L.
La composizione del TES è descritta in Tabella 10.
Tabella 10: Composizione della soluzione TES
2) Phytate Screening Medium (PSMG) (Jorkera et al., 2008), è stato preparato con acqua distillata. Solamente su questo terreno è stata
Reagente Concentrazione Na-phytate (Na-IHP) 10 g/L CaCl2·2H2O 0,1 g/L (NH4)2SO4 1,0 g/L KCl 7,0 g/L MgSO4 7 H2O 0,1 g/L FeNa-EDTA * 1,0 mL 0,1 M Bromocresol green ** 0,01 g/L TES 1 mL Agar 15mg/L Reagente Concentrazione Na2EDTA∙2H2O 15 g/L ZnSO4∙7H2O 0,43 g/L CoCl2∙6H2O 0,24 g/L MnCl2∙4H2O 0,99 g/L Na2MoO4∙2H2O 0,22 g/L NiCl2∙6H2O 0,19 g/L Na2SeO3∙6H2O 0,08g/L H3BO4 0,15g/L
41 riscontrata la formazione di aloni di chiarificazione intorno alle colonie. La composizione di tale mezzo è descritta in Tabella 11.
Tabella 11: Composizione del mezzo Phytate Screening
Medium (PSMG)
3) Phytate Screening Medium (PSM) è stato preparato con acqua milliQ. La sua composizione è uguale a quella del PSMG, le uniche eccezioni sono l’assenza di glucosio e una quantità maggiore di Na-phytate, 10 g anziché 4 g.
Per tutti e tre i terreni il pH è stato portato a 7 e, successivamente, è stata effettuata una sterilizzazione a 121°C per 15 minuti.
La comparsa di aloni trasparenti intorno alle colonie, cresciute su NBRIP e PSMG, è stata considerata la prova della mineralizzazione del fitato e della solubilizzazione del fosfato.
2.4.3. Produzione di siderofori
Un altro elemento fondamentale per la crescita della maggior parte dei microrganismi è il ferro, la cui concentrazione nel suolo è molto bassa. Gran parte dei microrganismi ha sviluppato una strategia per l’acquisizione del ferro che consiste nella produzione di siderofori, molecole con forte affinità per gli ioni Fe3+.
Reagente Concentrazione D- Glucose 10 g/L Na-phytate 4,0 g/L CaCl2 2,0 g/L NH4NO3 5,0 g/L KCl 0,5 g/L MgSO4 7H2O 0,5 g/L FeSO4 7H2O 0,01 g/L MnSO4 7H2O 0,01 g/L Agar 15mg/L
42 Per la produzione di siderofori i batteri sono stati coltivati su TSA in condizioni di carenza di ferro. Tutta la vetreria è stata trattata con HCl 6M (61,22 ml di HCl al 36% in 38,77 ml di ddH2O) e lavata con H2O milliQ.
Il protocollo ha previsto:
1) Per la preparazione del CAS (Chrome Azurol S) (Louden et al., 2011_CAS assay) sono stati utilizzati tre diversi contenitori in plastica da 100 ml in cui sono state rispettivamente preparate tre differenti soluzioni.
a) Soluzione 1: sciogliere 120 mg di CAS (Fluka) in 100 ml di H2O milliQ.
b) Soluzione 2: sciogliere 27 mg di FeCl3∙6H2O in 100 ml di HCl 10 mM (100 µl di HCl al 36% in 100 ml di H2O milliQ).
c) Soluzione 3: sciogliere 146 mg di HDTMA (Hexadecyltrimethylammonium bromide) in 80 ml di H2O milliQ. Scaldare 15 secondi con microonde per solubilizzare l’HDTMA. Le tre soluzioni sono state unite, mescolando 100 ml della Soluzione 1 con 18 ml della Soluzione 2. Successivamente sono stati aggiunti 80 ml della Soluzione 3. La soluzione ottenuta di colore blu scuro è stata sterilizzata a 121°C per 15 minuti in autoclave. Deve essere conservata al buio.
2) Per la preparazione del CAS agar sono stati sciolti 32,24 g di piperazine-N,N’-bis (2-ethanesulfonic acid) PIPES in 890 ml di H2O milliQ. Poiché il PIPES non si scioglie a pH < 5 è stato necessario portare il pH a 6 e lentamente aggiungere il PIPES mantenendo in agitazione. Il pH si è abbassato mano a mano che il PIPES si scioglieva; facendo attenzione a non superare pH 6,8 altrimenti la soluzione virava al verde.
43 Una volta preparata la soluzione è stata aggiunta nelle beute con 9 g/L di Agar Nobile e sterilizzata a 121°C per 15 minuti. A seguito della sterilizzazione, quando le beute hanno raggiunto una temperatura di 50°C, sono stati lentamente aggiunti 50 ml della soluzione colorante CAS (blu), facendola scivolare lungo la parete di vetro della beuta e agitando in modo tale da mescolare accuratamente.
3) O-CAS assay: 15 ml di CAS sono stati versati sulle piastre di TSA su cui sono cresciuti i microrganismi da testare. Dopo un’incubazione di 15 minuti è stato rilevato il cambiamento di colore dovuto alla produzione di siderofori: da blu a porpora o da blu ad arancio (precoci).
