FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
IEVA DAUTARTAITĖ
KAROTENOIDŲ NUSTATYMAS VAISTINIŲ MEDETKŲ
(CALENDULA OFFICINALIS L.) ŽIEDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: doc. dr. Audronis Lukošius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
KAROTENOIDŲ NUSTATYMAS VAISTINIŲ MEDETKŲ
(CALENDULA OFFICINALIS L.) ŽIEDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas:
Prof. dr. Robertas Lažauskas
Darbo vadovas: Doc. dr. Audronis Lukošius
Darbą atliko: Magistrantė Ieva Dautartaitė 2017.06.01
TURINYS
PADĖKA ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.) ... 12
1.2. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų cheminė sudėtis ... 13
1.3. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų preparatų farmakologinės savybės ... 14
1.4. Karotenoidų struktūra ... 17
1.5. Karotenoidų medicininė reikšmė ... 19
1.6. Antioksidacinis poveikis ... 20
1.7. Karotenoidų nustatymo metodai ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23 2.1. Tyrimų objektas ... 23 2.2. Reagentai ... 24 2.3. Naudota aparatūra ... 24 2.4. Tyrimų schema ... 25 2.5. Tyrimų metodai ... 25
2.5.1. Tiriamojo pavyzdžio ruošimas ... 25
2.5.2. β-karoteno analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 26
2.5.3. Bendro karotenoidų kiekio, išreikšto β – karoteno ekvivalentu nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27
2.5.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 28
2.6. Metodo validacija ... 29
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. β-karoteno kokybinės sudėties analizė vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žieduose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 30
3.2. β-karoteno kiekio nustatymas vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žieduose
efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 31
3.3. Bendro karotenoidų kiekio nustatymas vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose spektrofotometriniu metodu ... 34
3.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose ... 37 4. IŠVADOS ... 39 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41 7. PRIEDAI ... 47
PADĖKA
Dėkoju darbo vadovui doc. dr. Audroniui Lukošiui už vertingus patarimus ir konsultacijas. Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Medicinos akademijos, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros prof. Liudui Ivanauskui, doktorantui Mindaugui Marksai už nuoširdžią pagalbą, patarimus, atliekant tyrimus ir analizuojant turimus duomenis.
SANTRAUKA
I. Dautartaitės magistro bagiamasis darbas. Mokslinis vadovas: doc. dr. Audronis Lukošius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmakognozijos katedra – Kaunas.
Magistro baigiamojo darbo tiriamasis objektas - vaistinė medetka (Calendula officinalis L.) - tai astrinių (Asteraceae), graižažiedžių (Compositae) šeimos, karotenoidus, flavanoidus, eterinius aliejus, gleives, saponinus kaupiantis žolinis augalas. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) vaistinė augalinė žaliava vartojama liaudies medicinoje ir pasižymi klinikiniais tyrimais įrodytais poveikiais: priešuždegiminiu, hepatoprotekciniu, ląstelių atsinaujinimą skatinančiu, antimikrobiniu, antioksidaciniu, antivėžiniu bei širdies ir kraujagyslių sistemos funkcijas gerinančiu. Darbo tikslas - nustatyti β-karoteno, bendrą karotenoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žieduose, surinktuose skirtingose augimo vietose, parinkus efektyviausią ekstrakcijos metodiką. Uždaviniai - parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas β-karoteno ir bendro karotenoidų kiekio nustatymui vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose; efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti β-karoteno kiekio įvairavimą vaistinių medetkų žiedų mėginiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose; įvertinti bendrą karotenoidų kiekio įvairavimą vaistinių medetkų žiedų mėginiuose, taikant spektrofotometrinį metodą; nustatyti vaistinių medetkų mėginių antioksidacinį aktyvumą FRAP metodu ir įvertinti šio parametro įvairavimą surinktuose skirtinguose mėginiuose.
Didžiausias β-karoteno kiekis (544,96 µg/g) nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, atliekant šviežių šaldytų vaistinių medetkų žiedų (Calendula officinalis L.) smulkintų skystu azotu, naudojant tirpiklį heksaną su 0,1 % butilhidroksitoluenu, ekstrakcijos metodą. Mažiausias β-karoteno kiekis nustatytas Biržų rajone (47,04 µg/g). Visi ekstraktai pasižymėjo antioksidaciniu aktyvumu (didžiausias nustatyas Vilkaviškio rajone – 154,2 µg/g, mažiausias – 7,28 µg/g Druskininkuose), tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų, atsižvelgiant į auginimo vietos ir redukcinio aktyvumo koreliaciją, nenustatyta. Didžiausias bendras karotenoidų kiekis (8,05 mg/g) nustatytas Kupiškio rajone, Subačiaus seniūnijoje skintuose vaistinių medetkų žieduose, t.y. apytiksliai 3,3 karto daugiau už nustatytą mažiausią karotenoidų kiekį (2,45 mg/g) vaistinėje augalinėje žaliavoje, rinktoje rugpjūčio 11 dieną Druskininkuose.
SUMMARY
Marigold (Calendula officinalis L.) is a yearling medicinal plant of Asteraceae family. It accumulates many biological active substances (carotenoids, flavonoids, essential oils, mucilage, saponins). Calendula officinalis L. is a perspective plant, used in antimicrobial, anti-inflammatory, hepatoprotective, cell-generation inducing, antioxidantive, anticancer treatment and effective against cardiovascular diseases.
The aim of study – to identify total quantity of β-carotene, all carotenoids that containing at the marigold flowers and antioxidative activity. Tasks – select the most effective extraction method of Calendula offcinalis L. flowers; to determine quantity of β-carotene in marigold flowers, collected from different growing places in Lithuania, by high performance liquid chromatography method; to asses the total quantity of carotenoids using spectrophotometric methods; to determine antioxidant activity of Calendula officinalis L. flowers using FRAP method and compare results between different growing places. Marigold flowers were collected during different blooming periods, from thirteen different growing places in Lithuania in case to determine accumulated material differences.
The maximum quanty of β-carotene (544.96 µg/g) determined by high performance liquid chromatography, performing fresh flowers of Calendula officinalis L. dispergation by liquid nitrogen, as a solvent using hexane with 0.1 % butylhidroxitoluene. Lowest point of active substance (47.04 µg/g) appointed at Birzai district. All examples of Calendula officinalis L. flowers distinguished antioxidative effect (the maximum determined at Vilkaviskis district 154.2 µg/g, lowest – 7.28 µg/g at Druskininkai), although statistically significant changes could not be discern. The biggest quantity of total carotenoids was noticed in Kupiskis district - 8.05 mg/g and was about 3.3 times bigger than lowest (2.45 mg/g Druskininkai).
SANTRUMPOS
ABS – absorbcijaBHT – butilhidroksitoluenas (angl. butylhidroksitoluene)
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high performance liquid chromatography) FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. cupric ion reducing antioxidant capacity) IC50 – minimali slopinančioji koncentracija
IR – infraraudonoji šviesa KHB - Krebs-Henseleit buferis
MTT - spektrofotometrinė 3-(4,5-dimatiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazol bromido analizė PDA – fosfodiodų matricos detektorius
Ph.Eur. – Europos Farmakopėja R2 – regresijos koeficientas
RNS – reaktyviosios azoto formos ROS – reaktyviosios deguonies formos
TEAC – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (angl. trolox equivalent antioxidant capacity) TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (angl. 2,4,6-tripyridyl-s-triazine)
ĮVADAS
Augalai nuo seno naudojami vaistų kūrime. Seniausias rašytinis šaltinis įrodantis, medicininį panaudojimą, prieš 5000 metų, Nagpure, Šumerų rašytiniuose šaltiniuose minimi 12 vaistinių preparatų receptų, pagamintų iš 250 skirtingų rūšių vaistinių augalų. Šiais laikais tradiciniai augaliniai preparatai įgyja vis didesnę reikšmę medicinos srityje. Pasaulinės sveikatos organizacijos teigimu, kasmet vaistinių augalinių preparatų vartojimas siekia daugiau nei 60 milijardų Jungtinių Amerikos Valstijų dolerių. Medicinos pramonėje naudojama 35 – 70 tūkst. augalų rūšių. Šis skaičius sudaro 14 – 28 % visų, arba 35 – 70 % visų vartojamų pasaulyje, augalų rūšių [1, 2]. Vis didėjančią paklausą lemia tai, jog tradiciniai augaliniai vaistai, lyginant su sintezės būdu gaunamais preparatais, sukelia mažiau nepageidaujamų reakcijų, taip pat pasižymi platesniu veikimo spektru, todėl augaluose esančių biologiškai aktyvių medžiagų tyrimai tampa vis aktualesne tema.
Šio darbo tiriamasis objektas – vaistinė medetka (Calendula officinalis L.) yra astrinių (Asteraceae) šeimos, vienmetis, karotenoidus, flavanoidus, saponinus, eterinius aliejus, terpenus kaupiantis augalas. Pagal galiojančio leidimo Europos Farmakopėjos „Calendula flower“ monografiją (01/2011:1297) vaistinė augalinė žaliava yra nuskinti, surinkti ir išdžiovinti žiedai.
Naujausi moksliniai tyrimai rodo platų vaistinių medetkų žiedų ir jų preparatų vartojimą medicinoje. Naujausios studijos, kuriose analizuojami tiek vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktai, tiek atskiri komponentai, aptinkami augalinėje žaliavoje, atskleidžia įvairius augalo sąlygojamus farmakologinius poveikius: priešuždegiminį [3], audinius regeneruojantį, epitelizaciją skatinantį, antibakterinį, antivirusinį, antivėžinį [4].
Lietuvoje vaistinė medetka (Calendula officinalis L.) paprastai vartojama gydymo ir profilaktiniais tikslais. Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis, Lietuvoje registruota 12 vaistinių augalinių preparatų, sudėtyje turinčių vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) augalinės žaliavos [5, 6, 7].
Karotenoidai, flavanoidai, terpeniniai junginiai yra vieni iš svarbesnių biologiškai aktyvių junginių, esančių vaistinėje medetkoje, todėl jų analizės efektyviosios skysčių, dujų chromatografijos- masių spektrometrijos, spektrometrijos metodais leidžia įvertinti augalinės žaliavos kokybę, palyginti biologiškai aktyvių junginių pasiskirstymą augalo organuose.
Darbo naujumas. Nustatyti ir palyginti β-karoteno kiekiai vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) šviežiuose šaldytuose ir džiovintuose žieduose, surinktuose skirtingose augimo vietose. Dėl sudėtingo karotenoidų išskyrimo ir nustatymo, buvo sukurtos ekstrakcijos metodo modifikacijos ir vertinama β-karoteno kiekybinė išeiga, farmakopėjinėje vaistinių medetkų žaliavoje (džiovinti žiedai) ir ne farmakopėjinėje (švieži šaldyti žiedai). Lietuvoje, literatūros šaltinių duomenimis, nėra atlikta tyrimų, kuriuose β-karoteno kiekis nustatytas tiriant šaldytus vaistinių medetkų žiedų ekstraktus,
panaudojant skystą azotą bei ekstrakcijos metodiką nenaudojant saponifikacijos. Atliktas antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu bei bendro karotenoidų kiekio vertinimas.
Darbo tikslas – nustatyti β-karoteno, bendrą karotenoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą augalinėje vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žaliavoje, surinktoje skirtingose augimo vietose, parinkus efektyviausią ekstrakcijos metodiką.
Vaistinių medetkų žiedai buvo renkami 13-oje skirtingų Lietuvos augimo vietų, vegetacijos laikotarpiu. Tyrimams naudoti šviežių, šaldytų bei džiovintų medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktai.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Nustatyti β-karoteno, bendrą karotenoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą augalinėje vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žaliavoje, surinktoje skirtingose augimo vietose, parinkus
efektyviausią ekstrakcijos metodiką.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas β-karoteno ir bendro karotenoidų kiekio nustatymui vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose.
2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti β-karoteno kiekio įvairavimą vaistinių medetkų žiedų mėginiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose.
3. Įvertinti bendrą karotenoidų kiekio įvairavimą vaistinių medetkų žiedų mėginiuose, taikant spektrofotometrinį metodą.
4. Nustatyti vaistinių medetkų mėginių antioksidacinį aktyvumą FRAP metodu ir įvertinti šio parametro įvairavimą surinktuose skirtinguose mėginiuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.)
1 pav. Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.)
Morfologiniai požymiai. Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.), tai astrinių (Asteraceae), graižažiedžių (Compositae) šeimos vienmetis, malonaus kvapo, kartaus skonio žolinis augalas [3, 4].
Žydi birželio – rugsėjo mėnesiais. Aukštis siekia 30 – 50 cm [10], kitų šaltinių teigimu gali būti iki 60 cm [9]. Šaknis liemeninė, šakota [11]. Stiebas stačias, šakotas, apaugęs plaukeliais [4]. Lapai – žali, pražanginiai, beveik lygiakraščiai, apatiniai kastuviški, į lapkotį susiaurėję, 10 – 20 cm ilgio ir 1 – 4 cm pločio. Viršutiniai lapai bekočiai, ovalūs 4 - 7 cm pločio. Žiedai išsidėstę 3 – 5 cm diametro graižuose, kraštiniai (piesteliniai) - liežuviški (su 1 – 3 danteliais viršuje), oranžinės spalvos, išsidėstę 1 – 15 eilių, vidiniai (kuokeliniai) žiedai vamzdiški, tamsiai geltoni. Piestelė trumpa, lipni, apaugusi plaukeliais, pailga, 0,5 mm ilgio. Vaisius – lukštavaisis, pailgas, silpnai briaunuotas, turintis plaukelius, 10 – 12 mm ilgio [9]. Subrandina karūnos formos dėžutę, kurioje aptinkamos pjautuvo formos sėklos.
Žaliavos skynimas ir ruošimas. Vaistinė žaliava pradedama rinkti augalams pradėjus žydėti, 3 – 5 dienų intervalu, vėliau kas 4 – 5 dienas. Skynimas skatina greitesnį naujų graižų susidarymą, todėl per sezoną žiedus galima rinkti 15 – 18 kartų. Džiovinama plonu sluoksniu, pavėsyje ar specialioje džiovykloje 40 – 50 oC temperatūroje. Svarbu, kad išdžiūtų žiedynsostis.
Paplitimas. Vaistinės medetkos (Calendula officinalis L.) kilusios iš Viduržiemio jūros regiono [12]. Paplitusios Šiaurės Amerikoje, Europoje, Azijoje nesunkiai auginamos visame pasaulyje, neatsižvelgiant į klimato juostas. Lietuvoje medetka plačiai paplitusi, auginama kaip dekoratyvinis augalas daržuose, darželiuose ir gėlynuose. Gyvybingas, gerai auga įvairaus tipo dirvose, žydi saulės atokaitoje. Kultyvuojama soduose, gėlynuose, aptinkama sulaukėjusių individų. Calendula gentį sudaro 15 - 20 skirtingų rūšių [13]. Geriausiai žinomos šios rūšys: Calendula officinalis L., Calendula arvensis L., Calendula suffruticosa V., Calendula stellata C., Calendula adata R., Calendula tripterocarpa R. [14]. Lietuvoje auga tik Calendula officinalis L. Vaistinė medetka turi keletą sinonimų, sutinkamų literatūroje ir liaudies medicinoje: nadatka, negetka, nuodatka, noktelė [15].
Kokybės ir kiekybės reikalavimai. Galiojančio leidimo Europos farmakopėjos ,,Calendulae flos” 01/2011:1297 monografijoje aprašyta vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) augalinė žaliava yra sveiki ar supjaustyti, pilnai išsiskleidę, atskirti vienas nuo kito, išdžiovinti žiedai. Kokybiškoje vaistinių medetkų augalinėje flavanoidų kiekis, išreikštas hiperozidu turi būti ne mažesnis nei 0,4 %. Šalutinių priemaišų kiekis neturi būti didesnis kaip 5 %, nuodžiūvis - ne didesnis nei 12 %, o bendras pelenų kiekis – ne didesnis kaip 10 %.
1.2. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų cheminė sudėtis
Apžvelgus skirtingus literatūros šaltinius ir autorių atliktų mokslinių tyrimų duomenis, įvertinta vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų cheminė sudėtis:
• Karotenoidai. Bendras karotenoidų kiekis žieduose yra ne didesnis nei 3 %. [16]. Dažniausiai nustatomi α-karotenas (0,8 % - 1,89 %) [16, 17], β-karotenas (2,31 %, - 17,51 %) [16, 17], γ-karotenas (2,0 % - 12,15 %) [16,17, 18], liuteinas (2,0 % - 12,29 %) [16, 17], rubiksantinas (4,0 % - 14,36 %) [16, 17], likopenas (0,57 % - 15,0 %) [16, 17], flavoksantinas (14,1 % - 42,05 %) [16, 17], rubiksantinas (3,0 % - 14, 36 %). [16, 17]
• Flavonoidai. Bendras flavanoidų kiekis augalinėje žaliavoje neturi būti mažesnis kaip 0,4 % [19]. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žieduose randami: flavonoliai –
izoramnetinas, kvercetinas (0,2 % – 0,9 %) [19] taip pat O – glikozidai – izokvercetinas, narcizinas, neohesperidozidas, rutinas [12, 20].
• Eteriniai aliejai, kurių randama 0,1 % – 0,4 % [12]. Medetkų žiedai taip pat kaupia mentoną, izomentoną, kariofileną, pedunkulatiną ir dihidroaktindiolidą [21].
• Seskviterpenai ir jonono glikozidai. Randamas loliolidas (0,13 %), oficinozidai A, B, C, D, arvosidas A [12, 19].
• Lipai. Medetkų žieduose nustatomas kalendulinas [19].
• Terpenoidai. α-β-amirinai, lupeolis, longispinogeninas, oleonolinė rūgštis, arnidiolis, breinas, kalenduladiolis, eritrodiolis, faradiolis, faradiolio-3- miristininės rūgšties esteris, faradiolio-3- palmitininės rūgšties esteris, helantrioliai A1, B0, B1, B2, maniladiolis, ursadiolis [12, 22]. • Saponinai. Dažniausiai randami kalendulozidai C-H. Oleonolinė, ursolinė rūgštys. Steroliai:
kampsterolis, cholesterolis, sitosterolis, stigmasterolis ir taraksasterolis [12, 20, 23].
1.3. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų preparatų farmakologinės
savybės
Medetkos pasižymi antibakteriniu, antimutageniniu, antioksidaciniu poveikiu. Gydomos odos (žaizdos, nudegimai, bėrimai), gerklų ligos, skrandžio ir dvylikapirštės žarnos opaligė, gastritai, kepenų ir tulžies pūslės, širdies ligos. Remiantis ilgalaikiu vartojimu nustatyta, kad žaliava pasižymi baktericidiniu poveikiu prieš S.aureus. Nuovirai ir užpilai buvo vartojami amenorėjai, dismenorėjai, blauzdų opoms, hemorojui gydyti. Indijoje naudojant medetkų žiedus gaminami tepalai, lengvinantys žaizdų, opų, randų, odos nušalimo ir nudegimo gijimą [11, 24, 25, 26]. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) arbatos kaip priešuždegiminė priemonė vartojamos akių praplovimams, gerklės skalavimams [27].
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Įvairių literatūros šaltinių duomenimis vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedai kaupia didelius kiekius karotenoidų. Vaistinių medetkų žieduose (farmakopėjinėje vaistinėje augalinėje žaliavoje) esantis β-karotenas pasižymi kardioprotekciniu poveikiu gydant išeminę širdies ligą. Atliktas klinikinis tyrimas, kuriame dalyvavo stabiliąja krūtinės angina sergantys žmonės. Vienai tiriamųjų grupei kasdien buvo skiriama 50 mg β-karoteno. Pastebėta, kad jau po kelių dienų vainikinių širdies kraujagyslių užsikimšimas sumažėjo 50 % lyginant su tyrimo pradžioje gautais tyrimų rezultatais [28].
Atliktas ikiklinikinis tyrimas, kurio metu nustatytas kardioprotekcinis poveikis išeminės širdies ligos atveju. Eksperimento metu žiurkėms buvo leidžiama 50 mM vaistinių medetkų tirpalo kartu su KHB (Krebs-Henseleit buferis, į kurio sudėtį įeina: D-gliukozė, bevandenis magnio sulfatas, kalio fosfatas, kalio chloridas, natrio chloridas) buferiu. Kontrolinei grupei buvo skiriamas KHB buferinis tirpalas. Pageidaujamas poveikis pasireiškė kairiojo skilvelio stimuliavimu, todėl įvertinta, jog kraujo tėkmė aortoje buvo tokia pati kaip ir gydant miokardo infarkto sukeltą, širdies raumens ląstelių žūtį [27].
Antimikrobinis poveikis. Vaistinių medetkų žiedų etanolinio ekstrakto sukeltas antimikrobinis poveikis buvo nustatytas prieš 8 skirtingas bakterijų padermių rūšis (Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermitis, Escherichia coli, Klebseilla pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Enterococcus pneumonia). Atlikto tyrimo metu nustatyta, kad stipriausias antimikrobinis efektyvumas buvo pasiektas Pseudomonas aeruginosa mitybinėje terpėje (slopinimo zona buvo 25 mm, esant 100 mg/ml koncentracijai) ir Staphylococcus aureus (inhibicija siekė 14 mm, esant 50 mg/ml koncentracijai), lyginant su kitomis bakterijų rūšimis, pvz. Enterococcus pneumoniae slopinimas agar-agaro terpėje siekė tik 8 mm (100 mg/ml koncentracija) [29].
Ląstelių atsinaujinimą skatinantis, žaizdas gydantis poveikis. Indijos mokslininkai Preethi K. Chandran, Ramadasan Kuttan (2008) atliko ikiklinikinį tyrimą su žiurkėmis, siekdami įvertinti vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų priešuždegiminį, epitelizaciją skatinantį poveikį, esant odos nudegimams. Tyrimui naudoti švieži medetkų žiedai, dvi savaites ekstrahuoti 96 % etanoliu. Atliktas etanolinio ekstrakto dekantavimas, džiovinimas iki sauso likučio, kuris vėliau ištirpintas distiliuotame vandenyje ir vartotas eksperimento metu. Žiurkėms padarytos identiškos nudegiminės žaizdos, norint gauti kuo tikslesnius rezultatus. Gyvūnams per os kasdien buvo skiriamos skirtingos vaistinių medetkų ekstrakto dozės (20 mg, 100 mg ir 200 mg/kg). Tirtas kiekvienos tiriamųjų grupės atstovo kraujas, o odos dariniai, kuriuose padarytos nudegiminės žaizdos buvo laikomi formalino tirpale iki histologinio jų vertinimo. Atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad žaizdų gyjimą skatinančių medžiagų (kolageno-hidroksiprolino, heksoamino) kiekiai ženkliai buvo didesni lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Nudegimus lemiančių baltymų (haptoglobino, orozomukoido) kiekis, žiurkių, kurios buvo gydomos vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) ekstraktu, sumažėjo. Audinių pažaidos indikatorių/fermentų: šarminės fosfatazės, alanin- ir aspartat-transaminazių skaičius taip pat sumažėjo lyginant su žiurkėmis, kurioms nebuvo skirta medetkų ekstrakto. Histopataloginiai tyrimai taip pat patvirtino teiginį, kad vaistinių medekų (Calendula officinalis L.) ekstraktas pasižymi žaizdas gydančiu ir ląstelių epitelizaciją skatinančiu poveikiu [30]. Serbijoje 2005 m. atliktas klinikinis tyrimas, kurio metu buvo siekiama įvertinti medetkų tepalo sukeliamą epitelizacijos greitį ir efektyvumą, žaizdas kojose turintiems pacientams. Gydymas truko tris savaites, kontrolinei grupei skirtas salino tirpalas. Gauti rezultatai parodė teigiamą medetkų tepalo poveikį. Tiriamųjų grupėje bendras žaizdų paviršiaus plotas prieš pradedant tyrimą buvo 67,544 mm2, o po trijų savaičių gydymo sumažėjo iki 39,373 mm2, tai yra 41,71 %, kai tuo tarpu kontrolinėje grupėje pasiektas tik 14,5 % bendro žaizdų ploto sumažėjimas [31].
Poveikis virškinamąjam traktui. Atliktas klinikis tyrimas, kurio metu 24 pacientai, sergantys nespecifiniu skrandžio uždegimu buvo gydomi vaistinių medetkų žiedų arbata. Po dviejų savaičių, visiems tiriamiesiems, uždegimo simptomai sumažėjo 96 %. Kito tyrimo metu, 170 pacientų sergančių
dvylikapirštės žarnos opa, buvo gydomi vaistine arbata, kurios didžiają sudėties dalį sudarė vaistinių medetkų žiedai. Nustatya, kad visiems pacientams simptomų pasireiškimo dažnis sumažėjo 90 % [15]. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) etanolinio ekstrakto įtaka, hepariną rišančio epiderminio augimo faktoriaus genų ekspresijai KATO-III ląstelių kultūroje, esančioje žarnyno bakterijos Helycobacter pylori N6 padermėje, buvo vertinta naudojant tikrojo laiko polimerazės grandininę reakciją. Gautų rezultatų metu pastebėtas ženklus H. pylori stimuliuojamo hepariną rišančio epiderminio augimo faktoriaus genų ekspresijos slopinimas (sumažėjo 75,32 ± 1,16 % lyginant su kontroline grupe) [32].
Hepatoprotekcinis poveikis. Egipte atliktas ikiklinikinis tyrimas, naudojant izoliuotus eksperimentinių žiurkių hepatocitus, paveiktus anglies tetrachloridu (CCl4). Tiriamųjų žiurkių kepenų
ląstelės buvo veikiamos CCl4 ir nustatytas ryškus ląstelių gyvybingumo sumažėjimas. Kita tiriamųjų
ląstelių grupė, prieš anglies tetrachlorido ekspoziciją, buvo veikiama vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) etanoliniu ekstraktu. Tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausias hepatoprotekcinis poveikis (90,95 ± 1,32 % sveikų hepatocitų) buvo pasiektas veikiant ląsteles 100 µg koncentracijos etanoliniu vaistinių medetkų žiedų ekstraktu, 30 minučių prieš CCl4 ekspoziciją [33]. Dar vienas
mokslinis tyrimas atliktas, siekiant įvertinti medetkų žiedų vandeninio ektrakto poveikį kepenų vėžį sukeliančioms 5 ląstelių linijoms: HepG2/C3A, SK-HEP-1, HA22T/VGH, Hep3B ir PLC/PRF/5. Inhibicinis poveikis, naudojant 2000 µg/ml vandeninio ektrakto koncentraciją, siekė 25-26 % [27]. Vaistinių medetkų žiedų poveikis burnos žaizdoms gydyti. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų burnos žaizdas gydantis poveikis buvo įrodytas atlikus tyrimą, kurio metu naudota etanolinio (70 %) medetkų žiedų ekstrakto burnos skalavimo skystis, chemoradioterapijos sukelto burnos ir ryklės uždegimą turintiems pacientams. Eksperimentas vykdytas 6 savaites ir kasdien tiriamųjų pacientų grupei skirtas 2 % vaistinių medetkų tirpalas skalavimui. Rezultatai parodė, kad lyginant su placebo grupe, burnos ir gleivinės uždegimo simptomai ženkliai sumažėjo [34]. Ikiklinikinio tyrimo metu, žiurkėnams, sergantiems burnos ir ryklės gleivinės uždegimu skirtas atitinkamai 5 % ir 10 % medetkų gelis. Tyrimas vykdytas 17 dienų ir lyginant su placebo grupe burnos skausmas ir uždegimo simptomai sumažėjo, tačiau geresnis efektas pasiektas tai grupei žiurkėnų, kurie buvo gydomi 5 % vaistinių medetkų geliu [35].
Antioksidacinis poveikis. In vitro atliktų mokslinių tyrimų metu, įvertintas antioksidacinis vaistinių medetkų poveikis prieš laisvuosius radikalus. K. C. Preethi, Girija Kuttan ir Ramadasan Kuttan (2006) ištyrė vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) poveikį in vitro ir in vivo. Medetkų žiedų ekstraktas slopina superoksido radikalų katalizuojamą fotoredukciją, kurią sukelia Fentono reakciją indukuojantys riboflavino ir hidroksilo radikalai, ir taip pat in vitro slopina lipidų peroksidaciją (minimali slopinančioji koncentracija (IC50)) buvo pasiekta, kai ekstrakto buvo atitinkamai 480, 500 ir
2000 µg/ml, standartu naudotas imbiero ekstraktas). In vivo tyrimo metu gauti rezultatai pagrindė ekstrakto sukeliamą, superoksido radikalų inhibiciją makrofaguose (12,6 % ir 38,7 %, kai medetkų ekstrakto dozės buvo 100 ir 250 mg/kg). Vaistinės medetkos ekstrakto skyrimas per os, 1 mėnesį tiriamosioms pelėms padidino katalazių aktyvumą, kai tuo tarpu, glutationo reduktazės aktyvumas sumažėjo [36]. Galima daryti išvadą, jog ekstraktas pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu in vitro ir in vivo.
Priešvėžinis poveikis. Nustatyta, kad vaistinių medetkų žiedų arbata pasižymi nuo dozės priklausančiomis citotoksinėmis ir antivėžinėmis savybėmis prieš melanomos Fem-x ląsteles. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) vaistinėje augalinėje žaliavoje esantys saponinai veikia antimutageniškai prieš benzo(a)pireno junginius, kurie sukelia Erlicho karcinomą. Poveikis įvertintas atlikus in vitro tyrimus. [27]. Brazilijoje 2010 metais atlikto tyrimo metu buvo siekiama nustatyti etanolinio medetkų žiedų ekstrakto citotoksinį poveikį vėžinių ląstelių kultūroms. Vertinimas vykdytas taikant spektrofotometrinę 3-(4,5-dimatiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazol bromido (MTT) analizę. Gauti rezultatai parodė, kad citotoksinis poveikis prieš L929 ir HepG2 padermes nenustatytas, naudojant 15 mg/ml medetkų ekstraktą. Tačiau ženklūs pokyčiai ir aktyvumas pastebėtas, kai ekstrakto koncentracija siekė 30 mg/ml [37]. G. Matysik, M. Wójciak-Kosior, R. Paduch (2005), naudodami tris skirtingus vaistinių medetkų ekstraktus (ekstrakcijos tirpikliai: heptanas, etilacetatas ir metanolis), pagrindė antivėžinį poveikį krūties vėžio ląstelėms (T47D), nes esant 25 µg/ml koncentracijai, buvo skatinama ląstelių proliferacija, padidėjo mitochondrijų dehidrogenazės aktyvumas, tačiau koncentracijai pasiekus 75 µg/ml pasireiškė toksinis poveikis [38]. Duomenų, kurie vienareikšmiškai pagrįstų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) vaistinės žaliavos antivėžinį poveikį nėra pakankamai daug, todėl tikslinga atlikti išsamesnius tyrimus.
1.4. Karotenoidų struktūra
Karotenoidai – tai dideliu įvairumu pasižyminti polienų tipo, natūralių pigmentų grupė [39]. Karotenoidai daugiausiai aptinkami augaluose, dumbliuose ir fotosintetinančiose bakterijose. Karotenoidai labai svarbūs fotosintezės procese dalyvaujantiems organizmams. Pigmentų galima rasti ir fotosintezėje nedalyvaujančiuose organizmuose, pasižyminčiuose gebėjimu savarankiškai apsisaugoti nuo nepageidaujamo šviesos ir deguonies poveikio [40]. Šiuo metu žinoma 700 karotenoidų, iš kurių 50 tapo neatsiejama kasdienės mitybos dalimi, o 20 skirtingų rūšių pigmentų yra aptinkama žmogaus kraujyje ir audiniuose. Manoma, kad kasmet, natūrali, gamtoje vykstanti
karotenoidų produkcija siekia 100 milijonų tonų [41]. Pagrindiniai karotenoidai yra: β-karotenas,
neurosporenas, fitofluenas, fitoenas, ζ-karotenas. Visi jie randami žmogaus plazmoje (2 paveikslas) [42].
2 pav. Žmogaus plazmoje aptinkamų karotenoidų cheminės struktūros
Karotenoidai - tetraterpenų klasei priklausantys lipidai, kurių struktūros pagrindas yra keturiasdešimties anglies atomų grandinė. Grandinę sudaro aštuonios penkiaanglės izopreno molekulės, tarpusavyje sujungtos ,,galva-uodega” modeliu, išskyrus centrą, kur liekanos jungiasi ,,uodega-uodega” principu, todėl susidaro simetrinė molekulė [41, 42,43].
3 pav. β-karotenas. Karotenoidų struktūros pavyzdys fitoenas fitofluenas ζ-karotenas neurosporenas likopenas γ-karotenas Izopreno molekulė α-karotenas β-karotenas α-kriptoksantinas β-kriptoksantinas liuteinas zeaksantinas
Bazinė pigmentų grupės struktūra gali būti modifikuota ciklizacijos, hidrinimo, dehidrinimo, įtraukiant deguonies molekules, vidumolekulinio persitvarkymo, grandinės trumpėjimo ir ilgėjimo, procesus [45]. Šviesos absorbcijos procesui svarbi dvigubų jungčių sistema molekulės centre, kuri lemia savitąjį šviesos sugerties spektrą ir izomerinių formų susidarymą [46]. Priklausomai nuo dvigubų jungčių skaičiaus, susidarantys stereoizomerai, skiriasi fizinėmis ir cheminėmis savybėmis. Gamtoje egzistuoja trans- ir cis- izomerų formos, tačiau trans- izomerai pasižymi didesniu stabilumu [47]. Dažniausiai aptinkamos geometrinės, E- arba Z- formų konfigūracijos, stereoizomerų formos (E- formos izomeruose dvigubos jungtys yra skirtingose plokštumose, o Z-formos – toje pačioje) [48].
Pagal struktūrą karotenoidai skirstomi į karotenus ir ksantofilus. Karotenai sudaryti iš anglies ir vandenilio atomų (grupei priklauso likopenas, α-karotenas, β-karotenas), o ksantofilų struktūroje yra ir deguonies turinčių grupių (priskiriami zeaksantinas, liuteinas) [18].
Karotenoidai, struktūroje turintys nepakeistą β-jonono žiedą ir polieninę, vienuoliką anglies atomų turinčią, grandinę, pasižymi provitamino A aktyvumu. Retinolį (vitaminą A) sudaro dvi β-karoteno molekulės, todėl jam būdingas didžiausias provitamino A aktyvumas [49].
Ląstelėse karotenoidai aptinkami plastidėse (chloroplastuose ir chromoplastuose). Didesnis dvigubųjų jungčių skaičius lemia geresnę raudonos spalvos sugertį, o pigmentų susijungimas su chlorofilu lemia didesnę spalvų įvairovę [50]. β-karotenas, tai dažniausiai maiste randamas, oranžinės spalvos pigmentas [51].
1.5. Karotenoidų medicininė reikšmė
Šiuo metu medicinoje didelis dėmesys skiriamas natūraliai gamtoje randamiems antioksidantams. Perspektyvūs ir tyrinėjami karotenoidai, kurie netik suteikia augalams ryškias spalvas, dėl gebėjimo absorbuoti šviesą, tačiau literatūros šaltinių duomenimis, pagrindinė jų funkcija yra ląstelių apsauga nuo organelių pažaidos, nes būdami stiprūs vienatomio (1O2) ir kitų, reaktyvaus
deguonies turinčių rūšių slopikliai, apsaugo organizmą nuo neigiamo oksidacinio streso poveikio [37, 50]. Pigmentai įtraukiami į fotosintezės procesą, atlikdami fotoprotektorių vaidmenį, taip pat yra abisininės rūgšties prekursoriai [41].
Remiantis epidemiologinėmis studijomis, pakankamo kiekio karotenoidų suvartojimas kasdien sąlygoja lėtinių ligų prevenciją [53]. Nustatyta, kad β-karotenas ir likopenas mažina riziką susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis [54]. Naujausi tyrimai rodo, kad karotenoidai, veikdami per tarpinius mechanizmus reguliuoja ląstelių augimo, tarpusavio bendravimo, genų ekspresijos moduliavimo, imuninio atsako ir vaistų metabolizmo procesus [55]. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis,
vėžys pagal dažnumą yra antra mirties priežastis, mirtingumas, nuo šios ligos, iki 2030 metų gali padidėti iki 11 milijonų [56]. Imuninės sistemos stiprinimas (dėl provitamino A aktyvumo), reguliariai vartojant karotenoidus, padeda išvengti vėžio atsiradimo tikimybės [48]. Liuteinas ir zeaksantinas yra tinklainės geltonojoje dėmėje randami pigmentai (antioksidantai), atliekantys mėlynos šviesos filtro funkciją ir saugantys nuo senatvinės degeneracijos, kataraktos atsiradimo ir aklumo [57]. Indijoje (2001) atlikto tyrimo metu nustatyta, kad mažas vitamino A ir karotenoidų kiekis organizme lemia didesnę riziką susirgti žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) dėl nepakankamo imuninės sistemos aktyvumo [58]. Hepatito, kepenų, skrandžio, stemplės vėžio, H. pylori sukelto lėtinio skrandžio uždegimo, Barrett’o displazijos atsiradimo priežastis yra uždegimą lemiantys citokinai (IL-1 β, IL-6 ir auglių nekrozės faktorius – TNF-α) ir jų ekspresiją reguliuojantis NF-ĸB. Slopindami citokinus ir jų sintezę, karotenoidai pasižymi priešuždegiminiu poveikiu [59]. β-karoteno turintys maisto papildai vartojami, kaip nuo ultravioletinių (UV) saulės spindulių sauganti priemonė. Veikimo mechanizmas pagrįstas antioksidacinėmis karotenoidų savybėmis, saugančiomis nuo laisvųjų radikalų sukeliamos ląstelių pažaidos [60].
1.6. Antioksidacinis poveikis
Antioksidantai – medžiagos, redukuojančios prooksidantą ir sudarančios mažai arba visiškai netoksiškus junginius ir taip apsaugančios ląsteles nuo žalingo poveikio. Tai medžiagos slopinančios oksidacinius procesus [61]. Reaktyviojo deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formos skatina daugiau nei 50 ligų atsiradimą (senėjimo procesai, širdies ir kraujagyslių ligos, Alzhaimerio, Parkinsono, Hantingtono ligos, depresija, katarakta, vėžys, reumatoidinis artritas, atopinis dermatitas, dilgėlinė, eritema ir kt.). Sparčiai augant sergamumui, ieškoma būdų ir metodų išvengti minėtų ligų, todėl vis dažniau atsigręžiama į natūralios kilmės, antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčius junginius, kurie priešingai nei sintetiniai, nesukelia nepageidaujamo ar toksinio poveikio organizmui [62]. Vaistinės medetkos (Calendula officinalis L.) gali būti vienas iš potencialių antioksidantų šaltinių, nes atlikti tyrimai pagrindžia vaistinių medetkų antioksidacinį aktyvumą [61, 62, 63].
Prisijungdami nesuporuoto laisvojo radikalo elektroną arba atiduodami vandenilio atomą laisvajam radikalui, antioksidantai inaktyvuoja reaktyviosios deguonies ir azoto radikalus. Abiejų veikimo mechanizmų rezultatai nesiskiria – neutralizuotas prooksidantas skiriasi tik reakcijos kinetika. Poveikio stiprumas priklauso nuo laisvų hidroksilo (-OH) grupių, aromatiniame žiede [64, 65].
1.7. Karotenoidų nustatymo metodai
Siekiant panaudoti gamtoje randamas medžiagas gydymo tikslams, būtina rasti metodus, kurie padėtų aptikti ir identifikuoti junginius. Vienas pagrindinių mokslininkų tikslų – identifikuoti medžiagas biologinėse struktūrose. Maksimaliam jautrumui, atrankumui ir efektyvumui pasiekti parenkami skirtingi analizės metodai. Karotenoidų kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui dažniausiai ir plačiausiai taikoma efektyvioji skysčių chromatografija [68]. Taikoma ir kapiliarinė elektroforezė, kitos chromatografijos rūšys, pvz: plonasluoksnė chromatografija. Taikomi ir fizikiniai karotenoidų aptikimo metodai, kurie lyginant su cheminiais pasižymi didesniu jautrumu, greitesniu aptikimu ir atkartojamumu. Naudojami ultravioletinių spindulių (UV), infraraudonųjų spindulių (IR) spektrofotometriniai, masių spektrometrijos, kolorimetrijos, reoentgenografiniai, elektronografiniai, neutronografiniai, magnetinio ir sukinio branduolių rezonanso, optiniai (žiedinis dichroizmas, refraktometrinis) metodai [69]. Praktikoje sujungus skysčių chromatografiją su masių spektrometrija ar magnetiniu branduolių rezonanso spektroskopija, padidėja metodo jautrumas, selektyvumas, galima identifikuoti labai mažus junginių kiekius [70]. Bendram karotenoidų kiekiui nustatyti taikomas spektrofotmetrijos metodas.
Chromatografija. Dažniausiai taikomos – efektyvioji skysčių chromatografija ir plonasluoksnė chromatografija. Plonasluoksnė chromatografija – tai metodas, kurio dėka galima atskirti mišinyje esančius junginius, nustatyti jų kiekį bei tapatybę. Metodas greitas (analizė trunka 5-10 minučių), selektyvus ir pasižymi dideliu jautrumu (mikrogramas) [71]. Karotenoidų aptikimui kaip tirpiklis naudojamas acetonas, petroleteris, dietileteris. Kaip tirpiklių sistema naudojami tetrahidrofurano ir metanolio (1:1 V/V) ir petroleterio-heksano-acetono (2:1:1 V/V/V) mišiniai. Priklausomai nuo laukiamų rezultatų gali būti parenkamos skirtingos tirpiklių sistemos: β-karoteno ir liuteino atskyrimui naudojamas petroleterio-acetonitrilo-metanolio (1:2:2 V/V/V) mišinys. Mėginių perkėlimas ant silikagelio plokštelės turi vykti greitai, siekiant išvengti neigiamo šviesos ir oro deguonies poveikio [70, 71].
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – pirmo pasirinkimo metodas, taikomas karotenoidų nustatymui vaistinėje augalinėje žaliavoje [72, 73]. Dažniausiai taikoma atvirkščių fazių chromatografija, kur nejudanti fazė – nepolinis tirpiklis, o judanti – polinis. Naudojamos C18 kolonėlės [74, 75]. Plačiausiai paplitęs efektyviosios skysčių chromatografijos metodas su UV- regimosios šviesos detektoriumi [78], tačiau gali būti naudojami ir fluorescenciniai [77], masių spektrometriniai [79], branduolių magnetinio rezonanso ir fotodiodiniai detektoriai [80]. Dažniausiai naudojamos tirpiklių sistemos: acetonas-heksanas (2:3 V/V), acetonas:vanduo (75:25 V/V), acetonas:metanolis (75:25 V/V), acetonitrilas:metanolis:tetrahidrofuranas:amonio acetatas (68:22:7:3
V/V/V/V) [81]. Prieš pradedant analizę, būtina atkreipti dėmesį į mėginių paruošimą. Vykdant ektrakciją, taikoma saponifikacija, siekiant pašalinti muilus, trukdančius analizei.
Spektrofotometrija. Priklausomai nuo dvigubų jungčių skaičiaus karotenoidų molekulėje, jie geba absorbuoti UV šviesą, todėl bendram karotenoidų kiekio ir antioksidacinio poveikio vertinimui taikomas spektrofotometrinis nustatymas.
Sugerties spektrų analizė yra paprastas ir nesudėtingas metodas, naudojamas mėginyje esančių molekulių kiekiui nustatyti. Analizės metodas pagrįstas junginių gebėjimu absorbuoti šviesą ir yra panaudojama monochromatinė šviesa regimajame, ultravioletiniame ar infraraudonajame spektre. Tyrimams atlikti naudojama nesudėtinga aparatūra, todėl metodas plačiai pritaikomas praktikoje. Kiekybinės analizės pagrindą sudaro Bugero-Lamberto-Bero dėsnis, pagal kurį optinis tankis tiesiogiai proporcingas šviesą sugeriančių molekulių koncentracijai bandinyje. Metodas spartus ir pasižymi dideliu atrankumu. Atliekant kokybinę analizę remiamasi tuo, jog kiekviena molekulė turi charakteringą sugerties spektrą (maksimumų skaičius spektre, bangos ilgiai, juostos plotis) [82].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimų objektas
Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedai, rinkti 13-oje skirtingų augimo vietų, atitinkamais laiko intervalais, žydėjimo metu.
Bandinių rinkimo vietos, koordinatės žemėlapyje, data:
1. Varėnos rajono savivaldybė, Varėnos seniūnija, Perlojos kaimas, Armanios gatvė 3 (54.2175289, 24.4136315). Rinkta: 2015-08-10.
2. Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Raudondvario kaimas, Nevėžio gatvė 11 (54.9396896, 23.7747449). Rinkta: 2015-07-15.
3. Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 (54.9546648, 23.7774227). Rinkta: 2016-07-23, 2016-07-30, 2016-08-02, 2016-08-11, 2016-08-19, 2016-09-25
4. Pasvalio rajonas, Pumpėnų seniūnija, Vilkiškių kaimas, Vilkiškių gatvė 13 (55.9113758, 24.4179563). Rinkta: 2016-08-28.
5. Vilnius, Antakalnio seniūnija, Smėlio gatvė 2 (54.7080722, 25.315392). Rinkta: 2016-08-16.
6. Kauno rajonas, Karmėlavos seniūnija, Karmėlavos II kaimas, Pilies gatvė 11A (54.9753451,
24.0742062). Rinkta: 2016-08-04.
7. Alytaus apskritis, Druskininkų savivaldybė, Veičiūnų seniūnija, Neravų kaimas, Panemunės
gatvė 2 (54.041764, 24.03598). Rinkta: 2016-08-15.
8. Šiaulių rajonas, Šiaulių kaimiškoji seniūnija, Toliočių kaimas, Aguonų gatvė 2 (55.945293,
23.2689398). Rinkta: 2016-07-03.
9. Panevėžio apskritis, Biržų rajonas, Širvėnos seniūnija, Pievų gatvė 6 (56.200592, 24.7573).
Rinkta: 2016-07-18.
10. Vilkaviškio rajonas, Šeimenos seniūnija, Serdokų kaimas, Žalumynų gatvė 2 (54.627928,
23.0859043). Rinkta: 2016-07-16, 2016-07-27, 2016-08-04.
11. Kupiškio rajonas, Subačiaus seniūnija, Biržų gatvė 15 (55.7708011, 24.7439197). Rinkta:
2016-07-13, 2016-07-28, 2016-08-11, 2016-08-28.
12. Kretingos rajonas, Kretingos seniūnija, Vytauto gatvė 84 (55.904401, 21.2535122). Rinkta:
2016-08-16.
13. Joniškio rajonas, Saugėlaukio seniūnija, Bariūnų kaimas, Aušros gatvė 7 (56.2527555,
Vaistinė augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Išdžiovinti vaistinių medetkų žiedai laikomi popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25 °C temperatūroje, sausoje vietoje.
Didesnioji vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) surinktų žiedų dalis buvo užšaldyta, plastmasiniuose indeliuose, esant – 18 °C temperatūrai.
2.2. Reagentai
• Distiliuotas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV); • Etanolis 96 %;
• Askorbo rūgštis (≥ 99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija); • Skystas azotas;
• β-karotenas (SIGMA-ALDRICH, Vokietija); • Acetonitrilas (99 %, Roth, Vokietija);
• Butilhidroksitoluenas (0,1 %, SIGMA-ALDRICH, Steinhem, Vokietija); • Geležies chloridas heksahidratas (SIGMA-ALDRICH, Steinhem, Vokietija); • Natrio acetatas (SIGMA-ALDRICH, Steinhem, Vokietija);
• Ledinė acto rūgštis (99,8 %, Standart, Lenkija);
• Koncentruota vandenilio chlorido rūgštis (Fluka-Chemie, Buch, Šveicarija); • 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) (Alfa Aesar, Vokietija);
• Troloksas (≥ 98 %, Fluka-Chemie, Buch, Šveicarija);
2.3. Naudota aparatūra
Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) ekstraktams paruošti buvo naudojama vandens gryninimo sistema Milipore (Bedford, MA), ultragarso vonelė BioSonic U100 (Mavajai, JAV), termostatinė vonelė (Heidolf, Vokietija). β-karoteno kiekio įvertinimui, atliekant efektyviąją skysčių chromatografiją, naudotas Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (Waters Corporation, Miliford, JAV), 150x4,6 mm, 3 µm YMC kolonėlė (YMC Europe GmbH, Vokietija) bei Waters išorinis termostatas (Waters Corporation, Miliford, JAV). Bendram karotenoidų kiekiui nustatyti ir antioksidacinio aktvyvumo vertinimui FRAP metodu atlikti, taikytas spektrofotometras – Halo DH-20 UV – Vis Dinamika GmbH, Šveicarija. Bandiniams tirti naudotos 3 cm kiuvetės.
2.4. Tyrimų schema
4 pav. pateikta schema, nurodanti tiriamus objektus bei taikytus instrumentinės analizės metodus.
4 pav. Tyrimų schema
2.5. Tyrimų metodai
2.5.1. Tiriamojo pavyzdžio ruošimas
Nuodžiūvio vertinimas. Nuodžiūvis vertintas pagal galiojančio leidimo Europos Farmakopėjos (Ph. Eur.2.2.32) aprašytą metodiką. Atsveriamas 1 g smulkintos (mažiausiai 95 %, 1400 µm dydžio dalelių pagal Ph.Eur. 2.9.12) vaistinės augalinės žaliavos, džiovinima 2 valandas, esant 105 °C temperatūrai. Atlikus analizę, medetkų žieduose nustatytas nuodžiūvis atitiko Europos Farmakopėjos ,,Calendulae flos” 01/2011:1297 monografijoje reglamentuojamas ribas (ne daugiau kaip 12 %).
Ekstraktai buvo ruošiami, taikant dvi skirtingas metodikas, atliekant modifikacijas, proceso optimizacijai bei maksimaliai išeigai gauti.
Ekstrakcija heksanu, atliekant saponifikaciją. Atsveriama 0,5 g (0,001 g tikslumu) grūstuvėje smulkintų šviežių ir džiovintų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų. Žaliava talpinama į 100 cm3 tūrio plokščiadugnę kolbą, įpilama 15 ml distiliuoto vandens ir šildoma vandens vonelėje iki 70 °C temperatūros. Po to įpilama 30 ml 96 % etanolio, 0,1 g askorobo rūgšties ir 3 ml 50 % kalio hidroksido (KOH) tirpalo. Kaitinama 30 minučių vandens vonioje su grįžtamuoju šaldytuvu. Kolbos turinys atvėsinamas ir perkeliamas į dalomąjį piltuvą. Ekstrakcija vykdoma 2
minutes heksanu, tris kartus po 50 ml. Gauti ekstraktai perkeliami į plokščiadugnę kolbą ir praskiedžiami distiliuotu vandeniu, iki neutralios reakcijos (pH matuojamas pH-metru). Ekstraktas pilamas į 200 cm3 tūrio kolbą, skiedžiama heksanu iki žymės. Pipete paimama 4 ml gauto tirpalo ir džiovinama iki sauso likučio azoto aplinkoje. Sausas ekstraktas tirpinamas 2 ml acetonitrilo, paimamas 1 ml gauto tirpalo ir atliekama efektyvioji skysčių chromatografija [16].
Siekiant efektyvesnio vaistinės augalinės žaliavos smulkumo laipsnio, žiedai buvo disperguojami malimo mašinėle, grūstuvėje naudojant stiklo grūdelius, o švieži medetkų žiedai užšaldyti, esant -80 °C temperatūrai.
Ekstrakcija heksanu ir 0,1% butilhidroksitolueno (BHT) mišiniu, be saponifikacijos. Atsisveriamas tikslus (0,001 g tikslumu) 0,5 g kiekis vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) šviežių ir džiovintų žiedų, perkeliama į laboratorinę stiklinėlę ir užpilama 10 ml heksano ir 0,1 % butilhidroksitolueno mišiniu. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje, 30 minučių, esant 25 °C temperatūrai. Gautas ekstraktas nupilamas į 20 ml kolbą, o stiklinėlėje likusi smulkinti žiedai užpilami 5 ml tirpiklio ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 15 minučių. Ekstrakcija kartojama du kartus. Gauti ekstraktai perkeliami į 20 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės heksano ir 0,1 % BHT mišiniu. Pipete paimama 4 ml gauto ekstrakto ir džiovinama iki sauso likučio azoto aplinkoje. Sausas likutis ištirpinamas 2 ml acetonitrilo tirpalo, paimamas 1 ml tirpalo, kuris naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
Smulkinimo efektyvumui padidinti buvo naudojamas skystas azotas, grūstuvė bei malimo mašinėlė. Esant lakiems tirpikliams, garavimo sukeliamus nuostolius, buvo siekiama sumažinti panaudojant aliuminio foliją ir apsauginę plėvelę (Parafilm).
2.5.2. β-karoteno analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Efektyvioji skysčių chromatografija yra dideliu selektyvumu pasižymintis, greitai ir pakankamai nesudėtingai atliekamas, kiekybiniam medžiagų įvertinimui nustatyti skirtas metodas. Gauti vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) ekstraktai analizuojami, siekiant nustatyti β-karoteno kiekį, ESC tyrimai atlikti sujungus pokolonėlinę sistemą sudarytą iš Waters 2695 chromatografo (Waters, Milford, MA) ir Waters 2998 PDA fotodiodų matricos detektoriaus.
Analizei atlikti taikytas gradientinis režimas. Metodo sąlygos: judrioji fazė sudaryta iš acetonitrilo ir distiliuoto vandens, santykiu 9:1 kartu su 0,25 % trietilaminu (tirpiklis A) ir etilacetato su 0,25 % trietilaminu (tirpiklis B). Eliucijos gradiento formavimas atliktas chromatografu Waters 2695 (Wtares Corporation, Miliford, JAV). β-karoteno kiekis buvo nustatomas, naudojant optimalią gradientinę eliucijos sistemą: 90 % tirpiklio A – 0 min, 60 % tirpiklio A – 10 min, 10 % tirpiklio A –
50 min, 90 % tirpiklio A – 54 min. Veikliosios medžiagos atskyrimui naudota C18 kolonėlė, analizės metu injekuota 10 µl tiriamojo tirpalo, tirpiklio tėkmės greitis - 1 ml/min. Gauto reakcijos mišinio absorbcija matuojama detektoriumi (Waters, Miliford, MA), esant 450 nm bangos ilgiui.
Etaloninis tirpalas buvo ruošiamas tirpinant β-karoteno standartą chloroforme. Koncentracijos ribos (98,5 – 3,07 µg/ml). Kalibracinis grafikas buvo sudaromas iš skirtingų tirpalo koncentracijų.
Gauti duomenys vertinti pagal β-karoteno kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: y = 2,11× 104 x – 3,88 × 103; (5 pav.)
Čia:
y – β-karoteno smailės plotas; x – etaloninių β-karoteno tirpalų koncentracija.
5 pav. β-karoteno kalibracinė kreivė
2.5.3. Bendro karotenoidų kiekio, išreikšto β – karoteno ekvivalentu nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Bendras karotenoidų kiekis nustatomas spektrofotometriniu metodu. Analizei imamas vaistinės augalinės žaliavos ekstraktas su heksanu ir 0,1 % butilhidroksitoluenu. Absorbcija matuojama esant 450 nm bangos ilgiui. Matavimai kartojami tris kartus ir esant didesnei vaistinės augalinės žaliavos absorbcijai nei etaloninių β-karoteno tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, atliekami ekstraktų skiedimai.
Palyginamuoju tirpalu naudojamas heksano ir 0,1 % butilhidroksitolueno mišinys, kuris ruošiamas 0,1 g butilhidroksitolueno ištirpinant 100 ml heksano.
Etaloninis tirpalas ruošiamas tirpinant β-karoteno standartą chloroforme, atliekami skiedimai ir gaunami skirtingos koncentracijos (98,5 – 3,07 µg/ml) tirpalai. Kalibracinis grafikas sudaromas iš skirtingų tirpalo koncentracijų.
β-karoteno koncentracija mg/ml y = 2,11× 104 x – 3,88 × 103;
R2 = 0,999873
Gauti duomenys įvertinti pagal β-karoteno kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: y = 0,1473x + 0,0005; R2 = 0,9996; (6 pav.)
Čia:
x - β – karoteno standartinių tirpalų koncentracija mg/ml; y – absorbcijos dydis.
6 pav. β-karoteno kalibracinė kreivė
2.5.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
Tiriamųjų ekstraktų redukcinis aktyvumas nustatytas FRAP metodu. Metodas greitas, tikslus, pigus, nesudėtingas ir nereikalaujantis papildomos įrangos [83]. Darbinis FRAP tirpalas gaminamas sumaišius acetatinio buferio (300 mM, pH 3,6), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazino) ir geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalus santykiu 10:1:1. Acetatinis buferis gaminamas 1000 ml matavimo kolboje 3,1 g natrio acetato miltelių ištirpinant 16 ml ledinės acto rūgšties ir praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki 1000 ml žymės. 10 mM koncentracijos TPTZ tirpalas ruošiamas 0,1562 g TPTZ miltelių ištirpinant 40 mM vandenilio chlorido rūgšties tirpale, kuris gaunamas 50 ml matavimo kolboje 0,1695 ml koncentruotos vandenilio chloro rūgšties praskiedus distiliuotu vandeniu iki žymės. 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas ruošiamas 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato miltelių ištirpinant 50 ml distiliuoto vandens. 3 ml paruošto darbinio FRAP tirpalo sumaišoma su 20 µl tiriamojo medetkų žiedų ekstrakto. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, kaip ir tiriamasis tirpalas, tik vietoj žaliavos ekstrakto įpilama 20 µl. Gauti tirpalai sumaišomi ir laikomi 1 valandą tamsioje vietoje, kambario temperatūroje [84]. Po valandos inkubacijos, tirpalų absorbcija matuojama spektrofotometru esant 593 nm bangos ilgiui. Gauti duomenys išreiškiami trolokso ekvivalentais (TE) vienam gramui žaliavos. Kalibracinis troloksono grafikas sudaromas iš 5 – 6 skirtingų tirpalo
koncentracijų. Gauti duomenys įvertinti pagal trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtį: y = 235,43x + 0,233; R2 = 0,9953 (7 pav.)
Čia: x – trolokso standartinių tirpalų koncentracija mg/ml; y – absorbcijos dydis. Trolokso koncentracijos ribos (0,000078 – 0,025 mg/ml).
TEAC reikšmė (mg/g) apskaičiuojama naudojant formulę: Cc = A1 × ABS + A0;
Čia:
A1, A0 – konstantos; ABS – absorbcija;
7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP redukcinio stiprumo vertinimo metodu
2.6. Metodo validacija
Aprašytas β-karoteno kiekio nustatymo metodas, efektyviosios skysčių chromatografijos būdu nėra nurodytas Europos Farmakopėjoje, todėl jam reikalinga validacija. Nustatyti parametrai: atsikartojamumas – 0,03 %, tarpinis precizižkumas – 0,28 %, nustatymo riba – 1 µg/ml, aptikimo riba – 0,45 µg/ml.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta ,,MS Excel 2008” (Microsoft, JAV) programine įranga. Visi bandymai kartoti po tris kartus. Tyrimų duomenys apskaičiuoti pagal formules ir suvesti į duomenų bazę. Apskaičiuotas matematinis vidurkis. Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas, taikant ,,IBM SPSS Statistics 22.0, JAV” programą.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tyrimams naudojami vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedai buvo renkami žydėjimo metu iš 12-os skirtingų augimo vietų, pasiskirsčiusių keturiuose Lietuvos etnografiniuose regionuose. Daugiausia žaliavų buvo surinkta Aukštaitijoje - iš 5 augimviečių. Dvejose vietose, žaliavos buvo renkamos pakartotinai 4 kartus, skirtingais laiko intervalais. Suvalkijoje medetkų žiedai rinkti iš 2-jų augimo vietų ir vienoje rinkimas vykdytas 3 kartus, periodiškai kas dvi savaites.
3.1. β-karoteno kokybinės sudėties analizė vaistinių medetkų (Calendula officinalis
L.) žieduose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kokybinė β-karoteno analizė atlikta taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. ESC pasižymi dideliu jautrumu, atkartojamumu ir vis dažniau naudojama augalinių žaliavų ekstraktų kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams atlikti.
Atlikus kokybinę analizę, vertinant etaloninio (gamyba aprašyta 2.5.2 skyriuje) ir tiriamųjų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) (žiedų ektraktų gamyba aprašyta 2.5.1 skyriuje) mėginių sulaikymo laikus, gautos chromatogramos, kuriose nustatytas β-karotenas (8 pav.).
(a)
(b)
8 pav. Etaloninio (a) ir tiriamojo (b) tirpalų chromatogramos, kuriose nustatytas β-karotenas (λ= 450 nm)
3.2. β-karoteno kiekio nustatymas vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.)
žieduose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Atliekant β-karoteno kiekybinį vertinimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, didžiausias dėmesys skirtas maksimaliai išeigai ir veikliosios medžiagos išskyrimui, todėl siekiant padidinti metodo efektyvumą buvo taikytos kelios ekstrakcijos metodikos.
2015 m. surinkta vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) vaistinė augalinė žaliava, naudota tyrimui, buvo švieži ir džiovinti žiedai. Ekstrakcija vykdyta 96 % etanoliu, pridedant askorbo rūgšties kaip antioksidanto ir 50 % kalio hidroksido tirpalo. Ekstrakcijos proceso metu iškilo vaistinės augalinės žaliavos perkėlimo problema, nes dalomasis piltuvas nėra pritaikytas šiam veiksmui atlikti ir todėl gauti nuostoliai, kurie sąlygojo mažesnį β-karoteno kiekį. Ekstrakcijos procesas truko 4 valandas. Gauti rezultatai parodė, jog didžiausias β-karoteno kiekis (332 µg/g) buvo išskirtas iš šviežių šaldytų vaistinių medetkų žiedų (1 lentelė).
1 lentelė. β-karoteno kiekio įvairavimas vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose, atliekant ekstrakciją su saponifikacija (2015 m.)
Rinkimo vieta Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) vaistinės augalinė žaliava
β- karoteno
kiekis µg/g Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija,
Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Švieži, šaldyti žiedai 332
Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Džiovinti žiedai 53,56
Varėnos rajono savivaldybė, Varėnos seniūnija, Perlojos kaimas, Armanios
gatvė 3
Džiovinti žiedai 44,8
Varėnos rajono savivaldybė, Varėnos seniūnija, Perlojos kaimas, Armanios
gatvė 3
Džiovinti žiedai 38,72
Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Ekstrakcijos proceso supaprastimui ir metodo, laiko atžvilgiu, trumpinimui buvo taikyta ekstrakcija nenaudojant saponifikacijos. Kadangi didžiausias β-karoteno kiekis išskirtas iš šviežių žiedų (β-karoteno kiekis 332 µg/g) nuspręsta juos naudoti tolimesniuose tyrimuose. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedai ekstrahuoti tris kartus, heksano ir 0,1 % butilhidroksitolueno mišiniu. Proceso trukmė – 1 valanda. Siekiant padidinti žaliavos smulkumo laipsnį, šaldyti žiedai grūstuvėje disperguoti su stiklo grūdeliais, šaldyti esant -80 °C temperatūrai ir paveikti skystu azotu. Gauti rezultatai parodė, jog didžiausias β-karoteno kiekis (432 µg/g) , efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, gautas vaistinę augalinę žaliavą veikiant skystu azotu ir smulkinant malimo mašinėle (2 lentelė).
2 lentelė. β-karoteno kiekio įvairavimas vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose, atliekant ekstrakciją be saponifikacijos (2015 m.)
Rinkimo vieta Žiedų
smulkinimo būdas
β- karoteno kiekis µg/g
Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Malimo mašinėle, skystu azotu
432
Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Malimo mašinėle, esant -800C temperatūrai
372,08
Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Grūstuvėje su stiklo grūdeliais
75,6
Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25
Malimo mašinėle 35,8
Varėnos rajono savivaldybė, Varėnos seniūnija, Perlojos kaimas, Armanios gatvė 3
Malimo mašinėle 28,84
Atlikus ekstrakcijos metodikos analizę, optimizavimą ir pasirinkus efektyviausią β-karoteno išskyrimo būdą, atlikta efektyvioji skysčių chromatografija, vertinant vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedus, rinktus 11-oje skirtingų augimviečių (3 lentelė).
3 lentelė. β-karoteno kiekio įvairavimas vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose, atliekant ekstrakciją be saponifikacijos (2016 m.)
Augimvietė Calendula officinalis L. žiedų rinkimo data β- karoteno kiekis (µg/g) Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 2016-07-30 544,96 Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 2016-07-23 334,76 Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 2016-08-02 430,52 Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 2016-08-11 337,4 Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 2016-08-19 365,52 Kauno rajonas, Raudondvario seniūnija, Didvyrių kaimas, Stirnų gatvė 25 2016-09-25 294,56
Vilkaviškio rajonas, Šeimenos seniūnija, Serdokų kaimas, Žalumynų gatvė 2
2016-07-16 82,76
Vilkaviškio rajonas, Šeimenos seniūnija, Serdokų kaimas, Žalumynų gatvė 2
2016-07-27 168,48
Vilkaviškio rajonas, Šeimenos seniūnija, Serdokų kaimas, Žalumynų gatvė 2
2016-08-04 72,48
Kupiškio rajonas, Subačiaus seniūnija, Biržų gatvė 15 2016-07-13 72,68 Kupiškio rajonas, Subačiaus seniūnija, Biržų gatvė 15 2016-07-28 162,92 Kupiškio rajonas, Subačiaus seniūnija, Biržų gatvė 15 2016-08-11 271,12 Kupiškio rajonas, Subačiaus seniūnija, Biržų gatvė 15 2016-08-28 205,52 Pasvalio rajonas, Pumpėnų seniūnija, Vilkiškių kaimas, Vilkiškių gatvė
13
2016-08-28 267,28
Vilnius, Antakalnio seniūnija, Smėlio gatvė 2 2016-08-16 150,88 Kauno rajonas, Karmėlavos seniūnija, Karmėlavos II kaimas, Pilies gatvė
11A
2016-08-04 367,36
Alytaus apskritis, Druskininkų savivaldybė, Veičiūnų seniūnija, Neravų kaimas, Panemunės gatvė 2
2016-08-15 64,52
Šiaulių rajonas, Šiaulių kaimiškoji seniūnija, Toliočių kaimas, Aguonų gatvė 2
2016-07-03 163,72
Panevėžio apskritis, Biržų rajonas, Širvėnos seniūnija, Pievų gatvė 6 2016-07-18 47,04 Kretingos rajonas, Kretingos seniūnija, Vytauto gatvė 84 2016-08-16 525,44 Joniškio rajonas, Saugėlaukio seniūnija, Bariūnų kaimas, Aušros gatvė 7 2016-08-19 125,92
Didžiausias β-karoteno kiekis nustatytas Kauno rajone, Didvyrių kaime, 2016-07-30 rinktų žiedų mėginiuose (544,96 µg/g). Nežymiai mažesnis β-karoteno kiekybinis įvertinimas nustatytas Kretingos rajone, 2016-08-16, skintų vaistinių medetkų žiedų mėginiuose (525,44 µg/g). Mažiausias medžiagos kiekis užfiksuotas Biržų rajone, 2016-07-18, skintų žiedų mėginiuose (47,04 µg/g).
3.3. Bendro karotenoidų kiekio nustatymas vaistinių medetkų (Calendula
officinalis L.) žiedų mėginiuose spektrofotometriniu metodu
Atliekant spektrofotmetrinį tyrimą buvo naudojami heksano ir 0,1 % butilhidroksitolueno mišinio vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktai. Mėginiai ruošti iš 11 - skirtingų augimo vietų rinktų žiedų. Analizuojant ekstraktus buvo nustatytas bendras karotenoidų kiekis ir išreikštas β-karoteno ekvivalentu mg/g. Atliekant spektrofotometrinius analizės metodus, esant aukštam absorbcijos skaičiui, vaistinės augalinės žaliavos ekstraktai buvo skiedžiami santykiu 1:5.
Spektrofotometriniai analizės metodai atlikti pagal Europos Farmakopėjoje nenurodytas metodikas, todėl buvo reikalingas metodų validavimas.
Analizuota skirtinguose Lietuvos regionuose rinkta žaliava, bandymai kartoti po tris kartus.
9 pav. Bendras, vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktų, rinktų skirtinguose Lietuvos etnografiniuose rajonuose, karotenoidų kiekis (µg/g). Skirtingos raidės rodo statistiškai
reikšmingus (p<0,05, n=3) skirtumus tarp ėminių
Apskaičiavus bendrą karotenoidų kiekį, rezultatai suvesti į diagramą (9 pav.). Gauti duomenys parodė, jog didžiausias kiekis nustatytas Joniškio rajone, Bariūnų kaime (8,23 mg/g) rinktų žiedų
ekstraktuose. Šiek tiek mažesni rezultatai nustatyti Kauno rajone, Didvyrių kaime, iš vegetacijos laikotarpiu rinktų žaliavų kiekių, išvedus matematinį vidurkį (6,79 mg/g) bei Kupiškio rajone esančiame Subačiuje (matematinis vidurkis – 4,99 mg/g). Mažiausias bendras karotenoidų kiekis nustatytas, vaistinių medetkų žiedų mėginiuose, rinktuose Alytaus apskrityje, Neravų kaime (2,44 mg/g). Galima teigti, jog skirtingose augimo vietose rinkti vaistinės augalinės žaliavos mėginiai kaupia ženkliai skirtingus junginių kiekius, nes nustatytas skirtumas tarp didžiausio ir mažiausio rezultatų yra 3,37 karto. Atlikus statistinį vertinimą, reikšmingi (p<0,05) skirtumai gauti tarp vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktų, rinktų Kauno rajone, Didvyrių kaime ir Vilkaviškio rajone, Serdokų kaime, taip pat tarp Vilniuje, Antaklanio seniūnijoje ir Kauno rajone, Karmėlavos II kaime rinktų mėginių, bendro karotenoidų kiekio.
Norint įvertinti ar žaliavos rinkimo laikas turi įtakos bendram veikliųjų junginių kiekiui, trijose kultyvavimo vietose, vaistinių medetkų žiedai buvo rinkti skirtingais laiko intervalais (10, 11, 12 pav.).
Kauno rajone, Didvyrių kaime, rinktų vaistinių medetkų žiedų mėginių, didžiausias bendras karotenoidų kiekis nustatytas rugsėjo mėnesį (8,04 mg/g), o mažiausias – rugpjūčio 8 dieną (5,57 mg/g), tačiau ženklūs kiekio pokyčiai nenustatyti (10 pav.). Vilkaviškio rajone, Šeimenos seniūnijoje, Serdokų kaime rinktų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų sudėtyje didžiausias kiekis, nustatytas spektrofotometriniu metodu buvo rugpjūčio 4 dieną (6,65 mg/g) ir buvo 2,7 karto didesnis nei liepos 27 dieną (nustatytas mažiausias bendras karotenoidų kiekis – 2,45 mg/g). Galima daryti prielaidą, jog ryškūs kiekybiniai skirtumai pastebėti dėl temperatūrų svyravimų skirtingais mėnesiais (11 pav.). Didžiausias bendras karotenoidų kiekis Kupiškio rajone, Subačiaus seniūnijoje skintuose vaistinių medetkų žieduose nustatytas liepos 28 ir rugpjūčio 28 dienomis (atitinkamai 6,61 mg/g ir 8,05 mg/g) ir apytiksliai buvo 3,3 karto didesnis, nei nustatytas mažiausias bendras karotenoidų kiekis vaistinėje augalinėje žaliavoje, rinktoje rugpjūčio 11 dieną (2,45 mg/g) (12 pav.). Įvertinus rezultatus, gauti statistiškai reikšmingi (p<0,05) skirtumai tarp visų ėminių.
10 pav. Bendras, vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktų rinktų vegetacijos laikotarpiu (2016 m.) Kauno rajone, Raudondvario seniūnijoje, Didvyrių kaime, karotenoidų kiekis.
Skirtingos raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05, n=3) skirtumus tarp ėminių
11 pav. Bendras, vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktų rinktų vegetacijos laikotarpiu (2016 m.) Vilkaviškio rajone, Šeimenos seniūnijoje, Serdokų kaime, karotenoidų kiekis.
Skirtingos raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05, n=3) skirtumus tarp ėminių.
12 pav. Bendras, vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktų rinktų vegetacijos laikotarpiu (2016 m.) Kupiškio rajone, Subačiaus seniūnijoje, karotenoidų kiekis. Skirtingos raidės
rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05, n=3) skirtumus tarp ėminių
3.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu vaistinių medetkų
(Calendula officinalis L.) žiedų mėginiuose
Skyriuje aprašomi skirtingose augimo vietose rinktų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktų spektrofotometrinio tyrimo rezutatai, siekiant įvertinti galimus skirtumus. Nustatytas antioksidacinis aktyvumas panaudojant FRAP reagentą, remiantis standartiniu Trolokso ekvivalentu mkg/g. Vertinama vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo augimo vietos. Augalai buvo rinkti 11-oje skirtingų Lietuvos vietų (13 pav.).
13 pav. Skirtingose augimo vietose rinktų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) augalinės žaliavos (žiedų), ekstraktų antioksidaciniai aktyvumai FRAP metodu
TEA C ( µ g/ g)
