MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
LAURYNAS ŠOPAGA
EKSTRAKCIJOS SĄLYGŲ OPTIMIZAVIMAS BEI FENOLINIŲ
JUNGINIŲ ĮVERTINIMAS SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM
ESCULENTUM MOENCH) ŽALIAVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc.dr. Konradas Vitkevičius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALITINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data_________________
EKSTRAKCIJOS SĄLYGŲ OPTIMIZAVIMAS BEI FENOLINIŲ
JUNGINIŲ ĮVERTINIMAS SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM
ESCULENTUM MOENCH) ŽALIAVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Konradas Vitkevičius
Data_____________________
Recenzentas
Darbą atliko: Vardas, pavardė, parašas Magistrantas
Laurynas Šopaga
Data_______________ Data_________________
TURINYS
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 5
SANTRAUKA ... 6
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) apibūdinimas ... 10
1.2. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai požymiai ... 10
1.3. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas ... 11
1.4. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) cheminė sudėtis skirtingose augalo dalyse 11 1.5. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) panaudojimas ... 12
1.6. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) pritaikymas liaudies medicinoje ... 13
1.7. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) farmakologinis poveikis organizmui ... 13
1.8. Fenoliniai junginiai ir jų poveikis organizmui ... 14
1.9. Fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ... 17
1.10. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Tyrimo objektas ... 22
2.2. Žaliavos ruošimas ... 23
2.3. Medžiagos ir tirpikliai ... 23
2.4. Naudota aparatūra ... 23
2.5. Ekstrakcijos proceso optimizavimas taikant ultragarsinės ekstrakcijos metodą ... 24
2.6. Maceracijos proceso optimizavimas ... 24
2.7. Ekstraktų paruošimas fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui... 24
2.8. Fenolinių junginių kokybinis ir kiekybinis nustatymas ESC metodu ... 25
2.9. Statistinė duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1.1. Ekstrahentų ir jų koncentracijų parinkimas tolimesniam optimizavimo procesui ... 27
3.1.2. Temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui ... 29
3.1.3. Ekstrakcijos trukmės įtaka ekstrahavimo procesui ... 30
3.1.4. Ekstrakcijos ciklų įtaka ekstrakcijos procesui ... 31
3.2. Augalinės žaliavos smulkumo įtaka ultragarsinės ekstrakcijos procesui ... 32
3.3. Ekstrakcija maceracijos metodu ... 34
3.4. Kokybinis fenolinių junginių įvertinimas ... 35
3.5. Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas ... 36
3.6. Flavonoidų kiekybinis įvertinimas skirtingų veislių žaliavose... 38
3.7. Fenolinių rūgščių kiekybinis įvertinimas skirtingų veislių žaliavose ... 39
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 43
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
GI – glikemijos indeksas; II – insulinemijos indeksas; HI – hidrolizės indeksas;
IC50 – 50 proc. maksimalios vaisto koncentracijos;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
ALDH2 – aldehido dehidrogenazės forma, kuri atsakinga už acetaldehido skaidymą į acetatą; IR – infraraudonieji spinduliai.
SANTRAUKA
L. Šopagos magistro baigiamasis darbas „Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas bei fenolinių junginių įvertinimas sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) žaliavoje“. Mokslinis vadovas doc.dr. Konradas Vitkevičius. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: Fagopyrum esculentum Moench, ekstrakcija, optimizavimas, fenoliniai junginiai, ESC.
Tyrimo objektas – sėjamojo grikio skirtingos augalo dalys: žolė, lapai, žiedynai, stiebai, atolas. Tyrimo metu atliekamas fenolinių junginių įvertinimas.
Tyrimo tikslas – optimizuoti ekstrakcijos sąlygas rutino įvertinimui bei atlikti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę analizę skirtingose sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) augalo dalyse.
Metodai: Ekstrakcijos proceso optimizavimas atliekamas įvertinant skirtingų tirpiklių (metanolio, etanolio, acetono) koncentracijų, ekstrakcijos ultragarsu trukmės, temperatūros, susmulkintos žaliavos dalelių dydžio, ciklų įtaką rutino ekstrakcijos procesui. Fenolinių junginių kokybiniui ir kiekybiniui identifikavimui naudojamas ESC metodas.
Rezultatai: Optimizavus ekstrakcijos procesą nustatyta, kad efektyviausias ekstrakcija atliekama naudojant 0,45-0,125 mm dalelių dydžio žaliavą, 60 proc.(v/v) etanolio tirpalą, 45°C temperatūroje 15 min veikiant ultragarsu, procesą atliekant per tris ciklus. Rutinas yra pagrindinis junginys visose augalo dalyse. Didžiausias rutino kiekis nustatytas lapų žaliavose „VB Nojai“, (9,05±0,31 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (5,43±0,26 proc.). Mažiausias rutino kiekis nustatytas stiebuose „VB Nojai“ (1,32±0,33 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,38±0,08 proc.). Didžiausias kvercitrino kiekis nustatytas žiedynuose „VB Nojai“ (1,50±0,05 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (1,45±0,06 proc.). Lapuose ir stiebuose šis flavonoidas nebuvo nustatytas. Kvercetino didžiausias kiekis nustatytas lapuose „VB Nojai“ (0,04±0,008 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,04±0,02 proc.), o žieduose nebuvo identifikuotas. Neochlorogeno rūgšties daugiausiai nustatyta lapuose „VB Nojai“ (0,25±0,01 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,1±0,009proc.), o žiedynuose nebuvo identifikuota. Chlorogeno rūgšties didžiausias kiekis nustatytas žiedynuose „VB Nojai“ (0,54±0,03 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,40±0,21 proc.), o lapuose nenustatyta.
SUMMARY
L.Šopaga master‘s thesis „Extraction conditions optimization and phenolic compounds evaluation in raw buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) material“, scientific manager doc.dr. Konradas Vitkevičius. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas
Keywords: Fagopyrum esculentum Moench, extraction, optimization, phenolic compounds, HPLC analysis
The object of the research – Different plant parts of buckwheat: herb, leaves, flowers, stems, fog. Performing phenolic compound analysis.
The aim – Extraction conditions optimization of rutin evaluation and qualitative and quantitative phenolic compounds evaluation in raw buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) material.
Methods: Extraction process optimization is performed by evaluating different solvent (methanol, ethanol, acetone) concentration, extraction by ultrasound duration, temperature and cycle impact to process of rutin extraction from maced raw material particles. HPLC method is used for phenolic compound qualitative and quantitative identification.
Results: Extraction process optimization revealed that the most effective extraction is performed using 0,45-0,125 mm size raw material particles, 60 percent (v/v) ethanol solution, 15 min. ultrasound exposure in 45°C temperature, process splitting in to three cycles. Rutin was found to be main compound in all parts of the plant. Highest quantity of rutin was found in leaves material„VB Nojai“, (9,05±0,31 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (5,43±0,26 proc.). Lowest rutin quantity found in stems „VB Nojai“ (1,32±0,33 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,38±0,08 proc.). Highest kvercitrin quantity was found in flowers „VB Nojai“ (1,50±0,05 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (1,45±0,06 proc.). This flavonoid was not found in leaves and stems. Highest quantity of quercetin was found in leaves „VB Nojai“ (0,04±0,008 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,04±0,02 proc.), but was not identified in flowers. Neochlorogenic acid acid was mostly identified in leaves „VB Nojai“ (0,25±0,01 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,1±0,009proc.), but was not identified in flowers. Highest quantity of chlorogenic acid was identified in flowers „VB Nojai“ (0,54±0,03 proc.), „Belaruskij determinant-1“ (0,40±0,21 proc.), but was not identified in leaves.
The research was funded by a grant (No.SVE – 02/2014) from the Research Coucil of Lithuania.
ĮVADAS
Pastaruoju metu ieškoma junginių, kurie galėtų pakeisti sintetinius antioksidantus. Teigiama, kad šiam tikslui galima naudoti fenolinius junginius, kurie išekstrahuoti iš augalinių žaliavų. Dėl šios priežasties augalai, kurie turi perspektyvą kaupti didesnius fenolinių junginių kiekius, šiuo metu yra daugelio mokslinikų tyrimo objektas.
Sėjamasis grikis auginamas daugelyje pasaulio šalių, nes lengvai prisitaiko prie nepalankių klimato sąlygų ir geba augti įvairaus pobūdžio dirvožemiuose[1].Pastaruoju metu grikių pasėlių plotai Lietuvoje kasmet didėjo nuo 4,4 tūkst. ha 1997 m. iki 38,005 tūkst. ha 2014 m.[2,3]. Fagopyrum
esculentum Moench Lietuvoje auginamas tik dėl sėklų, kurios naudojams maisto pramonėje bei pašarų
gamyboje. Tuo tarpu sėjamojo grikio antžeminė biomasė (žolė) nenaudojama, nors žydėjimo laikotarpiu fenolinių junginių yra gerokai daugiau nei sėklose.
Nedidelės apimties įvairūs grikių žaliavos cheminės sudėties tyrimai buvo atliekami užsienio šalyse. Daugiausiai tyrimų sėjamojo grikio žaliavos yra publikuota Azijos, o ne Europos regione. Lietuvos agroklimatinėmis sąlygomis augintos žaliavos fenolinių junginių kaupimo ypatumai tyrinėti nebuvo.
Mokslinėje literatūroje teigiama, kad rutinas yra pagrindinis fenolinis junginys visose augalo dalyse. Dėl šios priežasties ekstrakcijos proceso optimizavimui pagrindiniu žymeniu pasirinktas rutinas [4]. Ekstrakcijos proceso optimizavimas, kurio metu įvertinami įvairūs faktoriai: ekstrakcijos metodas, ekstrahentas ir jo koncentracija, temperatūra, trukmė, dalelių dydis, yra reikšmingi, nes nuo šių faktorių priklauso išekstrahuojamo rutino kiekis ir tai ypač svarbu norint atlikti tikslius fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimus sėjamojo grikio žaliavose.
Sėjamajame grikyje nustatyti fenoliniai junginiai pasižymi antioksidantiniu, antialerginiu, antivirusiniu, priešuždegiminiu, antikarcinogeniniu poveikiu. Mažina riziką susirgti onkologine liga, slopina vėžines ląsteles, mažina aterosklerozės riziką, stiprina kapiliarų sieneles, pasižymi neuroprotekciniu, antidiabetiniu poveikiu, apsaugo nuo opų susidarymo [5-13].
Šio tyrimo metu siekta ne tik optimizuoti ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių įvertinimui, bet ir atlikti kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių analizę skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse. Įvertinus gautus rezultatus galima nustatyti skirtingų augalo dalių potencialų panaudojimą kaip fenolinių junginių šaltinį. Įvertinus gautus duomenis, ateityje bus galima gaminti ekstraktus, skirtus vaistinių preparatų gamybai bei maisto ir kosmetikos pramonei.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Optimizuoti ekstrakcijos sąlygas rutino įvertinimui bei atlikti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę analizę skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse.
Uždaviniai:
1) Optimizuoti ekstrakcijos ultragarsu sąlygas, įvertinant skirtingų tirpiklių (metanolio, etanolio, acetono) koncentracijų, ekstrakcijos ultragarsu trukmės, temperatūros, ciklų įtaką įvertinat rutino kiekį augalinėje žaliavoje.
2) Nustatyti augalinės žaliavos smulkumo įtaką ultragarsinės ekstrakcijos procesui, naudojant skirtingas augalo dalis: žolę, lapus, žiedynus, stiebus.
3) Įvertinti skirtingų tirpiklių, koncentracijų įtaką fenolinių junginių kiekiui augalinėje žaliavoje, taikant maceracijos metodą.
4) Atlikti kokybinį ir kiekybinį fenolinių junginių įvertinimą efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu. Palyginti skirtingų veislių grikių žolės, atolo, lapų, žiedų ir stiebų žaliavose, esančių fenolinių junginių kiekį.
1.LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) apibūdinimas
Sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum Moench) (1 pav.) priklauso grikių (Fagopyrum
Mill) genčiai, rūgtinių (Polygonaceae) šeimai. Sėjamasis grikis mokslinėje literatūroje gali būti
vadinamas šiais pavadinimais: Polygonum fagopyrum L., Fagopyrum fagopyrum (L.) Karst.,
Fagopyrum vulgare Hill, Fagopyrum sagittatum Gilib. Angliškas grikių pavadinimas buckwheat
(bukmedžio kviečiai), nes grikių sėklos panašios į mažus bukmedžio riešutus [14,15]. Grikių gentį sudaro 19 skirtingų grikių rūšių, kurios skirstomos į dvi grupes: vienmečiai (Fagopyrum. esculentum
Moench ir Fagopyrum. tataricum L) ir daugiamečiai (Fagopyrum cymosum Meissn, Fagopyrum suffruticosum Fr. Schmidt). Agrokultūriniu būdu auginamos tik dvi grikių rūšys: Fagopyrum esculentum ir Fagopyrum tataricum, o likusios yra laukinės floros dalis [16,17].
1 pav. Sėjamasis grikis [18,19]
1.2. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai
požymiai
Sėjamasis grikis - vienmetis žolinis augalas, užaugantis iki 70 cm aukščio. Stiebas status, cilindro formos, tuščiaviduris, briaunotas, rudai žalias arba rusvas, viršūnėje labiau šakojasi. Šaknis - liemeninė, prie šakniastiebio labai šakota. Lapai tamsiai žali, apatinė pusė šviesesnė, minkšti, pražanginiai, trikampiai, su strėlišku pagrindu ir plėveline makštimi ties apatinių lapų lapkočio pagrindu. Lapų ilgis iki 11 cm, plotis iki 7 cm, o lapkotis 1,5-5,0 cm ilgio. Viršutiniai lapai bekočiai. Prielapiai sudaro makštį, kuri gaubia apatinę stiebo tarpubamblio dalį. Žiedyno kekės forma trumpa ir
suspausta, turinti ilgą vaiskotį, žiedai maži baltos arba rausvos spalvos, 4 mm skersmens. Žydėti pradeda 4-6 savaitę po sėjos [20]. Vaisius - tribriaunės sėklos, 2-4 mm ilgio. Vaisius gali būti nuo sidabriškai pilkos iki rudos ar net juodos spalvos [14,20,21,22]. Totorinis grikis nuo sėjamojo grikio skiriasi šiais požymiais: siauresni lapai, daugiau šaknų, mažesni žiedai, subrandina daugiau sėklų [23].
1.3. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas
Sėjamasis grikis vienas iš seniausių sukultūrintų augalų Azijoje [20]. Natūraliai augančių augimviečių randama Kinijoje, Sibire, Mongolijoje, Mandžiūrijoje [1]. Sėjamasis grikis pradėtas kultivuoti 1000 metų prieš Kristų Kinijoje. XVII-XIX a. buvo vienas iš pagrindinių maisto šaltinių Azijoje, bet XX a. juos pakeitė kviečiai dėl didesnio derlingumo [20]. Europoje pradėti auginti apie XVIII a. Tame pačiame amžiuje pradėti auginti ir Lietuvoje [1]. Šiuo metu auginami visame pasaulyje, daugiausiai šiauriniame pusrutulyje. Didžiausi grikių žaliavos tiekėjai: Kinija, Rusija, Indija, Ukraina, Kanada, JAV, Kazachtanas, Lenkija [16,24]. Lietuvoje sėjamasis grikis daugiaisiai auginamas pietryčių Lietuvoje mažo našumo žemėse. 2014 m. Lietuvoje deklaruotas grikių pasėlių plotas 38,005 tūkst. ha, o 1997 m. buvo auginama tik 4,4 tūkst. ha [1,3]. Vienmečiai grikiai lengvai prisitaiko prie nepalankių klimato sąlygų ir geba augti įvairaus pobūdžio dirvožemiuose [1]. Sėjamojo grikio populiarumas pasaulyje didėja, nes vis daugiau dėmesio skiriamia sveikai mitybai, o maistinė sėklų vertė yra daug didesne nei kitų grūdinių kultūrų.
1.4. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) cheminė sudėtis
skirtingose augalo dalyse
Susisteminus literatūros duomenis, įvertinta sėjamojo grikio cheminė sudėtis, skirtingose augalo dalyse: žolėje, lapuose, žieduose, stiebuose, sėklose.
Grikių sėklos dažniausiai tiriama augalo dalis. Sėklose nėra gliutenų, kaupia 11,7-18,9 proc. baltymų, [10,24,25]. Riebalai sudaro nuo 1,3 proc. iki 4,0 proc. sėklų masės. Maistinių skaidulų sėklose yra nuo 12,7 proc. iki 17,8 proc., taninų nuo 1,54 proc. iki 1.76 proc., angliavandenių mažiausiais kiekis - 48,7 proc. Svarbiausi mineraliniai elementai: Ca 18mg/100g, , Mg 231 mg/100g, P 347 mg/100g, K 460 mg/100g [26]. Grikių sėklose gausu vitaminų: B1 (tiaminas 0.101 mg/100g), B2 (riboflavino 0.425 mg/100g,), B3 (niacino 7.020 mg/100g), B5 (pantoteno rūgšties, 1.233 mg/100g,) B6 (piridoksino 0.210 mg/100g), E (takoferolio 54,6mg/100g, kuriame α takoferolis 70,6 proc., β takoferolis 3,1proc., γ takoferolis 19.5 proc., δ takoferolis 6.7 proc.) [24,25,27]. Kaupiamos fenolinės
rūgštys (p-hidroksibenzoinė, p-kumarino, o-kumarino, kavos, siringino, chlorogeno, galo, vanilino, ferulino rūgštys) [24,27,28] Viena svarbiausių biologiškai aktyvių junginių grupė yra flavonoidai. Identifikuoti šios grupės junginiai: rutinas (0,002.-1 proc.), kvercetinas, kvercitrinas (0.01-0.05 proc.), orientinas, hiperozidas, viteksinas, izoviteksinas, izoorientinas, katechinas, (-) epikatechinas, (+) katechino-7-O-β-D-gliukopiranozidas, (-) epikatechino-3-O-(3,4-di-O-metil) galatas, (-) epikatechino galatas, kampferolio-3-O-rutinozidas, kvercetino-3-O-rutinozido-3'-O-β-gliukopiranozidas, 2-hidroksi-3-O-β-D-gliukopiranozilo benzoinė rūgštis, epikatechinas, epikatechino-(4,8)-epikatechino-O-(3,4-dimetil)galatas, epikatechino-(4,6)epikatechinas [10,27,28,29,30,31,32,33,34,35].
1 lentelė. Sėjamojo grikio žolėje, lapuose, žieduose ir stiebuose identifikuoti biologiškai aktyvūs junginiai [4,10,12,35,36]
žolėje lapuose žieduose stiebuose Fenolinės rūgštys: Chlorogeno Neochlorogeno P-kumarino Ferulino Galo P-hidroksibenzoinė Protokechino 4,09-5,57 proc. + + + + + + 0,01-0,03 proc. 0.3 proc. n/d n/d n/d n/d n/d 0,25 proc. 0,025 proc. + + n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 0,02 proc. n/d n/d Fagopirinai n/d 0,05 proc. 0,08 proc. n/d Taninai n/d 1,0 proc. 5,9 proc. 0,1 proc. Flavonoidai: Rutinas Kvercetinas Kvercitrinas Hiperozidas 19,54-22,31 proc. + n/d 0,18-0,37 proc. 0,27 proc.-10,5 proc. 0,002 proc. 0,02-0,03 proc. 0,005-0,015 proc. 7,1-12,0 proc. 0,005 proc. 0,35 proc. 0,04 proc. 0,5-3,0 proc. 0,002 proc. + n/d n/d-nėra duomenų
Cheminės sudėties skirtumus augalo dalyse lemia augimo sąlygos, veislės, žaliavos rinkimo laikotarpis [16]. Atliekant tyrimus įvairiais vegetacijos laikotarpiais, tiriant skirtingas veisles, siekiama išsiaiškinti biologiškai aktyvių junginių kaupimo ypatumus.
1.5. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) panaudojimas
Sėjamsis grikis dažnai priskiriamas prie grūdinių kultūrų, nes naudojimas ir auginimo technologija artima javams [16]. Kaip žaliava dažniausiai naudojamos sėklos, iš kurių gaminamos kruopos ir miltai, o tai yra žaliava košės, makaronų, duonos, blynų ir kitų maisto produktų gamybai. Japonijoje populiarus patiekalas makornai „soba“ gaminamas iš grikių arba kviečių ir grikių miltų mišinio [14]. Taip pat įvarios augalo dalys naudojamas kaip pašaras gyvuliams ir naminiams
paukščiams. Lukštai naudojami pagalvių užpildui gaminti. Gali būti auginami kaip žalioji trąša ar nektaro šaltinis bitėms [14]. Medicinoje plačiai vartojamas iš žydinčio augalo viršūnėlių išgaunamas rutinas [22]. Pastaruoju metu ieškoma junginių, kurie galėtų pakeisti sintenius antioksidantus: butilhidroksianizolį (BHA), butilintą hidroksitolueną (BHT), butilhidrokvinoną (TBHQ), nes daugėja įrodymų, kad jie sukelia neigiamą poveikį sveikatai. Manoma, kad šiam tikslui galima naudoti fenolinius junginius, kurie būtų išekstrahuoti iš augalinių žaliavų [37]. Atliekami in vivo ir in vitro tyrimai, kuriais norima įrodyti farmakologinį ir fiziologinį poveikį organizmui vartojant biologiškai aktyvius junginius, išgaunamus iš sėjamojo grikio.
1.6. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) pritaikymas liaudies
medicinoje
Liaudies medicinoje vartojami grikių žiedai, lapai ir sijoti miltai. Grikių žiedų užpilas gaminamas iš 40 g žaliavos, ant kurios užpilamas vienas litras vandens. Šis užpilas vartojamas kosuliui gydyti. Grikių žiedų ir lapų užpilas gaminamas taip: 15 g mišinio užpilama puse litro verdančio vandens ir dvi valandas laikomas sandariai uždarytame inde. Užpilas perkošiamas ir geriama po pusę stiklinės 3-5 kartus per dieną sergant ateroskleroze ir hipertonija. Sausi, išsijoti grikių miltai vartojami pabarstams ir minkštinantiems kompresams. Lapų nuoviras, virtas geležininiuose induose, skiriamas pacientams sergantiems anemija. Taip pat lapų nuoviras vartojamas vidurių užkietėjimui gydyti [38].
1.7. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) farmakologinis
poveikis organizmui
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. B.K Son ir kt. (2008) atliko tyrimą, kurio metu
keturias savaites žiurkėms buvo duodami produktai, pagaminti iš grikių. Grikių produktus vartojančią grupę, palyginus su kontroline grupe, nustatytas bendrojo ir mažo tankio lipoproteinų „blogojo cholesterolio“ sumažėjimas bei padidėjęs didelio tankio lipoproteinų „gerojo cholesterolio“ kiekis. Taip pat reikšmingai padidėjo aortos diametras [39]. Brandon T. ir kt. (2007) in vitro tyrimuose nustatė, kad grikių baltymai turi stiprų gebėjimą susijungti cholesteroliu. Jie sumažina cholesterolio absorbciją žarnyne iki 47 proc. [40]. Japonai H.Tomotake ir kt. (2007) tyrinėdami žiurkes nustatė, kad vartojant grikių baltymus bendrojo cholesterolio kiekį galima sumažinti nuo 25 proc. iki 32 proc. [41].
Cukrinio diabeto gydymas. Pagal Kawa, Taylor ir Przybylski (2003) atliktą su žiurkėmis
serume. Žiurkės buvo dirbtinai susargdintos pirmo tipo cukriniu diabetu. Nustatyta, jei žiurkėms per parą duodama grikių ekstrako, kuriame yra 10-20 mg/kg D-chrio-inozitolio, gliukozės koncentracija kraujo serume po 90-120 min sumažėja 12-19 proc. [42]. Skrabanja ir kt. (2001) įrodė, kad vartojant grikių košę ar baltą duoną, kurioje yra 50 proc. grikių miltų ar kruopų, reikšmingai sumažėja gliukozės koncentracija kraujyje ir insulino atsakas lyginant su balta duona. Nustatyti glikemijos (GI) ir insulinemijos (II) indeksai grikių košėje (GI=61 ir II=53) ir grikių duonoje (GI=66 ir II=74). Taip pat buvo apskaičiuotas hidrolizės indeksas (HI) košėje 50, duonoje (HI=54), o makaronuose, pagamintuose iš kvietinių miltų, (HI=71). Pacientams, kurie serga cukriniu diabetu, rekomenduojama kvietinius gaminius pakeisti grikių produktais, kurie pasižymi mažesniu glikeminiu ir hidrolizės indeksu [43].
Antimikrobinis aktyvumas ir onkologinių ligų gydymas. Iš grikių sėklų išgautas, išgrynintas
baltymas, kurio molekulinė masė 4kDa. Šis baltymas slopina Fusarium oxysporum (50 proc. maksimalios vaisto koncentracijos (IC50=35 µm)) ir Mycosphaerella arachidicola (IC50=40 µm)
grybelių augimą ir ŽIV-1 (žmogaus imunodeficito pirmąjį viruso tipą) atvirkštinę transkriptazę (IC50=5,5 µm). Taip pat slopinama proliferaciją Hep G2 (hepatomos IC50=33µm), L1210 (leukemijos
IC50=4µm), MCF-7 (krūties vėžioIC50=25µm), WRL 68 (embriono kepenų IC50=37µm) ląstelių. Min
Shena ir kt (2008) Įrodė, kad vartojant grikių produktus, sumažėja rizika susirgti plaučių vėžiu [44].
Prebiotinis poveikis. 2003 m. atlikus tyrimą su žiurkėmis įrodyta, kad 30 dienų vartojant
produktus, pagamintus iš grikių, ypač padidėja žarnyne esančių pieno rūgšties bakterijų: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium spp ir Bifidobacterium lactis kiekis [45].
1.8. Fenoliniai junginiai ir jų poveikis organizmui
Fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami remiantis jų kilme, biologinėmis savybėmis, chemine struktūra [46]. Dažniausiai fenoliniai junginiai klasifikuojami pagal anglies atomų skaičių molekulėje. Klasifikacija pateikiama 2 lentelėje.
2 lentelė. Fenolinių junginių klasifikacija augaluose pagal anglies atomų struktūrą [47]
Klasė Struktūra
Paprastieji fenoliai, benzokvinonai C6
Hidroksibenzoinė rūgštys C6-C2
Acetofenonai, fenilacto rūgštys C6-C2
Hidroksicinamo rūgšties, fenilpropanoidai C6-C3
Naptochinonai C6-C4
Ksantonai C6-C1-C6
Flavonoidai, izoflavonoidai C6-C3-C6
Lignanai, neolignanai (C6-C3)2
Biflavanoidai (C6-C3-C6)2
Ligninai (C6-C3)n
Kondensuoti taninai (C6-C3-C6)n
Fenolinės rūgštys ir flavonoidai yra svarbiausi fenoliniai junginiai sėjamajame grikyje. Jie vadinami biologinio atsako modifikatoriais, nes sugeba keisti organizmo atsaką į įvairius veiksnius: alergenus, kancerogenus, virusus. Pasižymi antioksidantinėmis, antialerginėmis, antivirusinėmis, priešuždegiminėmis, antikarcinogeninėmis, širdies ir kraujagyslių sistemą apsaugančiomis savybėmis, apsaugo organizmą nuo laisvųjų radikalų žalos [5-8].
Fagopyrum esculentum žaliavoje svarbiausias fenolinių junginių atstovas - rutinas, apsaugo
augalą nuo žalingos ultravioletinės spinduliuotės poveikio ir veikia kaip apsaugos priemonė nuo įvairių ligų. Pagrindinis rutino veikimo mechanizmas žmogaus organizme nėra žinomas, todėl intensyviai vykdomi in vivo ir in vitro tyrimai. Tyrimuose nustatyta, kad šis flavonoidas pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, mažina aterosklerozės riziką, sumažina kraujagyslių trapumą, pasižymi neuroprotekciniu, antidiabetiniu poveikiu. Naudojamas hormonų terapijoje, hemoragijų ir hipertenzijos gydymui, taip pat turi antiedeminį poveikį [9,10].
Antioksidantinis poveikis, kurį sukelia flavonoidai, buvo įrodytas daugelyje mokslinių tyrimų.
Ting Sun ir Chi-Tang Ho (2005), I. Hinneburg ir kiti (2005), G.E Inglett ir kiti (2010) tyrinėjo sejamojo grikio ekstraktų antioksidantinį poveikį [11-13]. Laisvieji radikalai (pvz.: hidroksilo radikalai, peroksinitritas, superoksidai, vandenilio peroksidas, singletinis deguonis) organizme susidaro veikiant aplinkos veiksniams bei sutrikus balansui tarp laisvųjų radikalų susidarymo ir antioksidantinių oraganizmo sistemų. Susidarę dideli kiekiai laisvųjų radikalų pažeidžia ląsteles, įvyksta oksidacinis stresas. Flavonoidai slopina laisvųjų radikalų susidarymą, neutralizuoja juos, skatina natūralius antioksidantinius procesus. Saugo ląstelės membranos lipidus nuo peroksidacijos. Tai prevencinė priemonė įvairioms patalogijoms ir naudojama terapiniams tikslams gydant ligas, kurias sukelia antioksidantinis stresas [48]. Su antioksidantiniu poveikiu taip pat glaudžiai susiję šie poveikiai: mažėja rizika susirgti onkologine liga, slopina vėžines ląsteles, mažina aterosklerozės riziką, stiprina kapiliarų sieneles, pasižymi neuroprotekciniu, antidiabetiniu poveikiu, apsaugo nuo opų susidarymo [6,9,10].
Poveikis širdies ir krujagyslių sistemoms. Pietų Korėjos mokslininkai Dae Won Kim ir kt.
(2009) atliko eksperimentą, kurio metu buvo tiriamas grikių ekstraktų, kuriuose kiekybiškai įvertintas fenolinių junginių kiekis, poveikis arterinio kraujo spaudimui žiurkėms. Jos suskirstomos į šešias grupes po dešimt tiriamųjų. Pirmajai grupei skirtas vanduo, antrajai per parą duodama 300 mg/kg grikių ekstrakto, trečiajai – 600 mg/kg grikių ekstrakto, ketvirtajai – 300 mg/kg daigintų grikių ekstrakto, penktajai – 600 mg/kg daigintų grikių ekstrakto, o šeštajai – 2,5mg/kg kaptoprilio.
Eksperimentas vykdomas 5 savaites, o rezultatai įvertinami kiekvieną savaitę. Ketvirtą savaitę įvertinus rezultatus nustatyta, kad vartojant 300 mg/kg grikių ekstrakto reikšmingų pokyčių nebuvo. Per parą skiriant 600 mg/kg grikių ekstrakto sistolinis kraujo spaudimas sumažėjo 44 mmHg, o vartojant 600 mg/kg daigintų grikių ekstrakto sistolinis kraujo spaudimas sumažėjo 53 mmHg, tuo tarpu vartojant kaptoprilį pasiektas tik 41 mmHg sistolinio kraujo spaudimo sumažėjimas. Po keturių savaičių gydymo pradeda mažėti ir penktą savaitę sumažėja oksidacinė žala aortos endodelio ląstelėms, nes jos apsaugomos nuo oksidacinio streso dėl sumažėjusių nitrotirosino susidarymo [5].
Taip pat kituose tyrimuose nustatyta, kad flavonoidai slopina trombocitų agregaciją, padeda išvengti ir gydo širdies ir kraugyslių sistemos ligas ir taip mažina miokardo infarkto riziką, veikia kaip prevencinė priemonė insulto profilaktikai [6].
Etanolio neurotoksinio poveikio mažinimas. Korėjos mokslininkai S. Kibbeum ir kiti (2014)
tyrinėjo rutino galimybes sumažinti etanolio toksiškumą neuronų ląstelėms. Nustatyta, kad rutinas sumažina alkoholio sukeltą neurotoksinį poveikį, nes aktyvina aldehido dehidrogenazę (ALDH2). Suaktyvinus ALDH2 skatinama detoksikacija, kurios metu toksiškas acetaldehidas oksidacijos metu paverčiama į netoksinę acto rūgštį [49].
Smegenų išemijos gydymas. Atliktas tyrimas, kuriame tirtas grikiuose esančių polifenolinių
junginių poveikis išeminei smegenų ligai. Tyrimas atliktas su žiurkėmis, kurios buvo susargdintos šia liga. Joms per parą buvo duodama 600 mg/kg polifenolinių junginių dozė ir gydymas tęsiamas 21 dieną. Nustatytas erdvinių atminties sutrikimų pagerėjimas, nes slopinamas glutamato išsiskyrimas ir NOx gamyba [50].
Priešuždegiminis poveikis. Šis poveikis tirtas artritu sergantiems žiurkių patinėliams. Gydymo
metu 21 dieną per parą buvo duodama 25 mg/kg ekstrakto. Gydymo efektyvumas vertintas biocheminiais ir histologiniais metodais, o efektyvumas lygintas su kontroline grupe. Nustatytas laisvųjų radikalų mažėjimas, kurie susidaro uždegimo metu lątelėse, ir taip įrodytas priešuždegiminis bei antioksidantinis poveikis reumatoidiniui artritui gydyti [7].
Atialerginis poveikis. Siuo-Ru ir kiti (2012) Taivano mokslininkai atlikdami in vitro ir in vivo
tyrimus nustatė, kad grikių ekstraktas (pagamintas naudojant 75 proc. (v/v) etanolio tirpalo) ir rutinas reguliuoja imuninį atsaką mažindami Th2 (ląstelės vyraujančios I tipo alerginėse reakcijose) išskiriamą IL-4 (interleukino 4) kiekį. Tai įrodo, kad rutinas pasižymi antialerginėmis savybėmis ir gali būti naudojamas alergijai gydyti [8].
Kiti poveikiai. Mityba, kurioje gausu fenolinių junginių, mažina riziką susirgti onkologine
liga, slopina pakitusių ląstelių dalijimasį. Mažina aterosklerozės riziką, kraujagyslių trapumą, pasižymi neuroprotekciniu, antidiabetiniu poveikiu [6,51].
1.9. Fenolinių junginių ekstrakcijos metodai
Ekstrakcija – tai procesas, kurio metu vyksta koncentruotos medžiagos išgavimas iš žaliavos. Tradiciniai ekstrakcijos metodai: maceracija, perkoliacija, Soksleto, kaitinimas su grįžtamuoju šaldytuvu – trunka keletą valandų ar net dienų, sunaudojami milžiniški kiekiai neekologiškų tirpiklių ir šiems procesams reikalingi didžiuliai kiekiai energijos. Sunaudojus daug ekstrahentų, sudėtinga pagaminti sausą ekstraktą, ypač jei yra termolabilių junginių, nes junginio degradacijos produktai gali užteršti sausą ekstraktą. Nauji ekstrakcijos metodai: IR spindulių, superkritinių skysčių, slėginė skysčių, mikrobangų, mechanocheminė, ultragarso – trunka trumpiau, sunaudojama keletą kartų mažiau tirpiklių ir energijos [52].
Maceracija – tai vienas seniausių ekstraktų ruošimo būdas. Šiam procesui naudojama
nesmulkinta arba malta žaliava, ant kurios užpiltas ekstrahentas. Laikoma tamsioje vietoje, kambario temperatūroje, kartkartėmis supurtoma. Ekstrakcijos trukmė mažiausiai 3 paros, nors gali trukti ir ilgiau. Tai vienas neefektyviausias ir ekonominiu požiūriu nepriimtiniausias ekstrakcijos procesas, kurio trukmė labai ilga, todėl dažniausiai taikomi naujesni metodai [52].
Šildymo ekstrakcija su grįžtamuojo šaldytuvu. Vienas iš dažniausiai naudojamų ekstrakcijos
metodų, kurio metu vyksta ekstrahento, kuriame yra augalinė žaliava, kaitinimas ir susidariusių garų šaldymas grįžtamajame šaldytuve. Išgaunamo rutino kiekis priklauso nuo ekstrahento koncentracijos, temperatūros, ekstrahento ir žaliavos santykio, ekstrakcijos ciklų [53,54]. Taikant šią metodiką išgaunamas rutino kiekis gali sumažėti, nes aukštoje temperatūroje intensyveja jonizacijos, hidrolizės, oksidacijos procesai [55]. Labai svarbus tinkamo ekstrahento parinkimas. Tinkamiausi ekstrakcijai - metanolis arba etanolis. Optimaliausia naudoti etanolį, nes jis netoksiškas ir ekonomiškai tinkamiausias variantas [56]. Teoriškai ilgas ekstrakcijos laikas turėtų didinti rutino išeigą, tačiau rutino koncentracija proporcingai mažėja ilgėjat ekstrahavimo laikui. Išgaunant rutiną šiuo metodu, sunaudojami dideli ekstrahento kiekiai, procesas nėra ekologiškas [57]. Šiai ekstrakcijai naudojami nesudėtingi prietaisai, paprasta ją atlikti [53].
Ekstrakcija mikrobangomis – tai modernus ekstrakcijos procesas, turintis didelę
perspektyvą. Mikrobangos – tai elektromagnetinės spinduliuotės forma, skleidžianti 0,3-300 GHz dažnio bangas. Kad būtų išvengiama radijo ryšio trikdžių, buitinės ir pramoninės mikrobangų krosnelės dažniausiai skleidžia 2.45 GHz dažnio bangas [58]. Vienas iš svarbiausių kriterijų, norint gauti efektyvų ekstrakcijos procesą, tinkamas tirpiklio pasirinkimas, atsižvelgiant į dielektrinį koeficientą ir išsklaidymo faktorių. Nepoliniai tirpikliai pasižymi maža dielektrinė skvarba, todėl veikiami mikrobangomis jie nešyla ir tai ypač tinka eterinių aliejų ekstrakcijai, nes šildoma tik augalinę žaliavą, o tirpiklis išlieka vėsus [58,59]. Mažos dielektrinės skvarbos tirpiklius naudojant fenolinių junginių ekstrakcijai būtina pridėti polinių medžiagų optimizuojant ekstrakcijos procesą.
Polinuose tirpikliuose aktyviau vyksta mikrobangų absorbcija ir mikrobangos efektyviau paverčiamos į šiluminę energiją. Vanduo turi aukštesnę dielektrinę konstantą nei metanolis ir etanolis, bet ekstrakcijai efektyviausia naudoti vandens ir etanolio mišinį [58,60]. Norint optimizuoti ekstrakcijos sąlygas, būtina parinkti efektyviausią mikrobangų galią. Rutino ekstrakcijos efektyvumas didėja didinat mikrobangų galią nuo 100 W iki 385 W, o padidinus nuo 385 W iki 750 W efektyvumas mažėja. Optimaliausias švitinimas laikas mikrobangomis 10-20 min [62]. Mikrobangų ekstrakcija atliekama per 6 min yra efektyvesnė už šias ekstracijas: 60 min ekstrakciją ultragarsu, 24 h maceraciją ir 60 min ekstrakciją šildant su grįžtamuoju šaldytuvu. Pastarojo metodo efektyvumą galima paaiškinti
tuo, kad mikrobangos vienodai šildo visą eksrtrahuojamą mišinį vienu metu, todėl sukeliamas greitas temperatūros padidėjimas ląstelės viduje. Padidėjus temperatūrai suardomos ląstelių sieneles ir ekstrahuojamos medžiagos lengviau patenka į ekstrahentą. Dėl šių priežasčių trumpėja ekstrakcijos trukmė, efektyviai naudojama energija, paprasta kontroliuoti ekstrakcijos temperatatūrą [58,60,61].
Infraraudonųjų spindulių (IR) ekstrakcija – procesas, kurio metu naudojama IR energija, kuri
tiesiogiai šildo tiriamąjį mėginį [63,64]. Norint pasiekti ekstrahavimo efektyvumą, kuris, veikiant IR spiduliais, gaunamas per 6 min, tiriamąjį bandinį tradiciniu būdu reikėtų šildyti 3 val. [65]. Didelis efektyvumas pasiekiamas suderinus skleidžiamų IR spindulių ilgį su tiriamojo mėginio absorbcija [63]. Tai vienas iš naujausių ekstrakcijos metodų, kuris pritaikytas biologiškai aktyviems junginiams išgauti. Pastarasis metodas turi didelę perspektyvą greitam biologiškai aktyvių junginių nustatymui. Šios ekstrakcijos efektyvumas mažesnis lyginant su eksrtakcija mikrobangomis, bet paprasčiau ir pigiau ją atlikti, išvengiama neigiamo mikrobangų poveikio [63,64,66].
Mechanocheminė ekstrakcija – tai vienas iš naujausių ir ekologiškiausių ekstrakcijos procesų,
kuriame vienu metu naudojama mechaninė jėga ir cheminių reakcijų derinys. Šiame procese nenaudojami organiniai tirpikliai, o vienintelis naudojamas ekstrahentas – vanduo, kuriame galima ištirpinti 12,5g/100ml rutino. Ekstrakcijoje naudojama mechaninė jėga suardo augalinės ląstelės sieneles ir taip skatinamas rutino difuzijos procesas, o cheminių reakcijų metu, pridėjus bazinių medžiagų (natrio karbonato (Na2CO3) ir dinatrio tetraborato (Na2B4O7×10H2O)), rutinas
neutralizuojamas, paverčiamas druska ir taip padidinamas rutino tirpumas vandenyje. Optimizuojant rutino ekstrakciją, didžiausias efektyvumas pasiekiamas augalinę žaliavą malant specialiu AGO-2 malūnu 4 min kartu su Na2CO3 (15,0 proc. bendros masės) ir Na2B4O7×10H2O (1,5 proc. bendros
masės). Ekstrakcija atliekama kambario temperatūroje, ekstrahuojamų medžiagų ir ekstrahento santykis 1:25. Ekstrakcijos procesas atliekamas dviem ciklais: pirmas ciklas trunka 10 min, o antras – 5 min. Mechanocheminės ekstrakcijos pagrindiniai privalumai: visas procesas atliekamas kambario temperatūroje ir išvengiama organinių tirpiklių naudojimo, tačiau šiam procesui reikalinga įranga yra brangi [67].
Ekstrakcija ultragarsu – tai dažniausiai naudojama alternatyva tradiciniams polifenolinų
junginių ekstrakcijos procesams. Ultragarsas skleidžia bangas, kurių dažnis nuo 20 kHz iki 2000kHz. Atliekant ekstrakciją ultragarsu sunaudojami mažesni kiekiai energijos, organinių tirpiklių ir procesas trunka gerokai trumpiau už tradicinius metodus [68,69]. Ekstrakcijos metu skleidžiamas ultragarso laukas sukelia dvejopą poveikį: vyksta kavitacijos procesas ir šildymas. Kavitacijos procesas suardo augalinės ląstelės, todėl didėja tirpiklio ir augalinės žaliavos sąlyčio plotas, tirpiklis lengviau patenka į ląstelę, taip pat ultragarsas šildo ekstrahentą ir visos šios priežastys skatina difuzijos procesą. Ultragarsinės ekstrakcijos metu vanduo nenaudojamas kaip ekstrahentas, nes vandenyje ultragarsas skatina aktyvių hidrosilo radikalų susidarymą, skatinamas vandenilio peroksidas susidarymas (OH¯+OH¯→H2O2), kuris mažina ekstrakcijos efektyvumą [70,71]. Pagrindinai šios ekstrakcijos trūkumai: nevienodas ultragarsinės energijos pasiskirstymas analitėje ir dideli energijos nuostoliai ultragarso vonelėje, bet šis metodas kelis kartus efektyvesnis nei tradiciniai ekstrakcijos procesai [68,69,70,71].
1.10. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas
Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas naudojamas nuo 1964 metų. Tai
vienas iš tiksliausių ir dažniausiai naudojamų metodų kokybiniui kiekybiniui fenolinių junginių nustatymui. Pagrindinė problema, su kuria susiduriama identifikuojant flavonoidus, - metodikos specifiškumas. Dažniausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija, skirstymui naudojamos C8 ar C18 silikagelio kolonėles, kuriose gradientinė eliucija atliekama naudojant dviejų tirpiklių sistemą: naudojamas vanduo, turintis acetato ar metano buferių, ir metanolis arba acetonitrilas. Jei pagrindinis tyrimo tikslas yra atskirti ir identifikuoti iki 9 junginių, esančių mėginyje, šiam tyrimui užtenka 0,5-1 val. Norint atskirti ir identifikuoti 30-50 skirtingų junginių, tyrimas užtruks ilgiau nei dvi valandas [72].
Sėjamojo grikio žaliavose esančių fenolinių junginių nustatymui naudojami įvairios ESC metodikos, kurie pateikiami 2 lentelėje. Pagal 5 metodiką įvertintą rutino kiekį, palyginus su spektrofotometriniais metodais, nustatyta, kad gaunami rezultatai 30 – 140 proc. didesni. Spektrofotometriniais metodais gaunamiems rezultatams daro įtaką kiti fenoliniai junginiai, esantys žaliavoje. Tuo tarpu ESC metodas selektyvus ir gaunami tikslesni rezultatai ir dėl šių priežasčių ESC metodas dažniausiai naudojamas identifikuoti fenolinius junginius [36].
2 lentelė. Fenoliniams jungiams identifikuoti naudojamos ESC metodikos 1 metodika [75] 2 metodika [74] 3 metodika [10] 4 metodika [35] 5 metodika [36] Naudojama kolonėlė Diaspher C18 (250 mm ilgio, 4 mm skersmens, 5 µm dalelių dydžio) Wakosil-II 5C18 HG (150 mm ilgio, 4.6 mm skersmens, 5µm dalelių dydžio). Waters C18 (75 mm ilgio, 4,6 mm skersmens, 5μm dalelių dydžio) LiChrospher 100, RP-18 (250 mm ilgio, 4 mm skersmens, 5 µm dalelių dydžio) Lichrospher 100RP-18 (250 mm ilgio, 4 mm skersmens, 5 μm dalelių dydžio) Mobili fazė Acetonitrilas: acto rūgštis: vanduo (15:6:79) A – 2 proc. acto rūgšties tirpalas, B-acetonitrilas 2 proc. acto rūgšties tirpalas: acetonitrilas: metanolis (75:15:10) acetonitrilo ir metanolio (50:50) mišinys (A) ir 0.75 proc. H3PO4 vandeninis tirpalas (B) metanolis (A) 2 proc. acto rūgšties tirpalas (B) Tėkmės
greitis 0,7 ml/min 1,0 ml/min 1ml/min n/d 1ml/min Injekcijos tūris 20 μm 10 µl n/d n/d 20 μm Detekcijos bangos ilgis 352 nm 280 nm 350 nm 380 nm 355 nm Nustatyti junginiai Rutinas, Hiperozidas, Izokvercetinas Fenoliniai
junginiai Rutinas Rutinas Rutinas n/d nėra duomenų
Dujų chromatografija flavonoidų analizei pirmą kartą panaudota 1960 m. pradžioje.
Flavonoidų analizei pradėjus taikyti skysčių chromatografiją, dujų chromatografijos metodas naudojamas vis rečiau. Pastaruoju metu, pradėjus naudoti aukštą temperatūrą ir patobulinus derivatizacijos procesą, atnaujintas susidomėjimas šiai metodikai [72]. Derivatizacijoje dažniausiai naudojamas reagentas TMSI (trimetilsililimidazolas) [6]. Norint pagerinti junginių identifikavimą, reikia gerinti termolabilių medžiagų (pvz., glikozilintų flavonoidų) terminį stabilumą. [72,56]. Net ir po derivatizacijos labai sunku identifikuoti glikozilintus flavonoidus. J.Kalinova ir kiti (2004) naudojami dujų chromatografijos sistemą su masių spektrometru kokybiškai ir kiekybiškai totoriniame grikyje įvertino benzoinę ir cinamo rūgštį, 2,4,5-trimetilfenolį, 3,4,5-trimetoksifenolį, 4-(3-hidroksi-1-propenilo)-2-metoksifenolį. Fenoliniai junginiai turi daugiau nei vieną hidroksilo grupę ir jų metilinimo metu gali suformuoti keli skirtingi junginiai, todėl sudėtinga atlikti fenolinių junginių kiekybinę analizę [72,76].
Plonasluoksnė chromatografija flavonoidų analizėje naudojama nuo 1960 m. Šis metodas
biologiškai aktyvių medžiagų mišinį prieš išsamesnius instrumentinės analizės tyrimus. Identifikavimui dažniausiai naudojama ultravioletinių spindulių (UV) šviesa arba densitometrija. Kiekybinė analizė dažniausiai nėra pagrindinis tikslas.
Pagal prancūzų farmakopėją grikių tinktūroje flavonoidų nustatymas atliekamas plonasluoksnės chromatografijos metodu. Naudojama silikagelio plokštelė, mobili fazė: skruzdžių rūgštis, vanduo, etilo acetatas (10:10:80 v/v/v). Užnešama 20 μl tiriamųjų mėginių. Identifikavimui naudojami purškiami difenilboro rūgšties amino esterio ir makrogolio 400 metanolinio tirpalo reagentai. Detekcija atliekama esant 365 nm ilgio bangoms [21]. Tai greitas, nebrangus ir lankstus metodas, nereikalaujantis sudėtingos įrangos, todėl dažnai naudojamas flavonoidų analizėje [72].
Kapiliarinė elektroforezė – tai analitinis metodas, pasižymintis aukštu atskyrimo efektyvumu.
Šio metodo mažesnis jautrumas ir duomenų atkuriamumas lyginant su ESC. Metodas dažnai taikomas flavonoidams atskirti, nes esant aukštai pH reikšmei, jie turi neigiamą krūvį. Analizuojant flavonoidus dažniausiai taikoma kapiliarinė zonos elektroforezė ar micelių elektrokinetinė chromatografija, kuriose naudojami fosfato ar borato buferiai, įtampa 10-30 kV, kapiliarai 50-100 µm, injekcijos tūris 10-50 ml, detektoriai: UV, fluorescenciniai, masių spektrometrijos [72].
Atliktas tyrimas, kurio metu kapiliarinės elektroforezės metodu nustatomas rutinas. Naudojamas HP3D CE įrenginys, poliamidu dengti lydyto kvarco kapiliarai (47 cm ilgio, 75 mm skersmens), buferis, sudarytas iš 20 mM Na2B4O7 (natriotetraboratas) ir 20 mM boro rūgšties,
pH=9,46, 25°C temperatūra, įtampa 20 kV. Analitės injekcija buvo atliekama naudojant 50 mbar slėgį, injekcijos laikas 5s. Detekcija atlikta prie 208 nm bangos ilgio su fotodiodo matricos detektoriumi [77].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tiriamos skirtingos sėjamojo grikio augalo dalys: žolė, lapai, žiedai, stiebai, atolas. Žaliavos buvo užaugintos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo eksperimentiniuose laukuose. Tirtos dvi veislės: lietuviška „VB Nojai“ (žaliosios masės derius 18,3 ± 0,4 t ha) ir baltarusiška „Belaruskij determinant-1“(žaliosios masės derlius 32,0 ± 1,7 t ha) [87]. Tyrimui rinktos 2014 m. sezono žaliavos, kurios buvo surinktos 2014-07-10 (lapai, žiedai, žolė, stiebai). Žydėjimo laikotarpis pasirinktas, nes pagal Nidhi Gupta ir kt. 2011 metais atliktą tyrimą nustatyta, kad žydėjimo laikotarpiu sėjamojo grikio žaliava sukaupia daugiausiai rutino [78].2014-07-10 nupjauta antžeminė dalis ataugo ir 2014-08-13 buvo surinkta atolo žaliava. Žaliavos džiovintos vėdinamoje patalpoje esant ne aukštesnei nei 50 °C temperatūrai. Augalai nebuvo tręšiami nei organinėmis, nei mineralinėmis trąšomis. Augalų apsaugos priemonės taip pat nenaudotos.
2.2. Žaliavos ruošimas
Išdžiovinta augalinė žaliava: lapai, žiedynai, stiabai, atolas, žolė - susmulkinta buitiniu smulkintuvu BOSCH MKM6003 (Gerlingen, Vokietija) iki <3 mm dydžio. Nuodžiūvis vertintas naudojant Kern DBS 60-3 (Balingenas, Vokietija) drėgmės analizatorių. Atsveriamas 1 g susmulkintos žaliavos, katinama 120°C temperatūroje iki pastovios masės. Visos žaliavos atitiko Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnyje minimas ribas, nes buvo <10 proc. drėgmės.
2.3. Medžiagos ir tirpikliai
Rutino trihidratas (~96,37 proc.; HWI ANALYTIK GMBH; Schnelldorf ,Vokietija) Chlorogeno rūgštis (~95,3 proc.; HWI ANALYTIK GMBH; Schnelldorf ,Vokietija) Kvercetinas (~93,4 proc.; ChromaDex, Kalifornija, JAV)
Neochlorogeno rūgštis (>95 proc.;Ekstrasynthese; Geny, Prancūzija) Kvercitrinas (~99,89 proc.; Rotichrom; Karlsruhe, Vokietija)
Etanolis (93,6 proc.; Stumbras, Kaunas, Lietuva)
Acetonas (>99,5 Sigma-Aldrich GmbH; Buchs, Šveicarija) Metanolis (>99.9 Sigma-Aldrich GmbH,Buchs, Šveicarija) Acto rūgštis (>99.8 Sigma-Aldrich GmbH,Buchs, Šveicarija) Acetonitrilas (>99,9 proc. Sigma-Aldrich GmbH; Buchs, Šveicarija) Acto rūgštis (>99,8Sigma-Aldrich GmbH; Buchs, Šveicarija)
2.4. Naudota aparatūra
Augalinė žaliava smulkinta naudojant buitinį smulkintuvą BOSCH MKM6003 (Gerlingen, Vokietija). Ekstrakcijos ultragarsu optimizavimui ir ekstraktų gamybai naudota ultragarsinė vonelė Ultrasonic Cleaner Set WUC-A06H (Witeg, Wertheim, Vokietija). Waters 2695 chromatografas su Waters 2998 PDA detektoriumi (Waters, Milford, USA). Nuodžiūvis įvertintas naudojant laboratorinį drėgmės analizatorių Kern DBS 60-3 (KERN & Sohn, Vokietija). Svėrimams naudotos analitinės svarstyklės Santorius (Santorius AG, Vokietija). Susmulkinta augalinė žaliava išfrakcionuota naudojant sietų purtytuvą (Retsch AS200 basic, Vokietija). Centrifugavimas atliekamas Centurion Scientific C2006 (Centurion Scientific Global, Jungtinė Karalystė) centrifuga.
2.5. Ekstrakcijos proceso optimizavimas taikant ultragarsinės ekstrakcijos
metodą
Eksrahavimo optimizavimas atiliekamas naudojant ultragarso vonelę, kurios ultragarso stipris 168 W, dažnis 40 KHz. Optimizavimo procesui naudojama lapų žaliava. Taigi šio proceso metu vertinami penki kintamieji: ekstrahentai (metanolis, acetonas, etanolis) bei skirtingų koncentracijų tirpalai, temperatūra, ekstrakcijos ultragarsu trukmė ir ciklų įtaka ekstrakcijos procesui. Gautas ekstraktas centrifiguojamas 10 min 6000 rpm. Surinktas centrifugatas prieš analizę ESC metodu filtruojamas per 0,45 μm dydžio membraninį porų filtrą. Atsižvelgiant į ekstrakcijos proceso optimizavimo rezultatus vertinamas skirtingų augalo dalių (žolės, lapų, žiedų, stiebų) žaliavos smulkumo įtaka ekstrakcijos procesui.
2.6. Maceracijos proceso optimizavimas
Ultragarsinės ekstrakcijos metu, vandeniniuose tirpaluose susidaro laisvieji radikalai, kurie veikia rutino stabilumą ir taip mažina išgaunamo rutino kiekį [9]. Dėl šios priežasties ultragarsinės ekstrakcijos metu optimizuotas tirpiklis ir jo koncentracija atliekant maceracijos procesą gali būti neefektyviausias [43,79]. Maceracijos procesas atliekamas 7 dienas įvertinant ekstrahentų (etanolio, metanolio, acetono) skirtingų koncentracijų įtaką rutino ekstrakcijos procesui.
2.7. Ekstraktų paruošimas fenolinių junginių kokybiniui ir kiekybiniui
įvertinimui
Tolimesniems tyrimams pasirinktas efektyviausias ekstrakcijos metodas. Atsveriama 0,1 g (0,001 g tikslumu) augalinės žaliavos, užpilama 10 ml 60 proc. (v/v) etanolinio tirpalo ir ekstrahuojama 45°C temperatūroje. Ekstarkcijos procesas atliekamas 15 min veikiant ultragarsu bei gautas ekstraktas centrifuguojamas 10 min 6000 rpm. Centrifugatas nupilamas ir procesas kartojamas du kartus užpilant 5 ml ekstrahento. Gautas ekstraktas filtruojams per 0,45 μm filtrą ir atliekama analizė ESC metodu. Rezultatai pateikiami absoliučiai sausos žaliavos mase.
2.8. Fenolinių junginių kokybinis ir kiekybinis nustatymas ESC metodu
Rutino, kvercetino, kvercitrino, neochlorogeno rūgšties ir chlorogeno rūgšties standartai ištirpinti metanolyje. Kalibracijos kreivės sudarytos iš 9 taškų. Visos identifikuotų junginių standartų kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtys ir regresijos koeficientai pateikti 1 lentelėje.ESC analizei buvo naudojamas Waters 2695 chromatografas su Waters 2998 PDA detektoriumi (Waters, Milford, USA).
2 lentelė. Identifikuotų fenolinių junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtys ir regresijos koeficientai
Junginio pavadinimas
Kalibracinio grafiko tiesinės
regresijos lygtis Regresijos koeficientas R2 Rutinas Y=17500*x 0,999822
Kvercetinas Y=43400*x 0,999924
Kvercitrinas Y=19900*x 0.999927
Chlorogeno r. Y=34600*x 0.999970
Neochlorogeno r. Y=30300*x 0.999980
Metodika pasirinkta remiantis literatūros duomenimis. Fenoliniai junginiai ekstraktuose identifikuojami taikant šiuos parametrus [80]:
Chromatografinio skirstymo kolonėlė ACE C18 150 mm ilgio, 4,6 mm skersmens, 5 µm dalelių dydžio chromatografinio skirstymo kolonėlė;
Tirpikliai: A - 2% acto rūgšties tirpalas, B-acetonitrilas (100%);
Tėkmės greitis 1,0 ml/min;
Injekcija 10 µl;
Gradientas: 0 min – 100 proc. A ir 0 proc. B, per 30 min kinta iki 85 proc. A ir 15 proc. B, iki 50 min kinta iki 50 proc. A ir 50 proc. B, o iki 55 min kinta iki 0 proc. A ir 100 proc. B
Detekcija: λ=324 (fenolinės rūgštys), λ=349 (kvercitrinas), λ=354 (rutinas), λ=367 (kvercetinas)
Gauti duomenys vertinti pagal identifikuotų fenolinių junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtis.Fenoliniai junginiai identifikuoti palyginant jų sulaikymo laikus ir spektrus su standartais. Fenolinių junginių koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal chromatografinių smailių plotus.
2.9. Statistinė duomenų analizė
Statistinei duomenų analizei atlikti naudotos „MS Excel 2010“ ir „IBM SPSS Statistics 20“ programinės įrangos. Įvertintas duomenų matematinis vidurkis ir santykinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingi skirtumai apskaičiuojami taikant vienfaktorinę dispersinę analizę (One-way ANOVA). Atskirom grupėm įvertinti taikytas aposteriorinis Tukey kriterijus.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos optimizavimas taikant ultragarsinės
ekstrakcijos metodą.
Taikant ultragarsinės ekstrakcijos metodą proceso optimizavimui, naudojama lapų žaliava. Vertinama skirtingų parametrų įtaka ekstrakcijos procesui: ekstrahentai (etanolis, metanolis, acetonas) bei įvairūs jų mišiniai su vandeniu, temperatūra, ekstrakcijos trukmė, ciklų skaičius. Ekstrakcijos efektyvumas vertinamas pagal nustatytą rutino kiekį augalinėje žaliavoje. Pagrindiniu žymeniu pasirinktas rutinas, nes šio fenolinio junginio sėjamojo grikio žaliavoje yra didžiausias kiekis. Kokybinis ir kiekybinis įvertinimas atliekamas ESC metodu.
3.1.1. Ekstrahentų ir jų koncentracijų parinkimas tolimesniam
optimizavimo procesui
Proceso optimizavimas atliekamas metanoliu ir acetonu bei jų mišiniais su vandeniu nuo 20 proc. (v/v) iki 100 proc. (v/v), taip pat naudojamas etanolis nuo 20 proc. (v/v) iki 96.3 proc. (v/v). Ekstarhavimui pasirinktas 10 proc. intervalas tarp ekstrahentų koncentracijų. Ekstrakcijai naudojama 0,1 g (0,001 g tikslumu) augalinės žaliavos, atliekama kambario temperatūroje 25,8°C. Ekstrakcijos trukmės laikas 30 min. Siekiant įrodyti gautų rezultatų patikimumą ekstrakcijos procesas kartojamas tris kartus. Didžiausia rutino kiekis (7,16±0,46 proc.) gaunamas naudojant 60 proc. (v/v) etanolio tirpalą (1 pav.). Ekstrahuojant acetonu didžiausias efektyvumas pasiekiamas naudojant 60 proc.(v/v) tirpalą, kuris išekstrahavo (6,53±0,25 proc.) rutino (2 pav.). Ekstrakcijai naudojant metanolį, didžiausias efektyvumas pasiekiamas naudojant 70 proc. (v/v) tirplą, kuris išekstrahavo (5,53±0,09 proc.) rutino (2 pav.).
Atlikus vienfaktorinę dispersijos analizę (one-way AVOVA) kartu su Tukey kriterijumi išsiaiškinta, tarp kokių tirpiklių yra statistiškai reikšmingi skirtumai, įvertinant išgaunamo rutino kiekį naudojant skirtingus ekstrahentus. Naudojant metanolio ir etanolio bei acetono ir metanolio mišinius nustatytas reikšmingumo lygmuo p<0,05. Tai parodo, kad tarp šių ekstrahentų gaunami statistiškai reikšmingi skirtumai. Ekstrahuojant rutiną etanolio ir acetono mišiniais su vandeniu statistinio reikšmingumo lygis p>0,05. Tai parodo, kad nėra statistiškai reikšmingo skirtumo ekstrahuojant rutiną etanolio ir acetono mišiniais. Dėl šios priežasties tolimesniems optimizavimo procesams naudojamas etanolio ir acetono tirpalai su vandeniu.
1 pav. Nustatytas rutino kiekis (proc.) lapuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolio tirpalus
2 pav. Nustatytas rutino kiekis (proc.) lapuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolio ir acetono tirpalus
Optimazavimui vykdyti naudojant 20 proc. (v/v), 30 proc. (v/v), 90 proc. (v/v), 100 proc. ekstrahentų (etanolio ir acetono) tirpalus netikslinga, kadangi šie rezultatai tarpusavyje neturi statistiškai reikšmingų skirtumų, nes statistinio reikšmingumo lygmuo p>0,05. Tuo tarpu šiuos rezultatus lyginat su rezultatais, kurie gauti naudojant 40 proc.(v/v), 50 proc. (v/v), 60 proc.(v/v), 70 proc. (v/v)., 80 proc. (v/v) koncentracijų tirpalus, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, nes reikšmingumo lygmuo p<0,05. Dėl šių priežasčių tolimesniam optimizavimo procesui pasirinkta naudoti 40 proc. (v/v), 50 proc. (v/v), 60 proc. (v/v), 70 proc. (v/v), 80 proc. (v/v) ekstrahentų (etanolio ir acetono) tirpalai. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 20 30 40 50 60 70 80 90 93,6 Rutin o k ieki s (pr oc .) lap u ose
Etanolio koncentracija proc.(v/v)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Rutin o k ieki s (p roc .) lap u ose
Metanolio ir acetono koncentracijos proc.(v/v)
metanolis acetonas
3.1.2. Temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui
Tolimesnis optimizavimo procesas atliekamas pagal prieš tai atliktame eksperimente nustatytus parametrus: ekstrahentai (etanolis ir acetonas), kurių koncentracijos nuo 40 proc. (v/v) iki 80 proc. (v/v). Temperatūros įtaka vertinama esant skirtingai temperatūrai ultragarso vonelėje (35°C; 45°C; 55°C; 65°C; 75°C), ekstrakcija atliekama 30 min. Gauti rezultatai pavaizduoti diagramose (4, 5 pav.). Didžiausias ekstrahavimo efektyvumas pasiekiamas 45°C temperatūroje, kurioje išekstrahuoti didžiausi rutino kiekiai visuose ekstrahentų koncentracijose, abiejuose tirpikliuose. Didžiausias rutino kiekis (7,85 ±0,15 proc.) nustatytas naudojant 60 proc. (v/v) etanolio tirplalą, 45°C temperaratūroje (5 pav.). Ekstrahuojant acetonu dižiausias rutino kiekis (6,95±0,15 proc.) gautas 45°C temperatūroje naudojant 60 proc. (v/v) tirpalą (4 pav.). Didinat ekstrahavimo temperatūrą rutino koncentracija ekstraktuose mažėjo nežymiai acetono ir etanolio tirpaluose (4, 5 pav.)
4 pav. Kiekybiškai įvertintas rutino kiekis (proc.) lapuose, skirtingose ekstrakcijos temperatūrose, naudojant 40-80 proc. (v/v) acetono tirpalus
5 pav. Kiekybiškai įvertintas rutino kiekis (proc.) lapuose skirtingose ekstrakcijos temperatūrose naudojant 40-80 proc. (v/v) etanolio tirpalus
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 35 45 55 65 75 Rutin o k on ce n tr ac ija žali avoje p roc . Temperatūra °C acetonas 40 proc.(v/v) acetonas 50 proc. (v/v) acetonas 60 proc.(v/v) acetonas 70 proc.(v/v) acetonas 80 proc.(v/v) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 35 45 55 65 75 Rutin o k on ce n tr ac ija (pr oc .) ž ali avoje Temperatūra °C etanolis 40 proc.(v/v)" etanolis 50 proc.(v/v) etanolis 60 proc.(v/v) etanolis 70 proc.(v/v) etanolis 80 proc.(v/v)
Atlikus statistinę analizę, kurios metu vertinama temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui, nustatyta, kad temperatūra neturi statistiškai reikšmingos įtakos ekstrakcijos procesui, visų rezultatų reikšmingumo lygmuo p>0,05. Tolimesniems optimizavimo procesams pasirinkta 45°C temperatūra, kadangi dar labiau didinant temperatūrą išekstrahuotas mažesnis kiekis rutino, nes manoma, kad aukštoje temperatūroje intensyvėja jonizacijos, hidrolizės, oksidacijos procesai, mažėja rutino stabilumas [55]. Kambario temperatūroje atlikti ekstrakcjos procesą nebūtų optimaliausias variantas, nes dididant temperatūrą didėja difuzijos greitis, gerėja rutino tirpumas ekstrahente [81].
3.1.3. Ekstrakcijos trukmės įtaka ekstrahavimo procesui
Ekstrakcijos trukmės įtakos analizė atliekama pagal prieš tai tyrimuose optimizuotas sąlygas: naudojamas etanolis ir acetonas, kurių koncentracijos nuo 40 proc. (v/v) iki 80 proc. (v/v), procesas atliekamas 45°C temperatūroje.Ekstrahuotas iš augalinės žaliavos rutino kiekis (proc.) įvertinamas po 5 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min. Iš grafiko matyti, kad rutino tirpimas intensyviausiai vyko pirmąsias 15 min, po to nežymiai mažėjo iki 35 min. Intensyviausiai ekstrakcija vyko 60 proc. (v/v) etanolio tirpale, 15 min buvo (7,92 proc. ±0,27) rutino. Acetono tirpale ekstrakcija efektyviausiai vyko naudojant 60 proc. (v/v) tirpalą, 15 min buvo (6,95±0,24 proc.) rutino.
6 pav. Kiekybiškai įvertintas rutino kiekis (proc.) lapuose, skirtingais laiko intervalais naudojant 40-80 proc.(v/v) acetono tirpalus
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min
Rutin o k ieki s (pr oc .) ž ali avoje
Ekstrakcijos laikas min
acetonas 40 proc.(v/v) acetonas 50 proc.(v/v) acetonas 60 proc.(v/v) acetonas 70 proc.(v/v) acetonas 80 proc.(v/v)
7 pav. Kiekybiškai įvertintas rutino kiekis (proc.) lapuose, skirtingais laiko intervalais naudojant 40-80 proc.(v/v) etanolio tirpalus
Įvertinus gautų rezultatų statistinį reikšmingumą skirtingais laiko intervalais nustatyta, kad statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti palyginus išekstrahuotą rutino kiekį po 5 min ir 10 min su kitais laiko intervalais, nes p<0,05. Ekstrakcijos procesą atlikti ilgiau nei 15 min netikslinga, nes negaunamas statistiškai reikšmingas skirtumas p>0,05. Tolimesniam ekstrakcijos procesui optimizuoti pasirinkta 15 min trukmė.
Optimizavimo procesui tęsti pasirinkta naudoti tik etanolio tirpalus, nes vertinat statistinį reikšmingumą, kurio metu palyginamas vienodų koncentracijų acetono ir etanolio tirpalų efektyvumas vienodais laiko intervalais, daugeliu atveju nustatytas statististiškai reikšmingas skirtumas p<0,05. Taip pat etanolis ekologiškesnis, mažiau toksiškas ir ekonomiškai tinkamesnis variantas.
Atlikus statistinio reikšmingumo vertinimą, kurio metu vertinamas ekstrakcijos efektyvumas 45°C temperatūroje po 15 min naudojant 40-80 proc. (v/v) etanolio tirpalus, nustatyta, kad efektyviausio 60 proc. (v/v) tirpalo išekstrahuotas rutino kiekis reikšmingai skiriasi lyginat su kitomis tirpalų koncentracijomis p<0,05. Dėl šios priežasties tolimesniems optimizavimo etapams naudojams 60 proc. (v/v) etanolio tirpalas.
3.1.4. Ekstrakcijos ciklų įtaka ekstrakcijos procesui
Ekstrakcijo ciklų efektyvumui įvertinti naudojamas 60 proc. (v/v) etanolio tirpalas, procesas atliekamas 45°C temperatūroje, 15 min. Vertinamas nustatomo rutino kiekis lapuose po 1, 2, 3, 4, 5 ciklų. Didinat ciklų skaičių efektyvumas didėjo iki trečio ciklo, kurio metu išgauta (8,49±0,08) proc. rutino, didinant ciklų skaičių iki 5 efektyvumas išliko panašus: išgauta (8,51±0,12) proc. rutino.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min
Rutin o k ieki s (pr oc .) ž ali avoje
Ekstrakcijos laikas min
etanolis 40 proc.(v/v) etanolis 50 proc.(v/v) etanolis 60 proc.(v/v) etanolis 70 proc.(v/v) etanolis 80 proc.(v/v)
8 pav. Rutino kiekio (proc.) lapuose priklausomybė nuo ciklų skaičiaus naudojant 60 proc. (v/v) etanolį
Įvertinus statistinį rezultatų reikšmingumą nustatyta, kad pirmą ir antrą ciklus nustatytas rutino kiekis statistiškai reikšmingai skiriasi tarp visų ciklų, nes p<0,05. Statistiškai reikšmingų skirtumų nėra lyginat trečio, ketvirto ir penkto ciklo rezultatus, nes p>0,05. Dėl šios priežasties ekstrakcijos procesą atlikti daugiau nei 3 kartus netikslinga. Efektyviausiai procesą atlikti per tris ciklus.
Nepavyko rasti literatūros duomenų apie rutino ekstrakcijos optimizavimą, naudojant ultragarsinės ekstrakcijos metodą, kuriame vienu metu būtų naudojami metanolio, etanolio, acetono tirpalai, optimizuojama ekstrakcijos temperatūra, laikas ir ciklai. Lyginant Lian-Xin Peng ir kt. optimizuotą rutino ekstrakcijos procesą, kurio metu buvo naudojami tik metanolio tirpalai, gautas beveik identiškas efektyviausias 72 proc. (v/v) tirpalas, bet nustatyta nepalyginamai aukštesnė optimaliausia ekstrakcijos temperatūra 60°C ir ilgesnė efektyviausia ekstrakcijos trukmė 21 min [82]. Literatūroje pateikti etanolio tirpalo optimizavimo duomenys ekstrahuojant rutiną skiriasi. Yi Yang ir Fan Zhang (2007) nustatė optimizavimo parametrus: didesnės koncentracijos 70 proc. (v/v) tirpalas, gerokai ilgesnė 30 min ekstrakcijos trukmė, naudojami taip pat trys ciklai [83]. Zhang Zhong (2012) nustatė panašią efektyviausią etanolio koncentraciją 65 proc. (v/v), ilgesnę ekstrakcijos trukmę 35 min ir aukštesnę optimaliausią 65°C temperatūrą.
3.2. Augalinės žaliavos smulkumo įtaka ultragarsinės ekstrakcijos procesui
Ekstrakcijos proceso efektyvumą įtakoja augalinės žaliavos dalelių dydis. Mažėjant dalelių dydžiui greitėja difuzijos procesas, ekstrahentas lengviau patenka į augalinę žaliavą, nes didėja paviršiaus plotas, kuriame sąveikauja ekstrahentas. Norint išgauti didžiausią efektyvumą dalelių dydį
7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
1 ciklas 2 ciklas 3 ciklas 4 ciklas 5 ciklas
Rutin o k ieki s (pr oc .) lap u ose Ciklų skaičius
gali tekti riboti, nes itin mažos dalelės gali aglomeruotis, todėl ekstrahentas sunkiau patenka į augalinę žaliavą, lėtėja difuzijos procesas [84,85]. Dėl šių priežasčių mažėja ekstrakcijos efektyvumas.
Nustatyti augalinės žaliavos smulkumo įtaka ultragarsinės ekstrakcijos procesui naudojamos skirtingos augalo dalys (žolė, lapai, stiebai, žiedynai). Ekstrakcija atliekama pagal 3.1 skyriuje optimizuotas sąlygas. Gauti rezultatai pateikiami (9 pav.). Augalinės žaliavos dalelių dydis labiausiai turi įtakos ekstrakcijos procesui, kuriame naudota stiebų ir žolės augalinė žaliava. Stiebuose, palyginus 0,45-0,125 mm su stambiausios žaliavos įtaka ekstrakcijos procesui nustatyta, kad išgaunamo rutino kiekis skiriasi daugiau nei 8 kartus. Žolėje šis skirtumas siekia apie 4 kartus, o lapuose šis skirtumas nesiekia nei 2 kartų. Visose augalinėse žaliavose, mažėjant dalelių dydžiui iki 0,45-0,125 mm, didėjo ekstrakcijos efektyvumas, o naudojant <0,125 mm išgaunamo rutino kiekis mažėjo. Mažėjimą galima argumentuoti vykstančia aglomeracija [84]. Didžiausias efektyvumas gautas naudojant 0,45-0,125 mm dydžio augalinę žaliavą. Mažiausi efektyvumo pokyčiai buvo lapuose naudojant 2,5,-0,71 mm smulkumo žaliavą. Didžiausias ekstrakcijos efektyvumo padidėjimas matomas žiedynų žaliavoje, palyginus 1,6-1,12 mm ir 0,9-1,12 mm frakcijas. Atlikus statistinė analizę, nustatyta 0,45-0,125 mm dalelių dydžio rezultatų statistinis reikšmingumas tarp visų dalelių dydžių (p<0,05). Atsižvelgiant į šiuos faktorius ekstrakcijai, optimaliausia naudoti 0,45-0,125 mm dydžio augalinę žaliavą
9 Pav. Augalinių žaliavų frakcijų dydžių įtaka ekstrakcijos procesui
Literatūros šaltiniuose nepavyko rasti duomenų, kuriuose būtų įvertinta sėjamojo grikio augalinės žaliavos dalelių dydžių įtaka ekstrakcijos procesui. Lyginant alyvmedžių lapų fenolinių junginių ekstrakcijos optimizavimo procesą, gauti panašūs rezultatai. Rekomanduojama naudoti 0,3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rutin o k ieki s p roc . au gali n ėje ž ali avoje
Susmulkintos augalnės žaliavos dalelių dydis mm
lapai žolė žiedynai stiebai
mm dydžio augalinę žaliavą, taip pat nustatyta, jei naudojama augalinė žaliava <0,2 mm, ekstrahavimo efektyvumas mažėja [86].
3.3. Ekstrakcija maceracijos metodu
Proceso optimizavimas atliekamas metanoliu ir acetonu bei jų mišiniais su vandeniu nuo 20 proc.(v/v) iki 100 proc. (v/v), taip pat naudojamas etanolis nuo 20 proc. (v/v) iki 96.3 proc. (v/v). Ekstarhavimui pasirinktas 10 proc. intervalas tarp ekstrahentų koncentracijų. Rutino didžiausias kiekis nustatytas naudojant 60 proc. (v/v) etanolio tirpalą (1,62±0,1 proc.) (10pav.). Didžiausias efektyvumas gautas naudojant 70 proc.(v/v) metanolio tirpalą (nustatyta 1,52±0,16 proc. rutino) (11 pav.). Ekstrahuojant acetonu didžiausias efektyvumas gautas naudojant 60 proc. (v/v) acetono tirpalą (nustatyta 1,42±0,11 proc. rutino) (11 pav.). Rezultatuose matome, kad efektyviausios koncentracijos identiškos palyginus su ultragarsinės ekstrakcijos optimizavimu procesu. Nustatytos rutino koncentracijos keletą kartų mažesnės nei ultragarsinės ekstrakcijos metu. Maceracijos metodas neefektyvus ir taikyti kiekybinei ir kokybinei analizei netikslinga.
10 pav. Nustatytas rutino kiekis (proc.) lapuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolio tirpalus
11 pav. Įvertintas rutino kiekis (proc.) lapuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolio ir acetono tirpalus 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 20 30 40 50 60 70 80 90 93,6 Rutin o k ieki s p roc . žali avoje
Etanolio koncentracija proc. (v/v)
0 0,5 1 1,5 2 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Rutin o k ieki s p roc . žali avoje
acetono ir metanolio koncentracijos proc. (v/v)
acetonas metanolis
