LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Greta Bukauskaitė
Taeniidae šeimos kaspinuočių metacestodų morfologinis ir
molekulinis identifikavimas bei paplitimas paskerstų
galvijų kepenyse
Morphological and molecular identification and prevalence
of Family Taeniidae tapeworm metacestodes in the liver of
slaughtered cattle
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Mindaugas Šarkūnas
DARBAS ATLIKTAS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Taeniidae šeimos kaspinuočių metacestodų morfologinis ir molekulinis identifikavimas bei paplitimas paskerstų galvijų kepenyse“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Greta Bukauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
Asta Baškevičienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
Prof. dr. Mindaugas Šarkūnas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Prof. habil. dr. Saulius Petkevičius
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas,
pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas Prof. habil. dr. Saulius Petkevičius
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 9 1.1. Echinococcus granulosus ... 9 1.1.1. E. granulosus biologija ... 91.1.2. E. granulosus metacestodo vystymasis ... 9
1.1.3. E. granulosus metacestodo morfologija ... 10
1.1.4. E. granulosus epidemiologija ... 11
1.1.5. Veiksniai, turintys įtakos E. granulosus plitimui ... 12
1.2. Echinococcus multilocularis ... 13 1.2.1. E. multilocularis biologija ... 13 1.2.2. E. multilocularis metacestodai ... 13 1.2.3. E. multilocularis epidemiologija ... 14 1.3. Taenia saginata ... 15 1.3.1. T. saginata biologija ... 15 1.3.2. T. saginata metacestodai ... 15
1.3.3. Veiksniai, turintys įtakos užsikrėtimo dažnumui ... 16
1.3.4. T. saginata paplitimas ... 17 1.4. Taenia hydatigena ... 17 1.4.1. T. hydatigena biologija ... 17 1.4.2. T. hydatigena epidemiologija ... 18 1.5. Molekulinis tyrimas ... 18 2. METODIKA ... 20 2.1. Tyrimo schema ... 20
2.2. Tiriamieji gyvūnai ir mėginių rinkimas ... 21
2.3. Morfologinis identifikavimas ... 21
2.4. DNR išskyrimas ir sudėtinės polimerazinės grandininės reakcijos (angl. Multiplex PCR) tyrimas ... 22
2.5. Statistinė analizė ... 22
3. TYRIMO REZULTATAI ... 23
3.1. Morfologinis identifikavimas ... 23
3.2. Sudėtinės PGR rezultatai ... 25
3.2.1. Morfologinio ir sudėtinės PGR tyrimų palyginimas ... 27
3.2.2. Skirtingos lyties, amžiaus ir produkcijos tipo galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais ... 27
3.2.3. Galvijų užsikrėtimo kaspinuočių metacestodais paplitimas ... 29
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32
IŠVADOS ... 35
TAENIIDAE ŠEIMOS KASPINUOČIŲ METACESTODŲ MORFOLOGINIS IR MOLEKULINIS
IDENTIFIKAVIMAS BEI PAPLITIMAS PASKERSTŲ GALVIJŲ KEPENYSE
Greta Bukauskaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Užsikrėtimas Taeniidae šeimos kaspinuočių lervomis yra pavojingas zoonotinis susirgimas. Nors pasaulyje vyksta aktyvūs epidemiologiniai tyrimai ir vykdoma šių parazitų kontrolė, Lietuvoje yra mažai duomenų apie šių cestodų paplitimą. Vienas iš zoonotinių kaspinuočių paplitimo nustatymo būdų yra tirti tarpinių šeimininkų skerdenų užkrėstumą kaspinuočių metacestodais. Visgi, ankstyvoje vystymosi stadijoje esančių arba degeneravusių metacestodų morfologinis identifikavimas yra sudėtingas. Šio darbo tikslas buvo nustatyti kaspinuočių metacestodais užsikrėtusių galvijų paplitimą, pritaikant morfologinį (1) bei molekulinį (2) metacestodų identifikavimą. Ankstesniuose tyrimuose kiaulių (3) ir šernų (4) kepenyse aptiktiems kaspinuočių metacestodams tirti buvo pritaikytas sudėtinės PGR tyrimas (2), skirtas mėsėdžių išmatose aptiktų kaspinuočių kiaušinėlių identifikavimui. Šio tyrimo metu, minėtas sudėtinės PGR tyrimas (2) buvo pritaikytas ir išbandytas galvijų kepenyse aptiktiems įvairaus išsivystymo kaspinuočių metacestodams identifikuoti.
Ištyrus 1247 galvijų iš Lietuvos, Latvijos, Estijos, Nyderlandų ir Prancūzijos vidaus organus, buvo surinktos kepenyse aptiktos cistos ir visi jungiamojo audinio dariniai. Ištyrus visus mėginius morfologiniu ir molekuliniu tyrimais, nustatyta, kad 2,81 proc. (35/1247; 95 % PI 1,9–3,7) paskerstų galvijų buvo užsikrėtę Taenia spp. bei 0,08 proc. (1/1247; 95 % PI -0,1–0,2) E. multilocularis kaspinuočių metacestodais.
Daugelis metacestodų (7/12; 58,3 proc.; 95 % PI 30,4–86,2) buvo cistų pavidalo, didesnio nei 20 mm skersmens (8/18; 32,8 proc.; 95 % PI 21,3–44,3). Tirtuose metacestoduose gemalinių galvučių nebuvo. Bulių (15/401; 3,74 proc.; 95 % PI 1,9–5,6) užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais buvo didesnis (p>0,05) nei karvių (20/846; 2,36 proc.; 95% PI 1,3–3,4). Daugiausia (p>0,05) užsikrėtusių gyvulių buvo iki dvejų metų (13/382; 3,14 proc.; 95% PI 1,58–5,2) lyginant su suaugusiais galvijais.
MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR IDENTIFICATION AND PREVALENCE OF FAMILY
TAENIIDAE TAPEWORM METACESTODES IN THE LIVER OF SLAUGHTERED CATTLE
Greta Bukauskaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
Infection with tapeworm larvae of the family Taeniidae may be a life-threatening zoonotic disease. Although active epidemiological investigations and control of tapeworm infections are undertaken in the world, there are few data on the prevalence of cestode infections in Lithuania. One of the methods to determine the prevalence of zoonotic tapeworm infections is the detection of tapeworm metacestodes in carcasses of intermediate hosts. However, morphological identification of metacestodes in the early developmental stage or degenerated metacestodes is difficult. The aim of present study was to examine the prevalence of tapeworm metacestode infections in slaughtered cattle, based on morphological (1) and molecular (2) identification of metacestodes. Although a multiplex PCR assay is designed to identify tapeworm eggs in carnivore feces, it has also been used to identify tapeworm metacestodes in pigs (3) and wild boars (4) with some success. Multiplex PCR assay (2) has been also used to identify metacestodes of various morphology in cattle.
During a post-mortem examination of 1247 slaughtered cattle, originating from Lithuania, Latvia, Estonia, The Netherlands and France was performed, the internal organs were inspected and metacestodes and various lesion samples were collected for further morphological and molecular examinations. The presence of Taenia spp. metacestodes was confirmed in 2,81 percent (35/1247; 95 % CI 1,9–3,7) and E. multilocularis in 0,08 percent (1/1247; 95 % CI -0,1–0,2) of slaughtered cattle.
Most of Taeniidae metacestodes have been found in the form of cysts (7/12; 58,3 percent; 95 % CI 30,4–86,2) and were larger than 20 mm in diameter (8/18; 32,8 percent; 95 % CI 21,3–44,3). No protoscolexes were observed in the examined metacestodes. Higher (p>0,05) infection rates were observed in male (15/401; 3,74 percent; 95 % CI 1,9–5,6) than those in female (20/846; 2,36 percent; 95 % CI 1,3–3,4) animals. The most frequently (p>0,05) infected animals were found to be younger than two years old (13/382; 3,14 percent; 95 % CI 1,58–5,2) as compared to those of adult animals.
SANTRUMPOS
ELISA (angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – biocheminis tyrimo metodas, kuriuo nustatoma antikūnų arba antigeno buvimas mėginyje.
IFA (angl. immunofluorescent assay) – tyrimo metodas, kuriuo nustatomas tiriamų antikūnų arba antigeno buvimas mėginyje, naudojant fluorescuojančius dažus.
PGR (ang. polymerase chain reaction, PCR ) – polimerazinė grandininė reakcija. CE – cistinė echinokokozė.
AE – alveolinė echinokokozė.
E. granulosus – Echinococcus granulosus.
E. mulilocularis – Echinococcus multilocularis.
T. saginata – Taenia saginata.
C. bovis – Cysticercus bovis.
T. hydatigena – Taenia hydatigena.
C. tenuicollis – Cysticercus tenuicollis.
ĮVADAS
Nuo antikos laikų cestodai sukelia didelę žalą žmonių, laukinių bei naminių gyvūnų sveikatai. Parazitai paveikia maisto saugą, žemės ūkio gyvulių produkciją, dėl ko patiriami dideli ekonominiai nuostoliai, paveikiama visuomenės sveikatos būklė (5). Virškinamojo trakto Taeniidae šeimos parazitai galutiniams šeimininkams žmonėms (Taenia) ir mėsėdžiams (Taenia ir Echinococcus spp.) nesukelia didelės žalos. Tačiau kaspinuočių lervos yra daug pavojingesnės, kadangi gali sukelti tarpinių šeimininkų, tarp jų ir atsitiktinių šeimininkų – žmonių, rimtus sveikatos sutrikimus ar netgi mirtį (2). Žmonių susirgimai cistine ir alveoline echinokokoze yra fiksuojami visuose žemynuose. CE yra dažnai pasitaikanti ir aktuali visuomenės sveikatos problema Kinijoje, Viduržemio jūros regione, Rusijoje, Rytų Afrikoje bei Šiaurės Amerikoje. Alveolinė echinokokozė yra mažo endemiškumo ir daugiausia registruojama šiauriniame Žemės pusrutulyje, tačiau ši parazitozė dažnai gali būti mirtina negydomiems pacientams (6). Dėl echinokokozių pasaulyje kiekvienais metais patiriami milžiniški ekonominiai nuostoliai, siekiantys tris milijardus JAV dolerių. Nuostolius sudaro echinokokozės gydymo išlaidos bei žemės ūkio gyvulių produkcijos brokavimas (7).
Taeniidae šeimos kaspinuočiai yra svarbūs veterinarijoje ir visuomenės sveikatoje. Tačiau sukėlėjo
diagnozavimas dažnai apsiriboja rutininiais tyrimais ir keliais specifiniais morfometriniais kriterijais, nepritaikytais tinkamai diagnozuoti nesubrendusius helmintus ir neišsivysčiusius metacestodus (8). Labiau jautrūs diagnozavimo būdai, tokie kaip IFA, detalus poskerdiminis tyrimas taikomi retai (9). Imunologiniai ir molekuliniai cestodų ir metacestodų diagnozavimo metodai yra pakankamai gerai ištobulinti, tačiau turi savų trūkumų. Taikant imunologinį tyrimo metodą yra sunku identifikuoti specifiniais cestodais užsikrėtusius šeimininkus dėl galimo daugiarūšio užsikrėtimo vienu metu bei dėl kryžminių parazitų antigeninių reakcijų (10). Be to, teigiamas IFA antikūnų testas neatskleidžia, ar šeimininkas parazitoze yra persirgęs anksčiau, ar užsikrėtęs šiuo metu (11). Taip pat imunologiniai tyrimai pasižymi mažu jautrumu ir nėra priimtini rutininiam naudojimui (10).
Sudėtinė PGR metodika, skirta identifikuoti Taeniidae šeimos kaspinuočių kiaušinėlius mėsėdžių išmatose, sėkmingai taikoma nuo 2007 metų. Analizei naudojami mitochondrinius genus veikiantys
E. granulosus, E. multilocularis bei Taenia spp. pradmenys (2). Ši metodika, naudojant tuos pačius
pradmenis, Lietuvoje buvo pritaikyta morfologiškai neidentifikuotiems – nekrozuotiems bei kalcifikuotiems metacestodams kiaulių kepenyse identifikuoti. Tyrimo metu buvo patvirtintas kiaulių užsikrėtimas tirtais E. multilocularis, E. granulosus bei Taenia spp. metacestodais (3). Sudėtinės PGR metodika buvo išbandyta Vainiaus Stanevičiaus (4) identifikuojant metacestodus šernų kepenyse. Šio tyrimo metu nustatytas šernų užsikrėtimas E. multilocularis bei Taenia spp. metacestodais, tačiau užsikrėtusių E. granulosus nebuvo (4).
Šio tyrimo tikslas – nustatyti galvijų užsikrėtimo kaspinuočių metacestodais dažnumą bei jų paplitimą, tiriant paskerstų galvijų vidaus organus morfologinio bei sudėtinės PGR tyrimų pagalba.
Uždaviniai:
1. Atlikti detalųjį morfologinį galvijų kepenyse aptiktų cistų ir kepenų darinių tyrimą (1).
2. Atlikti cistų ir kepenų darinių identifikavimą, pritaikant sudėtinės PGR tyrimą pagal Trachel et al. (2) neišsivysčiusiems ar netipiškiems kaspinuočių metacestodams identifikuoti, ir nustatyti galvijų užsikrėtimą Taeniidae šeimos kaspinuočių metacestodais.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Echinococcus granulosus
1.1.1. E. granulosus biologija
Suaugę E. granulosus kaspinuočiai yra 2–7 milimetrų ilgio. Cestodo kūną sudaro skoleksas, kaklelis ir 3–5 proglotidai. Anterinis proglotidas yra nesubrendęs, vidurinysis – subrendęs, o posteriniame narelyje esti pilnai susiformavę kiaušinėliai. Proglotidų kiekis, skolekso kabliukų forma, genitalinės angos lokacija ir hermafroditinių organų išsidėstymas minimaliai skiriasi tarp skirtingų echinokokų rūšių (13).
Echinokokų vystymosi ciklas apima du šeimininkus (14). Suaugę cestodai parazituoja mėsėdžių plonajame žarnyne. Iš galutinio šeimininko virškinamojo trakto patekę į aplinką kaspinuočių kiaušinėliai yra invaziniai tarpiniams šeimininkams. Naminiai ir laukiniai kanopiniai, žmonės užsikrečia kaspinuočių lervomis, kai peroraliai į organizmą patenka echinokokų kiaušinėliai. Tarpinio šeimininko virškinamajame trakte iš kiaušinėlių išsilaisvina onkosferos, kurios penetruoja žarnų sienelę ir migruoja į audinius. Juose formuoja pavienes cistas su protoskoleksais (15). Galutinis šeimininkas užsikrečia suėdęs tarpinio šeimininko visceralinių organų su įsikapsuliavusiais gyvybingais protoskoleksais (16,17). Skrandyje, veikiant pepsino fermentui, protoskoleksai ištrūksta iš kapsulės ir cistos audinių. Besivystantis helmintas čiulptukais bei kabliukais prisitvirtina prie plonosios žarnos sienelės. Po 20–35 dienų echinokokai įsiskverbia tarp žarnų gaurelių (16).
1.1.2. E. granulosus metacestodo vystymasis
E. granulosus metacestodų vystymosi ypatumai priklauso nuo tarpinio šeimininko rūšies (15).
Avys yra svarbiausi parazito transmisijoje dalyvaujantys tarpiniai šeimininkai, kadangi jų organizme formuojasi užkrečiama cistų forma (14). Užsikrėtusių avių vidaus organuose aptinkamos lengvai matomos ir vaisingos cistos. Metacestodai galvijų ir kiaulių organizmuose įprastai yra sterilūs, todėl pastarieji šeimininkai retai dalyvauja E. granulosus perdavime (18, 19).
E. granulosus kiaušinėliams patekus į tinkamo tarpinio šeimininko virškinamąjį traktą, onkosfera
sukelia šeimininko audinių lizę ir degeneraciją. Onkosferos liaukų išskiriamas sekretas yra naudojamas kaip antigenas vakcinos gamyboje prieš CE (21). Nėra iki galo ištirta, kokie faktoriai turi įtakos galutinei echinokokų metacestodų lokalizacijai tarpinio šeimininko organizme. Labiausiai tikėtina, kad metacestodo prisitvirtinimo vietą lemia šeimininko anatomija, fiziologija, parazito rūšis bei kamienas. Onkosferos patekimas iš žarnyno į limfotaką priklauso nuo limfagyslės dydžio, kuris varijuoja tarp skirtingų tarpinių šeimininkų rūšių. Kepenų ar plaučių invazija onkosferomis priklauso į kokią limfagyslę ar kraujagyslę onkosfera pateko (16).
E. granulosus cistos daugiausiai susidaro kepenyse ir plaučiuose. Daugiausia metacestodų
aptinkama kepenyse: galvijų – 56 proc., avių – 70 proc., ožkų – 65 proc. tirtų atvejų (14). Šie parenchiminiai organai yra gerai vaskuliarizuoti, todėl dažniausiai infekuojami iš kraujotakos patekusiomis echinokokų onkosferomis. Plaučiuose ar kepenyse neprisitvirtinusios lervos yra nunešamos į kitus organus (22). Onkosferai patekus į organą taikinį, prasideda formavimasis į metacestodą. Per keturiolika dienų įvyksta onkosferos ląstelių proliferacija, kabliukų degeneracija, raumenų atrofija, vaskuliarizacija, cistos centrinės ertmės formavimasis, germinatyvinio ir neląstelinio sluoksnio sintezė (16).
1.1.3. E. granulosus metacestodo morfologija
Tarpiniuose šeimininkuose gali parazituoti dviejų tipų cistos – vaisingos arba nevaisingos. Vaisingose cistose yra protoskoleksai, kurie būna prisitvirtinę prie germinatyvinio sluoksnio arba laisvai plaukioja cistos skystyje. Makroskopiškai cistą supa plona sienelė, o ertmėje – balkšvas skystis. Tarpinio šeimininko organizme plyšus cistai su protoskoleksais, inicijuojamas nelytinis antrinių cistų formavimasis. Vaisingos cistos yra invazinės, kurių prarijęs galutinis šeimininkas yra infekuojamas. Antro tipo cistos – nevaisingos. Metacestodo vidinė sienelė yra geltonai rudos spalvos, ertmę užpildantis skystis yra skaidrus, nėra protoskoleksų. Kadangi nevaisingos cistos neprodukuoja protoskoleksų, jos nedalyvauja tolimesniame vystymosi cikle (17, 23). Nors galvijai jautrūs užsikrėtimui E. granulosus, didžioji dalis cistų juose yra nevaisingos (17). Rinaldi et al. (24) atlikto tyrimo Pietų Italijoje metu nustatytas vidutinis cistų skaičius vieno galvijo organizme vidutiniškai buvo 8,1. Tirtos cistos buvo sterilios (42,7 proc.) arba kalcifikuotos / kazeozinės (57,3 proc.). Nebuvo rasta nei viena vaisinga cista. Daugiausia tirtų cistų buvo 1–3 cm skersmens (24).
minkštos konsistencijos. Dėl didesnio kiekio retikuloendotelinių ląstelių ir tankaus jungiamojo audinio kepenyse, cistos būna kalcifikuotos. Didelis kiekis mažų cistų gali būti dėl šeimininko imuninio atsako, dėl kurio ribojamas metacestodų augimas (22).
Cistos sienelė sudaryta iš vidinio germinatyvinio ir išorinio sluoksnių. Germinatyvinio sluoksnio struktūra panaši į suaugusio cestodo tegumentą (25). Germinatyvinis sluoksnis pasižymi metaboliniu aktyvumu, kuris reikalingas sąsajų su išoriniu sluoksniu sintezei ir palaikymui (27). Išorinis sluoksnis yra kietas, elastiškas, įvairaus storio neląstelinis sluoksnis. Ląstelinis sluoksnis apsaugo parazito ir šeimininko susijungimo vietą, palaiko cistos vientisumą, nuo kurio priklauso jos gyvybingumas (28). Manoma, kad cista turi inertišką bei stabilų barjerą, kuris apsaugo nuo šeimininko imuninio atsako, ir neleidžia šeimininko ląstelėms patekti į metacestodo vidų (16). Cistos sienelę dengia fibrozinė kapsulė – adventicinis sluoksnis, kuris susiformuoja dėl tarpinio šeimininko imuninio atsako (29). Fibrozinė kapsulė supa pilnai išsivysčiusią E. granulosus cistą. Fibrozinė kapsulė formuojasi vykstant uždegiminėms reakcijoms šeimininko organizme, kurias sukelia metacestodo vystymasis. Uždegimo intensyvumas priklauso nuo šeimininko rūšies. Jei šeimininko uždegiminės reakcijos intensyvios – sukeliama parazito degeneracija ir mirtis. Galvijų organizme kilusi uždegiminė reakcija į metacestodus dažniausiai sukelia jų destrukciją. Tinkamo tarpinio šeimininko organizme aplink metacestodus uždegiminės reakcijos nurimsta, o juos supa pilnai susiformavusi fibrozinė kapsulė (1 pav.) (16).
1 pav. E. granulosus metacestodas (16) 1.1.4. E. granulosus epidemiologija
patogeniškumas ir kontroliavimas. Parazito plitimą lemia jį perduodančių šeimininkų rūšių įvairovė bei gausa konkrečiame regione (16).
Apžvelgiant CE epidemiologiją Europos šalyse, didžiausias paplitimas registruojamas Viduržemio jūros regiono šalyse: Ispanijoje, Italijoje, Graikijoje, Turkijoje bei Pietrytinės Europos šalyse – Bulgarijoje ir Rumunijoje. CE mažiau paplitusi Jungtinėje Karalystėje, Centrinėje Europos dalyje, Baltijos ir Skandinavijos šalyse (30, 31). Didelis parazitozės paplitimas registruotas Rusijoje, tačiau prieinamos epidemiologinės informacijos kiekis nuo 2000 metų yra limituotas (32). Kaip ir daugelyje endeminių zonų pasaulyje, Europoje pagrindinė E. granulosus transmisija vyksta tarp šunų ir naminių kanopinių – avių, ožkų, galvijų, arklių, bufalų, kiaulių. Laukinis vystymosi ciklas tarp laukinių mėsėdžių (vilkų, šakalų, lapių) ir laukinių šernų fiksuojamas Ispanijoje, Italijoje ir Bulgarijoje (33).
Vykdyti žemės ūkio gyvulių monitoringą poskerdiminio tyrimo metu dėl užsikrėtimo CE yra privaloma daugelyje Europos šalių. Europos Sąjungos šalys turi pranešti rezultatus Europos maisto saugos tarnybai, kuri atlieka ligos paplitimo analizę. Galvijų hidatiozė pasireiškia dideliu endemiškumu Italijoje (27,8 proc.), Rumunijoje (22,5 proc.), Turkijoje (19,0 proc.). Bulgarijoje ir Ispanijoje ligos paplitimas tarp galvijų varijuoja 1–5 proc. Galvijų CE Jungtinėje Karalystėje, Austrijoje, Lietuvoje ir Slovėnijoje yra iki 0,5 proc. Pastebima, kad tarp Europos galvijų tirtų cistų vaisingumas yra ženkliai mažesnis, nei tarp Afrikos ir Azijos galvijų. Šis faktas byloja, kad tarp Europos galvijų vyraujantis echinokokų genotipas yra menkai prisitaikęs prie šios tarpinio šeimininko rūšies (33).
Nors rutininė poskerdiminė ekspertizė skerdyklose yra pagrindinis echinokokinių pūslių aptikimo būdas ir dažniausiai naudojamas pateikiant duomenis apie CE paplitimą tarp žemės ūkio gyvulių, tačiau tokio tyrimo tikslumas ir patikimumas gali būti paveikiamas daugelio potencialių veiksnių. Iki 37 proc. gyvulių po nekropsijos gali būti klaidingai teigiamai diagnozuoti CE. Echinokokų metacestodus gali priminti nespecifinės granulomos, pseudotuberkuliozė, riebalinė degeneracija, abscesai, kazeozinis limfadenitas, kitų kaspinuočių lervos. Klaidingai neigiami rezultatai gaunami esant mažoms, intraparenchiminėms echinokokinėms pūslėms (34, 35). Paklaidas lemia poskerdiminį tyrimą atliekančių inspektorių kompetencijos trūkumas, per greitai judančios skerdimo linijos ir kiti faktoriai (36).
1.1.5. Veiksniai, turintys įtakos E. granulosus plitimui
darbo priemonių, nevykdoma kontrolė. Be to, stinga profesionalių gyvūnų industrijos darbuotojų, visuomenės išsilavinimo, viešos informacijos (37). E. granulosus pasižymi didele šeimininkų įvairove, tai užtikrina parazitozės plitimą (24).
1.2. Echinococcus multilocularis
1.2.1. E. multilocularis biologijaEchinokokų rūšys tarpusavyje yra panašios savo vystymusi ir morfologija (13). Tačiau šie cestodai turi unikalias savybes, kuriomis skiriasi nuo kitų šeimos Taeniidae kaspinuočių. Suaugęs echinokokas yra iki septynių milimetrų ilgio ir turi ne daugiau kaip šešis segmentus. Tuo tarpu kitos šeimos Taeniidae rūšys užauga iki kelių metrų ilgio, o kūną sudaro keli tūkstančiai segmentų. Kaip ir visus kaspinuočius, echinokoką dengia pusiau pralaidus sluoksnis – tegumentas (26).
Galutiniai E. multilocularis šeimininkai yra mėsėdžiai – dažniausiai lapės ir šunys (38). Jie užsikrečia suėdę tarpinio šeimininko vidaus organų su metacestodais. Cistose esantys protoskoleksai galutinio šeimininko organizme subręsta į suaugusius cestodus (39). E. multilocularis tarpiniai šeimininkai yra graužikai (38). Šie užsikrečia, kai iš aplinkos į virškinamąjį traktą atsitikinai patenka parazito kiaušinėlių. Būdingo tarpinio šeimininko organizme metacestodai auga visą gyvenimą ir sukelia tarpinio šeimininko mirtį. Maždaug antrą–trečią mėnesį po užsikrėtimo metacestodai tarpinio šeimininko organizme tampa invaziniais. Po infekcijos praėjus keturiems mėnesiams, iš vienos ar kelių į organizmą patekusių onkosferų būna susiformavę tūkstančiai protoskoleksų (39).
Žmonės, naminės kiaulės, laukiniai šernai, arkliai, šunys, beždžionės ir kitos gyvūnų rūšys yra aprašytos kaip atsitiktiniai E. multilocularis šeimininkai, kurių organizme buvo rasti metacestodai (26, 38). Metacestodai sukelia skirtingus patologinius pokyčius, priklausomai nuo atsitiktinio šeimininko rūšies. Japonijoje – kiaulėms ir arkliams, Europoje – šernams ir naminėms kiaulėms atliktų tyrimų metu diagnozuoti metacestodai buvo aptikti kaip maži (1–20 mm), mazgelio formos kepenų pakitimai. Tokia metacestodo morfologija reiškia nepilną išsivystymą. Eksperimentiškai užkrėstoms kiaulėms Europoje buvo pastebėta, kad parazito lervos persistuoja ribotą laiką ir yra sunaikinamos šeimininko organizmo. Visiškai skirtingas yra beždžionių ir šunų užsikrėtimas, pasireiškiantis ryškiais klinikiniais požymiais ir mirtimi (26). Tačiau atsitiktinio šeimininko organizme protoskoleksai nesivysto ir nedalyvauja tolimesnėje parazito transmisijoje (39).
1.2.2. E. multilocularis metacestodai
E. multilocularis lervos yra išskirtinės savo vystymusi ir morfologija. Onkosferai patekus į tarpinio
primena neoplazinį augimą. E. multilocularis cistų sienelės sudarytos iš dviejų sluoksnių: plono germinatyvinio sluoksnio ir jį gaubiančio sincitinio neląstelinio – karbohidratinio sluoksnio (40). Iš germinatyvinio sluoksnio formuojasi kietos konsistencijos ląstelių filamentai, kurie suformuoja vamzdelius ir cistines struktūras, lemiančias infiltracinį augimą (16). Cistos ertmę užpildo puskietė medžiaga. Proliferacija vyksta endogeniškai ir egzogeniškai iš nediferencijuotų germinatyvinių ląstelių (25). Germinatyviniame sluoksnyje formuojasi mazgeliai, kurie invaginuojasi į cistos sienelę. Kapsule dengiamuose mazgeliuose vystosi protoskoleksai – invazyvi lervų forma galutiniam šeimininkui. Protoskoleksų anterinis galas yra panašus į suaugusio cestodo (40). Metacestodus dengia jungiamasis audinys. Tarp šeimininko ir cistos nėra aiškiai išskirto barjero – adventicinio sluoksnio (2 pav.). Nuo metacestodo atsiskyrusios germinatyvinės ląstelės patenka į kraujotaką ar limfotaką ir infiltruoja kitus organus – tolimuosius infekcijos židinius, vadinamus metastazėmis (16).
2 pav. E. multilocularis metacestodas (16) 1.2.3. E. multilocularis epidemiologija
E. multilocularis yra endemiškai pasitaikanti šiauriniame Žemės pusrutulyje. Didžiausias
paplitimas fiksuojamas Vakarų Kinijoje, Tibete, Centrinės Azijos dalyje, Juros kalnuose ir Centrinės Europos šalyse. Taip pat yra pranešimų apie E. multilocularis paplitimą Europos šiaurinėje dalyje, įskaitant Baltijos regioną (38). Endeminėse zonose lapės yra pagrindinis galutinis šeimininkas, platinantis E. multilocularis kiaušinėlius. Tačiau laukinėje gamtoje taip pat aptinkami užsikrėtę kojotai, vilkai, meškėnai, laukinės katės. Endeminėse zonose šunų užsikrėtimas E. multilocularis gali siekti 1–12 proc. (41). Daugelyje valstybių parazitozės paplitimas yra nehomogeniškas. Skirtingas paplitimas atskirose vietovėse atsiranda dėl daugelio faktorių: kraštovaizdžio struktūros ir panaudojimo, graužikų rūšių įvairovės ir gausos (31).
buvo aptikti dėl ligos plitimo, ar dėl pradėto monitoringo ir duomenų sekimo. Statistiniai duomenys nuo 1990-ųjų metų vaizduoja parazitozės plitimą ir šeimininkų gausos didėjimą (31, 43). Gyvūnų užsikrėtimo didėjimas siejamas su augančia lapių populiacija. Parazitozės plitimas geriausiai dokumentuotas Rytų Prancūzijoje, Vokietijoje, Lenkijoje ir Baltijos šalyse. Apie kitas endemiškas zonas trūksta ankstesnių duomenų, sunku nuspręsti, ar parazitozės plitimą lėmė tie patys faktoriai (31, 42, 43).
1.3. Taenia saginata
1.3.1. T. saginata biologija
Galvijinio kaspinuočio vystymosi ciklas apima dvi stadijas – suaugęs cestodas parazituoja žmonių žarnyne, o lervos aptinkamos tarpinių šeimininkų – galvijų širdyje ir skeleto raumenyse (44). Galvijinis kaspinuotis plinta su užsikrėtusių žmonių išmatomis, kai subrendę proglotidai su kiaušinėliais atitrūksta nuo strobilės. Kiaušinėliai į galvijų virškinamąjį traktą patenka tiesiogiai arba per užterštus augalus, inventorių (45, 46). Kiekviename atitrūkusiame narelyje yra apie šimtas tūkstančių kiaušinėlių, tačiau tik pusė proglotide esančių onkosferų yra subrendusios ir invazinės. Atsižvelgiant į didelius onkosferų kiekius, yra manoma, kad vienas žmogus gali užkrėsti šimtus ar net tūkstančius galvijų per visą kaspinuočio gyvavimo laikotarpį. Užsikrėsti kiaušinėliais gali tik galvijas, kitų gyvūnų ar žmonių užsikrėtimas negalimas. Galvijų virškinamajame trakte iš kiaušinėlių ištrūksta onkosferos, kurios penetruoja žarnos sienelę ir su kraujo ar limfos tėkme yra nunešamos į širdies arba griaučių skersaruožius raumenis. Raumenyse onkosferos formuoja metacestodus (46). Galvijai, užsikrėtę C. bovis, įprastai nerodo jokių klinikinių simptomų, tačiau esant didelei lervų invazijai gali pasireikšti miokarditas arba širdies nepakankamumas (47). Vystymosi ciklas užsibaigia žmogui suvalgius žalios arba nepakankamai termiškai apdorotos jautienos su cisticerkais. Plonajame žarnyne per 10–12 savaičių iš protoskoleksų išsivysto suaugę kaspinuočiai (46).
1.3.2. T. saginata metacestodai
C. bovis yra apvalios arba ovalios formos, skysčiu užpildyta pūslelė. Pilnai išsivysčiusio
1.3.3. Veiksniai, turintys įtakos užsikrėtimo dažnumui
Užsikrėtimui galvijų cisticerkoze turi įtakos gyvūno amžius bei lytis. Pastebėta, jog didėjantis amžius teigiamai koreliuoja su užsikrėtimo dažnumu. Ištirta, kad patelės serga dažniau nei patinai. Rizika užsikrėsti taip pat priklauso nuo bandos dydžio, ganymo vietos. Boone et al. (50), Allepuz et al. (51) savo bandymais įrodė, kad užsikrėtusiose bandose yra daugiau gyvulių nei neužsikrėtusiose (50, 51). Tačiau Nielsen et al. (52) ištyrė, kad didesnės bandos turi mažesnę riziką užsikrėsti nei mažos. Skirtingi duomenys buvo gaunami dėl skirtingų tiriamų bandų ganymo būdo (52).
Užsikrėtimo dažnumui turi įtakos gyvulių ganymo vieta. Pastebėtas didesnis užsikrėtimo dažnumas, kur gyvuliai ganomi kalnuotose vietose su priėjimu prie neaiškių vandens šaltinių. Galimybė užsikrėtusiems gyvuliams judėti tarp skirtingų bandų, gyvulių ganymas, kur aukštas žmonių demografinis paplitimas, taip pat turi įtakos užsikrėtimui. Su užsikrėtimu siejamas galvijų ganymas arti užterštų ganyklų ir vandens, dirvožemių tręšimas užterštomis trąšomis, žmonių defekacija netoli ganyklų, nepakankama musių ir paukščių kontrolė, tenijų kiaušinėlių patekimas į nuotekas po antiparazitinio gydymo, fermų prižiūrėtojų užsikrėtimas kaspinuočiais, agrikultūros plėtojimas didinant galvijų koncentraciją (53). T. saginata plitimą lemia žalios jautienos patiekalų valgymas, dalies žmonių populiacijos nesinaudojimas tualetu, skerdimas namuose, per menkas antihelmintinių medžiagų naudojimas. Tai yra pagrindiniai faktoriai, lemiantys galvijų cisticerkozės transmisiją tarp bandos ir teniozę tarp žmonių (54).
1.3.4. T. saginata paplitimas
T. saginata paplitusi ekonomiškai besivystančiose ir išsivysčiusiose pasaulio šalyse. Infekcija itin
reikšminga Afrikoje, Azijoje, Lotynų Amerikoje ir kai kuriose Viduržemio jūros regiono šalyse (48). Atsižvelgiant į Europoje vykdomus mėsos inspekcijos rezultatus, cisticerkų paplitimas varijuoja nuo 0,007 proc. iki 6,8 proc. Visgi manoma, kad tikrasis paplitimas yra bent 10 kartų didesnis. Nors ir atliekamas kruopštus poskerdiminis tyrimas, didžioji dalis atvejų lieka neaptikti dėl nedidelio cisticerkų kiekio jautienoje (55). 2010-ais metais Belgijoje atliktų tyrimų metu galvijų skerdyklose, buvo nustatyta, jog serologiškai teigiamų galvijų buvo aptikta 10 kartų daugiau, nei atliekant rutininę mėsos inspekciją (56).
Apie galvijų cisticerkozę yra pranešimų iš 18 Europos valstybių. Duomenys apie paplitimą pateikiami remiantis rutinine mėsos inspekcija (Europos ir Tarybos reglamentas, Nr. 854/2004). Tačiau mėsos inspekcijos jautrumas yra vos 15,6 proc. Klaidingai teigiamais C. bovis būna randami makroskopiniai pažeidimai, tokie kaip abscesai, Sarcocystis cistos. Tik 6 Europos valstybės yra pateikusios duomenis, gautus jautresniais cisticerkozės diagnozavimo metodais nei poskerdiminis tyrimas. Pateiktais galvijų cisticerkozės tyrimų duomenimis, paplitimas varijuoja nuo 0,54 proc. iki 38,4 proc. Didžioji dauguma duomenų apie paplitimą yra aptikti nuo 1990 metų. Užsikrėtimo dažnumas registruotas iki 1990 metų yra nuo 0,03 proc. iki 6,80 proc. Šiuo metu tam tikrose šalyse, pavyzdžiui Suomijoje, Norvegijoje, registruojami sporadiniai cisticerkozės atvejai (3 pav.). Tai lemia duomenų registravimo ir pranešimo sistemos nebuvimas, nepalankios sąlygos parazito gyvavimui. Islandijoje niekada nebuvo aptikta galvijų cisticerkozės atvejų, tačiau šioje šalyje galvijų poskerdiminio tyrimo metu nėra atliekami rutininiai pjūviai širdyje ir kramtomuosiuose raumenyse (9).
1.4. Taenia hydatigena
1.4.1. T. hydatigena biologija
Makroskopiškai C. tenuicollis yra 5–8 cm skersmens, baltos spalvos arba permatoma cista. Cistos sienelė plona, turinys skystas, skaidrus, balkšvos, gelsvos arba rausvos spalvos. Cistos ertmėje yra vienas skoleksas, kuris gali būti prisitvirtinęs prie sienelės arba laisvai plaukiojantis turinyje (4 pav.) Pūslės dažniausiai randamos poskerdiminio tyrimo metu (59, 61). Senesniuose gyvūnuose plonakaklių cisticerkų aptinkama daugiau ir dažniau. Infekcija gali būti pražūtinga tarpiniui šeimininkui, tačiau dažniausiai yra lengvos formos ir lokalizuota, pažeidžianti kepenis ir turinti mažai reikšmės bendrai organizmo būklei (57). Retesniais atvejais lervos migracija kepenyse gali sukelti trauminį hepatitą, dėl kurio galima tarpinio šeimininko mirtis (62).
4 pav. C. tenuicollis ant kepenų, žarnų ir pilvo sienos paviršiaus.
Rodykle pažymimas invaginavęsis skoleksas (61)
1.4.2. T. hydatigena epidemiologija
Taenia hydatigena metacestodai buvo aptikti 12,3 proc. tirtų elnių Slovakojoje, 22 proc. tirtų
laukinių atrajotojų Baltarusijoje bei 20 proc. ištirtų šernų Estijoje (63). Apie galvijų užsikėtimą
T. hydatigena lervomis ir paplitimą yra nedaug publikacijų, kuriose minima, kad galvijų užsikrėtimo
dažnis yra žemas. Yra sunku paaiškinti, kodėl cisticerkozės paplitimas tarp galvijų yra daug mažesnis nei tarp kiaulių. Tai gali lemti skirtingas šėrimo būdas, skirtingas cisticerko izoliavimas kiaulės organizme. Poskerdiminio tyrimo metu, atliekant metacestodų paiešką, rezultatai gali skirtis, priklausomai nuo inspektoriaus patirties. Tyrimų apie T. hydatigena paplitimą yra mažai, kadangi tai ne zoonotinė ir mažai dominanti liga. Taip pat C. tenuicollis gali būti sunkiai diferencijuojami nuo hidatiozės (64).
1.5. Molekulinis tyrimas
tenijų DNR identifikavimui sukurta ne viena tyrimo technika. Jos apima – RELP (restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas), RELP-PGR, PGR tiesiogiai padauginus DNR sekas, PGR atsitiktinai padauginus polimorfiškas DNR sekas, mikrosatelitų analizė. Daugiausiai išnagrinėtas ir taikomas tenijų identifikavimo būdas yra mitochondrinės DNR nustatymas PGR tyrimu, leidžiantis atskirti genetiškai panašius organizmus (65). Tyrimas taikytas atskiroms šeimos Taeniidae rūšims identifikuoti. PGR tyrimas E. granulosus, E. multilocularis diagnostikai, kuriuo identifikuojama mtDNR, taikomas nuo 1992-ųjų metų. Tyrime taikoma standartinė ekstrakcijos technika bei naudojami atskirų Echinococcus
spp. rūšių pradmenys (66). PGR metodu lyginant tiesiogines mitochondrinės DNR sekas pavyko
identifikuoti dešimt E. Granulosus genotipų (65). PGR tyrimas tenijų identifikavimui daugiausia taikytas siekiant diferencijuoti T. solium ir T. saginata. Metodas skirtas tenijų cisticerkams ir kiaušinėliams, pritaikant rekombinantinės DNR techniką (67).
PGR tyrimas pasižymi dideliu specifiškumu, leidžia identifikuoti Echinococcus spp. ir Taenia spp. bei jų kiaušinėlius (68). Sudėtinis PGR tyrimas vis dažniau taikomas morfologiškai neidentifikuojamoms parazitų cistoms ir kiaušinėliams diagnozuoti. Sudėtinę PGR pritaikė Yamasaki et al., identifikuojant skirtingas Taenia spp. rūšis (69). Taip pat sudėtinis PGR tyrimas buvo pritaikytas Echinococcus spp. bei
Taenia spp. kiaušinėlių identifikavimui mėsėdžių išmatose (2). Sudėtinės PGR technika yra paprasta ir
užima mažiau laiko, tyrimo metu naudojama skirtingų sukėlėjų pradmenų kombinacija padeda diferencijuoti skirtingas parazitų rūšis (68). Kaspinuočių kiaušinėliams identifikuoti skirtas sudėtinis molekulinis metodas sėkmingai pritaikytas suaugusių cestodų ir metacestodų diferenciacijai (2).
2.2. Tiriamieji gyvūnai ir mėginių rinkimas
Tyrimas buvo atliekamas skerdykloje „X“ Lietuvoje. Į skerdyklą buvo vežami galvijai iš įvairių Lietuvos rajonų bei iš kaimyninių šalių. Mėginiai buvo renkami nuo 2019 m. kovo 22 d. iki 2019 m. lapkričio 16 d. Mėginių rinkimas vyko pavasarį ir rudenį. Iš viso į skerdyklą buvo 6 išvykos, kurių metu buvo stebimas 1247 galvijų skerdimas veterinarinės-sanitarinės ekspertizės taške. Ekspertizės taške buvo atliekamas poskerdiminis galvijų vidaus organų tyrimas, laikantis Europos Parlamento ir Tarybos reglamento (EB) Nr. 854/2004. Vidaus organai buvo apžiūrimi vizualiai, palpuojami, atliekami jų pjūviai. Didžiausias dėmesys buvo skiriamas kepenų tikrinimui, kuriose ieškota kaspinuočių metacestodų. Kepenyse buvo ieškoma ne tik tipiškai atrodančių kaspinuočių cistų. Užčiuopus ar pastebėjus bet kokį neaiškios kilmės darinį, abscesą, uždegimo apimtą pažeidimą, jungiamojo audinio darinį – jis būdavo išpjaunamas ir patalpinamas į atskirą maišelį su atsekamumo numeriu (5 pav.). Tyrimui rinkti jungiamojo audinio dariniai, siekiant atmesti galimus riebalinio audinio, navikinius ar kitus neparazitinės kilmės darinius. Tokia atranka buvo taikoma siekiant aptikti netipiškai atrodančius, neišsivysčiusius ar degeneravusius kaspinuočių metacestodus. Iš viso buvo paimta 120 mėginių. Širdis ir plaučiai taip pat buvo apžiūrimi, tačiau jokių pakitimų, primenančių kaspinuočių metacestodus, nebuvo rasta. Po kiekvieno darinio išpjovimo peilis būdavo nuplaunamas ir patalpinamas į 82°C vonelę, vengiant maisto higienos pažeidimų bei kryžminio mėginių užteršimo genetine medžiaga.
.
5 pav. Galvijo kepenų darinys su identifikacijos numeriu
2.3. Morfologinis identifikavimas
Makroskopiškai buvo įvertinta 120 kepenų darinių. Kiekvienas darinys buvo su kepenų audinio likučiais, todėl buvo vertinama tik audinio spalva bei konsistencija. Kepenų makroskopinis vaizdas labai varijavo. Dalis kepenų buvo tamsiai rudos spalvos, standžios konsistencijos, tačiau taip pat pasitaikė šviesių, riebalinės degeneracijos apimtų, trapių, su nekrozės židiniais ir kraujosruvomis. Morfologinio tyrimo metu buvo registruojamas kiekvieno darinio dydis, forma, esama jungiamojo audinio kapsulė bei pertvaros, turinio spalva ir konsistencija. Individualiu numeriu pažymėti dariniai buvo fotografuojami.
Atlikus morfologinį tyrimą, iš kiekvieno darinio buvo imamas mėginys molekuliniam tyrimui. Steriliu skalpeliu buvo išpjaunamas maždaug 25 mg jungiamojo audinio gabalėlis ir patalpinamas į 2 mililitrų ependorfinį mėgintuvėlį. Buvo laikomasi visų saugumo priemonių, kad būtų išvengta kryžminės DNR taršos. Visi ependorfiniai mėgintuvėliai su tiriamąja medžiaga šaldomi -20°C temperatūroje iki tyrimo.
2.4. DNR išskyrimas ir sudėtinės polimerazinės grandininės reakcijos tyrimas
DNR ekstrakcija buvo atliekama naudojant komercinį rinkinį (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany). Darbo eiga vyko vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. DNR išskyrimas iš jungiamojo audinio darinių buvo atliekamas pagal Stefanic´ et al. (70), pritaikant procedūrą, skirtą DNR išskyrimui iš Taeniidae kiaušinėlių (70). Sudėtinė PGR buvo atliekama pagal Trachsel et al. (2), siekiant nustatyti E. granulosus (visas padermes), E. multilocularis arba Taenia spp. DNR (2). Tam buvo naudojami specifiniai E. granulosus, E. multilocularis ir Taenia spp. pradmenys. Visose PGR analizėse buvo naudojami neigiamas (distiliuotas vanduo) ir teigiamas kontrolinis (E. multilocularis) mėginiai. Elektroforezė vyko 35–45 minutes (10 pav.). Nuo elektroforezės pradžios praėjus 35 minutėms, reakcijos rezultatas agarozės gelyje registruotas su „BIO-RAD“ nuskaitymo sistema. Siekiant stipresnės reakcijos, elektroforezė buvo tęsiama dar 10–15 minučių, o rezultatai registruojami pakartotinai.2.5. Statistinė analizė
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Morfologinis identifikavimas
Morfologiškai tirti dariniai buvo suskirstyti pagal rūšį ir dydį. Diferencijuojant pagal rūšį išskirti trys darinių tipai: cistos, abscesai ir jungiamojo audinio dariniai (1 lentelė). Tarp morfologiškai tirtų darinių daugiausiai buvo jungiamojo audinio mazgelių (98/120; 81,7 proc.; 95 % PI 74,7–88,6) (6 pav.). Visus mazgelius dengė jungiamojo audinio kapsulė. Jungiamojo audinio dariniai buvo įvairios formos –
apvalūs, ovalūs, pailgi, neaiškios konfigūracijos. Dariniai buvo baltos, balkšvos, rausvos spalvos, 1–50 mm skersmens.
1 lentelė. Galvijų kepenų darinių tipų proporcinė sudėtis
*Jungiamojo audinio darinių buvo aptikta daugiausia, lyginant su cistomis ir abscesais.
6 pav. Jungiamojo audinio dariniai galvijų kepenyse. Nesusiformavęs Taenia spp. metacestodas (A)
(mėginio Nr. BOV-19-631) (patvirtinta sudėtine PGR). Jungiamojo audinio darinys (B) (mėginio Nr.BOV-19-841)(PGR neigiamas)
Identifikuota 10 neparazitinės kilmės pūlingų abscesų, kurie tarp tirtų darinių sudarė 8,3 proc. (10/120; 95 % PI 3,4–13,3) (7 pav.). Visi abscesai buvo subrendę, tipinės sandaros – juos dengė stora
jungiamojo audinio kapsulė, turinys buvo tirštas, gelsvai žalios spalvos, turintis stiprų specifinį kvapą (7 pav.). Makroskopiškai identifikuotų cistų buvo 10 proc. (12/120; 95 % PI 4,6–15,4) (8 pav.). Cistos buvo neiškilios, su dalinai permatoma sienele – šviesiai baltos spalvos. Prapjovus, viduje rasta ertmė, pripildyta skaidraus serozinio skysčio. Cistas dengė jungiamojo audinio kapsulė.
Darinio tipas n proc. 95% PI
Abscesas 10/120 8,3 3,4–13,3
Cista 12/120 10,0 4,6–15,4
Jungiamojo audinio darinys 98/120 81,7* 74,7–88,6
A A A
7 pav. Pūlingos masės pripildyti dariniai galvijų kepenyse. Daugybiniai žuvę Taenia spp. metacestodai
(A) (mėginių Nr. BOV-19-449) (patvirtinta sudėtine PGR). Abscesas (B) (mėginio Nr. BOV-19-900)
8 pav. Taenia spp. cistos galvijų kepenyse (patvirtinta sudėtine PGR), pripildytos serozinio skysčio,
dengiamos jungiamojo audinio kapsule, intraparenchiminės (mėginiai (A) Nr. BOV-19-578 ir (B) BOV-19-1002)
Dariniai buvo suskirstyti į grupes pagal dydį (2 lentelė). Darinių iki 5 mm skersmens buvo 30,8 proc. (37/120; 95 % PI 22,6–39,1) (9 pav. A). Jie buvo užpildyti jungiamuoju audiniu, baltos-balkšvos spalvos. Darinių 6–20 mm skersmens buvo daugiausia ir sudarė 53,3 proc. (64/120; 95 % PI 44,4–62,3), kurie morfologiškai atrodė kaip jungiamojo audinio dariniai, nedideli inkapsuliuoti abscesai bei cistos (9 pav. B). Didžiausių darinių buvo 15,8 proc. (19/120; 95 % PI 9,3–22,3), jie apibūdinti kaip pūliniai bei seroziniu skysčiu užpildytos cistos (9 pav. C).
A
A
B
2 lentelė. Darinių suskirstymas į grupes pagal dydį
*daugiausia aptikta vidutinio dydžio darinių (5–20 mm skersmens) lyginant su mažo (≤5 mm) ir didelio (≥21 mm)
skersmens dariniais.
9 pav. Galvijų kepenyse aptikti skirtingo dydžio dariniai: 4 mm skersmens jungiamojo audinio
darinys (A) (mėginio Nr. BOV-19-134); 8 mm skersmens jungiamojo audinio darinys (B) (mėginio Nr. BOV-19-288); 25 mm skersmens abscesas (C) (mėginio Nr. BOV-19-327)
3.2. Sudėtinės PGR rezultatai
10 pav. Elektroforezės reakcija agaro gelyje. Mėginiais pripildytos gelio duobutės (A) tyrimo pradžioje
ir reakcija agaro gelyje 35 min. (B) nuo tyrimo pradžios. Tamsiai mėlyna linija (B) nurodo DNR fragmentų judėjimą
Darinių skersmuo n proc. 95 % PI
Sudėtinės PGR analizės metodu buvo ištirti 120 galvijų kepenų darinių. Pradžioje, iš kiekvieno darinio mėginio buvo išskirta DNR. Padauginus genetinę medžiagą PGR metodu, atlikta elektroforezės reakcija ir vertinti agaro gelyje gauti rezultatai (10 pav.). Visi PGR tyrimai atlikti sėkmingai, juose intensyviai išryškėjo teigiama kontrolė (E. multilocularis). Atlikus sudėtinę PGR, teigiami mėginiai agaro gelyje išryškėjo skirtingos raiškos reakcijomis (11 pav.). Jos suskirstytos į tris grupes: mažo, vidutinio ir didelio ryškumo reakcijas. Visos jos laikytos teigiamomis.
11 pav
. Sudėtinės PGR rezultatai, gauti tiriant galvijų kepenyse aptiktų darinių DNR. Mažos (A),vidutinės (B) ir didelės (C,3) raiškos reakcijos agaro gelyje. M juosta-kopėtėlės, vaizduojančios žymenų DNR dydį. Visose panelėse (1, 2, 3) patvirtinta Taenia spp. DNR,
kurios molekulinis dydis yra 268 bp
Užsikrėtę Taenia spp. metacestodais buvo 2,81 proc. tirtų galvijų (35/1247; 95 % PI 1,9–3,7).
E. multilocularis buvo užsikrėtęs vienas galvijas ir sudarė 0,08 proc. tiriamųjų grupėje (1/1247; 95 %
PI -0,1–0,2). Užsikrėtusiųjų E. granulosus nenustatyta (0/1247) (3 lentelė). 3 lentelė. Galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais
*Galvijų užsikrėtusių Taenia spp. metacestodais buvo daugiau nei užsikrėtusių echinokokozėmis.
n teig. / n proc. 95 % PI
Neužsikrėtę galvijai 1211/1247 97,11 96,2–98,0
Užsikrėtę Taenia spp. 35/1247 2,81* 1,9–3,7
Užsikrėtę E. mulilocularis 1/1247 0,08 -0,1–0,2
3.2.1. Morfologinio ir sudėtinės PGR tyrimų rezultatų palyginimas
Daugiausiai sudėtine PGR patvirtintų Taenia spp. darinių buvo nuo 20 mm skersmens, kurie sudarė 42,1 proc. (95 % PI 15,2–58,5) nuo visų tokio dydžio kepenyse aptiktų darinių, p>0,05. Dažniausiai Taenia metacestodai buvo cistos pavidalo ir sudarė 58,3 proc. (95 % PI 30,4–86,2) nuo visų kepenyse aptiktų cistų, p>0,05. Tenijų morfologinio identifikavimo duomenys neturėjo įtakos molekulinio tyrimo rezultatams. PGR patvirtintas E. multilocularis metacestodas priminė abscesą ir sudarė 10 proc.(1/10; 95 % PI -8,6–28,6) nuo visų pūlinga mase užpildytų darinių, p>0,05. Jo skersmuo buvo 45 mm ir sudarė 5,3 proc. tiriamųjų grupėje (1/19; 95 % PI -4,8–15,3) (4 lentelė). Atlikus
E. multilocularis morfologinio ir PGR tyrimų palyginimo statistinę analizę, darinio skersmuo turėjo
statistinės reikšmės nustatant galvijų užsikrėtimą AE, p<0,05.
4 lentelė. Taenia spp. ir E. multilocularis identifikavimas morfologiniu ir sudėtinės PGR tyrimais
*Daugiausia PGR patvirtintų Taenia spp. darinių buvo ≥21 mm skersmens lyginant su mažesnio skersmens metacestodais, p>0,05.
**PGR patvirtintų Taenia spp. cistų pasitaikė dažniau nei abscesų ir jungiamojo audinio darinių, p>0,05.
3.2.2. Skirtingos lyties, amžiaus ir produkcijos tipo galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais.
Patinų užsikrėtusių Teania spp. lervomis (15/401; 3,74 proc.; 95 % PI 1,88–5,59) buvo daugiau nei patelių (20/846; 2,36 proc.; 95 % PI 1,34–3,39), tačiau skirtumas nebuvo ženklus (p>0,05). Patelių užsikrėtusių E. multilocularis nebuvo (0,0 proc.), tačiau AE sirgo vienas patinas ir sudarė 0,25 proc. (1/401; 95 % PI -0,24–0,73) tarp tirtų bulių, p>0,05 (12 pav.). Galvijų lytis neturi įtakos užsikrėtimo kaspinuočių metacestodais dažnumui, p>0,05.
12 pav. Skirtingos lyties galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais
E. multilocularis buvo užsikrėtęs iki dvejų metų amžiaus galvijas, kas tiriamųjų grupėje sudarė
0,26 proc. (1/382; 95 % PI -0,25–0,77). Taenia spp. metacestodais dažniausiai buvo užsikrėtę jauniausi, iki dvejų metų amžiaus galvijai (13/382; 3,14 proc.; 95 % PI 1,6–5,2), lyginant su suaugusiais galvijais, tačiau skirtumas nebuvo reikšmingas (p>0,05).
13 pav. Skirtingo amžiaus galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais
Daugiausia užsikrėtusiųjų Taenia spp. buvo pienininiai galvijai (31/930; 3,3 proc.; 95 % PI 2,3– 4,6) lyginant su mėsiniais ir mišrūnais, tačiau skirtumas nebuvo reikšmingas (p>0,05). Galvijas,
-1.0% 0.0% 1.0% 2.0% 3.0% 4.0% 5.0% 6.0%
PATELĖS PATINAI
Užsikrėtimo dažnumas, proc.
užsikrėtęs E. multilocularis, buvo pieninio tipo ir sudarė 0,1 proc. (1/930; 95 % PI -0,1–0,32) (14 pav.) Galvijų produkcijos tipas neturi įtakos užsikrėtimo kaspinuočių metacestodais dažnumui (p>0,05).
14 pav. Skirtingo produkcijos tipo galvijų užsikrėtimo dažnumas 3.2.3. Galvijų užsikrėtimo kaspinuočių metacestodais paplitimas
Skerdykloje „X“ buvo skerdžiami galvijai iš Lietuvos ir importuoti iš kaimyninių Europos šalių. Galvijo kilmės šalis nurodoma pagal tai, kurioje vyko pirmoji gyvūno registracija. Importuotų iš Estijos bei Prancūzijos ir užsikrėtusių Taenia spp. ir E. multilocularis galvijų nebuvo. Didžiausias užsikrėtimas buvo iš Nyderlandų importuotų galvijų ir siekė 14,3 proc. (1/7; 95 % PI -11,63–40,2), p>0,05. Lietuvoje registruotų ir augintų galvijų užsikrėtimo dažnumas (28/892; 3,1 proc.; 95 % PI 1,9–4,3) buvo panašus į iš Latvijos importuotų galvijų (6/226; 2,6 proc.; 95 % PI 0,6–4,8). Užsikrėtęs galvijas E. multilocularis buvo registruotas ir augintas Lietuvoje bei sudarė 0,1 proc. tirtų galvijų grupėje (1/892; 95 % PI -0,1– 0,3) (5 lentelė). Statistinė analizė nereikšminga ir kilmės šalis neturėjo įtakos galvijų užsikrėtimui (p>0,05).
5 lentelė. Iš skirtingų šalių importuotų galvijų užsikrėtimas metacestodais
Valstybė Taenia spp. E. multilocularis
n teig. / n proc. 95 % PI n teig. / n proc. 95 % PI
Estija 0/121 0,0 - 0/121 0,0 -
Latvija 6/226 2,6 0,6–4,8 0/226 0,0 -
Lietuva 28/892 3,1 1,9–4,3 1/892 0,1 -0,1–0,3
Nyderlandai 1/7 14,3* -11,6–40,2 0/7 0,0 -
Prancūzija 0/1 0,0 - 0/1 0,0 -
*Daugiausia užsikrėtę iš Nyderlandų importuoti galvijai lyginant su galvijais iš Latvijos ir Lietuvos, p>0,05.
-2.00% -1.00% 0.00% 1.00% 2.00% 3.00% 4.00% 5.00% 6.00% 7.00%
MĖSINIAI MIŠRŪNAI PIENINIAI
Užsikrėtimo dažnumas, proc.
Tarp Lietuvoje registruotų, augintų ir paskerstų galvijų, užsikrėtusių Taenia spp. buvo 3,1 proc. galvijų. Septyniolikoje Lietuvos rajonų buvo registruotas galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais (15 pav.). Daugiausia užsikrėtusių galvijų buvo Kretingos rajone (1/3; 33,3 proc.; 95 % PI -20,0–86,7). Marijampolėje (3/18; 16,7 proc.; 95 % PI -0,6–33,9) ir Ukmergėje (2/16; 12,5 proc.; 95 % PI -3,7–28,7) taip pat nustatyta daug užsikrėtusių galvijų, palyginus su kitais Lietuvos rajonais, kuriuose užsikrėtimas nesiekė 10 proc., p>0,05 (6 lentelė). E. multilocularis užsikrėtęs galvijas buvo augintas Marijampolėje, užsikrėtimo dažnumas siekė 5,5 proc. (1/18; 95 % PI -5,0–20.6).
6 lentelė. Galvijų užsikrėtimo Taenia spp. metacestodais dažnumas Lietuvos rajonuose
Lietuvos rajonas Taenia spp.
n teig. / n proc. 95 % PI Alytaus r. 1/12 8,3 % -7,3–24,0 Anykščių r. 1/36 2,8 % -2.6–8.1 Jurbarko r. 2/44 4,5 % -1,6–10,7 Kelmės r. 1/17 5,9 % -5,3–17,1 Kretingos r. 1/3 33,3 %* -20,0–86,7 Marijampolės r. 3/18 16,7 % -0,6–33,9 Mažeikių r. 1/14 7,1 % -6,3–20,6 Pagėgių r. 2/50 4,0 % -1,4–9,4 Plungės r. 1/56 1,8 % -1,7–5,3 Šakių r. 1/27 3,7 % -3,4–10,8 Šiaulių r. 1/14 6,7 % -6,3–20,6 Šilutės r. 3/81 3,7 % -0,4–7,8 Skuodo r. 3/39 7,7 % -0,7–16,1 Švenčionių r. 1/31 3,2 % -3,0–9,4 Tauragės r. 3/38 7,9 % -0,7–16,5 Telšių r. 1/57 1,8 % -1,6–5,2 Ukmergės r. 2/16 12,5 % -3,7–28,7
15 pav. Galvijų užsikrėtimas Taenia spp. metacestodais įvairiuose Lietuvos rajonuose (proc.).
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Per visą tyrimo laikotarpį buvo atliktas poskerdiminis tyrimas 1247 galvijams. Galvijai į skerdyklą buvo vežami iš Lietuvos ūkininkų bei iš kaimyninių užsienio šalių. Mėginiai rinkti vidaus organų veterinarinės-sanitarinės ekspertizės taške, atsižvelgiant į kaspinuočių metacestodams būdingą lokalizaciją. E. granulosus metacestodų daugiausia aptinkama kepenyse (39 proc.) ir plaučiuose (39 proc.), taip pat galimas cistų augimas blužnyje (6,2 proc.) ir inkstuose (1,5 proc.). Hidatinės cistos dažniausiai randamos viename organe (86,9 proc.), tačiau pasitaiko daugelio organų invazija
E. granulosus lervomis (14,1 proc.) (71). Visgi, tyrimo metu plaučiuose pakitimų nenustatyta, o
kepenyse buvo aptikta 120 neaiškios kilmės darinių. Tipiškų echinokokinių pūslių nebuvo.
Taenia saginata metacestodai dažniausiai aptinkami skersaruožiuose raumenyse, o kepenyse jų
aptinkama vos 1,4 proc. (72). Galvijų skeleto ir kramtomuosius raumenis tyrė skerdyklos darbuotojai, apie galvijų užsikrėtimą cisticerkoze prieinamos informacijos nebuvo. Nors tikrasis galvijų cisticerkozės paplitimas Lietuvoje nėra žinomas, ULAC duomenimis ši zoonotinė parazitozė pasitaiko itin retai. Kitose Europos šalyse cisticerkozės paplitimas taip pat nėra didelis – Prancūzijoje 2010 metais siekė 1,23 proc., o Danijoje 2006–2010 metais buvo 0,04 proc. (73, 74).
Duomenų apie galvijų užsikrėtimą plonakakle cisticerkoze yra mažai. Parazitozė nėra zoonozė, retai sukelianti klinikinius požymius arba produkcijos mažėjimą užsikrėtusiems galvijams. Poskerdiminio tyrimo metu tipiškai atrodančių plonakaklių cisticerkų galvijų vidaus organuose nebuvo aptikta. Atlikto tyrimo 2010 metais Tanzanijoje metu nustatytas parazitozės paplitimas tarp galvijų siekė 0,0 proc. (75).
Tyrimo metu nustatytas galvijų užsikrėtimas Taenia spp. (2,81 proc.), tačiau nežinoma, kokiomis konkrečiomis tenijų rūšimis galvijai buvo užsikrėtę. Galvijų užsikrėtimas E. multilocularis siekė 0,08 proc. Vienam galvijui nustatytas daugiarūšinis užsikrėtimas Taenia spp. bei E. multilocularis lervomis. Užsikrėtusių E. granulosus nebuvo.
Nustatyta, kad užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais buvo didesnis patinų (3,7 proc.) nei patelių (2,4 proc.), tačiau skirtumas nebuvo ženklus. Kitų autorių tyrimų duomenimis rezultatai buvo panašūs ir patinų užsikrėtimas cisticerkoze buvo beveik du kartus didesnis nei patelių (78, 79). Visgi, daugiausia nustatomas didesnis patelių užsikrėtimas, kuris siejamas su ilgesne patelių gyvenimo trukme bei skirtingu laikymo bei šėrimo būdu (53, 80). Nustatyta, jog patelės dažniau ir ilgesniais periodais ganomos pievose nei patinai, tai didina užsikrėtimo tikimybę (81).
Užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais dažniau diagnozuojamas vyresniems galvijams. Teigiama koreliacija tarp didėjančio amžiaus ir užsikrėtimo dažnumo siejama su didesniais šansais gyvenimo eigoje užsikrėsti parazitoze bei galimybe užsikrėsti iš skirtingų užsikrėtimo šaltinių (53, 82). Vyresnių galvijų, nuo ketverių–penkerių metų amžiaus, organizme aptinkamos skirtingo išsivystymo laipsnio cistos, kas siejama su pakartotiniu užsikrėtimu ir metacestodų kumuliacija (14, 81). Visgi, mūsų atlikto tyrimo duomenys skirtingi, ir stebimas didžiausias užsikrėtimo dažnumas galvijams iki dvejų metų amžiaus (3,4 proc.; 95 % PI 1,6–5,2).
Šio tyrimo metu daugiausiai ištyrėme pieninio tipo paskerstų galvijų. Sudėtinės PGR pagalba nustatėme, kad pieniniai galvijai Taenia spp. metacestodais buvo užsikrėtę dažniausiai (3,3 proc.; 95 % PI 2,3–4,6). Priklausomai nuo galvijų produkcijos paskirties, jų laikymo būdas, šėrimas ir gyvenimo trukmė gali skirtis. Pieniniai galvijai įprastai gyvena ilgiau nei mėsiniai ar mišrūnai, tai didina tikimybę užsikrėsti kaspinuočių metacestodais (56). Vasaros periodu pieninio tipo galvijai dažniau ganomi ganyklose, kurios gali būti užkrėstos kaspinuočių kiaušinėliais. Tai itin atsispindini ekologiniuose pieno ūkiuose Danijoje, kai galvijai bent penkis mėnesius metuose privalo būti išleidžiami ganytis po šešias valandas per dieną. Todėl galvijų auginimas pieno produkcijai yra įvardijamas kaip rizikos veiksnys užsikrėsti cisticerkoze (53, 81).
veterinarijos inspektorių apklausą, 10,4 proc. respondentų tvirtino nors kartą buvo aptikę galvijų užsikrėtimą cisticerkoze (83).
Lietuvoje 2001–2006 metais ištyrus rudąsias lapes bei usūrinius šunis, nustatytas endeminis
E. multilocularis paplitimas tarp šių gyvūnų (58,7 proc. rudųjų lapių bei 8,2 proc. usūrinių šunų
užsikrėtimas), ir aplinka yra užkrėsta šio kaspinuočio kiaušinėliais (84). Mūsų tyrimo metu, ištyrus nebūdingus E. multilocularis tarpinius šeimininkus – galvijus, nustatytas 0,08 proc. (1/1247; 95 % PI -0,1–0,2) galvijų užsikrėtimas E. multilocularis metacestodais. Visgi, E. multilocularis teigiama reakcija agaro gelyje buvo mažos raiškos, todėl rezultatą reiktų interpretuoti atsargiai.
Skerdykloje „X“ skerdžiami iš visų Lietuvos rajonų vežami galvijai. Tiriamų galvijų skaičius iš atskirų rajonų buvo netolygus. Didžiausias užsikrėtimas Taenia spp. nustatytas Kretingos rajone (33,3 proc.), tačiau iš šio rajono ištirti tik 3 galvijai, kas sudarė labai menką imtį ir galėjo iškreipti užsikrėtimo rezultatus. Galvijų užsikrėtimas kaspinuočių metacestodais registruotas septyniolikoje Lietuvos rajonų, didžiausias paplitimas buvo vakarinėje Lietuvos dalyje augintų galvijų.
IŠVADOS
1. Atliktas detalusis morfologinis tyrimas galvijų kepenyse aptiktiems dariniams. Dėl netipiškos metacestodų morfologijos ir degeneracijos identifikuoti kaspinuočių metacestodus buvo neįmanoma.
2. Pritaikius sudėtinę PGR nustatytas galvijų užsikrėtimas Taenia spp. (2,81 proc.; 95 % PI 1,9–3,7) bei E. multilocularis (0,08 proc.; 95 % PI -0,1–0,2) metacestodais. Vienam galvijui nustatytas
daugiarūšinis užsikrėtimas Taenia spp. bei E. multilocularis metacestodais.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Abuseir S, Kühne M, Schnieder T, Klein G, Epe C. Evaluation of a serological method for the detection of Taenia saginata cysticercosis using serum and meat juice samples. Parasitol Res. 2007;101(1):131–7.
2. Trachsel D, Deplazes P, Mathis A. Identification of taeniid eggs in the faeces from carnivores based on multiplex PCR using targets in mitochondrial DNA. Parasitology. 2007;134(6):911–20.
3. Bružinskaite R, Šarkunas M, Torgerson PR, Mathis A, Deplazes P. Echinococcosis in pigs and intestinal infection with Echinococcus spp. in dogs in southwestern Lithuania. Vet Parasitol. 2009;160(3– 4):237–41.
4. Stanevičius V. E. multilocularis , E. granulosus ir Taeniidae metacestodų diferediferencinis diagnozavimas šernų (Sus scrofa) kepenyse. Veterinarinės parazitologijos rezidentūros studijų baigimasis darbas. 2012.
5. Zhu GQ, Li L, Ohiolei JA, Wu YT, Li WH, Zhang NZ, et al. A multiplex PCR assay for the simultaneous detection of Taenia hydatigena, T. multiceps, T. pisiformis, and Dipylidium caninum infections. BMC Infect Dis. 2019;19(1):1–7.
6. Eckert J, Deplazes P. Biological, Epidemiological, and Clinical Aspects of Echinococcosis, a Zoonosis of Increasing Concern. Clin Microbiol Rev. 2004;17(1):107–35.
7. Higuita NIA, Brunetti E, McCloskey C. Cystic Echinococcosis. Clin Microbiol. 2016;54(3):518–23.
8. Al-Sabi MNS, Kapel CMO. Multiplex PCR identification of Taenia spp. in rodents and carnivores. Parasitol Res. 2011;109(5):1293–8.
9. Laranjo-González M, Devleesschauwer B, Trevisan C, Allepuz A, Sotiraki S, Abraham A, et al. Epidemiology of taeniosis/cysticercosis in Europe, a systematic review: Western Europe. Parasites and Vectors. 2017;10(1):1–14.
10 Alemu S, Kemal J, Muktar Y, Terefe G. Immunological and Molecular Diagnostic Tests for Cestodes and Metacestodes: Review. World Appl Sci J. 2015;33(12):1867–79.
11. Abuseir S, Kühne M, Schnieder T, Klein G, Epe C. Evaluation of a serological method for the detection of Taenia saginata cysticercosis using serum and meat juice samples. Parasitol Res. 2007;101(1):131–7.
13. Nakao M, Lavikainen A, Yanagida T, Ito A. Phylogenetic systematics of the genus
Echinococcus (Cestoda: Taeniidae). Parasitol. 2013;43(12–13):1017–29.
14. Addy F, Alakonya A, Wamae N, Magambo J, Mbae C, Mulinge E, et al. Prevalence and diversity of cystic echinococcosis in livestock in Maasailand, Kenya. Parasitol Res. 2012;111(6):2289–94.
15. Jenkins EJ, Castrodale LJ, de Rosemond SJC, Dixon BR, Elmore SA, Gesy KM, et al. Tradition and Transition: Parasitic Zoonoses of People and Animals in Alaska, Northern Canada, and Greenland. Vol. 82, Advances in Parasitology. Elsevier; 2013. 33–204 p.
16. Thompson RCA. Biology and Systematics of Echinococcus. Vol. 95, Advances in Parasitology. Elsevier Ltd; 2017. 65–109 p.
17. Paredes R, Godoy P, Rodríguez B, García MP, Cabezón C, Cabrera G, et al. Bovine (Bos
taurus) humoral immune response against Echinococcus granulosus and hydatid cyst infertility. Cell
Biochem. 2011;112(1):189–99.
18. Thompson RCA, Lymbery AJ. Let’s not forget the thinkers. Trends Parasitol. 2013;29(12):581–4.
19. Barnes TS, Hinds LA, Jenkins DJ, Bielefeldt-Ohmann H, Lightowlers MW, Coleman GT. Comparative Pathology of Pulmonary Hydatid Cysts in Macropods and Sheep. Comp Pathol. 2011;144(2–3):113–22.
20. Jabbar A, Swiderski Z, Mlocicki D, Beveridge I, Lightowlers MW. The ultrastructure of taeniid cestode oncospheres and localization of host-protective antigens. Parasitology. 2010;137(3):521–35.
21. Jabbar A, Jenkins DJ, Crawford S, Walduck AK, Gauci CG, Lightowlers MW. Oncospheral penetration glands are the source of the EG95 vaccine antigen against cystic hydatid disease. Parasitology. 2011;138(1):89–99.
22. Adinehbeigi K, Radfar MH, Rahmani K. The role of cattle in the epidemiology of
Echinococcus granulosus in Kerman area, southeast of Iran. Comp Clin Path. 2013;22(2):233–8.
23. Riesle S, García MP, Hidalgo C, Galanti N, Saenz L, Paredes R. Bovine IgG subclasses and fertility of Echinococcus granulosus hydatid cysts. Vet Parasitol. 2014;205(1–2):125–33.
24. Rinaldi L, Maurelli MP, Veneziano V, Capuano F, Perugini AG, Cringoli S. The role of cattle in the epidemiology of Echinococcus granulosus in an endemic area of southern Italy. Parasitol Res. 2008;103(1):175–9.
25. Moro P, Schantz PM. Echinococcosis: a review. Infect Dis. 2009;13(2):125–33.
27. Parkinson J, Wasmuth JD, Salinas G, Bizarro C V., Sanford C, Berriman M, et al. A Transcriptomic Analysis of Echinococcus granulosus Larval Stages: Implications for Parasite Biology and Host Adaptation. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(11).
28. Stadelmann B, Spiliotis M, Müller J, Scholl S, Müller N, Gottstein B, et al. Echinococcus
multilocularis phosphoglucose isomerase (EmPGI): A glycolytic enzyme involved in metacestode
growth and parasite-host cell interactions. Parasitol. 2010;40(13):1563–74.
29. Aziz A, Zhang W, Li J, Loukas A, McManus DP, Mulvenna J. Proteomic characterisation of
Echinococcus granulosus hydatid cyst fluid from sheep, cattle and humans. Proteomics.
2011;74(9):1560–72.
30. Dakkak A. Echinococcosis/hydatidosis: A severe threat in Mediterranean countries. Vet Parasitol. 2010;174(1–2):2–11.
31. Romig T, Dinkel A, Mackenstedt U. The present situation of echinococcosis in Europe. Parasitol Int. 2006;55:187–91.
32. Sotiraki S, Chaligiannis I. Cystic echinococcosis in Greece. Past and present. Parasite. 2010;17(3):205–10.
33. Cardona GA, Carmena D. A review of the global prevalence, molecular epidemiology and economics of cystic echinococcosis in production animals. Vet Parasitol. 2013;192(1–3):10–32.
34. Abdel Aaty HE, Abdel-Hameed DM, Alam-Eldin YH, El-Shennawy SF, Aminou HA, Makled SS, et al. Molecular genotyping of Echinococcus granulosus in animal and human isolates from Egypt. Acta Trop. 2012;121(2):125–8.
35. Gatti A, Alvarez AR, Araya D, Mancini S, Herrero E, Santillan G, et al. Ovine echinococcosis. I. Immunological diagnosis by enzyme immunoassay. Vet Parasitol. 2007;143(2):112–21.
36. Kebede N. A retrospective survey of bovine hydatidosis in three abattoirs of Amhara National Regional State, northwestern Ethiopia. Trop Anim Health Prod. 2010;42(3):323–5.
37. Battelli G. Echinococcosis: Costs, losses and social consequences of a neglected zoonosis. Vet Res Commun. 2009;33:47–52.
38. Brunetti E, White AC. Cestode Infestations. Hydatid Disease and Cysticercosis. Infect Dis Clin North Am. 2012;26(2):421–35.
39. Conraths FJ, Deplazes P. Echinococcus multilocularis: Epidemiology, surveillance and state-of-the-art diagnostics from a veterinary public health perspective. Vet Parasitol. 2015;213(3–4):149–61.
