DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei antioksidacinio aktyvumo įvertinimas bičių pienelyje ir maisto papilduose“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Vygintė Valutytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Vygintė Valutytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Palma Nenortienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-12 Palma Nenortienė
(aprobacijos data ) (vadovo (-ės) vardas, pavardė) (parašas)
2020-05-12 Liudas Ivanauskas
(aprobacijos data ) (katedros vedėjo (-os) vardas, pavardė)) (parašas)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
VYGINTĖ VALUTYTĖ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR FLAVONOIDŲ KIEKIO BEI ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS BIČIŲ
PIENELYJE IR MAISTO PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Lekt. dr. Palma Nenortienė
KAUNAS, 2020
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR FLAVONOIDŲ KIEKIO BEI ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS BIČIŲ
PIENELYJE IR MAISTO PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Palma Nenortienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Data Vygintė Valutytė
Data
KAUNAS, 2020
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Bičių pienelio apibūdinimas ... 10
1.2 Bičių pienelio išgavimas ... 11
1.3 Bičių pienelio fizikinės savybės ir laikymo sąlygos ... 11
1.4 Bičių pienelio cheminė sudėtis ... 12
1.5 Bičių pienelio biologinis aktyvumas ... 14
1.6 Bičių pienelio vartojimas ... 15
1.7 Fenolinių junginių apžvalga ... 15
1.8 Flavonoidų apžvalga ... 17
1.9 Fenolinių junginių ir flavonoidų bendrojo kiekio nustatymo metodai ... 18
1.10 Laisvieji radikalai ir antioksidacinis aktyvumas ... 19
1.11 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1 Tyrimo objektas ... 22
2.2 Naudoti reagentai ... 23
2.3 Naudota aparatūra ir prietaisai ... 23
2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 24
2.5 Bičių pienelio ir jo maisto papildų spektrofotometrinė analizė ... 24
2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 24
2.5.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
2.5.3 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu ... 26
2.5.4 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS radikalų - katijonų surišimo metodu ... 27
2.6 Statistinė duomenų analizė ... 28
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1 Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 29
3.1.1 Ekstrakcijos metodo parinkimas ... 29
3.1.2 Ekstrahento parinkimas ... 30
3.2 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas bičių pienelio ir jo papildų ekstraktuose
spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu ... 31 3.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas bičių pienelio ir jo papildų ekstraktuose
spektrofotometriniu metodu ... 33 3.4 Bičių pienelio ir jo maisto papildų mėginių antioksidantinio aktyvumo įvertinimas pagal DPPH radikalų surišimo metodą... 34 3.5 ABTS antioksidantinio aktyvumo įvairavimas bičių pienelio ir jo maisto papildų mėginiuose .. 36 3.6 Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei
antioksidacinio aktyvumo bičių pienelio žaliavose ir maisto papilduose ... 37
3.7 Bičių pienelio žaliavų ir maisto papildų polifenolinių junginių kiekinės sudėties palyginimas .. 38
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43
SANTRAUKA
V. Valutytės magistro baigiamasis darbas ,,Fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei antioksidacinio aktyvumo įvertinimas bičių pienelyje ir jo maisto papilduose“. Darbo vadovas lekt. dr.
P. Nenortienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020.
Raktiniai žodžiai: bičių pienelis, fenoliniai junginiai, flavonoidai, antioksidacinis aktyvumas, DPPH, ABTS, spektrofotometrija.
Tyrimo tikslas: Įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą bičių pienelyje ir jo maisto papilduose.
Tyrimo uždaviniai: Spektrofotometriniu metodu įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bičių pienelio ir jo maisto papildų ekstraktuose; nustatyti biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą DPPH ir ABTS spektrofotometriniais metodais bičių pienelio ir jo maisto papildų ekstraktuose; įvertinti bičių pienelio žaliavų ir maisto papildų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius; įvertinti fenolinių junginių kiekinės sudėties skirtumus tarp bičių pienelio žaliavos ir maisto papildų.
Tyrimo objektas ir metodai: Bičių pienelio žaliava ir jo maisto papildai (n=6). Bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniais ABTS ir DPPH metodais.
Rezultatai ir išvados: Didžiausias fenolinių junginių (4,22±0,144 GRE mg/g) bei flavonoidų (1,68±0,113 RE mg/g) kiekis nustatytas bičių pienelyje, surinktame Keižonyse. Labai panašūs kiekiai gaunami bičių pienelyje, kuris buvo surinktas Aleksote. Didžiausias antiradikalinis aktyvumas DPPH metodu nustatytas Aleksote surinktame bičių pienelyje (4,089±0,043 mg TE/g), o ABTS metodu nustatant, didžiausias antioksidacinis aktyvumas stebimas bičių pienelio, surinkto Keižonyse (5,684±0,367 μmol TE/g), žaliavoje. Įvertinus koreliacinio ryšio stiprumą, galima teigti, kad šaldyto bičių pienelio ir maisto papildų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą labiausiai nulemia juose esantys flavonoidai. Lietuviškame bičių pienelyje fenolinių junginių kiekis didesnis 4–5 kartus negu maisto papilduose, o flavonoidų kiekis didesnis nuo 2,1 iki 5,6 karto, priklausomai nuo maisto papildo.
Praktinės rekomendacijos. Remiantis atliktais spektrofotometriniais tyrimais ir gautais
rezultatais, galima teigti, kad lietuviškas bičių pienelis yra perspektyvi žaliava, kuri gali būti
naudojama preparatuose, skirtuose apsaugoti organizmą nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio.
SUMMARY
Master’s thesis by V. Valutytė, title “Phenolic compounds and flavonoids quantity and antioxidant activity determination in royal jelly and its food supplements”. Scientific Supervisor lect., dr. Palma Nenortienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2020.
Keywords: Royal jelly, phenolic compounds, flavonoids, antioxidant activity, DPPH, ABTS, spectrophotometry.
Aim of the study. To evaluate phenolic compounds and flavonoids quantity and antioxidant activity in royal jelly and its food supplements.
Objective. Utilize a spectrophotometric method to evaluate the qualitative composition of phenolic compounds and flavonoid found in royal jelly and its food supplement extracts; use DPPH and ABTS spectrophotometric methods to determine antioxidant activity of active compounds found in royal jelly and its food supplement extracts; to evaluate the correlation between oxidant activity of raw royal jelly material, phenolic compounds of its food supplements and their extracts; to evaluate the differences of phenolic compound’s quantitative composition between raw royal jelly material and its food supplements.
Object and methods of the study. The raw material of royal jelly and its food supplements (n=6). Total amount of phenolic compounds and flavonoids found using spectrophotometric method.
Antioxidant activity determined by ABTS and DPPH spectrophotometric methods.
Results and conclusions. The largest quantity of phenolic compounds (4,22±0,144 GAE mg/g) and flavonoids (1,68±0,113 RE mg/g) was found in the royal jelly collected in Keižonys. Similar amounts were found in royal jelly from Aleksotas. The largest antiradical activity was determined using DPPH method and it was in the royal jelly (4,089±0,043 mg TE/g) collected in Aleksotas. Utilizing the ABTS method the largest antioxidant activity was observed in the raw royal jelly from Keižonys (5,684±0,367 μmol TE/g). By measuring the strength of correlation we can state that the antioxidant activity in frozen royal jelly and its food supplements is mostly influenced by flavonoids. Lithuanian royal jelly has 4-5 times more phenolic compounds compared to food supplements and 2,1-5,6 times more flavonoids depending on the actual food supplement.
Recommendation. Based on spectrophotometric researches and the obtained data we can
state that Lithuanian royal jelly is a prospective raw material which can be used in medical products
that intend to protect the organism from the negative effects of free radicals.
SANTRUMPOS
10-HDA – 10-hidroksi-2-deceno rūgštis
ABTS – 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonrūgštis) ABTS•
+– ABTS radikalas-katijonas
BP – bičių pienelis
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas GRE – galo rūgšties ekvivalentas LBP – liofilizuotas bičių pienelis MP – maisto papildas
Proc. – procentai
RE – rutino ekvivalentas
RNS – reaktyviosios azoto formos ROS – reaktyviosios deguonies formos TE – trolokso ekvivalentas
V/V – tūrio procentai
ĮVADAS
Pirmieji istoriniai bičių pienelio (angl. Royal Jelly) panaudojimo užrašai datuojami antikinės Graikijos laikotarpiu. Senovės graikų filosofas Aristotelis bičių pienelio ir medaus mišinį naudojo savo mokinių pusryčiams, kad padidintų mokinių fizinę galią ir mąstymo gebėjimus. Taip pat yra žinoma, kad Kleopatra – senovės Egipto grožio etalonas – bičių pienelį naudojo kaip kosmetikos priemonę.
Bičių pienelis, nuo seno naudojamas kinų tradicinėje medicinoje, buvo siejamas su senovės Kinijos dinastijų ilgaamžiškumu [19].
Bičių pienelis yra klampus bičių darbininkių gaminamas sekretas, kitaip dar vadinamas karališkąja žele, labai vertinamas dėl savo unikalios sudėties bei naudingų maistinių, farmakologinių ir biologinių savybių. Bičių pienelis naudojamas kaip dietinis mitybos kompleksas, padedantis kovoti su įvairiomis lėtinėmis ligomis. [26]. Daugelyje šalių bičių pienelis yra plačiai naudojamas tradicinėje medicinoje, o Kinijoje bei Japonijoje šis bičių produktas parduodamas kaip vaistas [23].
Bičių pienelio sudėtyje esantys fenoliniai junginiai suteikia antioksidacinį, antibakterinį ir priešuždegiminį poveikį [44]. Bičių produktai, pasižymintys antioksidaciniu aktyvumu, įgyja vis didesnę svarbą medicinoje ir farmacijoje [11, 28]. Dėl laisvųjų radikalų poveikio organizmui išsivysto labai daug patologinių būklių: diabetas, neurodegeneracinės ligos, lėtinės širdies ir kraujagyslių ligos, vėžys, katarakta, astma, reumatoidinis artritas, uždegimas bei virškinamojo trakto ligos [50]. Todėl aktualu ištirti fenolinių junginių gausa pasižymintį bičių pienelį.
Bičių pienelis, surinktas Kinijoje, Japonijoje, Bulgarijoje yra plačiai išanalizuotas, išnagrinėtos jo savybės, cheminė sudėtis. Su lietuvišku bičių pieneliu atlikta nemažai tyrimų, nagrinėjant 10-HDA, tačiau apie jame sukauptų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį yra labai mažai, tyrimuose naudojamos skirtingos metodikos ir ekstrahentai, todėl sunku palyginti tyrimų rezultatus.
Darbo naujumas. Pirmą kartą Lietuvoje tiriami bičių pienelio maisto papildai, įvertinant fenolinių junginių, flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą. Atliktas ekstrakcijos sąlygų optimizavimas, nustatyti ekstraktų bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai ir antioksidantinis aktyvumas, vertinant antiradikalines ekstraktų savybes spektrofotometriniais metodais.
Praktinė ir teorinė reikšmė. Gauti rezultatai tiriant bičių pienelio žaliavų ekstraktų fenolinių junginių bei flavonoidų kiekį yra neabejotinai naudingi kuriant naujus bičių pienelio preparatus.
Nustatytas bičių pienelio ekstraktų gebėjimas surišti laisvuosius radikalus gali būti naudojamas kuriant preparatus, pasižyminčius antioksidantiniu ir antimikrobiniu poveikiu. Maisto papildų su bičių pieneliu fenolinių junginių ir jų biologinio aktyvumo rezultatai yra naudingi parametrai, vertinant preparatų poveikį bei nustatant maisto papildų žaliavos kokybę.
Darbo tikslas: Įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą
bičių pienelyje ir jo maisto papilduose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą bičių pienelyje ir jo maisto papilduose.
Darbo uždaviniai:
1. Spektrofotometriniu metodu įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bičių pienelio ir jo maisto papildų ekstraktuose.
2. Nustatyti biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą DPPH ir ABTS spektrofotometriniais metodais bičių pienelio ir jo maisto papildų ekstraktuose.
3. Įvertinti bičių pienelio žaliavų ir maisto papildų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.
4. Įvertinti fenolinių junginių kiekinės sudėties skirtumus tarp bičių pienelio žaliavos ir maisto
papildų.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Bičių pienelio apibūdinimas
Bičių pienelis (angl. Royal Jelly) yra natūralus, vienas vertingiausių bičių chemiškai sintetinamų produktų, pasižyminčių maistinėmis, farmakologinėmis ir biologinėmis savybėmis. Tai bičių darbininkių (Apis mellifera) hipofaringinės ir mandibulinės liaukų gaminamas baltos ar gelsvos spalvos grietinės konsistencijos koncentruotas sekretas [37]. Tai pagrindinis bičių darbininkių jaunų lervų ir tranų lervų maistas jų pirmosiomis trimis paromis bei svarbiausias bičių motinėlių maistas per visą jų gyvenimo ciklą. Po pirmųjų trijų parų darbininkių lervos maitinamos bičių pienelio, medaus ir žiedadulkių mišiniu. Baltymas „royalactin“ yra pagrindinis bičių pienelio junginys, kuris lervą morfologiškai paverčia į bitę motinėlę (1 pav.). Šis supermaistas lemia ne tik raidos skirtumus tarp bičių motinėlių ir kitų bičių darbininkių, bet ir yra svarbiausia bičių motinėlės ilgaamžiškumo priežastis [44]. Bitė darbininkė gyvena apie 45 dienas, o bičių motinėlė, maitindamasi bičių pieneliu, gali gyventi iki penkerių metų. Be to, esant palankioms sąlygoms, bičių motinėlė per dieną gali sudėti 2000-3000 kiaušinėlių, prilygstančių jos svoriui, ir per parą atstatyti savo svorį [19]. Palyginus su bičių darbininkių maistu, bičių pienelyje yra mažiau vandens, keliskart daugiau cukraus, baltymų bei skiriasi kai kurių mineralinių druskų koncentracijos [26]. Taigi, bičių pienelis yra ne tik pagrindinis maistas bičių motinėlei, bet ir visų bičių gyvybingumo šaltinis.
1 pav. Bičių pienelio įtaka bičių fenotipui [adaptuota pagal 16]
1.2 Bičių pienelio išgavimas
Bičių pienelis yra labai vertinamas bičių produktas, nes jo išeiga nėra didelė lyginant su kitais bičių produktais bei jo surinkimas yra sudėtingas procesas. Besiruošiančioje spiesti bičių šeimoje iš motininės akutės, pripildytos bičių pieneliu, laikinai išimama motinėlė (2 pav.). Tuomet į motininę akutę įdedama lervutė ir po trijų parų, kai yra didžiausias kiekis pienelio, išlaužomi spietininiai narveliai ir surenkamas bičių pienelis. Norint išgauti didesnį kiekį bičių pienelio, specializuotuose ūkiuose daromos dirbtinės motininės akutės, į kurias perkeliami bičių kiaušinėliai. Po 3 parų, akutės, prisipildžiusios bičių pieneliu, išsiurbiamos ir perfiltruojamos. Tačiau šis procesas nėra begalinis, nes tik pirmų dviejų kartų pienelis yra visavertis. Iš vienos motininės akutės vidutiniškai surenkama tik apie 0,3 g bičių pienelio [12].
2 pav. Bičių motininės akutės, užpildytos bičių pieneliu su bičių motinėlių lervomis viduryje [20]
Bičių pienelio išgaunama nedaug, nes tai sudėtingas procesas, o išeiga nėra didelė. Lietuvoje yra tik keletas bitininkų, iš kurių galima įsigyti šį bičių produktą. Azijos šalyse, ypatingai Kinijoje, specializuotuose ūkiuose, keičiant įvairias sąlygas, išgaunama daugiau bičių pienelio, kuris kaip žaliava tiekiamas į Europą.
1.3 Bičių pienelio fizikinės savybės ir laikymo sąlygos
Šviežias bičių pienelis yra aštraus fenoliui būdingo kvapo ir saldžiai rūgštaus skonio. Bičių pienelis iš dalies tirpus vandenyje, jo klampa kinta priklausomai nuo vandens kiekio ir amžiaus – jis klampėja laikomas kambario temperatūroje arba šaldytuve aukštesnėje kaip 5 °C temperatūroje. Bičių pienelis pasižymi rūgštinėmis savybėmis, pH svyruoja nuo 3,1 iki 4,2, tankis 1,1 g/ml [33, 37].
Bičių pienelis yra nestabilus produktas. Nors nėra duomenų apie laikomo netinkamomis
sąlygomis bičių pienelio biologinio efektyvumo pokyčius, tačiau atsiranda įvairūs fizikinių ir cheminių
savybių pakitimai – padidėja vandenyje netirpių azoto junginių kiekis, bičių pienelis pasidaro klampus, ima tamsėti, skonis tampa kartus. Juslinės savybės yra svarbūs kokybės kriterijai [23]. Laikant bičių pienelį jis dažnai sudaro mažas granules dėl komponentų nusėdimo. Siekiant kuo ilgiau išlaikyti kokybę ir cheminį stabilumą, šviežias bičių pienelis turi būti užšaldomas –18 ºC temperatūroje, gali būti liofilizuojamas arba maišomas nuo 1 iki 2 proc. su medumi tam, kad nevyktų fermentiniai kitimai [11, 38]. Bičių pienelio galiojimo laikas ir laikymo sąlygos nurodytos 1 lentelėje.
1 lentelė. Bičių pienelio galiojimo laikas ir laikymo sąlygos Galiojimo laikas ir laikymo sąlygos Šviežias bičių pienelis 6 mėnesiai, jei laikoma šaldytuve
3–5 ºC temperatūroje
2 metai, jei laikoma šaldiklyje
< –18 ºC Liofilizuotas bičių pienelis 1 metai, jei laikomas šaldytuve
(3–5 ºC)
Mažiausiai 2 metai, jei laikomas šaldiklyje < –18 ºC
Šviežias arba liofilizuotas bičių pienelis meduje
2 metai kambario temperatūroje, jei medaus-bičių pienelio bendra drėgmė yra mažesnė kaip 18 proc.
Atliekant tyrimus su bičių pieneliu labai svarbu žinoti ir laikytis šių nurodymų, kokiomis sąlygomis jis turi būti laikomas, kad neįvyktų negrįžtami cheminiai pakitimai bičių pienelio žaliavoje.
1.4 Bičių pienelio cheminė sudėtis
Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas kinta priklausomai nuo geografinių veiksnių, netoliese augančių augalų nektaro, aplinkos sąlygų, surinkimo laiko bei žaliavos apdorojimo metodų. Cheminiu požiūriu bičių pienelis yra baltymų, cukraus ir lipidų emulsija vandenyje [9, 26, 27, 37]. Bičių pienelis natūraliai yra heterogeniškas produktas [37].
Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad šviežiame bičių pienelyje randama 60–70 proc.
vandens, angliavandenių (7–21 proc.), lipidų (nuo 3 iki 8 proc.) ir baltymų su 22 nepakeičiamomis
amino rūgštimis (9–18 proc.). Taip pat randami nedideli kiekiai fenolinių junginių, flavonoidų,
vitaminų, fitosterolių, karotinų, bei kitų bioaktyvių medžiagų, tokių kaip 10-HDA (10-hidroksideceno
rūgštis), kurios bičių pienelyje randama nuo 1,4 iki 3,39 proc. Bičių pienelis turtingas svarbiomis
mineralinėmis medžiagomis, tokiomis kaip kalis, kalcis, geležis, cinkas, magnis ir varis. Jame taip pat
gausu B grupės vitaminų, ypač niacino, pantoteno rūgšties, riboflavino, piridoksino, biotino, folio
rūgšties, tiamino, nikotino rūgšties. Remiantis šiuolaikine spektrofotometrine analize bičių pienelyje
aptikti maždaug 185 organiniai junginiai. Bičių pienelyje randamos net tokios naudingos
bioaktyviosios medžiagos kaip benzenkarboksirūgštis, obuolių, pieno, citrinų rūgštys, acetilcholinas, adenozinas bei hormonai (testosteronas, progesteronas, prolaktinas, estradiolis) [5, 11, 44, 51]. Šviežio bičių pienelio cheminės sudėties pasiskirstymas pavaizduotas 3 paveiksle.
3 pav. Šviežio bičių pienelio cheminė sudėtis
Liofilizuotas – džiovinamas šalčiu – bičių pienelis patrauklus tuo, kad laikant šaldytuve jį galima ilgiau vartoti. Šviežiame bičių pienelyje didžiąją dalį sudaro vanduo, todėl jis greitai genda.
Liofilizuotas bičių pienelis, lyginant su šviežiu, turi maždaug 3 kartus daugiau bioaktyvių medžiagų.
Vandens jame ne daugiau kaip 5 proc., baltymų 27–41 proc., angliavandenių 21–31 proc., lipidų 8–
19 proc., 10-HDA daugiau kaip 3,5 proc. [11, 30, 38, 49, 51].
Bičių pienelis savo chemine sudėtimi yra unikalus bičių produktas. Mokslinėje literatūroje
aprašomi cheminės sudėties svyravimai priklauso nuo geografinių veiksnių, netoliese augančių augalų
nektaro, aplinkos sąlygų, žaliavos surinkimo laiko bei apdorojimo metodų. Atliekant tyrimus su
skirtingu metu ir skirtingose vietose surenkamu bičių pieneliu, siekiama išsiaiškinti biologiškai aktyvių
junginių įvairavimo ypatumus.
1.5 Bičių pienelio biologinis aktyvumas
Bičių pienelio biologinis aktyvumas labiausiai susijęs su jame randamais riebalais bei polinesočiosiomis riebiosiomis rūgštimis, baltymais, sudarytais iš nepakeičiamųjų aminorūgščių, vitaminais ir fenoliniais junginiais [25, 51]. Atlikti tyrimai su bičių pieneliu įrodo, kad šis bičių produktas gali būti labai įvairiai panaudojamas dėl plataus jo poveikio. Bičių pienelis pasižymi antioksidaciniu, hidroksilo (HO•) bei vandenilio peroksido (H
2O
2) radikalus surišančiu poveikiu, kurį nulemia bičių pienelyje randami fenoliniai junginiai [14, 32, 46]. Atliekant eksperimentus su gyvūnais, pastebėta, kad bičių pienelis pasižymi navikų augimą slopinančiu poveikiu. Tyrime su C6 ląstelių kultūra, išgauta iš žiurkės smegenų auglio, nustatyta, kad lietuviškas bičių pienelis ir 10-HDA turi įtakos vėžinių ląstelių gyvybingumo sumažėjimui [4, 25, 44]. Yra žinoma, kad bičių pienelis pasižymi priešuždegiminiu ir antimikrobiniu poveikiu tiek prieš gramteigiamas, tiek prieš gramneigiamas bakterijas dėl jame randamų peptidų, proteinų bei 10-HDA. Ypač stiprus antibakterinis poveikis nustatytas prieš Bacillus subtilis, Staphylococcus Aureus, Pseudomonas aeruginosa ir Escherichia coli bakterijas [10, 14, 15]. Nustatyta, kad bičių pienelis skatina žaizdų gijimą dėl suaktyvėjusios fibroblastų migracijos ir padidėjusio sfingolipidų kiekio [11, 44]. Tyrimas su žmonėmis, vartojančiais vaistus tuberkuliozei gydyti, parodė, kad bičių pienelis turi hepatoprotekcinį poveikį ir apsaugo nuo oksidacinių kepenų pažeidimų bei pagreitina gydymo eigą [45]. Taip pat ištirtas ir įrodytas stiprinamasis bičių pienelio poveikis imuninei sistemai. Nustatyta, kad imunomoduliacinis veikimas priklauso nuo bičių pienelyje esančių aminorūgščių ir gama globulino, kuris stiprina imuninę sistemą ir padeda įveikti infekcijas [11, 45, 51]. Bičių pienelis turi reikšmingą poveikį mažinant gliukozės kiekį kraujyje dėl sudėtyje esančių į žinduolių insuliną panašių peptidų ir yra efektyvus gydant cukrinį diabetą [11, 52]. Taip pat pastebėta, kad trans-2-okteno rūgštys ir 10-HDA bičių pienelyje yra svarbios antihipertenziniam veikimui ir turi prevencinį bei gydomąjį poveikį adrenalino sukeliamiems aritmijos atvejams [45, 56]. Bičių pienelio sudėtyje esantys fitosteroliai pasižymi cholesterolio kiekį serume mažinančiu veikimu. Tyrimo su pacientais, turinčiais padidėjusį cholesterolio kiekį, metu nustatyta, kad vartojant didelėmis dozėmis bičių pienelį bent dvi savaites, padidėja didelio tankio lipoproteinų ir sumažėja trigliceridų bei mažo tankio lipoproteinų kiekis [35]. Į dietą įtraukus bičių pienelį, pastebėta, kad jis daro įtaką spermatozoidų kokybei, palaiko spermos gyvybingumą, judrumą ir pagerina vaisingumą. Be to, bičių pienelis susijęs su tokių hormonų kaip testosterono, liuteinizuojančio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) aktyvumu [5]. Atlikus tyrimą su žiurkėmis, pastebėta, kad bičių pienelis pagerina pagyvenusių žiurkių erdvinį mokymąsi ir atminties savybes [11].
Eksperimento su gyvūnais metu nustatyta, kad baltymas „royalactin“ ir 10-HDA yra pagrindiniai bičių
pienelio komponentai, kurie atsakingi už gyvenimo trukmės prailgėjimą. „Royalactin“ prailgina
nematodų gyvenimo trukmę 18-34 proc. [18]. Dėl tokios gausos bičių pienelio naudingųjų savybių jis vis plačiau naudojamas alternatyviosios medicinos –apiterapijos – srityje [26].
Remiantis moksline literatūra, atliekama labai daug tyrimų su bičių pieneliu, siekiant ištirti ir plačiai pritaikyti jo gydomąsias savybes. Apibendrinant, galima teigti, kad bičių pienelis dėka plačios savo cheminės sudėties pasižymi labai įvairiu biologiniu aktyvumu.
1.6 Bičių pienelio vartojimas
Bičių pienelis dažniausiai vartojamas intensyviai sportuojant, nusilpus imunitetui arba sergant uždegiminėmis ir lėtinėmis ligomis. Suaugusiam žmogui profilaktinė bičių pienelio paros dozė 50–
200 mg. Gydymo ir profilaktikos tikslais bičių pienelio vartojimo kurso trukmė 2–3 savaitės, kartojant kursą 1–2 kartus per metus. Bičių pienelis geriausiai pasisavinamas sublingvaliniu būdu, laikant po liežuviu iki kol visiškai ištirps ir bus absorbuotas per burnos gleivinę. Šviežią bičių pienelį rekomenduojama vartoti maišant su medumi santykiu 1:100 po arbatinį šaukštelį iki 3 kartų per dieną prieš valgį [11].
Bičių pienelis pripažintas kosmetologijoje dėl odos elastingumą didinančių, jungiamojo audinio aprūpinimą krauju skatinančių, odą stangrinančių, odos sausumą, sudirgimą mažinančių, plaukų bei nagų būklę gerinančių savybių [41].
Bičių pienelis kontraindikuojamas žmonėms, sergantiems astma ar turintiems alergiją bet kokiems bičių produktams. Nerekomenduojama vartoti bičių pienelio turintiems žemą kraujo spaudimą [54].
Bičių pienelio maisto papildai gaminami tablečių, liofilizuotų miltelių, kapsulių, geriamų ampulių ir net švirkštų, pripildytų bičių pieneliu, formomis. Lietuvoje bičių pienelio, esančio maisto papilduose, galima rasti nuo 10 iki 3850 mg vienkartinėje dozėje, todėl labai svarbu žinoti, kiek laiko ir kokiomis dozėmis rekomenduojama vartoti bičių pienelį.
1.7 Fenolinių junginių apžvalga
Fenoliniai junginiai, dažnai dar vadinami polifenoliais, yra sudaryti iš aromatinio žiedo, prie
kurio prisijungusios viena ar kelios hidroksilo grupės. Pagal prisijungusių hidroksilo grupių skaičių
skirstomi į fenolius ir polifenolius. Fenolinių junginių struktūra gali būti sudaryta iš paprasto žiedo
arba sudėtingų polimerų. Fenoliniai junginiai pasižymi aukšta virimo temperatūra dėl tarp jų
susidarančių vandenilinių ryšių. Yra išskiriamos 8 pagrindinės fenolinių junginių grupės: lignanai,
stilbenai, fenolinės rūgštys, flavonoidai, chinonai, kumarinai, ksantonai ir chromonai (4 pav.).
Fenolinių junginių antioksidacinio poveikio stiprumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus ir išsidėstymo aromatiniame žiede [21].
4 pav. Fenolinių junginių klasifikacija [adaptuota pagal 21]
Fenoliniai junginiai yra pagrindiniai antriniai metabolitai, randami augaluose. Šie junginiai svarbūs augalų apsauginėms reakcijoms ir reprodukcijai. Fenoliniai junginiai suteikia augalui ne tik spalvą, kuri reikalinga privilioti bites bei maskuotis nuo žolėdžių, padeda prisitaikyti augalui prie temperatūros pokyčių sukelto streso, bet ir atlieka cheminių signalų vaidmenį augalų ląsteliniame bei tarpląsteliniame lygmenyse, turi priešgrybelinį ir antimikrobinį veikimą [31]. Fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai, veikiantys kaip reduktoriai, metalų chelatoriai ir vieninteliai aktyviųjų deguonies radikalų inhibitoriai [8]. Fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas atlieka svarbų vaidmenį absorbuojant ir neutralizuojant laisvuosius radikalus. Jie atsakingi už antioksidacinį, antibakterinį, antitrombozinį, priešvėžinį, priešgrybelinį, priešvirusinį ir priešuždegiminį poveikį [9, 21, 28].
Fenoliniai junginiai suteikia skonį ir kvapą vaisiams bei bičių produktams. Bičių pienelyje randami fenoliniai junginiai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, kurios atlieka svarbų vaidmenį bičių pienelio farmakologiniame aktyvume [58].
Moksliniai tyrimai su bičių pieneliu rodo, kad bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja
plačiose ribose. Fenolinių junginių koncentracija priklauso nuo įvairių veiksnių, įskaitant bičių
naudojamą augmeniją ir jos savybes, sezoną bei aplinkos veiksnius [9, 58]. Adaškevičiūtės V. ir kitų
2019 metais atliktame tyrime su bičių pieneliu, surinktu Kupiškio bei Pakruojo rajonuose 2018 metų
liepos–rugpjūčio mėnesiais, spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu nustatyta, kad vandeniniuose
ekstraktuose fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 1,644 mg RE/g iki 2,314 mg RE/g [1]. Čeksterytės
V. ir kitų atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad bendro fenolinių junginių kiekio metanoliniuose šviežio
lietuviško bičių pienelio ekstraktuose vidurkis yra 7,4±0,025 mg GAE/g [2]. Dar didesni fenolinių
junginių kiekiai buvo nustatyti 2017 metais Balkanska R. ir kitų atliktame tyrime su 20 skirtingų
šviežio bulgariško bičių pienelio vandeninių ekstraktų mėginių. Naudojant spektrofotometrinį Folin-
Ciocalteu metodą nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 11,66 mg GAE/g iki 36,73 mg GAE/g [9].
Apibendrinant, bičių pienelis dėka fenolinių junginių gausos pasižymi priešuždegiminėmis ir antioksidacinėmis savybėmis, kurios naudingos sveikatai ir yra svarbios įvairių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, prevencijoje.
1.8 Flavonoidų apžvalga
Flavonoidai yra viena svarbiausių ir labiausiai gamtoje paplitusių fenolinių junginių grupių.
Jie aptinkami beveik visose augalų dalyse, ypač fotosintetinančiose augalų ląstelėse, vaisiuose, daržovėse, uogose, sėklose bei vyne. Flavonoidai apsaugo augalus nuo įvairių biotinių ir abiotinių veiksnių, veikia kaip unikalūs UV filtrai, fitoaleksinai, signalinės molekulės, detoksikatoriai ir antimikrobiniai gynybiniai junginiai. Flavonoidai augalui suteikia atsparumą šalčiui, sausrai ir gali atlikti funkcinį vaidmenį augalų aklimatizacijoje [29, 42].
Chemiškai flavonoidai apibūdinami kaip mažos molekulinės masės junginiai, sudaryti iš 15 anglies atomų. Flavonoidų pagrindą sudaro C6-C3-C6 struktūra, kur du aromatiniai benzeno žiedai (A ir B) yra sujungti trimis anglies atomais, per deguonies tiltelį suformuojančiais heterociklinį žiedą (C) [29]. Flavonoidų aglikono struktūra pavaizduota 5 paveiksle.
Pagal įvairias C žiedo struktūros modifikacijas flavonoidai skirstomi į tokius pogrupius:
flavonai (apigeninas, luteolinas, flavonas, diosminas), flavonoliai (kvercetinas, kempferolis, miricetinas, rutinas), flavanonai (flavhesperidinas, naringeninas), flavanoliai (epikatechinas, galokatechinas, katechinas), antocianidinai (pelargonidinas, cianidas, peoninas) ir izoflavonai (biochaninas, genisteinas) (4 pav.) [8, 29, 43, 55].
5 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas [28]
Flavonoidai dabar yra laikomi nepakeičiamu komponentu mitybos, farmacijos, medicinos ir kosmetikos tikslais. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad flavonoidai pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešvirusiniu, priešvėžiniu, hepatoprotekciniu bei kardioprotekciniu poveikiu. Flavonoidai taip pat plačiai naudojami maisto technologijoje kaip maisto produktų savybių saugotojai veikdami kaip antioksidantai, dažikliai ar aromatizatoriai [29].
Užsienio mokslinėje literatūroje minima, kad flavonoidų kiekis bičių pienelyje yra labai nedidelis ir trūksta duomenų apie jo kiekybinį įvairavimą šiame bičių produkte. Tačiau Lietuvoje buvo atliktas tyrimas su šviežia bičių pienelio žaliava ir rezultatai rodo, kad lietuviško bičių pienelio vandeniniame ekstrakte flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu 10 gramų žaliavos, įvairuoja nuo 10,34 mg iki 16,31 mg [1].
Moksliniai tyrimai patvirtina, jog flavonoidai turi teigiamą poveikį sveikatai, kovojant su laisvųjų radikalų sukeliamu žalingu poveikiu sveikatai. Kadangi flavonoidai nėra sintetinami žmogaus organizme, jų reikia gauti su maistu ar maisto papildais. Todėl svarbu ištirti bičių pienelį kaip alternatyvų flavonoidų šaltinį.
1.9 Fenolinių junginių ir flavonoidų bendrojo kiekio nustatymo metodai
Prieš pradedant fenolinių junginių bei flavonoidų kiekio analizę, reikia pasiruošti augalinės žaliavos ekstraktus. Ekstrakcija yra svarbus biologiškai aktyvių junginių išskyrimo, identifikavimo ir naudojimo etapas. Tiriamosios medžiagos gali būti ektrahuojamos iš šviežios, šaldytos arba džiovintos sausos susmulkintos žaliavos. Ekstrakcijos efektyvumui didelę įtaką daro tirpiklio parinkimas bei jo savybės, augalinės žaliavos susmulkinimo laipsnis, žaliavos ir ekstrahento santykis, kitų medžiagų buvimas, temperatūra, kurioje vyksta ekstrakcija, sąlyčio su žaliava laikas, maišymo greitis bei ekstrakcijos ciklų kartojimo skaičius [57].
Remiantis moksliniais literatūros šaltiniais, fenolinių junginių bei flavonoidų ekstrakcija gali
būti atliekama naudojant įvairius metodus: skysčių-skysčių ekstrakciją, mechaninę ekstrakciją,
ekstrakciją ultragarsu, ekstrakciją panaudojant mikrobangas, superkritinių skysčių ekstrakciją,
Soksleto ekstrakciją, bei maceraciją [24]. Pasirinkus ekstrakcijos metodą sekantis žingsnis yra parinkti
tinkamą ekstrahentą. Siekiant didesnio ekstrakcijos efektyvumo, reikia atsižvelgti į tai, kad ekstrahento
bei ekstrahuojamos medžiagos poliškumas turi būti panašūs. Dažniausiai fenolinių junginių ir
flavonoidų ekstrakcijai pasirenkami organiniai bei neorganiniai ekstrahentai: yra vandens – metanolio,
vandens – etanolio, vandens – acetono mišiniai, vanduo, etilacetatas ir kt. Paprastai ekstrakcijos išeiga
didėja didėjant vandens kiekiui metanolio, etanolio ar acetono ir vandens sistemoje [57].
Bendro fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje įvertinimui dažniausiai naudojamas kolorimetrinis metodas su Folin-Ciocalteu reagentu. Šis metodas pagrįstas fenolinių junginių oksidacijos reakcija šarminėje aplinkoje su fosfomolibdato ir fosfovolframo rūgčių kompleksu, kuris yra Folin-Ciocalteu reagente. Vykstant reakcijai, geltonos spalvos Folin-Ciocalteu reagentas sudaro kompleksą su fenoliniais junginiais ir nudažo tirpalą mėlyna spalva. Absorbcija matuojama UV spektrofotometru esant 750–765 nm šviesos bangos ilgiui. Bendras fenolinių junginių kiekis dažniausiai išreiškiamas mg/g pagal galo rūgšties ekvivalentą (GRE). Metodas patrauklus tuo, kad yra paprastas, nereikalaujantis sudėtingos aparatūros bei gaunami tikslūs duomenys. Be to, gautus rezultatus lengva palyginti su kitais moksliniais tyrimais, nes analizuojant fenolinių junginių kiekį šis metodas taikomas dažniausiai [13].
Bendro flavonoidų kiekio augalinėje žaliavoje nustatymui dažniausiai naudojamas spektrofotometrinis metodas, kurio metu atliekama reakcija su aliuminio (III) chloridu. Metodas pagrįstas flavonoido – aliuminio komplekso susidarymu rūgščioje terpėje. Praėjus 30 min nuo mišinio paruošimo absorbcija matuojama spektrofotometru esant 404–430 nm šviesos bangos ilgiui.
Dažniausiai bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas mg/g pagal rutino ekvivalentą (RE) [47].
1.10 Laisvieji radikalai ir antioksidacinis aktyvumas
Mūsų organizme vykstant įvairioms biocheminėms reakcijoms, kurių metu maisto medžiagos paverčiamos ląstelėms reikalinga energija, susidaro sveikatai žalingi medžiagų apykaitos produktai.
Tai – laisvieji radikalai – neporinį elektronų skaičių turinčios deguonies molekulių dalys, susiformuojančios vykstant oksidacijos procesui. Nesuporuoti elektronai norėdami stabilizuotis atakuoja kitas molekules, atimdami iš jų elektronus ir tokiu būdu padaro žalą sveikoms organizmo ląstelėms ir jų DNR. Laisvieji radikalai inicijuoja daugelio patologinių būklių – diabeto, neurodegeneracinių ligų, lėtinių širdies ir kraujagyslių ligų, vėžio, kataraktos, astmos, reumatoidinio artrito, uždegimo bei virškinamojo trakto ligų – atsiradimą [50].
Organizme vykstant redukcijos ir oksidacijos reakcijoms, ląstelėse susidaro šalutiniai produktai – reaktyvios deguonies (ROS) ir reaktyvios azoto (RNS) formos. Padidėjus šių radikalų kiekiui, pasireiškia oksidacinis stresas. Kai nėra pusiausvyros tarp laisvųjų radikalų (ROS/RNS) ir elektronų donorų kiekio, laisvųjų radikalų koncentracija sparčiai didėja. Aktyviosios deguonies formos (ROS) apima laisvuosius superoksido (•O
2-) anijono, hidroksilo (HO•), peroksilo (ROO•), alkoksilo (RO•) radikalus ir ne radikalus: vandenilio peroksidą (H
2O
2), singletinį deguonį (
1O
2) ir hipochlorito rūgštį (HOCl). Kaip ir ROS, taip ir RNS randami nedideliais kiekiais vykstant reakcijoms ląstelėse.
RNS radikalams priskiriami azoto oksidas (NO•) ir azoto dioksidas (NO
2•), neradikalams –
peroksinitrito anijonas (ONOO
-), azoto dioksido katijonas (NO
2+), nitroperoksikarbonato anijonas (ONOOCO
2-), ir dinitrotrioksidas (N
2O
3). Reaktyvūs laisvieji radikalai pažeidžia labai svarbias biologines struktūras: sukelia lipidų peroksidaciją, baltymų pažaidą, DNR (deoksiribonukleorūgšties) bei RNR (ribonukleorūgšties) struktūrų pokyčius. ROS susidarymo greitis padidėja ne tik vykstant organizmo biocheminėms reakcijoms, bet ir veikiant įvairiems išoriniams faktoriams. Oksiduojančių medžiagų kiekis taip pat padidėja veikiant UV spinduliuotei, radiacijai, fizinio krūvio metu bei rūkant.
Norint užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeliamam žalingam poveikiui, juos reikia inaktyvuoti [39, 48, 53].
Junginiai, kurie net mažomis koncentracijomis geba sustabdyti oksidacinius procesus bei neutralizuoti laisvuosius radikalus, vadinami antioksidantais. Antioksidantai ROS ir RNS radikalus inaktyvina dviem pagrindiniais mechanizmais: antioksidantui paaukojant elektroną laisvajam radikalui ir taip nutraukiant grandininę reakciją bei pašalinant ROS/RAD iniciatorių [7].
Fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas daugiausia susijęs su jų redukcinėmis savybėmis, kurios atlieka svarbų vaidmenį absorbuojant ir neutralizuojant laisvuosius radikalus [9].
Bičių pienelis laikomas potencialiu natūralių antioksidantų šaltiniu, galinčiu neutralizuoti oksidacinio streso poveikį, kuris nulemia daugybės ligų patogenezę [3, 27]. Yra įrodytas bičių pienelio antioksidacinis radikalus surišantis poveikis naudojant DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) laisvuosius radikalus, hidroksilo ir superoksido radikalus [32].
1.11 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai
DPPH surišimo metodas yra vienas populiariausių spektrofotometrinių metodų
antioksidaciniam aktyvumui nustatyti. DPPH yra stabilus sintetinis radikalas, kuris nesuyra vandenyje,
metanolyje ar etanolyje. Tai tamsiai violetinės spalvos kristalai. Reakcijos metu DPPH radikalai
prisijungia vandenilį iš atitinkamo donoro (antioksidanto), DPPH laisvasis radikalas redukuojamas, o
spalva pereina iš tamsiai violetinės į blankiai geltoną, būdingą hidrazinui (6 pav.). Spalvos pokyčiai
atsiranda dėl mažėjančio DPPH radikalų kiekio aplinkoje. Laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas
priklauso nuo antioksidanto komponentų struktūros ir jo gebos prarasti vandenilį. DPPH metodas yra
priimtinas dėl jo paprastos, greitos, jautrios ir atkuriamos tyrimo metodikos. Be to, chromogeniniai
radikaliniai junginiai (DPPH) gali tiesiogiai reaguoti su antioksidantais, jų aktyvinti nereikia. DPPH
absorbcija matuojama prie 515-520 nm bangos ilgio, kuri mažėja redukuojant antioksidaciniu
aktyvumu pasižymintį junginį tol, kol tampa stabili [6, 8].
Atliekant ABTS (2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonrūgšties)) radikalų-katijonų surišimo testą, nustatomas santykinis antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių gebėjimas neutralizuoti ABTS radikalus. Pridėjus kalio persulfato, ABTS paverčiamas ABTS•
+(ABTS radikalu–
katijonu). Šis mėlynai žalios spalvos radikalas-katijonas reakcijos su antioksidantu metu prisijungia vandenilio atomą ir vėl pavirsta bespalve neutralia forma. Lyginamasis etalono tirpalas yra šviežiai paruoštas vandenyje tirpaus vitamino E analogas – troloksas. Tirpalo absorbcija matuojama regimosios šviesos spektre esant 734 nm bangos ilgiui. ABTS radikalų surišimo efektyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais. ABTS•
+reaguoja į daugumą antioksidantų, jis yra tirpus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, todėl šį metodą galima naudoti nustatant tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių junginių antiradikalinį aktyvumą [33, 34, 40].
Naudojant vieną antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodą būtų sunku įvertinti bičių pienelio ekstraktų antioksidantinį aktyvumą. Siekiant detaliau įvertinti tiriamojo objekto aktyvumą, tyrimus tikslinga vykdyti keletu in vitro metodų, kuriais būtų galima nustatyti ir palyginti ekstraktų gebą funkcionuoti keletu antioksidacinio aktyvumo mechanizmų.
DPPH•
(violetinė spalva) DPPH-H
(geltona spalva) A-H
6 pav. DPPH reakcija su antioksidantu [adaptuota pagal 40]
+ A•
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimui buvo naudoti 2 šaldyto bičių pienelio žaliavos pavyzdžiai, 1 liofilizuoto bičių pienelio žaliava ir 3 skirtingi maisto papildai, savo sudėtyje turintys bičių pienelio. Tyrimo objektai pateikti 2 lentelėje. Šaldytas bičių pienelis buvo gautas iš bitininkų. Liofilizuotas bičių pienelis buvo įsigytas elektroninėje parduotuvėje. 2 iš 3 maisto papildų yra notifikuoti Lietuvos Respublikoje. Visi 3 maisto papildai su bičių pieneliu buvo įsigyti Lietuvos fizinėse bei nuotolinio platinimo vaistinėse.
2 lentelė. Tiriamieji objektai
Eil.
Nr. Pavadinimas, kilmės šalis Sudėtis
Deklaruojamas bičių pienelio
kiekis
Rekomenduojama maksimali paros
dozė 1. Šaldytas bičių pienelis,
rinktas 2019 metų liepą, Keižonyse, Jonavos r.
Bičių pienelis 100 proc. 200 mg
2. Šaldytas bičių pienelis, rinktas 2019 metų rugsėjo
mėnesį Aleksote, Kaune.
Bičių pienelis 100 proc. 200 mg
3. Liofilizuotas bičių pienelis, Jungtinė
Karalystė
Liofilizuoto bičių
pienelio milteliai 100 proc. 200 mg
4.
MP, Lietuva
Gliukozė, bičių pienelis, lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgščių
magnio druskos.
50 mg liofilizuoto bičių
pienelio vienoje tabletėje
2 tabletės/100 mg
5.
MP, Lietuva
Gliukozė, bičių pienelis, lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgščių
magnio druskos.
70 mg liofilizuoto bičių
pienelio vienoje tabletėje
2 tabletės/140 mg
6.
MP, Prancūzija
Fruktozė, bičių pienelis, natūralus apelsinų skonis,
vanduo
1000 mg bičių pienelio vienoje
ampulėje
1 ampulė/1000 mg
2.2 Naudoti reagentai
Tyrimo metu naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus ir buvo analitinio švarumo.
ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)), (Buchs, Switzerland);
Aliuminio chloridas (99,99 proc., Sigma–Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), (Aldrich, Vokietija);
Etanolis (96 proc., Vilniaus degtinė);
Folin-Ciocalteu reagentas (2M, Sigma–Aldrich, Šveicarija);
Heksametilentetraminas (≥99,9 proc., Roth, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (Vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV);
Ledinė acto rūgštis (99,5 proc., Sigma–Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Metanolis (99,8 proc., Sigma–Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Natrio karbonatas (Sigma–Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Rutino reagentas (97,11 proc., Hwi Analytik Gmbh);
Troloksonas (98 proc., Flukachemika, Buchs, Šveicarija);
2.3 Naudota aparatūra ir prietaisai
Tiksliam bičių pienelio ir maisto papildų svėrimui buvo naudotos analitinės svarstyklės
Shimadzu Auw 120 D (Bellingen, Vokietija). Darbo metu taip pat naudotos automatinės pipetės
Eppendorf Research, (Eppendorf, JAV). Mėginiai buvo ekstrahuojami naudojant ultragarso bangų
vonelę BioSonic UC100 (Mavajai, JAV). Filtravimas atliktas naudojant Q-Max membraniniu filtru
25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, (Vokietija). Centrifugavimui buvo
naudotas Centurion Scientific C2006, Jungtinė Karalystė) aparatas. Bendras bičių pienelio ir jo maisto
papildų fenolinių junginių, flavonoidų kiekis bei antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant
UV-regimojo spektro dvigubo spindulio spektrofotometrą HALO DB-20 UV-Vis Dynamica GmbH
(Šveicarija). Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas
Ekstraktai ruošiami sveriant po 0,5 g (0,001 g tikslumu) šaldyto bičių pienelio, liofilizuoto bičių pienelio miltelių ir iki vienalytės masės susmulkintų maisto papildo (MP-1 ir MP-2) tablečių (vienos MP-1 tabletės vidutinė masė 0,501 g, MP-2 – 0,499 g). 0,5 ml maisto papildo MP-3 pamatuojama automatine pipete. Tiriamoji medžiaga užpilama 10 ml ekstrahento, kuris parenkamas bandymų būdu. Ekstrakcija vykdyta 15 min. ultragarso vonelėje. Po ekstrakcijos ištraukos nufiltruojamos pro metanoliu sudrėkintą membraninį filtrą ir nucentrifuguojamos. Gautas ekstraktas perkeliamas į tikslaus tūrio matavimo kolbą ir praskiedžiamas parinktu ekstrahentu iki 10 ml.
Ekstraktai laikomi sandariai uždaryti vėsioje, tamsioje vietoje.
2.5 Bičių pienelio ir jo maisto papildų spektrofotometrinė analizė
2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu
Bendram fenolinių junginių kiekio nustatymui buvo naudojamas spektrofotometrinis metodas su Folin-Ciocalteu reagentu. Pirmiausia paruošiamas darbinis reagentas: 7 proc. natrio karbonato tirpalas gaminamas 17,5 g natrio karbonato ištirpinant išgrynintame vandenyje 250 ml matavimo kolboje iki atžymos. Į 25 ml matavimo kolbutę pilama 1 ml bičių pienelio ekstrakto, kuris maišomas su 1 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu bei 9 ml išgryninto vandens. Po 5 min įpilama 10 ml 7 proc.
natrio karbonato tirpalo ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki atžymos. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 90 min. kambario temperatūroje, tamsoje.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas lygiai taip pat kaip tiriamasis tirpalas, tik vietoje bičių pienelio ekstrakto pilama 1 ml išgryninto vandens.
Po inkubacinio laikotarpio (90 min.) spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 750 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai atliekami po tris kartus.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomos koncentracijos galo rūgšties tirpalo. Naudojant galo rūgšties 70 proc. metanolinį tirpalą paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ir 2,5 mg/ml.
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
y = 0,9068x + 0,0617;
R² = 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
2.5.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Paruoštuose bičių pienelio ekstraktuose bendras flavonoidų kiekis buvo nustatinėjamas spektrofotometriniu metodu, pagrįstu flavonoidų reakcija su aliuminio chloridu. Bendras flavonoidų kiekis ekstraktuose išreiškiamas rutino ekvivalentu.
Ekstraktai buvo veikiami heksametilentetramino bei aliuminio chlorido tirpalais, terpę parūgštinus acto rūgštimi. Tiriamasis tirpalas ruošiamas 10 ml matavimo kolbutėje įpilant 4 ml 96 proc. etanolio, 0,2 ml proc. ledinės acto rūgšties, 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino, 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido ir 0,2 ml paruošto bičių pienelio ekstrakto. Gautas mišinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymos, gerai sumaišomas ir paliekama stovėti 30 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Praėjus duotam laikui spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 407 nm šviesos bangos ilgyje. Kiekvienas ekstrakto mėginys matuojamas mažiausiai po 3 kartus.
Lyginamasis tirpalas gaminamas taip pat kaip ir tiriamasis tirpalas, tik vietoj bičių pienelio ekstrakto naudojamas 70 proc. (V/V) etanolis.
Etaloniniai rutino rūgšties tirpalai ruošiami lygiai taip pat kaip ir tiriamieji, tik vietoje 0,2 ml bičių pienelio ekstrakto pilamas 0,2 ml žinomos koncentracijos rutino rūgšties tirpalas. Taip pagaminami skirtingų koncentracijų rutino rūgšties tirpalai: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 mg/ml. Kalibracinis etaloninių rutino tirpalų grafikas sudaromas iš 5 skirtingų tirpalo koncentracijų (7 pav.).
7 pav. Rutino kalibracinė kreivė bendram flavonoidų kiekiui nustatyti
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Absorbcija
Rutino koncentracija, mg/ml
y = 0,9465x + 0,0959 R² = 0,9965
Duomenys įvertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
y = 0,9465x – 0,0950;
R
2= 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
2.5.3 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu
Pagamintų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas yra įvertinamas pagal jų gebą neutralizuoti DPPH radikalus. Darbinis DPPH tirpalas ruošiamas atsveriant 0,0017 g (tikslus svėrinys) DPPH reagento, kuris skiedžiamas 96,3 proc. (V/V) etanoliu tol, kol esant 515 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03.
Kaip lyginamasis tirpalas naudojamas 96,3 proc. (V/V) etanolis.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 10 μl tiriamojo ekstrakto bei 3 ml paruošto darbinio DPPH tirpalo. Mėginys gerai sumaišomas ir laikomas kambario temperatūroje, tamsioje vietoje 30 min. Po to, esant 515 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas tiriamojo tirpalo absorbcijos sumažėjimas. Kiekvienas ekstraktas matuojamas tris kartus.
Gaminant pirminį trolokso tirpalą atsveriama 0,025 g trolokso ir ištirpinama 96,3 proc. (V/V) etanolyje 25 ml kolbutėje. Iš šio trolokso tirpalo ruošiami 0,0625 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml ir 1 mg/ml koncentracijos tirpalai. Sudaromas kalibracinis etaloninių trolokso tirpalų grafikas (8 pav.). Gauti duomenys įvertinami pagal trolokso kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: 𝑦 = 0,4461𝑥 + 0,1628; R²=0,9986.
Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (mg/g) ir apskaičiuojamas pagal formulę:
TE
ABTS= 𝑐 × 𝑉
𝑚
; mg TE/gčia:
c – trolokso koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės;
V – ekstrakto tūris (ml);
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Absorbcija
Standartinių trolokso tirpalų koncentracija, mg/ml
y = 0,4461x + 0,1628 R² = 0,9986
8 pav. Trolokso kalibracinė kreivė DPPH metodu
2.5.4 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS radikalų - katijonų surišimo metodu
Pirmiausia gaminamas 2M ABTS motininis tirpalas: į tamsaus stiklo buteliuką beriama 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių ir naudojant ultragarso bangų vonelę ištirpinama 50 ml išgryninto vandens. Gautas tirpalas aktyvuojamas į jį suberiant 0,0095 g kalio persulfato, indas užkemšamas ir gerai sumaišomas. Pagamintas ABTS motininis tirpalas paliekamas 16 val. tamsoje, kol įvyksta oksidacijos-redukcijos reakcija, kurios metu susidaro ABTS•+ radikalas-katijonas. Laikant kambario temperatūroje, tamsoje, susidaręs radikalas-katijonas išlieka stabilus 2 paras.
Darbinio tirpalo paruošimas: praėjus 16 val. motininis ABTS•+ tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kol esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03. Lyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.
Mėginio paruošimas: 3 µl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio ABTS•+ tirpalo.
Mėginys gerai sumaišomas ir laikomas tamsioje vietoje 30 min. Po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis.
Kiekvienas ekstraktas matuojamas nemažiau trijų kartų. Kalibracinis grafikas sudaromas iš 5 skirtingų
8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninių trolokso tirpalų.
Gauti duomenys įvertinami pagal trolokso kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: 𝑦 = 0,00003𝑥 − 0,00360; R²=0,9714. Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:
TE
ABTS= 𝑐 × 𝑉
𝑚
; μmol TE/gc – trolokso koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (μmol/l), V – žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris (ml);
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.6 Statistinė duomenų analizė
Gauti duomenys apdoroti pavaizduoti naudojant kompiuterines programas Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft, JAV) ir ,,SPSS 21” (IBM, JAV). Bandymai buvo kartoti tris kartus (n=3), apskaičiuotas matematinis vidurkis, standartinė paklaida ir standartinis nuokrypis. Koreliacinio ryšio stiprumas (r) įvertintas taikant Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirstinių nustatomi naudojant dviejų nepriklausomų imčių T-kriterijų (angl.
independent-samples T-test). Statistinis reikšmingumo lygmuo, laikomas jei p<0,05.
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Norint pagaminti kokybiškus, su didele išeiga, ekstraktus, reikia parinkti tinkamas ekstrakcijos sąlygas. Efektyviai fenolinių junginių, flavonoidų kiekio bei antioksidacinio aktyvumo analizei yra svarbu parinkti tinkamą ekstrahavimo metodą, naudojant geriausią ekstrakcijos tirpiklį, atsižvelgiant į jo selektyvumą tiriamosioms medžiagoms [17]. Įprasti augalinių žaliavų bei bičių produktų ekstrakcijos būdai yra maceracija, perkoliacija ir Soksleto ekstrahavimas. Šie metodai turi nemažai trūkumų: gaunami mažos išeigos ekstraktai, ilgas ekstrahavimo laikas, reikalingas didelis žaliavos kiekis, didelis tirpiklio sunaudojimas ir neigiamas jo poveikis aplinkai. Pastaruoju metu vis dažniau taikomas ekstrahavimas ultragarsu. Remiantis literatūra, šis ekstrahavimo metodas teikia daug privalumų: sutrumpinamas ekstrahavimo laikas, gaunama didesnė ekstrakto išeiga ir kokybė, taupomas tirpiklis bei mažinamas jo neigiamas poveikis aplinkai [24, 36].
Ekstrakcijos sąlygos pasirenkamos įvertinant ekstrahavimo metodo bei ekstrahento parinkimo įtaką fenolinių junginių ir flavonoidų išeigai. Ekstarkcijos sąlygų parinkimui buvo naudojamas bičių pienelio, surinkto 2019 metų liepą Keižonių k., Jonavos rajone, mėginys.
3.1.1 Ekstrakcijos metodo parinkimas
Ekstrakcijos metodo parinkimui buvo naudojama maceracija ir ekstrakcija ultragarsu. Šie metodai pasirinkti, atsižvelgiant į kitų mokslininkų tyrimus su bičių pieneliu ir kitais bičių produktais [1, 23]. Tolimesniems eksperimentams ekstrakcijos metodas pasirenkamas įvertinus fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį atitinkamai reakcijų su Folin-Ciocalteu reagentu ir aliuminio chloridu spektrofotometriniais metodais.
Maceracija buvo atliekama 0,5±0,01 g bičių pienelio žaliavos užpilant dalimi vandens (2 ml) išbrinkimui, vėliau supilamas likęs tirpiklis (3 ml) ir paliekama 24 val. kambario temperatūroje. Gautas ekstraktas nucentrifuguojamas, nupilamas centrifugatas ir kietos medžiagos ekstrahuojamos dar kartą ta pačia procedūra dar du kartus. Visi gauti ekstraktai sumaišomi ir praskiedžiami iki 15 ml.
Ultragarso vonelėje 0,5±0,01 g bičių pienelio žaliavos užpilama 70 proc. (V/V) etanoliu,
ekstrahuojama 15 min. ir nufiltruojama. Rezultatai pateikti 9 paveiksle.
9 pav. Ekstrakcijos metodo parinkimas (n=3)
Lyginant gautus rezultatus nustatyta, kad didesnis bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekis išgaunamas ekstrahuojant ultragarso vonelėje 15 min. – flavonoidų gautas kiekis 1,71±0,03 RE mg/g, fenolinių junginių 4,28±0,14 GRE mg/g. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad skirtingais metodais ekstrahuojant bičių pienelio žaliavą, fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio vidurkiai statistiškai reikšmingai skiriasi (p<0,05). Remiantis gautais tyrimo rezultatais, tolimesnių tyrimų atlikimui ekstraktai buvo ruošiami ekstrahuojant bičių pienelio žaliavą bei jo papildus ultragarso vonelėje 15 min.
3.1.2 Ekstrahento parinkimas
Tolimesnis ekstrakcijos optimizavimas atliekamas pagal prieš tai atlikto eksperimento rezultatus, pasirenkant ekstrahavimą ultragarso bangomis. Siekiant išgauti didžiausią fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį, toliau įvertinama ekstrahento ir jo koncentracijos įtaka ekstrakcijos išeigai iš bičių pienelio žaliavos. Šaldyta bičių pienelio žaliava (0,5±0,01 g) buvo ekstrahuojama 70 ir 96 proc. (V/V) etanolyje, 70 ir 99,9 proc. (V/V) metanolyje bei išgrynintame vandenyje. Šie tirpikliai buvo pasirinkti remiantis įvairių autorių pasirenkamais skirtingais ekstrahentais [1, 2, 22, 23].
Tinkamiausias ekstrahentas tolimesniems tyrimams pasirenkamas įvertinus vandeniniame ir skirtingų koncentracijų metanoliniuose ir etanoliniuose ekstraktuose esantį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį nustatant spektrofotometriniu metodu. Gauti rezultatai pavaizduoti grafike (10 pav.).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Maceracija 24 val Ultragarso vonelė 15 min.
Kiekis, mg/g
Ekstrakcijos metodas
Flavonoidai, RE mg/g
Fenoliniai junginiai, GRE mg/g
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Vanduo Etanolis 70% Etanolis 96 % Metanolis 70
%
Metanolis 99.9
%
Kiekis, mg/g
Ekstrahentas
Flavonoidai, RE mg/g Fenoliniai junginiai, GRE mg/g
