KIETAFAZĖS EKSTRAKCIJOS METODO TAIKYMAS SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH) FENOLINIŲ RŪGŠČIŲ FRAKCINEI ANALIZEI

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AGNĖ ŽILYTĖ

KIETAFAZĖS EKSTRAKCIJOS METODO TAIKYMAS

SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH)

FENOLINIŲ RŪGŠČIŲ FRAKCINEI ANALIZEI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof., dr. Valdas Jakštas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Data_________________

KIETAFAZĖS EKSTRAKCIJOS METODO TAIKYMAS SĖJAMŲJŲ

GRIKIŲ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH) FENOLINIŲ

RŪGŠČIŲ FRAKCINEI ANALIZEI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Valdas Jakštas

Data_______________

Recenzentas Darbą atliko:

Vardas, pavardė, parašas Magistrantė

Agnė Žilytė

Data_______________ Data_________________

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Grikio (Fagopyrum Mill) genties charakteristika, sistematikos ypatumai, augalų paplitimas ir panaudojimas medicinoje ... 10

1.1.1 Fagopyrum Mill genties apibūdinimas ... 10

1.1.2 Sėjamųjų grikių (Fagorpyrum esculentum Moench) paplitimas ir auginimas ... 11

1.1.3 Augalinė žaliava, jos paruošimas ir laikymas ... 12

1.1.4 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) biologiškai aktyvios medžiagos ... 12

1.1.5 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) panaudojimas ... 13

1.1.6 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) preparatai liaudies medicinoje ... 15

1.1.7 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) preparatų farmakologinės savybės ... 15

1.2. Fenolinių junginių charakteristika, cheminės savybės ir panaudojimas medicinoje ... 17

1.2.1 Fenoliniai junginiai, jų klasifikacija ... 17

1.2.2 Fenolinės rūgštys, jų panaudojimas medicinoje ... 19

1.2.3 Fenolinių junginių ekstrakcijos metodai... 20

1.2.4 Fenolinių junginių įvertinimas – kiekybinis ir kokybinis nustatymas ... 21

1.3 Kietafazė ekstrakcija ... 22 1.3.1. Sorbentai ... 22 1.3.2 Tirpikliai ... 23 2. TYRIMO METODIKA ... 25 2.1. Tyrimo objektas ... 25 2.2. Reagentai ... 25 2.3. Aparatūra ir priemonės ... 25

2.4. Nuodžiūvio nustatymas augalinėje žaliavoje ... 26

2.5. Ekstrakcijos proceso optimizavimas taikant ultragarsinės ekstrakcijos metodą ... 26

2.6. Sėjamųjų grikių ekstraktų paruošimas kokybiniui ir kiekybiniui įvertinimui ... 26

2.7. Suminio hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu .... 27

2.9. Gautų duomenų statistinis vertinimas ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

3.1. Nuodžiūvio įvertinimas ... 30

3.2. Fenolinių junginių ekstrakcijos optimizavimas taikant ultragarsinės ekstrakcijos metodą ... 31

3.2.1. Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos nustatymas ... 31

3.2.2. Temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui ... 32

3.2.3. Ekstrakcijos trukmės įtaka ekstrahavimo procesui ... 34

3.3. Kokybinis fenolinių rūgščių nustatymas grikių vaisių žaliavoje ... 35

3.4. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas sėjamųjų grikių vaisių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 36

3.5. Bendro fenolinių junginių kiekio palyginimas skirtingose žemdirbystės sistemose sėjamųjų grikių vaisiuose ... 37

3.6. Fenolinių junginių kiekio įvairavimo palyginimas grikių vaisių mėginiuose skirtingose žemdirbystės sistemose ... 38

3.7. Grikių žolės mėginių frakcinė analizė po kietafazės ekstrakcijos ... 39

3.8. Grikių vaisių mėginių frakcinė analizė po kietafazės ekstrakcijos ... 44

4. IŠVADOS ... 48

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49

SANTRAUKA

A.Žilytės magistro baigiamasis darbas „Kietafazės ekstrakcijos metodo taikymas sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) fenolinių rūgščių frakcinei analizei“. Mokslinis vadovas prof., dr. Valdas Jakštas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas, 2017.

Tyrimo objektas: Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) žolė ir vaisiai. Tyrimo metu

atliekamas fenolinių rūgščių nustatymas ir įvertinimas.

Tyrimo tikslas: Išanalizuoti sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) vaisiuose ir žolėje

esančių fenolinių rūgščių kokybinę ir kiekybinę frakcijų sudėtį.

Tyrimo metodai: Ekstrakcijos proceso optimizavimas atliekamas įvertinant skirtingų tirpiklio etanolio

koncentracijų, ekstrakcijos ultragarsu trukmės, temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui. Fenolinių rūgščių kokybinis ir kiekybinis nustatymas frakcionuojant, kietafazės ekstrakcijos metodu. Bendro fenolinių junginių kiekio ir fenolinių rūgščių įvertinimas naudojant ESC-MS.

Rezultatai: Optimizavus bendro fenolinių kiekio ekstrakcijos procesą nustatyta, kad didžiausias

fenolinių junginių kiekis išekstrahuotas naudojant 70 proc. (v/v) etanolio tirpalą, 45°C temperatūroje ir veikiant ultragarsu 15 min. Atlikus grikių vaisių mėginių kokybinę analizę, buvo identifikuotos 7 rūgštys: vanilino, galo, chinino, neochlorogeno, chlorogeno ir ferulo rūgštys. Atlikus kiekybinę analizę, gauti rezultatai palyginti tarp skirtingų sėjamųjų grikių veislių ir skirtingais laikotarpiais. 2014 metais ekologinės žemdirbystės sistemoje daugiausiai fenolinių junginių sukaupė grikių veislė „Kvietka“, o 2015 metais – „Žaleika“. Mažiausiai fenolinių junginių 2014 ir 2015 metais sukaupė veislė „Smuglianka“. Palyginus sėjamųjų grikių vaisių kaupiamų fenolinių junginių kiekį skirtingose žemdirbystės sistemose, nustatyta, kad didesni kiekiai sukaupiami grikius auginant intensyvios žemdirbystės sąlygomis (p<0,05). Pritaikyta kietafazės ekstrakcijos metodika, atlikta kokybinė bei kiekybinė skirtingų grikių vaisių ir žolės veislių kaupiamų fenolinių rūgščių frakcinė analizė. Šiuo metodu buvo identifikuotos šios fenolinės rūgštys: chlorogeno, neochlorogeno, ferulo, chinino, galo, vanilino, dihidroksibenzoinė rūgštys. Visuose grikių veislių mėginiuose daugiausiai rasta chlorogeno ir neochlorogeno rūgščių.

SUMMARY

A.Žilytė master‘s thesis „Solid phase extraction method in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) phenolic acids fractional analysis“. Scientific manager prof. Dr. Valdas Jakštas. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy – Kaunas, 2017.

The object of the research: buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) grass and fruits. Carring out

phenolic acids analysis.

The aim: to analyze buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) fruit and grass phenolic acids in the

qualitative and quantitative composition of the fractionation method.

Methods: Extraction process optimization is carred out by evaluating different solvent ethanol

concentrations, extraction by ultrasound duration andtemperature influence of extraction process. Phenolic acids qualitative and quantitative determination of fractionation, by solid phase extraction.

Results: Optimizing the total phenolic content of the extraction process provides the maximum

amount of phenolic compounds was extracted with 70 percent (v/v) ethanol solution at 45 ° C temperature and ultrasound exposure for 15 minutes. In buckwheat fruit samples qualitative analysis have been identified seven acids: vanillic, gallic, quinine, neochlorogenic, chlorogenic, ferulic and rosemary acids. Resultsof quantitative analysis compared among different buckwheat varieties and in different periods. In 2014 ecological agricultural system, mainly phenolic compounds accumulated buckwheat variety „Kvietka“ and in 2015 – „Žaleika“. At least phenolic compounds in 2014 and in 2015 accumulated „Smuglianka“. Compared phenolic compounds ofbuckwheat fruit in different agricultural systems, it was found that higher amounts of phenolic compound was found in intensive agricultureal system (p <0.05). To conduct a qualitative and quantitative different buckwheat varieties of fruit and herbs phenolic acids fractional analysis, using solid phase extraction method. In this method was identified these phenolic acids: chlorogenic, neochlorogenic, ferulic, quinine, vanillic, dihydroxybenzoic acids. All samples of buckwheat varieties mainly found neochlorogenic and chlorogenic acid.

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

HGB – hemoglobinas

IR – infraraudonieji spinduliai

ESC-MS – efektyvioji skysčių chromatografija – masių spektrofotometrija KFE – kietafazė ekstrakcija

MS – masių spektrometrija CD – cukrinis diabetas AH – arterinė hipertenzija

DTL – didelio tankio lipoproteinai TFA – trifluoracto rūgštis

ĮVADAS

Vaistiniai augalai jau nuo seniausių laikų yra laikomi viena iš pagrindinių priemonių gydant ligas. Per pastaruosiuos dešimtmečius susidomėjimas gydančiais augalais yra itin padidėjęs. Beveik 50% vaistų, kuriuos mes vartojame šiandien, gauti iš vaistinių augalų, kitaip vadinamų fitopreparatais. Pasak pasaulio sveikatos organizacijos (PSO), 80% pasaulio gyventojų remiasi būtent tradicinių vaistinių augalų teikiama nauda [1]. Vaistiniai augalai savyje kaupia dešimtis skirtingų junginių, kurie žmogaus organizme tampa aktyvūs ir geba teigiamai veikti atsiradus įvairiems negalavimams.

Sėjamasis grikis – rūgtinių (Polygonaceae) šeimai priskiriamas augalas. Jis kilęs iš pietryčių Azijos, o kilmė siekia net 4000 iki 5000 metų pr. Kr. [2]. Šiais laikais tai itin kultivuojamas augalas, konkuruojantis su javais ir kviečiais, tačiau grikiai turi žymiai daugiau maistinės vertės. Lietuvoje grikiai buvo pradėti auginti XVIII amžiuje. Grikių derlingumas, 2007 – 2009 m. duomenimis, Lietuvoje buvo 0,67-0,96 t ha-1.

Sėjamieji grikiai, žinomi kaip dietinis maisto produktas, plačiai pradėti naudoti kaip vaistinis augalas. Nors jo nauda žinoma jau seniai, tačiau plačiau pradėtas tyrinėti tik pastarąjį dešimtmetį. Sėjamieji grikiai kaupia daug vitaminų, mineralų, baltymų, skaidulų. Fenoliniai junginiai – itin svarbi grikių sudedamoji dalis, kurių nauda iki šiol domina mokslininkus. Jie pasižymi naudingomis savybėmis žmogaus organizmo sveikatai – antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, priešvirusinėmis, antidiabetinėmis savybėmis [3].

Šias teorines žinias būtina įvertinti ir analizuoti praktiškai. Būtent todėl, šio darbo objektas – fenolinės rūgštys, jų nauda organizmui. Norint įvertinti fenolines rūgštis, reikia atlikti kokybinius ir kiekybinius tyrimus. Metodika šiame darbe pasirinkta kietafazės ekstrakcija, nes šios metodikos tyrimų trūksta kitų mokslininkų darbuose. Norima sužinoti, ar efektyvus šis metodas fenolinių rūgščių gavybai grikių žaliavoje.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: išanalizuoti sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) vaisiuose ir žolėje esančių

fenolinių rūgščių kokybinę ir kiekybinę sudėtį frakcionuojant, kietafazės ekstrakcijos metodu.

Tyrimo objektai: kietafazės ekstracijos sąlygos, sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench)

vaisių ir žolės ekstraktai, fenolinės rūgštys.

Uždaviniai:

1. Optimizuoti ekstrakcijos ultragarsu sąlygas, vertinant skirtingų tirpiklio etanolio koncentracijas, ekstrakcijos ultragarsu trukmės, temperatūros įtaką bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti;

2. Atlikti sėjamųjų grikių vaisių mėginių kokybinę analizę;

3. Palyginti sėjamųjų grikių vaisių kaupiamų fenolinių junginių kiekį skirtingose žemdirbystės sistemose;

4. Parinkti chromatografinės ir spektrofotometrinės analizės sąlygas, atlikti kokybinį ir kiekybinį fenolinių rūgščių įvertinimą frakcionuojant, kietafazės ekstrakcijos metodu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Grikio (Fagopyrum Mill) genties charakteristika, sistematikos

ypatumai, augalų paplitimas ir panaudojimas medicinoje

1.1.1 Fagopyrum Mill genties apibūdinimas

Grikio (Fagopyrum Mill) genties augalai yra priskiriami rūgtinių (Polygonaceae) šeimai. Mokslinis pavadinimas Polygonum yra kilęs iš graikų kalbos polygonos, o tai reiškia daugiakampis, kuris apibūdina vaisių formą. Fagopyrum yra sudarytas iš lotyniškų žodžių „fagus “ (bukas) ir „pyros“ (kviečiai) [4]. Grikio gentį sudaro 19 skirtingų grikių rūšių, kurios skirstomos į dvi grupes: vienmečiai ir daugiamečiai.

1 pav. Sėjamasis grikis [5,6]

Fagopyrum esculentum Moench morfologiniai požymiai.

Sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum Moench) – vienmetis šakotas augalas,

cm ilgio, smailėja į viršūnę. Viršutiniai lapai be lapkočių, mažesni. Žiedynai yra viršūniniai ir sudėtiniai, išsišakojimas tankus, skydelinis arba šluotelinis. Žiedai yra baltos arba rausvos spalvos, 6 mm skersmens; žiedkotis yra 2-3 mm ilgio, ryškus; apyžiedis – 3 mm ilgio. 8 nektarinės yra geltonos, pakaitomis su kuokeliais, purka turi galvutę. Sėklos yra tribriaunės formos, smailiu kampu, ilgesnės nei 5 mm, rudos arba juodai – rudos spalvos. Grikių sėklų formos ir dydžiai gali labai skirtis, priklauso nuo augimo vietos, dirvožemio, aplinkos sąlygų. Ši grikių rūšis yra labiausiai paplitusi ir plačiai auginama šiauriniame pusrutulyje, šiek tiek pietiniame pusrutulyje [7].

1.1.2 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas ir

auginimas

Grikiai yra viena iš seniausių sukultūrintų augalų, kilusių iš pietryčių Azijos. Šių augalų kilmė siekia apie 4000 iki 5000 metų pr. Kr. Pietų Kinijoje [8]. Sėjamuosius grikius pirmieji pradėjo auginti rytų Azijos stepių gyventojai [9]. Visgi šiais laikais grikiai daugiausiai kultivuojami augalai Rusijoje, Kinijoje, Indijoje, Japonijoje. 2011 metais pasaulyje buvo sukultivuota 1,787,547 tonų grikių sėklų [10].

Lietuvoje grikiai buvo pradėti auginti XVIII amžiuje. Grikių derlingumas, 2007-2009 m. duomenimis, Lietuvoje buvo 0,67 – 0,96 t ha-1. LAMMC Vokės filiale nustatyta, kad derlius ten siekė 2,3-2,8 t ha-1. Visgi augimo procesą limituoja prastas grikių derlingumas [11]. Lietuvoje auginama sausuose smėlio dirvožemiuose, laukuose. Kartais kaip piktžolė pasitaiko pelkėse, dykvietėse, ant geležinkelio pylimų. Grikius auginti tinka atviros, saulėtos vietos ir lengvesnės dirvos. Auga rūgščiuose priesmėliuose, nusausintuose durpynuose, nelabai laidžiose žemėse. Nemėgsta kalkingų, drėgnų dirvų. Vegetacijos pradžioje ir žydėjimo metu grikiams reikia šilumos. Sėjama po šalnų – birželio mėnesį, sudygsta per 10 – 13 dienų, žydi 4 – 6 savaites [12].

Yra žinoma ne viena grikių veislė. Be šiame tyrime tirtos Fagopyrum esculentum Moench grikių veislės, mokslininkų grupė (Matsuoka, Ohnishi) ištyrė ir suklasifikavo kitas veisles: F. Esculentum ssp. Ancestralis, F. Homotropicum, F. Tataricum, F. Tataricum ssp. Potanini, F. Cymosum, F. Lineare, F. Leptopodum, F. Urophyllum, F. Callianthum, F. Pleioramosum, F. Gracilipes, F. Capillatum. Tyrimo tikslas – sudaryti naujos kartos grikių genties filogeninį medį. Tai išsprendė daugelį problemų, kurios kilo iš senosios kartos grikių morfologijos, sudarytos mokslininko Steward [13].

1.1.3 Augalinė žaliava, jos paruošimas ir laikymas

Grikių žaliavai dažniausiai naudojama grikių žolė (Fagopyri herba L.). Žaliava ruošiama žydėjimo metu birželio – rugpjūčio mėnesiais. Nupjautos 35 – 40 cm žydinčios augalų viršūnės džiovinamos pavėsyje gerai vėdinamoje patalpoje arba džiovyklėje esant 35 – 40 °C temperatūrai. Išdžiovinta žaliava vartojimui tinkama 2 metus, jei yra laikoma sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje [14].

1.1.4 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) biologiškai aktyvios

medžiagos

Sėjamieji grikiai plačiai vartojami medicinoje dėl kaupiamų biologiškai aktyvių medžiagų gausos. Sėjamųjų grikių cheminė sudėtis skirtingose augalo dalyse (žolėje, lapuose, žieduose, stiebuose, vaisiuose) yra skirtinga [15].

Grikių vaisiai yra labiausiai bei dažniausiai tyrinėjama ir vartojama sėjamųjų grikių dalis. Jie kaupia daug baltymų, riebalų, skaidulų, sacharidų, vitaminų bei mineralų. Grikių vaisiuose nėra glitimo – tai ypač svarbu celiakija sergantiems žmonėms [16]. Grikių vaisiuose daugiausia randama krakmolo, ląstelienos, baltymų: histidino, lizino, asparto rūgšties, treonino, serino, tirozino, glutamo rūgšties, prolino, glicino, arginino, alanino, cistino, metionino, izoleucino, valino, leucino. Nemažą dalį sudaro riebalai, iš kurių naudingos riebalų rūgštys: oleino, linolio, palmitino, stearino, arachidino. Randama ir B grupės vitaminų– B1, B2, B3, B5, B6, mineralinių medžiagų, vitamino E [17].

Kalbant apie kitas sėjamųjų grikių augalo dalis, pasiremta kitų mokslininkų rezultatais [18].

1 lentelė. Vidutinis krakmolo, riebalų, baltymų kiekis skirtingose sėjamųjų grikių augalo dalyse (vidurkis +/-standartinis nuokrypis proc.)

Kaupiamų medžiagų kiekis, %

Sėjamųjų grikių dalys Krakmolas Riebalai Baltymai

Sėklos 69.5 ± 0.00 3.4 ± 0.03 13.1 ± 0.04

Lapai 6.0 ± 0.00 3.1 ± 0.01 22.7 ± 0.26

Stiebas 1.1 ± 0.00 2.6 ± 0.01 6.5 ± 0.03

1 lentelėje esantys duomenys rodo, jog krakmolo kiekis didžiausias vaisiuose (69,5%). Visuose vaisiuose, sėklose, ne tik grikių, krakmolas užima didžiausią kiekį. Taip yra todėl, kad sėkloms reikalinga energija dygimui. Krakmolo nerasta žieduose, dėl mažo žaliavos svorio. Mažiausiai krakmolo rasta stiebuose (1,1%), šiek tiek daugiau lapuose (6,0%).

Riebalai taip pat būtini augalui augimo energijai gauti. Jų daugiausiai rasta grikių žieduose (5,7%). Mažiausiai riebalų rasta stiebuose (2,6%). Šiek tiek daugiau jų yra lapuose (3,1%) ir vaisiuose (3,4%).

Baltymų visose sėjamųjų grikių augalo dalyse rastas didžiausias kiekis. Lapuose jų rasta 22,7%, šiek tiek mažiau žieduose (19,1%), sėklose (13,1%). Mažiausiai baltymų rasta stiebe (6,5%).

Daroma išvada, kad mažiausiai šių medžiagų kaupia sėjamųjų grikių stiebai, (3,4%), o daugiausiai vaisiai (28,7%) [18].

Grikių žieduose daugiausia randama rutino (83,6 proc.). Rutino taip pat daug grikių lapuose (69,9 proc.). Mažiausiai rutino randama stiebuose (0,5 proc.), vos daugiau vaisių luobelėse, vaisiuose (0,1 proc). Rutino kiekis jaunuose lapuose yra didesnis lyginant su senesniais lapais [18]. Taip pat grikių lapuose randama tokių flavonoidų kaip hiperozido, chlorogeno, neochlorogeno, kavos, galo rūgšties [19].

Atliekant tyrimus įvairiais vegetacijos laikotarpiais, tiriant skirtingas veisles, siekiama išsiaiškinti biologiškai aktyvių junginių kaupimo ypatumus. Reikia atkreipti dėmesį, kad cheminę sudėtį skirtingose augalo dalyse, itin lemia augimo sąlygos, veislės, žaliavos rinkimo laikotarpis. Todėl reikia atlikti išsamesnius tyrimus pasiremiant šiomis svarbiomis sąlygomis.

1.1.5 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) panaudojimas

Grikiai pasaulinėje sveikų maisto produktų rinkoje vertinami kaip dietinis produktas. Palyginti su javais, kurių derlingumas didesnis, grikių auginama mažai. Visgi padidėjęs susidomėjimas grikiais prasidėjęs neseniai, auginimo plotai kasmet didėja, plečiasi, kuriasi naujos grikių žemdirbystės sistemos [20].

Naujausiais duomenimis, 2012 metais grikių gamyba priartėjo prie 6 milijonų tonų per metus ribos (2 pav.) 2014 metais jau gerokai viršytas šis skaičius. 2014 metų duomenimis didžiausios grikių gamybos šalys ir regionai – Rusija (661764.00 tonos), Kinija (564900.00 t), Ukraina (167440.00 t), Prancūzija (111300.00 t), Lenkija (83499.00 t). Baltijos šalių 2014 metų bendras grikių gamybos

kiekis buvo apie 45000.00 tonų. Didžiausias iš jų buvo – Lietuvos (35600.00 t), mažiausias – Estijos (600.00 t) [21].

2 pav. Grikių gamybos kiekiai pasaulyje 2014 metais (tonomis) [21]

Grikiai vartojami kaip žmonių maistas arba naudojami gyvulių pašarui. Taip pat tai grikių medaus šaltinis, jie vartojami kaip daržovės, naudojami kaip trąšos pasėliams, trukdančios augti piktžolėms. Grikių vartojimas skirtingose šalyse labai skiriasi. Japonijoje tai makaronai „soba“, Europoje ir Š. Amerikoje grikiai naudojami kaip ir kviečiai, miltų pavidalu, įvairių miltinių patiekalų ruošimui – blynams, sausainiams, pyragams, makaronams ir kt. Rusijoje, Lenkijoje dažniausiai grikių kruopos ir miltai yra sriubų, košių pagrindas. Švedijoje grikiai valgomi su žuvimi, o Pietryčių Azijoje grikių miltai naudojami kepti tradicinei duonai „chapattis“. Grikiai taip pat naudojami ruošti alkoholinius gėrimus, Kinijoje – žaliava actui gaminti. Grikiai dažnai pristatomi kaip įdomi rūšis dėl didelio kiekio baltymų vaisiuose [22].

Daugelyje šalių grikiai buvo naudojami kaip nektaras medaus gamybai. Grikių nektaras ypatingas tuo, kad medus gaunamas jau sezono pabaigoje, kai kitų rūšių nektaro šaltiniai visai menki arba jų nebėra. Grynas grikių medus yra tamsios spalvos ir intensyvaus, specifinio kvapo, kuris patinka ne kiekvienam [22]. Grikių medus žinomas dėl savo subalansuotos sudėties ir gydomųjų savybių. Šis bičių nektaras renkamas iš grikių liepos ir rugpjūčio mėnesiais. Įrodytas stiprus antioksidacinis ir priešuždegiminis poveikis [23].

Grikiai, naudojami ne tik kaip maisto medžiagų šaltinis, bet jau nuo senų laikų vartojami ir kaip vaistinis augalas. Todėl pradėti tyrimai, kuriais norima įrodyti farmakologinį ir fiziologinį poveikį organizmui vartojant biologiškai aktyvius junginius, esančius grikių žaliavoje.

1.1.6 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) preparatai liaudies

medicinoje

Nuo senų laikų žinoma, jog grikių ruošiniai plečia kraujagysles, skatina šlapimo išsiskyrimą, veikia raminamai. Šio gydomojo nuoviro rekomenduojama gydymo kurso trukmė 4-6 savaitės, geriamos 2-3 stiklinės per dieną. Verdamos grikių kruopų košės ar arbatos, manoma, padeda sergant mažakraujyste dėl juose esančio geležies kiekio. Taip pat grikių miltai didina HGB kiekį kraujyje, patariama porą šaukštų grikių miltų užgerti stikline vandens. Gaminamos tinktūros esant aukštam kraujo spaudimui ar nerviniams sutrikimams. Jos patariama vartoti po 15-20 lašų į 0,3 stiklinės vandens 1-2 kartus per dieną. Grikių miltų netgi siūloma dėti ant nudegimų – malšina skausmą. Grikių arbata pasižymi atsikosėjimą lengvinančiomis savybėmis – geriama sergant bronchitu. Nesudžiovintų grikių lapų kompresus patariama dėti ant žaizdų (tinka pūliuojančios) ir vočių. Manoma, kad lapai žaizdas gydo dėl juose esančių fitoncidų, kurie naikina pūlines bakterijas. Gerai persijotų grikių miltus siūloma naudoti kaip kūdikių pudrą, minkštinančius kompresus. Šiuo metu populiarios grikių lukštų pagalvės, tačiau manoma, jog jos buvo naudojamos dar senovės Rytų Azijos šalyse. „Sobagara“ – japoniškai vadinami grikių lukštai. Tai populiarėja ir Vakarų Europoje bei Amerikoje. Šių pagalvių naudą gamintojai aprašo itin plačiai: prisitaiko prie kiekvieno žmogaus galvos formos individualiai, itin pralaidžios orui, taip palengvėja migreniniai skausmai, nesukelia alergijų, nes nesikaupia dulkių erkutės.

Nors šie liaudies patarimai labai patrauklūs, teigiantys, kad grikių ruošiniai gydo ne vieną ligą ar sutrikimą, rekomenduojama remtis tik mokslininkų atliktais rezultatų duomenimis. Būtina atsižvelgti į kelis ar daugiau atliktus tyrimus, esamas ligas bei grikių preparatų kontraindikacijas.

1.1.7 Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) preparatų

farmakologinės savybės

Didelis dėmesys skirtas sėjamųjų grikių farmakologiniam poveikiui širdies ir kraujagyslių sistemai. 2011 metais atliktas tyrimas su eksperimentiniais gyvūnais, žiurkėmis, turėjusioms spontaninę hipertenziją. Joms buvo duodama sudygusių ir nesudygusių grikių ekstraktų, 5 savaites

kiekvieną dieną. Per eksperimento laikotarpį, kraujo spaudimas žiurkėms nesumažėjo, tačiau 4 savaitės po gydymo, ryškiai sumažėjo sistolinis kraujo spaudimas, kai ekstraktų dozė buvo padvigubinta. Sudygusių grikių ekstraktas turėjo ryškiai didesnį antihipertenzinį efektą, lyginant su nesudygusių grikių ekstraktu. Taip pat šis ekstraktas apsaugojo aortos endotelines ląsteles nuo oksidacinės pažaidos [24].

Tos pačios studijos įrodė teigiamą grikių poveikį mažinant kūno svorį ir lipidų koncentraciją kraujyje. Žiurkės buvo suskirstytos į 3 grupes: kontrolinę, didelio svorio ir didelio svorio su sėjamųjų grikių lapų ir žiedų miltelių mišinio gydymu. Šis mišinys buvo duodamas 12 savaičių, po kurio žymiai sumažėjo bendro cholesterolio, trigliceridų kiekis [24].

Remiantis Pietų Korėjos mokslininkų tyrimu, fenoliniai junginiai, esantys sėjamuosiuose grikiuose, veikia priešuždegimiškai. Tiriamasis objektas – grikių daigų ekstraktas. Nustatyta, kad grikių daigai turėjo stiprų antioksidacinį aktyvumą ir slopino pro-uždegiminių mediatorių gamybą. Taigi, grikiai gali būti naudingi slopinant uždegimines ligas sukeliančius laisvuosius radikalus ir uždegiminius mediatorius [25].

Nustatyta grikių ekstrakto nauda esant padidėjusiam didelio tankio lipoproteinų kiekiui. 70%, 100-200 mg/kg etanolinis sudygusių grikių sėklų ekstraktas buvo duodas 30 pelių patinėlių, kurie turėjo padidintą lipidų kiekį kraujyje. Išvada – sumažėjęs DTL kiekis kraujo serume [26].

Grikių etanolinis ekstraktas su rutinu ir kvercetinu padeda gydyti CD. Ekstraktai – grikių etanolinis ektraktas (100 μg/ml, 50 mg/kg ), kvercetinas (6 μg/ml;3mg/kg) ir rutinas (23 μg/ml; 11·5 mg/kg). Jie buvo duodami šešioms grupėms po 12 pelių. Po atliktų tyrimų (gliukozės toleravimo, kraujo mėginių ėmimo) gauti rezultatai – sumažėjęs gliukozės kiekis kraujyje ir pakeltas insulino išsiskyrimas, vartojant fruktozę [27].

Kito tyrimo rezultatas – sumažėjusi aortos endotelio oksidacinė pažaida, mažinant nitrotirozino imunoreaktyvumą. Tyrime dalyvavo 60 AH turinčios žiurkės. Jos padalintos į tris grupes: vienai duodama vandens, kitai sudygusių ir nesudygusių grikių sėklų ekstrakto 300–600 mg/kg, trečiai – kaptoprilis. Šie rezultatai parodė, kad sudygusių grikių sėklų ekstraktas turi antihipertenzinį poveikį ir gali apsaugoti arterijų endotelio ląsteles nuo oksidacinio streso [28].

Teigiami rezultatai gauti norint įrodyti grikių ruošinių naudą mažinant vazokontrikciją, didinant vazodilataciją, taip pat didinant antioksidantų kiekį [29]. Slovėnijos mokslininkai 2013 metais atliko tyrimą, kuriame ištirtas grikių metanolinių ekstraktų antigenotoksinis poveikis [30].

1.2 . Fenolinių junginių charakteristika, cheminės savybės ir panaudojimas

medicinoje

1.2.1 Fenoliniai junginiai, jų klasifikacija

Tai vienos plačiausiai žinomos fitocheminės medžiagos, kurios turi didelę reikšmę augalų fiziologijai ir morfologijai. Šie junginiai atlieka svarbų vaidmenį augalų augime ir reprodukcijoje, suteikia apsaugą nuo patogenų, aplinkos veiksnių, prisideda formuojant augalų spalvas bei juslines savybes [31]. Fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami remiantis jų kilme, biologinėmis savybėmis, chemine struktūra. Jie yra natūralūs antriniai metabolitai. Antriniai metabolitai nuo pirmųjų metabolitų (nukleorūgštys, aminorūgštys, cukrūs ir kt.) skiriasi savo chemine struktūra ir nėra svarbūs augalų gyvybinėms funkcijoms palaikyti. Struktūriškai fenolių junginiai susideda iš aromatinio žiedo, turi vieną ar kelis hidroksilo pakaitus ir skirstomi nuo paprastų fenolinių molekulių iki polimerinių junginių [32].

2 lentelė. Fenolinių junginių klasifikacija remiantis jų struktūra [31]

Struktūra Klasė

C6 Paprastieji fenoliai, benzochinonai

C6-C1 Hidroksibenzoinės rūgštys

C6-C2 Acetofenonai, fenilacto rūgštys

C6-C3 Hidroksicinamono rūgštys, fenilpropanoidai

C6-C4 Naftochinonai C6-C1-C6 Ksantonai C6-C2-C6 Stilbenai, antrachinonai C6-C3-C6 Flavonoidai, izoflavonoidai (C6-C3)2 Lignanai, neolignanai (C6-C3-C6)2 Biflavonoidai (C6-C3)n Ligninai (C6-C3-C6)n Kondensuoti flavonoidai

Fenoliniai junginiai atlieka reikšmingas fiziologines funkcijas: antialerginis, priešuždegiminis, antimikrobinis, antioksidacinis, antitrombozinis, kardiovaskulinę sistemą saugantis ir kraujagysles plečiantis poveikis [31].

Itin reikšmingas fenolinių junginių poveikis buvo nustatytas Indijos mokslinininkų 2007-aisiais metais. Nustatytas apsauginis poveikis rutino, polifenolinių flavonoidų prieš haloperidolio sukeltas burnos ir veido diskinezijas, susijusias su elgesio, biocheminiais ir neurocheminiais pokyčiais. Iš pradžių žiurkių patinėlių šešioms grupėms buvo duodamas haloperidolis, vėliau 25–100 mg/kg rutino. Po gydymo rutinu sumažėjo haloperidolio sukeltas nevalingas kramtymo judesys, nevalingas liežuvio iškišimas, veido trūkčiojimai [32].

Antioksidacinis poveikis – svarbi fenolinių junginių savybė. Buvo tirtas rutino antioksidacinis poveikis. Natūralūs antioksidantai padeda neutralizuoti laisvuosius radikalus, kurie sukelia įvairias DNR mutacijas, tuo pačiu sukeldami sveikatos negalavimus. Rutinas efektyviai mažina lipidų peroksidaciją [33].

Kita fenolinių junginių savybė – priešuždegiminis poveikis. Buvo tiriami šeši pelių patinėliai (6-7 savaičių, 18-20 g.), kurie susargdinti sepsiu. Pasirinktas modelis, kurio rezultatai labai vertingi tolimesniems tyrimams. Pagal šį modelį sepsis kyla iš polimikrobinės infekcijos per pilvo ertmę, iš kurios bakterijos pereina į kraują, taip itin sustiprėja sisteminis uždegiminis veikimas. Šio modelio reikalavimas – tyrimui atlikti reikalingas nuoseklumas, norint gauti atkuriamus rezultatus.

Rutinas skatina priešuždegiminį atsaką į žmogaus endotelines ląsteles, užtikrina kraujagyslių apsaugą, gydymas juo mažina uždegimo citokinų atsipalaidavimą. Kaip ir ankstesni tyrimai, taip ir šis, įrodė, kad rutinas gali būti naudojamas kaip terapinė priemonė, gydant kraujagyslių uždegimines ligas [34].

Kinijos mokslininkai išsiaiškino dar vieną fenolinių junginių savybę – slopina angiotenzino II sukeltos kardiomiopatinės hipertrofijos poveikį. Tyrime buvo viena kontrolinė grupė ir trys rutino, skirtingų koncentracijų (0,8 mg/L, 4,0 mg/L, 8,0 mg/L), grupės. Tokio tipo eksperimentai leidžia tirti vaistus širdies hipertrofijos prevencijai ir gydymui. Išvada – sėjamuosiuose grikiuose esantis rutinas mažina angiotenzino II sukeltos žiurkių naujagimių kardiomiopatinės hipertrofijos poveikį [35].

1.2.2

Fenolinės rūgštys, jų panaudojimas medicinoje

Fenolinės rūgštys susideda iš dviejų grupių, t.y. hidroksibenzoinės ir hidroksicinamono rūgščių (3 pav.). Hidroksibenzoinės rūgštys yra galo, p-hidroksibenzoinė, protokatechino, vanilino, siringo rūgštys, kurios turi bendrąją C6-C1 struktūrą. Hidroksicinamono rūgštys yra aromatiniai junginiai, kurie turi tris anglies atomus šoninėje grandinėje (C6-C3), su kavos rūgšties, ferulo, p-kumarino ir sinapine rūgštimis [36]. Fenolinės rūgštys randamos tirpiuose junginiuose, prisijungiant cukrus ar organines rūgštis. Taip pat gali būti aptinkamos kaip vandenyje tirpūs taninai ar ligninai. Sėjamuosiuose grikiuose dažniausiai randamos šios fenolinės rūgštys – p-hidroksibenzoinė, galo, protokatechinorūgštis, vanilino bei siringo rūgštis.

3 pav. Hidrobenzoinių (a) ir hidroksicinamono (b) rūgščių pavyzdžiai [36]

Fenolinės rūgštys pasižymi ne tik antioksidaciniu veikimu, bet ir kitokio pobūdžio biologiniu aktyvumu. Kofeino rūgštis ir kai kurie jos esteriai gali turėti priešvėžinį aktyvumą gaubtinės žarnos kancerogenezėje [37]. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog kofeino rūgštis selektyviai blokuoja leukotrienų biosintezę, kurie dalyvauja imunoreguliaciniuose sutrikimuose, alerginėse reakcijose, astmos procesuose [38]. Įrodyta, kad kofeino rūgšties dariniai taip pat turi stiprų slopinantį poveikį prieš pirmo tipo žmogaus imunodeficito viruso (HIV-1) integrazę. Šis fermentas katalizuoja viruso DNR integraciją į organizmo šeimininko chromatiną. Tokių tyrimų dėka, nustatyta, kad

hidroksicinamono dariniai turi didelį potencialą antivirusinių ligų gydyme ir prevencijoje [37, 38]. Fenolinės rūgštys taip pat pasižymi antialerginėmis, antivirusinėmis, priešuždegiminėmis, antikarcinogeninėmis, širdies ir kraujagyslių sistemą teigiamai veikiančiomis savybėmis [39].

Maistas, kuriame gausu fenolinių junginių, fenolinių rūgščių, mažina riziką susirgti onkologine liga, veikia ir inhibuoja pakitusių ląstelių dalijimasį. Taip pat mažina aterosklerozės riziką, kraujagyslių trapumą, pasižymi neuroprotekciniu, antidiabetiniu poveikiu [40]. Mokslinių tyrimų dėka nustatyta, jog fenolinės rūgštys apsaugo ląstelės membranos lipidus nuo peroksidacijos. Tai profilaktinė priemonė įvairioms organizmo patalogijoms. Naudojama terapiniams tikslams gydant ligas, kurias sukelia antioksidantinis stresas [37].

1.2.3 Fenolinių junginių ekstrakcijos metodai

Ekstrakcija – tai procesas, kurio metu vyksta koncentruotos medžiagos išgavimas iš žaliavos.

Tai vienas svarbiausių etapų bandinio paruošimui. Ekstrakcija yra nuoseklus ir sistemingai atliekamas procesas, naudojant vandeninį organinį tirpiklį, norint išgauti fenolinius junginius. Tradicinis metodas yra skystis – skystis ir skirtingų tirpiklių ekstrakcija. Soksleto sistema yra naudojama ištraukti lipidinę frakciją naudojant tinkamus tirpiklius. Nors tai nėra specifinis ar pagrindinis fenolinių junginių ekstrakcijos metodas, rezultatai gali būti lyginami su kitais, pagrindiniais fenolinių junginių ekstrakcijos būdais. Tradiciniai ekstrakcijos metodai: maceracija, perkoliacija, Soksleto sistema, kaitinimas su grįžtamuoju šaldytuvu – trunka iki keleto dienų, sunaudojama daug energijos, reikalingi dideli kiekiai neekologiškų organinių tirpiklių.

Nauji ekstrakcijos metodai: IR spindulių, superkritinių skysčių, slėginė skysčių, mikrobangų, mechanocheminė, ultragarso metodai – trunka trumpiau, sunaudojama keletą kartų mažiau tirpiklių ir energijos [41].

Vienas seniausių ekstraktų ruošimo būdas – maceracija. Šiam procesui naudojama nesmulkinta žaliava, ant kurios užpiltas ekstrahentas. Ekstrakcijos trukmė mažiausiai 3 paros, nors gali trukti ir ilgiau. Šiuos ekstraktus reikia laikyti vėsioje, tamsioje vietoje.

Infraraudonųjų spindulių ekstrakcija – procesas, kurio metu naudojama IR energija, kuri tiesiogiai šildo tiriamąjį mėginį. Norint pasiekti ekstrahavimo efektyvumą, kuris veikiant IR spinduliais, gaunamas per 6 min, tiriamąjį bandinį tradiciniu būdu reikėtų šildyti 3 val. Tai vienas iš naujausių ekstrakcijos metodų, kuris pritaikytas biologiškai aktyviems junginiams išgauti [42].

Ekstrakcija ultragarsu – tai dažniausiai naudojama alternatyva tradiciniams polifenolinų junginių ekstrakcijos procesams. Ultragarso spinduliai yra galinga pagalba norint paspartinti

ekstrakciją. Ši energija padeda kietų mėginių paruošime, tai palengvina ir pagreitina procesus, pvz. organinių, neorganinių junginių ekstrakcijai, homogenizacijai ir kt. Ekstrakcija ultragarsu laikomas vienas iš paprasčiausių ekstrakcijos metodų, nes lengva tai atlikti laboratorijos sąlygomis, nereikalauja ypatingos įrangos. Susmulkintas mėginys sumaišomas su tinkamu tirpikliu, dedama į ultragarso vonelę, kurioje nustatyta reikiama temperatūra ir ekstrakcijos laikas [42]. Ultragarsas skleidžia bangas, kurių dažnis nuo 20kHz iki 2000kHz. Ekstrakcijos metu skleidžiamas ultragarso laukas sukelia dvejopą poveikį: vyksta kavitacijos procesas ir šildymas [43].

Mikrobangų ekstrakcija – ši technologija žinoma dėl mėginių apdorojimo karščiu. Šis procesas gali būti naudojamas greitam produktų pasterizavimui. Tuo pačiu jis gali nustatyti suminį polifenolių turinį ir kiekį. Ekstrakciją mikrobangomis galima atlikti ir be šviesos. Fenoliniai junginiai yra jautrūs šviesai, todėl tai didelis privalumas šiam metodui. Pagrindinis mikrobangų ekstrakcijos privalumas toks, kad keli mėginiai kartu gali būti greičiau ekstrahuojami nei pvz. Soksleto ekstrakcija. Tačiau yra ypač svarbu atsargumo priemonės, dirbant su degiais tirpikliais arba mėginiais, kurių sudedamosiose dalyse yra medžiagų sąveikaujančių su mikrobangų spinduliuote [41].

Vienas iš dažniausiai naudojamų ekstrakcijos metodų – šildymo ekstrakcija su grįžtamuoju šaldytuvu, kurio metu vyksta ekstrahento, kuriame yra augalinė žaliava kaitinimas ir susidariusių garų šaldymas grįžtamajame šaldytuve. Gaunamo junginio kiekis priklauso nuo ekstrahento koncentracijos, temperatūros, ekstrahento ir žaliavos santykio, ekstrakcijos ciklų. Naudojami nesudėtingi prietaisai.

1.2.4 Fenolinių junginių įvertinimas – kiekybinis ir kokybinis nustatymas

Fenolinių junginių išskyrimas ir nustatymas iš augalinės kilmės žaliavos labai svarbus procesas. Kokybiniam fenolinių junginių identifikavimui įvairiose augalinėse žaliavose naudojami pažangūs analizės metodai, tokie kaip branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija - masių spektrometrija, IR spektroskopija, UV spektroskopija, dujų chromatografija [44]. Šių metodų dėka, kokybiniai tyrimai atliekami tiksliai ir efektyviai.

Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui augalinėse žaliavose naudojami plonasluoksnės ar efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodai, dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija.

Nuo 1960-ųjų metų plonasluoksnė chromatografija yra naudojama kaip analizės metodas fenolinių rūgščių nustatymui natūraliuose produktuose. Plonasluoksnė chromatografija naudojama junginių atskyrimui, identifikavimui, jų valymui po ekstrakcijos. Šis metodas yra sąlyginai pigus, paprastas, selektyvus, tikslus, bei plačiai pritaikomas. Plonasluoksnė chromatografija yra naudojama nustatyti nelakiems junginiams, nereikia jokios brangios įrangos, galima tirpiklių sistemų bei sorbentų įvairovė, nesunaikinama tiriama medžiaga [45]. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija pastaruoju metu labai populiarėja, sunaudojama mažiau tirpiklių.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas naudojamas nuo 1964 metų. Tai vienas iš dažniausiai naudojamų metodų kokybiniui ir kiekybiniui fenolinių junginių nustatymui. Efektyviąja skysčių chromatografija galima vienu metu atskirti analizuojamus junginius kartu su galimais dariniais. ESC panaudojimas fenolinių junginių analizei yra plačiai paplitęs dėl keleto priežasčių: greitos ir efektyvios analizės, plataus kolonėlių pasirinkimo. Ši metodika yra specifiška. Taikoma atvirkštinių fazių chromatografija, skirstymui naudojamos silikagelio kolonėlės, kuriose gradientinė eliucija atliekama naudojant dviejų tirpiklių sistemą. Jei tyrimas skirtas identifikuoti iki 10 junginių, tai trunka trumpą laiką – 0,5-1 val. Jei tyrimo tikslas atskirti ir identifikuoti 30-50 skirtingų junginių, tai užtruks daugiau nei dvi valandas [46].

1.3 Kietafazė ekstrakcija

Tai metodas, pagrįstas analitės pasiskirstymu tarp skystos fazės (pvz. biologinio mėginio) ir kietos fazės (sorbento). Absorbuota analitė yra išplaunama pasirinktu tirpikliu (eliuentu). Pagrindiniai kietafazės ekstrakcijos etapai: sorbento kondicionavimas (aktyvavimas), biologinio mėginio su analitėmis įleidimas, nepageidaujamų matricos komponentų (pvz. baltymų) išplovimas, analitės desorbcija pasirinktu eliuentu [47]. KFE efektyvumas priklauso nuo tinkamo sorbento ir eliuento pasirinkimo. Tai vis plačiau naudojamas metodas, nes gautus ekstraktus galima tiesiogiai analizuoti ir duomenis vertinti kokybiškai ir kiekybiškai. Kietafazė ekstrakcija vykdoma tam tikromis medžiagomis užpildytose šerdelėse [48]. KFE skiriasi cheminėmis savybėmis, dydžiais, adsorbentais.

1.3.1. Sorbentai

Tinkamas sorbentas užtikrina tikslius ir patikimus kietafazės ekstrakcijos rezultatus. Modifikuoto silikagelio - dažniausiai naudojami sorbentai. Kovalentiniais ryšiais prijungus nepolinius ligandus prie silikagelio silanolinių grupių, gaunami hidrofobinių savybių atvirkštinių fazių sorbentai (C8, C18),

kurie sąveikauja su poliniu mėginiu, analitės sulaikomos, veikiant van der Valso jėgoms. Prie silanolinių grupių prijungus jonines grupes gaunami jonų mainų sorbentai. Taip pat turi laisvas silanolines grupes, kurios gali adsorbuoti jonizuotis linkusias analites ir tokiu būdu sumažinti ekstrakcijos gavimą [49].

Biologinių mėginių ekstrakcijai dažnai naudojami nauji lipofiliniai – hidrofiliniai sorbentai. Jie veikia kaip atvirkštinių fazių kolonėlės, skirtumas, kad turi polimerinių grupių. Šie sorbentai tinka šarminių, rūgštinių ir neutralių analičių ekstrakcijai [50].

1.3.2 Tirpikliai

Pirmas ekstrakcijos etapas yra sorbento aktyvavimas (kondicionavimas). Tirpiklis parenkamas pagal analites, esančias biologiniame mėginyje. Naudojami tirpikliai, kurie poliškumu atitinka vaistines medžiagas. Atvirkštinių fazių ir jonų mainų sorbentai dažniausiai sudrėkinami 1 ml metanolio ir 1 ml vandens.

Ekstrakto išgryninimui (pašalinių medžiagų ir baltymų išplovimui iš sorbento) svarbu parinkti tinkamą praplovimo tirpalą. Atvirkštinių fazių sorbentui tinka 5 – 50 proc. koncentracijos organinis tirpiklis. Dažniausiai naudojamas praskiestas 5 – 10 proc. metanolio tirpalas, tačiau tinka ir kiti poliniai organiniai tirpikliai. Jonų mainų sorbentas plaunamas nedidelės joninės jėgos buferiniais tirpalais (pvz. kalio fosfato) [49].

Svarbiausias etapas yra analitės desorbcija iš sorbento, todėl reikia pasirinkti tinkamą eliuentą. Pagrindinės organinių tirpiklių savybės, kurios gali įtakoti eliucijos efektyvumą yra: poliškumas, eliucijos stiprumas, klampumas.

Norint išgauti medžiagas pilnai, būtini keturi optimizuoti žingsniai:

1

– sorbento kondicionavimas. Tai būtina sąlyga analitės sorbcijos pakartojamumui. Naudojamas organinis tirpiklis (acetonitrilas arba metanolis). Kaip papildomas organinis tirpiklis vartojamas vanduo arba buferis. Metanolis sudrėkina sorbento paviršių ir prasiskverbia per sujungtas alkilo fazes.

2

– bandinio užnešimas. Šiame procese analizuojama medžiaga koncentruojasi ant sorbento.

Būtinas tikslus bandinio perleidimas į šerdelę ar rezervuarą, naudojant tūrinę ar mikropipetę. Bandinys turi būti formoje, kuri yra suderinama su kietafaze ekstrakcija.

3

– praplovimas. Tai nereikalingų matricinių komponentų pašalinimas. Nuo stacionarios fazės

paviršiaus nereikalingi komponentai nunešami su mažu kiekiu vandens ar buferio. Taip pat gali būti naudojamas vandeninis buferis turintis savyje mažą kiekį metanolio.

4

– absorbuotų analičių išplovimas. Šiame paskutiniame kietafazės ekstrakcijos žingsnyje analizuota medžiaga yra desorbuojama su tinkamu tirpikliu ir išplaunama kaip siaura zona. Optimaliam tirpiklio pasirinkimui būtinos žinios apie analitės struktūrą, tirpumą, poliškumą [51].

1 2 3 4

4 pav. Kietafazės ekstrakcijos etapai [51]

Iškeltos problemos aktualios todėl, jog trūksta kitų mokslininkų rezultatų, susijusių su kietafazės ekstrakcija tiriant augalų sudėtį. Ankstesniuose skyriuose galima pastebėti, jog fenoliniai junginiai, gauti iš sėjamųjų grikių, itin naudingi žmogaus organizmui. Taip pat kitų mokslininkų atlikti rezultatai teigia, kad grikyje nėra sveikatai pavojingų medžiagų. Kietafazė ekstrakcija svarbi fenoliniams junginiams gauti, nes tai nebrangus ir kokybiškas būdas juos ekstrahuoti. Todėl šio darbo esmė – ištirti kaip kinta kietafazės ekstrakcijos metodu gautų sėjamųjų grikių frakcijų sudėtis.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrime buvo analizuojami sėjamųjų grikių vaisiai ir žolė. Žaliavos užaugintos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo eksperimentiniuose laukuose. Žaliavos auginimas paremtas ekologiška žemdirbystės sistema (tręšiami nebuvo). Augalai džiovinti vėdinamoje patalpoje esant ne aukštesnei nei 40 °C temperatūrai. Buvo pasirinkta tirti tris grikių veisles, palyginimui dviejų metų laikotarpyje: 2014 m. ir 2015 m. „Žaleika“, „Kvietka“, „Smuglianka“.

2.2. Reagentai

Fagopyrum esculentum Moench žaliavų fenoliniams junginiams ištirti, pasirinkti šie analitinio

grynumo reagentai:

 Etanolis (96%, „Vilniaus degtinė“)

 Acetonitrilas ( „Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija)

 Acto rūgštis („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija)

 Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV)

 Galo rūgštis (>99 %, „Fluka“, Lenkija)

 Natrio karbonatas (Na2CO3) („Roth“,Vokietija)

 Natrio molidbatas (Na2MoO4) („Alfa Aesar“, Vokietija)  Natrio hidroksidas (NaOH) („Lachema“, Čekija)

 37% vandenilio chlorido rūgštis (HCl) („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija)

 Natrio nitritas (NaNO2) („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija)  Metanolis (CH3OH) („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija)  Trifluoracto rūgštis 99,8 % („Carl Roth Gmbh“, Vokietija)

2.3. Aparatūra ir priemonės

 Augalinės žaliavos smulkintuvas BOSCH MKM6003 (Gerlingen, Vokietija)

 Analitinės svarstyklės „Sartorius“ (Götingen, Vokietija)

 Laboratorinį drėgmės analizatorius Kern DBS 60-3 (Balingenas, Vokietija).

 Centrifugatorius Centurion Scientific C2006 (Centurion Scientific Global, Jungtinė Karalystė)

 ESC-MS analizatorius „Acquity Sample Manager“ (United Kingdom)

 Kietafazės ekstrakcijos sistema „Waters“(Milford, USA)

2.4. Nuodžiūvio nustatymas augalinėje žaliavoje

Išdžiovinti grikių vaisiai susmulkinti buitiniu smulkintuvu BOSCH MKM6003 (Gerlingen, Vokietija) iki <3 mm dydžio. Nuodžiūvis vertintas naudojant Kern DBS 60-3 (Balingenas, Vokietija) drėgmės analizatorių. Atsveriama po 1 g susmulkintos žaliavos (masės skirtumas tarp mėginių svėrimo 0,01 g). Atsverta žaliava kaitinama 120°C temperatūroje iki pastovios masės. Visos žaliavos atitiko Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnyje minimas ribas, nes buvo <10 proc. drėgmės.

2.5. Ekstrakcijos proceso optimizavimas taikant ultragarsinės ekstrakcijos metodą

Ekstrahavimo optimizavimo procesui atlikti ir įvertinti rezultatus, naudojama ultragarso vonelė, kurios ultragarso stipris 168 W, dažnis 40 KHz. Šiam procesui atlikti naudojama lapų žaliava. Gautas ekstraktas centrifiguojamas 10 min 6000 rpm. Centrifugatas filtruojamas per 0,45 μm dydžio membraninį porų filtrą. Ekstrahavimo optimizavimui įvertinti, pasirinkti šie objektai: ekstrakcijos tirpiklio etanolio skirtingos koncentracijos tirpalai, ekstrakcijos ultragarsu trukmė bei temperatūra.

2.6. Sėjamųjų grikių ekstraktų paruošimas kokybiniui ir kiekybiniui įvertinimui

Išdžiovinami sėjamųjų grikių vaisiai, susmulkinami elektriniu malūnėliu. Atsveriama 1 g (0,01 g tikslumu) augalinės žaliavos, užpilama 4 ml 70 proc. (v/v) etanolinio tirpalo ir ekstrahuojama 45°C temperatūroje, 15 min. ultragarso vonelėje. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 10 min 6000 rpm. Centrifugatas nupilamas ir tas pats procesas kartojamas du kartus, antrą kartą užpilant 4 ml ekstrahento, trečią– 3 ml. Ekstraktas praskiedžiamas 70 proc. (v/v) etanoliu iki 10ml, filtruojama per membraninį 0,45 μm filtrą ir atliekami eksperimentai.

2.7. Suminio hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas

spektrofotometriniu metodu

Suminis hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis sėjamųjų grikių žaliavose buvo nustatomas naudojant farmakopėjinį metodą su Arnow reagentu [52]. Kiekvieno tiriamojo ekstrakto analizei paruošiami 2 mėginiai – tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamasis mėginys ruošiamas į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml Arnow reagento (mišinys sudarytas iš 10 proc. natrio molidbato tirpalo ir 10 proc. pr. natrio nitrito tirpalo santykiu 1:1), 2 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml.

Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 525 nm bangos ilgiui. Suminis procentinis hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išreikštas chlorogeno rūgšties ekvivalentais. Apskaičiuota pagal formulę:

𝑋(%) =A ∙ V (važ) ∙ S ∙ 10 188 ∙ m

A – tiriamojo mėgino absorbcijos dydis esant 525 nm bangos ilgiui;

V (važ) – pagaminto ekstrakto tūris ml;

S – skiedimas;

m – tikslus atsvertos augalinės žaliavos kiekis g.

Paruošti standartiniai etanoliniai hidroksicinamono rūgšties tirpalai skirtingomis koncentracijomis intervale 0,00625 – 0,1 mg/ml. Suminis fenolinių junginių kiekis vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono hidroksicinamono rūgšties kalibracinę kreivę (5 pav.).

5 pav. Hidroksicinamono rūgšties kalibracinė kreivė

2.8.

Kietafazės ekstrakcijos optimizavimas

Kietafazės ekstrakcijos efektyvumui įtakos turi ir ekstrakcijos laikas bei slėgis. Esant dideliam slėgiui aktyvūs junginiai nesulaikomi aktyviuose centruose ir stebimi didesni nuostoliai. Didinant ekstrakcijos laiką, aktyvūs junginiai pilnai užpildo aktyvius centrus ir nuostoliai sumažėja. Ekstrakcijai vykstant lėtai — efektyvumas išauga daugiau nei 10 %.

Kietafazė ekstrakcija (KFE) atliekama Discovery® DPA-6S SPE šerdele (poliamidinis sorbentas, Sigma Aldrich, Sent Luisas, JAV). Šio tipo šerdelė pasirenkama atsižvelgiant į jos gamintojo rekomendacijas [53]. Discovery šerdelės taikiniai yra junginiai turintys hidroksilines grupes, ypač fenoliniai junginiai, fenolinės rūgštys. Taip pat šios firmos šerdelių privalumas yra didelis dalelių dydis, kuris užtikrina gerą mėginio tėkmę šerdele ir patikimus rezultatus. Šis metodas atliekamas „Waters“ kietafazės ekstrakcijos sistema.

KFE atlikta pagal kolonėlės gamintojo pateiktą metodiką:

1. KFE šerdelė praplaunama 1 ml 100 % metanoliu,

2. praleidžiamas 1 ml bidistiliuoto vandens (parūgštintas TFA, pH = 2),

3. užnešamas praskiestas, parūgštintu vandeniu, grikių ekstraktas (0,5 : 9,5) ( I frakcija)

y = 0,8363x + 0,1078 R2 _{= 0,9981} 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

A

bs

o

rbci

jo

s

dy

di

s

4. užnešami 3 ml bidistiliuoto vandens (parūgštintas TFA, pH = 2) ( II frakcija)

5. išdžiovinama vakuumu (5min),

6. bandinys surenkamas 1 ml 75 % metanolio. ( III frakcija)

6 pav. Kietafazės ekstrakcijos eiga su „Waters“ kietafazės ekstrakcijos sistema

2.9. Gautų duomenų statistinis vertinimas

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojantis „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) ir SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV) programomis. Visi atlikti tyrimai pakartoti tris kartus, rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN).

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Nuodžiūvio įvertinimas

Nuodžiūvis – sumažėjęs džiūstančios medžiagos svorio kiekis, žaliavos kokybę apibūdinantis rodiklis. 3 ir 4 lentelėse pavaizduotos Fagopyrum esculentum Moench trijų vaisių ir žolės veislių 2014 m., 2015 m. vidutinės nuodžiūvio reikšmės.

3 lentelė. Skirtingų grikių lapų veislių nuodžiūvio reikšmės (proc.)

Nuodžiūvis % Metai

Veislė 2014 metai 2015 metai

„Žaleika“ 6,13±0,11 7,16±0,14

„Kvietka“ 7,08±0,16 6,96±0,1

“Smuglianka“ 6,84±0,1 7,19±0,13

4 lentelė. Skirtingų grikių vaisių veislių nuodžiūvio reikšmės (proc.)

Nuodžiūvis % Metai

Veislė 2014 metai 2015 metai

„Žaleika“ 6,78±0,15(6,89±0,11) 7,06±0,14

„Kvietka“ 7,04±0,13 (7,01±0,12

) 7,33±0,07

“Smuglianka“ 7,15±0,19 (7,02±0,13

) 6,83±0,16

Duomenys lentelėse parodo, kad Fagopyrum esculentum L. vaisių ir lapų žaliavų nuodžiūviai svyruoja nuo 6% iki 7%. Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnis leidžia Fagopyrum

esculentum L. sausos žaliavos ne daugiau kaip 10% drėgmės. Nuodžiūvio matavimai atlikti, kartojant

1

2014 metų intensyvios žemdirbystės sistemos sėjamųjų grikių „Žaleika“ veislės vaisių nuodžiūvis %

2_{2014 metų intensyvios žemdirbystės sistemos sėjamųjų grikių„Kvietka“ veislės vaisių nuodžiūvis %}

bandymą tris kartus, drėgmė svyruoja nuo 6,13 iki 7,33 procentų. Gauti rezultatai atitinka reikalavimus, galima tęsti eksperimentus.

3.2. Fenolinių junginių ekstrakcijos optimizavimas taikant ultragarsinės

ekstrakcijos metodą

Šio proceso optimizavimo metu vertinama skirtingų parametrų įtaka ekstrakcijos procesui. Pasirinktas ekstrakcijos tirpiklis etanolis, tiriamos įvairios jo koncentracijos, ekstrakcijos trukmė ir temperatūra. Ekstrakcijos efektyvumas vertinamas pagal suminį fenolinių junginių kiekį augalinėje žaliavoje. Kokybinis ir kiekybinis įvertinimas atliekamas masių spektrofotometru.

3.2.1. Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos nustatymas

Sąlygų parinkimui naudotos sėjamųjų grikių veislės “Žaleika„ 2014 m. žolės ir vaisių žaliavos. Šioms žaliavoms ekstrahuoti naudoti įvairių koncentracijų (v/v) (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ir 96 proc.) etanolis. Etanolis kaip ekstrakcijos tirpiklis pasirinktas todėl, kad jis itin tinkamas fenolinių rūgščių ekstrahavimui, saugus ir nebrangus. Ekstrakcijos laiko trukmė – 15 min. Šis eksperimentas pakartotas tris kartus. Palyginus nustatytą fenolinių junginių kiekį, gauta, jog daugiausiai jų išekstrahuojama 70 proc. (v/v) etanoliu ir žolės ir vaisių mėginiuose (5 pav.). Nuo 30% iki 70 % etanolio (v/v) koncentracijų gaunamas fenolinių junginių kiekis (mg/g) palaipsniui didėjo, pasiekus optimalią 70% etanolio (v/v) konc. Rezultatų didėjimas sustojo, taip nustatytas didžiausias išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis. Eksperimentas buvo tęsiamas toliau, su 80%, 90%, 96% etanolio (v/v) koncentracijomis. Tokių rezultatų buvo tikėtasi – išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis gana ryškiai sumažėjo didinant etanolio (v/v) koncentracijas. Šie rezultatai priskiriami ir žolės, ir vaisių mėginiams. Beje, beveik identiški rezultatai vaisių mėginiuose buvo esant 70% ir 80% etanolio (v/v) koncentracijoms. Žolėje, antra pagal daugiausiai išekstrahuotų fenolinių junginių kiekį, efektyviausia etanolio (v/v) koncentracija – 60%. Galima spręsti, jog eksperimentai su 60%, 70%, 80% etanolio koncentracijomis būtų teigiami ir rezultatyvūs.

7 pav. Etanolio koncentracijos nustatymas žolėje ir vaisiuose norint gauti didžiausią fenolinių junginių kiekį, %

Kadangi šie rezultatai tarpusavyje neturi statistiškai reikšmingų skirtumų (statistinio reikšmingumo lygmuo p>0,05), toliau tęsti bandymus netikslinga naudojant 30 proc. (v/v), 40 proc. (v/v), 90 proc. (v/v), 96 proc. (v/v) ekstrahento etanolio tirpalus. Gauti rezultatai, naudojant 50 proc. (v/v), 60 proc. (v/v), 70 proc. (v/v)., 80 proc. (v/v) koncentracijų etanolinius tirpalus, skiriasi nuo tų, kurie gauti naudojant 30 proc. (v/v) etanolį, nes nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (reikšmingumo lygmuo p<0,05). Kadangi tolimesniems eksperimentams galima pasirinkti etanolinius tirpalus su 50 proc. (v/v), 60 proc. (v/v), 70 proc. (v/v)., 80 proc. (v/v) koncentracijomis, pasirinkta 70% (v/v) optimali koncentracija, tinkanti efektyviai fenolinių junginių ekstrakcijai.

3.2.2. Temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui

Sąlygų parinkimui naudotos sėjamųjų grikių veislės “Žaleika„ 2014 m. žolės ir vaisių žaliavos. Atsižvelgiant į ankstesnį eksperimentą ( 3.2.1 skyrius), pasirinktas ekstraktas su 70% (v/v) etanoliu. Temperatūros įtaka nustatoma esant skirtingai temperatūrai (25°C, 35°C, 45°C, 55°C, 65°C, 75°C) ultragarso vonelėje. Ekstrakcija atliekama 30 min.

0 10 20 30 40 50 60 70 30 40 50 60 70 80 90 96 Fenolinių junginių kiekis, m g/g Etanolio koncentracija, % Žolė Vaisiai

Didžiausias ekstrahavimo efektyvumas pasiekiamas 45°C temperatūroje, kurioje išekstrahuoti didžiausi fenolinių junginių kiekiai ir žolėje ir vaisiuose (6 pav.). Iki 45°C žolės ir vaisių mėginiuose matomas palaipsnis išekstrahuotų fenolinių junginių kiekio (mg/g) didėjimas. Toliau didinant temperatūrą, ekstrahuotų fenolinių junginių kiekis sumažėjo, tačiau labai nežymiai. Mažiausias fenolinių junginių kiekis žolėje gautas ultragarso vonelėje esant 25°C, o vaisių mėginyje mažiausias fenolinių junginių kiekis gautas esant 75°C. Sėjamųjų grikių vaisių mėginyje gautas beveik vienodas, optimalus fenolinių junginių kiekis esant 45°C ir 55°C temperatūrai. Žinoma, lyginant žolės ir vaisių mėginių rezultatus, skirtumai akivaizdūs – žolėje randama ženkliai daugiau fenolinių junginių. Žolės, kaip eksperimentinio objekto rezultatai – geresni, efektyvesni, palankesni tęsti tyrimus.

8 pav. Kiekybiškai įvertintas fenolinių junginių kiekis žolėje ir vaisiuose, skirtingose temperatūrose, naudojant 70 proc. (v/v) etanolinius tirpalus.

Pagal atliktą statistinę analizę, temperatūra neturi statistiškai reikšmingos įtakos ekstrakcijos procesui, nes gautas rezultatų statistiškai nereikšmingas skirtumas p>0,05. Tolimesniems eksperimentams pasirinkta optimali 45°C temperatūra, nes šioje temperatūroje gautas didžiausias fenolinių junginių kiekis. Žinoma, galima naudoti 35°C, 55 °C ekstrahavimo temperatūrą, tačiau manoma, kad per didelė temperatūra gali pakenkti fenolinių junginių stabilumui ar ekstrahavimo efektyvumui. 0 10 20 30 40 50 60 25 35 45 55 65 75 Fenolinių junginių kiekis, m g/g Temperatūra, °C Žolė Vaisiai

3.2.3. Ekstrakcijos trukmės įtaka ekstrahavimo procesui

Sąlygų parinkimui naudotos sėjamųjų grikių veislės “Žaleika„ 2014 m. žolės ir vaisių žaliavos. Ekstrakcijos trukmės įtakos analizė atliekama pagal prieš tai tyrimuose optimizuotas sąlygas (3.2.1., 3.2.2. skyriai): naudojamas 70% etanolis (v/v), procesas atliekamas 45°C temperatūroje. Ekstrahuotas iš augalinės žaliavos fenolinių junginių kiekis (proc.) įvertinamas po 5 min, 10 min,15 min, 20 min, 25 min, 30 min. (7 pav.). Fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal anksčiau aprašytą metodiką, su Arnow reagentu (2.7. skyrius).

Fenolinių junginių kiekis tolygiai ir ryškiai didėjo žolės ir vaisių mėginiuose nuo 5 iki 15 min. Pasiekus optimalų laiką, ekstrahuotų fenolinių junginių kiekis palaipsniui mažėjo. Mažiausias išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis žolėje ir vaisiuose mažiausias buvo atlikus ekstrakciją 5 minutes, didžiausias esant 15 minučių, todėl šis laikas ir pasirinktas tolimesniems eksperimentams. Kaip ir ankstesniuose tyrimuose, rezultatyviausi išlieka žolės mėginiai, lyginant su vaisių mėginiais. Pagal gautus rezultatus diagramoje, galima nustatyti, jog ilgesnis ektrahavimas ultragarso vonelėje žymiai efektyvesnis nei trumpesnis. Tai atvirkščias procesas lyginant su ekstrakcijos tirpiklio etanolio koncentracijos didinimu aprašytu 3.2.1 skyriuje.

9 pav. Ekstrakcijos trukmės įtaka ekstrahavimo procesui žolėje ir vaisiuose norint gauti didžiausią fenolinių junginių kiekį, min

0 10 20 30 40 50 60 70 5 10 15 20 25 30 Fenolinių junginių kiekis, m g/g Laikas, min Žolė Vaisiai

Po statistinės analizės nustatyta, kad statistiškai reikšmingi skirtumai gauti esant 5 min ir 10 min, lyginant su kitais laiko intervalais, nes gautas statistiškai reikšmingas skirtumas p<0,05. Atliekant statistinę analizę su kitais laiko intervalais, gauti statistiškai nereikšmingi skirtumai, todėl atlikti ekstrakciją ilgiau nei 15 min. neefektyvu ir nenaudinga.

3.3. Kokybinis fenolinių rūgščių nustatymas grikių vaisių žaliavoje

Kokybinė fenolinių rūgščių analizė atliekama spektrofotometrijos metodu, kurio metu identifikuojamos fenolinės rūgštys. Kokybinis fenolinių rūgščių identifikavimas atliekamas, palyginat sulaikymo laikus bei absorbcijos spektrus su standartais.

10 pav. Fenolinių rūgščių chromatograma grikių vaisių žaliavoje

10pav. pateikta chromatograma, vaizduojanti fenolinių rūgščių, sėjamųjų grikių, užaugintų ekologinės žemdirbystės sistemoje, 2014 metų „Žaleika“ veislės vaisių, kokybinę analizę. Jie gauti augalinę žaliavą ekstrahuojant etanoliniu ekstraktu. Chromatogramoje matyti, jog gautos šešios fenolinės rūgštys – vanilino, galo, chinino, neochlorogeno, chlorogeno, rozmarino. Atliktos ir kitų grikių veislių chromatogramos. 2014 metų „Kvietka“ veislės grikių etanoliniame ekstrakte rastos tos pačios fenolinės rūgštys, tačiau „Smuglianka“ veislėje nustatytos penkios rūgštys – nerasta vanilino rūgštis.

3.4. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas sėjamųjų grikių vaisių

ekstraktuose spektrofotometriniu metodu

Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas Fagopyrum esculentum L. etanoliniuose ekstraktuose. Jis buvo apskaičiuotas remiantis anksčiau aprašyta kalibracine kreive. Tyrimui naudota žaliava buvo rinkta 2013 ir 2014 metais. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas

Fagopyrum esculentum L. veislės „Kvietka“ vaisiuose 2014 metais 4,19 ±0,23mg/g, „Žaleika“

veislės vaisiuose 2015 metais 3,89 ±0,22 mg/g. Mažiausias fenolinių junginių kiekis rastas „Smuglianka“ sėjamųjų grikių veislėje 2014 metais 1,89 ±0,14 mg/g, tos pačios veislės 2015 metais 2,05 ±0,78 mg/g (8pav.).

Atlikus statistinę analizę nustatyta, jog didesnis sukauptų fenolinių junginių kiekis buvo 2015 metais. Kadangi augimvietė buvo ta pati ir 2014 metais, ir 2015 metais, ekologiška, galima manyti, kad derlių ir sukauptų fenolinių junginių kiekį nulėmė meterologinės sąlygos: iškritusių kritulių kiekis bei vidutinė metų temperatūra.

Didžiausią fenolinių junginių kiekį Fagopyrum esculentum L. vaisiuose sukaupusi veislė – „Kvietka“ 3,75 ±0,59 mg/g. Tuo tarpu mažiausią fenolinių junginių kiekį sukaupusi veislė - „Smuglianka“ 1,97 ±0,55 mg/g (8 pav.).

11 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas sėjamųjų grikių vaisių ekstraktuose (mg/g) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

„Žaleika“ “Kvietka“ „Smuglianka“

Fenolinių junginių kiekis, m g/g 2014 metai 2015 metai

Įvertinus duomenų statistinį reikšmingumą nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis tarp tirtų grikių vaisių veislių „Žaleika“ ir „Kvietka“ yra statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05), o „Smuglianka“ veislėje gautas statistiškai nereikšmingas skirtumas (p>0,05).

3.5. Bendro fenolinių junginių kiekio palyginimas skirtingose žemdirbystės

sistemose sėjamųjų grikių vaisiuose

Nors visi tiriami objektai yra iš ekologiškos žemdirbystės sistemos, tačiau visgi palyginimui pasirinkta 2014 metų intensyvios žemdirbystės sistema. Palyginama 2014 metų sėjamųjų grikių, augintų ekologiškoje ir intensyvioje žemdirbystės sistemoje, skirtingų veislių vaisiai. Norima sužinoti ar skiriasi duomenys tarp žemdirbystės sistemų, kurioje sistemoje yra gaunamas didesnis fenolinių junginių kiekis, planuojant tęsti tyrimus, susijusius su grikių vaisiais. Šiame eksperimente fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas iš ankščiau sudarytos kalibracinės kreivės. Tyrimai buvo atliekami tris kartus, apskaičiuotas jų standartinis nuokrypis. Analitinių tyrimų rezultatai pateikti 5 lentelėje.

5 lentelė. Bendras fenolinių junginių kiekis skirtingose žemdirbystės sistemose ir sėjamųjų grikių veislėse 2014 metais (mg/g)

Žemdirbystės sistema, metai Veislė Ekologiška žemdirbystė, 2014 metai Intensyvi žemdirbystė, 2014 metai „Žaleika“ 2,82±0,13 4,11±0,1 „Kvietka“ 4,19±0,23 3,72±0,29 „Smuglianka“ 1,89±0,14 2,65±0,14

Apibendrinant tyrimų rezultatus nustatyta, jog intensyvios žemdirbystės sistemoje, didžiausias fenolinių junginių kiekis rastas 2014 metų „Žaleika“ veislės grikių mėginyje (4,11±0,1 mg/g), o mažiausias – 2014 metų „Smuglianka“ veislės mėginyje (2,65±0,14 mg/g). Ekologiškos žemdirbystės sistemoje augintų grikių rezultatai aptarti ankstesniame 3.3. skyriuje. Intensyvios žemdirbystės sistema pirmauja lyginant su ekologiška, tačiau visgi grikių veislė „Kvietka“ sukaupė didesnį fenolinių junginių kiekį ekologiškoje žemdirbystės sistemoje. Išvada – intensyvios žemdirbystės sistemoje rezultatai geresni, gauti didesni fenolinių junginių kiekiai.