LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
AIRIDA KUKAUSKAITĖ
PAPRASTOJO ERŠKĖČIO (ROSA CANINA L.) IR MIŠKINIO
ERŠKĖČIO (ROSA MAJALIS HERRM.) VAISIŲ VAISTINIŲ
AUGALINIŲ ŽALIAVŲ ASKORBO RŪGŠTIES, KAROTENOIDŲ IR
POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ FITOCHEMINIS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. Deividas Burdulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
PAPRASTOJO ERŠKĖČIO (ROSA CANINA L.) IR MIŠKINIO
ERŠKĖČIO (ROSA MAJALIS HERRM.) VAISIŲ VAISTINIŲ
AUGALINIŲ ŽALIAVŲ ASKORBO RŪGŠTIES, KAROTENOIDŲ IR
POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ FITOCHEMINIS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovas
Data Doc. dr. Deividas Burdulis
Data
Darbą atliko Magistrantė Airida Kukauskaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Rosaceae Juss. šeimos ir Rosa L. genties apibūdinimas ... 10
1.2. Erškėčių rūšių apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ... 10
1.3. Augalo paplitimas ir dauginimasis ... 11
1.4. Erškėčių vaisių cheminė sudėtis ... 12
1.5. Erškėčių vaisių vaistinės augalinės žaliavos ir preparatų vartojimo sritys medicinoje ... 12
1.5.1. Vaistinio augalo panaudojimas medicinoje ... 12
1.5.2. Uždegimą slopinantis poveikis ... 13
1.5.3. Antioksidantinis ir priešvėžinis poveikis ... 14
1.5.4. Hipoglikeminis poveikis ... 15
1.5.5. Svorį mažinantis poveikis ... 15
1.5.6. Kitos vartojimo sritys ... 16
1.6. Erškėčių augalinės žaliavos vartojimas ir dozavimas ... 17
1.7. Svarbiausių erškėčiuose randamų biologiškai aktyvių junginių apžvalga ... 17
1.7.1. Bendra flavonoidų apžvalga ... 17
1.7.2. Flavonoidų cheminė struktūra ... 18
1.7.3. Flavonoidų klasifikacija ... 18
1.7.4. Flavonoidų reikšmė augalams ... 20
1.7.5. Flavonoidų poveikis žmogaus organizmui ... 20
1.7.6. Askorbo rūgštis ir jos reikšmė augalams ... 20
1.7.7. Askorbo rūgšties reikšmė žmogaus organizmui ... 21
1.7.8. Karotenoidai ir jų reikšmė žmogaus organizmui ... 21
1.8. Laisvieji radikalai ir jų poveikis žmogaus sveikatai. Oksidacinis stresas ... 22
1.9. Antioksidantai ir antioksidantinis aktyvumas ... 22
2. TYRIMO METODIKOS... 24
2.1. Tiriamasis objektas ... 24
2.2. Naudotos medžiagos, reagentai ir aparatūra ... 25
2.3. Tyrimo metodai ... 25
2.3.2. Aliejinio ekstrakto paruošimas ... 26
2.3.3. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 26
2.3.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 26
2.3.5. Bendras fenolinių junginių nustatymas ... 27
2.3.6. Bendro karotenoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 29
2.3.7. Askorbo rūgšties nustatymas titrimetriniu metodu ... 29
2.3.8. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu ... 30
2.3.9. Duomenų statistinis įvertinimas ... 31
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
3.1 Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas flavonoidams ir karotenoidams išgauti ... 32
3.2. Cheminės sudėties įvairavimas erškėčių vaisiuose, skirtingose Lietuvos vietovėse ... 36
3.2.1. Askorbo rūgšties kiekio įvairavimas erškėčių vaisių mėginiuose ... 36
3.2.2. Karotenoidų kiekio įvairavimas erškėčių vaisių mėginiuose ... 38
3.2.3. Flavonoidų kiekio įvairavimas erškėčių vaisių mėginiuose ... 40
3.2.4. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas erškėčių vaisių mėginiuose ... 42
3.3. Cheminės sudėties įvairavimas erškėčių vaisių mėginiuose nokimo laikotarpiu ... 43
3.4. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas erškėčių vaisių ekstraktuose ... 45
3.4.1. Antiradikalinio aktyvumo priklausomybės nuo fenolinių junginių kiekio įvertinimas ... 46
4. IŠVADOS ... 48
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49
SANTRAUKA
A. Kukauskaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Doc. Dr. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas.
Darbo pavadinimas: Paprastojo erškėčio (Rosa canina L.) ir miškinio erškėčio (Rosa majalis Herrm.) vaisių vaistinių augalinių žaliavų askorbo rūgšties, karotenoidų ir polifenolinių junginių fitocheminis tyrimas.
Darbo tikslas: atlikti natūraliose augimvietėse surinktų paprastojo erškėčio (Rosa canina L.) ir miškinio erškėčio (Rosa majalis Herrm.) vaisių vaistinių augalinių žaliavų cheminės sudėties įvairavimo tyrimą bei įvertinti gautų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1. Parinkti tinkamiausią erškėčių vaisių augalinės žaliavos ekstrakcijos tirpiklį ir optimalias ekstrakcijos sąlygas, užtikrinančius didžiausią flavonoidų ir karotenoidų išeigą. 2. Atlikti erškėčių vaisių augalinės žaliavos mėginių, surinktų iš įvairių Lietuvos vietovių, cheminės sudėties analizę, įvertinant askorbo rūgšties, karotenoidų, flavonoidų bei fenolinių junginių įvairavimą. 3. Nustatyti flavonoidų, fenolinių junginių, askorbo rūgšties bei karotenoidų kiekybinės sudėties kitimo dinamiką erškėčių vaisiuose jų nokimo metu 4. Įvertinti erškėčių vaisių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Tyrimo metodai: Bendras flavonoidų ir fenolinių junginių bei karotenoidų kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu. Askorbo rūgšties įvertinimui naudotas titrimetrinis metodas. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas DPPH metodika spektrofotometriškai.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias kiekis karotenoidų (47,8 mg %) ir flavonoidų (0,88 proc.) R. canina L. vaisių mėginiuose aptiktas Meteliuose (Lazdijų rajone). Iš tirtų R. majalis Herrm. vaisių mėginių daugiausiai karotenoidų (50,5 mg %) ir flavonoidų (0,92 proc.) buvo sukaupta Druskininkuose rinktuose vaisių mėginiuose. Bendras fenolinių junginių kiekis abiejų rūšių erškėčių vaisiuose buvo intervale nuo 4,9 iki 18,93 GAE mg /g. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis aptiktas R. majalis Herrm. vaisiuose rinktuose Visagine (Utenos apskrityje) (18,93 GAE mg/g). Didžiausias kiekis askorbo rūgšties aptiktas Druskininkų mieste rinktuose R. majalis Herrm. vaisių mėginiuose (0,466 proc.). Nustatyta, kad biologiškai aktyvių junginių kiekis kinta nokstant erškėčių vaisiams ir priklauso nuo erškėčių rūšies. Didžiausi kiekiai askorbo rūgšties (0,412 proc.), karotenoidų (38,9 mg %), flavonoidų (0,95 proc.) bei fenolinių junginių (18,2 GAE mg/g) aptikti R. majalis Herrm. vaisių mėginiuose rinktuose vaisių nokimo pabaigoje. Didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas vaisių nokimo pabaigoje surinktuose R. majalis Herrm. vaisių mėginiuose (58,3 proc.). Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys (koreliacijos koeficientas 0,965) tarp fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo.
SUMMARY
Master thesis of A. Kukauskaitė / associate professor Deividas Burdulis Dr.; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Medical academy, Department of Pharmacognosy – Kaunas.
The topic of master thesis: Phytochemical analysis of ascorbic acid, carotenoids and polyphenolic compounds in dog rose (Rosa canina L.) and cinnamon rose (Rosa majalis Herrm.) fruit raw material
The aim of the research: To examine the variety of chemical composition and antiradical activity of naturally growing dog rose (Rosa canina L.) and cinnamon rose (Rosa majalis Herrm.) fruits.
The objectives of the research: 1.To select the most suitable solvent for extraction of rosehip fruits and optimize the extraction method which ensures the highest yield of flavonoids and carotenoids. 2.To perform a chemical composition analysis of rosehip fruit samples collected from different areas of Lithuania, evaluating the amount of ascorbic acid, carotenoids, flavonoids and phenolic compounds. 3.To determine the quantitative composition of flavonoids, phenolic compounds, ascorbic acid and carotenoids in rosehip fruits during different maturity stages. 4.To evaluate the antiradical activity of the rosehip fruit extracts.
The methods of research: the total amount of flavonoids, phenolic compounds and carotenoids were determined by spectrophotometric methods. For quantitative analysis of the ascorbic acid titrimetric method was used. The antiradical activity was determined spectrophotometrically by DPPH method.
Results and conclusions: The highest levels of carotenoids (47,8 mg %) and flavonoids (0,88 %) were detected in R. canina L. fruit samples, collected in Meteliai (Lazdijai county). Of the samples of R. majalis Herm. fruit, the highest amount of carotenoids (50,5 mg%) and flavonoids (0,92%) were found in fruit samples collected in Druskininkai. The total amount of phenolic compounds in rosehip fruit samples varied from 4,9 GAE mg/g to 18,93 GAE mg/g. The highest amount of phenolic compounds was determined in R. majalis Herrm. fruit, collected in Visaginas (Utena county) (18,93 GAE mg/g). The highest amount of ascorbic acid was determined in R. majalis Herrm. fruit samples (0,466 %), collected in Druskininkai. It was found that the amount of biologically active compounds in rosehip fruit changes during ripening and depends on rosehip species. The highest content of ascorbic acid (0,412 %), carotenoids (38,9 mg %), flavonoids (0,95 %) and phenolic compounds (18,2 GAE mg/g) were found in R. majalis Herrm. fruit samples collected at the end of ripening. The highest antiradical activity was detected in R. majalis Herrm. fruit samples (58,3 %) collected at the end of the fruit ripening. A strong correlation relationship (correlation coefficient – 0,965) was found between the amount of phenolic compounds and antiradical activity.
SANTRUMPOS
AKT – baltymų kinazė B
ALT – alanininė aminotransferazė AST – asparagininė aminotransferazė CD – cukrinis diabetas COX – 1 – ciklooksigenazė – 1 COX – 2 – ciklooksigenazė – 2 CRB – C – reaktyvinis baltymas DNR – deoksiribonukleorūgštis DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo hidratas DTL – didelio tankio lipoproteinai
EP – Europos farmakopėja
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija KMI – kūno masės indeksas
MAPK – mitogenų aktyvinamos proteinkinazės (angl. mitogen-activated protein kinase) MTL – mažo tankio lipoproteinai
NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo PI3K – fosfatidilinozitolio 3 – kinazės PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija RPN – rekomeduojama paros norma SN – standartinis nuokrypis
ĮVADAS
Šio darbo tiriamasis objektas yra erškėčių (Rosa L.) genties augalai, priklausantys erškėtinių (Rosaceae) šeimai. Lietuvoje medicinoje yra vartojami 3 rūšių erškėčių vaisiai: paprastasis erškėtis (Rosa canina L.), miškinis erškėtis (Rosa majalis Herrm. arba Rosa cinnamomea L.) ir raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) [2]. Magistro baigiamojo darbo tyrimams atlikti pasirinktos dvi erškėčių rūšys – paprastojo erškėčio (Rosa canina L.) bei miškinio erškėčio (Rosa majalis Herrm.) vaisiai, kurie surinkti iš skirtingų Lietuvos vietovių.
Erškėčiai dėl savo vertingųjų savybių žinomi jau daugiau kaip 2000 metų ir visos rūšys yra gana plačiai paplitusios visoje Lietuvoje, išskyrus šiaurinę Lietuvos dalį, kur augalas nėra itin dažnas. Erškėtis jau nuo senų laikų pripažintas kaip polivitamininis augalas. Geriausiai žinoma ir pagrindinė erškėčio vaisių panaudojimo sritis yra avitaminozės profilaktikai ir gydymui, organizmui sustiprinti po sunkių ligų ar operacijų, vartojama sergant mažakraujyste, peršalimo ligų profilaktikai. Erškėčių vaisių arbatos taip pat yra vartojamos sergant gastritu, skrandžio ir dvylikapirštės žarnos opomis [1, 8, 26, 29].
Erškėčių vaisiuose aptinkamas didelis vitamino C kiekis bei kitų vitaminų, tokių kaip A, PP, K, E, B grupės vitaminų bei įvairių mineralinių medžiagų [19]. Be to, vaistinis augalas kaupia ir karotenoidus bei fenolinius junginius, iš kurių pagrindiniai yra flavonoidai, fenolinės rūgštys ir antocianinai. Fenoliniai junginiai pasižymi antioksidantinėmis savybėmis – apsaugo ląsteles nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio. Flavonoidai pasižymi priešuždegiminėmis, trombocitų agregaciją slopinančiomis, antibakterinėmis, antivirusinėmis savybėmis [18,19,20]. Taigi, dėl šių priežasčių erškėčių vaisiai pasirinkti norint sužinoti flavonoidų bei fenolinių junginių įvairavimą juose bei įvertinti su šiais junginiais susijusį erškėčių vaisių antiradikalinį aktyvumą.
Šio tyrimo metu nustatytas flavonoidų ir polifenolinių junginių kiekis Rosa canina L. ir Rosa majalis Herrm. vaisiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos vietovių. Taip pat abiejose augalo rūšyse ištirtas bendras karotenoidų, askorbo rūgšties kiekis, įvertintas antiradikalinis aktyvumas. Tyrimo metu karotenoidų ekstrakcija iš augalinių žaliavų buvo vykdyta naudojant natūralius ekstrahentus – augalinius aliejus.
Darbo tikslas: atlikti natūraliose augimvietėse surinktų paprastojo erškėčio (Rosa canina L.) ir miškinio erškėčio (Rosa majalis Herrm.) vaisių vaistinių augalinių žaliavų cheminės sudėties įvairavimo tyrimą bei įvertinti gautų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas : atlikti natūraliose augimvietėse surinktų paprastojo erškėčio (Rosa canina L.) ir miškinio erškėčio (Rosa majalis Herrm.) vaisių vaistinių augalinių žaliavų cheminės sudėties įvairavimo tyrimą bei įvertinti gautų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausią erškėčių vaisių augalinės žaliavos ekstrakcijos tirpiklį ir optimalias ekstrakcijos sąlygas, užtikrinančius didžiausią flavonoidų ir karotenoidų išeigą.
2. Atlikti erškėčių vaisių augalinės žaliavos mėginių, surinktų iš įvairių Lietuvos vietovių, cheminės sudėties analizę, įvertinant askorbo rūgšties, karotenoidų, flavonoidų bei fenolinių junginių įvairavimą.
3. Nustatyti flavonoidų, fenolinių junginių, askorbo rūgšties bei karotenoidų kiekybinės sudėties kitimo dinamiką erškėčių vaisiuose jų nokimo metu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Rosaceae Juss. šeimos ir Rosa L. genties apibūdinimas
Erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeima yra didelė šeima, kurioje yra apie 100 genčių ir 2000 rūšių daugiamečių, rečiau vienmečių žolinių augalų, medžių ir krūmų. Lietuvoje natūraliai erškėčio (Rosa L.) genties auga 12 rūšių augalų, o 13 augalų auginama kultūrinių. Kultūrinės erškėčio rūšys vadinamos rožėmis, kurių yra apie 10 000 veislių [1]. Lietuvoje medicinoje yra vartojami 3 rūšių erškėčiai: paprastasis erškėtis (Rosa canina L.), miškinis erškėtis (Rosa majalis Herrm. arba Rosa cinnamomea L.) ir raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) [2].
1.2. Erškėčių rūšių apibūdinimas ir morfologiniai požymiai
Paprastasis erškėtis. Pavadinimas - paprastasis erškėtis (Rosa canina L.), šeima - erškėtinių (Rosaceae). Liaudiški pavadinimai: arškėtys, erškėčiakrūmis, erškėtinė rožė, erškėtys, radasta, radastas, rožė, šipšingė, šunrožė, vilkbukis, vilkdagis [3]. Kitose Europos sąjungos šalyse paprastasis erškėtis turi taip pat nemažai pavadinimų, pavyzdžiui angliškai yra vadinamas: wild briar, witches briar, dog rose, hip fruit, hip tree [4,3].
Paprastasis erškėtis yra daugiametis augalas, iki 2-3 metrų užaugantis krūmas, tačiau aukštis kartais gali siekti iki 5 metrų ir daugiau [5,6,7]. Augalo stiebai yra gana ploni, bet aštrūs, kadangi yra padengti tvirtais spygliais, kurie pasižymi pjautuviškai išlenkta forma, plačiais suplotais pamatais, yra nevienodo dydžio ir išsidėstę netvarkingai [3, 6, 7, 8]. Jaunos šakelės yra daug tankiau dygliuotos negu seni stiebai [3]. Augalo žievė yra žalios arba raudonai rudos spalvos ir dažniausiai be pilko apnašo [6]. Lapai pražanginiai, neporiškai plunksniški, suskirstyti į 5-7 lapų skiautes. Lapų skiautės yra pailgai kiaušiniškos arba elipsiškos formos, viršūnėje trumpai nusmailėjusios, pakraščiuose turi paprastus arba sudėtinius dantelius, kurie užsibaigia aštriai ir turi liaukutes [3, 6, 9, 7, 8]. Lapai iš abiejų pusių glotnūs ir lygūs, žalios spalvos, o lapkočiai pliki, rečiau plaukuoti. Žiedų spalva įvairuoja nuo baltos, šviesiai rožinės iki tamsiai rožinės spalvos, žiedai paprastai yra susitelkę po 3-5, gali būti pavieniai arba skėtiškuose žiedynuose [6, 8]. Žiedai aromatingi ir malonaus, švelnaus kvapo, susideda iš 5 vainiklapių. Taurėlapiai – 5, paprastai turi 10 arba daugiau piestelių ir daug kuokelių [8]. Krūmai žydi birželio- liepos mėnesiais, o rugpjūčio- rugsėjo mėnesiais augalas subrandina vaisius. Vaisiai yra netikros uogos, kurios yra ovalios, kiaušiniškos, rečiau rutuliškos formos, blizgančios, ryškios oranžiniai raudonos spalvos, saldžiai rūgštaus skonio [3, 6, 8]. Vaisių vidinė pusė apaugusi plaukeliais, o viduje randama daug riešutėlių – sėklų [3]. Erškėčių vaisių svoris su sėklomis gali būti nuo 1,25 iki 3,25 g [10].
Miškinis erškėtis. Pavadinimas – miškinis erškėtis (Rosa majalis Herm. arba Rosa cinnamomea L.), šeima - erškėtinių (Rosaceae). Liaudiškas pavadinimas – vilniškis erškėtis. Anglų kalboje sutinkamas pavadinimas – cinnamon rose [3]. Miškinis erškėtis kaip ir paprastasis erškėtis yra daugiametis augalas, jo aukštis gali siekti nuo 0,5 iki 2 metrų aukščio. Augalo šakos plonos, o žievė rausvai ruda, blizganti. Šakelės pasidengusios spygliais, kurie yra nedideli, lenkti ir išsidėstę tvarkingai – poromis prie lapų pagrindo. Pasitaiko ir smulkių, tiesių spyglių. Šakelės ant kurių yra žiedai, spyglių beveik neturi. Miškinio erškėčio lapai susideda iš 5-7 lapelių, o lapeliai elipsiškos, pailgai kiaušiniškos formos, viršūnėje užaštrinti. Lapų viršutinė pusė lygi, o apatinė pusė gausiai apaugusi plaukeliais. Augalo žiedai pavieniai, tamsiai purpurinės spalvos. Taurėlapiai – ilgi, siauri. Žydi birželio – gegužės mėnesiais, o vėliau subrandina raudonus, apvalius arba apvaliai kūgiškus vaisius [3, 6, 11]. Iš visų erškėčių rūšių augančių Lietuvoje, miškinis erškėtis sukaupia daugiausiai vitamino C savo vaisiuose [6]. Raukšlėtalapis erškėtis. Pavadinimas – raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.), šeima – erškėtinių (Rosaceae). Liaudiški pavadinimai : radasta, radastas. Angliškai – rose rugose, Japanese rose, Sitka rose, Turkestan rose [3, 12].
Tai daugiametis nedidelis krūmas, kurio aukštis gali būti nuo 1 iki 2 metrų [3]. Augalo šakos gausiai apaugusios įvairaus dydžio spygliais, kurie yra tiesūs, stori bei aštrūs [12, 13]. Lapai susideda iš 5-7 ar 9 lapelių, kurie yra elipsės formos, dantyti ir gana ilgi. Lapai ryškiai žali ir stori, o paviršius raukšlėtas, viršutinė jų pusė lygi, o apatinė apaugusi pilkais plaukeliais [3, 12, 13]. Raukšlėtalapio erškėčio žiedai pavieniai arba susitelkę po 3-6 į žiedynus, dideli bei ryškūs – tamsiai rožinės spalvos. Augalas subrandina didelius, rutuliškus vaisius, kurie yra šiek tiek suploti ir subręsta vasaros pabaigoje [3,12].
1.3. Augalo paplitimas ir dauginimasis
Visų rūšių erškėčių krūmai yra paplitę Europos šiaurinėje dalyje iki pietinės Skandinavijos, Rusijos europinėje dalyje, Kaukaze, Irane bei Vidurinėje Azijoje. Šiaurės Amerikoje augalas yra introdukuotas ir yra dažniausiai sutinkamas rytinėje pakrantėje [1, 8].
Lietuvoje augalo visos rūšys yra gana dažnos, išskyrus šiaurinę Lietuvos dalį [1]. Erškėčių krūmai dažniausiai auga miško aikštelėse, pamiškėse, išretintuose miškuose, kirtimuose, pakelėse, upelių krantuose, krūmynuose ar atviruose šlaituose. Augalai mėgsta augti šviesiose vietose bei vidutinio drėgnumo derlinguose dirvožemiuose. Augalas dauginasi sėklomis, šakninėmis atžalomis arba atlankomis [14].
1.4. Erškėčių vaisių cheminė sudėtis
Erškėčiai yra daug vitaminų kaupiantys augalai. Erškėčių vaisiuose aptinkamas didelis kiekis vitamino C. Nustatyta, kad erškėčių vaisiai turi didžiausią askorbo rūgšties kiekį iš visų vaisių ir daržovių, kuris gali būti 300–4000 mg/100g [16]. Pavyzdžiui, erškėčių vaisiuose askorbo rūgšties kiekis yra apie 10 kartų didesnis negu juodųjų serbentų uogose bei apie 50 kartų didesnis negu citrinose [14]. Vitamino C kiekis vaisiuose labai priklauso nuo to, kada jie surinkti, kadangi nepilnai sunokę vaisiai yra mažiau vitaminingi [3]. Europos farmakopėjoje (EP) nurodoma, kad kokybiškoje išdžiovintoje erškėčių vaistinėje augalinėje žaliavoje turi būti ne mažiau kaip 0,3 (%) askorbo rūgšties [17].
Be vitamino C erškėčių vaisiuose aptinkama ir kitų vitaminų: vitaminas A (217 μg / 100g), B1 (0,016 mg /100 g), B2 (0,166 mg /100 g), PP (1,3 mg / 100 g), K (25,9 μg / 100 g) ir E (5,84 mg / 100
g) bei nemažai mineralinių medžiagų: makroelementai – kalis, natris, fosforas, siera, kalcis ir ypač geležis, mikroelementai – molibdenas, manganas, cinkas, varis [19].
Taip pat vaistinėje augalinėje žaliavoje aptinkami pektinai (3,7%–14,0%), angliavandeniai (iki 18%), organinės rūgštys – daugiausia citrinų rūgštis ir obuolių rūgštis (2,6%), rauginės medžiagos (apie 3%), karotenoidai (β–karotenas, likopenas, kriptoksantinas, rubiksantinas, zeaksantinas ir liuteinas) bei galaktolipidai (mono ir diglicerolių glikozidai). Sėklose vyrauja riebalinis aliejus (apie 10%), kuriame yra linolino ir linoleno, oleino, palmitino bei stearino rūgščių, aptinkama eterinio aliejaus (0,3%), karotenoidų bei vitamino E [1,14,15,19, 20,22, 23, 24].
Vaistinis augalas kaupia ir fenolinius junginius, iš kurių pagrindiniai yra flavonoidai, fenolinės rūgštys ir antocianinai. Remiantis moksline literatūra, pagrindiniai erškėčių vaisiuose aptinkami flavonoidai yra kvercetinas ir jo dariniai, kemferolis, rutinas, flavon–3–olių pogrupiui priklausantis katechinas bei jo dariniai (katechino heksozidas, katechino – metil –galatas) ir trans– tilirozidas. Iš fenolinių rūgščių vyrauja hidroksicinamono rūgšties dariniai – P–kumarino rūgštis bei kofeino rūgštis, antocianinai – cianidinas [18, 19, 20].
1.5. Erškėčių vaisių vaistinės augalinės žaliavos ir preparatų vartojimo sritys
medicinoje
1.5.1. Vaistinio augalo panaudojimas medicinoje
Dėl savo vertingų savybių erškėčiai yra žinomi daugiau kaip 2000 metų [25]. Rosa canina L. rūšies pavadinimas yra kildinamas iš lotynų kalbos žodžio „šuo“ (lot. canina – šuo). Antikinės Graikijos gydytojo Hipokrato ir gamtininko Plinijaus Vyresniojo raštuose siūloma erškėtį naudoti gydantis po šuns įkandimų [26]. Erškėtis buvo plačiai vartojamas ir Viduramžiais, Avicena erškėtį
minėjo savo raštuose kaip vaistinį augalą gydant įvairias ligas [14]. Buvo tikima, kad erškėčio vaisių viduje esantys dirginantys šereliai gydo bėrimo sukeltą niežulį ir vabzdžių įkandimus [27]. Geriausiai erškėtis yra žinomas kaip polivitamininis augalas, todėl Antrojo Pasaulinio karo metais, kuomet Didžioji Britanija negalėjo importuoti citrusinių vaisių, vyriausybė skatino rinkti ir vartoti erškėčių vaisius kaip vitamino C šaltinį [8].
Liaudies medicinoje kaip vaistinė augalinė žaliava yra naudojami erškėčių lapai, vainiklapiai, tačiau dažniau vaisiai. Pagrindinė ir geriausiai žinoma erškėčio vaisių panaudojimo sritis yra avitaminozės profilaktikai ir gydymui, organizmui po sunkių ligų ar operacijų sustiprinti,tinka sergant mažakraujyste, peršalimo ligų profilaktikai, kuomet yra vartojamas erškėčių vaisių sirupas arba ekstraktas. Erškėčių vaisių arbatos vartojamos sergant gastritu, skrandžio ir dvylikapirštės žarnos opa, palengvina kosulį bei viduriavimą, sutrikusį virškinimą [1,8,26,29]. Geriant erškėčių vaisių arbatas gydomi ir inkstų bei kepenų veiklos sutrikimai, kadangi augalas skatina šlapimo ir tulžies išsiskyrimą [1]. Augalas vartojamas ir kaip širdies bei kraujagyslių veiklą normalizuojanti priemonė. Erškėčio lapai ir antpilai pasižymi antimikrobinėmis savybėmis, antpilais gydomas burnos gleivinės uždegimas [14], [15]. Erškėčių aliejumi gydomos žaizdos, pragulos, įvairūs odos susirgimai bei opos.
Vaistinis augalas yra panaudojamas ir maisto bei kosmetikos pramonėje. Iš nedžiovintų erškėčių vaisių ruošiamos uogienės, tyrelės, gaminamas kompotas, erškėčių žiedų vainiklapiais bei vaisiais galima aromatizuoti vyną, likerį bei įvairias užpiltines. Kosmetikos pramonėje erškėčio ekstraktai įeina į kremų, kaukių ir losjonų sudėtį,o išgautas eterinis aliejus panaudojamas pudrų bei kvepalų gamybai [22, 23, 28, 30].
1.5.2. Uždegimą slopinantis poveikis
Atlikti tyrimai keliuose in vivo eksperimentiniuose modeliuose parodė, kad Rosa canina L. vaisiai pasižymi uždegimą slopinančiomis ir skausmą mažinančiomis savybėmis dėl manomai vykstančių cheminių komponentų sinergistinių sąveikų. Nustatyta, kad etanoliniai erškėčių vaisių ekstraktai ir jų frakcijos geba slopinti prostaglandinų E1 veiklą [31]. Organizme prostaglandinai yra
gaminami infekcinio proceso metu ir dalyvauja kaip uždegimo, skausmo ir karščiavimo mediatoriai [32]. A. K. Jäger ir kt. (2007) atliko tyrimus ir in vitro, kurie padėjo nustatyti, kad skirtingi lipofiliniai komponentai, esantys erškėčių vaisiuose, yra atsakingi už uždegimo ir skausmo slopinimą, kadangi inhibuoja fermentą ciklooksigenazę (COX-1 ir COX- 2), ypač COX- 2, kuri yra susijusi su uždegimu [33, 34]. Atlikti klinikiniai tyrimai atskleidžia, kad viena iš R. canina L. vaisių miltelių sudedamųjų dalių yra galaktolipidai (mono ir diglicerolių glikozidai), kurie pasižymi uždegimą slopinančiu poveikiu – mažina periferinio kraujo neutrofilų ir monocitų chemotaksį, sumažina reaktyviojo baltymo C (CRB)
koncentraciją ir taip padeda pacientams sergantiems osteoartritu, artritu, reumatoidiniu artritu bei kitomis uždegiminėmis ligomis. Be to, galaktolipidai pasižymi ir antivėžiniu poveikiu [35, 36, 37]. Kaj Winther bei kt. (2008) nustatė, kad erškėčių milteliai (5 g per dieną) geba palengvinti osteoartrito sukeliamus simptomus. Šių studijų rezultatai parodė, kad erškėčių vaisių milteliai turi didesnį poveikį negu placebo, lengvina sąnarių skausmus, padidina jų lankstumą bei judrumą, veikia uždegimą slopinančiai [37]. Osteoartrito sąnarių skausmams palengvinti yra vartojamas paracetamolis bei nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (NVNU) [38]. Pasak kitų mokslininkų atliktų tyrimų, Rosa canina L. vaisių ekstraktai pasižymi tokiu pat uždegimą slopinančiu poveikiu kaip ir NVNU atstovas indometacinas [39]. Rosa canina L. ekstraktai galėtų būti kaip alternatyva NVNU, kadangi kitaip nei paracetamolis ar NVNU, erškėčių ekstraktai nesukelia tokių šalutinių poveikių kaip skrandžio opos, neturi antiagregacinio poveikio ir neveikia inkstų bei kepenų toksiškai [37].
1.5.3. Antioksidantinis ir priešvėžinis poveikis
Paskutiniuoju laikotarpiu mokslininkai yra susidomėję erškėčių vaisių priešvėžinėmis savybėmis. Kadangi erškėčių cheminėje sudėtyje vyrauja dideli kiekiai askorbo rūgšties ir polifenolinių junginių, Vesna T. Tumbas bei kiti mokslininkai (2011), norėdami nustatyti atskirų komponentų antioksidantinį bei priešvėžinį poveikį, erškėčių arbatoje esančius junginius išskyrė į tris skirtingas frakcijas: pirmoji frakcija – askorbo rūgšties, antroji – flavonoidų ir trečioji frakcija – fenolinių rūgščių (elago rūgšties ir kvercetino). Atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo flavonoidų frakcija, kiek mažiau askorbo rūgšties bei fenolinių rūgščių frakcijos (prieš 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikalus – DPPH(•)), tačiau tik polifenoliniai junginiai pasižymėjo antiproliferacinėmis savybėmis prieš gimdos kaklelio, krūties bei storosios žarnos vėžines ląsteles tiriant in vitro [40, 41]. Kitų mokslininkų duomenimis, metanoliniai erškėčių vaisių ekstraktai turėjo antiproliferacinį poveikį ir prieš daugiaformės glioblastomos ląsteles. Rosa canina L. vaisių ekstraktai (1 mg/ml, 250 μg/ml, 25 μg/ml and 25 ng/ml koncentracijų ) pasižymėjo žymiu vėžinių ląstelių augimo sutrikdymu, mažinant mitogeninį (MAPK) bei AKT signalinį perdavimą. Erškėčių ekstraktų antiproliferacinis poveikis buvo palygintas ir su žinomais ląstelių augimo inhibitoriais (PI3K/AKT bei MAPK), didesnės koncentracijos erškėčių ekstraktai turėjo vienodą poveikį kaip ir inhibitoriai arba net didesnį [42]. Teigiamą rezultatą parodė ir erškėčių vaisių ekstraktas, kuris buvo panaudotas prieš trigubai neigiamo krūties vėžio ląsteles. Mokslininkai tyrė ar erškėčių ekstraktai gali pagerinti chemoterapinio vaisto doksorubicino savybes ir gauti rezultatai parodė, jog vaistinės augalinės žaliavos ekstraktai pagerina vaisto savybes, pasižymi antiproliferaciniu veikimu, papildo chemoterapinių vaistų poveikį [43].
1.5.4. Hipoglikeminis poveikis
Pasaulinės Sveikatos Organizacijos (PSO) duomenys rodo, kad apie 415 mln. žmonių pasaulyje, o iš jų apie 60 mln. Europoje serga cukriniu diabetu (CD) [44, 45]. Organizacija spėja, kad iki 2030 metų diabetas taps 7-ąja priežastimi, kuri lems didžiausią mirštamumą [46]. Ulrika Andersson ir kt. (2010) tyrė erškėčių vaisių miltelių metabolinį poveikį nutukusioms pelėms. Rezultatai parodė, kad erškėčių milteliai, kurie buvo naudoti kaip maisto papildas, apsaugojo peles nuo kūno svorio bei riebalų masės padidėjimo. Atlikus gliukozės toleravimo testą nustatyta, jog erškėčių miltelių papildas geba sumažinti gliukozės koncentraciją ir bendrą cholesterolio kiekį plazmoje, tačiau veikimo mechanizmas nėra žinomas [47].
2015 metais mokslininkai atliko tyrimą, kuriame buvo tiriamos vyriškos lyties pelės, kurioms CD buvo sukeltas dirbtinai (suleista streptomicino 55 mg/kg kūno masės į pilvaplėvės ertmę) ir pelės girdytos paprastųjų erškėčių vaisių ekstraktu (250 mg/kg ir 500 mg/kg ). Rezultatai parodė ypač greitą gliukozės kiekio kraujyje sumažėjimą bei trigliceridų kiekio sumažėjimą, tačiau mažo tankio lipoproteinų (MTL), didelio tankio lipoproteinų (DTL) ir cholesterolio kiekis nežymiai pakito lyginant su kontrolinėmis pelėmis [48]. Hashem Dabaghian F ir kt. (2015) atliko klinikinį tyrimą, kuriame dalyvavo 36-60 metų amžiaus pacientai sergantys antrojo tipo CD, kuriems 3 mėnesius buvo duodamos kapsulės su paprastųjų erškėčių vaisių ekstraktu bei placebo kapsulės. Šių studijų rezultatai parodė, kad vartojant 750 mg erškėčių vaisių ekstrakto kapsules, pacientams gliukozės kiekis kraujyje nevalgius sumažėjo žymiai lyginant su placebo grupe. Tyrimo rezultatai taip pat parodė didelio tankio lipoproteinų (DTL) kiekio sumažėjimą. Pasak mokslininkų, R. canina L. ekstraktai ateityje galėtų būti sėkmingai panaudojami gydant cukrinį diabetą, tačiau būtina toliau atlikti tyrimus norint užtikrinti vaistinės augalinės žaliavos efektyvumą bei saugumą [49].
1.5.5. Svorį mažinantis poveikis
Remiantis PSO duomenimis, pastaraisiais metais pasikeitus mitybos bei gyvenimo įpročiams, žymiai padidėjo žmonių skaičius, kurie turi antsvorio problemų [50]. Antsvoris yra daugelio ligų atsiradimo priežastis. Nutukimas turi neigiamos reikšmės gyvenimo trukmei bei kokybei, yra rizikos veiksnys tokių ligų kaip CD, arterinės hipertenzijos, dislipidemijos, artrito ir artrozės bei širdies ligų – miokardo infarkto, insulto. Be to, nutukimas gali paskatinti ir kai kurių vėžinių ligų atsiradimą – krūties, gimdos, inkstų, kasos vėžinius susirgimus [51, 52]. Atsižvelgiant į tai, Ninomiya ir kt. (2007) tyrinėjo Rosa canina L. vaisių ir sėklų cheminėje sudėtyje esantį flavonoidą trans–tilirozidą ir pranešė apie junginio gebėjimą mažinti antsvorį. Atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad erškėčių ekstraktai ir būtent biologiškai aktyvus junginys trans–tilirozidas tyrime naudotoms pelėms geba mažinti kūno svorį ir
riebalų kaupimąsi kepenyse [53]. 2016 metais mokslininkai atliko tyrimus su pelėmis ir patvirtino anksčiau kitų mokslininkų atliktų tyrimų išvadas. Michele Cavalera ir kt. (2016) tyrė, kokią įtaką turi erškėčių vaisių ekstraktas su mityba susijusiam nutukimui. Vyriškos lyties pelės buvo šeriamos didelį riebalų kiekį turinčiu maistu kartu su erškėčių ekstraktu arba be jo tris mėnesius. Atlikus tyrimus rezultatai parodė, kad pelėms, kurioms buvo duodamas erškėčių ekstraktas, sumažėjo gliukozės kiekis kraujyje, cholesterolio bei insulino lygis, erškėčių vaisių ekstraktas gebėjo apsaugoti nuo svorio augimo [54]. Japonijoje mokslininkai atliko dvigubai aklą, atsitiktinių imčių, placebo kontroliuojamą klinikinį tyrimą (2015), kurio metu dalyvavo žmonės turintys antsvorį (KMI tarp 25 ir 30). Dalyviai kiekvieną dieną vartojo erškėčių vaisių ekstrakto tabletes arba placebo kartą per dieną dvylika savaičių. Šių studijų rezultatai parodė, kad dalyviams, kurie vartojo erškėčių vaisių ekstraktą, buvo pastebimas kūno svorio ir KMI sumažėjimas, riebalų kiekio sumažėjimas pilvo srityje ir vidaus organuose [55].
1.5.6. Kitos vartojimo sritys
Rosa canina L. vaisių sėklų aliejinės ištraukos pasižymi odą regeneruojančiomis savybėmis ir yra naudojamos minkštinti ir mažinti randams. Pedro Valerón-Almazán ir kt. (2015) atliko klinikinį tyrimą, kurio metu ištyrė erškėčių sėklų aliejaus veiksmingumą mažinant po operacijų atsiradusius randus. Pastebėta, kad tepant randus aliejumi du kartus per dieną tris mėnesius pakito odos spalva ir išnyko pažeistos odos paraudimas, atrofiniai randai tapo vos matomi [56]. Pastebėtas teigiamas poveikis odai naudojant ne tik aliejų, bet ir pagamintus erškėčių vaisių ekstraktus. Takashi Fujii ir kt. (2011) stebėjo Rosa canina L. vaisių ekstrakto inhibuojamą poveikį melanogenezei naudojant pelių melanomos ląsteles bei odos pigmentacijai tiriant jūrų kiaulytes. Tyrimo metu pastebėtas ryškus inhibuojamasis poveikis melanogenezei bei odos pigmentacijai dėl fermento tirozinazės slopinimo. Šių atliktų studijų rezultatai teigia, kad erškėčių vaisių ekstraktai galėtų pagelbėti balinant odą bei tamsias odos dėmes vartojant per os. [57].
In vivo atlikto tyrimo metu nustatytas Rosa rugosa Thunb. žiedų ekstraktų sukeliamas antihipertenzinis poveikis, tiriant sukeltą hipertenziją žiurkėms bei in vitro nustatant erškėčių žiedų inhibuojamą poveikį angiotenziną I konvertuojančiam fermentui. Žiurkėms duodant 20 g/ kg žiedų ekstrakto 6 dienas sistolinis kraujo spaudimas sumažėja 17,5 mmHg. Įrodyta, kad erškėčių ekstrakto antihipertenzinis poveikis pasireiškia dėl galimybės inhibuoti angiotenziną I konvertuojantį fermentą [58].
In vivo atlikto tyrimo metu nustatytos Rosa canina L. vaisių ekstrakto hepatoprotekcinės savybės dirbant su pelių modeliu, kepenų pažeidimą sukėlus naudojant anglies tetrachloridą. Heibatollah Sadeghi ir kt. (2016) tyrimų metu įrodė, kad Rosa canina L. vaisių ekstraktas (500 mg/ kg ir 750 mg/kg dozėmis) geba sumažinti padidėjusių kepenų fermentų aspartataminotransferazės (AST),
alaninaminotransferazės (ALT), šarminės fosfatazės kiekius, slopina lipidų peroksidaciją, padidina albuminų kiekį kraujo serume [59].
Taip pat tyrinėjamas erškėčių vaisių antimikrobinis aktyvumas. S.O. Oyedemi ir kt. (2016) ištyrė Rosa canina L. metanolinio ekstrakto aktyvumą prieš daugeliui vaistų atsparias Staphylococcus aureus bakterijų padermes. Nors Rosa canina L. vaisių ekstraktas pasižymėjo prastomis ir silpnomis antibakterinėmis savybėmis, tačiau ekstrakto mėginys gebėjo sustiprinti tetraciklino aktyvumą prieš tetraciklinui atsparią bakterijų padermę bei pasižymėjo vidutinėmis plazmidžių konjugaciją inhibuojamosiomis savybėmis [60].
1.6. Erškėčių augalinės žaliavos vartojimas ir dozavimas
Iki šiol nėra jokių naujusių klinikinių tyrimų įrodymų, kuriais galima pagrįsti dozavimo rekomendacijas, todėl pateikiamos vaistinės augalinės žaliavos farmacinės formos ir dozės yra rekomenduojamo pobūdžio.
Švieži žiedai: 3-6 g/ per dieną [61].
Išdžiovinti erškėčių vaisiai: 2,5-3 g susmulkintų erškėčių vaisių užpilti 150- 200 ml karšto vandens, uždengti, po 10-15 min. perkošti. Paros dozė – 10-15 g išdžiovintų ir susmulkintų erškėčių vaisių. Vartojimo trukmė neribojama [26, 29, 62, 63].
Erškėčių sėklų aliejus: gydant randus pastebėtas teigiamas poveikis tepant aliejumi randus 2 kartus / per dieną 3 mėnesius [56].
1.7. Svarbiausių erškėčiuose randamų biologiškai aktyvių junginių apžvalga
1.7.1. Bendra flavonoidų apžvalga
Pastaruoju metu mokslo srityje vis auga susidomėjimas natūralių fenolinių junginių stipriomis antioksidantinėmis teigiamomis savybėmis žmogaus sveikatai ir vieni iš jų yra flavonoidai. Flavonoidai yra išskiriami kaip didžiausia fenolinių junginių grupė, kurių teigiamas poveikis žmogaus sveikatai buvo žinomas prieš juos išskiriant kaip aktyvius junginius. Šiuo metu yra žinoma ir identifikuota daugiau nei 6000 skirtingos cheminės struktūros flavonoidų [64]. Terminas „flavonoidai“ kilo iš lotyniško žodžio „flavus“, kuris reiškia „geltonas“, šie junginiai yra pigmentai ir antriniai augalų metabolitai, kurie atlieka skirtingas medžiagų apykaitos funkcijas augaluose [65]. Flavonoidai yra randami beveik visose augalo ląstelėse, ypač tose ląstelėse, kurios atlieka fotosintezę [66]. Šių junginių gausu augaluose ir daržovėse bei vaisiuose, tačiau galima aptikti ir grūduose, riešutuose, netgi gėrimuose
– kavoje, arbatoje, vyne [66, 67]. Flavonoidų nustatymui vaistinėse augalinėse žaliavose taikomi tokie metodai kaip efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), spektrofotometrija, kapiliarinė elektroforezė [68].
1.7.2. Flavonoidų cheminė struktūra
Flavonoidų pagrindą sudaro benzo – γ pirono žiedas. Biologiškai aktyvūs junginiai turi C6–C3–C6 molekulinę grupę. Flavonoidų cheminė struktūra (1 pav.) yra sudaryta iš 15 anglies atomų,
kurie yra sujungti tarpusavyje į du aromatinius benzolo žiedus (A ir B žiedai), benzolo žiedus sieja heterociklinis pirano žiedas (C). Augaluose flavonoidai gali būti aptinkami aglikonų, metilintų darinių arba glikozidų pavidalu, tačiau dažniau glikozidų pavidalu. Prie aglikono dažniausiai turi prijungtą gliukozę, tačiau gali būti prijungta ir ksilozė, arabinozė, ramnozė, galaktozė [66, 68, 69, 70].
1 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas (A ir B žiedai – benzolo, o C žiedas – pirano)
1.7.3. Flavonoidų klasifikacija
Flavonoidai gali būti klasifikuojami įvairiai, pagal pirano žiedo oksidacijos laipsnį, atsižvelgiant į šoninio radikalo padėtį, heterociklo dydį ar remiantis cukrų molekulių prisijungimo prie aglikono kiekiu ir pobūdžiu.
Viena iš labiausiai paplitusių klasifikacijų remiasi pirano žiedo (C žiedo) oksidacijos laipsniu ir chemine junginių struktūra ir flavonoidus skirsto į šias klases: flavonoliai, flavonai, flavononai, izoflavonai, flavan-3-oliai (katechino tipo), antocianidinai, leukoantocianidinai, auronai, chalkonai, biflavonoidai, neoflavonoidai, izoflavonoidai. Lentelėje (1 lentelė) pateikiamos pagrindinės flavonoidų grupės su grupei būdinga bendrine chemine formule bei atstovų pavyzdžiais [66, 70, 71, 72].
1 lentelė. Flavonoidų grupės, grupėms būdinga struktūros formulė ir atstovų pavyzdžiai [66]
FLAVONOIDAI FLAVONOIDŲ
GRUPĖS PAVADINIMAS
GRUPEI BŪDINGA CHEMINĖ FORMULĖ ATSTOVŲ PAVYZDŽIAI Flavonoliai KVERCETINAS KEMFEROLIS RUTINAS RESVERATROLIS Flavonai LUTEOLINAS APIGENINAS VITEKSINAS
Flavan – 3- oliai KATECHINAS
EPIKATECHINAS Izoflavonai ONONINAS GENISTINAS DAIDZEINAS Flavononai O O 2 3 4 5 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' HESPERIDINAS NARINGINAS NARINGENINAS Antocianidinai CIANIDINAS CIANINAS DELFINIDINAS PELARGONIDINAS
1.7.4. Flavonoidų reikšmė augalams
Flavonoidai yra biologiškai svarbūs junginiai augalams jų augimo bei vystymosi, egzistavimo etapuose. Šie junginiai suteikia augalui skonį ir spalvą, šios savybės padeda privilioti vabzdžius, kad juos apdulkintų. Taip pat flavonoidai turi svarbią reikšmę gynybai, veikia kaip signalinės molekulės ir apsaugo augalus nuo įvairių patogenų bei žolėdžių. Flavonoidų kiekio padidėjimas augalų ląstelėse yra kaip atsakas į stresinius veiksnius tokius kaip UV radiaciją, aukštą arba žemą temperatūrą, sunkiuosius metalus, sausrą. Nustatyta, kad būtent flavonoidai antocianinai atlieka svarbią fotoprotekcinę funkciją ir saugo augalus nuo kenksmingų UV spindulių. Be to, flavonoidai dalyvauja augalo sporoms ir sėkloms bręstant ir dygstant, pasižymi antimikrobinėmis savybėmis [64,73,74, 75].
1.7.5. Flavonoidų poveikis žmogaus organizmui
Flavonoidai yra fenoliniai junginiai, kurie pasižymi ląsteles apsaugančiu poveikiu nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio. Labiausiai ištyrinėtas ir aprašytas yra flavonoidų antioksidacinis poveikis [71]. Stipriausiai antioksidacinėmis savybėmis pasižymi flavan-3-oliai (katechinas, epikatechinas) bei flavonoliai (kemferolis, kvercetinas). Šie biologiškai aktyvūs junginiai gali būti panaudoti su oksidaciniu stresu susijusioms degeneracinėms ligoms gydyti – osteoartritui, diabetui, širdies ir kraujagyslių ligoms, vėžiui bei šių ligų profilaktikai [67,75]. Be to, flavonoidai pasižymi priešuždegiminėmis, trombocitų agregaciją slopinančiomis, antibakterinėmis savybėmis. Flavonoidai taip pat kovoja prieš virusus tokius kaip Herpes simplex, respiracinį sincitinį virusą, paragripo bei adenovirusą. Nustatyta, kad flavonoidas kvercetinas pasižymi tiek antiinfekcinėmis, tiek virusų replikaciją slopinančiomis savybėmis [67]. Tyrimai rodo, kad maistas yra svarbus veiksnys, kuris turi įtakos vėžio atsiradimui. Vaisiai ir daržovės bei įvairūs augalai savo cheminėje sudėtyje turintys flavonoidų pripažinti maistu, kuris padeda išvengti vėžio [72].
1.7.6. Askorbo rūgštis ir jos reikšmė augalams
Vitaminas C yra vandenyje tirpus vitaminas, kuris yra žinomas kitais pavadinimais kaip askorbo rūgštis arba antiskorbutinis vitaminas, kurio aktyvioji forma yra L – askorbo rūgštis [76]. Augalų ląstelių citoplazmose L–askorbo rūgštis yra sintezuojama keletu būdų iš angliavandenių D– gliukozės, D–fruktozės ir MYO–inozitolio ir pasižymi teigiamu poveikiu augalams [77]. Askorbo rūgštis bei su jos metabolizmu susiję fermentai yra atsakingi už ląstelių dalijimąsi augale ir kontroliuoja augalo augimo procesus tam tikrais biologiniais mechanizmais: yra paveikiamas ląstelės sienelės metabolizmas, kontroliuoja daug hidroksiprolino (aminorūgštis įeinanti į baltymų sudėtį) turinčius
baltymus, kurie reikalingi ir svarbūs ląstelių dalijimosi ciklo G1 ir G2 fazėms bei kt. Naujausi tyrimų rezultatai pateikia, kad askorbo rūgšties poveikis augalo augimui galimai yra susijęs su askorbo rūgšties sąveika su fitohormonais [79]. Vitaminas C taip pat yra fermento violaksantino epoksidazės kofaktorius ir dalyvauja violaksantino cikle, kur violaksantinas virsta zeaksantinu ir atvirkščiai, ir apsaugo chloroplastus nuo toksinio stiprios šviesos poveikio. Kaip ir žmogaus organizme, vitaminas C augale pasižymi antioksidaciniu aktyvumu ir saugo augalo ląsteles nuo laisvųjų radikalų neigiamo poveikio, sunkiųjų metalų sukelto streso bei geba regeneruoti α-tokoferolį iš α-tokoferoksilo radikalo [77, 78, 79,80].
1.7.7. Askorbo rūgšties reikšmė žmogaus organizmui
Vitaminas C yra stiprus antioksidantas, kuris dalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose ir apsaugo organizmą nuo laisvųjų radikalų kenksmingo poveikio, redukuodamas žalingas molekules apsaugo vitaminus A ir E nuo oksidacijos. Šis vitaminas yra svarbus kolageno ir kaulinio audinio formavimuisi, dalyvauja angliavandenių, baltymų, nukleino rūgščių, aminorūgščių apykaitoje, aktyvina folio rūgštį bei skatina eritrocitų gamybą. Askorbo rūgštis skatina geležies įsisavinimą organizme, dalyvauja karnitino, kuris reikalingas energijos perdavimui sintezėje. Askorbo rūgštis reikalinga normaliai antinksčių, hipofizės bei lytinių liaukų veiklai. Reguliariai vartojant vitaminą galima sušvelninti peršalimo ir infekcinių ligų simptomus, kadangi askorbo rūgštis sustiprina imuninę sistemą [21,76,81]. Remiantis Lietuvos higienos normos HN 119:2002 „Maisto produktų ženklinimo“ 4 priede pateiktomis normomis, vitamino C rekomenduojama paros norma (RPN) suaugusiems yra 80 mg/ dieną [82].
1.7.8. Karotenoidai ir jų reikšmė žmogaus organizmui
Karotenoidai yra gana nemaža grupė junginių – apie 750, kuriuos sintezuoja augalai, dumbliai ir fotosintetinančios bakterijos. Karotenoidai yra natūralūs pigmentai suteikiantys geltoną, oranžinę, raudoną spalvą daugeliui augalų. Patys svarbiausi karotenoidai yra α – karotenas, β – karotenas, β – kriptoksantinas, liuteinas, zeaksantinas ir likopenas. α – karotenas, β – karotenas, β – kriptoksantinas yra vitamino A provitaminai, kurie kepenyse yra verčiami į retinolį, kuris svarbus odos ląstelių susidarymui bei atsinaujinimui, svarbus regėjimui bei imuninei sistemai [83, 84]. Kadangi karotenoidai yra netirpūs vandenyje, tačiau gerai tirpsta riebaluose, todėl jų absorbcijai organizme reikalingas tam tikras riebalų kiekis. Žmogaus organizme geriausiai absorbuojami tie karotenoidai, kurie yra išgauti iš augalų ir ištirpinti aliejuje [84]. Jau ilgą laikotarpį mokslininkai tyrinėja karotenoidų
poveikį žmogaus organizmui. Tyrimų rezultatai rodo, kad liuteinas ir zeaksantinas pasižymi akis saugančiu ir regą gerinančiu poveikiu, slopina degeneracijos procesus vykstančius geltonojoje dėmėje [85, 86]. Be to, karotenoidai pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, kadangi ląstelėse neutralizuoja laisvuosius radikalus [83].
1.8. Laisvieji radikalai ir jų poveikis žmogaus sveikatai. Oksidacinis stresas
Žmogaus organizme laisvieji radikalai atsiranda kaip šalutiniai produktai vykstant svarbiems apykaitos procesams. Šių radikalų susidarymą taip pat skatina žalingi aplinkos veiksniai kaip rentgeno spinduliai, tabako dūmai, užterštas oras ir vanduo, cheminės medžiagos – nitratai, pesticidai. Laisvieji radikalai gali būti atomai arba molekulės, kurios egzistuoja nepriklausomai, turi savo išorinėje orbitalėje vieną ar kelis nesuporuotus elektronus. Daugelis radikalų yra nestabilūs ir labai reaktyvūs, jie gali atiduoti elektroną arba atvirkščiai – priimti elektroną iš kitų molekulių, todėl jie dalyvauja kaip oksidatorius arba reduktorius. Vieni svarbiausių radikalų, kurie savo struktūroje turi deguonies yra hidroksilo radikalai, superoksido jonai, hipochloro rūgštis, azoto oksido radikalai [87]. Radikalų susiformavimas yra įprastas procesas normaliai funkcionuojančiame organizme, kadangi susidariusios dalelės dalyvauja signalų perdavime, padeda naikinti mikroorganizmus, o lygiųjų raumenų ląstelėse susidaręs azoto oksidas atpalaiduoja kraujagysles ir reguliuoja kraujo spaudimą [88]. Visgi, laisvųjų radikalų perteklinė gamyba ląstelėse, dėl endogeninių ir egzogeninių veiksnių, skatina daugelio ligų atsiradimą. Esant didelėms dalelių koncentracijoms pasireiškia oksidacinis stresas [89].
Oksidacinis stresas – žalingas procesas, kuomet atsiranda disbalansas tarp laisvųjų radikalų susidarymo ir antioksidantų veikimo. Šis procesas gali pakeisti ląstelių membranas bei kitas struktūras kaip baltymai, lipidai, lipoproteinai ir deoksiribonukleino rūgštis (DNR). Oksidacinis stresas yra vienas pagrindinių veiksnių, kuris lemia chroninių ir degeneracinių ligų, tokių kaip osteoartritas atsiradimą, skatina ląstelių senėjimo procesus. Dėl oksidacinio streso gali būti pažeistos DNR ląstelės ir vystytis vėžys. Oksidaciniam stresui paveikus kraujotakos organų ląsteles padidėja rizika susirgti širdies ir kraujotakos ligomis [89, 90,91].
1.9. Antioksidantai ir antioksidantinis aktyvumas
Antioksidantais yra vadinamos tokios medžiagos, kurios saugo nuo žalingo oksidacinių reakcijų poveikio. Šios medžiagos geba surišti laisvuosius radikalus ir stabdyti oksidacijos procesus, inhibuodamos laisvųjų radikalų sukeltas polimerizacijos grandines, taip pat slopina tolimesnes oksidacijos reakcijas. Antioksidantai gali stabdyti laisvųjų radikalų veikimą bei taip pat sumažinti jų susidarymą ląstelėse [92, 93].
Atsižvelgiant į prigimtį antioksidantai gali būti skirstomi:
1. Fermentiniai antioksidantai (pvz.: katalazė, glutationo reduktazė ir glutationo peroksidazė) 2. Nefermentiniai antioksidantai. Šie junginiai nutraukia vykstančias grandinines reakcijas, priima
arba atiduoda elektroną iš radikalo ir tokiu būdu susidaro stabilūs tarpiniai produktai. Nefermentiniai antioksidantai dar gali būti skirstomi:
1. Antioksidantus susijusius su medžiagų apykaita (pvz.: lipoinė rūgštis, gliutationas, L – argininas, kofermentas Q10, melatoninas, transferinas ir kt.)
2. Antioksidantus gaunamus su maistu (pvz.: vitaminas C, vitaminas E, karotenoidai, omega- 3 ir omega- 6 riebalų rūgštys bei metalai, tokie kaip selenas, magnis ar cinkas) [89, 93].
Reikalingiausi ir vertingiausi augaluose aptinkami antioksidantai yra vitaminas C, vitaminas E, karotenoidai, flavonoidai ir polifenoliai. Vitaminas C tiesiogiai sąveikauja su O2- ir –HO (hidroksilo) radikalais, o pats svarbiausias polimerizacijos grandines ardantis antioksidantas yra d-alfa tokoferolis [94].
Dėl savo cheminėje sudėtyje esančių fenolinių junginių, karotenoidų, askorbo rūgšties bei vitamino E ir kitų junginių Rosa canina L. augalo vaisiai pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, kuris ištirtas ir įrodytas in vitro. Ira Taneva ir kt. (2016) įvertino Rosa canina L. vaisių antioksidantinį aktyvumą taikant įvairius cheminius metodus. Nustatyta, kad didžiausiu fenolinių junginių kiekiu ir geriausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo erškėčių vaisių 50% V/V etanoliniai tirpalai [16]. 2010 metais Čilėje atliktame tyrime įvertintas įvairių Čilėje augančių uogų, tarp jų ir erškėčių vaisių antiradikalinis aktyvumas DPPH metodu. Rosa canina L. vaisių ekstraktai pasižymėjo dideliu antoksidantiniu aktyvumu (95,3%), kadangi gebėjo surišti laisvuosius radikalus geriau nei kiti tyrime naudoti vaisiai [95]. Etanoliniai erškėčių vaisių ekstraktai taip pat sėkmingai panaudoti ir kaip natūralūs antioksidantai maltoje jautienoje [96]. Viename iš antiradikalinių tyrimų, kuriame antiradikalinis aktyvumas buvo vertinamas matuojant deguonies radikalų absorbcijos galią (ORAC, angl. oxygen radical absorbance capacity), erškėčių vaisių ekstraktas pasižymėjo panašiomis antioksidantinėmis savybėmis kaip šeivamedžio (Sambucus nigra) uogų ekstraktas, tačiau daug stipresnėmis antioksidantinėmis savybėmis negu kiti 24 tyrime naudoti vaisių ir uogų ekstraktai (pvz.: Aronia melanocarpa, Crataegus mollis, Ribes nigrum) [97].
2. TYRIMO METODIKOS
2.1. Tiriamasis objektas
Tyrimų objektas buvo natūraliai augančių erškėčių vaisiai. Buvo tirta dviejų erškėčių rūšių vaisiai – paprastojo erškėčio (Rosa canina L.) ir miškinio erškėčio (Rosa majalis Herrm.) surinkti mėginiai 2017 metais rugpjūčio ir rugsėjo mėnesiais skirtingose Lietuvos augimvietėse. Duomenys pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Rosa canina L. ir Rosa majalis Herrm. vaisių ėminių rinkimo datos ir vietos Rosa canina L.
Eilės numeris
Rinkimo data Žaliavos rinkimo vieta
1. 2017. 09. 15 Traupis, Anykščių raj. (pamiškė) 2. 2017. 09. 03 Dieveniškės, Šalčininkų raj. sav. (pamiškė) 3. 2017. 08. 19 Dovilai, Klaipėdos raj. (prie upelio) 4. 2017. 08. 16 Linkuva, Pakruojo raj. (miestelio parkas) 5. 2017. 09. 13 Meteliai, Lazdijų raj. (pamiškė) 6. 2017. 09. 05 Vabalninkas, Biržų raj. (pamiškė)
7. 2017. 08. 29 Jurbarko miestas, Tauragės apskritis (žaliava rinkta prie Jurbarko karjero)
Rosa majalis Herrm.
Eilės numeris
Rinkimo data Žaliavos rinkimo vieta
1. 2017. 09. 05 Druskininkai, Alytaus apskritis (miškas) 2. 2017. 09. 11 Būdviečio kaimas, Lazdijų sav. (prie sodybos) 3. 2017. 08. 25 Dembava, Panevėžio raj. sav.(miškas)
4. 2017. 08. 31 Želva, Ukmergės raj. (pamiškė)
5. 2017. 09. 09 Rudaminos kaimas, Vilniaus raj. (pamiškė) 6. 2017. 08. 31 Viešvėnų kaimas., Telšių raj. sav. (prie sodybos) 7. 2017. 09. 02 Kauno miestas, Šiaurės prospektas (prie daugiabučio) 8. 2017. 08. 20 Daugų kaimas, Alytaus raj. sav. (pamiškė) 9. 2017. 08. 28 Visaginas, Utenos apskritis (pamiškė/paežerė)
Vaistinė augalinė žaliava buvo renkama sunokus vaisiams, džiovinta kambario temperatūroje, vėdinamoje patalpoje. Džiovinimo metu vaisiai buvo apsaugoti nuo tiesioginių saulės
spindulių. Išdžiovinti vaisiai buvo sudėti ir laikomi popieriniuose maišeliuose, sausoje bei gerai vėdinamoje vietoje.
Rosa canina L. ir Rosa majalis Herrm. vaisių mėginiai, kurie buvo rinkti 2017 metų
rugpjūčio – rugsėjo mėnesiais iš gamtinių cenopopuliacijų Liškiavoje (Varėnos rajono savivaldybė, Alytaus apskritis) buvo naudojami cheminės sudėties dinamikos tyrimams. Tyrimo metu nustatyta kaip kinta cheminė sudėtis augalo vaisiuose skirtingu jų subrandinimo laikotarpiu – vaisių nokimo pradžioje (žaliavos rinktos 2017.08.07), viduryje (žaliavos rinktos 2017.08.19) bei pabaigoje (žaliavos rinktos 2017.09.18 ).
2.2. Naudotos medžiagos, reagentai ir aparatūra
Medžiagos ir reagentai : rektifikuotas etilo alkoholis 96,3 proc. V/V (AB „Vilniaus degtinė“, Lietuva), rafinuotas saulėgrąžų aliejus („Floriol“, Lenkija), rafinuotas rapsų aliejus („Floriol“, Lenkija), nerafinuotas šaltai spaustas linų sėmenų aliejus („Naturalisimo“, Rusija), vandenilio chlorido rūgštis („Sigma – Aldrich“, Vokietija), aliuminio chloridas („Fluka“, Vokietija), heksametilentetraminas („Sigma – Aldrich“, Anglija), rutinas („Carl Roth GmbH“, 76185, Vokietija), Folin – Ciocalteu reagentas („Sigma – Aldrich“, Šveicarija), natrio karbonatas („Sigma – Aldrich“, Prancūzija), galo rūgštis („Sigma – Aldrich“, Kinija), 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalas („SIAL“, Kanada), DPPH reagentas („Sigma – Aldrich”, Vokietija),
Aparatūra: elektrinis malūnėlis („First“, Austrija), analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija), spektrofotometras („SPECTRONIC CAMSPEC M550“), ultragarsinė vonelė („Elmasonic P“).
2.3. Tyrimo metodai
2.3.1. Etanolinio ekstrakto paruošimas
Išdžiovinti skirtingų rūšių erškėčių vaisiai susmulkinami elektriniu malūnėliu. Gaminami ekstraktai su etanoliu iš kiekvieno vaistinės augalinės žaliavos mėginio santykiu 1:10, todėl atsveriama po 2 g (±0,01) susmulkintos, iki raudonai – oranžinės spalvos augalinės žaliavos miltelių ir užpilama 20 ml (±0,01) 70 proc. V/V etanoliu. Atsargiai pamaišoma stikline lazdele, suplakama. Ekstrahuojama ultragarsinėje vonelėje 20 min užkimštuose rudo stiklo buteliukuose, ekstrakcija vykdoma kambario temperatūroje.
Gauti ekstraktai filtruojami per distiliuotu vandeniu sudrėkintą popierinį filtrą ir išpilstomi į tamsaus rudo stiklo buteliukus, laikomi sandariai uždaryti tamsioje vietoje.
2.3.2. Aliejinio ekstrakto paruošimas
Norint ištirti karotenoidų kiekį vaistinėje augalinėje žaliavoje, gaminami aliejiniai ekstraktai. Aliejiniai ekstraktai gaminami tokiu pat santykiu kaip ir etanoliniai ekstraktai 1:10, kuomet sveriama susmulkinta augalinė žaliava 2 g (±0,01), tačiau vietoj etanolio naudojame saulėgrąžų aliejų 20 ml (±0,01). Ant susmulkintos augalinės žaliavos miltelių užpilama saulėgrąžų aliejaus, atsargiai suplakama ir ekstrahuojama rudo stiklo buteliukuose naudojant ultragarsinę vonelę, ekstrahavimo trukmė – 40 min.
Gauti aliejiniai ekstraktai filtruojami per dvigubą marlės sluoksnį ir išpilstomi į rudo stiklo buteliukus, taip pat sandariai uždaromi ir laikomi tamsioje vietoje.
2.3.3. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje
Vaistinės augalinės žaliavos kokybė buvo įvertinta atliekant nuodžiūvio testą remiantis Europos farmakopėjoje nurodytu straipsniu (Ph. Eur. 2.2.32). Atsisveriamas 1 g (0,001 g tikslumu) susmulkintas augalinės žaliavos mėginys ir džiovinamas 2 val. 100-105°C temperatūroje iki pastovios masės.
Gautas nuodžiūvis (proc.) apskaičiuojamas remiantis formule:
𝐗 =
(𝒎 − 𝒎
𝟏)𝒙 𝟏𝟎𝟎
𝒎
Formulėje:
m – žaliavos masė (g) prieš džiovinimą m1 – žaliavos masė po džiovinimo
2.3.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas veikiant ekstraktą aliuminio chlorido tirpalu parūgštinus vandenilio chlorido rūgštimi. Bendras flavonoidų kiekis yra įvertinamas lyginant gautą tiriamojo tirpalo absorbcijos koeficientą su rutino etanolinio tirpalo absorbcijos koeficientu.
Tiriamasis tirpalas. Į 25 ml matavimo kolbutę įpilama 2 ml anksčiau paruošto erškėčių vaisių etanolinio ekstrakto, pilama 10 ml 96,3 proc. V/V etanolio bei 0,5 ml 30 proc. vandenilio chlorido
rūgšties tirpalo ir 1,5 ml proc. aliuminio chlorido tirpalo. Matavimo kolbutė paliekama stovėti 30 min, praėjus laikui įpilama 2 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir tuomet kolbutėje esantis turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki nurodytos žymės bei sumaišoma. Tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis matuojamas prie 407 nm bangos ilgio.
Palyginamasis tirpalas. Ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 2 ml erškėčių vaisių etanolinio ekstrakto, 10 ml 96 proc. V/V etanolio bei 0,5 ml 30 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo. Kolbutėje esantis turinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki nurodytos žymės.
Palyginamasis rutino tirpalo tiriamasis ir etanolinis tirpalai. Vadovaujantis tomis pačiomis sąlygomis yra ruošiami rutino etanolinis ir tiriamasis tirpalai, tik vietoj 2 ml erškėčių vaisių etanolinio ektrakto, pilama 2 ml etanolinio rutino tirpalo. Etanolinis rutino tirpalas paruošiamas tikslų 0,025 g rutino svėrinį tirpinant 70 proc. V/V etanolyje 25 ml talpos kolbutėje.
Bendras flavonoidų kiekis esantis augalinėje žaliavoje, perskaičiuotas į rutiną ir išreikštas procentais (X), buvo apskaičiuotas pagal šią formulę:
𝑿 =
𝒎
𝒓× 𝑽
𝑽𝑨Ž× 𝑨
𝑽𝑨Ž× 𝟏𝟎𝟎
𝒎
𝑽𝑨Ž× 𝑨
𝒓× 𝟐𝟓
Formulėje :
mr – rutino masė gramais (g), sunaudota etanoliniam rutino tirpalui
VVAŽ –paruošto ekstrakto tūris mililitrais (ml)
AVAŽ – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis
mVAŽ – ekstrakto žaliavos svėrinio masė gramais Ar –rutino tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.
2.3.5. Bendras fenolinių junginių nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis erškėčių vaisių etanoliniuose ekstraktuose nustatytas naudojant spektrofotometrą, Folin – Ciocalteu metodu.
Paruošiamas darbinis Folin – Ciocalteu reagentas praskiedžiant jį distiliuotu vandeniu 10 kartų bei pasigaminamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas (7,5 g natrio karbonato tirpinama distiliuotame vandenyje 100 ml talpos matavimo kolboje).
kuris sumaišomas su 2,0 ml darbiniu Folin – Ciocalteu reagentu bei įpilama 1,6 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Šis gautas mišinys, sumaišomas ir laikoma kambarioje temperatūroje, tamsoje 1 val, o vėliau spektrofotometro pagalba išmatuojama mišinio absorbcija, kai bangos ilgis 765 nm. Palyginamasis tirpalas paruošiamas tokiomis pat sąlygomis, tačiau vietoj 0,4 ml tiriamojo ekstrakto pilama 0,4 ml 70 proc. V/V etanolio.
Galo rūgšties tiriamasis ir palyginamieji tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamojo augalinio ekstrakto tirpalas, tačiau vietoj 0,4 ml tiriamojo ekstrakto imama toks pat kiekis žinomos koncentracijos galo rūgšties tirpalų (paruošti intervale 0,01 – 0,1 mg/ml). Galo rūgšties kalibracinė kreivė sudaroma išmatavus tirpalų absorbciją (pavaizduota 2 pav.).
2 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė
Bendras fenolinių junginių kiekis yra išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui žaliavos ir apskaičiuojamas remiantis šia formule:
GAE = c x V/ m mg/ml Šioje formulėje :
c – galo rūgšties koncentracija mg/ ml , kuri nustatyta iš kalibracinės kreivės ;
V – ekstrakto tūris mililitrais (ml) ;
m – vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g)
y = 12.689x - 0.0027 R² = 0.9944 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 AB S O RB CI J A
2.3.6. Bendro karotenoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras karotenoidų kiekis nustatytas iš jau pasiruoštų erškėčių vaisių aliejinių ekstraktų. Į 100 ml kolbą apie 0,0500 g aliejinio erškėčių ekstrakto užpilama apie 40 ml 96,3 proc. V/V etanolio ir maišoma, kol ištirpsta aliejinis ekstraktas, sunkiai tirpstant pašildoma iki 35-45oC. Kolbos turinys
perkeliamas į 50 ml matavimo kolbą, kurioje skiedžiamas iki nurodytos žymės 96,3 proc. V/V etanoliu. Paruošus tiriamąjį tirpalą, jo absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru esant 450 nm ilgio bangai. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 96,3 proc. V/V etanolis. Bendras karotenoidų kiekis perskaičiuojamas į β – karoteną mg % (X) remiantis šia formule:
𝑿 =𝑨 × 𝟓𝟎 × 𝟏𝟎𝟎 × 𝟏𝟎
𝒂 × 𝟐𝟓𝟎𝟎 =
𝑨 × 𝟓𝟎 𝒂 Formulėje:
A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis
a – aliejinio erškėčių vaisių ekstrakto masė gramais (g)
50 – praskiedimas mililitrais ml
2500 – β – karoteno savitasis absorbcijos dydis
10 – β – karoteno kiekis miligramais (mg) esantis 1 ml 1% tirpalo.
2.3.7. Askorbo rūgšties nustatymas titrimetriniu metodu
Atsveriama 5 g išdžiovintų ir susmulkintų erškėčių vaisių, kurie užpilami kūginėje kolboje 50 ml vandens ir paliekama 10 min stovėti, o vėliau filtruojama į kitą 50 ml kūginę kolbą per distiliuotu vandeniu sudrėkintą popierinį filtrą.
Tiriamasis tirpalas – įpilama 1 ml vandenilio chlorido rūgšties (20 g/l tirpalo), 1 ml gautos erškėčių vaisių ištraukos bei 13 ml vandens. Šis gautas tirpalas titruojamas naudojantis mikrobiurete, kuri pripildyta natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalu. Titruojama kol tirpalas nusidažo blyškia rožine spalva, kuri neišnyksta per 10 sekundžių.
1 ml natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato tirpalo 0,001 M atitinka 0,000088 g askorbo rūgšties.
Askorbo rūgšties kiekis (proc.) apskaičiuojamas remiantis šia formule:
𝑿 =𝑽 × 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟖𝟖 × 𝑽𝟏× 𝟏𝟎𝟎 × 𝟏𝟎𝟎 𝒎 × 𝑽𝟐 × (𝟏𝟎𝟎 − 𝑾) Šioje formulėje:
V – titravimui sunaudotas natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalo kiekis ml ;
V1 – ištraukos tūris ml ;
m – žaliavos masė g ;
V2 – ištraukos sunaudotos titravimui tūris ml ;
W – žaliavos drėgmės kiekis (proc.)
2.3.8. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu
Ekstraktų antiradikalinis aktyvumas vertinamas ekstraktą veikiant DPPH tirpalu. Etaloninis DPPH tirpalas. Etaloninis tirpalas paruoštas sveriant 0,0024 g (0,0001 g tikslumu) DPPH radikalo ir tirpinant 100 ml kolboje 96,3 proc. V/V etanolyje iki nurodytos žymės. Paruošto tirpalo absorbcija buvo matuojama esant 515 nm bangos ilgiui, o palyginamasis tirpalas – atitinkamos koncentracijos etanolis.
Tiriamasis tirpalas. Į 50 μl paruošto erškėčių ekstrakto įpilama 3 ml etaloninio DPPH tirpalo, o palyginamajam tirpalui imama 50 μl 70 proc. V/V etanolio ir 3 ml DPPH tirpalo. Gauti mišiniai palaikomi 30 min visiškoje tamsoje ir tuomet matuojamas šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui.
Bendras antiradikalinis aktyvumas (proc.) apskaičiuojamas remiantis formule:
𝑺𝑨𝑨 =𝑨𝒑𝒂𝒍.− 𝑨𝒕𝒊𝒓.
𝑨𝒑𝒂𝒍. × 𝟏𝟎𝟎
Formulėje:
Atir. – tiriamojo tirpalo absorbcijos reikšmė Apal. – palyginamojo tirpalo absorbcijos reikšmė
2.3.9. Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas „MS Excel 2013“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa. Naudojant šią programą apskaičiuoti tyrimų matematiniai vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, įvertintas statistinis duomenų reikšmingumas bei koreliacinis ryšys taikant Pirsono koreliacijos koeficientą.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas flavonoidams ir karotenoidams
išgauti
Tinkamas ekstrakcijos sąlygų parinkimas yra svarbus norint užtikrinti efektyvią ir kuo didesnę veikliųjų junginių išeigą iš vaistinės augalinės žaliavos ir turi įtakos tolimesnių tyrimų atlikimui. Daugelis veiksnių, pavyzdžiui, tinkamai parinktas tirpiklis, tirpiklio koncentracija, ekstrahavimo laikas, pH, skystųjų ir kietų medžiagų santykis, dalelių dydis bei ekstrakcijos metodas gali turėti reikšmingos įtakos ekstrakcijai iš kietųjų medžiagų [98]. Ekstrakcijos sąlygos flavonoidams buvo optimizuotos parenkant tinkamą tirpiklio poliškumą bei ekstrakcijos trukmę, o karotenoidams parenkant tinkamą tirpiklį ir ekstrakcijos trukmę.
Ekstrakcijai iš vaistinių augalinių žaliavų vykdyti gali būti naudojami tradiciniai ekstrakcijos metodai tokie kaip maceracija, perkoliacija, ekstrakcija Soksleto aparatu ir naujos kartos metodai – ekstrakcija ultragarsu, mikrobangų ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija ir kiti. Atsižvelgiant į ekstrakcijos metodų privalumus ir trūkumus, biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš erškėčių vaisių, buvo pasirinkta vykdyti ekstrakciją ultragarsinėje vonelėje, kadangi tai yra greitas ir lengvai atliekamas procesas, vyksta greita difuzija, galima gauti gana didelę veikliųjų medžiagų išeigą [99].
Optimalaus poliškumo tirpiklio ir jo koncentracijos nustatymas flavonoidų ekstrakcijai. Tirpiklio parinkimas yra vienas iš svarbiausių ekstrahavimo proceso etapų. Metanolis, etanolis arba acetonas ir jų mišiniai su vandeniu iki šiol yra dažniausiai naudojami tirpikliai ekstrahuojant fenolinius junginius iš augalinių žaliavų, tačiau etanolio ir vandens mišiniai yra labiausiai tinkami, kadangi iš visų išvardintųjų tirpiklių pasižymi mažiausiu toksiškumu [100]. Atliekant tinkamo poliškumo tirpiklio bei jo koncentracijos nustatymą buvo pasirinkti skirtingų koncentracijų etanolio ir vandens mišiniai - 30 proc., 50 proc., 70 proc., 96 proc. V/V bei distiliuotas vanduo.Vaistinė augalinė
žaliava sumalta elektriniu malūnėliu. Pagal anksčiau aprašytą metodiką (2.3.1. skyrius) atliekamas
ekstraktų paruošimas ir ekstrahuojama ultragarsinėje vonelėje 20 min. Optimalaus tirpiklio pasirinkimas įvertinamas spektrofotometriškai pagal suminį flavonoidų kiekį. Rezultatai pateikiami 3 paveiksle.
