Arklių kraujo hematologiniai pasikeitimai dėl erkių pernešamų ligų– arklių granuliocitinės anaplazmozės ir arklių piroplazmozės

(1)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Dominyka Girdauskaitė

Arklių kraujo hematologiniai pasikeitimai dėl erkių

pernešamų ligų– arklių granuliocitinės anaplazmozės ir

arklių piroplazmozės

Hematology findings associated with tick–borne diseases–

equine granulocytic anaplasmosis and equine

piroplasmosis

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: Dr. Zoja Miknienė

(2)

DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Arklių kraujo hematologiniai pasikeitimai dėl erkių pernešamų ligų– arklių granuliocitinės anaplazmozės ir arklių piroplazmozės “:

1. yra atliktas mano pačios.

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(3)

TURINYS

SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1. Taksonomija ... 9 1.2. Anaplasma phagocytophilum ... 11 1.3. Paplitimas ... 11

1.4. Arklių granuliocitinės anaplazmozės klinikiniai simptomai ... 12

1.5. Diferenciacija ... 13

1.6. Diagnozavimas ... 13

1.6.1. Kraujo tepinėlio tyrimas ... 13

1.6.2. PGR tyrimas ... 14

1.6.3. NIF tyrimas ... 14

1.6.4. Imunofermentinis metodas (ELISA) ... 15

1.7. Gydymas ... 16 1.8. Prevencija ir profilaktika ... 17 1.9. Arklių piroplazmozė ... 17 2. Etiologija ... 17 2.1. Paplitimas ... 17 2.2. Klinikiniai simptomai ... 18 2.3. Diferenciacija ... 18 2.4. Diagnozavimas ... 18

2.4.1. Komplemento fiksavimo tyrimas ... 19

2.4.2. Netiesioginis imunofluorescencinis metodas ... 19

2.4.3. Imunofermentinis metodas (ELISA) ... 19

2.4.4. PGR tyrimas ... 19

2.9. Gydymas ... 19

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21

2.1. Tiriamųjų grupių sudarymas ... 22

2.2. Kraujo mėginių surinkimas ... 23

2.3. Kraujo morfologinis tyrimas, kraujo tepinėlių ruošimas, dažymas ... 24

2.4. Leukoformulių skaičiavimas, greitasis diagnostinis testas ... 25

2.5. A. phagocytophilum ir piroplazmozės identifikavimas kraujo tepinėlyje ... 26

2.6. Gydymo metodika ... 27

2.7. Statistinė analizė ... 27

3. TYRIMO REZULTATAI ... 28

3.1. Sergančių arklių pasiskirstymas tirtuose žirgynuose ... 28

3.2. Kraujo morfologinių rodiklių kitimas sergant arklių granuliocitine anaplazmoze ir arklių piroplazmoze ... 28

3.3. Kraujo leukoformulės pakitimai tarp sergančių ir nesergančių ... 31

3.4. Pirsono koreliacija ... 32

3.5. Gydytų arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, kraujo rodikliai ... 34

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35

IŠVADOS ... 38

REKOMENDACIJOS ... 39

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40

(4)

ARKLIŲ KRAUJO HEMATOLOGINIAI PASIKEITIMAI DĖL ERKIŲ PERNEŠAMŲ LIGŲ– ARKLIŲ GRANULIOCITINĖS ANAPLAZMOZĖS IR ARKLIŲ PIROPLAZMOZĖS

Dominyka Girdauskaitė Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Tyrimas atliktas 2017– 2018 metais. Tyrimai buvo atliekami LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikos, klinikinių tyrimų laboratorijoje. Baigiamojo darbo apimtis 45 puslapiai, jame yra 16 paveikslų, 6 lentelės, du priedai. Viso panaudota 80 literatūros šaltinių.

Baigiamojo darbo tikslas buvo išanalizuoti arklių kraujo hematologinius pasikeitimus dėl erkių pernešamų ligų- arklių granuliocitinės anaplazmozės ir arklių piroplazmozės. Tyrimą sudarė du etapai: I– arklių kraujo mėginių rinkamas X, Y, Z žirgynuose esantiems arkliams; II– kraujo mėginių rinkimas ir taikytas gydymo protokolas LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikoje esantiems arkliams, sergantiems arklių granuliocitine anaplazmoze. Tyrimo metu buvo ištirti 36 kraujo mėginiai: pirmojo etapo metu 33, o antrojo 3 kraujo mėginiai.Tyrimui atlikti buvo iškelti šie uždaviniai: atlikti arklių kraujo tepinėlio tyrimus granuliocitinės anaplazmozės bei piroplazmozės atvejais, įvertinti arklių kraujo morfologinių rodiklių pakitimus sergantiems arklių granulioctine anaplazmoze ir piroplazmoze, įvertinti arklių granuliocitine anaplazmoze bei piroplazmoze užsikrėtimą tirtuose žirgynuose, įvertinti taikyto gydymo efektyvumą arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze. Tyrimo metu buvo atlikta: kraujo tepinėlio tyrimai, leukoformulės skaičiavimas, kraujo morfologiniai tyrimai bei greitieji diagnostiniai testai įtarus arklių granuliocitinę anaplazmozę.

Remiantis tyrimų rezultatais, A. phagocytophilum morulių buvo rasta keturiuose arklių kraujo tepinėliuose, o arklių piroplazmozės sukėlėjų– trijuose arklių kraujo tepinėliuose; sirgusiems arklių granuliocitine anaplazmoze, vidutinis bendras leukocitų kiekis kraujyje buvo 10,64±1,31 x109_{/L, o}

sirgusiems piroplazmoze 7,61±0,70 x109/L; sirgusiems arklių granuliocitine anaplazmoze, vidutinis granuliocitų kiekis kraujyje buvo 8,90±1,63 x109_{/L, o sirgusiems piroplazmoze 5,81±0,32 x10}9_/L;

arkliams, sirgusiems granuliocitine anaplazmoze, vidutinė LY (%) koncentracija buvo 21,20±1,30 proc. o, sergantiems arklių piroplazmoze 15,85±4,82 proc.; iš visų tirtų arklių X, Y, Z žirgynuose, arklių granuliocitinė anaplazmozė X, Y, Z žirgynuose buvo diagnozuota 1 arkliui, piroplazmozė 3 arkliams; LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikos pacientams, diagnozavus arklių granuliocitinę anaplazmozę, taikytas gydymo protokolas naudojant oksitetracikliną buvo efektyvus, gydyti arkliai pasveiko. Atlikus pakartotinus tyrimus po gydymo A. phagocytophilum morulių kraujo tepinėliuose nebuvo rasta, o kraujo morfologiniai bei leukoforumulės rodikliai– normos ribose.

(5)

Raktažodžiai: arklių granuliocitinė anaplazmozė, arklių piroplazmozė, kraujas, erkių pernešamos ligos

(6)

HEMATOLOGY FINDINGS ASSOCIATED WITH TICK–BORNE DISEASES– EQUINE GRANULOCYTIC ANAPLASMOSIS AND EQUINE PIROPLASMOSIS

Dominyka Girdauskaitė Master’s Thesis

SUMMARY

The research was performed in a clinical research laboratory of Large Animal Clinic of Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, throughout the period of 2017 – 2018. The volume of the Master’s Thesis is 45 pages and it contains 16 illustrations, 6 tables, 2 annexes. 80 literature sources were used.

The objective of the Master’s Thesis was to analyze the hematological changes in equine blood, associated with tick-borne diseases – equine granulocytic anaplasmosis and equine piroplasmosis. The research was divided into two parts: I – horses’ blood samples collection from X, Y, Z studs, II – horses’ blood samples collection and treatment protocol application for the patients with equine granulocytic anaplasmosis in the Large Animal Clinic of Lithuanian University of Health Sciences. In this research 36 blood samples were examined: 33 in the first part of the research, and 3 in the second. To perform the study, several tasks were proposed: to perform horses’ blood smear tests in cases of equine granulocytic anaplasmosis and piroplasmosis, to evaluate the morphological parameters of horses with granulocytic anaplasmosis and piroplasmosis, to estimate the infection in Y, X, Z studs of equine granulocytic anaplasmosis and piroplasmosis, to evaluate the treatment efficacy applied in horses’ with equine granulocytic anaplasmosis.

Following actions were perfomed throughout the study period: blood smear tests, white blood cell count, morphological blood tests, rapid diagnostic tests in case of suspicion of equine granulocytic anaplasmosis.

According to the research results, Anaplasma phagocytophilum morulae were found in four horses’ blood samples, and equine piroplasmosis agents– in three horses’ blood samples; the average white blood cell count in horses with granulocytic anaplasmosis was 10,64±1,31 x109/L, and 7,61±0,70 x109_{/L with piroplasmosis; the average granulocytic count in horses with granulocytic}

anaplasmosis was 8,90±1,63 x109/L, and 5,81±0,32 x109/L with piroplasmosis; the average lymphocyte concentration in horses blood with granulocytic anaplasmosis was 21,20±1,30 %, and 15,85±4,82 % with piroplasmosis; out of all the horses in the X, Y, Z studs, equine granulocytic anaplasmosis was diagnosed for 1 horse and equine piroplasmosis for 3 horses; the applied treatment protocol with oxytetracycline for horses with equine granulocytic anaplasmosis was effective.

(7)

SANTRUMPOS

A. phagocytphilum – Anaplasma phagocytophilum

T. equi – Theileria equi B. caballi – Babesia caballi

NIF – netiesioginis imunofluorescencinis tyrimas PGR – polimerazine grandinine reakcija

Proc. – procentai

LY % – limfocitai, proc. GR % – granuliocitai, proc. MI % – monocitai, proc.

WBC – bendras leukocitų kiekis LYM – limfocitų kiekis

GRA – bendras granuliocitų kiekis RBC – bendras eritrocitų kiekis MCV – vidutinis eritrocitų tūris

MCH – vidutinis hemoglobino kiekis eritrocite

MCHC – vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite HGB – hemoglobino koncentracija

PLT – bendras trombocitų skaičius PCT – suminis trombocitų tūris MPV – vidutinis trombocitų tūris

PDWc – trombocitų pasiskirstymo plotis RDWc – eritrocitų pasiskirstymo plotis HCT – hematokritas

(8)

ĮVADAS

Labai daug užsienio šaltinių skelbia apie erkių pernešamas ligas, jų plitimą, pavojų tiek laukiniams gyvūnams, tiek naminiams, taip pat ir žmogui. Vis daugiau pirmųjų konkrečių ligų ir sukėlėjų identifikavimų yra aprašoma Šiaurės Europos šalyse, kur klimato sąlygos keičiasi dėl klimato šiltėjimo. Arkliams dvi pagrindines erkių pernešamas ligas– arklių granuliocitinę anaplazmozę ir piroplazmozę- Europoje platina Ixodes ricinus erkės (1).

Šios dvi ligos Lietuvoje nėra plačiai aprašytos, todėl ir jų diagnostika bei atpažinimas yra sudėtingas. Pagal užsienio šaltinius ir aprašytus ligų atvejus, šios ligos gali sukelti ir nespecifinius ligos simptomus. Erkių rūšis, kuri platina šias dvi ligas– Ixodes ricinus– pagal naujausius Europos ligų kontrolės ir prevencijos centro (angl. European Centre for Diseases Prevention and Control) duomenis, yra paplitusi beveik visoje Pietų Europoje ir jau siekia ir Šiaurės Europą.

Arklių granuliocitinės anaplazmozės pavadinimas buvo pakeistas dėl taksonominių pakeitimų nuo 2001 metų, o arklių piroplazmozė yra geriau žinoma kaip arklių babeziozė. Šios dvi ligos arkliams gali būti diagnozuojamos taikant paprastą kraujo tepinėlio tyrimo metodą, o gydymas yra skirtingas. Erkių kontrolė yra esminis aspektas prevencijai. Tačiau jokie naudojami akaricidai negali visiškai pašalinti erkių pernešamų ligų rizikos, o ir vakcinų šiuo metu nėra (1).

Darbo tikslas: Išanalizuoti arklių kraujo hematologinius pasikeitimus, dėl erkių pernešamų ligų– arklių granuliocitinės anaplazmozės ir arklių piroplazmozės.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti arklių kraujo tepinėlio tyrimus granuliocitinės anaplazmozės bei piroplazmozės atvejais.

2. Įvertinti arklių kraujo morfologinių rodiklių pakitimus sergantiems arklių granulioctine anaplazmoze ir piroplazmoze.

3. Įvertinti arklių granuliocitine anaplazmoze bei piroplazmoze užsikrėtimą tirtuose žirgynuose. 4. Įvertinti taikyto gydymo efektyvumą arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze.

(9)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Taksonomija

Erlichiozės terminas buvo plačiai taikomas įvairioms žmonių ir gyvūnų ligoms, sukeltoms patogenų, anksčiau klasifikuotų kaip Ehrlichia genties patogenai (2).

Naujausi Anaplasmitaceae šeimos ir sukeliamų ligų toksonomijos pokyčiai gali būti šiek tiek klaidinantys. Anksčiau erlichiozė buvo grupė ligų, sukeltų organizmų, kurie replikavosi leukocituose ir priklausė Ehrlichia genčiai, Ehrlichieae tribai, Rickettsiaceae šeimai. Ligų pavadinimai dažniausiai priklausydavo nuo to, kuri rūšis ir kuriuos leukocitus infekuoja. Pavyzdžiui Ehrlichia equi dažniausiai infekuodavo neutrofilus ir užkrėsdavo arklius. Taigi, ligos pavadinimas būdavo arklių granuliocitinė erlichiozė. Po 2001 metų kai kurios Ehrlichia rūšys buvo perklasifikuotos į Anaplasma ar Neorickettsia gentis ir visos trys gentys buvo priskirtos Anaplasmataceae šeimai. Šiai dienai, Anaplasmitaceae šeimai priklauso gentys– Ehrilichia, Anaplasma, Neorickettsia taip pat ir Wolbachia (1,3,4,5) (žr. 1pav.).

Šiuo metu atpažintos rūšys, priklausančios Anaplasma genčiai yra: A. phagocytophilum, A. platys (anksčiau E. platys), A. marginale, A. bovis (anksčiau E. bovis) ir A. ovis. Anaplasma phagocytophilum sukelia susirgimus žmonėms ir daugeliui gyvūnų rūšių. Žmonėms liga yra žinoma kaip žmonių granuliocitinė anaplazmozė (anksčiau žmonių granuliocitinė erlichiozė), šunims– šunų granulioctinė anaplazmozė (anksčiau šunų granuliocitinė erlichiozė), arklių granuliocitinė anaplazmozė (anksčiau arklių granuliocitinė erlichiozė) arkliams (žr. 2 pav.).

Dabar Anaplasma phagocytophilum rūšiai priklauso buvusios Ehrlichia equi ir Ehrlichia phagocytophila (kuri sukelia susirgimus atrajotojams) rūšys ir žmogaus granuliocitinės erlichiozės sukėlėjas. Dėl to kai kurių ligų pavadinimai taip pat pasikeitė. Taigi, arklių granuliocitinė erlichiozė tapo žinoma kaip arklių granuliocitinė anaplazmozė (1).

Arklių granuliocitinės anaplazmozės sukėlėjas A. phagocytophilum yra labai heterogeniškas organizmas, o genetiniai variantai gali skirtis dėl jų virulentiškumo šeimininko rūšiai. Likusios Anaplasma rūšys nėra laikomos zoonotinėmis. A. platys infekuoja trombocitus, o tuo tarpu

A. marginale, A. bovis ir A. ovis infekuoja atrajotojų eritrocitus (5) (žr. 2 pav.). Naujos Anaplasma

(10)

1 pav. Genčių Ehrlichia ir Anaplasma taksonomija prieš 2001 metus ir po 2001 metų (5).

(11)

2 pav. Anaplasma genties patogenų charakteristika (5)

1.2. Anaplasma phagocytophilum

Arkliai gali užsikrėsti Anaplasma phagocytophilum. Ši bakterija sukelia arkliams granuliocitinę arklių anaplazmozę (6). Anaplasma phagocytophilum yra maža (0,2 – 2 µm skersmens) gram-neigiama bakterija, kuri dauginasi ląstelių vakuolėse, kad suformuotų mikrokoloniją, vadinamą morule (3,7). Arkliams ši bakterija infekuoja granuliocitus, o dažniausiai- neutrofilus (3). Morulė arklių neutrofiluose gali būti nuo 0,5 iki 5 μm diametro dydžio (8), ir ją gali sudaryti daugiau nei viena ir iki dvidešimt bakterijų (9).

1.3. Paplitimas

Arklių granuliocitinė anaplazmozė yra sezoninė arklių liga, pirmą kartą užregistruota 1969 metais Kalifornijoje (6,8). Nuo tada ši liga buvo aprašyta ir kitose valstybėse, tokiose kaip Šveicarija, Švedija, Prancūzija, Vokietija, Italija ir Didžioji Britanija (10,11,12,13,14).

Per paskutinius tris dešimtmečius arklių granuliocitinė anaplazmozė buvo aprašyta daugelyje Europos valstybių: Vokietijoje, Šveicarijoje, Jungtinėje Karalystėje, Austrijoje, Prancūzijoje, Italijoje, Olandijoje, Portugalijoje, Lenkijoje, Čekijoje (15).

A. phagocytophilum yra plačiai paplitus šiauriniame pusrutulyje (16) ir buvo aptikta naudojant PGR tyrimo metodą Ixodes ricinus erkėse beveik visoje Europoje (17). Vokietijoje bendras paplitimas svyruoja nuo 1,0 proc. iki 4,5 proc. (18). Bendras paplitimas Europoje svyruoja nuo 0,25 proc., Škotijoje iki 57,1 proc. Italijoje (19,20). Kiekvienoje šalyje labai skiriasi: nuo 0,4 proc. iki 15 proc. Prancūzijoje (21,22), nuo 3 proc. iki 57 proc. Italijoje (23,24), nuo 0,25 proc. iki 2 proc. Škotijoje (19), 3 proc. Estijoje (25), nuo 5,1 proc. iki 8,7 proc. Austrijoje (26,27), nuo 0,5 proc. iki 2,2 proc. Šveicarijoje (28,29), iki 40,5 proc. Danijoje (30) ir iki 14 proc. įvairiose Rytų Europos šalyse (31,32,33,34).

(12)

Anaplazmozė yra endeminė tropiniuose ir subtropiniuose regionuose (35). Kadangi tai yra sezoninė liga, dažniausiai klinikiniai simptomai pasireiškia rudenį, žiemą ir pavasarį (36).

Europoje arklių granuliocitinė anaplazmozė yra pernešama Ixodes ricinus erkių (37) (žr. 3 pav.). Šiaurės Amerikoje pagrindiniai vektoriai yra I. pacificus ir I. scapularis (38) (žr. 3 pav.). Erkės perneša bakteriją į kraują, kai maitinasi kito gyvūno krauju (5). Bakterijos pernešimo laikas buvo ištirtas eksperimentinių užkrėtimų metu ir yra manoma, jog trunka tarp 40 – 48 maitinimosi valandos (39).

Anaplasma phagocytophilum atsitiktinai gali būti pernešama ir kitais būdais. Per užkrėstas adatas, ypatingai tokių medicininių procedūrų, kaip kraujo perpylimas ar kaulų čiulpų transplantacija, metu. Taip pat transplacentinis plitimo būdas buvo pademonstruotas ekperimentiškai užkrėtus galvijus (1). Žmonės ir naminiai gyvūnai, tokie kaip šunys, manoma, daugiausiai yra atsitiktiniai šeimininkai ir vaidina mažą vaidmenį natūraliame šių patogenų cikle (40, 41).

3 pav. Anaplasma phagocytophilum genties bakterijų vektorių paplitimas pasaulyje (5)

1.4. Arklių granuliocitinės anaplazmozės klinikiniai simptomai

Arklių granuliocitinė anaplazmozė pasireiškia itin sparčiai ir šios ligos formos sunkumas skiriasi. Jauniems gyvūnams paprastai būna lengvesnė šios ligos forma, o saugusiems arkliams būdingi sunkesni simptomai. Arkliams iki metų amžiaus gali pasireikšti tik karščiavimas, vyresniems– karščiavimas, sumažėjęs apetitas, mieguistumas, petechijos, gelta, nenoras judėti, ataksija, priekinių galūnių edema. Kraujo pokyčiai– trombocitopenija ir leukopenija. Trombocitopenija yra ryškesnė arkliams nei kitiems gyvūnams (42). Leukopenija pasireiškia dažniausiai esant neutropenijai, ypač gali būti ir sunki miopatija (1). Taip pat gali būti padidėjęs kūno svoris, pireksija, anoreksija (43). Retais atvejais atsiranda trumpalaikė skilvelio aritmija, o kartu gali

(13)

sustiprėti ir kitos infekcijos. Vienam eksperimentiškai užkrėstam arkliui pasireiškė diseminuota intravaskulinė koaguliacija. Mirtis yra nedažna visų amžių arkliams (1). Sergamumas gali varijuoti nuo švelnios iki sunkios formos. Inkubacinis šios ligos periodas yra 1 – 2 savaitės (43). Klinikiniai simptomai dažnai gali ir pranykti netaikant jokio gydymo per 7 – 14 dienų, tačiau greitesnis išgijimas vis dėlto bus panaudojus medikamentinį gydymą tetraciklinų grupės antibiotikais (9).

1.5. Diferenciacija

Arklių granuliocitinę anaplazmozę reikia diferencijuoti nuo arklių infekcinės anemijos, arklių virusinio arterito, arklių herpes virusų (EHV1/4) sukeliamų kvėpavimo takų infekcijų, Purpura Heamorrhagica, kepenų ligų (9).

1.6. Diagnozavimas

Diagnozė yra pagrįsta žiniomis apie geografinės zonos infekcijas, tipiniais klinikiniais simptomais, kraujo morfologiniais pokyčiais bei A. phagocytophilum morulės aptikimu granuliocituose, naudojant periferinio kraujo tepinėlį (44).

Dažniausiai A. phagocytophilum yra diagnozuojama naudojant serologinius testus, nors antikūnų kiekio padidėjimas neaptinkamas pirmas 7 – 10 dienų. Netiesioginis imunofluorescencinis tyrimas (NIF) yra dažniausiai naudojamas serologinis tyrimas. Antikūnai gali būti randami ir pas sveikus gyvūnus. Taip pat gali būti, kad antikūnai nerandami pas sergančius gyvūnus ankstyvoje ligos stadijoje (1). Ūmi ligos stadija gali būti diagnozuota tiriant kraujo tepinėlius mikroskopu ir nustatant morules neutrofiluose bei polimerazine grandinine reakcija (PGR) (45,46).

1.6.1. Kraujo tepinėlio tyrimas

Arklių granuliocitinė anaplazmozė gali būti diagnozuota tiriant kraujo tepinėlį ir aptinkant leukocituose, dažniausiai– neutrofiluose, suformuotas kolonijas– morules. Nuo 2016 m., atsižvelgiant į Ligų kontrolės ir prevencijos centro (angl. Center for Disease Control and Prevention) rekomendacijas, ligai patvirtinti, tiriant kraujo tepinėlį mikroskopu, būtina rasti mažiausiai tris neutrofilus su morulėmis (44,47). Šis tyrimo metodas yra mažo jautrumo, kadangi morules galima pastebėti tik trumpą laiko tarpą (39). Morulių dydis gali būti įvairus, tarp 1,5 μm ir 6 μm diametro (48). Morulės neutrofiluose dažniausiai pastebimos ankstyvoje ligos stadijoje, kuomet yra ūmi ligos stadija, dažnai pirmąją ligos savaitę, o vėlesnėse ligos stadijose jos nebepastebimos (1,3,8). Morules galima pastebėti 40 procentų cirkuliuojančių neutrofilų (11).

Morulių aptikimas leukocituose yra greitas metodas, kuriuo galima nustatyti tariamą diagnozę. Morulės yra matomos kaip tamsiai mėlynos ar violetinės spalvos mikrokolonija ir kartais jos gali būti aptinkamos ir kito tipo ląstelėse (žr. 4 pav.). Šiam metodui yra naudojami periferinio kraujo arba PRP frakcijos tepinėliai. Jiems dažyti naudojami Wright‘s, Diff-Quik, Romanovskio-Gimzos dažymo

(14)

metodai. Šios struktūros pradeda išnykti iš kraujo per 24 – 72 valandas pradėjus gydymą antibiotikais (1).

4 pav. A. phagocytophilum morulės neutrofile (49) 1.6.2. PGR tyrimas

Taip pat gali būti naudojami ne tik serologiniai testai, bet ir polimerazinė grandininė reakcija (PGR) (50). PGR tyrimai leidžia greitai ir anksti diagnozuoti ligą, aptinkant A. phagocytophilum DNR. Ypač kai nėra pastebimos morulės neutrofiluose (51).

A. phagocytophilum genas yra 16sRNR. PGR yra tinkamas tyrimo metodas nustatyti diagnozę esant ūmiai arklių granuliocitinės anaplazmozės ligos formai (1,39,51).

1.6.3. NIF tyrimas

Netiesioginis imunofluorescencinis tyrimas (NIF) yra dažniausiai naudojamas tyrimas. Šis tyrimas yra labai jautrus, leidžia nustatyti mažą antigeno ar antikūno kiekį (39). Taikant netiesioginės imunofluorescencijos metodą, yra naudojamas pirminis antikūnas, kuris atpažįsta antigeną pirmojo etapo metu, ir tuomet yra naudojamas antrinis antikūnas, žymėtas fluoresceinu (fluorescuojantys dažai), kuris susijungia arba nesusijungia su pirminiu antikūnu (žr. 5 pav.). Tyrimas panašus į ELISA, tik su antikūnu jungiamas ne fermentas, bet florescuojantys dažai. Plokštelė inkubuojama 37 °C temperatūroje 30 – 60 min. prieš tai ant jos užnešus tiriamo kraujo serumo. Po inkubacijos plokštelė nuplaunama 3 – 5 kartus fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Po inkubacijos ir plovimo išlieka tik antigeno– antikūno kompleksas. Antrame reakcijos etape, specifiniai pirminiai antikūnai (IgG) yra dažomi antikūnais prieš arklių antikūnus (IgG). Jie yra žymėti fluoresceinu. Plokštelė vėl inkubuojama tokiomis pačiomis sąlygomis 30 – 60 min. Po inkubacijos plokštelė vėl plaunama fosfatiniu buferiniu tirpalu 3 – 5 kartus. Žymėtieji antikūnai susijungia su antigenais. Susidaro imunoflorescuojantis kompleksas, kurį pamatyti reikalingas fluorescentinis mikroskopas. Kaip šviesos šaltinis jame naudojama gyvsidabrio lempa, kuri generuoja UV spindulius. Fluorescinas UV spindulius sugeria ir kaip emisija yra matomas žalias švytėjimas. Mikroskopavimas atliekamas tamsiame regėjimo lauke (52).

(15)

5 pav. Netiesioginės imunofluorescencijos schema (55) 1.6.4. Imunofermentinis metodas (ELISA)

Yra kelios šio tyrimo metodo versijos. Netiesioginė imunofermentinė analizė, daugiasluoksnė “sumuštinio” tipo imunofermentinė analizė bei konkurencinė imunofermentinė analizė. Tyrimo metu yra nustatomas antikūnų kiekis kraujo serume prieš A. phagocytophilum.

Arklių granuliocitinei anaplazmozei diagnozuoti yra naudojami greitieji diagnostiniai testai, kurie yra paremti imunofermentine “sumuštinio” tipo analizės metodu. Plokštelė padengiama polikloniniais antikūnais. Antikūnai prisitvirtina prie polimero paviršiaus veikiant fizikinės prigimties jėgoms. Kiekvienam plokštelių tipui parenkama individuali dengimui naudojamų antikūnų koncentracija ir skiedimo buferinis tirpalas. Po kiekvieno ELISA inkubavimo plokštelė plaunama tam, kad būtų pašalintas reagentų perteklius, nesusirišusios molekulės. Plovimui naudojami įvairūs buferiniai tirpalai.

Labai svarbi yra blokavimo procedūra. Tuščios, antikūnų neužimtos ELISA plokštelės vietos padengiamos kokiomis nors imunologiniu požiūriu inertiškomis molekulėmis – tai leidžia išvengti klaidingai teigiamų rezultatų. Po to yra inkubuojama su antigenu– specifiški antikūnai, atpažinę antigeną, jį suriša, o neatpažintos molekulės nuplaunamos. Kito etapo metu yra pridedami monokloniniai antikūnai. Vėliau – antriniai antikūnai, atpažįstantys monokloninius antikūnus. Specifiška antigeno ir antikūno sąveika išryškinama padedant fermentinei reakcijai, kurios pobūdis priklauso nuo prijungto prie antrinių antikūnų fermento rūšies ir pasirinkto substrato. Fermento– substrato reakcijos metu susidaro spalvotas produktas, kuris parodo, jog įvyko specifinė reakcija tarp antigeno ir antikūno (54).

(16)

6 pav. „Sumuštinio“ tipo ELISA (56)

1.7. Gydymas

A. phagocytophilum yra jautri tetraciklinų grupės antibiotikams. Efektyviausias gydymas nuo arklių granuliocitinės anaplazmozės yra oksitetraciklinu 6 – 7 mg/kg į veną, vieną kartą per dieną, 8 dienas (9). Karščiavimas baigiasi dažniausiai per 12 – 24 valandas, o kiti ligos simptomai pradingsta per keletą dienų. Laikoma, jog diagnozę patvirtina greitas išgijimas nuo oksitetraciklino injekcijos.

Mirtingumas yra labai mažas, tačiau mirtys gali įvykti dėl traumų, kurios gali atsirasti dėl sutrikusios galūnių koordinacijos ūmioje ligos fazėje arba dėl antrinės infekcijos (8,9). Jeigu arkliams yra oksitetraciklino netoleravimas, granuliocitinė anaplazmozė gali būti gydoma kitais antibiotikais, pavyzdžiui doksiciklinu (p.o. 10 mg/kg kas 12 valandų) (36). Be to, tyrimai, atlikti in vitro atskleidė, jog A. phagocytophilum yra jautri naujos kartos fluorochinolonams ir rifampicinui (55). Gydant arklius ankstyvoje ligos fazėje trumpesnį laiką, liga gali atsinaujinti. Esant ataksijai ir edemai gali padėti trumpalaikis gydymas kortikosteroidais. Naudojamas deksametazonas, 20 mg per dieną, 2 – 3 dienas. Nesteroidiniai priešuždegiminiai vaistai ir skysčių infuzijos yra paskiriamos tik pagrįstais atvejais. Išgiję arkliai įgyja imunitetą dviems metams ir netampa ligos nešiotojais (56).

(17)

1.8. Prevencija ir profilaktika

Prevencijai yra būtina erkių kontrolė naudojant repelentus, akaricidus. Pavyzdžiui, permetriną (57). Erkės pašalinimas nuo odos, neatmeta galimybės užsikrėsti (58). Šiuo metu vakcinos nuo arklių granuliocitinės anaplazmozės (AGA) nėra. Anaplasma marginale antigenų pagrindu yra vykdomi vakcinos nuo anaplazmozės tyrimai (59,60).

1.9. Arklių piroplazmozė

Arklių piroplazmozė yra erkių pernešama protozojinė infekcija. Piroplazmozę sunku diagnozuoti, kadangi ji gali sukelti įvairių ir nespecifinių klinikinių simptomų. Šios ligos simptomai varijuoja nuo ūmaus karščiavimo, bendro negalavimo iki anemijos, geltos, staigios mirties ar svorio netekimo ir prasto fizinio krūvio netoleravimo (61).

2. Etiologija

Arklių piroplazmozė (AP) pirmą kartą buvo nustatyta Sudane 1907 metais (61). Arklių piroplazmozės sukėlėjai yra Babesia caballi arba Theileria equi (anksčiau Babesia equi). Abu organizmai priklauso Apicomplexa tipui, Piroplasmida būriui. Babesia bovis, galvijų babeziozės sukėlėjas, buvo aptiktas labai retais atvejais arkliams. Arklių prioplazmoze gali užsikrėsti arkliai, mulai, asilai ir zebrai (62).

2.1. Paplitimas

Arklių piroplazmozės sukėlėjai yra endemiški daugelyje tropinių ir subtropinių regionų įskaitant Afriką, Aziją, Centrinę ir Pietų Ameriką, Karibus ir Europą. T. equi yra plačiau paplitusi nei B. caballi. Australija, Naujoji Zelandija, Kanada, Japonijoja– šios šalys yra laisvos nuo šių parazitų (62).

Arklių pripolazmozę perneša Ixodes ricinus erkės siurbdamos kraują. Maždaug 14 rūšių erkių, priklausančių Dermacentor, Hyalomma ir Rhipicephalus gentims, gali būti piroplazmozės sukėlėjų vektoriai (62,63,64).

Europoje, erkės yra svarbiausias ekologinis patogenų vektorius, kuris sukelia ir žmonių ir gyvūnų ligas. Ixodes ricinus erkės yra labiausiai paplitusios Europoje. Jos gali pernešti didelę įvairovę zoonozinių patogenų, tokių kaip virusai, bakterijos ir helmintus (65). Erkės, užsikrėtusios Theileria praranda šiuos parazitus po perdavimo kitam organizmui ir dažniausiai B. caballi ir T. equi yra pernešamos po to, kai erkė būna prisisiurbusi prie gyvūno kelias dienas. AP taip pat gali būti pernešama tiesiogiai tarp gyvūnų, naudojant užkrėstas adatas ar švirkštus, atliekant kraujo perpylimą. T. equi gali plisti per gimdą, tačiau kai kurie kumeliukai gali būti tik sveiki ligos nešiotojai. B. caballi plitimas per placentą yra mažai užfiksuotas (62).

(18)

2.2. Klinikiniai simptomai

Arklių piroplazmozės inkubacinis laikotarpis nuo 12 iki 19 dienų, kai ją sukelia T. equi, o kai sukėlėjas B. caballi– nuo 10 iki 30 dienų (66).

Arklių piroplazmozės klinikiniai simptomai yra įvairūs ir dažnai nespecifiniai. T. equi pasižymi tuo, jog sukeliama ligos forma yra sunkesnė nei B. caballi. Dažniausiai piroplazmozė pasireiškia kaip ūmi infekcija su karščiavimu, apetito nebuvimu, bendru negalavimu, sunkiu ir padažnėjusiu kvėpavimu, gelta, hemoglobinurija, prakaitavimu, petechijomis konjuktyvose, padidėjusia pilvo apačia. Užpakalinės kūno dalies silpnumas bei lingavimas taip pat gali būti pastebėtas. Išmatos gali būti sausos, tačiau diarėja taip pat buvo užfiksuota. Kraujo tyrimuose taip pat matomi pakitimai– trombocitopenija, anemija (62). Sunki anemija yra būdinga T. equi infekcijos atvejais (67). Poūminio pobūdžio ligos metu klinikiniai simptomai panašūs, tačiau ne tokie sunkūs. Karščiavimas gali būti nepastovus, gyvūnai netenka svorio, diegliuoja, gali būti pastebima švelni galūnių edema. Gleivinės gali būti rožinės, šviesiai rožinės arba geltonos, gali būti petechijų. Lėtinio pobūdžio ligos metu stebimas apetito nebuvimas, prastas fizinio krūvio toleravimas, svorio netekimas, padidėjusi blužnis. Kai kurios kumelingos kumelės gali abortuoti (62, 68).

Pasveikę arkliai gali tapti šios ligos nešiotojais ilgą laiko tarpą. Arkliai užsikrėtę B. caballi gali išlikti nešiotojais iki 4 metų, o arkliai užsikrėtę T. equi lieka užsikrėtę visam laikui (62,69).

2.3. Diferenciacija

Arklių piroplazmozės diferencines diagnozes apima arklių tripanosomozę, sukeltą T. evansi, arklių infekcinę anemiją, Purpura Heamorrhagica, Afrikinę arklių ligą, kergimo ligą, apsinuodijimą įvairiais augalais ir cheminėmis medžiagomis (62).

2.4. Diagnozavimas

Arklių piroplazmozės diagnozavimui naudojamas kraujo tepinėlio tyrimas mikroskopuojant. Dažymui naudojami 10 proc. Gimzos dažai ir yra ieškoma parazitų eritrocituose. Ūmių atvejų metu šis metodas yra vadinamas ,,auksiniu standartu”. B. caballi yra pastebima kriaušės formos, dažniausiai poromis, o T. equi – kriaušės formos, po keturias arba formuojant vadinamąjį “Maltos kryžiaus” modelį (62,70,71). T. equi dažnai gali būti randama ūmiais atvejais, o B. caballi kartais sunku rasti net ir ūmių atvejų metu (62).

Kadangi ligos nešiotojams yra sunku diagnozuoti arklių piroplazmozę, yra naudojami

serologiniai tyrimo metodai. Tai – komplemento fiksavimo tyrimas, netiesioginis

(19)

2.4.1. Komplemento fiksavimo tyrimas

Šis testas yra iki šiol patvirtintas įprastas arklių piroplazmozės tyrimas ir yra naudojamas įvežant arklius į laisvas nuo arklių piroplazmozės šalis. Pagrindinis šio tyrimo standartas yra komplemento fiksavimas vykstant reakcijai tarp specifinio antigeno ir antikūno. Komplemento fiksavimo tyrimas nustato antikūnų titrus nuo 8 dienos po infekcijos ir titrai mažėja nuo 2 – 3 mėnesio po infekcijos. Sirgę arkliai turi būti dar kartą ištirti nuo 4 iki 6 savaičių po gydymo. Dėl Ig (T) antikūnų buvimo šis tyrimas parodė žemą jautrumą lėtiniais atvejais (70).

2.4.2. Netiesioginis imunofluorescencinis metodas

Šis tyrimas yra jautresnis ir yra naudojamas kaip papildomas, kai komplemento fiksavimo tyrimo rezultatai yra abejotini. Šio bandymo metu, tiriami kraujo serumai reaguoja su parazitų antigenais ir yra pritvirtinti prie objektinio stiklelio. Antikūnai yra stebimi naudojant ultravioletinę šviesą, prieš tai prijungus fluoresceinu žymėtą serumą. Norint padidinti specifiškumą, kraujo serumas turi būti praskiestas. Šis tyrimas yra sunkus, jam reikia didelių kiekių antigenų (70).

2.4.3. Imunofermentinis metodas (ELISA)

Šio tyrimo metu yra identifikuojami dominuojantys antikūnai tiek prieš T. equi tiek prieš B. caballi. ELISA gali nustatyti slaptas infekcijas, kurių nenustatė komplemento fiksavimo tyrimas. 2004 metais OIE patvirtino, jog šis tyrimas yra tinkamas naudoti tarptautinės arklių prekybos metu, norint identifikuoti T. equi ir B. caballi (62,70,71).

2.4.4. PGR tyrimas

PGR yra dažniausiai naudojamas mokslinių tyrimų tikslais, taip pat tiriant arklius endeminiuose regionuose dėl šio tyrimo jautrumo ir specifiškumo. Yra aprašyta, jog PGR nustatė T. equi 0.0083 proc. parazitemijas ir B. caballi 0,017 proc. parazitemijas. Šis tyrimas yra tinkamas nustatyti T. equi ir B. caballi, kai naudojant kitus tyrimo metodus, parazitai neaptinkami. Taip pat šis tyrimas naudingas norint nustatyti parazitus kraujyje ligos nešiotojams (62,70).

2.9. Gydymas

Arklių piroplazmozės gydymui, sukeltos B. caballi, naudojamas imidokarbo dipropionatas. Jis taip pat gali būti naudojamas ir prieš T. equi, tačiau šiuo atveju, jo veiksmingumas yra mažesnis (71).

Teigiama, jog B. caballi infekcija gali ir pranykti pati. Arkliams, užsikrėtusiems B. caballi ir esant ūmiai ligos formai, imidokarbas turi būti aplikuojamas į raumenis, 2,2 mg/kg kūno svorio, du kartus, esant 24 valandų tarpui. Taip pat efektyvus yra ir diminazeno aceturatas, kuris taip pat skiriamas du kartus, esant 24 valandų tarpui, 11 mg/kg kūno svorio, aplikuojant giliai į raumenis. Amikarbalidas, naudojamas vieną kartą, 9 – 10 mg/kg kūno svorio, aplikuojant į raumenis, taip pat yra tinkamas, esant ūmiai ligos formai. Šie gydymo būdai gali visiškai pašalinti B. caballi iš

(20)

organizmo. Yra nustatyta, jog tetraciklinas ir kiti preparatai tik pašalina klinikinius simptomus, tačiau sukėlėjo iš organizmo nepašalina.

Arkliams, užsikrėtusiems T. equi, skiriamas imidokarbo dipropionatas, aplikuojamas į raumenis su 72 valandų tarpu, 4 mg/kg kūno svorio. Teigiama, jog imidokarbo dipropionatas yra efektyviausias esant mišriai infekcijai. Efektyvios priemonės vis dar nėra nustatytos prevencijai prieš abortus. Tiksliai nėra žinoma, kurią vaisiaus stadiją paveikia T. equi ir tinkamas gydymo laikas taip pat nėra numatytas. Abortai dažniausiai įvyksta trečia kumelingumo trimestrą, tačiau T. equi buvo nustatyta vaisiuose 120-tą kumelingumo dieną. Per 2 valandas 2,4 mg/kg kūno svorio imidokarbo aplikavimo, jis piene yra pašalinamas (72).

3. Prevencija ir profilaktika

Permetrino pagrindu pagaminti akaricidai yra veiksminga priemonė prieš erkes. Yra labai svarbu, kad preparatus būtų saugu naudoti arkliams (71,72). Nuolatinė gyvūnų apžiūra ir rastų erkių likvidavimas iš karto yra taip pat būtina priemonė. Radus erkes, jos turi būti surinktos ir saugomos laikant jas formaline ar alkoholyje ir atiduotos identifikavimui. Turi būti aprašyta, ant kurio gyvūno ir kurioje vietoje jos buvo rastos. Dezinfekcija ar sanitarija nėra veiksmingos priemonės, tačiau užkirsti kelią kontaktui su kitais gyvūnais ir galimybę erkei pernešti sukėlėją su krauju yra svarbu (62,71). Vakcinos nuo piroplazmozės nėra (62, 73, 74).

(21)

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Tyrimas buvo atliktas 2017– 2018 metais. Tyrimą sudarė du etapai. I etapas atsitiktinių imčių analizė, kai arklių kraujo mėginiai buvo renkami X, Y, Z žirgynuose esantiems visiems arkliams bei II etapas LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikoje atvežtų arklių (pacientų) kraujo tyrimas bei gydymas. Pirmojo etapo metu arklių kraujo mėginiai buvo imami atsitiktiniu būdu, pasirinkus tris žirgynus vadovaujantis 2017 metų epizootologiniais duomenimis esant didžiausiam erkių paplitimui rajonuose ar žirgynams esant prie miško. Antrojo etapo metu arklių kraujo mėginiai buvo imti LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikoje esantiems pacientams įtarus ligą, atsižvelgiant į ligos simptomus. Arkliai į LSMU VA Stambiųjų gyvūnų kliniką buvo atvežti dėl dieglių. Atlikus diegliuojančio arklio tyrimą ir nustačius klinikinius simptomus, panašius į arklių granuliocitinę anaplazmozę, buvo nuspręsta atlikti išsamesnius pacientų tyrimus. Buvo atlikti kraujo tepinėlio tyrimai ir aptikus morules neutrofiluose, buvo atlikti ir greitieji diagnostiniai testai. Patvirtinus diagnozę pacientai buvo gydomi nuo arklių granuliocitinės anaplazmozės.

Iš viso buvo surinkti ir ištirti 36 arklių kraujo mėginiai: I etapo metu 33 arklių kraujo mėginiai, II etapo metu 3 arklių kraujo mėginiai. Tyrimai buvo atliekami LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikos, klinikinių tyrimų laboratorijoje. Visi tyrimai buvo atlikti sutikus gyvūnų savininkams bei laikantis Nacionalinių ir Europos Sąjungos teisės aktų reikalavimų: Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 2012, Nr. 122–6126); Europos Ekonominės Bendrijos Stuburinių gyvūnų, naudojamų eksperimentiniams ir kitiems mokslo tikslams, apsaugos direktyvos ir Stuburinių gyvūnų, naudojamų eksperimentams ir kitiems mokslo tikslams, apsaugos Europos Tarybos konvencijos.

(22)

7 pav. Principinė tyrimo schema

2.1. Tiriamųjų grupių sudarymas

Tirtų arklių veislės buvo: Žemaitukas, Lenkijos jojamoji, Lietuvos jojamoji, Oldenburgo. Tirtų arklių pasiskirstymas pagal veislę  Lenkijos jojamoji sudarė 3,6 proc. (1/36), Žemaitukas 33 proc., Lietuvos jojamasis 42 proc., Oldenburgo 22 proc. visų tirtų arklių.

Pasiskirstymas pagal lytį yra: 50 proc. kumelės ir 50 proc. eržilai.

28 tirti arkliai buvo iš Kauno rajono. Tai sudaro 78 proc. visų tirtų arklių. Iš Panevėžio rajono buvo tirti 8 arkliai (22 proc.).

I etapas X, Z, Y žirgynai (n=33) II etapas LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinika (n=3) Kraujo mėginių rinkimas iš v. jugularis Kraujo morfologinis tyrimas Kraujo tepinėlių ruošimas ir dažymas Leukoformulės skaičiavimas A. phagocytophilum ir piroplazmozės identifikavimas kraujo tepinėlyje „FASTest® ANAPLASMA” Gydymas oksitetraciklinu

(23)

1 lentelė. Tirtų arklių veislės, lytis, rajonas

Tyrimo etapas Arklių skaičius Veislė Lytis Rajonas

I etapas

1 Lietuvos jojamasis Eržilas Kauno

4 Lietuvos jojamoji Kumelė Kauno

14 Žemaitukas Eržilas Kauno

18 Žemaitukas Kumelė Kauno

26 Oldenburgo Kumelė Panevėžio

29 Oldenburgo Eržilas Panevėžio

II etapas

34 Lenkijos jojamoji Kumelė Kauno

2.2. Kraujo mėginių surinkimas

Arklių kraujo mėginiai buvo renkami į vakuuminius mėgintuvėlius (5 ml „BDVacutiner “) su antikoaguliantu (EDTA), laikantis aseptikos ir antiseptikos reikalavimų.

Kraujo ėmimui buvo naudota kraujo ėmimo sistema, kuri sudaryta iš trijų dalių: vienkartinio vakuuminio kraujo paėmimo mėgintuvėlio laikiklio, kraujo paėmimo adatos ir vakuuminio mėgintuvėlio. Mėgintuvėlis, naudotas kraujo surinkimui, buvo su etilendiaminotetraacto rūgšties koaguliantu (EDTA), medžiaga, kuri neleidžia kraujui sukrešėti mėgintuvėlyje.

(24)

Mėginiai buvo renkami iš veninio kraujo, paimto iš v. jugularis. Prieš imant kraują, dūrio vieta dezinfekuojama spiritiniu tirpalu. Jungo vena užspaudžiama žemiau dūrio vietos. Užspaudus v. jugularis adata yra duriama į išryškėjusią veną 45 laipsnių kampu. Įdūrus adatą į veną, prie kito jos galo, kuris yra adatos fiksatoriuje, prijungiamas vakuuminis mėgintuvėlis. Kraujui pradėjus tekėti mėgintuvėlio sienele, turi būti užtikrinta, kad srovė nestipri, kadangi dėl to yra pažeidžiami kraujo elementai ir kraujas suputoja. Kraujui pripildžius 2/3 mėgintuvėlio, jis nustoja tekėti. Pirmiausia atjungiamas vakuuminis mėgintuvėlis ir tik tada ištraukiama adata iš venos. Dūrio vieta užspaudžiama vata, suvilgyta spiritiniu tirpalu. Laukiama, kol kraujas nustos tekėti ir sukrešės. Vakuuminis mėgintuvėlis su EDTA kelis kartus švelniai pavartomas, kad kraujas pasiskirstytų mėgintuvėlyje ir susimaišytų su antikoaguliantu.

Po kraujo paėmimo vienkartinės vakuuminės adatos ir adatų fiksatoriai buvo utilizuojami. Kraujo mėginiai paėmus kraują buvo numeruojami ir patalpinami į transportinį šaldytuvą (0– 4 °C) ir iš karto gabenami į LSMU VA tyrimų bazę.

2.3. Kraujo morfologinis tyrimas, kraujo tepinėlių ruošimas, dažymas

Pristatyti kraujo mėginiai į LSMU VA tyrimų bazę, laboratorijoje buvo vartomi papildomai, naudojant automatinę vartyklę „ELMI RM–2 S” (žr. 8 pav.). Mėginiai buvo po vieną išimti, tirti ir vertinti automatiniu morfologiniu analizatoriumi „Abacus Junior Vet” (žr. 9 pav.). Nustatyti bendri eritrocitų (RBC) ir leukocitų (WBC), limfocitų (LYM) ir trombocitų (PLT) kiekiai, hemoglobino (Hb) koncentracija, hematokritas (HCT), apskaičiuoti kiti rodikliai: vidutinis eritrocito tūris (MCV), vidutinis hemoglobino tūris (MCH), vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (MCHC).

(25)

9 pav. automatinis morfologinis analizatorius„Abacus Junior Vet” (Stambiųjų gyvūnų klinika)

Kraujo tepinėliai buvo ruošiami iš veninio kraujo, paimto iš v. jugularis.

Kraujo tepinėliai dažyti Papenheimo metodu (Kraft and Durr, 1997), naudojant May-Griunvaldo ir Gimzos-Romanovskio dažus (Merck KGaA, Vokietija). Tepinėliai vertinti mikroskopu XSZ-107BN (Japonija) 100x padidinimu.

Kraujo lašas buvo dedamas ant naujo, nenaudoto objektinio stiklelio. Kitas objektinis stiklelis, 30 – 40° kampu, buvo glaudžiamas per kraujo lašą prie objektinio stiklelio. Palaukus, kol kraujas pasiskleis palei visą objektinio stiklelio kraštinę švelniai spaudžiant, kraujas stumiamas į kitą stiklelio galą. Tepinėliai buvo daromi ploni. Išdžiovinus, tepinėliai buvo dažomi Pappenheim metodu, naudojant kombinaciją su May-Grünwald tirpalu ir Giemsa tirpalu.

Procedūra:

1. May– Grünwald tirpalas (4 min)

2. Nuskalauti buferiniu tirpalu (pH 7.2, 1min.)

3. Praskiestas Giemsa tirpalas (20 min) (1 ml vandens: 2 lašai of Giemsa dažų) 4. Nuskalauti tekančiu vandeniu (2 min)

5. Sausinimas (3 – 5 min)

2.4. Leukoformulių skaičiavimas, greitasis diagnostinis testas

Tepinėliai vertinti mikroskopu (YS 100, Nicon, Japonija) 100x padidinimu. Leukoformulė skaičiuota kiekvienam tepinėliui atskirai, fiksuojant kiek tepinėlyje buvo: mielocitų, jaunų neutrofilų, lazdelinių neutrofilų, segmentinių neutrofilų, eozinofilų, bazofilų, limfocitų, monocitų. Skaičiuota šimtas ląstelių, duomenys suvesti į MS Excel programą ir apskaičiuota procentinė kiekvienos ląstelės dalis.

Atliekant kraujo vertinimą greituoju testu „FASTest® ANAPLASMA”, buvo naudojama

(26)

buferinio tirpalo (80 – 100 μl). Testo rezultatai buvo vertinami praėjus 15 minučių po buferinio tirpalo užlašinimo. Testas buvo vertintas kaip teigiamas, jeigu atsirado kontrolinė juostelė (C) bei testo juostelė (T).

10 pav. A. phagocytophilum identifikavimui naudotas greitasis diagnostinis testas „FASTest®

ANAPLASMA”.

2.5. A. phagocytophilum ir piroplazmozės identifikavimas kraujo tepinėlyje

Identifikuojant A. phagocytophilum, tepinėlis buvo tiriamas imersiniu mikroskopu (Nicon) ir ant paruošto kraujo tepinėlio buvo lašinamas lašas imersinio aliejaus. Mikroskopuojant leukocituose (neutrofiluose) buvo ieškoma morulių. Morulės buvo matomos kaip tamsiai mėlynos ar violetinės spalvos mikrokolonijos. Radus kraujo tepinėlyje daugiau nei 3 morules – mėginys buvo laikomas kaip teigiamas A. phagocytophilum atžvilgiu.

Identifikuojant piroplazmozę buvo tiriamas tas pats paruoštas kraujo tepinėlis, kuriame buvo ieškoma A. phagocytophilum suformuotų morulių. Šiuo atveju mikroskopuojant buvo ieškoma eritrocitų, kuriuose būtų piroplazmozės sukėlėjų T. equi ir B. caballi. Šiuos parazitus identifikuoti vieną nuo kito buvo galima tik pagal tai, kaip jie dažniausiai pastebimi eritrocituose. T equi kriaušės formos, po keturias arba formuojant vadinamąjį “Maltos kryžiaus” modelį, o B. caballi- kriaušės formos, dažniausiai poromis.

(27)

12 pav. A. phagocytophilum morulė neutrofile (100 x padidinimas (dr. Z. Miknienė)

2.6. Gydymo metodika

Arklių granuliocitinės anaplazmozės gydymui buvo naudojami tetraciklinų grupės antibiotikai (oksitetraciklinas). Taikyta dozė – 7 mg/kg į veną, 8 dienas iš eilės.

2.7. Statistinė analizė

Skaičiavimai apdoroti Microsoft Excel for Mac (Microsoft Inc., 2015) paketu. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „SPSS Statistics for Mac, Version 21.0” (SPSS Inc., JAV, 2012). Apskaičiuotas vidutinis aritmetinis vidurkis, vidutinio aritmetinio vidurkio paklaida, laisvų narių skaičius, standartinis nuokrypis ir grupių statistinio patikimumo laipsnis (p). Skirtumai statistiškai patikimais laikomi, kai p < 0,05; p < 0,01. Koreliacinių ryšių patikimumas tarp morfologinių rodiklių vertintas naudojant Pirsono koreliacinę matricą. Koreliacijų reikšmės vertintos naudojant koreliacijos reikšmių lentelę (žr. 2 lentelę). Darbas parengtas Microsoft Word for Mac (Microsoft Inc., 2015).

2 Lentelė. Koreliacijos reikšmės (75)

Neigiamos reikšmės Aprašymas Teigiamos reikšmės

0,00 „Nėra“ 0,00 0,19 – -0,01 „Labai silpnas“ 0,01 – 0,19 -0,39 – -0,20 „Silpnas“ 0,20 – 0,39 -0,69 – -0,40 „Vidutinis“ 0,40 – 0,69 -0,89 – -0,70 „Stiprus“ 0,70 – 0,89 -0,99 – -0,90 „Labai stiprus“ 0,90 – 0,99 -1,00 „Visiškai tikslus“ 1,00

(28)

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Sergančių arklių pasiskirstymas tirtuose žirgynuose

Nustatytas ligos pasiskirstytas žirgynuose. X žirgyne arklių granuliocitine anaplazmoze sirgo 1, arklių piroplazmoze 2 arkliai. Viso šiame žirgyne buvo tirta 13 arklių. Y žirgyne arklių piroplazmoze sirgo 1 arklys. Šiame žirgyne buvo tirta 12 arklių. Z žirgyne arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze bei piroplazmoze, nebuvo. Z žirgyne buvo tirti 8 arkliai.

3 lentelė. Sveikų ir sergančių arklių pasiskirstymas žirgynuose

Liga

Viso

Piroplazmozė Sveiki Anaplazmozė

Žirgynai X Kiekis 2 10 1 13 Proc. 15 77 8 100 Y Kiekis 1 11 0 12 Proc. 8,33 91,66 0 100 Z Kiekis 0 8 0 8,00 Proc. 0 100 0 100 Viso Kiekis 3 29 1 33 Proc. 9,0909 87,8787 3,0303 100

3.2. Kraujo morfologinių rodiklių kitimas sergant arklių granuliocitine

anaplazmoze ir arklių piroplazmoze

Iš visų tirtų arklių (n = 36), arklių granuliocitinė anaplazmozė buvo diagnozuota 4 arkliams, o piroplazmozė 3 arkliams. Sveiki arkliai buvo 29.

13 pav. Kraujo morfologinių rodiklių WBC (x109/L), LYM, (x109/L), MID (x109/L), GRA

(x109/L) vidutinės normos su standartiniu nuokrypiu (±SE)

7,57 10,64 7,61 4,68 8,90 5,81 2,44 1,65 1,62 0,26 0,43 0,18 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

Sveiki Anaplazmozė Piroplazmozė 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 LY M, MID (10 ^9/L) WBC , GRA (10 ^9/L)

(29)

Arkliams, sirgusiems granuliocitine anaplazmoze, nustatytas statistiškai reikšmingas bendrųjų baltymų kiekio (p = 0,007; p < 0,05), granuliocitų kiekio (p = 0,03; p < 0,05) padidėjimas, statistiškai nereikšmingas monocitų (p > 0,05) padidėjimas, lyginant su sveikais arkliais. Vidutinis bendras leukocitų kiekis buvo didesnis už fiziologines normas (2 proc.), granuliocitų (2 proc.) (žr. 13 pav.). Arkliams, sirgusiems piroplazmoze, nustatytas statistiškai nereikšmingas bendrųjų baltymų kiekio, granuliocitų kiekio padidėjimas. Arklių, sirgusių granuliocitine anaplazmoze ir piroplazmoze, nustatytas dvigubai mažesnis limfocitų kiekis lyginant su sveikais arkliais ir fiziologine norma (1 priedas).

14 pav. Kraujo morfologinių rodiklių LY (%), GR (%), MI (%) vidutinės normos su standartiniu

nuokrypiu (±SE)

Kaip matoma iš 14 paveislo, atlikus arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze kraujo morfologinį tyrimą, nustatytas limfocitų koncentracijos sumažėjimas, lyginant su sveikais arkliais. Arklių, sergančių piroplazmoze, limfocitų koncentracija taip pat nustatyta sumažėjusi, lyginant su sveikais arkliais. Granuliocitų koncentracija, arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, nustatyta padidėjusi, lyginant su sveikais arkliais. Taip pat padidėjimas nustatytas ir arkliams, sergantiems piroplazmoze, lyginant su sveikais arkliais. Monocitų koncentracija, arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, nustatyta fiziologinės normos ribose, tačiau arkliams, sergantiems piroplazmoze, monocitų koncentracija nustatyta sumažėjusi, lyginant su sveikais arkliais (1 priedas). 31,82 21,20 15,85 67,43 84,80 76,60 3,40 3,63 2,20 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00

Sveiki Anaplazmozė Piroplazmozė

MI (% ) G R, LY (% ) LY (%) GR (%) MI (%)

(30)

15 pav. Kraujo morfologinių rodiklių RBC (x1012/L), HGB (g/L), HCT (%) vidutinės normos su

standartiniu nuokrypiu (±SE)

Atlikus arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze ir piroplazmoze kraujo morfologinį tyrimą, nustatyta hemoglobino koncentracijos, hematokrito ir bendrųjų eritrocitų kiekio padidėjimai. Statististinis reikšmingumas nenustatytas (p> 0,05). Arklių, sergančių piroplazmoze, hematokrito kiekis nustatytas didesnis, lyginant su fiziologine norma (žr. 15 pav.). Arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, nustatytas bendras eritrocitų skaičius didesnis, lyginant su fiziologine norma (1 priedas).

16 pav. Kraujo morfologinių rodiklių) PLT (x109_{/L), PDWc (%), MPV (fL) vidutinės normos su}

standartiniu nuokrypiu (±SE)

Kaip matoma iš 16 paveikslo, atlikus arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze kraujo morfologinį tyrimą, nustatytas bendras trombocitų kiekio sumažėjimas, lyginant su sveikais arkliais,

137,94 158,00 154,50 43,02 46,90 50,22 9,06 10,13 9,98 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 10,50 11,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 180,00

RBC (10 ^12/L) H G B, (g/ L); H CT , ( %) HGB (g/L) HCT (%) RBC (10^12/L) 164,17 137,67 190,00 34,23 34,77 32,95 7,04 _7,30 6,40 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 MPV (f L) PLT (10 ^9/L) ; PDWc (% ) PLT (10^9/L) PDWc (%) MPV (fL)

(31)

tačiau arklių, sergančių piroplazmoze  nustatytas padidėjimas. Arkliams, sergantiems piroplazmoze, nustatyta trombocitozė. Duomenys statistiškai nepatikimi (1 priedas).

3.3. Kraujo leukoformulės pakitimai tarp sergančių ir nesergančių

4toje lentelėje pateikti tirtų arklių (sveikų, sirgusių granuliocitine anaplazmoze ir piroplazmoze) leukoformulės parametrų vidurkiai su standartiniu nuokrypiu.

4 lentelė. Leukoformulės vidurkiai ir standartinis nuokrypis (±SE)

a, b, c - skirtingomis raidėmis stulpelyje pažymėti vidurkiai skyrėsi tarpusavyje statistiškai reikšmingai (p < 0,05).

Atlikus leukoformulės skaičiavimus, tiriamųjų arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, nustatytas statistiškai reikšmingai padidėjęs lazdelinių neutrofilų skaičius (p = 0,001; p < 0,05), monocitų skaičius (p = 0,001; p < 0,05) ir sumažėjęs limfocitų skaičius (p = 0,001; p < 0,05) lyginant su sveikais arkliais; tačiau statistiškai nereikšmingai stebimas segmentinių neutrofilų skaičiaus padidėjimas.

Tiriamųjų arklių, sergančių piroplazmoze, nustatytas statistiškai reikšmingas padidėjęs lazdelinių neutrofilų skaičius (p = 0,032; p < 0,05), segmentinių neutrofilų skaičius (p = 0,037; p < 0,05) sumažėjęs limfocitų skaičius (p = 0,003; p < 0,05) ir monocitų skaičius (p = 0,001; p < 0,05) lyginant su sveikais arkliais; tačiau statistiškai nereikšmingas yra padidėjęs bazofilų skaičius. Arklių, sergančių piroplazmoze, nustatytas statistiškai reikšmingai sumažėjęs lazdelinių neutrofilų skaičius (p = 0,032; p < 0,05) lyginant su arkliais, sergančiais granuliocitine anaplazmoze. Arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, nustatytas didesnis nei norma lazdelinių neutrofilų ir monocitų skaičius, sergančių piroplazmoze, nustatytas didesnis nei norma segmentinių neutrofilų ir eozinofilų skaičius. Sergančių arklių atvejais, nustatytas sumažėjęs limfocitų skaičius, lyginant su fiziologine norma.

Sveiki Anaplazmozė Piroplazmozė Norma

(76) n 29 4 3 Mielocitai, % 0,17±0,07 0,00±0,07 0,33±0,33 0 Jauni neutrofilai, % 1,52±0,32 1,75±0,32 1,33±0,88 01 Lazdeliniai neutrofilai, % 1. ,59±0,41 a 10,75±0,41 c 3,33±1,76 bc 36 Segmentiniai neutrofilai, % 48,21±2,36 a 52,00±2,36 64,00±2,31b 4562 Eozinofilai, % 5,48±0,87 5,50±0,87 3,00±2,52 26 Bazofilai % 3,97±0,85 1,25±0,85 8,00±5,57 01 Limfocitai, % 36,59±1,80 a 13,25±1,80 b 17,67±4,85 bc 2544 Monocitai, % 2,48±0,47 a 15,75±0,47 b 2,33±0,88 c 24

(32)

3.4. Pirsono koreliacija

Analizuojant kintamųjų priklausomybę atlikta koreliacinė analizė paskaičiuojant Pirsono koreliacijos koeficientą.

Sergančių arklių piroplazmoze, visi kraujo morfologiniai rodikliai tarpusavyje koreliuoja stipriai. WBC (x109_{/L) stipriai neigiamai koreliuoja su GR (%), MCHC (g/L), RDWc (%), PLT}

(x109/L), PCT (%) (p < 0,01). WBC (x109/L), LYM (x109/L), MID (x109/L), GRA (x109/L), LY (%), MI (%), MPV(fL), PDWc (%) stipriai teigiamai koreliuoja tarpusavyje (p < 0,01).

Stipriai neigiamai LYM (x109/L), MID (x109/L), GRA (x109/L), LY (%), MI (%), MPV(fL), PDWc (%) koreliuoja su GR (%), MCHC (g/L), RDWc (%), PLT (x109/L), PCT (%) (p < 0,01).

Stipriai neigiamai koreliuoja GR (%) su WBC (x109/L), LYM (x109/L), MID (x109/L), GRA

(x109/L), LY (%), MI (%), RBC (x1012/L), HGB (g/L), HCT (%), MCV (fL), MPV (fL), PDWc (%)

(p < 0,01). O Stipriai teigiamai koreliuoja su MCHC (g/L), RDWc (%), PLT (x109/L), PCT (%) (p <0,01).

RBC (x1012/L), HGB (g/L), HCT (%), HCT (%), MCV (fL), MCH (pg) stipriai teigiamai koreliuoja tarpusavyje (p < 0,01).

RBC (x1012/L), HGB (g/L), HCT (%), MCV (fL), MCH (pg) stipriai neigiamai koreliuoja su

MCHC (g/L), RDWc (%), PLT (x109/L), PCT (%) (p < 0,01).

MCHC (g/L), RDWc (%), PLT (x109/L), PCT (%) stipriai neigiamai koreliuoja su WBC (x109/L), LYM (x109/L), MID (x109/L), GRA (x109/L), LY (%), MI (%), GR (%), RBC (x1012/L), HGB (g/L), HCT (%), MCV (fL), MCH (pg) (p < 0,01). Stipriai teigiamai MCHC (g/L), RDWc (%), PLT (x109_{/L), PCT (%) koreliuoja tarpusavyje (p < 0,01).}

WBC (x109_{/L), LYM (x10}9_{/L), MID (x10}9_{/L), GRA (x10}9_{/L), LY (%), MI (%), MPV(fL),}

PDWc (%) stipriai teigiamai koreliuoja tarpusavyje (p < 0,01).

Arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, kraujo morfologiniai rodikliai tarpusavyje koreliavo stipriai. Stipriai teigiamai tarpusavyje koreliavo MID (x109/L) su MI (%) (p < 0,01). Stipriai teigiamai koreliavo WBC (x109/L) su MCV (fL) (p < 0,05). Stipriai neigiamai koreliavo LYM (x109/L) su HCT (%) (p < 0,05).

GRA (x109/L) stipriai teigiamai koreliavo su MCV (fL) ir MCH (pg) (p < 0,05), stipriai neigiamai su MCHC (g/L) (p < 0,05), PLT (x109/L), PCT (%), MPV(fL), PDWc (%) (p < 0,01).

LY (%) stipriai teigiamai koreliavo su MCHC (g/L) (p < 0,01), o stipriai neigiamai su HCT (%) (p < 0,05).

Stipriai neigiamai HCT (%) koreliavo su MCHC (g/L) (p < 0,05). GR (%) stipriai neigiamai koreliavo su PLT (x109/L), PCT (%), MPV(fL), PDWc (%) (p < 0,01) (2 priedas).

(33)

Vertinant arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze leukoformules, limfocitai stipriai neigiamai koreliavo su segmentiniais neutrofilais (žr. 5 lentelę).

5 lentelė. Sergančių arklių granuliocitine anaplazmoze leukoformulės rodiklių koreliacija Anaplazmozė Mielocitai Jauni neutrofilai Lazdeliniai neutrofilai Segmentiniai

neutrofilai Eozinofilai Bazofilai Limfocitai Monocitai Mielocitai Jauni neutrofilai 1 ,575 -,073 ,014 -,293 ,053 -,590 Lazdeliniai neutrofilai 1 -,808 -,582 ,494 ,782 -,852 Segmentiniai neutrofilai 1 ,435 -,912 -,999 ** _,805 Eozinofilai 1 -,236 -,391 ,091 Bazofilai 1 ,928 -,594 Limfocitai 1 -,806 Monocitai 1

(34)

3.5. Gydytų arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, kraujo rodikliai 6 lentelė. Arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, kraujo rodikliai prieš gydymą ir po

gydymo

Anaplazmozė Prieš 1 atvejis 2 atvejis 3 atvejis

gydymą Po gydymo Prieš gydymą Po gydymo Prieš gydymą Po gydymo WBC (10^9/L) 6,79 6,92 12,55 9,86 11,15 10,59 LYM (10^9/L) 1,05 1,58 0,99 1,25 3,29 3,53 MID (10^9/L) 0,04 0,04 0,51 0,41 0,30 0,20 GRA (10^9/L) 5,7 5,29 11,05 8,20 9,94 4,27 LY (%) 15,5 22,90 7,90 12,70 29,50 33,50 MI (%) 0,6 0,60 4,10 4,10 2,70 2,70 GR (%) 83,9 76,50 88,00 83,20 82,50 60,90 RBC (10^12/L) 11,56 9,36 10,93 10,33 7,86 8,72 HGB (g/L) 158,00 128,00 181,00 160,00 139,00 136,00 HCT (%) 48,1 38,95 49,05 44,65 37,71 37,96 MCV (fL) 42,00 42,00 54,00 53,00 48,00 43,00 MCH (pg) 13,6 13,70 16,50 15,50 17,70 15,70 MCHC (g/L) 328,00 328,00 306,00 293,00 368,00 368,00 RDWc (%) 22,5 22,50 20,80 21,30 22,00 22,20 PLT (10^9/L) 124,00 189,00 103,00 146,00 115,00 129,00 PCT (%) 0,08 0,11 0,07 0,11 0,09 0,09 MPV (fL) 6,70 5,80 7,10 7,40 7,60 6,90 PDWc (%) 5,60 31,70 34,50 33,40 34,80 33,10

WBC – bendras leukocitų kiekis; LYM – limfocitų kiekis; MID – bendras monocitų skaičius; GRA – bendras granuliocitų kiekis; LY % – limfocitai, proc.; GR % – granuliocitai, proc.; MI % – monocitai, proc.; RBC – bendras eritrocitų kiekis; HGB – hemoglobino koncentracija; HCT – hematokritas; MCV – vidutinis eritrocitų tūris; MCH – vidutinis hemoglobino kiekis eritrocite; MCHC – vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite; RDWc – eritrocitų pasiskirstymo plotis; PLT – bendras trombocitų skaičius; PCT – suminis trombocitų tūris; MPV – vidutinis trombocitų tūris.

Prieš gydymą, visais trimis tirtais atvejais, GR % koncentracija kraujyje buvo padidėjusi, lyginant su norma (22 – 80 proc.), tačiau po taikyto gydymo oksitetraciklinu, GR % koncentracija arklių kraujyje sumažėjo. Antruoju bei trečiuoju atveju, WBC x109_{/L kiekis kraujyje prieš gydymą}

buvo padidėjęs lyginant su norma 4,9 – 10,3 x109_{/L. Po gydymo oksitetraciklinu, WBC x10}9_{/L kiekis}

kraujyje sumažėjo. Visais atvejais, mūsų tirtiems ir gydytiems arkliams (n = 3), limfocitų kiekis buvo nepadidėjęs, lyginant su norma (1,7 – 5,8 x109_{/L). Pirmuoju ir antruoju atveju, prieš gydymą}

oksitetraciklinu, RBC x1012/L kiekis kraujyje buvo padidėjęs lyginant su norma 6,2 – 10,2 x1012/L, o po gydymo RBC x1012/L kiekis sumažėjo.

(35)

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Lietuvoje apie arklių granuliocitinę anaplazmozę bei piroplazmozę yra labai mažai duomenų. Mes beveik nieko nežinome apie šios ligos plitimą mūsų šalyje. Todėl gauti rezultatai buvo lyginami su užsienio šalių literatūra bei užsienio šalyse atliktais tyrimais.

Vidutinis bendras leukocitų kiekis sergančių arklių granuliocitine anaplazmoze buvo 10,64±1,31 x109_{/L. Southwood (2013) tyrimo duomenimis, bendras leukocitų kiekis turėtų būti}

4,9 – 10,3 x109/L (77). Taip pat, Kornelio universiteto, Veterinarinės medicinos koledžo duomenimis (2014), nustatyta, kad sveikų arklių WBC x109_{/L norma yra 5,2 – 10,1 x10}9_{/L. Tai reiškia, jog mūsų}

tirtų arklių, sergančių granuliocitine anaplazmoze, bendras leukocitų skaičius yra didesnis nei fiziologinė norma. Saleem ir bendraautorių (2018) tyrimo duomenimis, nustatyta, kad arkliams, kurie yra užsikrėtę arklių granuliocitine anaplazmoze, bendras leukocitų kiekis yra padidėjęs, o limfocitų kiekis taip pat būna padidėjęs (78). Tačiau mūsų tirtiems arkliams vidutinis limfocitų skaičius nebuvo padidėjęs ir buvo fiziologinės normos ribose (77).

Vidutinis granuliocitų skaičius mūsų tirtiems, sergantiems granuliocitine anaplazmoze arkliams, buvo padidėjęs 8,90±1,63 x109_{/L lyginant su fiziologine norma. Saleem ir bendraautorių}

tyrimų duomenimis (2018), granuliocitų kiekis arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze buvo sumažėjęs sveikų arklių atžvilgiu (78,79).

Arklių, sergančių piroplazmoze, vidutinis bendras leukocitų kiekis buvo 7,61±0,70 x109_/L.

Southwood (2013) tyrimo duomenimis bendras leukocitų kiekis kraujyje turėtų būti nuo 5,57 iki 12,23 x109_{/L (77). Mūsų tyrimų duomenimis, bendras leukocitų kiekis arkliams, sergantiems}

piroplazmoze, yra normos ribose. Lakshmi (2015) tyrimo duomenimis, bendras leukocitų kiekis buvo nustatytas padidėjęs arkliams, serganties piroplazmoze, sveikų arklių atžvilgiu (80).

Vidutinis granuliocitų kiekis mūsų tirtiems arkliams, sergantiems piroplazmoze, buvo nustatytas padidėjęs lyginant su sveikais arkliais 5,81±0,32 x109/L. Lakshmi (2015) tyrimo duomenimis, granuliocitų kiekis kraujyje arkliams, sergantiems piroplazmoze, stebimas kaip padidėjęs, sveikų arklių atžvilgiu (80).

Vertinant leukoformulių pakitimus, lazdelinių neutrofilų kiekis, arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, nustatytas 10,75±0,41 proc., lyginant su sveikais arkliais– padidėjęs 5,5 karto, o lyginant su fiziologine norma beveik 2 kartus (3  6 proc.). Monocitų nustatytas kiekis 15,75±0,47 proc. buvo padidėjęs 4 kartus sergantiems granuliocitine anaplazmoze, lyginant su sveikais arkliais ir fiziologine norma 2 4 proc. Arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, nustatytas limfocitų kiekis 13,25±1,80 proc. buvo sumažėjęs beveik 3 kartus, lyginant su sveikais arkliais, sumažėjęs 2 kartus lyginant su fiziologine norma 25  44 proc.

(36)

Vertinant leukoformulių pakitimus arkliams, sergantiems piroplazmoze, lazdelinių neutrofilų kiekis 3,33±1,76 proc. buvo padidėjęs 2 kartus, lyginant su sveikais arkliais. Segmentinių neutrofilų skaičius 64,00±2,31 proc., arkliams, sergantiems piroplazmoze nustatytas padidėjęs 1,5 karto lyginant su sveikais arkliais. Nustatytas limfocitų kiekis arkliams, sergantiems piroplazmoze, 17,67±4,85 proc. 1,5 karto yra mažesnis nei fiziologinė norma, o lyginant su sveikais arkliais mažesnis 2 kartus.

Tiriant arklius, atvykusius į LSMU Stambiųjų gyvūnų kliniką (n = 3), pagrindinis simptomas buvo diegliai. Buvo atliktas diegliuojačių arklių klinikinis tyrimas, vadovaujantis LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikos diegliuojančio arklio prototokolu. Virškinimo trakto diegliams pilnai nepasitvirtinus ir tyrimo metu rastiems nebūdingiems dieglių simptomams: vangumas, priekinių galūnių patinimas, petechijos gleivinėse, gelta, buvo įtarta arklių granuliocitinė anaplazmozė. Saleem ir bendraautorių (2018) tyrimo duomenimis, arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, simptomai yra: karščiavimas, apatija, vangumas, priekinių galūnių patinimas, gleivinėse petechijos, gelta (79). Tirtuose kraujo tepinėliuose, pirmuoju ir antruoju atveju morulių buvo rasta daugiau nei trijuose neutrofiluose. Rikihisa (1991) ir Gribble (1969) tyrimų duomenimis, morulės gali būti pastebimos tik pirmąją savaitę, ūmioje ligos stadijoje (3,8). Trečiuoju atveju, kraujo tepinėlio tyrimu buvo įtariama granuliocitinė anaplazmozė, nes buvo rasti du neutrofilai su morulėmis. Atlikus greitąjį diagnostinį testą, diagnozė pasitvirtino.

Vertinant granuliocitų koncentraciją arklių kraujyje prieš gydymą, ji buvo padidėjusi, lyginant su norma (22  80), tačiau Saleem ir bendraautorių (2018) tyrimų duomenimis, arkliams, sirgusiems granuliocitine anaplazmoze, buvo stebimas granuliocitų kiekio sumažėjimas (78,79).

Antruoju bei trečiuoju atveju, bendras leukocitų kiekis kraujyje prieš gydymą buvo padidėjęs lyginant su norma 4,9 – 10,3 x109/L (77). Saleem su bedraautoriais (2018) tyrimo duomenimis, arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze bendras leukocitų kiekis buvo nustatytas kaip padidėjęs, lyginant su sveikais arkliais (78).

Saleem ir bendraautorių (2018) tyrimų duomenimis, limfocitų kiekis arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, yra padidėjęs (78), tačiau visais atvejais, mūsų tirtiems ir gydytiems arkliams (n = 3), limfocitų kiekis nebuvo padidėjęs, lyginant su norma (1,7–5,8 x109/L) (77).

Pirmuoju ir antruoju atveju, prieš gydymą oksitetraciklinu, RBC x1012/L kiekis kraujyje buvo padidėjęs lyginant su norma 6,2 – 10,2 x1012_{/L (77). O po gydymo RBC x10}12_{/L kiekis sumažėjo.}

Tačiau literatūroje tyrimų duomenų apie bendro eritrocitų kiekio pokytį arkliams, sergantiems granuliocitine anaplazmoze, nėra.

Remiantis Saleem (2018) tyrimų duomenimis, yra aprašoma keletas veiksmingų granuliocitinės anaplazmozės gydymo protokolų, naudojant tetraciklinus: skiriant oksitetracikliną dozė- 10 mg/kg, 5 dienas išeilės. Naudojant 7 mg/kg arba 8 mg/kg oksitetraciklino, jis buvo skiriamas 7 dienas iš eilės.

(37)

Taip pat veiksmingas gydymas aprašytas naudojant doksiciklino tabletes, 10 mg/kg, 7 dienas iš eilės (79). Mūsų tyrimo metu, buvo taikytas protokolas skiriant 7 mg/kg oksitetraciklino 8 dienas iš eilės. Po taikyto gydymo, buvo atliekami pakartotini tyrimai. Kraujo tepinėlio tyrimo metu morulių neutrofiluose nebuvo rasta, leukoformulės rezultatai buvo normos ribose, bei įvertinus kraujo morfologinius rodiklius, visi rodikliai buvo normos ribose. Taigi, taikytas gydymas buvo efektyvus ir visi gydyti arkliai (n = 3) pasveiko.