LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA DEIMANTĖ GUDMONAITĖ PAGRINDO IR GAMYBOS METODO ĮTAKA ŽVAKUČIŲ SU ANTIKŪNŲ FRAGMENTAIS TEKSTŪRAI IR FIZIKOCHEMINĖMS SAVY

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

DEIMANTĖ GUDMONAITĖ

PAGRINDO IR GAMYBOS METODO ĮTAKA ŽVAKUČIŲ SU ANTIKŪNŲ

FRAGMENTAIS TEKSTŪRAI IR FIZIKOCHEMINĖMS SAVYBĖMS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė: Prof. dr. Jurga Bernatonienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data

PAGRINDO IR GAMYBOS METODO ĮTAKA ŽVAKUČIŲ SU ANTIKŪNŲ

FRAGMENTAIS TEKSTŪRAI IR FIZIKOCHEMINĖMS SAVYBĖMS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė:

Prof. dr. Jurga Bernatonienė Data

Recenzentas: Darbą atliko:

Prof. dr. Nijolė Savickienė Magistrantė Deimantė Gudmonaitė Data Data

TURINYS

1.2 Darbo tikslas ir uždaviniai ... 9

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

2.1. Antivaginolizino charakteristika: apibūdinimas ir gavimas ... 10

2.2. Antivaginolizino savybės ir vaidmuo bakterinės vaginozės gydyme ... 10

2.3. Žvakučių bendroji charakteristika ... 12

2.4. Žvakučių gamyba ... 13

2.5. Žvakučių kokybės kontrolė ir laikymas ... 13

2.6. Žvakučių gamyboje naudojami pagrindai ... 14

2.6.1. Hidrofobiniai pagrindai ... 15

2.6.2. Hidrofiliniai pagrindai ... 17

3. TYRIMŲ METODIKA IR METODAI ... 20

3.1. Tyrimo objektas ... 20

3.2. Medžiagos ir prietaisai ... 20

3.2.1. Tyrime naudotos medžiagos ... 20

3.2.2. Reagentų paruošimas ... 21

3.2.3. Tyrime naudoti prietaisai ... 22

3.3. Metodai ... 22

3.3.1. Žvakučių gamyba ritinimo būdu, kai pagrindas yra kakavos sviestas ... 22

3.3.2. Kakavos sviesto pH reikšmės nustatymas ... 23

3.3.3. Žvakučių gamyba liejimo būdu su kakavos sviestu, parūgštintu 10% ledine acto rūgštimi………... 23

3.3.4. Žvakučių gamyba su trigliceridų ir kakavos sviesto pagrindais, parūgštintais 10% pieno rūgštimi. ... 24

3.3.5. Žvakučių su Witepsol H15, W45, W35, kakavos sviesto ir rafinuoto kakavos sviesto pagrindais gamyba ... 24

3.3.6. Baltymo ekstrakcija iš žvakučių su kakavos sviesto, rafinuoto kakavos sviesto ir Witepsol H15, W45, W35 pagrindais ... 24

3.3.8. Hemolizės testas ... 26

3.3.9. Vienalytiškumo tyrimas ... 27

3.3.10. Žvakučių pagrindų tekstūros analizavimas ... 28

3.3.11. Masės vienodumo testas ... 29

3.3.12. Žvakučių fizikinių savybių vertinimas ... 29

3.3.13. Statistinė duomenų analizė ... 29

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

4.1. Gamybos metodo įtaka žvakučių formulavimui ... 30

4.2. Gamybos metodo įtaka žvakučių formos kokybei ... 31

4.3. Kakavos sviesto pagrindo ir 10% ledinės acto rūgšties įtaka baltymo stabilumui... 33

4.4. Skirtingų pagrindų, pH reikšmę reguliuojančių medžiagų ir temperatūros įtaka baltymo stabilumui ... 35

4.5. Pagrindo įtaka baltymo aktyvumui, esant skirtingoms baltymo koncentracijoms žvakutėse 37 4.6. Žvakučių su skirtingais pagrindais baltymo aktyvumo palyginimas ... 38

4.7. Žvakučių vienalytiškumo vertinimas ... 40

4.8. Žvakučių tekstūros analizė ... 41

4.9. Žvakučių fizikinių savybių vertinimas ... 49

5. IŠVADOS ... 51

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 52

SANTRAUKA

D. Gudmonaitė. Pagrindo ir gamybos metodo įtaka žvakučių su antikūnų fragmentais tekstūrai ir fizikocheminėms savybėms. Magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė Dr. Prof. J. Bernatonienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. - Kaunas

Tyrimo tikslas: nustatyti pagrindo ir gamybos metodo įtaką žvakučių su antikūnų fragmentais tekstūrai ir fizikocheminėms savybėms.

Tyrimo uždaviniai ir metodai: pagaminti žvakutes ritinimo ir liejimo metodais, palyginti šiuos metodus ir įvertinti technologijos įtaką žvakučių formos kokybei; įvertinti žvakučių pagrindų, pH reikšmei reguliuoti skirtos medžiagos ir temperatūros įtaką baltymo stabilumui, taikant NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezę; ištirti ir palyginti skirtingų pagrindų ir įvairių baltymo koncentracijų įtaką baltymo aktyvumui, taikant hemolizės testo metodiką; nustatyti ir įvertinti gamybos metodo, baltymo, pH reikšmę reguliuojančios medžiagos ir pagrindo įtaką žvakučių tekstūrai, organoleptinėms ir fizikinėms savybėms.

Tyrimo rezultatai ir išvados: Išanalizavus gautus rezultatus nustatyta, kad žvakučių gamybos metodas turi įtakos jų formos taisyklingumui ir vienodumui. Taisyklingos ir vienodos formos žvakutės yra pagaminamos liejimo būdu, naudojant prietaisą Unguator®2100. Taip pat nustatyta, kad kakavos

sviesto pagrinde, parūgštintame 10% ledine acto rūgštimi, baltymas yra nestabilus, tačiau baltymas išliko stabilus kakavos sviesto pagrinde, parūgštintame 10% pieno rūgštimi, padidinus baltymo kiekį žvakutėje. Trigliceridų pagrinde, naudotame žvakučių gamybai, baltymas nestabilus ir baltymas nėra atsparus 37±2 oC temperatūrai. Nustatyta, kad baltymas yra aktyvus kakavos sviesto pagrinde, parūgštintame 10% ledine acto rūgštimi, kai jo kiekis žvakutėje 405µl. Esant 50μl, 135μl, 275μl baltymo žvakutėje, baltymas neaktyvus. Tiriant aktyvumą skirtinguose pagrinduose nustatyta, kad tik Witepsol W45 pagrinde baltymas yra aktyvus. Atlikus tekstūros analizę gauti rezultatai rodo, kad gamybos metodas, baltymo kiekis bei pH reikšmę reguliuojanti medžiaga turi įtakos žvakučių tekstūrai. Nustatyta, kad pagrindas turi įtakos žvakučių spalvai ir paviršiaus lygumui: su Witepsol H15, W35, W45 ir rafinuoto kakavos sviesto pagrindais žvakutės yra baltos spalvos ir jų paviršius lygus, o su kakavos sviestu – geltonos spalvos ir jų paviršius nelygus. Žvakučių gamybos metodas, baltymo kiekis, pH reikšmę reguliuojanti medžiaga ir jų gamybai naudoti pagrindai neturi įtakos žvakučių vidutinės masės, svorio ir ilgio parametrams.

Rekomendacijos: Rekomenduojama pratęsti šiuos tyrimus ir surasti metodiką, leidžiančią kiekybiškai identifikuoti antivaginoliziną, bei įvertinti laboratorinės ir pramoninės gamybos įtaką kuriamų žvakučių kokybės parametrams.

SUMMARY

D. Gudmonaitė. The Influence of the Base and Production Method on the Texture and Physicochemical Characteristics of Suppositories with Antibody Fragments. Master’s thesis/ scientific supervisor Dr. Prof. J. Bernatonienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. Kaunas.

Work goal:determine the influence of the base on production method on the texture and physicochemical characteristics of suppositories with antibody fragments.

Work tasks and methods: manufacture suppositories by both rolling and moulding methods, compare both these methods and evaluate the influence of technology on the quality of suppository shape; evaluate the influence of suppository base, pH regulation substance, and temperature on the stability of protein, by applying SDS polyacrylamide gel electrophoresis; examine and evaluate the influence of different bases and different protein concentrations on the activity of the protein by applying the hemolysis test method; determine and evaluate the influence of the production method, protein, pH regulating substance, and base on the texture as well as the organoleptic and physical qualities of suppositories.

Test results and conclusions: After analysing obtained results, it has been determined, that suppository production method influences the regularity and consistency of their shape. Regular and consistent suppositories are made by method of moulding, using the instrument Unguator®2100. It

emerged, that a cocoa butter base, acidified with 10% glacial acetic acid, destabilises the protein, however, the protein remained stable in a cocoa butter base, acidified with 10% lactic acid, after increasing the amount of protein within an suppository. Triglyceride base and a temperature of 37±2°C destabilises the protein. It has been determined, that the protein is active in a cocoa butter base, acidified with 10% glacial acetic acid, when the amount of protein within an suppository is 405µl. With protein amounts of 50μl, 135μl or 275μl per suppository, the protein was not active. After completing a texture analysis, it emerged, that the production method, amount of protein, and pH regulation substance all have an influence on the texture of suppositories. It has been determined, that the base influences the colour and surface smoothness of suppositories: suppositories with Witepsol H15, W35, W45 and refined cocoa butter bases were white with a smooth surface, while suppositories with cocoa butter were yellow-coloured with a rough surface. The production method, amount of protein, pH regulation substance, and the base used for suppository production do not influence their average mass, weight or length.

Recommendations: it is recommended to continue this research and seek out a technique, which would allow to quantitatively identify anti-vaginolysin and to evaluate the influence of laboratorial and industrial manufacture on the quality parameters of produced suppositories.

SANTRUMPOS

VLY – vaginolizinas

Anti – VLY – antivaginolizinas (baltymas)

scFv – (angl. single-chain varianble fragment) – viengrandis monokloninio antikūno fragmentas pH – vandenilio jonų (H+) koncentracijos tirpale matas

Ph.Eur. – Europos farmakopėja VU – Vilniaus universitetas % - procentai pav. – paveikslas min. – minutės ml – mililitrai µl – mikrolitrai g – gramai mg – miligramai cm – centimetrai °C – laipsniai Celsijaus

aps./min. – apsisukimai per minutę kDa – Kilo Daltonas

NaDS – PAGE – natrio dodecilsulfato poliakrilamidinio gelio elektroforezė APS – amonio persulfatas

PBS – fosfatinis buferinis tirpalas PEG – polietilenglikolis

1. ĮVADAS

1.1 Darbo aktualumas

Pasaulinėje praktikoje bakterinė vaginozė (BV) yra gydoma įvairiais antibiotikais. Nors tai ir efektyvus gydymo būdas, bet yra žinoma, kad daug žmonių antibiotikams yra alergiški. Be to, gydymas antibiotikais yra problemiškas nėščiosioms: antibiotikai gali pakenkti vaisiui bei yra kenksmingi natūraliai vaginalinei mikroflorai, pvz. Laktobaciloms. Pastarosios palaiko normalią genitalinio trakto būklę. Be to, daugėja antibiotikams atsparių bakterijų, kurių antibiotikai nebeveikia. Dėl šių priežasčių išlieka rizika, kad BV pasikartos. [3,4,37]

Dažnai infekcijos metu patogeniniai mikroorganizmai sudaro atsparias antibiotikams bioplėveles, todėl antibiotikai gali nesunaikinti ten pasislėpusių patogenų. Antivaginolizinas yra nauja medžiaga, turinti unikalią savybę suardyti patogenines bioplėveles, neleisdamas išgyventi tokiu būdu užsimaskavusiems mikroorganizmams. Su šia veikliąja medžiaga nėra pagamintų farmacinių formų, todėl tyrimo metu buvo kuriamos žvakutės su antivaginolizinu. Naujasis antivaginolizino preparatas gali daugeliu atveju pakeisti problemiškus antibiotikus. Be to, šis preparatas nekenkia natūralioms

Laktobaciloms, kurių gyvybingumas yra svarbus gydant bakterinę vaginozę. [3,9,10]

Aktualus yra žvakučių su antivaginolizino rekombinantiniu baltymu technologinis funkcionalizavimas. Žvakučių gamybai buvo naudojami šie pagrindai: kakavos sviestas, rafinuotas kakavos sviestas, Witepsol H15, W35, W45 ir trigliceridai. Pagrindų pH reikšmės reguliavimui naudota 10% ledinė acto rūgštis ir 10% pieno rūgštis. Tyrimo metu buvo vertinama, kokią įtaką žvakučių formos kokybei turi gamybos metodas. Analizuojama ir nustatoma, kokiuose, žvakučių gamybai naudojamuose pagrinduose, baltymas išlieka stabilus. Taip pat analizuojamas baltymo aktyvumas skirtinguose pagrinduose bei esant skirtingam baltymo kiekiui. Nustatoma, kokią įtaką pagrindas, pH reikšmę reguliuojanti medžiaga, baltymo kiekis bei gamybos metodas turi žvakučių tekstūrai ir kokybės parametrams. Šio darbo tikslas – nustatyti pagrindo ir gamybos metodo įtaką žvakučių su antikūnų fragmentais tekstūrai ir fizikocheminėms savybėms.

1.2 Darbo tikslas ir uždaviniai

Darbo tikslas:

Nustatyti pagrindo ir gamybos metodo įtaką žvakučių su antikūnų fragmentais tekstūrai ir fizikocheminėms savybėms.

Darbo uždaviniai:

1. Pagaminti žvakutes taikant skirtingus gamybos metodus, palyginti juos ir įvertinti technologijos įtaką žvakučių formos kokybei.

2. Įvertinti žvakučių pagrindų, pH reikšmei reguliuoti skirtos medžiagos ir temperatūros įtaką baltymo stabilumui.

3. Ištirti ir palyginti skirtingų pagrindų ir įvairių baltymo koncentracijų įtaką baltymo aktyvumui. 4. Nustatyti ir įvertinti gamybos metodo, baltymo, pH reikšmę reguliuojančios medžiagos ir

pagrindo įtaką žvakučių tekstūrai.

5. Įvertinti pagrindo, gamybos metodo, baltymo kiekio ir pH reikšmei reguliuoti skirtos medžiagos įtaką žvakučių organoleptinėms ir fizikinėms savybėms.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Antivaginolizino charakteristika: apibūdinimas ir gavimas

Antivaginolizinas (anti-VLY scFv) – rekombinantinis baltymas, gautas naudojant genų inžinerijos technologijas. [2] Tai viengrandis antikūno fragmentas (scFv), gautas iš dviejų hibridomos ląstelių linijų (9B4 ir 23A2). Iš kiekvienos hibridomos buvo sukurta po du variantus antivaginolizino (anti-VLY scFv), kurį sudaro VL-VH arba VH-VL antikūno grandinės, sujungtos 20 aminorūgščių ilgio seka (G4S)4. Perkėlus scFv baltymą į E.coli ląsteles ir taikant baltymų gryninimo metodus, buvo išskirtas aktyvus scFv baltymas (antivaginolizinas), kuris pasižymi neutralizuojančiu vaginoliziną (VLY) poveikiu. VLY neutralizuojantis aktyvumas buvo tiriamas in vitro hemoliziniu metodu, naudojant žmogaus eritrocitus arba citoliniu metodu, naudonat HeLa ląstelių liniją. Nustatyta, kad VH-VL ir VH-VL-VH antikūno grandinių afiniškumas ir neutralizavimo aktyvumas buvo panašūs. Antivaginolizinas, gautas iš hibridomos 94B, parodė didžiausią vaginoliziną neutralizuojantį aktyvumą, apsaugant žmogaus eritrocitus ir gimdos kaklelio HeLa ląsteles nuo VLY. [3]

VLY yra baltymas toksinas, gaminamas Gardnerella vaginalis bakterijos, kuri apibūdinama kaip dominuojantis mikroorganizmas moterų, sergančių bakterine vaginoze (BV), makštyje. [3,5] VLY yra apibūdinamas kaip pagrindinis Gardnerella vaginalis bakterijų virulentiškumo faktorius. Jis siejamas su nuo cholesterolio priklausomų toksinų citolizinų (CDCs) šeima. [4,5] Šie toksinai sukelia ląstelės membranos lizę ir veikia kaip virulentiškumo faktoriai Gardnerella vaginalis bakterijų infekciniuose procesuose. [6]

2.2. Antivaginolizino savybės ir vaidmuo bakterinės vaginozės gydyme

BV yra labiausiai paplitusi makšties infekcija visame pasaulyje, kuriai būdingos specifinio kvapo ir spalvos išskyros, perštėjimas, niežulys, skausmas šlapinantis bei skausmingi lytiniai santykiai. Ši makšties infekcija susijusi su daugeliu sveikatos problemų, pvz., priešlaikinis gimdymas ir mažesnis naujagimių svoris, dubens organų uždegimai, pogimdyviniai endometritai ir padidėjusi ŽIV susirgimo rizika. [7,8,10] BV kyla tuomet, kai pakinta normali makšties mikrofloros pusiausvyra ir ima sparčiai daugintis Gardnerella vaginalis bakterijos. Jų išskiriamas toksinas VLY sudaro palankias sąlygas makšties gleivinės paviršiuje iš mikroorganizmų susiformuoti bioplėvelei. Bioplėvelė neleidžia prasiskverbti antimikrobinėms medžiagoms (antibiotikams) ir taip sunaikinti viduje esančias

bakterijas. Antivaginolizinas pasižymi savybe suardyti patogenines bioplėveles, neleisdamas išgyventi tokiu būdu užsimaskavusiems mikroorganizmams (1 pav.). [9,10]

1 pav. Nuo dozės priklausomas bioplėvelių ardymas antivaginolizinu (scFv) [10]

Vilniaus universiteto Biotechnologijų instituto mokslininkų atlikti tyrimai parodė, kad rekombinantinis antivaginolizinas scFv slopina ląstelių irimą, kurį paskatino VLY. Jie nustatė, kad naudojant didesnę scFv baltymo koncentraciją, ląstelių irimo slopinimas antivaginolizinu didėja. (2 pav.) [10]

2 pav. Nuo dozės priklausomas epitelinių ląstelių irimo slopinimas antivaginolizinu (scFv) [10]

Taigi, BV gydymas, naudojant specifinio antikūno fragmentą, yra pagrįstas Gardnerella

vaginalis bakterijos išskiriamo VLY toksino neutralizavimu. Inaktyvavus šį toksiną yra sumažinama Gardnerella vaginalis infekcijos poveikis ir daroma žala žmogaus organizmui. Anti-VLY scFv slopina Gardnerella vaginalis bakterijos prisikabinimą prie makšties gleivinės epitelio ir bakterinių

bioplėvelių susidarymą. Tokiu būdu stabdomas ligos intensyvumas bei plitimas. [3]

2.3. Žvakučių bendroji charakteristika

Makšties žvakutės yra vadinamos ovulėmis. [13] Remiantis Europos farmakopėja (Ph.Eur. 01/2002:1164) ovulės apibūdinamos kaip kieta vienadozė vaisto forma. Ovulės gali būti įvairios formos, pritaikytos įdėti į makštį. Paprastai kambario temperatūroje ovulės būna kietos konsistencijos, o lydosi, minkštėja ar tirpsta esant kūno temperatūrai. Ovulėse gali būti viena ar daugiau veikliųjų medžiagų, disperguotų ar ištirpintų tam tikrame pagrinde. Taip pat gali būti pagalbinių medžiagų, pvz., adsorbentų, paviršinio aktyvumo medžiagų, skiediklių, slidiklių, antimikrobinių konservantų ir dažiklių. [1] Ovulių masė gali svyruoti nuo 1,5 – 6,0 g. [30] Jos pasižymi vietiniu poveikiu, esant bakterinėms ar grybelinėms infekcijoms (taip pat gali pasireikšti ir sisteminis poveikis), atkuria makšties gleivinę. [13] Svarbią reikšmę makšties žvakučių gydomajam poveikiui turi biologinio prieinamumo parametrai ir žvakučių pagrindų reologinių savybių charakteristikos. [25]

Makštis apibūdinama kaip dinamiška ir sudėtinga sistema, kurioje vyrauja natūrali vaginalinė mikroflora.[37] Ji pasižymi keliais privalumais, pvz., dėl savo didelio paviršiaus ploto, užtikrinamas geras kraujo tiekimas bei santykinai didelis pralaidumas daugeliui vaistų. [28]

Žvakutės į makštį turi būti įvedamos nesukeliant jokio skausmo ar diskomforto. Makšties pH yra rūgštinis (pH = ~ 4,5), dauguma makšties žvakučių yra buferinės, esant pH 4,5. [13] Žvakutės turi keletą pranašumų, pavyzdžiui, palaikomas dozės vienodumas, žvakutės įterpiamos į makštį išvengiant dirginimo, o vaistinė medžiaga lengvai atsipalaiduoja iš pagrindo, žvakutei pradėjus lydytis kūno ertmėje. [12] Kiti preparatai, naudojami makšties ligoms gydyti, pvz., kremai, putos, geliai ir tabletės, dažnai neužtikrina reikiamo terapinio poveikio, nes daugelis šių preparatų makšties ertmę padengia trumpam laikui ir norint efektyvesnio gydymo, juos reikia naudoti keletą kartų per dieną. [28]

2.4. Žvakučių gamyba

Žvakutės yra gaminamos ritinimo, slėgimo (presavimo) ir lydymo/liejimo metodais. [30,31] Gamybos etapai: pagrindo paruošimas; vaistinės medžiagos paruošimas; pagalbinių medžiagų paruošimas; vaistinės medžiagos įvedimas į pagrindą; žvakučių formavimas ir įpakavimas. [30]

Remiantis Europos farmakopėja (Ph.Eur. 01/2002:1164), makšties žvakutės dažniausiai yra gaminamos lydymo būdu. Siekiant užtikrinti tinkamą veikliųjų medžiagų dalelių dydį, kartais atliekami tam tikri matavimai. Jei veikliųjų medžiagų dalelės per didelės, tuomet jos sumalamos ir sijojamos per reikiamo dydžio sietą. [1] Susmulkintos veikliosios medžiagos kruopščiai įvedamos į išlydytą pagrindą nuolat maišant. [27] Gaminant makšties žvakutes lydymo būdu, pašildyta skysta masė su veikliosiomis medžiagomis yra pilama į specialias formeles. Kad į formeles išpilstyta žvakučių masė sustingtų, žvakutės yra šaldomos. Be to, kietinimui gali būti naudojamos įvairios pagalbinės medžiagos, pvz., kietieji riebalai, makrogoliai ir kt. [1]

Kitas žvakučių gamybos metodas yra ritinimas. Šiuo būdu gali būti pagamintos žvakutės, kurių pagrindas kakavos sviestas. Plastiškumui pagerinti dedama kitų ingredientų. Pagrindas susmulkinamas ir dedamas į grūstuvę, taip pat dedamos veikliosios ir pagalbinės medžiagos ir minkoma. Iš žvakučių masės mentele formuojamas ilgas cilindras, kuris supjaustomas peiliu lygiomis dalimis. Tuomet ritinamos vienodo dydžio ir formos žvakutės. [31,32,33]

Slėgimo (presavimo) metodu žvakutės gaminamos pagrindą ir kitas medžiagas sudedant į specialias formas bei naudojant žvakučių gamybos mašinas. Pagrindas, veikliosios ir pagalbinės medžiagos yra kruopščiai maišomos ir žvakučių masė tampa minkšta. Masė sudedama į cilindrą, kuris po to uždaromas, ir presavimo procesas vyksta mechaniškai spaudžiant ar sukant ratą. Procesui pasibaigus surenkamos suformuotos žvakutės. [31,32]

2.5. Žvakučių kokybės kontrolė ir laikymas

Žvakučių kokybės kontrolę apima fizikinė ir cheminė analizė. Fizikinei analizei priskiriama vizualinė apžiūra (išvaizda), kurią atliekant svarbu įvertinti kvapą, spalvą, paviršiaus būklę, formas bei kitas ypatybes, kurios vertinamos organoleptiškai. [18,23] Be to, atliekami kiti tyrimai: masės vienodumas, masės vienalytiškumas, lydymosi temperatūra, skystėjimo laikas, lydymosi ir kietėjimo laikas bei mechaninis tvirtumas. Masės vienalytiškumas gali būti vertinamas perpjaunant žvakutę išilgai ir stebint paviršiaus lygumą. Cheminė analizė apima aktyvumo tyrimus ir tirpumo testą. [23]

Žvakučių identifikavimo testai yra atliekami remiantis identifikavimui ir patvirtinimui parengtais oficialiais straipsniais. Tyrimų ir bandymų procedūros yra naudojamos nustatyti ar produkto

kokybė atitinka farmakopėjinius standartus (tapatybė, stiprumas, kokybė ir grynumas). [23,24] Kokybės kontrolės testai žvakutėms yra atliekami remiantis Europos farmakopėja: turinio vienodumo testas (Ph.Eur. 01/2002, 2.9.6), masės vienodumo testas (Ph.Eur. 01/2002, 2.9.5), tirpimo testas (Ph.Eur. 01/2002, 2.9.3) ir suirimo testas (Ph.Eur. 01/2002, 2.9.2) [1] Vaistinių medžiagų aptikimui bei kiekybei nustatyti dažniausiai yra taikomi chromatografiniai ir spektrofotometriniai metodai. [23,24]

Žvakutes reikia laikyti sausoje vietoje, esant ne aukštesnei kaip 20°C temperatūrai. Kiekviena žvakutė yra apdengta aliuminio ar polimerine folija. Taip žvakutės apsaugomos nuo išorės veiksnių. Taip pat žvakutės gali būti apdengtos plastmasine plėvele. Žvakučių išėmimas iš pakuotės turi būti paprastas, todėl įpakavime padaromos įpjovos. Svarbu, kad įpakavimas užtikrintų mikrobiologinį švarumą. [18]

2.6. Žvakučių gamyboje naudojami pagrindai

Pagrindas yra svarbi sudedamoji dalis žvakučių gamyboje, kuris apsprendžia apribotų dispersinių sistemų stabilumą. Pagrindas atsakingas už vaisto struktūrines, mechanines ar reologines savybes bei veikimą. [11] Be to, pagrindas turi svarbią įtaką vaistinės medžiagos atsipalaidavimui. [26]

Pagrindas sudaro didelę dalį žvakutės, išreiškia tam tikras fizikines ir chemines savybes ir turi svarbią įtaką vaisto biologiniam prieinamumui, gydomajam poveikiui, vaisto pasiskirstymui ir kt. Norint pagaminti kokybiškas žvakutes, svarbu žinoti pagrindo savybes. [11] Be to, kokybiškas produktas pagaminamas su pagrindais, kurie atitinka tam tikrus reikalavimus: pagrindas turi būti tvirtas,esant kambario temperatūrai, o lydytis arba tirpti, esant kūno temperatūrai; pagrindas turi pasižymėti geromis maišymosi savybėmis su vaistinėmis ir pagalbinėmis medžiagomis; taip pat svarbu, kad nereaguotų su vaistinėmis ir pagalbinėmis medžiagomis, turi būti stabilus; pagrindas turi lengvai išskirti vaistines medžiagas; pagrindas turi sudaryti tvirtą masę žvakučių naudojimo metu bei turi nedirginti gleivinių. [18]

Pagrindai yra skirstomi į hidrofobinius ir hidrofilinius. Hidrofobiniai pagrindai yra riebalai ar riebalinės medžiagos, kurios lydosi kūno temperatūroje ir yra gamtinės arba pusiau sintetinės kilmės. Dėl savo savybių, hidrofobinių pagrindų grupei priskiriami: kakavos sviestas, hidrogenizuoti riebalai, trigliceridai, Witepsol pagrindai ir kt. Hidrofilinių pagrindų pagrindinė savybė yra tirpumas vandenyje. Šiai grupei priskiriami: želatinos-glicerolio pagrindas, polietileno glikoliai ir kiti pagrindai. [11,14]

2.6.1. Hidrofobiniai pagrindai

Kakavos sviestas (Teobroma aliejus)

Tai dažniausiai naudojamas pagrindas gaminant žvakutes. Jei gamybos nurodymuose nėra paminėtas pagrindas, tuomet yra imamas kakavos sviestas. Šis pagrindas atitinka daugelį keliamų reikalavimų ir gali būti vadinamas idealiu pagrindu.

Kakavos sviestas – tai augalinės kilmės riebalai. Jis gaunamas presuojant susmulkintas bei pašildytas kakavos medžio sėklas. Chemiškai kakavos sviestas apibūdinamas kaip riebalai iš trigliceridų su dominuojančiomis gliceridų grandinėmis: oleino, palmitino ir stearino rūgščių bei oleino ir distearino rūgščių. Tai yra gelsvi, trapūs riebalai, kurie maloniai kvepia ir primena šokolado skonį. Kadangi kakavos sviestas gali lengvai ištirpti, todėl jis turi būti vėsioje, sausoje vietoje ir apsaugotas nuo šviesos. [14]

Privalumai:

 Lydosi esant 34-38°C (t.y. kietas kambario temperatūroje, bet tirpsta kūno temperatūroje). [14]  Šildant greitai tirpsta, vėsinant greitai stingsta. [14]

 Maišosi su daugeliu medžiagų. [14]

 Iš kakavos sviesto greitai išsiskiria veiklioji medžiaga. [11]

 Pasižymi geru plastiškumu (ypač įdėjus bevandenio lanolino).[11]  Švelnus, nepavojingas, nereaguojantis ir neerzinantis. [14]

Trūkumai:

 Limpantis prie formelių: prilipimo galima išvengti sutepant žvakučių formas tam tikromis medžiagomis.

 Minkštėja šiltoje aplinkoje.

 Dėl palyginus žemos lydymosi temperatūros, naudojami priedai (pavyzdžiui vaškas), kad pakeltų lydymosi temperatūrą ir neutralizuotų vaistų ir/ar klimato padarinius.

 Apkarsta laikant, dėl nesočiųjų gliceridų oksidacijos.

 Prastai emulsuoja vandenį, todėl gali būti naudojami emulsikliai.

 Prateka iš kūno. Kartais ištirpintas pagrindas išteka iš tiesiosios žarnos ar makšties.  Brangus.

Hidrogenizuoti riebalai

Hidrogenizuoti riebalai – tai yra sintetiniai kieti riebūs pagrindai, kurie gaunami pirmiausia hidrolizuojant augalinį aliejų, tuomet hidrinant atsirandančias riebalų rūgštis ir galiausiai kaitinant rūgštis su gliceroliu. [14]

Pranašumai lyginant su kakavos sviestu:

 Jų sukietėjimo taškai nepasikeičia perkaitinus.  Atsparūs oksidacijai.

 Skirtumas tarp lydymosi ir nustatymo taškų yra mažas, tiktai 1,5-2°C, retai apie 3°C.

 Jie paprastai savo sudėtyje turi dalinių gliceridų, iš kurių, kai kurie, pavyzdžiui glicerolio monostearatas, yra vanduo-aliejuje emulsuojančios medžiagos ir todėl jų gebėjimas absorbuoti vandenį yra geras.

 Nėra reikalingas žvakučių formų sutepimas.

 Su šiuo pagrindu žvakutės yra baltos ir beveik bekvapės, turi patrauklią išvaizdą. Trūkumai

 Mažai klampūs, todėl gaminant žvakutes su hidrogenizuotų riebalų pagrindu yra naudojamas tirštiklis.

 Greitai aušinant tampa trapūs. [14]

Trigliceridai

Trigliceridai – tai lipidai, sudaryti iš vienos glicerolio ir trijų riebalų rūgščių molekulių. Trigliceridai priskiriami riebaliniams ar aliejiniams pagrindams, priklausomai nuo to, ar esant kambario temperatūrai jie yra kietos ar skystos būsenos. [19] Trigliceridai gali būti natūralūs, pavyzdžiui, kakavos sviestas, arba sintetiniai trigliceridai, tokie kaip Witepsol ar Wecobee. [20] Naujesni sintetiniai trigliceridai sudaryti iš hidrintų augalinių aliejų. Jų privalumas lyginant su kakavos sviestu - nepasižymi polimorfizmu, o trūkumas – brangūs. [21]

Witepsol pagrindai

Witepsol pagrindai yra vis labiau populiarėjanti žvakučių sudedamoji dalis, susidedanti iš lauro rūgšties hidrogenizuotų trigliceridų su monogliceridais. [14] Witepsol pagrindai yra plačiai naudojami ir pramonėje, ir farmacijos praktikoje. Šio pagrindo nėra daug rūšių. Tai leidžia pasirinkti optimalią bazę su tam tikromis fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Witepsol pagrindas turi privalumų, nes yra inertiškas, nesudaro polimorfinių modifikacijų, gerai emulsuoja vandeninius tirpalus ir greitai sukietėja po išsilydymo. [11]

1 lentelė. Witepsol pagrindų rūšys, sudėtis, fizikocheminės savybės ir lydymosi temperatūra [11,38]

Žvakučių pagrindas Sudėtis Fizikocheminės savybės Lydymosi temperatūra, °C Witepsol H, W, S, E Mišinys, susidedantis iš mono-, di- ir trigliceridų iš augalų rūgščių C12-C18. Pagrindinė dalis trigliceridai iš lauro rūgšties. Balta byranti kieta lengvai tirpstanti masė, be aromato ir skonio. Lydymosi taškas /kietėjimo taškas, °C H-15 33,5-35,5 / 32,0-34,5 W-45 33,0-35,5 / 32,0-35,0 W-35 33,5-35,5 / 27,0-30,0

Kaip matoma 1 lentelėje, Witepsol yra H, W, S, E rūšių. Visi jie kietieji riebalai, kurie skiriasi lydymosi ir kietėjimo temperatūra. [14] Witepsol pagrindų yra apie 12. Witepsol H-15 lydymosi temperatūros intervalas yra panašus į kakavos sviesto. [11,15] Witepsol pagrindai, turintys aukštą lydymosi temperatūrą, gali būti sumaišyti su tais pagrindais, kurių lydymosi temperatūra yra žema ir tokiu būdu suformuojami pagrindai, turintys platų lydymosi ribų intervalą. Kadangi Witepsol pagrindai turi emulsuojančių medžiagų, tai reiškia, kad gali absorbuoti ribotą kiekį vandens. [15] Dėl visų šių savybių Witepsol pagrindai yra vadinami hidrofobiniais emulsiniais pagrindais. [22]

2.6.2. Hidrofiliniai pagrindai

Želatinos-glicerolio pagrindas

Ši medžiaga turi daug ypatybių, dėl kurių ji yra tinkamas pagrindas žvakutėms. Viena iš ypatybių yra hidrofilinės savybės. [14] Žvakutės pagamintos su želatinos-glicerolio pagrindu lėtai tirpsta ir užtikrina lėtą nuolatinį vaistinės medžiagos išsiskyrimą. [14]

Želatinos-glicerolio pagrindas gali būti naudojamas paruošti visus žvakučių tipus, ypač tinka gaminant vaginalines žvakutes. Taip pat šis pagrindas gali būti naudojamas žvakutėms su boro rūgštimi; bromidais, chloralio hidratu, jodidu, jodoformu ir kitais vaistais. Be to, šis pagrindas yra geriausia ir patikimiausia priemonė žvakučių su antiseptinėmis medžiagomis gamyboje. Dažniausiai želatinos-glicerolio pagrindas susideda iš 70% glicerolio, 20% želatinos ir 10%vandens. Jis netirpsta kūno temperatūroje, bet greičiau tirpsta kūno ertmėse, į kurias yra įdėta žvakutė. [14,15]

Trūkumai:

 Nenuspėjamas tirpimo laikas. Jis svyruoja dėl maišymosi su želatina ir pagrindo amžiaus.  Glicerolio žvakutės laisvina vidurius.

 Higroskopiškas. Pagrindas turi būti apsaugotas nuo šilumos ir drėgmės. Pasižymi dehidratuojančiomis savybėmis ant tiesiosios žarnos ar makšties gleivinės, gali pasireikšti alergija.

 Mikrobinis užterštumas. Gali būti naudojami konservantai, todėl kyla problemų dėl nesuderinamumo.

 Ilgas paruošimo laikas. Pagrindą paruošti užtrunka ilgiau negu paruošti riebalų pagrindus. Be to, pagrindą sunku nunešti iki žvakučių formų. Formų sutepimas yra būtinas. [14]

Polietileno glikoliai (makrogoliai)

Polietileno glikoliai yra polimerai, sudaryti iš etileno oksido ir vandens. Jie yra kaip skysčiai, kurių vidutinė molekulinė masė svyruoja nuo 200 Da iki 600 Da, ir kaip vaškas – kaip kietas kūnas, kurio molekulinė masė yra apie 1000 Da. 2 lentelėje pateikiami polietileno glikolių mišinių pavyzdžiai, formuojant minkštą ir kietą pagrindą.

2 lentelė. Polietileno glikolio pagrindų mišinių pavyzdžiai [15] Pagrindas 1 (Bendrosios paskirties minkštas pagrindas)

PEG 3350 60%

PEG 1000 30%

PEG 300 10%

Pagrindas 2 (Bendrosios paskirties kietas pagrindas)

PEG 8000 30%

Polietileno glikoliai yra tirpūs vandenyje, higroskopiški ir jų garų slėgis mažėja didėjant vidutinei molekulinei masei. [14] Be to, polietileno glikoliai gali būti naudojami kaip emulsikliai. [17] Žvakutės su polietileno glikoliais gali būti paruošiamos ir karšto, ir šalto suspaudimo metodais. Polietileno glikolių pH reikšmė yra 4,5-7,5. [16]

Polietileno glikolių privalumai: mažas mikrobinis užterštumas, patogus žvakučių paruošimas ir nebūtinas žvakučių formų sutepimas. Lydymosi temperatūra aukštesnė už kūno temperatūrą, todėl nėra būtina laikyti vėsioje vietoje. Tinka naudoti karštame klimate ir mažesnė tikimybė, kad ištirps apdorojant. Aukšta lydymosi temperatūra taip pat reiškia, kad pagrindas netirpsta jį įdėjus į kūno ertmę, bet lėtai ištirpina ir išsklaido vaistinę medžiagą. Pagrindas pasižymi didele klampa. Kai vaistais pasiskirsto organizme, pagrindo ištekėjimas iš organizmo yra mažai tikėtinas.[14]

Polietileno glikolių pagrindas turi ir keletą trūkumų: yra higroskopiškas. Kaip ir želatinos-glicerolio pagrindas, polietileno glikolio pagrindai gali dirginti gleivinę. Pasižymi prastu vaistų biologiniu prieinamumu. Geras tirpumas gali būti vaistinės medžiagos užsilaikymo suskystintame pagrinde priežastimi, dėl šios priežasties sumažėja terapinis poveikis. Vienas iš trūkumų yra nesuderinamumas. Polietileno glikolio pagrindai yra nesuderinami su kai kuriomis vaistinėmis medžiagomis, pavyzdžiui, bismuto druskomis, ichtamoliu, benzokainu ir fenoliu, ir mažina kai kurių amonio junginių ir hidroksibenzoato veiklą. Jie taip pat sąveikauja su kai kuriais plastikais, todėl reikia atidžiai pasirinkti talpyklę. Taip pat polietileno glikolių pagrindai yra trapūs. Trapumas sumažinamas pridėjus paviršinio aktyvumo medžiagų ar plastifikatorių. [14]

3 lentelė. Molekulinės masės įtaka lydymosi temperatūrai. [17]

Vidutinė molekulinė masė (Daltonai) Molekulinės masės svyravimai (Daltonai) Lydymosi temperatūra (°C) 200 190-210 - 400 380-420 4-8 600 570-630 20-25 1500 1300-1600 44-48 4000 3000-4700 54-58

Polietileno glikoliai yra aprašomi kaip puikiai tinkantys pagrindai žvakučių gamybai. Jie parenkami pagal molekulinės masės ir klampumo diapazoną, kad būtų užtikrinta reikiama lydymosi temperatūra žvakutės veikimui. Kaip parodyta 3 lentelėje, polietileno glikolio lydymosi temperatūra keičiasi priklausomai nuo molekulinės masės.

Polietileno glikoliai, kurių molekulinė masė yra apie 1000 Da, užtikrina pageidaujamą lydymosi temperatūrą ir pastovumą, todėl šis pagrindas yra efektyvus žvakučių gamyboje. [17]

3. TYRIMŲ METODIKA IR METODAI

3.1. Tyrimo objektas

Žvakutės su antivaginolizinu, pagamintos naudojant šiuos pagrindus: kakavos sviestą, rafinuotą kakavos sviestą, Witepsol H15, W35, W45 ir trigliceridus.

3.2. Medžiagos ir prietaisai

3.2.1. Tyrime naudotos medžiagos

 Antivaginolizinas (baltymas). (UAB „Profarma“,Lietuva);  Išgrynintas vanduo (Ph.Eur.01/2008:0008);

 Kakavos sviestas (Henry Lamotte GmbH, Vokietija);

 Kakavos sviestas (rafinuotas, baltas) (Henry Lamotte GmbH, Vokietija);  Trigliceridai (Ph.Eur.01/2010:0868) (Sigma-Aldrich, JAV);

 Witepsol (H15, W45, W35) (Sasol GmbH, Vokietija);

 Ledinė acto rūgštis (Ph.Eur.01/2008:0590) (Sigma-Aldrich, JAV);  Pieno rūgštis (Ph.Eur.01/2008:0458) (Sigma-Aldrich, JAV);

 Ultra švarus vanduo, paruoštas Millipore vandens valymo sistema (VU Biotechnologijos institutas, Lietuva);

 Etanolis (Stumbras, Lietuva);

 Natrio dodecilsulfato tirpalas (Sigma-Aldrich, JAV)  Amonio persulfato milteliai (Sigma-Aldrich, JAV)

 NaDS tirpalas - TRIS-glicino buferis (Thermo-scientific,JAV)

 Neredukuoto pavyzdžio buferinis tirpalas (Lane Marker non-reducing Sample Buffer, Thermo-scientific, JAV)

 Akrilamidas – BIS (Bio-Rad, JAV)

 N,N,N,N´ - tetrametiletilendiaminas (TEMED) (Bio-Rad, JAV)  Standartas (Molecular weight standards) (Thermo-scientific,JAV)

 1,5 M TRIS-HCL buferinis tirpalas, pH 6,8 ir 8,8 (Bio-Rad, JAV)  Fosfatinis buferinis tirpalas – PBS (Sigma-Aldrich, JAV)

 Baltymų standartas (Baltymas scFv 5/6 c=0.63 mg/mL, 003-007-140702 po Mustang E, naudojamas elektroforezei (UAB „Profarma“,Lietuva);

 Žmogaus kraujas iš venos (savanorių kraujas, VU Biotechnologijos institutas, Lietuva);  Vaginolizinas (VU Biotechnologijos institutas, Lietuva);

3.2.2. Reagentų paruošimas

Tirpalai, naudoti NaDS elektroforezėje

Atlikta bendradarbiaujant su VU Biotechnologijos instituto mokslininkais.

1. 10 proc. NaDS tirpalas. 5 g NaDS tirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 50 ml. Laikoma 15 – 25 °C temperatūroje.

2. 10 proc. amonio persulfato (APS) tirpalas. 100 mg amonio persulfato miltelių ištirpinama 1 ml vandens. Paruošiamas prieš naudojimą.

3. Elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS – glicino - NaDS buferinis tirpalas (10X) skiedžiamas vandeniu iki 1000ml. Laikoma 15 – 25 °C temperatūroje.

Geliai, naudoti NaDS elektroforezėje

Atlikta bendradarbiaujant su VU Biotechnologijos instituto mokslininkais. Paruošiamas 15% koncentracijos frakcionuojantis (apatinis) poliakrilamidinis gelis. Jis paruošiamas sumaišant 2,5 ml 1,5M TRIS-HCL (pH 8,8) buferinio tirpalo, 2,3 ml ultra švaraus vandens, 5 ml akrilamido – BIS tirpalo, 0,1 ml 10 proc. NaDS tirpalo, 0,1 ml 10 proc. amonio persulfato tirpalo ir 0,01 ml TEMED.

4% koncentracijos koncentruojantis (viršutinis) gelis pagaminamas sumaišant 2,5 ml 1,5M TRIS-HCL (pH 6,8) buferinio tirpalo, 6,1 ml ultra švaraus vandens, 1,3 ml akrilamido – BIS tirpalo, 0,1 ml 10 proc. NaSD tirpalo, 0,05 ml 10 proc. amonio persulfato tirpalo ir 0,01 ml TEMED.

Paruoštas 15% koncentracijos frakcionuojantis (apatinis) poliakrilamidinis gelis pilamas į formą. Atstumas nuo viršutinio krašto turi būti 4±0,5 cm. Pilama 1 ml švaraus vandens ir paliekama 20-30 minučių, esant 15 – 25 °C temperatūrai. Tuo metu vyksta polimerizacija. Frakcionuojantis gelis sustingsta ir ant jo pilamas paruoštas 4% koncentracijos koncentruojančio (viršutinis) gelio tirpalas ir įstatomos gelio takelius formuojančios šukos. Polimerizacija trunka 40-50 minučių, esant 15 – 25 °C temperatūrai. Prieš elektroforezę šukos ištraukiamos ir praplaunama švariu vandeniu.

3.2.3. Tyrime naudoti prietaisai

 Analitinės svarstyklės „SCALTEC“ (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija);  Vandens vonelė „J.P.Selecta“, s.a. (Ispanija);

 Termometras „LCD Digital Portable Multi-Thermometer“ (Kinija);  Mikropipetės „Gilson“ (Prancūzija);

 pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija);  Magnetinė maišyklė „MSM-20A“ (Korėja);

 Maišyklė Unguator2100® (Gako International, Vokietija);  Krepšelio aparatas Erweka DZT (Erweka GmbH, Vokietija)

 Tekstūros analizatorius „TA.XT.plus“ (Stable Micro Systems Ltd, Godalming, Surrey, Jungtinė Karalystė);

 Mikroskopas Motic® (Motic China Group Co., Ltd., Kinija);

 Elektroforezės aparatas „Cleaver“ VS10 (Cleaver Scientific Ltd, Jungtinė karalystė);  Spektofotometras TECAN infinite M200 (Tecan, Vokietija);

 Centrifuga Eppendorf Centrifuge 541R (Eppendorf Research, JAV);  Šilumos cirkuliacinis termostatas (Huber GmbH, Vokietija);

3.3. Metodai

3.3.1. Žvakučių gamyba ritinimo būdu, kai pagrindas yra kakavos sviestas

Žvakutės buvo gamintos ritinimo būdu ir kaip pagrindas naudotas kakavos sviestas. Pagamintos kontrolinės žvakutės ir žvakutės su baltymu.

Kakavos sviestas susmulkinamas. Pasveriamas atitinkamas jo kiekis ir suberiamas į grūstuvę. Piestele minkoma iki vienalytės masės. Kad masė būtų plastiška, į ją dedama bevandenio lanolino. Į minkomą masę įlašinamas baltymas. Kai žvakutės masė lengvai atšoka nuo grūstuvės sienelių, ji pernešama ant stiklinės plokštelės. Mentelė yra apvyniojama pergamentiniu popieriu ir naudojama suformuoti lygią ilgą cilindrinę lazdelę. Lazdelė supjaustoma lygiais gabalėliais ir iš jų yra ritinamos žvakutės.

3.3.2. Kakavos sviesto pH reikšmės nustatymas

pH reikšmė nustatyta pH-metru pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1. Prieš tyrimą pH – metro elektrodas nuplaunamas išgrynintu vandeniu. Matuojant kakavos sviesto pH reikšmę, pagaminama kakavos sviesto 5% ištrauka. Į tiriamąją ištrauką įkišus elektrodą, parodoma pH reikšmė. Tyrimas buvo pakartotas 3 kartus, esant 37±2°C temperatūrai.

Kakavos sviesto pH reikšmė buvo reguliuojama naudojant 10% ledinę acto rūgštį. Į kakavos sviesto 5% ištrauką lašinant 10% ledinę acto rūgštį pH reikšmė reguliuojama iki 4,2±0,05. Matavimai atlikti esant 37±2ºC temperatūrai.

3.3.3. Žvakučių gamyba liejimo būdu su kakavos sviestu, parūgštintu 10% ledine

acto rūgštimi

Žvakutės buvo gaminamos liejimo būdu ir kaip pagrindas naudojamas kakavos sviestas. Pagamintos kontrolinės žvakutės ir žvakutės su skirtingais baltymo kiekiais, kai kakavos sviesto pH reikšmė nepakeista ir kai pakeista iki 4,2±0,05 , naudojant 10% ledinę acto rūgštį.

Buvo pagamintos dviejų rūšių kontrolinės žvakutės. Vienų pagrindas – kakavos sviestas, kitų pagrindas kakavos sviestas, kurio pH=4,2±0,05.

Gaminant žvakutes su kakavos sviestu, kurio pH reikšmė nepakeista, buvo dedama 9,1 µl baltymo. Visos kitos žvakutės buvo gaminamos su kakavos sviestu, kurio pH=4,2±0,05. Į šias žvakutes buvo dedama 9,1µl, 50µl, 135µl, 275µl ir 405µl baltymo.

Pasveriamas atitinkamas kiekis kakavos sviesto. Dalis kakavos sviesto suberiama į indelį, tuomet įlašinama 10% ledinės acto rūgšties iki pH reikšmės 4,2±0,05, įberiama dar šiek tiek kakavos sviesto, įpilamas baltymas ir likęs kakavos sviestas. Tokiu būdu baltymas yra įterpiamas į kakavos sviestą. Indelis su tiriama mase yra prijungiamas prie maišyklės Unguator®2100 ir nustatomas režimas suppositories. Gauta vienalytė masė supilama į žvakučių formeles.

Žvakutės, į kurias buvo įdėta 405µl baltymo ir kurių pagrindo pH=4,2±0,05, taip pat buvo gaminamos naudojant maišyklę Unguator®2100, tačiau baltymas buvo įdėtas maišymo pabaigoje. Prietaisui nustojus veikti ir nuėmus indelį su parūgštintu kakavos sviestu, į gautą vienalytę masę įdedama 405µl baltymo, greitai išmaišoma ir supilama į žvakučių formeles.

3.3.4. Žvakučių gamyba su trigliceridų ir kakavos sviesto pagrindais,

parūgštintais 10% pieno rūgštimi

Gaminant žvakutes su trigliceridų pagrindu, pasigaminama 5% trigliceridų ištrauka, į kurią lašinama 10% pieno rūgštis iki pH reikšmės 4,2±0,05. Į parūgštintą 5% trigliceridų ištrauką įpilama 50µl baltymo.

Žvakutės su kakavos sviestu gaminamos liejimo būdu, masę paruošiant ranka. Pagaminamos kontrolinės žvakutės su kakavos sviestu, parūgštintu 10% pieno rūgšties tirpalu. Baltymo kiekis žvakutėje – 50 µl. Kakavos sviestas lydomas ant kaitinimo plytelės MSM-20A. Kai temperatūra pasiekia 37±2°C, tuomet į kakavos sviestą įpilama 10% pieno rūgšties tirpalo iki pH reikšmės 4,2±0,05. Maišoma ir įpilamas baltymas. Gauta masė supilama į formeles.

3.3.5. Žvakučių su Witepsol H15, W45, W35, kakavos sviesto ir rafinuoto kakavos

sviesto pagrindais gamyba

Žvakutės gaminamos su Witepsol H15, W45, W35, kakavos sviesto ir rafinuoto kakavos sviesto pagrindais, parūgštintais 10% pieno rūgštimi. Baltymo kiekis vienoje žvakutėje 25µl. Gaminant žvakutes buvo nustatoma kiekvieno pagrindo pH reikšmė ir lašinama 10% pieno rūgšties, kol pasiekiama 4,2±0,05 pH reikšmė. Žvakutės buvo gaminamos liejimo būdu, naudojant maišyklę

Unguator®2100.

3.3.6. Baltymo ekstrakcija iš žvakučių su kakavos sviesto, rafinuoto kakavos

sviesto ir Witepsol H15, W45, W35 pagrindais

Tirpimo testo metodika (Ph.Eur. 01/2002, 2.9.3.) buvo pritaikyta žvakučių mėginių ekstraktų gavimui, kurie toliau naudojami NaDS elektroforezės ir hemolizės tyrimams atlikti. Tyrime buvo naudojamas mentinis prietaisas Erweka DZT. Atliekama 100 apsisukimų per minutę greičiu. Žvakučių pagrindų receptūros ir tirpimo terpės sudėtys pateikiamos 4 lentelėje. Visose žvakutėse baltymo buvo po 9,1µl.

4 lentelė. Žvakučių pagrindų receptūros ir tirpimo terpė

Žvakutės numeris

Pagrindas Tirpimo terpė

1 Kakavos sviestas Išgrynintas vanduo

2 Kakavos sviestas Išgryninto vandens ir 10%

ledinės acto rūgšties tirpalas, kurio pH=4,2±0,05 3 Kakavos sviestas parūgštintas 10%

ledine acto rūgštimi. Pagrindo pH=4,2±0,05

Išgrynintas vanduo

4 Kakavos sviestas parūgštintas 10% ledine acto rūgštimi. Pagrindo pH=4,2±0,05

Išgryninto vandens ir 10% ledinės acto rūgšties tirpalas, kurio pH=4,2±0,05

Atliekant tyrimą į indą buvo pilama tirpimo terpė ir pašildoma iki 37±0,5°C. Žvakutė dedama į tirpimo terpę ant indo dugno ir pradedama sukti prietaiso mentė. Imami du bandiniai: po 30 ir 60 minučių. Paėmus tam tikrą kiekį tiriamojo skysčio, įpilamas toks pat kaip paimtas tirpimo terpės kiekis.

Kitas tyrimas baltymo ekstrakcijai buvo atliekamas bendradarbiaujant su VU Biotechnologijos Instituto mokslininkais. Atliekant baltymo ekstrakciją iš žvakutės, kurios pagrindas kakavos sviestas, dalis žvakutės įdedama į fosfatinį buferinį tirpalą (PBS) , kurio pH reikšmė 6,5±0,05 ir inkubuojama 1 val., esant 37±2 oC temperatūrai. Po inkubacijos mėgintuvėlis dedamas į šaldytuvą, kakavos sviestui sustingus, imami buferinio tirpalo mėginiai tolimesniems tyrimams.

Vykdant tyrimą su žvakutėmis, kurių pagrindai yra Witepsol H15, W45, W35 ir rafinuotas kakavos sviestas, žvakutės dalis įdedama į 1,5% PEG 4000, PBS buferinį tirpalą,kurio pH reikšmė 6,5±0,05 ir inkubuojama 1 val.,esant 37±2 oC temperatūrai. Po inkubacijos mėgintuvėlis dedamas į šaldytuvą, žvakutės masės mėginiui sustingus, imami buferinio tirpalo mėginiai ir filtruojami per 30 kDa centrifuginius filtrus. Gauti žvakutės masės mėginiai naudojami baltymų elektroforezei (dažymas sidabru) bei hemolizės tyrimams.

3.3.7. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė

Šis tyrimas atliktas bendradarbiaujant su VU Biotechnologijos Instituto mokslininkais. Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS-PAGE) buvo atliekama baltymo stabilumo nustatymui įvairiuose pagrinduose. Vykdant tyrimą visų pirma buvo paruošiami mėginiai. Imamos baltymų frakcijos ir sumaišomos su neredukuoto pavyzdžio buferiniu tirpalu (angl. Lane Marker

non-Reducing Sample Buffer x5, „Thermo – scientific“). Tuomet mėginiai kaitinami termostate 5 minutes,

esant 95 °C temperatūrai.

NaDS-PAGE elektroforezė atliekama vertikaliame elektroforezės aparate poliakrilamido gelyje neredukuojančiomis sąlygomis. Paruošiamas poliakrilamidinis gelis sudarytas iš 15% koncentracijos frakcionuojančio (apatinio) ir 4% koncentracijos koncentruojančio (viršutinio) gelio. Forma su paruoštu geliu yra įstatoma į elektroforezės aparatą, iš gelio ištraukiamos šukos. Gelio matmenys 10x10x1 mm. Viršutinis ir apatinis elektroforezės aparato rezervuarai užpildomi elektroforezės tirpalu: TRIS-glicino-NaDS buferiu (angl. Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X),

„Thermo-scientific“). Ant gelio užnešami mėginiai ir standartas (angl. Molecular weight standards, „Thermo-scientific“). Elektroforezė vykdoma 80 minučių per gelį tekant 25 mA stiprio elektros srovei.

Pasibaigus elektroforezei, gelio plokštelė išimama, apatinis gelis iškerpamas nuo viršutinio gelio ir ruošiama dažymui.

Po elektroforezės gelis dažomas sidabro nitrato tirpalu. Gelis dedamas į specialų indą, kuriame jis 5 minutes plaunamas ultra švariu vandeniu. Vanduo pakeičiamas ir gelis plaunamas dar 5 minutes. Po to gelis užpilamas tirpalu, pagamintu iš 30 proc.etanolio ir 10 proc.acto rūgšties, santykiu 3:1, laikoma 15 minučių. Kartojama 2 kartus. Tuomet 30 proc.etanolio ir 10 proc.acto rūgšties tirpalas nupilamas ir gelis plaunamas 2 kartus 10 proc.etanolio tirpalu, laikoma po 5 minutes. Gelis 2 kartus plaunamas ultra švariu vandeniu po 5 minutes. Po to gelis laikomas jautrumą didinančiame darbiniame tirpale (0,2 proc.“Silver Stain Sensitizer“ tirpalas ultra švariame vandenyje). Dar kartą perplaunama ultra švariu vandeniu. Tuomet ant gelio pilama 2 proc. „Silver Stain Enhancer“ ir „Silver Stain“ mišinio. Šiame mišinyje gelis laikomas 30 minučių ir perplaunama vandeniu. Ant gelio pilama ryškinamojo tirpalo (2 proc. „Silver Stain Enhancer“ su „Silver Stain Developer“). Tokiu būdu išryškinamos gelyje atsiradusios baltymų juostelės. Nudažytas gelis stabilizuojamas 5 proc. acto rūgštimi.

3.3.8. Hemolizės testas

Tyrimas atliktas bendradarbiaujant su VU Biotechnologijos Instituto mokslininkais. Hemolizės testas atliekamas siekiant nustayti baltymo aktyvumą. Paimama 4ml žmogaus kraujo iš venos. Ampulė su krauju centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 5 min., esant kambario temperatūrai. Nupylus supernatantą, eritrocitai suspenduojami steriliai filtruotame PBS buferiniame tirpale (iki 4 ml) ir vėl centrifuguojami 1000 aps./min. greičiu 5 min., esant kambario temperatūrai. Kartojama 3 kartus, galiausiai pridedama steriliai filtruoto PBS buferinio tirpalo iki 4 ml.

Spektrofotometriniu metodu nustatomas eritrocitų suspensijos tūris. Eritrocitų suspensija įvedama į 1 ml dejonizuoto vandens. Siekiama gauti tirpalo optinį tankį (esant 415 nm bangos ilgiui) ne didesnį nei 1,5. Paprastai būna apie 3 – 4 µl eritrocitų suspensijos 1ml vandens.

Nustačius eritrocitų suspensijos kiekį, sužinoma, koks minimalus VLY toksino kiekis reikalingas pilnai suardyti visiems eritrocitams. Paprastai tai būna 4 ng/ml VLY. Toliau mikroplokštelėje, sudarytoje iš 96 šulinėlių, inkubuojamas minimalus VLY kiekis (40 µl 0,1 µg/mL VLY) kartu su žvakutės masės mėginiu. Inkubacija vykdoma 30 minučių PBS buferiniame tirpale, kurio pH reikšmė 6,5±0,05 , esant kambario temperatūrai (20±2ºC).

Po baltymo inkubacijos su VLY, mikroplokštelės šulinėlių turinys supilamas į 1,5 ml eppendorf mėgintuvėlius, pridedama eritrocitų suspensijos bei PBS buferinio tirpalo, kurio pH reikšmė 6,5±0,05 iki galutinio tūrio - 1 ml. Inkubuojama 30 min. kambario temperatūroje. Po inkubacijos mėgintuvėliai centrifuguojami 1000 aps./min. greičiu 5 min., esant kambario temperatūrai (20±2ºC), kad nebūtų pažeisti nesulizuoti eritrocitai. Matuojamas supernatantų optinis tankis, esant 415 nm bangos ilgiui.

Kaip kontrolė hemolizės tyrime buvo naudojama:

- Eritrocitų suspensija PBS buferiniame tirpale (galutinis tūris toks pat kaip ir mėginių).

- Eritrocitų suspensija su didžiausia žvakutės masės mėginio koncentracija (galutinis tūris toks pat kaip ir mėginių).

- Eritrocitų suspensija su VLY (galutinis tūris tok pats kaip ir mėginių).

- Eritrocitų suspensija su baltymu žvakutės masės mėginio ekstrakte (galutinis tūris toks pat kaip ir mėginių).

3.3.9. Vienalytiškumo tyrimas

Mėginių vienalytiškumui nustatyti buvo naudojamas mikroskopas Motic®, kuriame integruota kamera ir programinė įranga (Motic® Images Plus). Preparatas paruošiamas dedant ant objektinio stiklelio skalpeliu atpjautą labai ploną žvakutės sluoksnį, užlašinant imersinio aliejaus lašą ir gerai prispaudžiant dengiamuoju stikleliu. Naudotas 400X didinamasis lęšis. Mikroskopinio stebėjimo metu daromos preparatų nuotraukos, stebimi paruoštų preparatų skirtumai ir vertinamas žvakučių masės vienalytiškumas.

3.3.10. Žvakučių pagrindų tekstūros analizavimas

Žvakučių pagrindų tekstūra analizuojama naudojantis tekstūros analizatoriumi TA.XT.plus. Atliekama remiantis kompiuterinėje programoje esančiu testu, skirtu įvertinti ir palyginti žvakučių kietumą (angl. Comparison of hardness of different formulation of suppositories by penetration with 2

mm needle probe). Šio tyrimo metu yra išmatuojama zondo prasiskverbimo jėga į tiriamąsias žvakutes.

[29] Siekiant tikslių rezultatų svarbu, kad mėginių masė būtų vienoda, aplinkos ir mėginių temperatūra būtų ta pati ir būtų tie patys tekstūros analizatoriaus programos parametrai.

Prieš tyrimą prie pagrindinio aparato strypelio, prisukamas adatos formos zondas, kuris tyrimo metu skverbiasi į žvakutę. Ant specialios tekstūros analizatoriaus plokštumos – platformos yra padedama žvakutė. Matavimai vykdomi į dvi žvakutės vietas: visų pirma laikant žvakutę šoninėje pozicijoje (3 pav.), po to skalpeliu nupjovus žvakutės viršūnę, tyrimas atliekamas laikant statmenai (4 pav).

3 pav. Tekstūros analizė atliekama 4 pav. Tekstūros analizė atliekama laikant žvakutę šoninėje pozicijoje laikant žvakutę statmenoje pozicijoje

Kompiuterinėje programoje (Exponent) pasirenkamas testas – žvakutės (angl. suppositories). Taip pat pasirenkami darbinio režimo parametrai: atstumas - 3,0 mm, greitis – 0,5 mm/s. Nustačius reikiamus parametrus, tekstūros analizatorius pradeda veikti – adata nusileidžia ir skverbiasi gilyn į mėginį. Tuomet kompiuterinėje programoje automatiškai yra nubraižomas grafikas ir duomenų lentelėse yra užrašomi tyrimo rezultatai. (5 pav.) Su kiekviena žvakute tyrimas kartojamas 3 kartus ir po kiekvieno bandymo zondas kruopščiai nuvalomas popierine servetėle.

5 pav. Kompiuterinės programos grafikas. Kreivės atspindi žvakučių kietumą. (Force – zondo prasiskverbimo jėga gramais (g); Time – laikas sekundėmis (s), kai zondas

skverbiasi į žvakutę) [29]

3.3.11. Masės vienodumo testas

Masės vienodumo testas atliktas remiantis Ph.Eur. 01/2002, 2.9.5. Vienadoziai preparatai turi atitikti masės vienodumo testą. Tyrimas atliekamas pasveriant 20 atsitiktinai parinktų tos pačios sudėties žvakučių ir tuomet apskaičiuojama vidutinė vienos žvakutės masė. Nukrypimai nuo vidutinės masės neturi viršyti ±5 procentų. Tai yra ne daugiau kaip dviejų žvakučių masės nuokrypis nuo vidutinės masės neturi viršyti ±5 procentų. [1]

3.3.12. Žvakučių fizikinių savybių vertinimas

Norint įvertinti žvakučių fizikines savybes, atliekama vizualinė apžiūra: įvertinama spalva, kvapas, paviršiaus būklė. [18] Apžiūrint žvakutę atsižvelgiama į spalvos intensyvumą, pobūdį, vienalytiškumą. [23] Įvertinamas žvakutės paviršius, t.y. blizgesys, lygumas, dėmelės, įtrūkimai, tamsesnės vietos, įdubimai, oro burbuliukai, grūdėtumas ir kt. [23] Taip pat matuojamas žvakučių plotis ir ilgis.

3.3.13. Statistinė duomenų analizė

Tyrimo metu gauti duomenys apdoroti naudojant Microsoft® Office Excel 2010 programą. Duomenys statistiškai palyginti taikant dispersinę analizę (ANOVA), naudojant GraphPad Prism 5.02 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, JAV) programą. Vidurkiai pateikti su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis, skirtumai tarp vidurkių patiki, jei p<0,05.

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

4.1.

Gamybos metodo įtaka žvakučių formulavimui

Pasirenkant gamybos metodą, labai svarbu įvertinti gamybos trukmės ir pagamintų produktų kiekio santykį. Žvakutės buvo gaminamos ritinimo ir liejimo metodais. Ritinimo metodas aprašytas 3.3.1 skyriuje, o liejimo – 3.3.3 skyriuje. Literatūroje minimi abu šie žvakučių gamybos metodai, tačiau akcentuojama, kad liejimo metodas taikomas dažniausiai. [1] Palyginus technologijos ypatumus, nustatyta, kad taikant liejimo metodą per tą patį laikotarpį galima pagaminti reikšmingai daugiau žvakučių negu gaminant ritinimo būdu, nes gaminant liejimo metodu yra naudojama maišyklė

Unguator®2100, o ritinimo metodu žvakutės yra gaminamos rankiniu būdu. Be to, svarbu atsižvelgti į

tai, kad liejimo metodu pagamintos žvakutės yra taisyklingos vienodos torpedos formos (6 pav.), nes gamybos metu naudojamos formelės, į kurias liejama išlydyta žvakučių masė.

6 pav. Liejimo metodu pagamintos žvakutės. Kairėje – kontrolinė žvakutė, dešinėje – žvakutė su baltymu.

*Sudėtis: pagrindas – kakavos sviestas, baltymo kiekis 50µl, pH reikšmę reguliuojanti medžiaga - 10% ledinė acto rūgštis

Pagal pagamintas žvakutes, pavaizduotas 6 pav., galima spręsti, kad baltymas neturi įtakos žvakučių išvaizdai, nes žvakutė su baltymu nesiskiria nuo kontrolinės žvakutės.

Gaminant žvakutes ritinimo metodu, rankiniu būdu sunku išgauti vienodą žvakučių formą, suformavimas priklauso nuo rankos įgūdžių. (7 pav.). Gali skirtis pagamintų žvakučių svoris, ilgis ir plotis.

7 pav. Ritinimo metodu pagamintos žvakutės. 1- kontrolinė žvakutė, 2 ir 3 žvakutės su baltymu. *Sudėtis: pagrindas – kakavos sviestas, baltymo kiekis 9,1µl, pH reikšmę reguliuojanti

medžiaga – 10% ledinė acto rūgštis

Taip pat liejimo metodu pagamintose žvakutėse veiklioji medžiaga pasiskirsto tolygiau negu gaminant ritinimo metodu, nes naudojant maišyklę Unguator®2100 ir nustačius režimą suppositories,

žvakučių masė yra maišoma tam tikru greičiu ir visos medžiagos yra išmaišomos tolygiai. Rankiniu būdu ruošiant žvakučių masę ritinimui, veiklioji medžiaga gali pasiskirstyti nevienodai.

Taigi, palyginus ritinimo ir liejimo gamybos metodus bei remiantis gautais rezultatais, tolimesniems tyrimams atlikti, žvakutės buvo gaminamos liejimo metodu.

4.2. Gamybos metodo įtaka žvakučių formos kokybei

Žvakučių gamybai pritaikius liejimo metodą, dalis žvakučių buvo pagaminta naudojantis maišyklę Unguator®2100, kita dalis žvakučių – masę paruošiant ranka. Metodikos aprašytos 3.3.3 ir

3.3.4 skyriuose. Pagaminus žvakutes pastebėta, kad skiriasi skirtingais metodais ruoštų žvakučių fizinė išvaizda, skiriasi jų formos taisyklingumas ir vienodumas. Pavyzdžiai pateikti 8 ir 9 paveiksluose.

8 pav. Žvakutės, pagamintos naudojant maišyklę Unguator®2100. Kairėje – kontrolinė žvakutė, dešinėje – žvakutė su baltymu.

*Sudėtis: pagrindas – kakavos sviestas, baltymo kiekis 50µl, pH reikšmę reguliuojanti medžiaga –10% ledinė acto rūgštis

9 pav. Žvakutės, pagamintos masę paruošiant ranka. Kairėje – kontrolinė žvakutė, dešinėje – žvakutė su baltymu.

*Sudėtis: pagrindas – kakavos sviestas, baltymo kiekis 50µl, pH reikšmę reguliuojanti medžiaga –10% pieno rūgštis

Apžiūrėjus pagamintas žvakutes matoma, kad žvakutės, kurios buvo pagamintos su maišykle

Unguator®2100, yra taisyklingos torpedos formos (8 pav.) ir skiriasi savo fizine išvaizda nuo

žvakučių, pagamintų rankiniu būdu. Pastarosios nėra vienodos, žvakutėms yra nutrupėjusios viršūnės (9 pav.). Taip pat pastebima, kad žvakučių, pavaizduotų 9 paveikslėlyje, paviršius yra nelygus. Remiantis pagamintų žvakučių išvaizda galima teigti, kad žvakutės, paruoštos su maišykle

4.3. Kakavos sviesto pagrindo ir 10% ledinės acto rūgšties įtaka baltymo

stabilumui

Tyrimo metu buvo siekiama išsiaiškinti, ar kakavos sviesto pagrindas bei 10 % ledinė acto rūgštis turi įtakos baltymo stabilumui. Literatūros šaltiniuose duomenų apie tai nėra, todėl buvo aktualu atlikti baltymo kokybinį nustatymą ir išsiaiškinti ar kakavos sviesto pagrinde, parūgštintame 10% ledine acto rūgštimi, baltymas išliko stabilus.

Eksperimento pradžioje buvo atliekamas žvakučių mėginių ekstraktų gavimas, taikant tirpimo testo metodiką, pagal 3.3.6 skyriuje pateiktą aprašymą. Atliekant bandymą buvo panaudotos keturios žvakutės, kuriose yra po 9,1 µl baltymo. Žvakučių pagrindas – kakavos sviestas. Vienose žvakutėse kakavos sviesto pH reikšmė buvo nekeičiama, kitose – reguliuojama iki pH reikšmės 4,2±0,05, naudojant 10% ledinę acto rūgštį. Kaip tirpimo terpė buvo naudojamas išgrynintas vanduo bei vandens ir 10% ledinės acto rūgšties tirpalas, kurio pH reikšmė nureguliuota iki 4,2±0,05. Pagrindų receptūros, tirpimo terpė ir mėginių ėmimo laikas pateikiamas 5 lentelėje.

5 lentelė. Žvakučių su kakavos sviestu mėginių pagrindai ir tirpimo terpė

Nr. Tirpimo terpė Pagrindas Mėginių

ėmimo laikas 1. Išgrynintas vanduo Kakavos sviestas, kurio

pH=4,2±0,05

Mėginys po 30 min. 2. Išgrynintas vanduo Kakavos sviestas Mėginys po 30 min. 3. Išgrynintas vanduo Kakavos sviestas, kurio

pH=4,2±0,05

Mėginys po 60 min. 4. Išgrynintas vanduo Kakavos sviestas Mėginys po 60 min. 5. Vandens ir 10% ledinės

acto rūgšties tirpalas, kurio pH= 4,2±0,05

Kakavos sviestas, kurio pH=4,2±0,05

Mėginys po 30 min.

6. Vandens ir 10% ledinės acto rūgšties tirpalas, kurio pH= 4,2±0,05

Kakavos sviestas Mėginys po 30 min.

7. Vandens ir 10% ledinės acto rūgšties tirpalas, kurio pH= 4,2±0,05

Kakavos sviestas, kurio pH=4,2±0,05

Mėginys po 60 min.

8. Vandens ir 10% ledinės acto rūgšties tirpalas, kurio pH= 4,2±0,05

Kakavos sviestas Mėginys po 60 min.

Paėmus žvakučių mėginių frakcijas po 30min. ir 60min., jos buvo tiriamos NaDS-PAGE elektroforezės prie neredukuojančių sąlygų metodu, aprašytu 3.3.7 skyriuje. NaDS-PAGE ir gelio

dažymas sidabro nitrato tirpalu parodo ar tirpimo testo metu gautose mėginių frakcijose yra baltymas. Atliekamas kokybinis baltymo nustatymas ir taip įvertinamas baltymo stabilumas. NaDS-PAGE elektroforezės tyrimui buvo naudojamos 8 mėginių frakcijos, kurių sudėtys pateiktos 9 lentelėje. Naudotas kontrolinis mėginys - Baltymas scFv 5/6 c=0.63 mg/mL, 003-007-140702 po Mustang E. Tyrimo rezultatai pateikti 10 ir 11 paveiksluose.

1 2 3 4 5 6

10 paveikslas. Žvakučių masės mėginių frakcijų NaDS-PAGE elektroforezė (1)

7 8 9 10 11 12

11 paveikslas. Žvakučių masės mėginių frakcijų NaDS-PAGE elektroforezė (2)

Takeliai:

1 takelis – kontrolinis mėginys; 0,048 µg; 2 takelis – 1 mėginys; 0,048 µg; 3 takelis – 2 mėginys; 0,048 µg; 4 takelis – 3 mėginys; 0,048 µg; 5 takelis – 4 mėginys; 0,048 µg; 6 takelis – standartas, #26634. Takeliai:

7 takelis – kontrolinis mėginys; 0,048 µg; 8 takelis – 5 mėginys; 0,048 µg; 9 takelis – 6 mėginys; 0,048 µg; 10 takelis – 7 mėginys; 0,048 µg; 11 takelis – 8 mėginys; 0,048 µg; 12 takelis – standartas, #26634.

Paveiksluose pateikti rezultatai rodo, kad atlikus NaDS – PAGE elektroforezę, žvakučių masės mėginiuose baltymo nematyti, matoma tik kontrolinė baltymo juostelė. Vadinasi, žvakučių gamyboje naudotame kakavos sviesto pagrinde, parūgštintame 10% ledine acto rūgštimi, baltymas yra nestabilus, nes baltymo aptikti nepavyko.

Tolimesniems tyrimams tirpimo testo metodika žvakučių ekstraktų gavimui nebuvo taikoma, buvo atliekami kiti metodai baltymo išsiskyrimui. Kakavos sviesto tinkamumas, žvakučių su anti-VLY gamybai, toliau buvo tiriamas pagrindo parūgštinimui vietoj 10% ledinės acto rūgšties naudojant 10% pieno rūgštį bei padidinus baltymo koncentraciją žvakutėse.

4.4. Skirtingų pagrindų, pH reikšmę reguliuojančių medžiagų ir temperatūros

įtaka baltymo stabilumui

Tyrime buvo analizuojamas baltymo stabilumas kakavos sviesto ir trigliceridų pagrinduose, parūgštinant juos 10% ledine acto rūgštimi arba 10% pieno rūgštimi. Taip pat tiriama ar 37±2 oC temperatūra turi įtakos baltymo stabilumui.

Eksperimento pradžioje atliekamas žvakučių mėginių ekstraktų gavimas pagal 3.3.6 skyriuje aprašytą metodiką. Toliau taikomas mėginių NaDS-PAGE elektroforezės prie neredukuojančių sąlygų tyrimas. Mėginių receptūros ir numeravimas pateikiami 6 lentelėje.

6 lentelė. Mėginių receptūros

Nr. Mėginiai

1 Kontrolinis mėginys (baltymas)

2 Žvakutė su kakavos sviestu, parūgštintu 10% ledine acto rūgštimi iki pH reikšmės 4,2±0,05

3 Žvakutė su kakavos sviestu. Baltymo kiekis vienoje žvakutėje 9,1 µl

4 Žvakutė su kakavos sviestu, parūgštintu 10% ledine acto rūgštimi iki pH reikšmės 4,2±0,05. Baltymo kiekis vienoje žvakutėje 9,1 µl

5 Žvakutė su kakavos sviestu, parūgštintu 10% pieno rūgštimi iki pH reikšmės 4,2±0,05. Baltymo kiekis vienoje žvakutėje 50 µl

6 Trigliceridų 5 % ištrauka, parūgštinta 10% pieno rūgštimi iki pH reikšmės 4,2±0,05. Baltymo kiekis 50 µl

7 40 ml vandens + 9,5 µl baltymo. Šildyta 37±2 oC temperatūroje. Mėginys: 1 ml po 30 min.

8 40 ml vandens, parūgštinto 10% ledine acto rūgštimi iki pH reikšmės 4,2±0,05. Baltymo kiekis 9,5 µl. Šildyta 37±2 oC temperatūroje. Mėginys: 1 ml po 30 min.