DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Crocus sativus L. lapuose ir šakniagumbiuose kaupiamų polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Brigita Marciuškaitė (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS
TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Brigita Marciuškaitė (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Brigita Marciuškaitė (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(data) prof. dr. Liudas Ivanauskas (parašas)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(data) (vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
BRIGITA MARCIUŠKAITĖ
CROCUS SATIVUS L. LAPUOSE IR ŠAKNIAGUMBIUOSE KAUPIAMŲ POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKO IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Vientisųjų studijų programa „Farmacija“, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis „Farmacija“
Darbo vadovas doc. K. Vitkevičius
KAUNAS, 2020
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
CROCUS SATIVUS L. LAPUOSE IR ŠAKNIAGUMBIUOSE KAUPIAMŲ POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas doc. K. Vitkevičius Data
Recenzentas
Data
Darbą atliko Magistrantė
Brigita Marciuškaitė Data
KAUNAS, 2020
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Daržinio kroko charakteristika ... 10
1.2. Daržinio kroko kilmė, paplitimas ... 10
1.3. Bendroji junginių, esančių Crocus L. lapuose ir šakniagumbiuose, apžvalga ... 11
1.4. Fenolinių junginių kiekio apžvalga ... 13
1.5. Daržinio kroko lapuose esančių bioaktyvių junginių farmakologinis aktyvumas ... 14
1.6. Daržinio kroko šakniagumbiuose esančių bioaktyvių junginių farmakologinis aktyvumas ... 17
1.7. Crocus L. lapuose esančių bioaktyvių junginių farmakologinis aktyvumas ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktų paruošimui naudoti reagentai ... 23
2.2. Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktų paruošimui naudota aparatūra ... 23
2.3. Metanolinių Crocus sativus L. ekstraktų paruošimas ... 24
2.4. Bendras fenolinių junginių kiekio, išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin – Ciocalteu metodu...25
2.5. Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu 25 2.6. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu ... 26
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 28
3.1. Fenolinių junginių ekstrahavimo metodo parinkimas ... 28
3.2. Bendro fenolių kiekio, esančio Crocus sativus L. žaliavoje, rezultatai ... 29
3.3. Bendro flavonoidų kiekio, esančio Crocus sativus L. žaliavoje, rezultatai ... 31
3.4. Antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodu Crocus sativus L. žaliavose, rezultatai ... 33
IŠVADOS ... 35
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37
LITERATŪROS SĄRAŠAS... 38
SANTRAUKA
B. Marciuškaitės magistro baigiamasis darbas „Crocus sativus L. lapuose ir šakniagumbiuose kaupiamų polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas“. Mokslinis vadovas doc. K. Vitkevičius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020.
Tyrimo tikslas: nustatyti ir palyginti Daržinio kroko (Crocus sativus L.) lapuose ir šakniagumbiuose kaupiamus flavonoidus ir fenolinius junginius, ir įvertinti jų antiradikalinį aktyvumą.
Uždaviniai: ištirti flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio bei antiradikalinio aktyvumo įvairavimą Daržinio kroko (Crocus sativus L.) lapų ir šakniagumbių mėginiuose.
Tyrimo objektas: Crocus sativus L. lapai ir šakniagumbiai iš Ukrainos, Charkovo, Karazinos;
Ukrainos, Nikolajevo; Ukrainos, Chersono regiono, Liubimovkos.
Tyrimo metodai: bendras flavonoidų bei fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu, spektrofotometriškai.
Pagrindiniai tyrimo rezultatai: bendras flavonoidų kiekis Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių mėginiuose iš skirtingų Ukrainos regionų įvairavo nuo 2,96 ± 0,21 µmol/g iki 32,9 ± 1,97 µmol/g (p<0,05), bendras fenolinių junginių kiekis Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių mėginiuose iš skirtingų Ukrainos regionų įvairavo nuo 3,34 ± 0,07 µmol/g iki 19,08 ± 1,53 µmol/g (p<0,05). Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo reikšmės svyravo nuo 80,5 ± 3,22 μmol/g iki 1362,58 ± 68,13 μmol/g (p<0,05).
Išvados: optimalios ekstrakcijos sąlygos fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatymui:
tirpiklis – 70 % etanolis, ekstrakcijos trukmė – 20 min. Didžiausi flavonoidų kiekiai, bei antiradikalinis aktyvumas nustatytas Daržinio kroko lapų mėginiuose. Nustatyta koreliacija tarp flavonoidų bei fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo (p<0,05).
Praktinės rekomendacijos: atliktų tyrimų rezultatai leido daryti prielaidą, kad augalinė Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių žaliava gali būti renkama ir panaudojama maisto papildų ar vaistų gamyboje, nes Crocus sativus L. žaliavoje yra fenolinių junginių, turinčių teigiamą įtaką žmonių sveikatai.
Raktiniai žodžiai: Daržinis krokas (Crocus sativus L.), fenolinės rūgštys, flavonoidai,
šakniagumbiai, lapai, antiradikalinis aktyvumas.
SUMMARY
B. Marciuškaitė master’s thesis, title "Determination of polyphenolic compounds accumulated in the leaves and tubers of Crocus sativus L. and determination of antiradical activity". Science manager doc. K. Vitkevičius; Department of Analytical and Toxicological Chemistry at the Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2020.
Key words: Crocus sativus L., phenolic acids, flavonoids, corms, leaves, antiradical activity.
The aim of the research: to identify and compare the flavonoids and phenolic compounds accumulated in the leaves and corms of Crocus sativus L. and to evaluate their antiradical activity.
The tasks of the research: to investigate the diversification of flavonoids and phenolic compounds content and antiradical activity in leaf and corm samples of Crocus sativus L.
The object of the research: Crocus sativus L. leaves and corms from Ukraine, Kharkiv, Karazina; Ukraine, Nikolaev; Ukraine, Kherson Oblast, Liubimovka.
The methods of the research: total flavonoids and phenolic compounds were determined spectrophotometrically. Antiradical activity was determined by ABTS radical-cation binding method, spectrophotometrically.
The results of the research: the total amount of flavonoids in the samples of leaves and corms of Crocus sativus L. from different regions of Ukraine varied from 2,96 ± 0,21 µmol/g to 32,9 ± 1,97 µmol/g (p<0,05), the total amount of phenolic compounds Crocus sativus L. in leaf and corm samples from different regions of Ukraine varied from 3,34 ± 0,07 µmol/g to 19,08 ± 1,53 µmol/g (p<0,05). The antiradical activity values of leaves and corms extracts of Crocus sativus L. ranged from 80,5 ± 3,22 μmol/g to 1362,58 ± 68,13 μmol/g (p<0,05).
The conclusion of the research: optimal extraction conditions for the determination of phenolic compounds and flavonoids: solvent – 70 % ethanol, extraction time – 20 min. The highest amounts of flavonoids and antiradical activity were found in the samples of Crocus sativus L. leaves.
There was a correlation between the amount of flavonoids and phenolic compounds and antiradical activity (p<0,05).
Practical recommendations: The results of the studies suggested that the plant material of Crocus sativus L. leaves and tubers can be collected and used in the production of food supplements or medicines, as Crocus sativus L. material contains phenolic compounds that have a positive effect on human health.
Keywords: Crocus sativus L., phenolic acids, flavonoids, tubers, leaves, antiradical activity.
PADĖKA
Dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui už
konsultacijas ir praktinius patarimus. Taip pat noriu padėkoti analizinės ir toksikologinės chemijos
katedros lektoriui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant tyrimus.
SANTRUMPOS
ABTS (2,2-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties radikalas) DPPH (gebėjimas apsaugoti ląsteles nuo laisvųjų radikalų pažaidos) GRE (galo rūgšties ekvivalentas)
MIC (minimali slopinamoji koncentracija) p (reikšmingumo lygmuo)
RE (rutino ekvivalentas)
ŽIV (žmogaus imunodeficito virusas)
ĮVADAS
Antikos laikais žmonės plačiai naudojo šafraną, kaip prieskonį, maistinį dažą, o tradicinėje medicinoje šio augalo piestelėmis buvo gydoma nemiga, menstruacinės, kepenų, virškinimo ligos.
Prieskonis buvo naudojamas kaip stimuliantas, antidepresantas ar afrodiziakas [1]. Daržinio kroko piestelės, dėl jose esančių biologiškai aktyvių komponentų, yra vertinamos ir šiomis dienomis. Yra atlikta daug mokslinių tyrimų, įrodančių, jog Crocus sativus L. stigmos ir žiedlapiai kaupia daug biologiškai aktyvių medžiagų, tokių kaip fenolio rūgštys, flavonoidai, izoflavonoidai, todėl šis augalas yra plačiai naudojamas uždegiminėms, širdies, kepenų ligoms gydyti, taip pat depresijai ar diabetui.
Norint gauti 1 kg šafrano, net 1500 kg Crocus sativus L. lapų yra išmetami kaip nenaudingi, tačiau Daržinio kroko lapuose taip pat yra biologiškai aktyvių antioksidantų ir flavonoidų, kuriuos būtų galima panaudoti farmacijos pramonėje, gaminant maisto papildus ar kosmetikos gaminius [2]. Šių žaliavų panaudojimas sumažintų augalinių medžiagų eikvojimą ir turėtų pridėtinės vertės sveikatos gerinime [3].
Darbo naujumas: iki 2020 metų Lietuvoje nebuvo atlikti spektrofotometriniai tyrimai,
kuriuose būtų nustatinėjami Crocus sativus L. lapuose ir šakniagumbiuose kaupiamų polifenolinių
junginių kiekiai ir antiradikalinis aktyvumas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti ir palyginti Daržinio kroko (Crocus sativus L.) lapuose ir šakniagumbiuose kaupiamus flavonoidus ir fenolinius junginius, ir įvertinti jų antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Pasirinkti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas skirtingų junginių išskyrimui iš tiriamosios Daržinių krokų (Crocus sativus L.) lapų ir šakniagumbių augalinės žaliavos;
2. Atlikti kokybinę flavonoidų ir fenolinių junginių analizę Daržinių krokų (Crocus sativus L.) lapų ir šakniagumbių ekstraktuose, taikant spektrofotometriją;
3. Atlikti kiekybinę flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio analizę Daržinių krokų (Crocus sativus L.) lapų ir šakniagumbių ekstraktuose;
4. Įvertinti Daržinių krokų (Crocus sativus L.) lapų ir šakniagumbių ekstraktuose esančių junginių antiradikalinį aktyvumą;
5. Palyginti Daržinių krokų (Crocus sativus L.) lapų ir šakniagumbių ekstraktų skirtingų junginių
kiekybinę sudėtį.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Daržinio kroko charakteristika
Daržinis krokas (Crocus sativus L.) – dar žinomas kaip šafranas, daugiametis augalas be stiebų, žolinis geofitas, priklauso Iridaceae šeimai. Daržinis krokas pasižymi šešiais alyvinės ar violetinės spalvos žiedlapiais, trimis kuokeliais ir trejomis raudonai oranžinėmis purkomis. Gėlės žiedas – masyvus, o stiebas – baltas ir liaunas, kylantis iš svogūnėlio, kurį dengia plonas rudas apvalkalas, šaknys baltos. Daržinio kroko lapai yra linijiški, aukščiau esantys lapai šviesiai žalios spalvos, o žemiau esantys lapai – tamsiai žalios spalvos. Ryškaus žiedo viduryje matomos didelės, ryškiai oranžinės spalvos purkos, maisto pramonėje žinomos kaip šafranas, pasižymintis aromatingu kvapu ir šiek tiek karčiu skoniu [4,5].
1 pav. Daržinis krokas (Crocus sativus L.) [41]
1.2. Daržinio kroko kilmė, paplitimas
Crocus L. gentis, kuri apima maždaug apie 80 rūšių, labiausiai paplitusi Viduržemio jūros
zonoje ir Azijos pietryčiuose [6]. Geografinis šafrano paplitimas Irane apima Chorasano provinciją
(Genatą, Birjandą ir Gonabadą), Jazdą, Kermaną, Guilaną ir Mazandaraną [5]. Italijoje kultivuojamos
vienos vertingiausių šafrano rūšių visoje Europoje – Sardinijoje, Abrucoje ir Toskanoje. Itališkas
šafranas, kultivuojamas Sicilijoje ir vadinamas „Sicilijos raudonuoju auksu“ [7]. Daržinis krokas yra
plačiai kultivuojamas Irane, Azerbaidžane, Indijoje, Maroke, Graikijoje ir Ispanijoje. Taip pat yra ir
mažesnių privačių kompanijų ar ūkininkų, turinčių mažus Daržinio kroko kultivacijos plotus Italijoje,
Prancūzijoje, Argentinoje, Naujojoje Zelandijoje, Jungtinėje Karalystėje ir Vengrijoje [8].
1.3. Bendroji junginių, esančių Crocus L. lapuose ir šakniagumbiuose, apžvalga
Lyginant Crocus sativus L. lapus ir žiedlapius, 2018 metų tyrime nustatyta, jog lapuose yra didesnis procentas drėgmės, baltymų, lipidų ir angliavandenių, nei Daržinio kroko žieduose, taip pat lapai pasižymėjo didesniu antioksidaciniu aktyvumu. Nustatyta, jog net 55,4 % lapo sudaro mineralinis elementas – natris. Lapų sudėtyje taip pat rasta kalcio, kalio, geležies bei cinko. Kiekius bei palyginimą su žiedlapiais galima matyti apačioje esančioje diagramoje [9].
2 pav. Mineraliniai elementai, esantys Crocus sativus L. lapų sudėtyje
3 pav. Mineraliniai elementai, esantys Crocus sativus L. žiedlapių sudėtyje
13.85 55.4
20.15
985.59
20.59 0
200 400 600 800 1000 1200
Ca Na K Fe Zn
(mg/kg)
Mineraliniai elementai, esantys Crocus sativus L. lapų sudėtyje
39.25 45.85
23.75
149.5
47.23
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ca Na K Fe Zn
(mg/kg)
Mineraliniai elementai, esantys Crocus sativus L. žiedlapių sudėtyje
Crocus sativus L. šakniagumbiuose polifenolių koncentracija yra labai maža, tačiau atlikus skysčių chromatografiją ir masių spektometriją, buvo nustatytos šios fenolinės rūgštys [10]:
p-kumaro rūgštis;
ferulo rūgštis;
kofeino rūgštis;
cinamono rūgštis;
galo rūgštis;
p-hidroksibenzoinė rūgštis;
gentino rūgštis;
salicilo rūgštis;
sinapo rūgštis;
katecholis;
vanilinas.
Taikant šiluminę desorbciją, Crocus sativus L. šakniagumbiuose nustatytos [11]:
linoleno;
linolio;
oleino;
palmitino;
palmitoleino;
ursolio;
stigmasterolio;
kampesterolio;
β-sitosterolio rūgštys.
Informacijos apie fenolines karboksirūgštis Crocus L. šakniagumbiuose nėra, o apie kroko lapuose esančias fenolines karboksirūgštis informacijos nėra daug. Crocus sativus L. šakniagumbių ekstrakte, petroleterio frakcijoje, buvo nustatyti n-tridekanas, n-tetradekanas, n-pentadekanas, n- heptadekanas, n-katanas ir dietiltoluamidas. Heksadekanoinė ir oktadekadienoinė rūgštys buvo pagrindinės nustatytos sudedamosios dalys, sudariusios atitinkamai 33,32 % ir 27,55 % visų sudedamųjų medžiagų, rastų Crocus sativus L. šakniagumbių ekstrakte, petroleterio frakcijoje [12]. Taip pat Crocus sativus L. šakniagumbiuose buvo rasta [13]:
cistino;
serino;
glicino;
prolino;
metionino;
valino;
leucino;
feinilalanino;
asparto r.;
glutamo r..
Crocus alatavicus L. šakniagumbiuose buvo rasta katechinų, pasižyminčių stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, taip pat pektinų, protopektinų, saponinų ir askorbo rūgšties, o lapuose – p-kumaro, p-hidroksibenzoinės, ferulo, cinamono, kofeino, galo, vanilino ir chlorogeninės rūgščių [14].
Dažniausiai pasitaikantys junginiai Crocus L. augaluose – kemferolis ir kvercetinas, kurie iš 49 tirtų rūšių buvo nustatyti net 38 Crocus L. rūšyse. Crocus aureus L., Crocus candidus L., Crocus olivieri L.
ir Crocus stellaris L. lapuose taip pat buvo rasta miricetino, priklausančio polifenolinių junginių flavonoidų klasei, pasižyminčio antioksidacinėmis savybėmis. Crocus chrysanthus L., Crocus corsicus L. ir Crocus minimus L. lapuose buvo rasta 6-hidroflavonų. Crocus chrysanthus L. – 6-hidroksiliuteolin- 7-gliukozidas, skutelarin-7-gliukozidas; Crocus corsicus L. – 6-hidroksiliuteolin-7-metileterio-6- gliukozidas, skutelarin-7-metileterio-6-gliukozidas, Crocus minimus L. – 6-hidroksiliuteolin-7- metileterio-6-gliukozidas, 6-hidroksiliuteolin-7-ramnosilgliukozidas, skutelarin-7-metileterio-6- gliukozidas [15].
1.4. Fenolinių junginių kiekio apžvalga
2011 metų tyrimo metu, iš skirtingų pasaulio šalių surinktų Daržinio kroko mėginių, buvo identifikuoti 8 flavonoidai, iš kurių 2 buvo nustatyti pirmą kartą – kemferol-8-C-gliuko-6,3-O- digliukozidas ir kemferol-8-C-gliuko-6-O-gliukozė, nustatyta, jog didžiausias kiekis fenolinių junginių buvo rastas Crocus sativus L. lapų ekstraktuose iš Ispanijos, Kastilos-La Mančos regiono, Albaceto provincijoje, San Pedro mieste – čia bendras polifenolių kiekis sudarė 17 %. Bendri fenolinių junginių kiekiai visuose analizuotuose ekstraktuose iš skirtingų pasaulio šalių buvo vidutiniškai 8,55–9,49 % [2].
Įtaką bendram fenolinių junginių kiekiui turi ne vien augimvietės vieta, tačiau ir skirtingos auginimo
sąlygos, derliaus nuėmimo laikas ar pačios augalinės žaliavos paruošimo laikas.
1.5. Daržinio kroko lapuose esančių bioaktyvių junginių farmakologinis aktyvumas
2018 metais atliktame tyrime buvo nustatyta, jog Crocus sativus L. lapų ekstrakte esančios veikliosios medžiagos pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš bakterijų Listeria rūšį. Tyrime naudotas 80 % metanolinis Crocus sativus L. lapų ekstraktas [9]. Taip pat nustatyta, jog naftos eterio Crocus sativus L. lapų ekstraktas pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš S. aureus rūšį, o etanolinis lapų ekstraktas pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš M. luteus rūšį [16].
Liofilizuoti Crocus sativus L. šakniagumbio žievės ir šakniagumbio be žievės ekstraktai pasižymi priešgrybelinėmis savybėmis, naudojant juos po 100 mg/ml, esant 0,7 %, 2,3 %, 3,9 % ir 5,4 % koncentracijoms. Mažiausia koncentracija, slopinanti Aspergillus niger grybą, po 30 dienų, gydant šakniagumbio žieve, buvo 5,4 %, Bipolaris spicifera, Fusarium oxysporum, Penicillium raistriicki grybus mažiausia slopinanti koncentracija buvo – 3,9 %, Rhizopus nigricans – 2,3 %. Šakniagumbio be žievės mažiausia koncentracija, slopinanti Fusarium oxysporum, Penicillium raistriicki grybus – 7,0 %, Rhizopus nigricans – 3,9 %, o Aspergillus niger ir Bipolaris spicifera grybams mažiausia slopinanti koncentracija nebuvo nustatyta [17].
Metanoliniai Daržinio kroko ekstraktų komponentai pasižymi radikaliniu aktyvumu, todėl siūloma Crocus sativus L. ekstraktus panaudoti kosmetiniuose produktuose gydant su amžiumi susijusius sutrikimus arba maisto papilduose [18]. Laisvaisiais radikalais domimasi dėl jų cheminio nestabilumo. Tai yra atomas arba molekulė, kurie prarado arba įgijo elektroną. Dėl šios savybės, šios medžiagos yra labai reaktyvios ir dalyvauja reakcijose su ląstele, daro joms žalą. Laisvieji radikalai tapo dažnai vartojamais terminais dabartinėse diskusijose apie ligos mechanizmus ir yra laikomi viena iš audinių senėjimo priežasčių, ypač kalbant apie odos raukšlių atsiradimą. Taip pat yra manoma, jog laisvieji deguonies radikalai, kurie sukelia oksidacinį stresą, yra pagrindiniai įvairių degeneracinių ligų, tokių kaip vėžys, aterosklerozė ar skrandžio opa, veiksniai [19].
Flavonoidai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, galinčiomis užkirsti kelią ląstelių sienelės lipidų oksidacinį skaidymą ir padidinti organizmo antioksidacinį pajėgumą [20]. Crocus sativus L.
metanolinis 80 % lapų ekstraktas pasižymi aukštesniu antioksidaciniu aktyvumu, nei Crocus sativus L.
metanolinis žiedlapių ekstraktas. Taip pat metanolinis 80 % lapų ekstraktas savo antioksidaciniu
pajėgumu buvo panašus į α-tokoferolį. Pusė maksimalios slopinamosios koncentracijos buvo pasiekta,
esant 12,5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml ir 200 µg/ml. [21,22]. Taip pat nustatyta, jog etanolinis
Crocus sativus L. šakniagumbių ekstraktas [etanolio koncentracija nenurodyta] pasižymi didesniu
antioksidaciniu poveikiu, nei tos pačios koncentracijos etanoliniai Crocus sativus L. sausų ir šviežių lapų
ekstraktai. Šakniagumbio ekstrakto maksimali slopinamoji koncentracija – 244 µg/ml. Taip pat įrodyta
ekstraktų priklausomybė tarp ekstraktų koncentracijos ir DPPH (gebėjimas apsaugoti ląsteles nuo
laisvųjų radikalų pažaidos). Tyrime naudotos ekstraktų koncentracijos: 125 µg/ml, 250 µg/ml ir 500 µg/ml [23]. Galo rūgštis, esanti Crocus sativus L. šakniagumbių sudėtyje, pasižymi antioksidaciniu, antimikrobiniu ir radikalus šalinančiu poveikiu, tai galėjo turėti įtakos didesniam Crocus sativus L.
šakniagumbių antioksidaciniam poveikiui [24].
75 % etanolinis naftos frakcijos ir dichlormetano frakcijos Crocus sativus L. šakniagumbių ekstraktas veikia kaip antidepresantas, esant 150 mg/kg, 300 mg/kg ir 600 mg/kg dozėms [12].
Etanolinis 70 % Crocus sativus L. lapų ekstraktas pasižymi ląstelių augimą slopinančiu poveikiu. Caco-2 ląstelių proliferacija buvo slopinama, esant 0,42 mg/ml dozei [25].
Naringeninas, esantis Crocus sativus L. lapuose, taip pat pasižymi sveikatai naudingomis savybėmis. Tyrimai parodė, jog 20 mg/kg ir 40 mg/kg dozės naringenino galimai efektyviai pakeičia visus kepenų ir inkstų serologinius, audinių, biocheminius ir histologinius rodiklius, todėl naringeninas gali būti naudingas mažinant arba gydant sunkius kepenų ir inkstų pažeidimus, kuriuos sukelia antituberkulioziniai vaistai, tokie kaip izoniazidas, rifampicinas, pirazinamidas ir etambutolis [26]. Taip pat įrodyta, jog naringeninas mažina aterosklerozę, jei yra laikomasi dietos, kai nevartojama maisto produktų, turinčių cholesterolio [27].
4 pav. Naringenino cheminė struktūra
Orientinas, kuris taip pat randamas Crocus sativus L. lapuose, pasižymi antioksidacinėmis ir
senėjimą lėtinančiomis savybėmis. Antioksidacines savybes lemia gebėjimas atiduoti elektronus ir
sumažinti ląstelių mirtingumą, kuris įvyksta dėl makromolekulių oksidacijos. Orientinu aštuonias
savaites gydomų pelių katalazės, glutationo peroksidazės ir superoksido dismutazės serume, smegenyse,
kepenyse ir inkstuose kiekis padidėjo, o malondialdehido (oksidacinio streso biomarkerio) ir lipofuscino
(amžiaus pigmento) lygis kepenyse, inkstuose ir smegenyse reikšmingai sumažėjo. Taip pat nustatyta,
jog orientinas pasižymi kraujagysles plečiančiu ir širdį apsaugančiu poveikiu, padidindamas endogeninį
antioksidazės aktyvumą ir sumažindamas deguonies laisvųjų radikalų susidarymą, slopindamas kreatino
fosfokinazės ir pieno rūgšties dehidrogenazės aktyvumą serume, taip pat padidindamas superoksido
dismutazės aktyvumą ūmaus miokardo infarkto metu sergantiems šunims, kartu sumažindamas miokardo infarkto dydį [28].
5 pav. Orientino cheminė struktūra
1 lentelė. Crocus sativus L. lapuose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai
Crocus L. dalis Lapai
Crocus L. rūšis Crocus sativus L.
Biologiškai aktyvūs junginiai
Sofor aflavo nolos idas [ k emf erol - 3 -O -β -D -so forozida s Kemf erol -8 -С -β -D - gli kopi ran oz il -6,3 -di -О -β -D - gli ukopirano zida s Kemf erol -8 -С -β -D - gli kopi ran os il -6 -O -β -D - gli ukopirano zida s Orientina s [liuteolin -8 -C -β -D - gli ukopirano zida s] Narin genina s
Šaltinis
Smol skaite et a l., 2011 Smol skaite et a l., 2011; Sánchez - Vioque et a l. , 2016 Smol skaite et a l., 2011; Sánchez - Vioque et a l. , 2016 Smol skaite et a l., 2011 Baba et al., 2015a, 2015b
1.6. Daržinio kroko šakniagumbiuose esančių bioaktyvių junginių farmakologinis aktyvumas
P-kumaro rūgštis randama daugelyje vaisių ir daržovių, taip pat ją galima rasti Crocus baytopiorum L. lapuose ir Crocus sativus L. šakniagumbiuose. Nustatyta, jog p-kumaro rūgštis turi du baktericidinio aktyvumo mechanizmus – ardo bakterijų ląstelių membranas, taip pat jungiasi prie bakterijų DNR genomo, slopina ląstelių funkcijas, galiausiai sukelia ląstelių mirtį. P-kumaro rūgštis buvo panaudota prieš gramteigiamas (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) ir gramneigiamas (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium) bakterijas.
Stipriausias poveikis nustatytas prieš S. dysenteriae. P-kumaro rūgšties MIC vertė buvo 10 mg/ml S.
dysenteriae atveju [29]. Taip pat nustatyta, jog diabetinių žiurkių gydymas tulžies ir p-kumaro rūgštimi sumažino diabetinių žiurkių gliukozės koncentraciją, smegenų oksidacinį stresą ir uždegimą. Rezultatai parodė, kad galo ir p-kumaro rūgštis gali slopinti hipokampo neurodegeneraciją, nes pasižymi stipriu antioksidaciniu, priešuždegiminiu ir antiapoptotiniu poveikiais [30]. Be to, galo rūgštį taip pat kaupia Crocus sativus L. šakniagumbiai.
6 pav. P-kumaro rūgšties cheminė struktūra
7 pav. Galo rūgšties cheminė struktūra
Krocetinas, esantis Crocus sativus L. šakniagumbiuose, pasižymi ne tik ankstesniuose
tyrimuose įrodytu antioksidaciniu ir antikoaguliaciniu poveikiais, tačiau ir stipriai slopina kraujagyslių
endotelio uždegimą [31].
8 pav. Krocetino cheminė struktūra
Galo ir kofeino rūgštys, kurios taip pat randamos Crocus sativus L. šakniagumbiuose, pasižymi antistafilokokiniu veikimu. Nustatyta, jog šios rūgštys veikia Staphylococcus aureus – gramteigiamus patogenus, galinčius sudaryti bioplėveles, pasižyminčias ryškesniu atsparumu antibiotikams ir dezinfekavimo priemonėms. Šių rūgščių antimikrobinis poveikis prieš S. aureus buvo įrodytas su planktoninėmis ląstelėmis ir ląstelėmis bioplėvelėse [32]. Taip pat nustatytas sinergistinis šių rūgščių poveikis, stiprinantis antibiotikų poveikį. Kofeino rūgštis ir norfloksacinas pasižymėjo sinergistiniu poveikiu ir MIC prieš Staphylococcus aureus sumažino nuo 156.3 µg/ml iki 15.5 µg/ml. Prieš Escherichia coli pasižymėjo sinergistiniu poveikiu su imipenemu ir sumažino MIC nuo 2500 µg/ml iki 1574 µg/ml. O prieš Pseudomonas aeruginosa kofeino rūgštis pasižymėjo sinergistiniu poveikiu su dviem antibiotikais – gentamicinu (sumažino MIC nuo 625 µg/ml iki 24.61 µg/ml) ir imipenemu (sumažino MIC nuo 1250 µg/ml iki 78.13 µg/ml). Galo rūgštis pasižymėjo sinergistiniu poveikiu taip pat su dviem antibiotikais – gentamicinu (sumažino MIC nuo 49.21 µg/ml iki 2.44 µg/ml) ir norfloksacinu (sumažino MIC nuo 156.3 µg/ml iki 49.21 µg/ml), tačiau tik prieš Staphylococcus aureus [33].
9 pav. Kofeino rūgšties cheminė struktūra
Stigmasterolis yra dažnai augaluose randamas sterolis, kuris taip pat randamas ir Crocus sativus
L. šakniagumbiuose. Nustatyta, jog šis sterolis pasižymi antinociceptiniu poveikiu, kitaip tariant,
neleidžia sensoriniams neuronams atlikti skausmą sukeliančio dirgiklio [34].
10 pav. Stigmasterolio cheminė struktūra
Nustatyta, jog gentisino rūgštis, kaupiama Crocus sativus L. šakniagumbiuose, skatina keratinocitų proliferaciją, kuri yra reikšminga odos žaizdų gijimui [35].
11 pav. Gentisino rūgšties cheminė struktūra
2 lentelė. Crocus L. šakniagumbiuose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai
Biologiškai aktyvūs junginiai
Augalinė žaliava
Crocus L.
rūšis Šaltinis
Krocetinas
Šakniagumbiai C. sativus
Zhou et al., 2011; Baba et al., 2015a, 2015b
Kofeino rūgštis
Esmaeili et al., 2011 Cinamono rūgštis
Ferulo rūgštis
Sinopo rūgštis Baba et al., 2015a, 2015b
Galo rūgštis
Esmaeili et al., 2011 p-hidroksibenzoinė
rūgštis p-kumaro rūgštis
Siringinė rūgštis
Gentisino rūgštis Salicilo rūgštis
β-sitosterolis
Masuda et al., 2012 Stigmasterolis
Kampesterolis Katecholis
Esmaeili et al., 2011 Vanilinas
1.7. Crocus L. lapuose esančių bioaktyvių junginių farmakologinis aktyvumas
Antioksidantas kemferolis, esantis C. speciosus, C. aureus, C. candidus, C. olivieri, C. stellaris ir C. baytopiorum lapų sudėtyje [15,36], sumažina vėžio ląstelių atsparumą vaistams nuo vėžio, tokių kaip vinblastinas ar paklitakselis, taip pat slopina kolagenazės, elastazės ir hialuronidazės fermentus, kurie ardo tarpląstelinę matricą ir taip greitina odos senėjimą. Taip pat nustatyta, jog kemferolis ir jo glikozidai sukelia ląstelių mirtį daugelyje vėžio ląstelių linijų, gautų iš skirtingų audinių, sinergiškai sustiprina cisplatinos poveikį slopindamas OVCAR-3 vėžio ląstelių dauginimąsi [37].
Mangiferinas, esantis Crocus stellaris L. ir Crocus aureus L. lapų augalinėje žaliavoje, yra žinomas antioksidantas, pasižymintis antivirusiniu, antidiabetiniu, priešvėžiniu, antioksidaciniu, imunomoduliaciniu, hepatoprotekciniu bei analgeziniu poveikiais. Įrodyta, jog mangiferinas pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš gramteigiamas (t. y. Bacillus pumilus) ir gramneigiamas (t. y. Salmonella agona) bakterijas. Taip pat apsaugo nuo kenksmingo Enterococci ir Mycobacterium tuberculosis poveikio. Nustatytas ir priešgrybelinis mangiferino poveikis prieš Trichoderma reesei, Aspergillus flavus ir Thermoascus aurantiacus grybus. Mangiferiną galima vartoti kaip prevencinę priemonę arba gydant oksidacinius pažeidimus neuronuose, širdies raumenyje, inkstuose ir kepenyse, susijusius su laisvaisiais radikalais, taip pat periodonto ligas, tokias kaip gingvitą ar periodontitą. Taip pat nustatyta, jog mangiferinas slopina ŽIV-1 proteazę ir yra veiksmingas prieš Herpes simplex virusą (HSV-1) [38].
Įrodyta, jog mangiferinas moduliuoja gliukozės metabolizmą, mažindamas gliukozės kiekį kraujyje, taip
pat gerina atsparumą insulinui, mažina cholesterolio sintezę ir slopina auglio nekrozės α faktoriaus
ekspresiją, taip pat indukuojama azoto oksido sintazė [39].
12 pav. Mangiferino cheminė struktūra
3 lentelė. Crocus L. lapuose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai
Biologiškai aktyvūs
junginiai Augalinė žaliava Crocus L. rūšis Šaltinis
Mangiferinas
Lapai
C. aureus Bate-Smith, 1968;
Harborne and Williams, 1984 C. stellaris
Kemferolis (3,5,7,4′- tetrahidroksiflavonas)
C. speciosus
Harborne and Williams, 1984 C. aureus
C. candidus C. olivieri C. stellaris
C. baytopiorum Acar et al., 2010
Soforaflavonolosidas kemferol-3-O-β-D-
soforozidas
C. etruscus
Harborne and Williams, 1984 C. korolkowii
C. laevigatus C. versicolor Kemferol-7-O-β-D-
soforozidas C. aureus
Kvercetinas
C. aureus C. corsicus C. etruscus C. korolkowii
C. laevigatus
C. minimus C. versicolor
C. baytopiorum Acar et al., 2010 C. alatavicus Satybaldiyeva et al.,
2015
Miricetinas
C. aureus
Bate-Smith, 1968;
Harborne and Williams, 1984 C. candidus
C. olivieri C. stellaris Viteksinas (apigenin-8-C-β-
D-gliukopiranozidas) C. minimus Harborne and
Williams, 1984 Naringeninas
Akacetinas C. laevigatus
Liuteolinas
C. nevadensis
Harborne and Williams, 1984; Bate-
Smith, 1968 C. corsicus
Harborne and Williams, 1984 C. minimus
6-hidroksiliuteolin-7-О-β-D-
gliukopiranozidas C. chrysanthus
6-hidroksiliuteolin-7-O-β-D- gliukopiranozil-O-α-L-
ramnopiranozidas
C. minimus 6-hidroksiliuteolin-7-
metilesterio-6-O-β-D-
gliukopiranozidas C. minimus,
C. corsicus Skutelarein-7-O-metileterio-
6-O-β-D-gliukopiranozidas Skutelarein-7-O-β-D-
gliukopiranozidas C. chrysanthus
Tricinas
C. korolkowii Bate-Smith, 1968 C. graveolens
Bate-Smith, 1968;
Harborne and Williams, 1984 C. hyemalis
C. heuffelianus Skoparin-О-ramnosil-7-O-β-
D-gliukopiranozidas C. reticulatus Harborne and
Williams, 1984 p-kumaro rūgštis
C. baytopiorum Acar et al., 2010
Rozmarino rūgštis
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktų paruošimui naudoti reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., “Acros organics”);
Rutino reagentas (97,11 proc., “Hwi analytik gmbh”);
Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė);
Aliuminio chloridas (99,99 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Ledinė acto rūgštis (99,5 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Heksametilentetraminas (≥99,9 proc., Roth, Vokietija);
Vario (II) chlorido dihidratas (Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe, Vokietija));
Neokuproinas (Sigma-Aldrich, Vokietija);
Troloksonas (98 proc., FlukaChemika, Buchs, Šveicarija):
Amonio acetatas (Sigma-Aldrich, Belgija);
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV).
2.2. Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktų paruošimui naudota aparatūra
Augalinė žaliava sverta elektroninėmis svarstyklėmis ,,Sartorius AG“ (Götingen, Vokietija).
Augalinė žaliava smulkinta, naudojant buitinį smulkintuvą BOSCH MKM6003 (Gerlingen, Vokietija).
Ekstrakcijai ultragarsu, naudota ultragarso vonelė Biosonic UC100 Ultrasonic Cleaner Set WUC-A06H (Witeg, Wertheim), Bandiniams tirti buvo naudotos 1 cm skersmens kiuvetės. (Vokietija).
Spektrofotometriniams tyrimams – bendro flavonoidų kiekio, fenolinių junginių kiekio bei
antioksidantinio aktyvumo ABTS metodu nustatymams buvo naudojamas spektrofotometras Halo DB
– 20 UV – Vis (Dynamica GmbH, Šveicarija).
4 lentelė. Tyrimo metu naudota žaliava
Crocus sativus L. bandiniai Crocus sativus L.
žaliava Žaliavos masė: Tūris:
1 Karazina, Charkovas, 2019 m.
balandis
Crocus sativus L.
šakniagumbis 0,1075 g 5 ml
2 Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis
Crocus sativus L.
lapai 0,1029 g 5 ml
3 Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis
Crocus sativus L.
šakniagumbis 0,1021 g 5 ml
4 Karazina, Charkovas, 2019 m.
kovas
Crocus sativus L.
lapai 1,0097 g 10 ml
5 Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2019 m. gruodis
Crocus sativus L.
lapai 1,0053 g 10 ml
6 Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2018 m. gruodis
Crocus sativus L.
šakniagumbis 1,0004 g 10 ml
2.3. Metanolinių Crocus sativus L. ekstraktų paruošimas
Visi mėginiai buvo užpilti 70 % metanoliu ir laikyti ultragarso vonelėje 20 minučių. Tuomet mėginiai iki kolbučių žymės (1, 2 ir 3 bandiniams buvo naudotos 5 ml kolbutės, o 4, 5 ir 6 bandiniams buvo naudotos 10 ml kolbutės) buvo praskiesti metanoliu ir perfiltruoti mikrofiltrais.
13 pav. Tyrime naudoti Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktai
2.4. Bendras fenolinių junginių kiekio, išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin – Ciocalteu metodu
Tyrimams buvo naudojamas darbinis reagentas – 7 % natrio karbonato tirpalas. Jis gaunamas tirpinant 17,5 g natrio karbonato 250 ml distiliuoto vandens. Analizei buvo paimta 1 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, kuris buvo sumaišytas su 1 ml Folin – Ciocalteu reagento ir 9 ml distiliuoto vandens. Pirmojo mėginio analizei buvo paimta 2 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, o 2, 4 ir 5 metanoliniai ekstraktai buvo skiedžiami santykiu 1:10, 10 ml kolbutėje. Po 5 min.
įpilta 10 ml 7 % natrio karbonato tirpalo ir praskiesta iki 25 ml. Gautas mišinys buvo sumaišytas ir paliktas 90 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Po inkubacinio laikotarpio spektrofotometru buvo matuojama tirpalo absorbcija 750 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai buvo kartojami tris kartus.
Lyginamas tirpalas buvo ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje Daržinio kroko augalinės žaliavos ekstrakto buvo pilama 1 ml distiliuoto vandens.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai buvo ruošiami taip, kaip tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 1 ml ekstrakto, buvo imta 1 ml žinomos koncentracijos galo rūgšties tirpalas. Naudojant galo rūgšties 70 % metanolinį tirpalą, paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2,0 mg/ml ir 2,5 mg/ml.
Gauti duomenys buvo vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
y = 0,9068x + 0,0617;
𝑅
2= 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
2.5. Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu
Tyrimui buvo gaminamas reagentas iš 4 ml, 96 % etanolio, 0,2 ml, 33 % ledinės acto rūgšties, 0,8 ml, 5 % heksametilentetramino (5 g medžiagos buvo tirpinami 100 ml distiliuoto vandens), 0,6 ml, 10% aliuminio chlorido (10 g aliuminio chlorido miltelių buvo tirpinami 100 ml distiliuoto vandens) ir 0,2 ml vaistinės augalinės žaliavo ekstrakto. Gautas mišinys buvo sumaišytas ir paliktas stovėti 30 min.
kambario temperatūroje, tamsoje.
Lyginamasis tirpalas buvo gaminamas lygiai taip pat, tik vietoje vaistinės augalinės žaliavos
ekstrakto buvo naudojamas 70 % etanolis.
Praėjus 30 min. inkubaciniam laikotarpiui, buvo atliekami matavimai su spektrofotometru prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai buvo kartojami tris kartus.
Buvo paruošti penkių skirtingų koncentracijų rutino tirpalai: 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml ir 1,0 mg/ml.
Duomenys buvo įvertinti pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
y = 0,9465x – 0,0950;
𝑅
2= 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
Rezultatai išreikšti mikrogramais, galo rūgšties ekvivalentu (GRE) mg/ml ekstrakto.
2.6. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu
Pirmiausia buvo gaminamas 2 mmol/l ABTS•+ motininis tirpalas. 0,0548 g ABTS (2,2'-azino- bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninės) rūgšties) miltelių buvo ištirpinti 50 ml tamsaus stiklo išgrynintojo vandens buteliuke. Į gautą tirpalą buvo įdėta 0,0095 g K
2S
2O
8. Pagamintas ABTS motininis tirpalas buvo laikomas 16 val. tamsoje, kol vyko oksidacijos-redukcijos reakcija, kurios metu susidarė ABTS
•+. Susidaręs radikalas-katijonas išlieka stabilus 2 paras, laikant kambario temperatūroje, tamsioje vietoje.
Darbinis ABTS
•+tirpalas gaminamas motininį tirpalą skiedžiant išgrynintuoju vandeniu, kol, esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03. ABTS yra mėlynai žalias radikalinis katijonas (ABTS
•+), kuris sugeria šviesą.
ABTS
•+reaguoja beveik į visus antioksidantus. Galima analizuoti tiek hidrofilinius, tiek lipofilinius junginius, nes šis radikalas yra tirpus ir vandenyje, ir organiniuose tirpikliuose. Šiuo metodu tyrimai gali būti atliekami ir grynam natūraliam junginiui, ir sudėtingam mišiniui. Regimosios šviesos spektre, spalvotam radikalui, charakteringi absorbcijos maksimumai esant 417, 650, 734 nm bangos ilgiams [40].
Mėginio paruošimas: 10 µl Crocus sativus L. etanolinės ištraukos buvo sumaišyta su 3 ml darbinio ABTS•+ tirpalo. Mėginys buvo laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru buvo išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis.
Lyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.
Kalibravimo grafikas sudarytas, naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus:
y = 0,00003x – 0,00360;
R² = 0,9714;
y = absorbcijos dydis;
x = antioksidacinis aktyvumas.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Gautų duomenų analizė buvo atlikta programinėmis įrangomis: „New Microsoft Excel
Worksheet 2016“ (Microsoft, JAV), „SPSS 20“ (IBM, JAV). Gauti duomenys buvo apskaičiuoti pagal
formules, tuomet suvesti į duomenų bazę ir statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų
duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį ir santykinį standartinį nuokrypį. Statistiškai
reikšmingas skirtumas nustatytas, kai p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Fenolinių junginių ekstrahavimo metodo parinkimas
Atliekamas ekstrahento koncentracijos tyrimas, kuriame naudojami vandens ir įvairių koncentracijų metanolio ir etanolio mišiniai. Spektrofotometriškai nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis galo rūgšties ekvivalentais Folin-Ciocalteu metodu.
Daugiausia fenolinių junginių ekstrahuota 70 proc. metanoliu (39,8 ± 1,63 mg/g), mažiausiai - distiliuotu vandeniu ir 40 proc. etanoliu, atitinkamai 19,3 ± 1,02 mg/g ir 31,2 ± 1,11 mg/g (p<0.05).
Literatūros šaltiniuose minimi dažniausiai naudojami tirpikliai: alkoholiai (etanolis, metanolis), acetonas, dietileteris ir etilacetatas, tačiau šiuose grynuose organiniuose tirpikliuose nevisiškai išsiekstrahuoja fenolinės rūgštys (hidroksibenzenkarboksirūgštys ir hidroksicinamono rūgštys). Todėl ekstrakcijai naudojamas alkoholio – vandens mišinys. Daržinio kroko šakniagumbių ir lapų ekstraktai dažniausiai gaminami su vandens, metanolio ir etanolio mišiniais. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, nustatytas tinkamiausias ekstrahentas – 70 proc. metanolis, kuris naudojamas tolimesniuose tyrimo etapuose. Nėra vienintelio standartinio fenolinių junginių išgavimo būdo, todėl fenolinių junginių ekstrakcijai gali būti naudojami įvairūs metodai: skysčių – skysčių ekstrakcija, kietafazė ekstrakcija, soksleto ekstrakcija, superkritinė skysčių ekstrakcija, purtymu, mikrobangomis, mechaniniu maišymu paremta ekstrakcija. Šiame tyrime pasirinkta mechaniniu purtymu ir ultragarsu paremta ekstrakcija, skirtingu laiko intervalu. Folin-Ciocalteu metodu spektrofotometriškai nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis galo rūgšties ekvivalentais.
14 pav. Ekstrakcijoje naudojami vandens ir skirtingos koncentracijos vandens – etanolio, vandens – metanolio mišiniai
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Vanduo 40 % etanolis 60 % metano 70 % etanolis 70 % metanolis 96,3 % etanolis
Bendras fenolinių junginių kiekis mg/g
Vandens, vandens – etanolio, vandens – metanolio mišiniai
Remiantis gautais rezultatais nustatyta, jog vykdant ekstrakciją ultragarso vonele, gaunami didesni fenolinių junginių kiekiai, lyginant su mechanine purtykle. Nustatytas didžiausias fenolinių junginių kiekis, vykdant ekstrakciją ultragarso vonele, kuri truko 20 min (34,31 ± 0,83 mg/g) (p<0.05). Atsižvelgiant į eksperimentinio tyrimo gautus rezultatus, pasirenkamas 70 proc. metanolio tirpiklis, bei vaistinės augalinės žaliavos (Daržinio kroko šakniagumbių ir lapų) ekstrakcija ultragarso vonelėje, trukmė – 20 min.
15 pav.
Fenolinių junginių kiekis (mg/g) skirtingais laiko intervalais, ekstrakciją vykdant skirtingais būdais3.2. Bendro fenolių kiekio, esančio Crocus sativus L. žaliavoje, rezultatai
Bendrieji fenolinių junginių kiekiai buvo išreikšti GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml. Pirmojo bandinio – 0,213 mg/ml, antrojo – 0,381 mg/ml, trečiojo – 0,39 mg/ml, ketvirtojo – 0,416 mg/ml, penktojo – 0,419 mg/ml, šeštojo – 0,334 mg/ml. Tuomet gauti rezultatai buvo perskaičiuoti į µmol/g. Pirmojo bandinio – 9,91 ± 0,69 µmol/g, antrojo – 18,51 ± 1,67 µmol/g, trečiojo – 19,08 ± 1,53 µmol/g, ketvirtojo – 4,12 ± 0,21 µmol/g, penktojo – 4,17 ± 0,33 µmol/g, šeštojo – 3,34 ± 0,07 µmol/g.
23.78 25.12 26.54 27.32
25.34
32.38
34.81
26.97
0 5 10 15 20 25 30 35 40
10 min 15 min 20 min 40 min
Fenolinių junginių kiekis, mg/g
Laikas, min
Mechaninė purtyklė Ultragarso vonelė
16 pav.
Bendras fenolinių junginių kiekis (
mol/g) Crocus sativus L. šakniagumbių mėginiuose17 pav.
Bendras fenolinių junginių kiekis (
mol/g) Crocus sativus L. lapų mėginiuoseGauti rezultatai rodo, jog 2018 – 2019 metų Crocus sativus L. rinktų lapų ir šakniagumbių ekstraktuose fenolinių junginių kiekis svyravo nuo 3,34 ± 0,07 µmol/g iki 19,08 ± 1,53 µmol/g (p<0,05). Didžiausias fenolinių junginių kiekis Crocus sativus L. lapuose nustatytas žaliavoje, rinktoje
9.91
19.08
3.34
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
Karazina, Charkovas, 2019 m., balandis
Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2018 m., gruodis
Fenolinių junginių kiekis mol/g
Crocus sativus L. šakniagumbių mėginiai
4.12
18.51
4.17
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
Karazina, Charkovas, 2019 m., kovas Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2019 m., gruodis
Fenolinių junginių kiekis mol/g
Crocus sativus L. lapų mėginiai
Ukrainoje, Nikolajeve, 2018 m. spalio mėnesį – 18,51 ± 1,67 µmol/g. Mažiausias fenolinių junginių kiekis Crocus sativus L. lapuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Charkove, 2019 metais, balandžio mėnesį – 4,12 ± 0,21 µmol/g, tačiau žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Chersono regione, Liubimovkoje, fenolinių junginių kiekis beveik nesiskiria – 4,17 ± 0,33 µmol/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis Crocus sativus L. šakniagumbiuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Nikolajeve, 2018 metų spalio mėnesį – 19,08 ± 1,53 µmol/g ir tai yra didžiausias fenolinių junginių kiekis, nustatytas ištyrus visas turėtas žaliavas. Mažiausias fenolinių junginių kiekis Crocus sativus L. šakniagumbiuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Chersono regione, Liubimovkoje, 2018 metų gruodį – 3,34 ± 0,07 µmol/g ir tai yra mažiausias fenolinių junginių kiekis, nustatytas ištyrus visas turėtas žaliavas.
3.3. Bendro flavonoidų kiekio, esančio Crocus sativus L. žaliavoje, rezultatai
Bendrieji flavonoidų kiekiai buvo išreikšti RE (rutino ekvivalentu) mg/ml. Pirmojo bandinio – 0,115 mg/ml, antrojo – 0,677 mg/ml, trečiojo – 0,237 mg/ml, ketvirtojo – 1,072 mg/ml, penktojo – 1,408 mg/ml, šeštojo – 0,296 mg/ml. Tuomet gauti rezultatai buvo perskaičiuoti į µmol/g. Pirmojo bandinio – 5,35 ± 0,54 µmol/g, antrojo – 32,9 ± 1,98 µmol/g, trečiojo – 11,61 ± 0,58 µmol/g, ketvirtojo – 10,62 ± 0,42 µmol/g, penktojo – 14,01 ± 0,7 µmol/g, šeštojo – 2,96 ± 0,21 µmol/g.
18 pav.
Bendras flavonoidų kiekis (
mol/g) Crocus sativus L. šakniagumbių mėginiuose5.35
11.61
2.96
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
Karazina, Charkovas, 2019 m., balandis
Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2018 m., gruodis
Flavonoidų kiekis mol/g
Crocus sativus L. šakniagumbių mėginiai
19 pav.
Bendras flavonoidų kiekis (
mol/g) Crocus sativus L. lapų mėginiuoseNustačius fenolinius junginius, toje pačioje augalinėje žaliavoje buvo nustatytas ir bendras flavonoidų kiekis. Gauti rezultatai rodo, jog 2018 – 2019 metų Crocus sativus L. rinktų lapų ir šakniagumbių ekstraktuose flavonoidų kiekis svyravo nuo 2,96 ± 0,21 µmol/g iki 32,9 ± 1,97 µmol/g (p<0,05). Didžiausias flavonoidų kiekis Crocus sativus L. lapuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Nikolajeve, 2018 m. spalio mėnesį – 32,9 ± 1,97 µmol/g ir tai yra didžiausias flavonoidų kiekis, nustatytas ištyrus visas turėtas žaliavas. Mažiausias flavonoidų kiekis Crocus sativus L. lapuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Charkove, 2019 metais, balandžio mėnesį – 10,62 ± 0,42 µmol/g. Didžiausias flavonoidų kiekis Crocus sativus L. šakniagumbiuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Nikolajeve, 2018 metų spalio mėnesį – 11,61 ± 0,58 µmol/g. Mažiausias flavonoidų kiekis Crocus sativus L. šakniagumbiuose nustatytas žaliavoje, rinktoje Ukrainoje, Chersono regione, Liubimovkoje, 2018 metų gruodį – 2,96 ± 0,21 µmol/g ir tai yra mažiausias flavonoidų kiekis, nustatytas ištyrus visas turėtas žaliavas. Bendras flavonoidų kiekio lapuose nustatytas didesnis, nei Daržinio kroko šakniagumbiuose.
10.62
32.90
14.01
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
Karazina, Charkovas, 2019 m., kovas Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2019 m., gruodis
Flavonoidų kiekis mol/g
Crocus sativus L. lapų mėginiai
3.4. Antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodu Crocus sativus L.
žaliavose, rezultatai
Įvertintas 2018 – 2019 metų Crocus sativus L. lapų ir šakniagumbių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas, spektrofotometriniu metodu. Rezultatai perskaičiuoti į µmol/g. Pirmojo bandinio – 284,65 ± 17,08 µmol/g, antrojo – 1362,58 ± 68,13 µmol/g, trečiojo – 116,88 ± 5,84 µmol/g, ketvirtojo – 150,08 ± 4,5 µmol/g, penktojo – 150,4 ± 12,03 µmol/g, šeštojo – 80,5 ± 3,22 µmol/g.
20 pav.
Antiradikalinis aktyvumas (
mol/g) Crocus sativus L. šakniagumbių mėginiuose21 pav.
Antiradikalinis aktyvumas (
mol/g) Crocus sativus L. lapų mėginiuose284.65
116.88
80.50
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00
Karazina, Charkovas, 2019 m., balandis
Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2018 m., gruodis
Antiradikalinis aktyvumas, mol/g
Crocus sativus L. šakniagumbių mėginiai
150.08
1362.58
150.40
0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 1600.00
Karazina, Charkovas, 2019 m., kovas Nikolajevas, Ukraina, 2018 m., spalis Chersono regionas, Ukraina, Liubimovka, 2019 m., gruodis
Antiradikalinis aktyvumas, mol/g
Crocus sativus L. lapų mėginiai
