SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH.) ŽALIAVŲ FITOCHEMINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO VERTINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Vaidotas Žvikas

SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM

ESCULENTUM MOENCH.) ŽALIAVŲ

FITOCHEMINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO

VERTINIMAS

Daktaro disertacija Medicinos ir sveikatos mokslai,

Farmacija (M 003)

Disertacija rengta 2014–2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakultete, Farmakognozijos katedroje.

Mokslinis vadovas

prof. dr. Valdas Jakštas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. dr. Ramunė Morkūnienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).

Nariai:

prof. dr. Loreta Kubilienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003);

dr. Milda Pukalskienė (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, chemijos inžinerija – T 005);

doc. dr. Vilma Kaškonienė (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, chemija – N 003);

prof. dr. Ain Raal (Tartu universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).

Disertacija ginama viešame farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. rugpjūčio 29 d. 10 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto „Santakos“ slėnio Naujausių farmacijos ir sveikatos technologijų centro 202 auditorijoje.

Disertacijos gynimo vietos adresas: Sukilėlių pr. 13, LT-50162, Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

Vaidotas Žvikas

EVALUATION OF COMMON

BUCKWHEAT (FAGOPYRUM

ESCULENTUM MOENCH.) HERBAL

MATERIAL PHYTOCHEMICAL

COMPOSITION

Doctoral Dissertation Medical and Health Sciences,

Pharmacy (M 003)

Dissertation has been prepared at the Department of Pharmacognosy of Faculty of Pharmacy of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences, during the period of 2014–2019.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Valdas Jakštas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).

Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Dr. Ramunė Morkūnienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).

Members:

Prof. Dr. Loreta Kubilienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003);

Dr. Milda Pukalskienė (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – T 005);

Assoc. Prof. Dr. Vilma Kaškonienė (Vytautas Magnus University, Natural Sciences, Chemistry – N 003);

Prof. Dr. Ain Raal (Tartu University, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).

Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy Research Council of Lithuanian University of Health Sciences at 10 a. m. on the 29 th of August, 2019, in the 202 auditorium of „Santaka“ Valley Center for the Advanced Pharmaceutical and Health Technologies of Lithuanian University of Health Sciences.

5

TURINYS

1.1. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas ir apibūdinimas ... 12

1.2. Sėjamųjų grikių fitocheminė sudėtis ... 13

1.3. Sėjamųjų grikių augalinių žaliavų vartojimas medicinoje ir biologinio poveikio tyrimai ... 15

1.4. Antioksidantai. Grikių fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai ... 19

1.5. Augalinių žaliavų ekstraktų paruošimas ir instrumentiniai analizės metodai ... 22

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 25

2.1. Tyrimo objektas... 25

2.2. Medžiagos ir reagentai ... 25

2.3. Tiriamųjų mėginių ekstraktų ruošimas ... 26

2.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika fenolinių junginių nustatymui grikių žolės, lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose ... 26

2.5. Pokolonėlinis fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymas grikių žolės, lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose ... 27

2.6. Hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografijos metodika fagomino ir aminorūgščių nustatymui grikių sėklų mėginiuose ... 28

2.7. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika fagopirinų įvertinimui grikių mėginiuose ... 29

2.8. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika fenolinių junginių analizei grikių sėklų mėginiuose ... 30

2.9. Statistiniai duomenų vertinimo metodai ... 31

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32

3.1. Skysčių chromatografijos metodikų sukūrimas grikių augalinių žaliavų cheminei sudėčiai įvertinti ... 32

3.1.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų vystymas iš grikių augalinių žaliavų ... 32

6

3.1.2. ESC metodikos fenolinių junginių nustatymui grikių augalinėse

žaliavose pritaikymas ir validavimas ... 36

3.1.3. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos įdiegimas grikių sėklų fenolinių junginių cheminei sudėčiai įvertinti ... 39

3.1.4. Fagopirinų įvertinimo grikių augalinėje žaliavoje metodikos kūrimas ir validacijos parametrų įvertinimas ... 43

3.1.5. Hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas fagomino ir aminorūgščių analizei ... 47

3.2. Fenolinių junginių sudėties vertinimas sėjamųjų grikių augalinėse žaliavose ... 49

3.2.1. Fenolinių junginių analizė grikių žolės, lapų, žiedų, stiebų ir sėklų mėginiuose ... 49

3.2.2. Fenolinių junginių kiekybinė analizė ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu grikių sėklų mėginiuose ... 51

3.3. Grikių ėminių antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ... 59

3.4. Fagopirinų analizė grikių augalinėse žaliavose ... 66

3.4.1. Kokybinis fagopirinų vertinimas ... 66

3.4.2. Kiekybinė fagopirinų analizė ... 70

3.5. Hidrofilinių junginių analizė sėjamųjų grikių augalinėse žaliavose ... 72

3.5.1. Fagomino kiekybinės sudėties vertinimas sėjamųjų grikių augalinėse žaliavose ... 72

3.5.2. Aminorūgščių įvairavimo vertinimas sėjamųjų grikių grūdų žaliavose ... 75

3.5.3. Aminorūgščių kiekybinės sudėties panašumų vertinimas hierarchinės klasterinės analizės metodu ... 77

IŠVADOS ... 80

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 81

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 95

PRIEDAI ... 97

SUMMARY ... 129

7

SANTRUMPOS

ABTS azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (angl. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid))

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

ESC-PDA – efektyvioji skysčių chromatografija su fotodiodų matricos detektoriumi

ESC-FLR - efektyvioji skysčių chromatografija su fluorescenciniu detektoriumi

ESC-ABTS – efektyvioji skysčių chromatografija su pokolonėline 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) reakcija

ESI – elektropurkštuvinė jonizacija

APCI – atmosferinio slėgio cheminė jonizacija APPI – atmosferinio slėgio foto jonizacija

UESC – ultra efektyvioji skysčių chromatografija

UESC-MS/MS – ultra efektyvioji skysčių chromatografija su tandeminiu masių spektrometriniu detektoriumi

UESC-FLR-MS/MS – ultra efektyvioji skysčių chromatografija su fluorescenciniu ir tandeminiu masių spektrometriniu detektoriais

MRM – daugybinės reakcijos stebėjimas (angl. Multiple reaction monitoring)

DNR – deoksiribonukleorūgštis

PDA – fotodiodų matricos detektorius (angl. Photodiode array detector) MS/MS – tandeminė masių spektrometrija

HILIC – hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografija TE – trolokso ekvivalentas

AR – aptikimo riba NR – nustatymo riba FLR – fluorescencija

FAOSTAT – maisto ir agrokultūros organizacijos prie jungtinių tautų duomenų bazė

ROS – reaktyvios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species) RNS – reaktyvios azoto formos (angl. Reactive nitrogen species)

8

ĮVADAS

Lietuvoje ir pasaulyje nuolat didėja susidomėjimas gydymasis natūraliais augaliniais preparatais ir ekologiškų produktų vartojimas. Augaliniai prepa-ratai, tiekiami vartotojui turi būti saugūs, efektyvūs ir kokybiški. Biologiškai aktyvūs junginiai, esantys augalinių preparatų sudėtyje, lemia jų kokybę, todėl svarbu nuolatos vertinti žaliavų ir produktų kokybinę sudėtį ir jų kie-kybę. Naujų analitinių metodikų taikymas leidžia atlikti tikslesnius ir jaut-resnius analitinius tyrimus, kuriais įvertinama ir užtikrinama augalinių preparatų kokybė ir saugumas.

Sėjamamieji grikiai priklauso rūgtinių (Polygonaceae) šeimai. [1]. Že-mės ūkyje yra kultivuojamos dvi Fagopyrum Mill. rūšys: sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Meoch) ir totorinis grikis (Fagopyrum tataricum L). Grikių augalinės žaliavos nuo seno vartojamos maistui, pašarams ir tradicinėje medicinoje. Daugelį metų, grikių produkcija ir auginami plotai mažėjo, tačiau paskutiniu metu pastebimas intensyvesnis grikių kultivavi-mas dėl grūdų maistingumo ir naudingumo žmonių sveikatai [2].

Grikių sėklos ir kitos augalo dalys sukaupia daug skirtingų biologiškai aktyvių junginių [3, 4]. Aminorūgščių sudėtis yra subalansuota ir didelės maistinės vertės [5]. Vieni reikšmingiausių biologiškai aktyvių junginių grikių sėklose ir žolėje yra flavonoidai. Rutino, kvercetino, kvercitrino, katechinų ir kitų fenolinių junginių kiekiai ir jų antioksidantinis aktyvumas yra svarbūs grikių žaliavų panaudojimui ir fitopreparatų kokybei užtikrinti [6, 7]. Grikių vaisiai yra skaidulinių medžiagų šaltinis [8].

Biologiškai aktyvių junginių įvairovė gali būti nulemta augalo auginimo sąlygų, žaliavos laikymo ir paruošimo, aplinkos veiksnių ir genetinių fak-torių, todėl svarbu ištirti sėjamųjų grikių veislės ir taikytų auginimo sistemų įtaką šių junginių kaupimosi dėsningumams. Augalinių preparatų gamybai naudojamos skirtingų rūšių, veislių ar vegetatyvinių ir generatyvinių organų žaliavos turi skirtingą biologiškai aktyvių junginių sudėtį ir farmakoterapinį efektą. Nuolat ieškant naujų augalinių žaliavų medicinos praktikai ir ple-čiant augalinių preparatų vartojimo spektrą yra svarbu įvertinti kuo daugiau veiksnių, galinčių turėti įtakos vaistinės augalinės žaliavos kiekybinius ir kokybinius pokyčiams ir galimą poveikį biologinėms sistemoms.

Fenolinių junginių sudėties vertinimai yra svarbūs siekiant įvertinti grikių augalinių žaliavų kokybinius parametrus. Dauguma autorių savo darbuose įvertino grikių sėklų kiekybinę ir kokybinę sudėtį, tačiau mažai dėmesio skirta sėjamųjų grikių lapų, žiedų ir stiebų analizei [9–13]. Lietuvos klima-tinėmis sąlygomis augintų skirtingų grikių veislių analizė nebuvo atlikta, taip pat trūksta duomenų apie intensyvios ir ekologinės žemdirbystės įtaką

9

fenolinių junginių kaupimosi dėsningumams grikių augalinėse žaliavose, todėl yra svarbu atskirai ištirti įvairių veislių mėginius.

Fagopirinų tyrimai yra svarbūs siekiant įvertinti fototoksiškų junginių kiekybinę ir kokybinę sudėtį grikių augalinių žaliavose ir jų ekstraktuose. Svarbu gauti papildomų žinių apie šiuos menkai ištirtus junginius grikių žaliavose. Literatūros šaltiniuose aprašyta tik dalis fagopirinų grupės atstovų [14]. Trūksta duomenų apie ekologinės ir intensyvios auginimo sistemos įtaką sukaupiamam fagopirinų kiekiui, taip pat nėra surinkta pakankamai duomenų apie skirtingų veislių įtaką fagopirinų kiekybinei sudėčiai. Dau-guma autorių įvertino tik suminį fagopirinų kiekį, todėl yra poreikis įvertinti atskirų junginių kiekybinę sudėtį.

Literatūros šaltiniuose nepakanka informacijos apie Lietuvoje auginamų sėjamųjų grikių augalinių žaliavų biologiškai aktyvių junginių kiekius ir jų kaupimosi dėsningumus vegetatyviniuose ir generatyviniuose organuose. Nustačius biologiškai aktyvių junginių įvairavimą tarp augalo dalių, veislių ir auginimo sąlygų galima tikslingai įvertinti augalinės žaliavos pritaikymą fitofarmacinių ir nutraceutinių preparatų kūrimui. Gauti rezultatai apie skirtingų augalo antžeminių dalių fitocheminę sudėtį ir jos įvairavimą, taikant ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygas, leidžia įvertinti įvairių faktorių įtaką parenkant augalines žaliavas kryptingai naujų fitopre-paratų gamybai. Tyrimas buvo atliekamas pagal nacionalinės mokslo prog-ramos „Sveikas ir saugus maistas“ projektą „Grikių veislių ir auginimo sąlygų atranka, technologijos funkcionaliųjų komponentų didinimui kūri-mas“. Projektas vykdytas 2014 – 2015 m. Vykdytas kartu su Lietuvos agra-rinių ir miškų mokslo centru.

Darbo tikslas – ištirti veislės ir auginimo sistemų įtaką fitocheminių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimui sėjamųjų grikių augali-nėje žaliavoje.

Uždaviniai:

1. Išvystyti atrankias ir jautrias analitines metodikas (ESC, UESC-MS/MS) kokybinei ir kiekinei įvairių sėjamųjų grikių augalinių žaliavų ir jų ekstraktų analizei.

2. Nustatyti kokybinę ir kiekinę fenolinių junginių sudėtį įvairiose sėja-mųjų grikių veislėse, augalinėse žaliavose ir įvertinti ekologinės ir intensy-vios auginimo sistemų įtaką jų variacijai.

3. Parinkti tinkamas ESC pokolonėlinės reakcijos sąlygas ir įvertinti gri-kių augalinių žaliavų antioksidantinį aktyvumą.

4. Atlikti kokybinę fagopirinų analizę sėjamųjų grikių augalinėse žalia-vose ir įvertinti jų kiekybinius pokyčius lyginant skirtingas auginimo sąly-gas ir veisles.

10

5. Įvertinti fagomino ir laisvųjų aminorūgščių kaupimosi dėsningumus sėjamųjų grikių sėklų mėginiuose.

Mokslinio darbo naujumas. Atlikta Lietuvos klimato sąlygomis augintų 15 skirtingų veislių sėjamųjų grikių augalinių žaliavų kiekybinės ir kokybi-nės fitochemikokybi-nės sudėties analizė. Įvertinta ekologikokybi-nės ir intensyvios augi-nimo sistemų įtaka biologiškai aktyvių junginių įvairavimui. Įvertinti biolo-giškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumai sėklų, žiedų, lapų, stiebų ir žolės mėginiuose.

Validuota hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografijos metodika hidro-filinių junginių analizei sėjamųjų grikių mėginiuose ir įvertinta fagomino ir aminorūgščių kokybinė ir kiekybinė sudėtis mėginiuose iš skirtingų augalo organų, grikių veislių ir taikytų auginimo sistemų tipų.

Atlikti grikių mėginių antioksidantinio aktyvumo vertinimai pokolonėli-niu ESC - ABTS metodu ir nustatyta, kad labiausiai antioksidantipokolonėli-niu akty-vumu iš tirtų fenolinių junginių pasižymi rutinas ir kvercitrinas.

Atlikus fagopirinų analizę sėjamųjų grikių sėklų, žiedų ir žolės mėgi-niuose nustatyti ir aprašyti nauji identifikuotų fagopirinų homologai, jų oksiduotos formos ir vienas protofagopirinas. Įvertinta žemdirbystės ir veislės įtaka šių junginių kaupimosi dėsningumams. Atlikta fagopirinų kiekybinė analizė UESC-MS/MS metodu ir nustatyta, kad daugiausiai fago-pirinų sukaupiama žieduose.

Praktinė ir teorinė reikšmė. Išvystytos naujos ESC ir UESC-MS/MS metodikos fenolinių rūgščių ir flavonoidų kokybinei ir kiekybinei analizei sėjamųjų grikių augalinėse žaliavose. Flavonoidų ir fenolinių rūgščių tyri-mai aktualūs parenkant perspektyviausias veisles ir jų augalines žaliavas fitofarmacinių ir nutraceutinių preparatų gamybai. Gauti rezultatai suteikia papildomos informacijos apie cheminės sudėties įvairavimą skirtingų augalų organų žaliavose. Ekologinės ir intensyvios žemdirbystės mėginių vertini-mai atskleidė auginimo sąlygų įtaką biologiškai aktyvių junginių įvairavi-mui. Ištyrus 15 skirtingų sėjamųjų grikių veislių nustatyta, kaip fenolinių junginių įvairavimas priklauso nuo augalo veislės.

Aminorūgščių ir fagomino vertinimai suteikia papildomos informacijos apie hidrofilinių junginių kaupimosi dėsningumus skirtingose grikių veislė-se, augintose Lietuvos klimato sąlygomis. Gauti duomenys apie hidrofilinių junginių profilį gali pasitarnauti kryptingai kuriant vaistinius preparatus ir nutraceutikus hidrofilinių junginių pagrindu.

Fagopirinų tyrimai praplėtė teorines žinias apie šiuos mažai tyrinėtus junginius. Fototoksinis fagopirinų poveikis siejamas su šių junginių kieky-bine ir kokykieky-bine sudėtimi augalinėje žaliavoje, todėl sukurta analitinė meto-dika leidžia įvertinti preparatų kokybę ir užtikrinti saugumą.

11

Ištyrus sėjamųjų grikių augalinių žaliavų ekstraktų antiradikalinį akty-vumą ESC – ABTS metodu nustatyti fenoliniai junginiai, kurie pasižymi antioksidantiniu aktyvumu in vitro. Rutinas, kvercitrinas, chlorogeno ir neochlorogeno rūgštys yra tinkami grikių ir jų produktų antioksidantiniam aktyvumui įvertinti. Gauti rezultatai suteikia papildomos informacijos verti-nant augalinių preparatų kokybę ir praplečiant augalinių žaliavų, pasižymin-čių antioksidantiniu poveikiu, spektrą.

Įvertinus įvairių junginių cheminės sudėties skirtumus tarp skirtingų gri-kių veislių, augalinių žaliavų ir jų auginimo sąlygų nustatyta šių faktorių įtaka fitocheminei sudėčiai. Šie rezultatai gali būti taikomi tikslinei fitoche-minių žymenų analizei.

Darbo rezultatų aprobavimas: tyrimų rezultatai pristatyti 7 mokslinėse konferencijose: 8th International Scientific Conference The Vital Nature Sign (2014 m. gegužės 29 d. Kaunas), The 5th

International Conference On Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice dedicated to 145th Anniver-sary of prof. Petras Raudonikis (2014 m. Lapkričio 22 Kaunas), 75th FIP World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences "Better practice – Science based, evidence drive" (2015 m. rugsėjo 29 – spalio 3, Düsseldorf, Vokietija), The 6th International Pharmaceutical Conference "Science and Practice 2015", (2015 m. lapkričio 5 – 6, Kaunas), Internatio-nal scientific-practical conference BaltPharm Forum 2016 main theme: "Complementary and self-care health products: A pharmacist competences and responsibilities" (2016 m. balandžio 15–17, Klaipėda), The 7th Inter-national Pharmaceutical Conference "Science and practice 2016", dedicated to the 240th anniversary of prof. Johann Friedrich Wolfgang (2016 m. spalio 20–21, Kaunas), Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencija [69-oji] – JMTK (2017 m. gegužės 17–19 d., Kaunas).

Tyrimų tematika paskelbtos dvi publikacijos.

Darbo apimtis ir struktūra: disertaciją sudaro įvadas, literatūros apž-valga, tyrimo objektas ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatū-ros sąrašas (138 šaltiniai), disertacijos tema paskelbtų publikacijų sąrašas, mokslinių publikacijų disertacijos tema kopijos, santrauka ir gyvenimo aprašymas. Darbe pateikta 22 lentelės ir 8 paveikslai. Disertacijos apimtis 140 puslapių.

12

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas ir apibūdinimas

Sėjamasis grikis yra vienmetis žolinis 50–70 cm aukščio augalas. Šaknis liemeninė, stiebas stačias, mažai šakotas, plikas, vagotas, rausvas, vaisiams bręstant tampa rausvesnis, žemiau bamblių šiek tiek plaukuotas. Lapai širdiškai trikampiški arba širdiškai strėliški, beveik penkiakampiai, nusmai-lėjusiomis viršūnėmis, su apskritomis arba smailiomis apatinėmis skiautė-mis, mėsingi, pliki (tik gyslos apaugusios plaukeliais). Apatiniai lapeliai – ilgakočiai, o viršutiniai – trumpakočiai [15]. Žiedai dvilyčiai, susitelkę kekėse. Kekės stiebo viršūnėje skėtiškos. Žiedų stiebai ilgi, esantys lapų pažastyse, žiedkočiai beveik vienodo ilgio su apyžiedžiu. Apyžiedis rožinis arba baltas, jo lapeliai kiaušiniški, 3–4 cm ilgio. Kuokeliai 8, išsidėstę dviem ratais, tarpuose tarp kuokelių yra nektarinės liaukutės. Liemenėliai 3 yra tokio pat ilgio, kaip ir tribriaunė mezginė [15]. Vaisius – tribriaunis riešutėlis, į abu galus smailėjantis, smailiomis skiauterėlėmis, rudos spalvos, matinis 6–7 mm ilgio ir 2–2,2 mm pločio [16]. Grikių vaisiai yra tribriauniai riešutėliai [17], tačiau dažniausiai yra priskiriami prie grūdų dėl panašaus pritaikymo ir cheminės sudėties [18]. Grikių (Fagopyrum) gentis priklauso rūgtinių (polygonaceae) šeimai. Tarp daugelio grikių veislių, 9 pasižymi agrikultūrine ir maistine verte [19, 20]. Dvi rūšys yra kultivuojamos: sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) ir totorinis grikis (Fagopyrum tataricum L)

Sėjamasis grikis plačiai paplitęs Azijoje, Europoje ir Šiaurės Amerikoje. Manoma, kad sėjamąjį grikį pirmieji pradėjo auginti centrinės Azijos gyven-tojai [21–23] ir šis produktas buvo labai populiarus XVII–XIX amžiuose. Nuo XX-ojo amžiaus grikių auginimas sumažėjo dėl padidėjusio kviečių kultivavimo [24]. Europą sėjamasis grikis pasiekė 4000 m. pr. m. e [23]. Daugiausiai grikių užauginama Kinijoje, Rusijoje, Ukrainoje ir Kazachstane [3,25]. Grikiai skiriasi nuo kitų grūdinių kultūrų tuo, kad pakankamai gerai auga be dirbtinių trąšų ir pesticidų [25]. Taip pat grikiai absorbuoja mažiau vandens ir maistinių medžiagų iš dirvožemio, nei kitos grūdinės kultūros [3]. Remiantis FAOSTAT duomenimis grikių produkcijos kiekis per kelis pastaruosius dešimtmečius pakito neženkliai nuo 2479 kilotonų 1961 m. iki 1924 kilotonų 2014 m. [2] Lietuvoje grikių produkcija ženkliai padidėjo nuo 1300 tonų 1993 m. iki 53221 tonų 2017 m. pagal oficialius FAOSTAT duomenimis [2]. Pagal deklaruotus grikių pasėlių plotus Lietuvoje grikių auginama vis daugiau. 1999 m. deklaruotas bendras pasėlių plotas buvo

13

16261,2 ha iš kurių daugiausiai buvo auginama Varėnos (2772,8), Šalčinin-kų (2011,6) ir Anykščių (1151,3) rajonuose [26], o 2014 m. bendras dekla-ruotas plotas 48499 ha iš kurių daugiausiai buvo auginama Rokiškio (6909,29), Šalčininkų (5008,33) ir Varėnos (3539,52) rajonuose [26].

1.2. Sėjamųjų grikių fitocheminė sudėtis

Grikių sėklų ėminiuose nustatyti baltymai, polisacharidai, riebalai, skai-dulinės medžiagos, fenoliniai junginiai, mikro- ir makroelementai [27]. Didelę įtaką kaupiamam biologiškai aktyvių junginių kiekiui lemia augalo veislė ir aplinkos sąlygos [28]. Didžioji dalis publikacijų susijusių su grikių fitochemine sudėtimi apžvelgia ir įvertina fenolinių junginių sudėtį.

Sėklose nustatytas krakmolas sudaro daugiau nei pusę (55 proc.) visos žaliavos masės, lipidai 4 proc., tirpūs angliavandeniai (cukrozė ir fagopirito-liai) iki 2 proc., skaidulinės medžiagos – 7 proc. [19]. Baltymų bendras kiekis literatūros duomenimis įvairuoja nuo 12 iki 18,9 proc. sausos masės kiekiui [19, 29, 30]. Daugiau nei pusę visų baltymų sudaro vandenyje tirpūs albuminai ir globulinai, kurie sudaryti iš 12–13 subvienetų, kurių molekuli-nė masė yra nuo 1 iki 66 kDa [19], o pagrindinis saugojimo baltymas - 13S globulinas [3, 31]. Sėjamųjų grikių baltymus sudaro šios aminorūgštys: lizinas, histidinas, argininas, glutamo rūgštis, aspartamo rūgštis, treoninas, serinas, prolinas, glicinas, alaninas, valinas, izoleucinas, leucinas, metioni-nas, tirozimetioni-nas, fenilalaninas ir triptofanas [29, 32]. Baltymų kiekis grikiuose yra reikšmingai didesnis, nei kitose grūdinėse kultūrose [33]. Grikiuose nėra nustatyta glitimo, todėl jų žaliavos yra tinkamos vartoti žmonėms, kenčian-tiems nuo celiakijos.

Atlikti moksliniai tyrimai ir aprašyta grikių ir jų produktų mikroelementų sudėtis [34–38]. Vaisiuose kaupiami šie mirkoelementai: kalis, magnis, fosforas, geležis, kalcis, cinkas, varis, manganas, selenas, baris, boras, jodas ir kobaltas. Nustatyta, kad mineralai yra labiausiai sukoncentruoti išoriniuo-se vaisių sluoksniuoišoriniuo-se [25]. Lyginant, su kitomis grūdinėmis kultūromis, grikių sėklose nustatyta daugiau cinko, vario ir mangano [30]. Šių mikroe-lementų pasisavinimas žmogaus organizme yra ypač geras [39]. Nustatyta, kad 100 g grikių miltų yra nuo 13 iki 89 proc. šių elementų rekomenduoja-mos paros dozės [25].

Grikių miltuose, gautuose iš endospermo, yra 700–750 mg/g krakmolo, 60–100 mg/g baltymų, 20–240 mg/g skaidulinių medžiagų, 10–30 mg/g riebalų, ir 130 mg/g kitų komponentų. Grikių sėklų luobelėje nustatyta 360 mg/g baltymų, 180 mg/g krakmolo, 150 mg/g skaidulinių medžiagų, 100 mg/g riebalų, 60 mg/g tirpių angliavandenių ir 70 mg/g kitų medžiagų. [40–

14

44]. Grikių sėklų sėlenose sukaupiama daug skaidulinių medžiagų, ypač sėlenose su grikių lukštais, kuriuose nustatyta 400 mg/g skaidulų, iš kurių 250 mg/g yra tirpios vandenyje, o sėlenose be luobelių nustatyta iki 160 mg/g skaidulų, iš kurių 75 mg/g buvo tirpios. Sėlenose iš visų sėklų malimo frakcijų buvo nustatyta didžiausi baltymų kiekiai [19, 30].

Riebalų rūgštys ir riebalai grikiuose sudaro nuo 70–140 mg/g sėklų ge-male iki 4–9 mg/g sėklų luobelėje [18]. Pagrindinės riebalų rūgštys gri-kiuose yra: palmitino, oleino, linoleno, stearino ir arachidono [45]. Šios rūgštys sudaro beveik 90 proc. visų identifikuotų riebiųjų rūgščių [45]. Grikiai savo riebiųjų rūgščių sudėtimi yra maistingesni, nei kitos grūdinės kultūros, nes iš 800 mg/g nesočiųjų riebiųjų rūgščių 40 mg/g yra polineso-čiosios [30].

Grikių sėklų ir žolės mėginiuose atvirkštinių fazių chromatografijos metodu nustatyti šie fenoliniai junginiai: rutinas, kemferolio-3-rutinozidas, orientinas, viteksinas, kvercetinas, kvercitrinas, izoorientinas, izoviteksinas, hiperozidas, (-)-epikatechinas, (+)-katechinas, chlorogeno ir neochlorogeno rūgštys, procianidinai C ir B, svertiamakrozidas, 5,7,4 – trimetoksiflavanas, vanilininė rūgštis, p-kumaro rūgštis, ferulo ir trans ferulo rūgštys, salicilinė rūgštis, p-anyžinė rūgštis ir metoksi-cinaminė rūgštis [46–54]. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti grikių masinio žydėjimo metu [55]. Nustatyti antocianinai: cianidino rutinozidas [56], cianidino 3-O-gliukozidas, cianidino 3-O-galaktozidas ir cianidino 3-O-galaktopiranozil-ramnozidas [57]. Nustatyta, kad grikių sėklos sukaupia daugiau rutino ir kitų fenolinių junginių, nei kitos grūdinės kultūros [47]. Fenoliniai junginiai yra glikozidų ir aglikonų formose, nesurišti su baltymais ir pasiskirstę visose sėklos dalyse [58]. Fenolinių junginių identifikavimas efektyviausiai atliekamas taikant kapiliarinę elektroforezę ar atvirkštinių fazių skysčių chromatografiją su didelės raiškos masių spektrometru [51, 53]. Fenolinių junginių sudėtis priklauso nuo grikių veislės ir augimo stadijos. Sėjamųjų grikių žolė gali būti naudinga dėl didelio sukaupiamų flavonoidų kiekio [59]. Sukaupiamų flavonoidų kokybinė sudėtis ir jų kiekybė priklauso nuo fenilalanino, tirozino ir kinetino aktyvumo audiniuose ir azoto kiekio dirvoje [3].

Antriniai metabolitai fagopirinai yra fototoksiški junginiai, savo struktūra artimi jonažolių kaupiamam hipericinui, pirmą kartą buvo išskirti ir aprašyti 1943 m. [60]. Ilgą laiką buvo matoma, kad egzistuoja tik vienas fagopirinas, kol 1995 m. buvo įvardinta ir protofagopirino forma [61]. Tik 2013 m. buvo įvardintas daugiau negu vienas fagopirinas [49], o po metų slovėnų moksli-ninkų atlikti tyrimai naudojant masių spektrometriją ir branduolių magnetini rezonansą suteikė papildomos informacijos apie šių junginių kokybinius skirtumus [14]. Identifikuoti fagopirinai buvo pavadinti A, E ir F, tačiau kiti

15

jų homologai nebuvo charakterizuoti. Fagopirinų ekstrakcijai ir kiekybiniam nustatymui buvo atlikti tyrimai [14, 60, 62–65]. Visi šie tyrimai atlikti su viena fagopirinų frakcija ir atliktas tik suminis fagopirinų kiekio įvertinimas UV spektrofotometriniais, ECS-PDA ar ESC-FLR metodais. Neturint fago-pirinų komercinių standartų visuose tyrimuose kiekybiniam nustatymui naudotas hipericino standartas dėl savo struktūrinių panašumų.

Kita grupė grikių sėklose identifikuotų junginių yra iminocukrūs. Šių junginių struktūroje vietoje anglies atomo cukraus molekulėje yra azoto atomas. Šių junginių populiarumas padidėjo dėl nustatyto biologinio povei-kio (glikozidazės inhibitoriai) [66]. Koyama ir Sakamura pirmą kartą išsky-rė šį junginį iš sėjamųjų grikių sėklų 1971 m. [67], o struktūra buvo nustaty-ta tų pačių tyrėjų iš Japonijos po trejų metų [68]. Papildomai nustaty-taikant jonų mainų ESC-MS nustatyti du struktūriniai analogai: 3-epi-fagominas ir 3,4-di-epi-fagominas [69]. Sėkmingai imocukrų analizei galima pritaikyti ir dujų chromatografiją [70].

Apibendrinant sėjamųjų grikių žaliavų fitocheminės sudėties tyrimų duomenis, galima teigti, kad sėjamųjų grikių žaliavose sukaupiami dideli fenolinių junginių, ypač rutino kiekiai. Duomenys apie fenolinių junginių ir fagopirinų fitocheminės sudėties kiekinės ir kokybinės sudėties įvairavimą yra riboti. Aktualu yra ištirti Lietuvoje auginamų sėjamųjų grikių veislių ir auginimo sistemų įtaką biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningu-mams.

1.3. Sėjamųjų grikių augalinių žaliavų vartojimas medicinoje ir biologinio poveikio tyrimai

Grikių žaliavose kaupiami junginiai, pasižymi biologiniu poveikiu, o sėk-los ir antžeminės augalo dalys nuo seno yra vartojamos tradicinėje medici-noje. Didelė dalis biologinio poveikio priskiriama žaliavų ekstraktams arba vartojamoms žaliavoms ir tik nedidelė dalis tyrimų skirta atskiriems išskir-tiems junginiams. Dauguma atliekamų mokslinių tyrimų vertina grikių vaisių ar daigų poveikį.

Tyrimo naudojant triušius, kuriems buvo taikoma dieta su padidintu rie-balų kiekiu, metu nustatyta, kad vartojant grikių žolės ekstraktą statistiškai reikšmingai sumažėjo malondialdehido kiekis ir laisvųjų radikalų gamyba kepenyse. Grikių žolės ekstraktas pasižymėjo stipresniu poveikiu tiriamie-siems faktoriams, nei rutinas [71]. Pietvakarių Kinijoje atlikto tyrimo metu su Yi etninės populiacijos atstovais nustatyta, kad grikių sėklų vartojimas (100 g/d) buvo siejamas su sumažėjusiu bendru cholesterolio kiekiu, suma-žėjusiu mažo tankio lipoproteinų kiekiu ir padidėjusiu didelio tankio

lipop-16

roteinų santykiu su bendru cholesterolio kiekiu [72]. Baltymų, išskirtų iš grikių miltų poveikis žiurkėms, maitintoms didelį cholesterolio kiekį turin-čiu maistu buvo įvertintas tiriant kraujo plazmoje ir kepenyse esančio cho-lesterolio koncentraciją. Statistiškai reikšmingai mažesnė chocho-lesterolio koncentracija nustatyta tiek kraujo plazmos, tiek kepenų audinio mėginiuose [73]. Grikių baltymų hipocholesteroleminis aktyvumas buvo susietas su žemų jų suvirškinimu ir pasisavinimu [74]. Atliekant tyrimą naudojant žiurkėnus nustatyta, kad grikių baltymų ekstraktas sumažino kraujo plazmos ir kepenų cholesterolio kiekius. Tulžies akmenų susiformavimo nebuvo nustatyta grikių baltymų ekstraktu maitintoje žiurkėnų grupėje. Efektas paaiškinamas tuo, kad grikių baltymai lėtina tulžies akmenų formavimąsi sumažindami laisvo cholesterolio kiekį ir padidindami neutralių ir rūgštinių steroidų pašalinimą iš organizmo [75]. Lin ir kt. tyrimo, atlikto naudonat žiurkėnus, metu didžiausias cholesterolį mažinantis poveikis nustatytas grikių daigų ekstrakto. Teigiamas poveikis buvo nustatytas grupėje, kuri vartojo grikių sėklų ekstraktą [76]. Grikių lapų ir žiedų ekstraktai pasižymė-jo antioksidantiniu poveikiu, sumažino sočiųjų riebalų rūgščių kiekybinę sudėtį ir pablogino riebalais maitintų žiurkių kepenų būklę [77]. Cholestero-lio ir mažo tankio lipoproteinų koncentraciją mažinantis poveikis buvo pastebėtas žmonių grupėje, kuri vartojo grikių miltais praturtintą kvietinę duoną. Šioje grupėje taip pat sumažėjo mažo tankio lipoproteinų santykis su didelio tankio lipoproteinais [78].

Archimowicz ir kt. atliko tyrimą su pacientais, kuriems pasireiškė diabe-tine retinopatija. Nustatyta, kad grikių žolės vartojimas (1 g/d) turėjo tei-giamą įtaką diabetinės retinopatijos simptomų sumažėjimui, gliukozės kiekio kraujyje ir bendro cholesterolio kiekio sumažėjimui. Grupė, kuri vartojo tabletes su grikių žolės ekstraktu po eksperimento pasižymėjo ge-resniais oftalmologiniais ir biocheminiais rodikliais lyginant su grupe, kuri vartojo tik trokserutiną [79].

Klinikinių tyrimų su grikių žolės arbata metu nustatyta, kad pacientų, sergančių chroniniu kojų venų nepakankamumu, buvo sumažėjęs kojų venų diametras ir sumažėjęs jų pralaidumas. Teigiamo poveikio bendram kojų tūriui nebuvo nustatyta, tačiau šis rodiklis padidėjo kontrolinėje grupėje, todėl buvo iškelta prielaida, kad grikių žolės arbata pristabdė edemos pliti-mą ir tolesnį ligos vystypliti-mąsi [80]. Tradicinėje kinų medicinoje grikių vaisiai vartojami gydant chroninį viduriavimą, dizenteriją, odos pažeidimus, padi-dėjusi prakaitavimą ir kraujospūdį [81].

Žiurkėms, kurioms buvo bandomas sukelti krūties vėžys su 7,12-dimetilbenzen antracenu, vėžio plitimas ir formavimasis buvo pristabdytas naudojant grikių baltymų ekstraktą. Šis poveikis siejamas su sumažėjusiu kraujo serumo estradiolio kiekiu [82]. Identiškas tyrimas buvo atliekamas su

17

storosios žarnos vėžiu, kuris buvo sukeltas su 1,2-dimetilhidrazinu. Varto-jant grikių baltymų ekstraktą buvo sumažinta vėžinių ląstelių proliferaciją adenokarcinomos atveju, tačiau nebuvo efektyvus adenomų atveju [83]. Grikių vaisių luobelių ekstraktai pasižymėjo priešvėžiniu poveikiu prieš gimdos kaklelio, odos, skrandžio ir kitas ląstelių linijas in vitro tyrimuose [84]. In vitro tyrimuose su lipopolisacharidu paveiktomis storosios žarnos vėžio ląstelėmis grikių daigų ekstraktas pasižymėjo ryškiu priešuždegiminiu poveikiu [85]. Citotoksinis fenilpropanoidų glikozidų poveikis krūties, storosios žarnos, plaučių ir leukemijos vėžio ląstelių linijoms buvo įvertintas grikių šaknų etanoliniame ekstrakte [86]. Fenoliniai junginiai, išskirti iš grikių grūdų lukštų, pasižymėjo priešvėžiniu aktyvumu prieš krūties vėžio ląsteles. Šis poveikis pasireiškė dėl sukeltos ląstelių apoptozės [87].

Priešalerginis grikių grūdų ekstrakto poveikis buvo įvertintas tyrime su žiurkėmis, kurio metu nustatyta, kad grūdų ekstraktas slopino sukeltą krau-jagyslių pralaidumą, taip pat slopino imunoglobulino E sukeltą anafilaksines reakciją. In vitro tyrimų metu antialerginis poveikis priskirtas grikių grūdų ekstrakto savybėms slopinti histamino sekreciją ir citokinų genų ekspresijos slopinimas jungiamojo audinio ląstelėse [88]. In vitro ir in vivo tyrimuose nustatytas interleukino 4 sekrecijos slopinimas ir imuninio atsako slopini-mas T ląstelėse [89]. Tyrimo autoriai iškelia prielaidą, kad etanolinis grikių sėklų ekstraktas gali sumažinti imuninį atsaką, kylantį dėl alergenų, esančių maisto produktuose, ir sumažinti alerginių reakcijų padarinius.

Grikių sėklų polifenoliai, kurių didžiąją dalį sudarė katechino ir epika-techino oligomerai, buvo tiriami su žiurkėmis, kurioms sukelta pakartotinė smegenų išemija ir ilgalaikė erdvinės atminties pažaida. Teigiamas polifeno-lių poveikis pastebėtas atminties sutrikimų atstatymui ir hipokampo ląstepolifeno-lių pažeidimui. Veikimo mechanizmas susietas su glutamato ir nitrato jonų perteklinės sekrecijos slopinimu [90]. Atminties sutrikimai atkartojant alzheimerio ligos modelį buvo sukelti pelėms į smegenis injekuojant beta amiloido tirpalą. Sėjamųjų ir totorinių grikių metanoliniai ekstraktai pasi-žymėjo teigiamais atminties atstatymo efektais, lipidų oksidacijos slopinimu ir sumažino azoto oksido kiekį, susidariusį dėl beta amiloido injekcijos [91]. Grikių žolės ekstraktas, išvalytas nuo rutino, pasižymėjo vazodilataciniu poveikiu žiurkių aortos žiedų modelyje. Išskirta frakcija padidino išskirto ciklinio guanozinomonofosfato kiekį. Šiuo tyrimu nustatytas teigiamas poveikis kraujagyslių vazodilatacijai, kuriai neturėjo įtakos grikių ekstrakte esantys fenoliniai junginiai [92]. Panašūs duomenys gauti atlikus tyrimą su grikių sudaigintomis ir nesudaigintomis sėklomis. Abiejų tipų sėklų ekstrak-tai reikšmingai sumažino kraujospūdį žiurkėse ir sumažino oksidacinės pažaidos padarinius aortos endotelio ląstelėse [93]. Šis teigiamas poveikis, skirtingai nei prieš tai aprašytame tyrime buvo priskirtas rutinui. Grikių

18

daigais praturtinti makaronai pasižymėjo vazodilataciniu poveikiu, kuris buvo susietas su padidėjusiu bradikinino ir azoto oksido kiekiu, bei sumažė-jusiu vazokonstriktoriaus endotelino-1 kiekiu [94]. Žiurkėms, kurioms dėl didelio druskos kiekio vartojimo buvo sukeltas aukštas kraujospūdis ir inkstų pažeidimai, grikių miltų vartojimas sumažino padidėjusį kraujospūdį, oksidacinio streso pažeidimus inkstuose ir padidino natrio/kalio adenozintri-fosfatazės aktyvumą [95].

Antioksidantinio poveikio įvertinimo metu nustatyta, kad vandeniame grikių sėklų ekstrakte esantys fenoliniai junginiai pasižymėjo didesniu antioksidantiniu aktyvumu po virškinimo. Papildomai nustatytas teigiamas riebiųjų rūgščių oksidacijos slopinimas pelių smegenyse [96]. Antioksidan-tinis ir priešuždegiminis poveikis grikių daigų poveikis susietas su interleu-kino 6 ir auglių nekrozės faktoriaus produkcija lipopolisacharidais pažeisto-se ląstelėpažeisto-se [97]. Su Lactobacillus plantarum fermentuoti grikių daigai (0,01 mg/kg) pasižymėjo stipriu kraujospūdį mažinančiu poveikiu žiurkėms, kurioms buvo sukelta staigi hipertenzija. Fermentuoti grikių daigai pasižy-mėjo tiek vazodilataciniu poveikiu, tiek angiotenziną konvertuojančio mento aktyvumo slopinimu [98]. Grikių daigai, kurie nebuvo paveikti fer-mentacijos, tokiu poveikiu nepasižymėjo. Makaronai, kurių sudėtyje buvo 30 proc. grikių daigų žaliavos, pasižymėjo antigenotoksišku poveikiu prieš DNR pažeidimus žiurkių grupėje, kurioje buvo spontaniškai sukelta hiper-tenzija [99].

Grikių grūdų flavonoidų frakcija pasižymėjo antidiabetiniu ir hipolipi-deminiu poveikiu žiurkėms, kurioms buvo sukeltas antro tipo diabetas [100]. Tyrimo atlikto su žmonėmis, sergančiais antro tipo diabetu, nustatyta, kad virškinamo trakto hormonų aktyvumas buvo žymiai didesnis lyginant su kontroline grupe. Pacientai valgė iš grikių miltų pagamintus sausainius ir jų teigiamas poveikis gliukozės kiekiui kraujyje buvo statistiškai reikšmingai didesnis, nei grupės, kuri valgė sausainius iš ryžių miltų [101]. Šio tyrimo metu nebuvo nustatytas staigus gliukozės kiekio sumažėjimas kraujyje po valgio, todėl Li ir kt. teigia, kad grikių miltų produktai gali būti skirti ilga-laikiam antro tipo debeto gydymui.

Tradicinėje kinų medicinoje grikių vaisiai vartojami gydant chroninį vi-duriavimą, dizenteriją, odos pažeidimus, padidėjusi prakaitavimą ir kraujos-pūdį [81]. Apibendrinant literatūros duomenis galima teigti, kad pastarai-siais metais vis didesnis dėmesys skiriamas maisto produktų, praturtintų grikių augaline žaliava, tyrimams lyginant su anksčiau vykdytais tyrimais su grikių žaliavų ekstraktais. Grikių žaliavos teigiamai veikia kraujagyslių sieneles, pasižymi priešuždegiminiu, antioksidantiniu poveikiu, gali būti pritaikomos diabeto gydyme ar Alzheimerio ligos simptomų slopinime. Dažniausiai, autorių nuomone, teigiamas biologinis efektas pasiekiamas

19

vartojant visą žaliavą ar tam tikrą junginių frakciją, o ne atskirus iš jos išskirtus junginius.

Šiame skyriuje pateiktų tyrimų duomenys rodo, kad sėjamųjų grikių au-galinės žaliavos pasižymi plačiu biologiniu poveikiu ir gali būti potencialiai naudojamos įvairių ligų prevencijai ir gydymui. Atsižvelgiant į tai tikslinga atlikti sėjamųjų grikių augalinių žaliavų fitocheminės sudėties ir antioksi-dantinio poveikio tyrimus. Gauti tyrimų rezultatai galėtų būti naudingi kuriant naujus maisto papildus ar funkcinį maistą sėjamųjų grikių augalinių žaliavų pagrindu.

1.4. Antioksidantai. Grikių fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai

Antioksidantai - medžiagos, kurios gali stabdyti oksidacinius procesus ar apsaugoti nuo oksidacijos jai jautrias medžiagas. Antioksidantai suriša laisvuosius radikalus, neleidžia jiems susiformuoti ir skatina organizmo apsauginius mechanizmus prieš laisvuosius radikalus, taip sumažina oksida-cinį stresą ląstelėse [102]. Oksidacinis stresas yra disbalansas ląstelėje, kurio metu reaktyvių deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formų atsiranda daugiau, nei vidinių ląstelės antioksidantų. Dėl nuolatinio oksidacinio streso ląstelėje pradedamos oksiduoti įvairios medžiagos (lipidai, baltymai ar DNR). Oksi-dacinis stresas daro įtaką senėjimo procesuose, širdies ir kraujagyslių ligų bei vėžio atsiradimui ir vystymuisi [103, 104].

Kondensuoti katechinai ir fenolinės rūgštys (p-hidroksi benzoinė, vanili-no, ir p-kumaro), aptinkami grikių sėklose, pasižymi antioksidantinėmis savybėmis [105]. Rutinas, kvercetinas ir hipericinas yra pagrindiniai antiok-sidantai grikiuose [106]. Grikių luobelių antioksidantinis aktyvumas buvo nuo 2 iki 7 kartų didesnis, nei miežių, kviečių, rugių, kvietrugių ar avižų [47, 107, 108]. Grikių antioksidantinės savybės buvo prilygintos butilintam hidroksianizolui (BHA), butilintam hidroksitoluenui (BHT) ir tretiniam butilhidrochinonui (TBHQ) [4, 109]. Inglet ir kt. studijavo grikių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą. Nustatyta, kad didžiausiu aktyvumu pasižymėjo etanoliniai ekstraktai [110, 111]. Lin ir kt. nustatė, kad kvietinė duona, pra-turtinta grikių miltais pasižymėjo didesniu antioksidantiniu aktyvumu [112]. Panašūs rezultatai gauti ir Sedej ir kt. tyrime, kuriame nustatyta, kad grikių miltai pasižymėjo didesniu antioksidantiniu aktyvumu, nei kviečių [113]. Tyrimuose in vitro fenoliniai junginiai savo antioksidantiniu poveikiu pasi-rodė efektyvesni nei vitaminas C, E ar karotenoidai [102]. Fenoliniai jungi-niai (F-OH) suriša reaktyvias ROS ir RNS formas, inhibuoja enzimus ir sudaro chelatus su metalais, kurie skatina reaktyvių formų susidarymą.

F-20

OH+ R· → RH+ F–O· fenoliniai junginiai lengvai atiduoda vandenilį lais-viesiems radikalams ir sudaro stabilesnius fenolinius radikalus, kurie daug lėčiau dalyvauja grandininėse reakcijose. Taip pat fenoksi radikalai dalyvau-ja terminalinėse reakcijose. F-O·+R·→F-OR [102]. Flavonoidų struktūroje svarbiausi faktoriai, lemiantys antioksidantinį aktyvumą yra: orto – dihiroksi struktūra B žiede, kuri pasižymi geriausiomis elektrono donorinėmis savy-bėmis ir didina radikalo stabilumą, 2–3 dviguba jungtis C žiede su 4 – okso funkcine grupe dalyvauja elektronų delokalizacijoje iš C žiedo, 3 – ir 5 – hidroksi grupės A žiede yra atsakingos už maksimalų radikalų surišimą. 3– glikozilinti flavonoidai yra mažiau aktyvūs antioksidantiniame procese, nei aglikonai [103].

Fenoliniai junginiai su dviguba hidroksi grupe gali konjuguotis su metalų jonais (Cu+ ir Fe2+), kurie jungdamiesi su vandenilio peroksidu suformuoja hidroksilo radikalus.

H2O2 + Cu+/Fe2+ → Cu2+/Fe3+ + OH + OH·

Dėl dviejų skirtingų veikimo mechanizmų ženkliai sumažėja lipidų, bal-tymų ar kitų molekulių oksidacija ląstelėse. Svarbu paminėti, kad didesnis sinergetinis efektas pasiekiamas, kai naudojamas dviejų antioksidantų miši-nys iš kurių vienas yra fenolinis, o kitas - ne [102].

Prooksidantinis aktyvumas. Verta paminėti, kad tam tikromis sąlygo-mis fenoliniai junginiai ir jų radikalai gali elgtis kaip prooksidantai ir patys sukelti ROS ar RNS susidarymą:

F–O· + O2→ F=O + O2·

Metalų jonai taip pat gali paskatinti fenolinių junginių oksidaciją ir lais-vųjų radikalų susidarymą.

Cu2+/Fe3+ + F-OH → Cu+/Fe2+ + F–O· +H+ F-O· + R–H → F–OH + R·

R· + O2 → ROO·

ROO· + RH → ROOH + R·

ROOH + Cu+/Fe2+ → Cu2+/Fe3+ + RO· + OH-

Esant aukštai pH, didelei metalų jonų ir deguonies koncentracijai, gali vykti fenolinių junginių auto oksidacija. Prooksidantiniu poveikiu labiau linkę pasižymėti yra mažos molekulinės masės fenoliniai junginiai (galo rūgštis, kvercetinas), nei didesnės molekulinės masės junginiai (taninai) [102, 103].

Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai yra skirstomi į dvi grupes: vandenilio atomo pernešimo (HAT) ir elektrono pernešimo (ET) [114]. HAT metodai paremti tiesioginiu vandenilio atomo pernešimu ir reaktyvaus radikalo slopinimu. A–H+ R· → A· +R–H. HAT reakcijos yra nepriklausomos nuo tirpiklio ir aplinkos pH, trunka nuo kelių sekundžių iki kelių minučių [114]. ET paremti metodai nustato antioksidanto galimybę

21

pernešti vieną elektroną ir redukuoti metalus ar laisvus radikalus. ET reakci-jos yra priklausomos nuo pH, lėtos ir ilgai trunka, todėl matuojamas procen-tinis produkto pokytis, o ne reakcijos kinetika, kaip HAT atveju [115].

Metodai paremti vandenilio atomo pernešimo reakcijomis. ORAC (oxygen radical absorbance capacity) metodu išmatuojamas antioksidanto gebėjimas slopinti oksidacijos procesus, kuriuos sukėlė peroksido radikalas [116]. Peroksido radikalas reaguoja su fluorescuojančia medžiaga, kurią oksiduoja ir ji virsta nefluorescuojančia. Fluorescencija išmatuojama, nus-tatomas kiekybinis medžiagos pokytis ir reakcijos greitis bei įvertinama antioksidanto galia ir išreiškiama trolokso ekvivalentu [104]. ORAC meto-das leidžia įvertinti tiek lipofilinius, tiek hidrofilinius antioksidantus [102]. Metodas automatizuotas, tačiau analizė pakankamai ilga (apie 1val.), fluo-rescenciniai markeriai yra jautrūs ir jiems nustatyti reikalinga speciali įranga [115]. TRAP (total radical-trapping antioxidant parameter) metodo veikimo mechanizmas yra toks pat kaip ORAC, matuojamas antioksidantų gebėjimas stabdyti reakciją tarp peroksido radikalo ir oksiduojamos medžiagos [104]. Oksiduojamos medžiagos pokytis gali būti nustatomas fluorescencijos arba spektrofotometrijos būdu. Vienas iš didžiausių ORAC metodo privalumų yra tai, kad šis metodas yra selektyvus visiems antioksidantams, kurie stab-do radikalų grandinės augimą. Dažniausiai naustab-dojamas matuoti kraujo plazmos antioksidantams, metodas yra sudėtingas ir ilgai trunkantis [115].

Metodai paremti elektrono pernešimo reakcijomis. FRAP (Ferric Re-ducing Antioxidant Power) metodas pirmiausiai buvo panaudotas kraujo plazmos antioksidantinio aktyvumo vertinimas, vėliau pritaikytas ir antiok-sidantams iš augalų tirti. Reakcijos metu išmatuojama Fe-TPTZ redukcija iš trivalentės formos į dvivalentę iki spalvoto produkto [116]. Reakcijai būtina 3,6 pH terpė, kad būtų išlaikomas geležies tirpumas absorbcija matuojama prie 593nm bangos ilgio [104]. FRAP metodas netinka visiems antioksidan-tams tirti, nes juo negalima nustatyti, kuomet vyksta vandenilio jono perne-šimas, ypač aktualu tiriant tiolius ar baltymus, tačiau lyginant su kitais metodais skirtais bendram antioksidantiniam aktyvumui nustatyti yra pigus, greitas, lengvai atliekamas ir nereikalauja ypatingos įrangos [115]. CUP-RAC (Copper Reduction Assay) metodas paremtas vario-kurpoino redukcija iš dvivalentės formos į vienvalentę, spalvos pakitimas matuojamas ties 490nm bangos ilgiu [104]. Reakcijai nereikia rūgštinės pH. Laisvas ir komplekso sudėtyje varis turi mažesnį redukcijos potencialą, nei geležis, todėl metodas yra selektyvesnis polifenoliniams junginiams, šiuo metodu galima tirti didesnį kiekį antioksidantų, reakcijos laikas trunka nuo 4 iki 60 min. ir labai priklauso nuo pasirinkto antioksidanto, todėl, tiriant antioksi-dantų mišinį, yra sudėtinga parinkti tinkamą reakcijos laiką [115].

22

Metodai paremti vandenilio atomo ir elektrono pernešimo reakcijų mechanizmais. ABTS (2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) yra ABTS·+

radikalo surišimo metodas. Pirmiausiai stabilus ABTS paverčiamas į mėlynai žalią ABTS·+ _{radikalą, kuris reakcijos su}

antioksidan-tais metu paverčiamas į bespalvį ABTS junginį [104, 116]. Yra daug šio metodo modifikacijų, absorbcijos pokytis po reakcijos matuojamas spektro-fotometru ties 415 ar 734nm bangos ilgiais. Matavimai atliekami fiksuotais laiko momentais. Metodas tinkamas hidrofiliniam ir lipofiliniam antioksi-dantam tirti, yra paprastas, platus tinkamo pH spektras [104, 115]. DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) yra stabilaus DPPH· radikalo surišimo metodas. DPPH· skirtingai nei ABTS·+ _{nereikia paruošti prieš tyrimą.}

Rea-guojant radikalui su antioksidantu jis iš violetinės spalvos pereina į bespal-vę, tirpalo absorbcijos pokytis išmatuojamas ties 515 nm šviesos bangos ilgiu [104, 116].

Antioksidantinio aktyvumo nustatymas leidžia įvertinti antioksidantais praturtintos augalinės žaliavos kokybės parametrus. Antioksidantinio akty-vumo vertinimu atliekama visų augalinės žaliavos ekstrakte esančių biolo-giškai aktyvių junginių analizė. Siekiant nustatyti tam tikrų biolobiolo-giškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą reikia atlikti pokolonėlinės reak-cijos tyrimus.

1.5. Augalinių žaliavų ekstraktų paruošimas ir instrumentiniai analizės metodai

Kokybinė ir kiekybinė biologiškai aktyvių junginių iš augalinių žaliavų analizė dažniausiai priklauso nuo žaliavos paruošimo ir tinkamo ekstrakci-jos metodo [117]. Tinkamų ekstrakcijos sąlygų parinkimas yra svarbus

pradinis žingsnis siekiant gauti patikimus rezultatus. Atliekant augalinių žaliavų tyrimus ekstrakcijos įtakai skiriamas mažas dėmesys [118]. Vystan-tis vis naujesnėms analitinėms technologijoms, mėginio paruošimas ir bio-logiškai aktyvių junginių analizės tampa vis paprastesnės [119]. Ekstrakci-jos metodai skirstomi į tradicinius ir netradicinius [120]. Tradiciniams pris-kiriamos maceracija, hidrodistiliacija ir Soksleto ekstrakcija. Netradicinės ekstrakcijos, kuriose naudojamas ultragarsas, mikrobangos, fermentai ar superkritiniai skysčiai yra efektyvesnės, greitesnės ir ekonomiškesnės [120]. Dažniausi faktoriai, lemiantys ekstrakcijos proceso efektyvumą yra: au-galinės žaliavos parametrai, ekstrakcijos tirpiklis, temperatūra, slėgis ir laikas [121]. Vienas žaliavos kokybės parametrų yra žaliavos dalelių dydis: kuo jis mažesnis, tuo didesnis paviršiaus plotas, su kuriuo sąveikauja ekstrakcijos tirpiklis ir tuo greitesnė difuzija. Kitas parametras - drėgmės kiekis: kuo jis didesnis, tuo mažiau hidrofobinių veikliųjų medžiagų

i-23

šekstrahuojama [122, 123]. Literatūros duomenimis dažniausiai fenolinių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų naudojami 50–80 proc. (v/v) etanoliniai ar metanoliniai tirpikliai [124, 125]. Temperatūra – didinat ją, didėja difuzijos greitis, veikliųjų medžiagų tirpumas, tačiau mažėja termola-bilių medžiagų kiekis, nes jos suskyla aukštesnėje temperatūroje, išgaruoja eteriniai aliejai bei koaguliuoja baltymai. Ekstrahavimas vyksta greičiau, jei medžiaga prieš tai buvo užšaldyta, nes ledo kristalai suardo audinių struktū-rą ir ekstrakcijos tirpiklis lengviau prasiskverbia į ląsteles [126]. Maišymas sudaro didesnį koncentracijų skirtumą tarp ląstelės vidaus ir išorės, taip pagreitinama molekulinė difuzija, taip pat greitinama konvekcinė difuzija ekstrahento sraute [122, 123, 126]. Ekstrahavimo laikas – kuo trumpesnis ekstrahavimo laikas, tuo greičiau vyksta difuzija, o ilgėjant ekstrahavimo laikui difuzijos greitis mažėja ir procesas tampa neekonomišku. Ilga fenoli-nių jungifenoli-nių ekstrakcijos trukmė didina jų oksidacijos tikimybę [126].

Didelė biologiškai aktyvių junginių įvairovė nulemia tai, kad kuriamos vis naujos analitinės metodikos. Augalinių žaliavų matricos kompleksišku-mai reikalauja atskirti biologiškai aktyvius junginius nuo priekompleksišku-maišų ar gimi-ningų junginių, kurie gali apsunkinti analizę ir iškreipti rezultatus. Chroma-tografija yra dažniausiai naudojama augalinių žaliavų ekstraktų skirstymo metodika [127]. Plonasluoksnė chromatografija taikoma augalinių žaliavų analizei, tačiau tai nėra pirmo pasirinkimo chromatografinė technika [128]. ESC yra dažniausiai pasirenkamas analitinis metodas skirtas biologiškai aktyviems junginiams identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti augalų žaliavų ekstraktuose [126, 129]. Tinkamai parinktos ESC metodikos leidžia vieno

tyrimo metu analizuoti įvairių grupių junginius, jų darinius bei skilimo produktus. Daugiakomponentėms biologinėms matricoms tirti dažniausiai

naudojamas chromatografinis skirstymas su C18 kolonėlėmis ir aptikimas su diodų matricų, fluorescentiniais ar šviesos išbarstymo detektoriais. Sudė-tingesniems objektams tirti pasirenkami masių spektrometriniai detektoriai [129].

Šiuolaikiniai masių spektrometrai sudaryti iš trijų pagrindinių dalių: jonų šaltinio, masių analizatoriaus ir detektoriaus. Jonų šaltinyje yra sugeneruo-jami analizuojamų medžiagų jonai [130]. Dažniausiai sutinkami šie trys jonizacijos tipai: elektropurkštuvinė jonizacija (ESI), atmosferinio slėgio cheminė jonizacija (APCI) ir atmosferinio slėgio foto jonizacija (APPI) [130]. Jonizacija parenkama pagal tiriamus junginius: ESI yra universaliau-sia ir dažniauuniversaliau-siai naudojama nelakių ir mažiau hidrofilinių junginių analizei [131]. APCI dažniausiai naudojama labiau hidrofobinių junginių tyrimams [130]. APPI yra rečiausiai naudojamas jonizacijos tipas, tačiau yra atlikta nemažai tyrimų kuriuose APPI įvertinta, kaip tinkama specifinių junginių jonų generavimui [132, 133]. Masių analizatoriai atskiria susidariusius jonus

24

pagal jų masės ir krūvio santykį (m/z). Populiariausi analizatoriai yra šie: kvadrupolinis, jonų gaudyklė ir lėkio trukmės analizatorius. Kvadrupoliniai analizatoriai sudaryti iš 4 metalinių strypų, kurie yra veikiami radijo dažniu ir elektros srove, taip sukuriamas elektrinis laukas, kuriame jonai yra atski-riami [131]. Trigubo kvadrupolio analizatoriai gali atlikti pirminių jonų fragmentaciją ir veikti MRM režimu. Taip padidinamas metodo jautrumas ir selektyvumas [134]. Trigubo kvadrupolio analizatoriai dažniausiai naudo-jami kiekybinei biologiškai aktyvių junginių analizei. Jonų gaudyklės veikia panašiu principu, kaip ir kvadrupoliniai analizatoriai, tik papildomai sugeba sukoncentruoti jonus po fragmentacijos ir atlikti papildomas fragmentacijas iki 10 laipsnio [135]. Šie analizatoriai skirti kokybiniam identifikavimui ir metabolitų struktūrai nustatyti. Lėkio trukmės analizatoriai atskiria jungi-nius pagal jonų dydį. Svarbiausi šio analizatoriaus parametrai yra skrydžio kameros ilgis ir reflektorius, kuris prailgina jonų skriejimo kelią ir padidina jų atskyrimą [136]. Šis analizatorius pasižymi dideliu jautrumu ir rezoliucija ir yra skirtas biologiškai aktyvių junginių kokybiniams tyrimams [137]. Detektoriai masių spektrometras fiksuoja jonų sukurtą krūvį ar elektros srovę. Moderniuose instrumentuose signalas dažniausiai sugeneruojamas naudojant mikrokanalinių lėkštelių technologiją. Ji sudaryta iš plonų metali-nių lėkštelių pradurtų mažu diametro vamzdeliais. Elektriniame lauke šie kanalai veikia kaip elektronų daugintuvai, kai į juos atsitrenkia jonai ar fotonai [130]. Po elektronų kaskados išėję elektronai yra matuojami ant anodo ir taip sugeneruojamas signalas. Norint padidinti masių spektrometro jautrumą naudojama ne viena, o dvi ar trys plokštelės sudėtos į V ar Z formą [138].

Apibendrinat šiame skyriuje pateiktą informaciją galima teigti, kad tiek ekstrakcijos procesas, tiek tinkamo analitinio metodo parinkimas yra svar-būs žingsniai norint atlikti kiekybinę ir kokybinę augalinių žaliavų analizę. Pritaikius skirtingas ekstrakcijos sąlygas galima išskirti specifines augalinių žaliavų frakcijas tolimesniems tyrimams. Selektyvaus analitinio metodo parinkimas leidžia užtikrinti, kad kompleksiškos augalinės matricos kompo-nentai turės minimalią įtaką biologiškai aktyvių junginių kiekinės ir kokybi-nės sudėties vertinimui.

25

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

Grikių žaliavų tyrimams pasirinkti 15 skirtingų veislių mėginiai. Dvejos iš šių veislių yra lietuviškos: VB Vokiai ir VB Nojai, dvi lenkiškos: Kora ir Panda, 11 baltarusiškų: Anita Belaruskaja, Smuglianka, Volma, Anika, Kvietka, Čanita, Žaleika, Mara, Žniajarka, Belaruskij determinant – 1 ir Belaruskij determinant – 2. Visos žaliavos buvo surinktos ir užaugintos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo bandymų lauke 2014 metais. Mėginiai paruošti vykdant Nacionalinės mokslo programos „Sveikas ir saugus maistas“ projektą „Grikių veislių ir auginimo sąlygų atranka, technologijos funkcionaliųjų komponentų didinimui kūrimas“. Vykdytojai: LSMU ir LAMMC Vokės filialas. 2014–2015 m. (SVE-02/2014). Taikytos dvi skirtingos auginimo sistemos: ekologinė ir intensyvi. Ekologinėje žemdirbystės sistemoje auginami grikių augalai nebuvo tręšia-mi nei organinėtręšia-mis, nei tręšia-mineralinėtręšia-mis trąšotręšia-mis. Augalų apsaugos priemo-nės taip pat nenaudotos. Intensyvioje žemdirbystės sistemoje buvo taikytas tręšimas mineralinėmis azoto, kalio ir fosforo trąšomis. Grikių žaliavų ėminiai rinkti du kartus. Pirmuoju rinkimu masinio augalų žydėjimo metu surinkta žalioji biomasė (žolė ir atskiros jos dalys: žiedai, lapai ir stiebai) nupjauta 2014 m. liepos 10 d. Sėjamųjų grikių žalioji biomasė išdžiovinta gerai vėdinamoje, sausoje ir apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių patalpoje. Antruoju rinkimu surinktos grikių sėklos, augalai nupjauti rugsėjo 4 d. 2014 m. Po pjovimo augalai dvi savaites džiovinti lauke ir išdžiūvę grūdai iškulti. Išdžiovinta žaliava supakuota į popierinius maišelius ir laiky-ta sausoje, laiky-tamsioje vietoje iki tyrimo pradžios. Nuodžiūvis nuslaiky-tatylaiky-tas su „Mettler Toledo“ (Torontas, Kanada) drėgmėmačiu remiantis Europos farmakopėja (str. 2.2.32.). Tyrimų rezultatai apskaičiuoti absoliučiai sausai augalinei žaliavai.

2.2. Medžiagos ir reagentai

Naudoti reagentai buvo analitinio švarumo ir grynumo. Chromatografinio švarumo eliuentai naudoti ESC tyrimo metu. Taikant masių spektrometrinę analizę naudoti masių spetrometrijai skirti reagentai. Gradientinio ir masių spektrometrinio švarumo acetonitrilas; ledinė acto rūgštis 99,8 proc.; skruzdžių rūgštis MS; trifluoracto rūgštis HPLC įsigyti iš „Sigma–Aldrich GmbH“, Steinheim, Vokietija; etanolis 96,3 proc. (v/v) (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva); Troloksas

((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-26

karboksilo rūgštis) (≥98 proc.), 2,2'-azinobis(3-etillbenzotiazolin-6-sulforūgšties) diamonio druska (ABTS) (≥98 proc.) ir kalio persulfatas (≥99 proc.) įsigyti iš „Fluka Chemie“, Buchs, Šveicarija; ESC grynumo standar-tiniai junginiai: kvercitrinas (≥98 proc.) („ChromaDex“, JAV); chlorogeno rūgštis (≥95 proc.), galo rūgštis (≥95 proc.); apigeninas (≥95 proc.), floreti-nas (≥95 proc.), epikatechifloreti-nas (≥95 proc.), katechifloreti-nas (≥95 proc.), rozmari-no rūgštis (≥95 proc.), apigenirozmari-no-7-gliukozidas (≥95 proc.), viteksinas (≥95 proc.), avikuliarinas (≥95 proc.), kvercetino-3-O-α-L-arabinopiranozidas (≥95 proc.), floridzinas (≥95 proc.), rutino trihidratas (≥95 proc.) ir epika-techino galatas (≥95 proc.) iš „Carl Roth GmbH“, Karlsrujė, Vokietija; homoorientinas (≥95 proc.), orientinas (≥95 proc.), hiperozidas (≥95 proc.), izokvercitrinas (≥95 proc.), izoramnetino-3-O-rutinozidas (≥95 proc.), procianidinas C1 (≥95 proc.) kvercetinas (≥95 proc.), neochlorogeno rūgštis (≥95 proc.), reinuotrinas (≥95 proc.), D-fagominas (≥98 proc.), hipericinas (≥95 proc.) ir aminorūgščių standartų mišinys įsigyti iš „Sigma–Aldrich GmbH“, Steinheim, Vokietija; Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩ*cm-1_{), ruoštas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.}

2.3. Tiriamųjų mėginių ekstraktų ruošimas

Grikių žaliavos susmulkinamos laboratoriniu malūnu iki 125 µm ir ma-žesnių dalelių, pamatuotų naudojant sietus. Tyrimui atsveriama po 0,1 g (tikslus kiekis) žolės, lapų, stiebų ir žiedų, bei po 1 g (tikslus kiekis) sėklų žaliavos. Atsverta žaliava supilama į plastikinius centrifugavimo mėgintuvė-liu, užpilama 10 ml 60 proc. (v/v) etanoliu (80 proc. (v/v) acetonu atliekant fagopirinų analizę), ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje „Elmansonic P“ (Singen, Vokietija) 15 min. palaikant pastovią 45 °C temperatūrą. Gautas ekstraktas centrifuguojamas „Heraeus Biofuge Stratos“ (Langenselbold, Vokietija) centrifuga 10 min. 6000 apsisukimų/min. greičiu. Viršutinis sluoksnis nupilamas, papildomai užpilama 10 ml ekstrakcijos tirpiklio ir kartojama ekstrakcija, gaunamas bendras ekstrakto tūris 20 ml. Ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų membraninius filtrus („Carl Roth Gmbh“, Karlsrujė, Vokietija).

2.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika fenolinių junginių nustatymui grikių žolės, lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose Kiekybinė ir kokybinė fenolinių junginių analizė grikių etanoliniuose ekstraktuose atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu. Naudotas Waters 2695 Alliance (Milfordas, MA, JAV) skysčių

chromatog-27

rafas su diodų matricos detektoriumi Waters 996 (Milfordas, MA, JAV). Skirstymui taikyta „ACE“ („ACT“, Didžioji Britanija) C18 (150 × 4.6 mm, 3 μm) kolonėlė su prieškolonėle. Kolonėlė laikoma termostate, kuriame palaikoma pastovi 25 °C temperatūra. šviesos absorbcijos spektro intervalas 200–600 nm srityje. Metodikos mobili fazė sudaryta eliuento A (2 proc. vandeninis acto rūgšties tirpalas) ir eliuento B (acetonitrilas). Gradientinės eliucijos metu tirpiklio A kiekis kito nuo 100 proc. iki 85 proc. per 30 min, 85 proc. iki 50 proc. per 20 min, 50 proc. iki 0 proc. per 5 min ir nuo 0 proc. iki 100 proc. per 5 min. Bendra gradientinės eliucijos trukmė – 60 min. Eliuento tėkmės greitis – 1 ml/min. Injekcijos tūris – 10 µl. Fenolinių rūgš-čių smailės buvo identifikuojamos diodų matricos detektoriumi ties 324 nm šviesos bangos ilgiu, kvercitrinas ties 349 nm, rutinas ties 354 nm ir kverce-tinas ties 367 nm. Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką ir diodų matricos detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių UV šviesos absorbcijos spektrus. Kiekybinis analičių įvertinimas atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale pagal sudary-tas kalibracijos lygtis.

2.5. Pokolonėlinis fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymas grikių žolės, lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose Pradinis ABTS tirpalas ruoštas 50 ml matavimo kolbutėje 0,05 g (tikslus svoris) ABTS amonio druskos miltelių ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. Ištirpus milteliams, pridedama 0,009 g (tikslus svoris) kalio persulfato. Paruoštas tirpalas 16 valandų laikomas kambario temperatūroje tamsioje vietoje. Darbinis ABTS tirpalas ruoštas praskiedžiant gautą ABTS radikalo-katijono tirpalą išgrynintu vandeniu tiek, kad jo absorbcija, esant 650 nm šviesos bangos ilgiui, būtų 0,9. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Po fenolinių junginių skirstymo ESC metodu judri fazė su išskirstytais junginiais tiesiogiai sumaišoma su siurblio tiekiamu ABTS radikalu-katijonu, kurio tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Reakcija tarp ABTS radikalo-katijono ir atskirtos analitės vyksta reakcijos kilpoje (ilgis 3 m, vidinis skersmuo 0,25 mm, išorinis – 1,58 mm) 50° C temperatūroje. UV-matomos šviesos tipo detektoriumi (Waters 2487), esant 650 nm šviesos bangos ilgiui, registruojamas absorbcijos sumažėjimas kaip neigiama smailė pokolonėlinėje chromatogramoje.

Ekstraktų antiradikalinis aktyvumas apskaičiuojamas pagal trolokso ka-libracinę kreivę ir išreiškiamas trolokso ekvivalentu (TE) μmol/g. TE pas-kaičiuojamas pagal formulę:

28 ) μmol/g ( , .(g) m (l) V a b A TE band band.   

Čia: A – antioksidantiškai aktyvaus junginio smailės plotas antioksidan-tinio aktyvumo chromatogramoje; a – nuolydis (angl. slope) ir b – nuok-rypis (angl. intercept) iš trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties; Vband. – tiriamos augalinės žaliavos ekstrakto bandinio tūris (l); mband. –

tiriamo bandinio atsvertas kiekis (tiksli masė, g).

2.6. Hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografijos metodika fagomino ir aminorūgščių nustatymui grikių sėklų mėginiuose Kiekybinė ir kokybinė hidrofilinių junginių analizė grikių etanoliniuose ekstraktuose atlikta ultra efektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodu. Naudotas Acquity H-class („Waters“, Milfordas, MA, JAV) skys-čių chromatografas su Xevo TQD masių spektrometru („Waters“, Milfordas, MA, JAV). Analičių skirstymui pagal jų hidrofiliškumą pasirinkta taikyti hidrofilinės sąveikų skysčių chromatografinę (HILIC) kolonėlę SeQuant ZIC-HILIC (100Å, 3,5 µm, 150 × 2,1 mm) („Merck”, Kenilvortas, NJ, JAV). Taikomas gradientinės eliucijos metodas. Mobilioji fazė sudaryta iš 50 mM amonio acetato vandeninio tirpalo, kurio pH 4,5 (tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B). Tyrimo pradžioje taikomos izokratinės eliucijos sąlygos: 20 proc. A ir 80 proc. eliuentų. Nuo 5 min. iki 6 min. įvedamas gradientinis tirpiklio A pokytis iki 35 proc. 6–10 min. iki 50 proc. A. 10–11 min. išlaikomos izokratinės sąlygos. 11–11,2 min gradientinis eliuento atstatymas iki pradinių sąlygų. Bendra gradientinės eliucijos trukmė – 15 min. Eliuento tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Kolonėlė laikoma termostate, kuriame palaikoma pastovi 40°C temperatūra. Injekcijos tūris – 1 µl. Masių spektrometro nustatymai: teigiama elektropurkštuvinė jonizacija, kapiliaro įtampa – 3200 V, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento išgarinimo temperatūra – 600 °C, eliuento išgarinimo dujų tėkmės greitis – 1000 L/val. Kūgio įtampa ir ardymo kameros energija parenkama individuali kiekvie-nam junginiui (2.6.1 lentelė). Fagomino ir aminorūgščių smailės identifi-kuotos pagal etaloninio junginio sulaikymo laiką ir masių spektrometriniu detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių masių spektrus. Kiekybi-nis analičių įvertinimas atliktas remiantis analitės smailės ploto priklauso-mybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale pagal sudarytas kalib-racijos lygtis.

29

2.6.1 lentelė Masių spektrometro parametrai hidrofilinių junginių analizei.

Junginys MRM perėjimas Kūgio įtampa, V Ardymo kameros energija, eV Fagominas 148 > 86 24 14 Glicinas 76 > 30 12 6 L-Alaninas 90 > 44 16 10 D-Serinas 106 > 60 14 8 L-Prolinas 116 > 70 20 10 Valinas 118 > 72 12 10 L-Treoninas 120 > 74 38 20 Leucinas 132 > 86 16 10 Aspartamo r. 134 > 88 14 10 L-Lizinas 147 > 84 14 14 Metioninas 150 > 104 14 10 Fenilalaninas 166 > 120 18 14 L-Argininas 175 > 70 16 14 L-Tirozinas 182 > 136 16 16 Izoleucinas 132 > 86 16 10 Glutamo r. 148 > 84 12 14

2.7. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika fagopirinų įvertinimui grikių mėginiuose

Kiekybinė fagopirinų analizė grikių žolės ir žiedų acetoniniuose ekstrak-tuose atlikta atvirkštinių fazių ultra efektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodu. Naudotas Acquity H-class („Waters“, Milfordas, MA, JAV) skysčių chromatografas su Xevo TQD masių spektrometru („Waters“, Milfordas, MA, JAV) ir Acquity FLR fluorescenciniu detektoriumi („Waters“, Milfordas, MA, JAV). Chromatografiniam skirstymui taikyta YMC Triart C18 (100 Å, 1,9 µm 100 × 2,0 mm) („YMC“, Kiotas, Japonija) kolonėlė su prieškolonėle. Kolonėlė laikoma termostate, kuriame palaikoma pastovi 40°C temperatūra. Metodikos mobili fazė sudaryta eliuento A (0,1 proc. vandeninis trifluoracto rūgšties tirpalas) ir eliuento B (acetonitrilas). Gradientinės eliucijos metu tirpiklio A kiekis kito nuo 60 proc. iki 40 proc. per 5 min, 5–5,1 min. 30 proc. A, nuo 5,1 iki 11,1 min. 25 proc. A, 11,5 min. 0 proc. A, 11,6 min. – 60 proc. A. Bendra gradientinės eliucijos trukmė – 14 min. Eliuento tėkmės greitis – 0,7 ml/min. Injekcijos tūris – 1 µl. Fluorescencinio detektoriaus parametrai: sužadinimo šviesos bangos ilgis – 330 nm, emisijos šviesos bangos ilgis – 590 nm, duomenų surinkimo dažnis – 10 taškų per sekundę. Masių spektrometro parametrai: teigiama elektro-purkštuvinė jonizacija, kapiliaro įtampa – 3900 V, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento išgarinimo temperatūra – 500 °C, eliuento išgarinimo