Laisvųjų amino rūgščių kiekybinis įvertinimas Lietuvoje auginamų pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklose dujų chromatografijos metodu

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

AGNĖ BARONAITĖ

Laisvųjų amino rūgščių kiekybinis įvertinimas Lietuvoje auginamų

pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklose dujų chromatografijos

metodu

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof., dr. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė

Laisvųjų amino rūgščių kiekybinis įvertinimas Lietuvoje auginamų

pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklose dujų chromatografijos

metodu

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. dr. Liudas Ivanauskas

Recenzentas: Darbą atliko: Magistrantė Agnė Baronaitė

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) morfologija ... 12

1.2.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) kultivavimas ... 13

1.3.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) cheminė charakteristika ... 13

1.4.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) biologinis poveikis ... 14

1.5.Amino rūgštys... 16

1.6.Amino rūgščių klasifikacija ... 17

1.7.Amino rūgščių nustatymo metodai ... 20

2. TYRIMO METODIKA ... 22

2.1.Tyrimo objektas ... 22

2.2.Cheminiai reagentai ... 22

2.3.Aparatūra ... 22

2.4.Tyrimų metodika ... 23

2.4.1.Tiriamojo mėginio paruošimas ... 23

2.4.1.1.Nuodžiūvis ... 23

2.4.1.2.Ekstraktų ruošimas ... 23

2.4.1.3.Amino rūgščių derivatizacija ... 23

2.4.2.Amino rūgščių kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos metodu ... 24

2.5.Statistinė duomenų analizė ... 24

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25

3.1.Skirtingų veislių pluoštinių kanapių sėklų tiriamieji mėginiai ... 25

3.2.Nuodžiūvio nustatymas ... 25

3.3.Metodo validacija ... 25

3.4.Amino rūgščių kokybinis įvertinimas tiriamosiose sėklose ... 26

3.5.Kiekybinis amino rūgščių nustatymas pluoštinių kanapių sėklose ... 27

4. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42 5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43

Agnės Baronaitės magistro baigiamasis darbas, darbo vadovas: prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: sėklos, amino rūgštys, pluoštinė kanapė, dujų chromatografija.

Darbo tikslas: Kiekybiškai ištirti ir įvertinti Lietuvoje kultivuojamų pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklose esančias laisvąsias amino rūgštis.

Uždaviniai: remiantis moksliniais straipsniais parengti literatūros apžvalgą; paruošti surinktas pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklas eksperimentiniams tyrimams, atlikti mėginių ekstrakciją pritaikant derivatizacijos metodą.; dujų chromatografijos analizės metodu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti laisvąsias amino rūgštis; palyginti gautus laisvųjų amino rūgščių kiekius kepintose ir žaliose pluoštinių kanapių sėklose.

Tyrimo objektas: tyrime buvo analizuojamos 6 skirtingos pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklų veislės, ARG B1 – Finola veislė, surinkta Panevėžio raj., ARG B2 – Futura 75 veislė, surinkta Anykščių raj., ARG B3 – Futura 75 veislė, surinkta Marijampolės raj., ARG W1 – Futura 75 veislė, surinkta Rokiškio raj., Panemunėlio m., ARG W2 – Finola veislė, surinkta Anykščių raj., ARG W3 – Finola veislė, surinkta Kupiškio raj. Vykdant tyrimą su žaliomis sėklomis, buvo nuspręsta tas pačias sėklų veisles pakepinti ir palyginti tarpusavyje gautus rezultatus.

Rezultatai: tiriamuosiuose mėginiuose dujų chromatografijos/masių spektrometrijos metodu buvo identifikuota 14-15 laisvųjų amino rūgščių: alaninas, glicinas, valinas, leucinas, izoleucinas, prolinas, metioninas, serinas, treoninas, fenilalaninas, aspartamo rūgštis, L-glutamatas, L-lizinas, L-tirozinas ir L-cistinas. Didžiausi bendri nepakeičiamų amino rūgščių kiekiai buvo aptikti kepintose (18,103µg/ml) ir žaliose (17,851µg/ml) Futura 75 veislės, surinktos Rokiškio raj., Panemunėlio m., sėklose, mažiausi kiekiai nustatyti Finola veislės, surinktos Anykščių raj. sėklose: kepintose (16,69µg/ml), o žaliose (16,224µg/ml). Didesnės bendros pakeičiamų amino rūgščių koncentracijos aptiktos kepintose sėklose, dėl gautos L-cistino amino rūgšties, kurios žaliose sėklose nebuvo aptikta. Didžiausi šių amino rūgščių kiekiai nustatyti Futura 75 veislės, surinktos Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose: kepintose (19,916µg/ml), o žaliose (12,827µg/ml). Tiriant bendrą visų amino rūgščių kiekį, buvo pastebėta, jog didesni kiekiai nustatyti mėginiuose, kuriuose buvo tirtos žalios sėklos, iš jų didžiausias kiekis nustatytas Futura 75 veislės, surinktos Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose (30,678µg/ml), o mažiausias kiekis aptiktas Futura 75 veislės, surinktos Anykščių raj. sėklose (23,719µg/ml). Kepintose sėklose taip pat didžiausias kiekis nustatytas Futura 75 veislės, surinktos Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose (25,195µg/ml), o mažiausias – Futura 75 veislės, surinktos Anykščių raj. sėklose (21,69µg/ml).

Keywords: seeds, amino acids, industrial hemp (Cannabis sativa L.), gas chromatography. The aim of this research is to analyze the quantitative composition of free amino acids found in the seeds of varieties of industrial hemp (Cannabis sativa L.) cultivated in Lithuania.

The objectives of the research: analise literature sources and prepare literature review; collect seeds of the industrial hemp (Cannabis sativa L.) and prepare samples for extraction with derivatization; to select optimal conditions for quantitative analysis of free amino acids; using the gas chromatography method, to identify and qualitatively evaluate free amino acids content; to determine and compare the amount of free amino acids in different variety of industrial hemp (Cannabis sativa L.) seeds.

The object of the research was 6 different seeds varieties of industrial hemp (Cannabis sativa L.), ARG B1 – Finola variety, collected in Panevėžio raj., ARG B2 – Futura 75 variety, gathered in Anykščių raj., ARG B3 – Futura 75 variety, gathered in Marijampolės raj., ARG W1 – Futura 75 variety, collected in Rokiškio raj., Panemunėlio m., ARG W2 – Finola variety, gathered in Anykščių raj., ARG W3 – Finola variety, collected in Kupiškio raj. In the research with raw seeds was decided to do the same research with roasted same varieties of seeds.

The results of the research: L-alanine, L-glycine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-proline, L-methionine, L-serine, L-threonine, L-phenylalanine, L-aspartame, L-glutamate, L-lysine, L-tyrosine and L-cystine have been identified by the gas chromatography method in comparison of retention times according to the standards. The highest amount of essential amino acids was found in roasted (18,103μg/ml) and in raw (17,851μg/ml) Futura 75 variety, which was collected in Rokiškio raj. seeds, the smallest quantities were found in Finola variety, which was gathered in Anykščių raj. seeds: roasted (16,69μg/ml) , and in raw (16.224μg/ml). Larger amount of non-essential amino acids were found in roasted seeds, due to the L-cystine, which were not found in raw seeds. The highest amount of these amino acids are found in Futura 75 variety, which was collected in Rokiškio raj., Panemunėlio m. seeds: roasted (19,916μg/ml) and raw (12,827μg/ml). Larger a total amount of all amino acids was found in samples with raw seeds, of which the highest content was found in Futura 75 variety, which was collected in Rokiškio raj., Panemunėlio m. seeds (30,678μg/ml) and the lowest amount was detected in Futura 75 variety, which was gathered in Anykščių raj. seeds (23,719μg/ml). In the roasted seeds, the highest amount were also found in Futura 75 variety, which was collected in Rokiškio raj., Panemunėlio m. seeds (25,195μg/ml) and the lowest in Futura 75 variety, which was gathered in Anykščių raj. seeds (21.69μg/ml).

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui prof. dr. Liudui Ivanauskui už konsultacijas ir patarimus. Taip pat norėčiau padėkoti analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lektoriui Mindaugui Marksai už patarimus ir pagalbą atliekant tyrimą ir analizuojant gautus rezultatus.

SANTRUMPOS

THC – tetrahidrokanabinolis GABA – gama aminobutyro rūgštis CBD – kanabidiolis

NMDA – N-metil-D-asparto rūgštis AR – amino rūgštys

TLC – plonasluoksnė chromatografija DC – dujų chromatografija

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija MS – masių spektrometrija

ĮVADAS

Šiais laikais sparčiai didėja žmonių susidomėjimas augalinėmis žaliavomis, tokiomis kaip pluoštinė kanapė, kurią stengiamasi panaudoti maisto pramonėje bei pritaikyti jos naudojimą šiuolaikinėje medicinoje, todėl norint nustatyti juose esančių biologiškai aktyvių junginių kiekį, atliekami įvairūs tyrimai.

Pluoštinė kanapė (Cannabis sativa L.) vienmetis, žydintis augalas, žinomas dėl savo plonų ir ilgų žiedų bei smailių lapų. Kanapė kilusi iš Vakarų ir Centrinės Azijos, bet šiuo metu auginama beveik visame pasaulyje: Europoje, Kinijoje, Japonijoje, Kanadoje ir Jungtinėse Amerikos Valstijose. Senovėje tūkstančius metų kanapė buvo naudojama kaip maisto šaltinis, pluošto gamybai bei medicinoje [26,8]. 1930 metais Vakarų Amerikoje buvo uždrausta vartoti bet kokius kanapių produktus, dėl atsiradusių daug nepageidaujamų reakcijų ir nežinomo cheminio junginio tetrahidrokanabinolio (THC) veikimo, kurį laiką nebuvo atliekami išsamūs tyrimai su šiais augalais. Šiuo metu galima auginti kanapes ir vartoti jų produktus, kuriose THC kiekis yra ne didesnis nei 0,3% [26,19]. Lietuvoje vis didesnė dalis ūkininkų užsiima kanapių auginimu, o žmonės naudoja kanapių sėklas pramonėje.

Kanapių sėklos daug metų naudojamos maisto pramonėje, liaudies medicinoje, jos gali būti naudojamos neapdorotos, virtos, keptos, taip pat iš jų spaudžiamas kanapių aliejus. Kinijoje kanapių sėklos kaip maisto ir medicinos šaltinis buvo vartojamas daugiau nei 3000 metų ir iki šių dienų šios sėklos išlieka viena iš pagrindinių grūdinių kultūrų Azijietiškoje virtuvėje [4,19]. Šiaurės Amerikoje anksčiau kanapių sėklos buvo naudojamos dažų pramonėje ir importuojamas kaip paukščių lesalas. Kanapių sėklose randama daug vitamino A, C, E, taip pat gausu mineralų, β-karoteno ir kitų maistinių medžiagų [26,8]. Jose nemažai galima rasti ir amino rūgščių, iš jų gautas ekstraktas gali būti potenciali terapeutinė priemonė gydant žmones, sergančius lėtinėmis ligomis. Dėl to daugėja maisto produktų, kuriuose galima rasti kanapių sėklų, tokie produktai tampa prieinami žmonėms įvairiose šalyse.

Kanapių sėklose gausu įvairių junginių, jose galima rasti ir amino rūgščių. Amino rūgštys vienos iš svarbiausių junginių mūsų organizme, iš jų sudaryti peptidai, baltymai, kurie atlieka struktūrinę, apsauginę, pernašos ir daug kitų funkcijų, be kurių mūsų organizmo veikla sutriktų, taip pat iš jų sudaryti tokie vaistai kaip antibiotikai. Amino rūgštys gali būti klasifikuojamos pagal jų sintezės procesus organizme ir radikalo struktūrą. Visos amino rūgštys organizme atlieka skirtingas funkcijas [36,38].

Analizuojant amino rūgštis maisto produktuose, gali būti taikomi įvairūs analizės metodai, tokie kaip plonasluoksnė chromatografija (TLC), dujų chromatografija (DC), kapiliarinė elektroforezė ir efektyvioji skysčių chromatografija (ESC).[23]

Dėl kelių priežasčių stengiamasi nustatyti amino rūgščių sudėtį maisto produktuose: bandoma išsiaiškinti jų galimą toksinį poveikį organizmui ir sukeliamas nepageidaujamas reakcijas, taip pat

žinant amino rūgščių sudėtį galima nustatyti maisto produktų kokybiškumą. Amino rūgščių analizė atliekama norint užtikrinti žaliavų, tarpinių ir galutinių produktų kokybės kontrolę, taip pat siekiant stebėti fermentacijos procesus organizme [23,29].

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Kiekybiškai ištirti ir įvertinti Lietuvoje kultivuojamų pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklose esančias laisvąsias amino rūgštis.

Darbo uždaviniai:

1. Remiantis moksliniais straipsniais parengti literatūros apžvalgą.

2. Paruošti surinktas pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklas eksperimentiniams tyrimams, atlikti mėginių ekstrakciją pritaikant derivatizacijos metodą.

3. Dujų chromatografijos/masių spektrometrijos metodu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti laisvąsias amino rūgštis.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) morfologija

Pluoštinė kanapė (Cannabis sativa L.) – tai vienmetis, žolinis, žydintis augalas. Kanapė kilusi iš Vakarų ir Centrinės Azijos, priklauso kanapinių (Cannabaceae) šeimai, augalas dažniausiai užauga iki 2 metrų aukščio, bet kartais gali pasiekti ir 5 metrų aukštį. Stiebas tiesus, status ir plaukuotas, žalios spalvos. Lapai priešiniai, siauri, ilgi, pirštiškai suskaldyti ir turi plaukuotus lapkočius, ant stiebo dažniausiai yra po 5-9 lapus, . Augalas turi lancetiškus lapalakščius, kurie taip pat yra giliai pirštiškai suskaldyti ir turi dantytus kraštus, augant forma gali pasikeisti. Šaknis liemeninė, visas augalo šakotumas, jo aukštis gali kisti priklausomai nuo aplinkos sąlygų ir genetinių pakitimų [6,9,16].

Tai dvinamis augalas, moteriškos lyties augalus nuo vyriškos lyties augalų galima atskirti žydėjimo metu, moteriškos lyties kanapės pražysta keliomis dienomis anksčiau. Pluoštinė kanapė žydi birželio – liepos mėnesiais. Moteriški žiedai smulkūs, glaudžiai susijungę į žiedynus, žiedai sudaryti iš 5 žiedlapių, kurie yra baltai žalios spalvos. Taip pat moteriškos lyties augalai turi apgaubtas mezgines, kuriose yra piestelė su purkomis. Vyriškos lyties augalai turi geltonai žalius žiedlapius, jie gaubia 5 kuokelius su dulkinėmis, kuriose auginamos žiedadulkes. Augalai apdulkinami vėjo, jų žiedai nedideli, neryškių spalvų, todėl nepritraukia vabzdžių. Augalo lytį taip pat galima atskirti pagal tai, jog moteriškos lyties kanapės turi trumpesnius ir storesnius kotelius, su daugiau lapų, o vyriškos lyties kanapės koteliai ploni ir aukšti, bet turi mažiau lapų [25].

Pluoštinės kanapės vaisius – dviskiltis riešutėlis šviesiai rudos, pilkšvos spalvos, dažniausiai vadinami sėklomis. Vaisių dydis įvairus 2,5-4mm pločio ir 2,5-3,5mm ilgio, dažniausiai ovalūs, turi ploną apvalkalėlį. Stebint sėklas mikroskopu, galima pastebėti, jog apvalkalėlis yra tinklinio paviršiaus. Pluoštinės kanapės sėklose randama apie 30-35% aliejaus ir apie 20% baltymų. Kanapių sėklos plačiai naudojamos maisto pramonėje dėl savo skonio, pagardinant patiekalus, taip pat dėl maistingumo ir jose esančių vertingų medžiagų, tokių kaip omega-3, omega-6 ir omega-9 riebiųjų rūgščių. Klimato sąlygos ir derliaus nurinkimo data turi įtakos sėklų kokybei ir jų savybėms [13,24].

Pluoštinė kanapė auga saulėtose vietose, drėgname dirvožemyje, kur gausu maistinių medžiagų, auga atvirose vietose, kur randamas didelis kiekis vandens. Norint išauginti kokybiškas kanapes, jos turėtų būti sėjamos tam tikru atstumu viena nuo kitos, jog nevyktų konkurencijos tarp augalų dėl vandens ir maistinių medžiagų [16].

1.2.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) kultivavimas

Kai kurios augalo dalys yra kultivuojamas augimo metu, augalas subręsta rugpjūtį, rugsėjį ir spalį po trijų – penkių mėnesių augimo. Visas augalo stiebas su lapais, žiedais ir vaisiais nupjaunamas prie žemiausiai esančių apatinių šakų. Augalai dedami ant popierinių ar plastikinių lakštų ir džiovinami ore, kambario temperatūroje. Išdžiūvę lapai ir žiedai nuo stiebų nurenkami rankomis, o sėklos atskiriamos mechaniniu sėklų separatoriumi. Sausos augalo dalys laikomos talpyklose pagamintose iš pluošto, o likę stiebai sudeginami. Sudžiovintos lapų dalys persijojamos per tinklelį, stiebo likučiai pašalinami rankiniu būdu [27,2].

1.3.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) cheminė charakteristika

Pluoštinių kanapių cheminė sudėtis labai sudėtinga dėl jų komponentų įvairumo ir dėl galimų jų tarpusavio sąveikų. Kanapėse esantys junginiai priklauso beveik visoms cheminių junginių klasėms, pavyzdžiui: monoterpenams ir seksviterpenams, cukrams, angliavandeniams, steroidams, flavanoidams, azoto junginiams ir amino rūgštims, bei daugeliui kitų. Geriausiai žinoma ir labiausiai specifinė cheminių junginių klasė kanapėje yra terpenofenoliniai kanabinoidai, kurios atstovas tetrahidrokanabinolis (THC), stipriausiai psichiką veikianti cheminė medžiaga.

Sintetinių kanabinoidų vystymasis ir chemiškai skirtingų endogeninių kanabinoidų receptorių ligandų (endokanabinoidų) atradimas paskatino termino „fitokanabinoidai“ vartojimą apibūdinant šiuos junginius. Bendras identifikuotų natūralių junginių skaičius pluoštinėje kanapėje 1980 metais buvo 423, 1995 – 483, vykdant įvairius tyrimus su kanapėmis vis dar atrandama po kelis naujus junginius [37].

Šiuo metu pluoštinėje kanapėje yra nustatyta 489 junginiai, iš jų 70 yra kanabinoidai, 27 azoto junginiai ir 18 amino rūgščių, 3 baltymai ir 6 fermentai, 2 glikoproteinai, 34 cukrai ir jiems panašūs junginiai, 50 angliavandenių, 7 paprasti alkoholiai ir 12 aldehidų, 13 ketonų ir 20 paprastų rūgščių, 23 riebalų rūgštis, 12 paprastų esterių, 1 laktonas, 11 steroidų, 120 terpenų, 25 ne kanabinoidiniai fenoliai, 23 flavanoidai, 1 vitaminas, 2 pigmentai ir 9 cheminiai elementai [31,12].

Pluoštinių kanapių sėklose yra gausu vitamino A, C ir E, mineralų, β-karoteno ir teigiama, jog jos turi išskirtinę maistinę vertę. Jose yra 20-25% baltymų, 20-30% angliavandenių, 25-35% aliejaus, 10-15% netirpių skaidulų ir daug mineralų, tokių kaip fosforo, kalio, magnio, sieros ir kalcio, taip pat nedidelis kiekis geležies ir cinko, kuris yra svarbus fermento ko-faktoriui, dėl riebiųjų rūgščių metabolizmo žmogaus organizme. Pluoštinių kanapių sėklos turi teigiamos naudos mažinant cholesterolio kiekį ir aukštą kraujo spaudimą. Nuo senų laikų sėklos būdavo vartojamos maisto pramonėje, liaudies medicinoje, taip pat kaip paukščių ir žuvų pašaras [8,13].

Sėklose gausu aukštos kokybės baltymų, jie lengvai virškinami, absorbuojami ir šalinami. Pagrindiniai du baltymai esantys sėklose yra globulinas edestinas ir albuminas. Edestinas atlieka sandėlinę funkciją, jame yra didelis arginino ir glutamo rūgšties kiekis, jis lengvai virškinamas ir turi daug nepakeičiamų amino rūgščių savo sudėtyje. Sėklose amino rūgščių sudėtis priklauso nuo genotipo įvairumo bei agronominių sąlygų, pagal tai vertinama jų maistinė vertė. Baltymų virškinimą organizme gali paveikti jo struktūra, nemaistingų junginių kiekis ir aukšta temperatūra. Atlikus įvairius tyrimus su pluoštinių kanapių produktais buvo rastas nedidelis nemaistingų junginių kiekis, dėl kurio tokius produktus reikėtų vartoti saikingai. Sėklose esantis fitino rūgšties ir tripsino inhibitoriaus kiekis nedidelis palyginus su kitais augalais. Fitino rūgštis yra pagrindinė organinio fosforo forma sėklose, ji mažina baltymų virškinimo greitį ir padidina endogeninio azoto, amino rūgščių ir mineralų išsiskyrimą iš dvivalenčių katijonų. Tripsino inhibitorius dažniausiai randamas augaluose, kurie priklauso Leguminosae L., Brassicacae L. ir Gramineae L. šeimoms, jis mažina tripsino fermentų biologinį aktyvumą, o tripsino fermentai dalyvauja skaidant įvairius baltymus [11,15].

1.4.Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) biologinis poveikis

Vis daugiau atliekama tyrimų su pluoštinėmis kanapėmis, norint įrodyti jos poveikį gydant įvairias ligas ar ligų sukeltus simptomus. Kanapių produktai anksčiau buvo skiriami kaip nuskausminamieji, atsikosėjimą lengvinantys vaistai, gydant astmą, taip pat kaip raminantys ar migdantys vaistai [39,22].

Kanapės gali būti vartojamos norit gydyti chemoterapijos sukeltus šalutinius simptomus, tokius kaip pykinimą ir vėmimą. Kanabinoidai sąveikauja su įvairiais neurotransmiteriais ir neuromoduliatoriais, tokiais kaip gama aminobutyro rūgštimi (GABA), histaminu, seratoninu, dopaminu, glutamatu, norepinefrinu, prostaglandinais ir opioidiniais peptidais. Pacientai nurodo, jog chemoterapijos gydymo sunkiausi šalutiniai poveikiai yra pykinimas ir vėmimas, kurie gali būti ūmios, lėtinės ar laukiančios reakcijos. Apie tris ketvirtadalius vėžiu sergančių pacientų susiduria su vėmimu, kurį sukelia chemoterapijos gydymas, dėl tokių reakcijų pacientams gali atsirasti nerimas, bejėgiškumo jausmas ir depresija. Šiuo metu yra užregistruoti keli sintetiniai kanabinoidiniai vaistai, kurie skiriami gydyti chemoterapijos sukeltas šalutines reakcijas, šie vaistai buvo įvertinti klinikiniais tyrimais, kurių metu dalyvavo pacientai gaunantys chemoterapinį gydymą ir dėl jo patiriantys pykinimą ir vėmimą. Keli iš užregistruotų vaistų yra delta-9-THC, nabilonas ir levonantradolis [22,20].

Ikiklinikiniais ir klinikiniais tyrimais įrodyta, jog pluoštinėse kanapėse esantis kanabidiolis (CBD) yra efektyvus, saugus ir gerai toleruojamas alternatyvus vaistas gydant pacientus sergančius šizofrenija. CBD pasižymi raminančiu ir antipsichoziniu poveikiu.

Norint įrodyti CBD raminantį poveikį buvo atliktas dvigubai aklas tyrimas, kuriame dalyvavo sveiki savanoriai, CBD buvo lyginamas su ipsapironu (5mg), diazepamu (10mg) ir placebu. Testo rezultatai parodė, jog CBD kaip ir kiti du raminamieji sumažino nerimą, kuris buvo sukeltas bandymo metu. Taip pat buvo atliktas tyrimas tiriant regioninės smegenų kraujotakos greitį panaudojant vieno fotono emisijos kompiuterinę tomografiją. Tokia procedūra leidžia įvertinti raminamųjų vaistų poveikį. Atlikus tyrimus su gyvūnais gauti panašūs rezultatai, tai leido teigti, jog CBD turi raminantį poveikį.

Vertinant CBD antipsichozinį poveikį buvo naudojami gyvūnų modeliai, norint pagrįsti šizofrenijos neurocheminę hipotezę, kuri daugiausiai susijusi su neurotransmiteriais tokiais kaip dopaminas ir glutamatas. Atliktas tyrimas su pelėmis, kuriame buvo lyginamas CBD ir haloperidolis, buvo stebima dopamino receptorių blokavimas, bet šis mechanizmas nėra vienintelis antipsichoziniam veikimui įrodyti. Kitas antipsichozinis vaistas klozapinas, tyrimais įrodyta, jog jo veikimo mechanizmas susijęs su N-metil-D-asparto rūgšties (NMDA) receptoriais. CBD kaip ir haloperidolis sumažino pelėms apimorfino sukeltą būdingą elgesį ir padidino prolaktino koncentraciją plazmoje. Tačiau CBD priešingai nei haloperidolis nesukelia katalepsijos, kaip ir klozapinas. Gauti rezultatai parodė, jog CBD priklauso netipiniams antipsichoziniams vaistams [42].

Tyrimais įrodyta, jog THC, taip pat kiti nesintetiniai kanabinoidai, sintetiniai kanabinoidų agonistai ir endokanabinoidai turi priešvėžinį veikimą plaučių karcinomoms, skydliaukės epiteliui, odos, gimdos, krūties ir prostatos karcinomoms. Kanabinoidų priešvėžinio veikimo mechanizmas nėra iki galo aiškus ir ištirtas, todėl vykdomi tolimesni tyrimai, bet jie gali sukelti kai kurių vėžinių ląstelių apoptozę ir slopinti angiogenezę [14].

Nepaisant to, jog yra daugiau nei 20 skirtingų vaistų nuo traukulių, bet apie 30% žmonių sergančių epilepsija vis dar patiria traukulius. Per kelis dešimtmečius užregistruotų daugelio naujų vaistų nuo traukulių, tarp jų ir keletas su naujais mechanizmais, nesumažino pacientų skaičiaus, kurie vis dar patiria traukulius sergant epilepsija. Šių vaistų šalutiniai poveikiai susiję su centrine nervų sistema yra dažni ir turi didelės įtakos pacientų gyvenimo kokybei. Dėl šios priežasties vis daugiau žmonių ieško alternatyvių gydymo būdų. Spaudoje ir socialiniuose tinkluose plinta istorijos, kaip drąstiškai pagerėjo traukulių kontroliavimas vaikams sergantiems epilepsija, kurie naudojo alternatyvų gydymą kanapėmis [7].

Atlikti tyrimai su kanabidioliu, panaudojant gyvūnų modelius, norint pagrįsti teorija, jog kanabidiolis mažina traukulius. Tyrime buvo tiriama antiepilepsinis ir prieštraukulinis poveikis, panaudojant elektrofiziologiją in vitro ir gyvūnų traukulių modelius in vivo. Įvertinus visus gautus rezultatus, tyrimas parodė, jog kanabidiolis nepriklausomai nuo CB1 receptorių buvimo, slopino

epilepsijos poveikį in vitro ir sumažino traukulių atsiradimus in vivo [17].

Pluoštinėje kanapėje randami kanabinoidai, galėtų būti vieni iš potencialių vaistų gydant demenciją. Norint įrodyti jų veiksmingumą, buvo atliktas dvigubai aklas, randomizuotas, placebu

kontroliuojamas tyrimas. Jame dalyvavo įvairaus amžiaus ir skirtingų lyčių pacientai, kuriems buvo diagnozuota įvairaus sunkumo Alzhaimerio, kraujagyslinė, mišri ar nespecifinė demencija. Jiems buvo skiriamos, įvairios dozės ir įvairių formų kanabinoidai. Gauti rezultatai parodė ligos simptomų pagerėjimą pacientų grupei vartojantiems dronabinolį, nei placebo grupei. Tačiau sunku įrodyti jo veiksmingumą, nes šiuo metu trūksta klinikinių tyrimų [18].

Klinikiniais tyrimais įrodyta, jog nedidelės oralinės kanabinoidų dozės slopina aterosklerozės progresavimą. Tyrimai atlikti su pelėmis, buvo naudojamos mažos THC dozės. Manoma, jog prieš aterosklerozinis poveikis susijęs su CB2 receptoriais, kurie susiję su makrofagų ir T limfocitų judėjimu

aterosklerozės metu. THC sumažina monocitų/makrofagų, bei limfocitų migraciją į uždegimo vietą. Gauti tyrimo rezultatai parodė, jog kanabinoidų dariniai, kurie jungiasi prie CB2 receptorių, gali būti

naudingi junginiai gydant ateroslerozę [34].

Per kelis dešimtmečius vis daugiau atliekama tyrimų su kanapėmis ir jose esančiais biologiškai aktyviais junginiais, tyrimų rezultatai rodo, jog kanabinoidai gali būti kaip alternatyvi gydymo priemonė gydant tokias ligas kaip šizofreniją, epilepsiją ir jos sukeltus traukulius, demenciją ir aterosklerozę, kanabinoidai pasižymi raminančiu, antipsichoziniu ir antiemetinėmis savybėmis. Tačiau ne visos savybės ir šalutinės reakcijos yra žinomos, todėl reikia išsamesnių tyrimų norint užtikrinti saugų ir efektyvų kanapių vartojimą.

1.5.Amino rūgštys

Amino rūgštys (AR) – tai organinių junginių grupė, jos gali būti alfa, beta, gama ir kt. amino rūgštys. Daugiausiai yra α amino rūgščių, prie jų α anglies atomo yra prisijungusios –NH2 ir –COOH

funkcinės grupės, β amino rūgštys, tai tokios rūgštys kurių –NH2 ir –COOH funkcinės grupės

prisijungusios prie β anglies atomo. α amino rūgštys skiriasi pagal tai koks radikalas yra prisijungęs prie α anglies atomo. Dėl amino rūgščių šoninių grandinių įvairumo, kiekviena rūgštis pasižymi skirtingomis biologinėmis savybėmis. Dažniausiai amino rūgštys yra stabilios vandeniniame tirpale, kai pH yra fiziologinis, išskyrus glutamatą, kuris lėtai ciklinamas iki piroglutamato ir cisteiną, kuris greitai oksiduojamas iki cistino [40,41].

Gamtoje randama daugiau kaip 300 amino rūgščių, iš kurių tik 20 α amino rūgščių sudaro baltymus. Tačiau baltymus nesudarančios α amino rūgštys, tokios kaip ornitinas, citrulinas ir homocisteinas ir ne α amino rūgštys, tokios kaip taurinas ir β-alaninas taip pat atlieka svarbų vaidmenį ląstelių metabolizme [40].

Iš amino rūgščių taip pat sintezuojami ir mažos molekulinės masės junginiai, tokie kaip NO, poliaminai, glutationas, kreatinas, karnitinas, karnozinas, skydliaukės hormonai, serotoninas, melaninas,

reikalingos melatonino ir hemoglobino sinteze, visi šie junginiai labai svarbūs organizmo fiziologijai [41].

Kai kurios amino rūgštys tokios kaip glicinas, alaninas, prolinas ir kt. gali būti vadinamos „osmolitais“ arba „suderintais tirpalais“, nes šie mažos molekulinės masės junginiai kaupiasi ląstelėse, kad padidintų osmosinį slėgį, kai aplinkoje atsiranda didelės koncentracijos druskų. „Suderintais tirpiklais“ šios amino rūgštys vadinamos dėl jų gero suderinamumo su junginiais, kurių molekulinė masė didesnė, ląstelėse dera jų struktūros ir funkcijos. Šie junginiai dažniausiai nesąveikauja su fermentais ir nesutrikdo jų veiklos, taip pat jie nekeičia funkcinių baltymų struktūrų. Dėl šių priežasčių amino rūgštys gali būti naudojamos norint stabilizuoti baltymus, nekeičiant jų funkcijos [5].

Keletas amino rūgščių atlieka svarbų vaidmenį imuninėje sistemoje. Pavyzdžiui alaninas yra vienas pagrindinių substratų sintezuojant gliukozę, kuri reikalinga kaip energijos šaltinis gaminant leukocitus. Tyrimais įrodyta, jog padidinus alanino kiekį kultūros terpėje, yra išvengiama ląstelių apoptozės ir padidėja antikūnių gamyba B limfocituose. Pagrindinis mechanizmas nėra žinomas, bet manoma, jog tai susiję su baltymų skilimo slopinimu imunocituose. Reikalingi išsamesni tyrimai, norint išsiaiškinti jo poveikį, bet alanino įtraukimas į pacientų mitybą, kuriems paskirta parenteralinė mityba galėtų žymiai pagerinti gliukoneogenezę ir leukocitų metabolizmą. Argininas svarbus insulino, augimo hormono, prolaktino ir insulino augimo faktoriaus sintezei. Insulinas ir augimo hormonas reguliuoja gliukozės ir amino rūgščių metabolizmą pagrindiniuose audiniuose, tokiuose kaip skeleto raumenyse, riebaliniame audinyje, kepenyse ir širdyje, taip daro įtaką maistingų medžiagų prieinamumui leukocitams, kuriems jos būtinos sintezei ir augimui. Augimo hormonas taip pat gali padidinti T limfocitų gamybą užkrūčio liaukoje, hematopoetiškų ląstelių skaičių kaulų čiulpuose. Insulino augimo faktorius skatina limfocitų brendimą kaulų čiulpuose, padidina jų skaičių ir aktyvumą [10].

Amino rūgštys yra ne tik svarbūs tarpiniai metabolitai, bet jos veikia ir kaip signalūs perduodančios molekulės, kurios turi įtakos insulino susidarymui. Insulino gamybos stimuliavimas β-ląstelėse signalizuojant amino rūgštimis stiprina amino rūgščių anabolines savybes ir pabrėžia jų svarbą ląstelių metabolizme [30].

1.6.Amino rūgščių klasifikacija

Amino rūgštys gali būti klasifikuojamos pagal sintezės procesus, kuriuos atlieka organizme, jos gali būti:

 Nepakeičiamos amino rūgštys, tokios rūgštys organizme nesintetinamos, jos gali būti gaunamos tik su maistu. Tai treoninas, metioninas, valinas, fenilalaninas, leucinas, izoleucinas, lizinas ir triptofanas.

 Dalinai pakeičiamos amino rūgštys, tai tokios rūgštys, kurias organizmas gali sintetinti tuo atveju, kai organizme yra didelis kiekis nepakeičiamų rūgščių. Tai argininas ir histidinas.

 Pakeičiamos amino rūgštys, tokios rūgštys, kurias organizme galime susintetinti iš kitų organinių junginių. Tai alaninas, glicinas, serinas, cistinas, glutaminas, glutamatas, aspartamo rūgštis, asparaginas, prolinas ir tirozinas.

Tačiau reikia nepamiršti, jog visos 20 amino rūgštys yra reikalingos norint palaikyti normalią ląstelių funkciją ir fiziologiją. Pakitęs amino rūgščių metabolizmas, sutrikdo organizmo homeostazę, stabdo augimą ir netgi gali sukelti mirtį.

Amino rūgštys taip pat gali būti klasifikuojamos pagal tai kokius turi prisijungusius radikalus prie šoninės grandinės [28].

 Alifatinės amino rūgštys: glicinas, alaninas, valinas, leucinas, izoleucinas ir prolinas. (1 pav.) [28].

 Aromatinės amino rūgštys: fenilalaninas, tirozinas ir triptofanas. (2 pav.) [28].

Glicinas

Alaninas Valinas Leucinas

Izoleucinas Prolinas

1 pav. Alifatinės amino rūgštys [28]

Fenilalaninas Tirozinas Triptofanas

 Bazinės amino rūgštys: lizinas, argininas ir histidinas. (3 pav.) [28]

 Rūgščios amino rūgštys: asparatamo rūgštis, glutamatas (glutamato rūgštis). (4 pav.) [28].

 Amidinės amino rūgštys: asparaginas ir glutaminas. (5 pav.) [28].

 Hidroksi amino rūgštys: serinas ir treoninas. (6 pav.) [28].

Lizinas _{Argininas Histidinas}

3 pav. Bazinės amino rūgštys [28]

Aspartamo rūgštis Glutamatas

4 pav. Rūgščios amino rūgštys [28]

Asparaginas _Glutaminas

 Amino rūgštys, turinčios SH radikalą: cisteinas ir metioninas. (7 pav.) [28].

1.7.Amino rūgščių nustatymo metodai

Yra keletas priežasčių, kodėl bandoma nustatyti amino rūgščių sudėtį maisto produktuose: norima išsiaiškinti jų galimą toksinį poveikį organizme, pagal amino rūgščių sudėtį galima nustatyti maisto produktų kokybiškumą. Amino rūgščių analizė atliekama norint užtikrinti žaliavų, tarpinių ir galutinių produktų kokybės kontrolę ir norint stebėti fermentacijos procesus.

Analizuojant amino rūgštis maisto produktuose, yra pritaikomi įvairūs analizės metodai, tokie kaip plonasluoksnė chromatografija (TLC), dujų chromatografija (DC), kapiliarinė elektroforezė ir efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) [30].

Plonasluoksnė chromatografija palyginus su dujų ir efektyviąja skysčių chromatografija nėra tokia tiksli atskiriant junginius vieną nuo kito, tačiau šis metodas yra greitas atskiriant įvairius junginius įvairiose kompleksinėse matriksose tuo pačiu metu, dėl to, jog mėginio išvalymo žingsnis dažniausiai yra išvengiamas arba būna minimalus. Taip pat lyginant su efektyviąja skysčių chromatografija nėra jokių apribojimų pasirenkant mobiliosios fazės tirpiklius. Norint padidinti analizės metodo efektyvumą ir jautrumą galima kartu naudoti ir masių spektrometriją (MS) [28].

Serinas Treoninas

6 pav. Hidroksi amino rūgštys [28]

Cisteinas Metioninas

Taikant kapiliarinės elektroforezės metodą, analizuojamos medžiagos atskiriamos viena nuo kitos pagal skirtingas mases ir krūvį, tai turi įtakos jonų judėjimui kapiliaro viduje pro elektrolito tirpalą, kai paleidžiama elektra. Šio metodo privalumai: reikalingi nedideli bandinių ir tirpiklių kiekiai, didelis selektyvumas, mažos sąnaudos ir greita analizė. Taip pat kapiriarinė elektroforezė lyginant su skysčių chromatografija yra mažiau kenksminga aplinkai, dėl mažo susidariusių atliekų kiekio ir nedidelio naudojamų organinių tirpiklių kiekio [21].

Efektyvioji skysčių chromatografija, tai įvairių medžiagų skirstymas, kuris vyksta dėl skirtingo analičių giminingumo fazės paviršiui. Skirstymas vyksta kolonėlėse, kurios pagamintos iš nerūdijančio plieno, jose esančios poros būna pripildytos nejudančiąja faze. ESC gali būti klasifikuojama pagal išskirstymo mechanizmą: jonų mainų, gelchromatografija, pasiskirstymo, chiralinė, afininė ir adsorbcijos chromatografijos. ESC metodo skirstymas taip pat gali būti priklausomas nuo naudojamo tirpiklio ir nejudančiosios fazės poliškumo: normalių fazių, kai nejudri fazė poliškesnė už judrią fazę ir atvirkštinių fazių, kai judri fazė poliškesnė už nejudrią fazę. Palyginus su kitais chromatografijos metodais, šis metodas yra jautrus, galima tiksliausiai nustatyti kiekybinius tiriamų medžiagų rodiklius, platus pritaikymas tiriant įvairius junginius, tačiau šio metodo įranga yra brangi ir su ja gali dirbti tik tam kvalifikuotas personalas [33,1].

Dujų chromatografijos analizės metodas gana greitas ir patogus. Tai toks išskirstymo metodas, kuriame judri fazė yra dujos, šios dujos turi nereaguoti su tiriamo mėginio junginiais. Dažniausiai dujų chromatografijos metodas naudojamas lakiems ir termostabiliems, aukštoje temperatūroje neskylantiems junginiams. Naudojamos dujos gali būti vandenilis, argonas, helis, anglies dioksidas ir azotas.[32]

Dažniausiai analizuojant amino rūgštis naudojamos jonų mainų arba efektyviosios skysčių chromatografijos, tačiau analizuojant šiais metodais išskirstymo laikas gali būti gana ilgas ir junginių atskyrimui gali trukdyti matriksos poveikis junginiams. Analizuojant amino rūgštis dujų chromatografijos metodu atliekama derivatizacija, kuri gali pagerinti junginių stabilumą ir padidinti detektoriaus jautrumą. Laisvosios amino rūgštys gali būti derivatizuojamos tiesiogiai į vandeninius tirpalus su alkil chloroformatais. Pavyzdžiui derivatizuojant amino rūgštis su propilo chloroformatu gauti dariniai gali būti ekstrahuojami su organiniais tirpikliais ir tiesiogiai injekuojami į DC/MS aparatą [3].

2. TYRIMO METODIKA

2.1.Tyrimo objektas

Tyrimo objektas buvo pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) sėklos. Pasirinktos 6 pluoštinių kanapių sėklų veilės, kurios buvo užkoduotos ARG B1 – Finola veislė, surinkta Panevėžio raj., ARG B2 – Futura 75 veislė, surinkta Anykščių raj., ARG B3 – Futura 75 veislė, surinkta Marijampolės raj., ARG W1 – Futura 75 veislė, surinkta Rokiškio raj., Panemunėlio m., ARG W2 – Finola veislė, surinkta Anykščių raj., ARG W3 – Finola veislė, surinkta Kupiškio raj. Vykdant tyrimą su žaliomis sėklomis, buvo nuspręsta tas pačias sėklų veisles pakepinti ir palyginti tarpusavyje gautus rezultatus.

2.2.Cheminiai reagentai

Šiame tyrime buvo naudoti tokie reagentai:

1) 16 amino rūgščių standartai: L-alaninas (Ala), L-glicinas (Gly), L-valinas (Val), L-leucinas (Leu), izoleucinas (Ile), prolinas (Pro), metioninas (Met), serinas (Ser), treoninas (Thr), L-fenilalaninas (Phe), L-aspartamo rūgštis (Asp), L-glutamatas (Glu), L-lizinas (Lys), L-histidinas (His), L-tirozinas (Tyr), L-cistinas (Cyt) (Sigma-Aldrih);

2) Derivatizatorius naudotas N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyl-trifluoroacetamide (>97%, Sigma-Aldrih);

3) Ekstrahentas - metanolis (99,9%, Sigma-Aldrih); 4) Tirpiklis - acetonitrilas (99,9%, Sigma-Aldrih);

2.3.Aparatūra

Tyrimas atliktas su dujų chromatografu Shimadzu (SHIMADZU GC-2010 PLUS, Japonija). Analizei naudota silikagelio kolonėlė, kurios ilgis 35m, diametras 0,25mm ir nejudančios fazės storis 0,25μm. Injekcijos tūris 1µl, injekavimo temperatūra 260o_{C, naudotas masių spektrometrijos}

detektorius. Tyrime naudotos helio dujos.

Nuodžiūvis buvo nustatytas su drėgmės analizatoriumi KernandSohn, DBS-60-3 (Balingen, Vokietija).

Pluoštinių kanapių sėklos buvo atsvertos su Shimadzu AUW120D (Bellingen, Vokietija) svarstyklėmis.

Žaliava susmulkinta su IKA A11 Basic (Vokietija) smulkinimo aparatu.

Žaliavos ekstrakcija buvo atlikta ultragarso bangų vonelėje BioSonic UC100 (Mavajai, JAV). Tirpalų lašinimui buvo panaudotos automatinės pipetės (Eppendorf Research, JAV).

2.4.Tyrimų metodika

2.4.1.Tiriamojo mėginio paruošimas

2.4.1.1.Nuodžiūvis

Pirmiausia buvo įvertinta tiriamos žaliavos kokybė, apskaičiuojant jos nuodžiūvį. Žaliavos nuodžiūvis – tai masės sumažėjimas, kai veikiant žaliavą karščiu yra išgarinami lakieji junginiai ir jos drėgmė. Atliekant šį tyrimą žaliava džiovinama iki pastovios masės ir apskaičiuojama masės procentais (m/m). Nuodžiūvio tyrimas buvo atliktas naudojant drėgmės analizatorių. Atsvertas 1g susmulkintų pluoštinių kanapių sėklų, buvo plonu sluoksniu paskirstytos ant drėgmės analizatoriaus lėkštelės ir džiovinama 5 minutes, 120o_{C temperatūroje. Apskaičiuotas nuodžiūvis atitiko reglamentuojamą leistiną}

didžiausią nuodžiūvio kiekį, kuris neturi viršyti 15% [35].

2.4.1.2.Ekstraktų ruošimas

Pluoštinių kanapių sėklos buvo susmulkintos, kiekvienam mėginiui atsverta po 1g susmulkintos žaliavos ir supilta į 25ml tūrio kolbutes. Į kolbutes buvo įpilta po 10ml metanolio, užkimštos kolbutės buvo dedamos į ultragarso bangų vonelę 10 minučių, esant 25o temperatūrai. Gauti ekstraktai buvo dedami į centrifugą ir centrifuguojami 2 minutes, esant 7500 apsisukimo greičiui. Baigus centrifuguoti buvo paimta 100μl ekstrakto ir supilta į tamsaus stiklo, sandariai užsidarančius buteliukus.

2.4.1.3.Amino rūgščių derivatizacija

Tiriant amino rūgštis dujų chromatografijos metodu būtina atlikti derivatizaciją, todėl gautas ekstraktas buvo išgarintas iki sauso likučio su azoto dujomis. Į buteliukus su išgarintu sausu likučiu buvo įpilta 100μl derivatizatoriaus N-tert-Butildimetilsilyl-N-metil-trifluoroacetamido (>97%) ir 100μl acetonitrilo. Buteliukai su gautais tirpalais buvo sandariai uždaryti ir kaitinami 2,5 valandos 100-103o_C

automatinėmis pipetėmis perpilami į skaidraus stiklo buteliukus, paženklinami ir dedami į dujų chromatografą analizuoti.

2.4.2.Amino rūgščių kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos

metodu

Tiriamųjų junginių analizė buvo atliekama su Shimadzu dujų chromatografijos/masių spektrofotometrijos (DC/MS) aparatu. Tyrime naudota silikagelio kolonėlė, kurios ilgis 35m, diametras 0,25mm ir nejudančios fazės storis 0,25μm. Kolonėlės temperatūra 75o_{C, tekėjimo kolonėle greitis}

1,5ml/min, slėgis 100,0kPa, bendras tekėjimo greitis 34,4ml/min, pasirinktos dujos nešėjos – helis. Metodas buvo atliekamas per 41 minutę. Per pirmas 10 tyrimo minučių kolonėlėje temperatūra buvo pakelta iki 75oC, nuo 10 iki 20 tyrimo minutės temperatūra buvo keliama iki 290oC, o tyrimui įpusėjus, nuo 20 iki 41 tyrimo minutės temperatūra buvo pakelta iki 320oC ir laikoma iki tyrimo pabaigos. Mėginių injekavimui buvo naudojamas split 10 (1:10) injekcijos režimas, injekcijos tūris 1μl, injekavimo temperatūra 260o_{C. Tyrimai kartoti po tris kartus, buvo vedamas rezultatų vidurkis ir apskaičiuota}

santykinė paklaida. Tarp tyrimų su tiriamaisiais mėginiais, buvo paleidžiama metodika, naudojant vien tirpiklį – acetonitrilą, norint išvalyti kolonėlę. Šiame tyrime buvo naudojamas masių spektrometrijos detektorius.

2.5.Statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV) programą. Visi bandymai kartoti po tris kartus ir išvestas rezultatų vidurkis ± standartinis nuokrypis (SN). Statistiškai reikšmingas nuokrypis nustatytas, jeigu p<0,05.

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.Skirtingų veislių pluoštinių kanapių sėklų tiriamieji mėginiai

Tyrime buvo naudotos kelios pluoštinių kanapių sėklų veislės, kai kurios sėklų veislės buvo tiriamos žalios, kitos sėklų veislės – kepintos. Buvo lyginami gauti laisvųjų amino rūgščių kiekiai. Kiekvienos veislės bandiniai buvo ruošiami po tris kartus, tiriami, pagal gautus rezultatus buvo išvedamas amino rūgščių koncentracijos vidurkis ir skaičiuota santykinė paklaida.

3.2.Nuodžiūvio nustatymas

Atlikus nuodžiūvio tyrimą, buvo nustatyta, jog pluoštinių kanapių sėklų nuodžiūvis atitiko keliamus reikalavimus, neviršijo 15%, tai didžiausias leidžiamas nuodžiūvio kiekis, kuris yra reglamentuotas Britų farmakopėjoje [35]. Džiovintos ir susmulkintos pluoštinių kanapių sėklos šviesiai rudos, pilkšvos spalvos. Gauti rezultatai parodė, jog žaliava yra kokybiška ir tinkama atlikti tolimesnę analizė. Nustatyti nuodžiūvio kiekiai tiriamuosiuose mėginiuose pateikti 1 lentelėje.

3.3.Metodo validacija

Vertinant metodo validaciją buvo įvertinta amino rūgščių derivatizacijos ir DC/MS analizės procedūros. Norint pilnai įvertinti metodikos procedūras, buvo naudojami amino rūgščių standartiniai mišiniai, su kuriais buvo atliekama derivatizacija, tyrimo analizė atlikta su DC/MS aparatu.

Pluoštinių kanapių sėklų veislės Nuodžiūvio kiekis

ARG B1 5,20±0,12% ARG B2 5,56±0,22% ARG B3 6,48±0,27% ARG W1 5,42±0,19% ARG W2 6,21±0,23% ARG W3 5,63±0,15%

3.4.Amino rūgščių kokybinis įvertinimas tiriamosiose sėklose

Tyriamuosiuose mėginiuose dujų chromatografijos/masių spektrometrijos metodu buvo identifikuota 14-15 laisvųjų amino rūgščių: alaninas (Ala), glicinas (Gly), valinas (Val), L-leucinas (Leu), L-izoL-leucinas (Ile), L-prolinas (Pro), L-metioninas (Met), L-serinas (Ser), L-treoninas (Thr), L-fenilalaninas (Phe), L-aspartamo rūgštis (Asp), L-glutamatas (Glu), L-lizinas (Lys), L-tirozinas (Tyr) ir L-cistinas (Cyt). Vieno iš tirtų mėginių chromatograma pateikiama 8 paveiksle, standarto chromatograma pateikta 9 paveiksle.

8 pav. Tiriamojo mėginio chromatograma

3.5.Kiekybinis amino rūgščių nustatymas pluoštinių kanapių sėklose

Įvertinus pluoštinių kanapių sėklų kokybinę sudėtį, buvo vertinamas kiekybinis gautų junginių pasiskirstymas įvairiose pluoštinių kanapių sėklų veislėse, lyginami gauti amino rūgščių kiekiai žaliose ir keptose sėklose.

Amino rūgšties L-alanino pasiskirstymas bandiniuose pavaizduotas 10 paveiksle

Atlikus kiekybinę tiriamųjų mėginių analizę, rezultatai parodė, jog didesnės L-alanino koncentracijos, lyginant žalias ir kepintas sėklas, buvo nustatytos žaliose pluoštinių kanapių sėklose, tarp jų didžiausia koncentracija buvo aptikta ARG W1 veislės sėklose (1,262±0,041µg/ml), mažesni kiekiai aptikti ARG B3 veislės sėklose (0,853±0,022µg/ml) ir ARG W3 veislės sėklose (0,742±0,012µg/ml), mažiausias kiekis žaliose sėklose buvo nustatyta ARG B2 veislės sėklose (0,637±0,015µg/ml). L-alanino didžiausia koncentracija kepintose sėklose buvo aptikta taip pat ARG W1 veislės sėklose (0,811±0,021µg/ml), mažesni kiekiai gauti ARG B3 veislės sėklose (0,781±0,017µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose (0,577±0,016µg/ml), o mažiausia koncentracija nustatyta ARG B2 veislės sėklose (0,422±0,011µg/ml). Palyginus gautus rezultatus, L-alanino didesnės koncentracijos buvo gautos žaliose pluoštinių kanapių sėklose, lyginant su keptomis.

L-glicino kiekybinis pasiskirstymas mėginiuose pavaizduotas 11 paveiksle. 10 pav. L-alanino kiekis (µg/ml) skirtinguose pluoštinių kanapių sėklų

Atlikus tiriamųjų mėginių analizę, buvo nustatyta, jog didesnės L-glicino koncentracijos buvo aptiktos kepintose pluoštinių kanapių sėklose. Iš jų didžiausia L-glicino koncentracija nustatyta ARG W1 veislės sėklose (1,342±0,053µg/ml), mažesnės koncentracijos buvo gautos ARG B3 veislės sėklose (1,319±0,048µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose, o mažiausia koncentracija nustatyta ARG B2 veislės sėklose (1,246±0,034µg/ml). Žaliose kanapių sėklose didžiausia L-glicino koncentracija aptikta ARG B3 veislės sėklose (1,296±0,031µg/ml), mažesnės koncentracijos buvo ARG W3 veislės sėklose (1,288±0,039µg/ml) ir ARG W1 veislės sėklose (1,275±0,039µg/ml), o mažiausia koncentracija nustatyta ARG B2 sėklose (1,218±0,046µg/ml). L-glicino didesnės koncentracijos nustatytos kepintose sėklose, nei žaliose. Todėl galima manyti, jog pakepinus žalias pluoštinių kanapių sėklas, išsiskyrė didesnis laisvo L-glicino kiekis.

L-leucino kiekybinis pasiskirstymas paruoštuose mėginiuose pavaizduotas 12 paveiksle. 11 pav. L-glicino kiekis (µg/ml) skirtinguose tiriamuosiuose pluoštinių kanapių

Atlikta kiekybinė L-leucino amino rūgšties analizė parodė, jog lyginant kepintas ir žalias sėklas buvo gauti nedideli koncentracijų skirtumai, didžiausias šios rūgšties kiekis nustatytas žaliose ARG W1 veislės sėklose (0,781±0,017µg/ml), kepintose ARG B2 veislės sėklose (0,711±0,025µg/ml) ir kepintose ARG W3 veislės sėklose (0,762±0,021µg/ml), mažesni kiekiai aptikti žaliose ARG W2 veislės sėklose (0,757±0,027µg/ml) ir kepintose ARG W1 veislės sėklose (0,756±0,014µg/ml), o mažiausios koncentracijos aptiktos kepintose ARG W2 veislės sėklose (0,714±0,012µg/ml) ir žaliose ARG B3 veislės sėklose (0,712±0,009µg/ml). Palyginus gautas L-leucino koncentracijas žaliose ir kepintose pluoštinių kanapių sėklose, buvo gautos skirtingos koncentracijos, trijose veislėse didesnis kiekis buvo aptiktas žaliose sėklose, kitose trijose – kepintose sėklose.

L-prolino kiekybinis pasiskirstymas bandiniuose pavaizduotas 13 paveiksle. 12 pav. L-leucino kiekio (µg/ml) pasiskirstymas skirtinguose pluoštinių

Tiriant amino rūgšties L-prolino koncentraciją pluoštinių kanapių sėklose, rezultatai parodė, jog žymiai didesni kiekiai buvo aptikti žaliose sėklose. Didžiausia rūgšties koncentracija žaliose sėklose buvo gauta ARG W1 veislės žaliavoje (3,614±0,084µg/ml), mažesni kiekiai - ARG W2 veislės sėklose (2,921±0,053µg/ml) ir ARG B3 žaliavoje (2,547±0.061µg/ml), mažiausia amino rūgšties koncentracija žaliose sėklose buvo gauta ARG B2 žaliavoje (0,333±0,004µg/ml). Kepintose pluoštinių kanapių sėklose didžiausios L-prolino koncentracijos buvo nustatytos ARG B3 veislės sėklose (1,286±0,022µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose (1,244±0,028µg/ml), mažesnės koncentracijos aptiktos ARG W3 veislės sėklose (0,958±0,021µg/ml), ARG W1 veislės sėklose (0,759±0,014µg/ml) ir ARG B1 veislės sėklose (0,715±0,011µg/ml), o mažiausia koncentracija kepintose sėklose buvo aptikta ARG B2 veislės sėklose (0,098±0,002µg/ml) ARG B1 žaliavoje (1,098±0,019µg/ml) ir kepintose sėklose ARG W1 (0,759±0,014µg/ml), o mažiausia koncentracija buvo gauta ARG B2 žaliavoje (0,333±0,004µg/ml). Gauti duomenys parodė, jog L-prolino rūgšties koncentracija buvo ženkliai didesnė žaliose sėklose lyginant su keptomis. Galima manyti, jog šios amino rūgšties išsiskyrimui turi įtakos sėklų apdorojimas, veikiant jas karščiu L-prolino išsiskyrimas mažėja.

L-metionino rūgšties kiekybinis pasiskirstymas paruoštuose mėginiuose pavaizduotas 14 paveiksle.

13 pav. L-prolino kiekio (µg/ml) pasiskirstymas skirtinguose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose

Atlikus tyrimą, pagal gautus duomenis buvo nustatyta, jog L-metionino didesnės koncentracijos aptiktos kepintose pluoštinių kanapių sėklose. Didžiausios šios amino rūgšties koncentracijos kepintose sėklose buvo nustatytos ARG B3 veislės sėklose (4,111±0,174µg/ml) ir ARG W1 veislės sėklose (3,948±0,11µg/ml), mažesni kiekiai - ARG B1 veislės sėklose (3,687±0,098µg/ml), ARG W3 veislės sėklose (3,361±0,103µg/ml) ir ARG B2 veislės sėklose (3,249±0,101µg/ml), o mažiausia koncentracija kepintose sėklose aptikta ARG W2 veislės sėklose (3,078±0,114µg/ml). Didžiausia L-metionino koncentracija žaliose sėklose nustatyta ARG W1 veislės sėklose (3,482±0,097µg/ml), šiek tiek mažesnės koncentracijos - ARG W2 veislės sėklose (3,361±0,109µg/ml), ARG B1 veislės sėklose (3,247±0,095µg/ml) ir ARG B3 veislės sėklose (3,238±0,095µg/ml), o mažiausias kiekis žaliose sėklose buvo gautas ARG W2 veislės sėklose (2,947±0,093µg/ml). Palyginus gautus rezultatus tarp žalių ir kepintų pluoštinių kanapių sėklų pastebima, jog L-metionino rūgšties koncentracija skiriasi nežymiai, bet pagal gautus rezultatus šios rūgšties kiekis yra šiek tiek didesnis kepintose sėklose.

L-treonino rūgšties kiekybinis įvertinimas bandiniuose pavaizduotas 15 paveiksle. 14 pav. Amino rūgšties L-metionino kiekio (µg/ml) įvertinimas

Atlikus tyrimą, tiriant pluoštinių kanapių sėklas, buvo gauti rezultatai, jog didesnės L-treonino koncentracijos aptiktos žaliose sėklose, iš jų didžiausia – ARG W2 veislės sėklose (0,158±0,004µg/ml), mažesni kiekiai nustatyti ARG B3 ir ARG W1 žaliavose (0,124±0,002µg/ml), ARG B2 veislės sėklose (0,118±0,002µg/ml) ir ARG W3 veislės sėklose (0,113±0,003µg/ml), mažiausias kiekis žaliose sėklose aptiktas ARG B1 žaliavoje (0,104±0,001µg/ml). Kepintose sėklose didžiausia L-treonino koncentracija buvo ARG W2 veislės sėklose (0,096±0,002µg/ml), mažesnė koncentracija aptikta ARG B3 veislės sėklose (0,073±0,0009µg/ml), o mažiausios koncentracijos – ARG B2 veislės sėklose (0,051±0,001µg/ml) ir ARG W3 veislės sėklose (0,049±0,0008µg/ml). Gauti L-treonino koncentracijos kiekiai žaliose sėklose šiek tiek buvo didesni nei kepintose sėklose.

L-fenilalanino rūgšties kiekybinis pasiskirstymas mėginiuose pavaizduotas 16 paveiksle. 15 pav. L-treonino kiekio pasiskirstymas skirtinguose pluoštinių kanapių

Išanalizavus gautus rezultatus, diagramoje pastebima jog L-fenilalanino rūgšties koncentracijos tiriamuosiuose junginiuose lyginant žalias ir kepintas sėklas skyrėsi, didžiausia koncentracija nustatyta ARG W1 veislės žaliose sėklose (0,235±0,006µg/ml), mažesnės rūgšties koncentracijos gautos ARG W2 veislės žaliose sėklose (0,157±0,004µg/ml), kepintose ARG B3 (0,14±0,002µg/ml), ARG W2 (0,139±0,002µg/ml) ir ARG W1 (0,135±0,003µg/ml) veislės sėklose, o mažiausia L-fenilalanino koncentracija buvo nustatyta žaliose ARG B3 veislės sėklose (0,04±0,0009µg/ml). Žaliose ir kepintose pluoštinių kanapių sėklose L-fenilalaninas rūgšties koncentracijos buvo gautos įvairios, todėl šios amino rūgšties koncentracijai sėklų apdorojimas neturi didelės įtakos, nes keliose veislėse jos išsiskyrė daugiau, kai sėklos buvo žalios, o kitose kai sėklos kepintos.

L-aspartamo rūgšties kiekybinis įvertinimas pluoštinių kanapių sėklose pavaizduotas 17 paveiksle.

16 pav. L-fenilalanino kiekio (µg/ml) įvertinimas tiriamuosiuose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose

Atlikus tiriamųjų mėginių analizę, buvo nustatyta, jog didesnės L-aspartamo rūgšties koncentracijos buvo gautos žaliose pluoštinių kanapių sėklose, išskyrus vienoje veislėje šios amino rūgšties didesnis kiekis buvo gautas kepintose sėklose. Didžiausios koncentracijos žaliose sėklose buvo aptiktos ARG W1 veislės sėklose (0,411±0,012µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose, mažesni kiekiai aptikti ARG W3 veislės sėklose (0,196±0,002µg/ml), mažiausias kiekis – ARG B2 veislės sėklose (0,11±0,003µg/ml). Didžiausios L-aspartamo rūgšties koncentracijos kepintose sėklose buvo nustatytos ARG W1 veislės sėklose (0,276±0,008µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose (0,269±0,009µg/ml), mažesnės koncentracijos gautos ARG B2 veislės sėklose (0,162±0,003µg/ml) ir ARG B3 veislės sėklose (0,111±0,001µg/ml), o mažiausios koncentracijos kepintose sėklose buvo nustatytos ARG B1 veislės sėklose (0,109±0,001µg/ml) ir ARG W3 veislės sėklose (0,094±0,001µg/ml). L-aspartamo rūgšties koncentracija lyginant žalias ir kepintas sėklas ženkliai nesiskyrė, bet šiek tiek didesni kiekiai buvo aptikti žaliose sėklose.

L-glutamato kiekybinis įvertinimas pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose pavaizduotas 18 paveiksle.

17 pav. L-aspartamo rūgšties kiekio (µg/ml) pasiskirstymas įvairiuose tiriamuosiuose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose

Atlikta kiekybinė L-glutamato analizė parodė, jog šios amino rūgšties didesnės koncentracijos nustatytos tiriamosiose žaliose sėklose, lyginant koncentracijas gautas kepintose sėklose. Didžiausia koncentracija žaliose sėklose aptikta ARG W1 veislės sėklose (5,613±0,148µg/ml), mažesnės koncentracijos gautos ARG B2 veislės sėklose (4,488±0,189µg/ml), ARG B1 veislės sėklose (4,036±0,193µg/ml) ir ARG W3 veislės sėklose (3,917±0,143µg/ml), mažiausia koncentracija žaliose sėklose – ARG B3 veislės sėklose (2,213±0,089µg/ml). Kepintose sėklose didžiausia L-glutamato koncentracija aptikta ARG W1 veislės sėklose (3,781±0,105µg/ml), mažesnės – ARG B1 veislės sėklose (2,996±0,102µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose (2,741±0,115µg/ml), o mažiausios koncentracijos gautos ARG B3 veislės sėklose (2,201±0,043µg/ml) ir ARG W3 veislės sėklose (1,997±0,103µg/ml). Palyginus žalias ir kepintas pluoštinių kanapių sėklas, diagramoje galima matyti, jog L-glutamato koncentracija yra didesnė žaliose sėklose, šios amino rūgšties išsiskyrimui gali turėti įtakos temperatūros pokytis.

L-lizino kiekybinis pasiskirstymas bandiniuose pavaizduotas 19 paveiksle. 18pav. Amino rūgšties L-glutamato kiekio (µg/ml) įvertinimas skirtinguose

Atlikus tyrimą, gauti duomenys, kurie parodė, jog šiek tiek didesnės L-lizino koncentracijos buvo nustatytos kepintose pluoštinių kanapių sėklose, iš jų didžiausios koncentracijos aptiktos ARG B1 (13,019±0,381µg/ml), ARG W1 (12,995±0,493µg/ml) ir ARG B2 (12,961±0,395µg/ml) veislės sėklose, mažesnės koncentracijos buvo ARG B3 veislės sėklose (12,647±0,493µg/ml) ir ARG W2 veislės sėklose (12,539±0,413µg/ml), o mažiausia koncentracija gauta kepintose sėklose ARG W3 veislės sėklose (12,493±0,455µg/ml). Pagal gautus rezultatus didžiausios L-lizino koncentracijos žaliose sėklose buvo nustatytos ARG W1 (12,921±0,395µg/ml) ir ARG B2 (12,804±0,406µg/ml) veislės sėklose, mažesni kiekiai aptikti ARG B1 (12,562±0,356µg/ml), ARG B3 (12,472±0,414µg/ml), ARG W3 (12,338±0,362µg/ml) veislės sėklose, o mažiausias šios amino rūgšties kiekis nustatytas kepintose ARG W2 veislės sėklose (12,106±0,398µg/ml). Palyginus gautas koncentracijas tarp žalių ir kepintų pluoštinių kanapių sėklų, galima matyti, jog didesnis L-lizino išsiskyrimas gautas kepintose sėklose.

L-cistino kiekybinis įvertinimas paruoštuose mėginiuose pavaizduotas 20 paveiksle. 19 pav. L-lizino kiekio (µg/ml) įvertinimas skirtinguose pluoštinių kanapių

Atliktas tyrimas parodė, jog L-cistino rūgšties koncentracija buvo gauta tik kepintose pluoštinių kanapių sėklose. Nustatyta, jog didžiausia koncentracija buvo ARG B3 veislės sėklose (13,699±0,421µg/ml), mažesnės koncentracijos aptiktos ARG W2 (13,194±0,442µg/ml), ARG W3 (13,061±0,394µg/ml) ir ARG W1 (12,824±0,356µg/ml) veislės sėklose, o mažiausios koncentracijos aptiktos ARG B2 (12,472±0,385µg/ml) ir ARG B1 (12,061±0,317µg/ml) veislės sėklose. Neradus L-cistino rūgšties žaliose pluoštinių kanapių sėklose, galima manyti, jog šios amino rūgšties išsiskyrimui turi įtakos sėklų apdorojimas ir temperatūros pokytis.

Tiriamuosiuose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose amino rūgšties L-histidino koncentracija nebuvo aptikta nei viename žalių ar kepintų sėklų mėginyje. Amino rūgščių valino, izoleucino, L-serino ir L-tirozino koncentracijos buvo aptiktos tyriamuose mėginiuose, bet jų kiekiai nedideli. Palyginus gautus duomenis, didžiausia L-valino koncentracija buvo gauta ARG W1 veislės sėklose: žaliose (0,177±0,005µg/ml) ir kepintose (0,142±0,003µg/ml). L-izoleucino didžiausia koncentracija aptikta ARG W1 veislės žaliose sėklose (0,131±0,003µg/ml) ir ARG W3 veislės kepintose sėklose (0,078±0,002µg/ml). L-serino didžiausias kiekis buvo nustatytas ARG W1 veislės žaliose sėklose (0,503±0,013µg/ml), o kepintose – ARG B1 veislės sėklose (0,084±0,001µg/ml). L-tirozino daugiausiai buvo gauta ARG W1 veislės žaliose sėklose (0,149±0,003µg/ml) ir ARG W2 veislės kepintose sėklose (0,134±0,002µg/ml).

Bendras nepakeičiamų amino rūgščių kiekis pavaizduotas 21 paveiksle.

12,061 12,472 13,699 12,824 13,194 13,061 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5

ARG B1 ARG B2 ARG B3 ARG W1 ARG W2 ARG W3

Ki ekis µ g/m l

L-cistinas

20 pav. L-cistino kiekio (µg/ml) įvertinimas skirtinguose pluoštinių kanapių kepintų sėklų mėginiuose

Susumavus gautus rezultatus, didesni kiekiai nepakeičiamų amino rūgščių gauti kepintose sėklose, tarp jų didžiausi kiekiai gauti ARG W1 (18,103µg/ml), ARG B3 (17,886µg/ml) ir ARG B1 (17,686µg/ml) veislės sėklose, mažesni kiekiai gauti ARG B2 (17,164µg/ml) ir ARG W3 (16,922µg/ml) veislės sėklose, o mažiausias kiekis nustatytas ARG W2 veislės sėklose (16,69µg/ml). Žaliose sėklose didžiausias bendras nepakeičiamų amino rūgščių kiekis aptiktas ARG W1 veislės sėklose (17,851µg/ml), mažesni kiekiai nustatyti ARG B2 (16,838µg/ml), ARG B1 (16,823µg/ml), ARG B3 (16,673µg/ml) ir ARG W3 (16,643µg/ml) veislės sėklose, mažiausias nepakeičiamų amino rūgščių kiekis aptiktas ARG W2 veislės sėklose (16,224µg/ml).

Bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis pavaizduotas 22 paveiksle.

21 pav. Bendras nepakeičiamų amino rūgščių kiekis (µg/ml) tirtuose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose

Atlikus amino rūgščių kiekio įvertinimo tyrimą ir susumavus gautus rezultatus, ženkliai didesnis bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis nustatytas kepintose sėklose, dėl jose aptikto L-cistino kiekio. Didžiausi bendri kiekiai kepintose sėklose aptikti ARG W1 (19,916µg/ml), ARG W2 (19,492µg/ml) ir ARG B3 (19,489µg/ml) veislės sėklose, mažesni kiekiai nustatyti ARG W3 (18,075µg/ml) ir ARG B1 (17,794µg/ml) veislės sėklose, mažiausias kiekis kepintose sėklose gautas ARG B2 veislės sėklose (16,998µg/ml). Žaliose sėklose didžiausias bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis aptiktas ARG W1 veislės sėklose (12,827µg/ml), mažesni kiekiai buvo aptikti ARG W2 (8,895µg/ml), ARG W3 (8,247µg/ml), ARG B1 (7,32µg/ml) ir ARG B3 (7,134µg/ml) veislės sėklose, o mažiausias bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis žaliose sėklose buvo aptiktas ARG B2 veislės sėklose (6,881µg/ml).

Bendras visų amino rūgščių kiekis pavaizduotas 23 paveiksle.

22 pav. Bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis (µg/ml) įvairiuose tiriamuosiuose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose

Atlikus tyrimą ir gavus kiekvienos tirtos amino rūgšties kiekius skirtingose pluoštinių kanapių sėklose, gauti rezultatai buvo sudėti ir palyginti tarpusavyje. Diagramoje galime matyti žymiai didesnius amino rūgščių kiekius kepintose sėklose, toks skirtumas gautas dėl L-cistino kiekio, ši amino rūgštis buvo aptikta tik kepintuose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose. Didžiausias kiekis kepintose sėklose gautas ARG W1 veislės sėklose (38,019µg/ml), o mažiausias kiekis aptiktas ARG B2 veislės sėklose (34,48µg/ml). Žaliose pluoštinių kanapių sėklose taip pat didžiausias kiekis nustatytas ARG W1 veislės sėklose (30,678µg/ml), o mažiausi kiekiai gauti ARG B3 (23,807µg/ml) ir ARG B2 (21,69µg/ml) veislių sėklose. Apibendrinus rezultatus galime matyti, jog skirtingos pluoštinių kanapių sėklų veislės kaupia panašų kiekį amino rūgščių, beveik visų amino rūgščių kiekiai žaliose sėklose buvo didesni nei kepintose, išskyrus amino rūgšties L-cistino kiekis, kuris buvo aptiktas tik kepintose pluoštinių kanapių sėklose.

Pagal gautus rezultatus, buvo palyginta dvi pluoštinių kanapių sėklų veislės „Finola“ ir „Futura 75“, susumavus gautus laisvųjų amino rūgščių kiekius buvo nustatyti didesni jų kiekiai „Futura 75“ veislėje, nepriklausomai nuo apdorojimo.

ARG B1 ARG B2 ARG B3 ARG W1 ARG W2 ARG W3

Žalios 24,143 23,719 23,807 30,678 25,119 24,89 Kepintos 35,48 34,162 37,375 38,019 36,182 34,997 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ki ekis µg /m l

Bendras visų amino rūgščių kiekis

Žalios Kepintos

23 pav. Bendras visų amino rūgščių kiekio (µg/ml) palyginimas žaliose ir kepintose, skirtingose pluoštinių kanapių sėklų veislėse

4. IŠVADOS

1. Dujų chromatografijos/masių spektrometrijos metodu žaliose pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose buvo identifikuota ir kiekybiškai įvertinta 14 laisvųjų amino rūgščių: alaninas, glicinas, valinas, leucinas, izoleucinas, prolinas, metioninas, serinas, treoninas, fenilalaninas, aspartamo rūgštis, glutamatas, lizinas ir tirozinas. Kepintose pluoštinių kanapių sėklose identifikuota ir kiekybiškai įvertinta

2. Analizuojant pluoštinių kanapių sėklų mėginius, buvo nustatyta, jog ženkliai didesnis bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis nustatytas kepintose sėklose, dėl jose gauto L-cistino kiekio. Didžiausi bendri kiekiai kepintose sėklose aptikti Futura 75 veislės, kuri surinkta Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose (19,916µg/ml), Finola veislės, kuri surinkta Anykščių raj. sėklose (19,492µg/ml) ir Futura 75 veislės, kuri surinkta Marijampolės raj. sėklose (19,489µg/ml), mažiausias kiekis kepintose sėklose nustatytas Futura 75 veislės, kuri surinkta Anykščių raj. sėklose (16,998µg/ml). Žaliose sėklose didžiausias bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis aptiktas Futura 75 veislės, kuri surinkta Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose (12,827µg/ml), o mažiausias bendras pakeičiamų amino rūgščių kiekis žaliose sėklose buvo aptiktas Futura 75 veislės, kuri surinkta Anykščių raj. sėklose (6,881µg/ml).

3. Atlikus tyrimą, pluoštinių kanapių sėklų mėginiuose buvo aptikti didesni nepakeičiamų amino rūgščių kiekiai kepintose sėklose, tarp jų didžiausi kiekiai gauti Futura 75 veislės, kuri surinkta Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose (18,103µg/ml), Futura 75 veislės, kuri surinkta Marijampolės raj. sėklose (17,886µg/ml) ir Finola veislės, kuri surinkta Panevėžio raj., sėklose (17,686µg/ml), o mažiausias kiekis gautas Finola veislės, kuri surinkta Anykščių raj. sėklose (16,69µg/ml). Žaliose sėklose didžiausias bendras nepakeičiamų amino rūgščių kiekis aptiktas Futura 75 veislės, kuri surinkta Rokiškio raj., Panemunėlio m. sėklose (17,851µg/ml), mažiausias nepakeičiamų amino rūgščių kiekis aptiktas Finola veislės, kuri surinkta Anykščių raj. sėklose (16,224µg/ml). Susumavus gautus laisvųjų amino rūgščių kiekius buvo nustatyti didesni jų kiekiai „Futura 75“ veislėje, nepriklausomai nuo jų apdorojimo.

4. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remiantis atliktu tyrimu nustatyta, jog didesni amino rūgščių kiekiai buvo gauti žaliose ir kepintose „Futura 75“ veislės sėklose, lyginant su gautais kiekiais „Finola“ veislės sėklose, todėl rekomenduojama rinktis „Futura 75“ veislę, norint gauti didesnius amino rūgščių kiekius.

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Ahuja, S. and Rasmussen, H. (2011). HPLC Method Development for Pharmaceuticals. Academic Press, pp.426-432.

2. Amaducci, S., Scordia, D., Liu, F., Zhang, Q., Guo, H., Testa, G. and Cosentino, S. (2015). Key cultivation techniques for hemp in Europe and China. Industrial Crops and Products, 68, pp.2-16. 3. An, Y., Schwartz, Z. and Jackson, G. (2013). δ13C analysis of amino acids in human hair using

trimethylsilyl derivatives and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 27(13), pp.1481-1489.

4. Anwar, F., Latif, S. and Ashraf, M. (2006). Analytical characterization of hemp (Cannabis sativa) seed oil from different agro-ecological zones of Pakistan. Journal of the American Oil Chemists' Society, 83(4), pp.323-329.

5. Arakawa, T., Tsumoto, K., Kita, Y., Chang, B. and Ejima, D. (2007). Biotechnology applications of amino acids in protein purification and formulations. Amino Acids, 33(4), pp.587-605.

6. Callaway JC. Hempseed as a nutritional resource: An overview. In: Euphytica. 2004. p. 65-72 7. Cannabinoids in the Treatment of Epilepsy. (2016). New England Journal of Medicine, 374(1),

pp.94-95.

8. Chen, T., He, J., Zhang, J., Zhang, H., Qian, P., Hao, J. and Li, L. (2010). Analytical Characterization of Hempseed (Seed ofCannabis sativaL.) Oil from Eight Regions in China. Journal of Dietary Supplements, 7(2), pp.117-129.

9. Craker LE, Gardner Z. The Botany of Cannabis. In: The Pot Book: A Complete Guide to Cannabis. 2010. p. 35–43.

10. Damodaran, S. (2017). Fennema's Food Chemistry, Fifth Edition. Taylor & Francis Group, pp.237-245.

11. Docimo, T., Caruso, I., Ponzoni, E., Mattana, M. and Galasso, I. (2014). Molecular characterization of edestin gene family in Cannabis sativa L. Plant Physiology and Biochemistry, 84, pp.142-148. 12. ElSohly MA, Slade D. Chemical constituents of marijuana: The complex mixture of natural

cannabinoids. In: Life Sciences. 2005. p. 539–48.46.

13. Galasso, I., Russo, R., Mapelli, S., Ponzoni, E., Brambilla, I., Battelli, G. and Reggiani, R. (2016). Variability in Seed Traits in a Collection of Cannabis sativa L. Genotypes. Frontiers in Plant Science, 7.

14. Hall, W., Christie, M. and Currow, D. (2005). Cannabinoids and cancer: causation, remediation, and palliation. The Lancet Oncology, 6(1), pp.35-42.