FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MILDA ADOMAVIČIŪTĖ
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS
TAIKYMAS GLUOSNIO (SALIX L.) ŢIEVĖS ANALIZĖJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Dr. Guoda Kiliuvienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS
TAIKYMAS GLUOSNIO (SALIX L.) ŢIEVĖS ANALIZĖJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Dr. Guoda Kiliuvienė Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantė Milda Adomavičiūtė Data KAUNAS, 2014
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 1. SANTRUMPOS ... 7 SĄVOKOS ... 8 2. ĮVADAS ... 93. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI ... 11
4. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
4.1 Botaninė klasifikacija ... 12
4.2 Botaninis gluosnio genties apibūdinimas ... 12
4.3 Paplitimas ... 13
4.4 Augalų rūšys ir kilmė ... 13
4.5 Makroskopinis gluosnio ţievės tyrimas ... 13
4.6 Mikroskopinis gluosnio ţievės tyrimas ... 14
4.7 Cheminė gluosnio ţievės sudėtis ... 14
4.8 Panaudojimas ... 15
4.9 Cheminis aktyvių sudėtinių dalių nustatymas ... 17
4.10 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 18
4.10.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos klasifikacija, taikymas, privalumai, trūkumai ... 18
4.10.2 Fosfodiodų matricos detektorius (PDA) ... 19
4.11 Farmakopėjinė ESC metodika salicino kiekiui gluosnio ţievėje nustatyti ... 19
4.12 Gluosnio ţievės tyrimai Lietuvoje ... 21
4.13 Gluosnio ţievės tyrimai kitose šalyse ... 21
5. TYRIMO METODIKA ... 23
5.1 Tyrimo objektas ... 23
5.2 Cheminiai reagentai ... 23
5.3 Gluosnio ţievės drėgmės kiekio apskaičiavimas ... 24
5.4 Ekstraktų ir etaloninių tirpalų paruošimas ... 24
5.5 ESC taikymas Salix L. veikliųjų junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui ... 24
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
6.2 Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 25
6.3 ESC metodikos optimizavimas ... 27
6.4 Metodikos validacija... 27
6.4.1 Metodikos specifiškumas (atrankumas) ... 27
6.4.2 Tiesiškumas ... 30
6.4.3 Metodo glaudumas (preciziškumas) ... 32
6.4.4 Aptikimo ir nustatymo ribos ... 34
6.5 Kokybinis tyrimas... 34
6.6 Kiekybis tyrimas ... 35
6.6.1 Salicino ir piceino tirpalų paruošimas kalibracinėms kreivėms sudaryti ... 35
6.6.2 Piceino kiekio nustatymas gluosnio ţievės ekstraktuose ... 35
6.6.3. Seno medţio ţievės kiekybinis tyrimas ... 36
6.6.4. Salicino kiekio nustatymas 2 – 3 metų amţiaus gluosnių ţievėje ir statistinė analizė ... 37
IŠVADOS ... 39
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40
SANTRAUKA
M. Adomavičiūtės magistro baigiamasis darbas. Vadovė dr. Guoda Kiliuvienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas
Pastaruoju metu pasaulyje ir Lietuvoje vis didėja nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo (NVNU) vartojimas. Minėti vaistai turi įtakos virškinamojo trakto sutrikimams, kelia grėsmę širdies ir kraujagyslių
sistemai. Dėl didelės NVNU sukeliamų komplikacijų rizikos, siekiama ieškoti naujų augalinių šaltinių, kurių vartojimas esant uţdegiminiams procesams galimai sukelia maţesnius nepageidaujamus poveikius. Vienas iš potencialių variantų – gluosnio ţievės ekstraktas. Gluosnis plačiai paplitęs augalas, pasiţymintis priešuţdegiminiu poveikiu, tinkamas vartoti esant osteoartritui, apatinės nugaros dalies skausmui, siekiant išvengti trombocitų agregacijos, slopinantis storosios ţarnos ir plaučių vėţinių ląstelių proliferaciją.
Tyrimo tikslas. Pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą nustatyti Lietuvoje augančių gluosnių ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą.
Uţdaviniai:
1. Išanalizuoti ir apibendrinti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie gluosnių gentį, augalo pritaikymą medicinoje, taikytinas tyrimo metodikas.
2. Nustatyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas gluosnio ţievėje esančių veikliųjų junginių ekstrahavimui bei optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką junginių identifikavimui.
3. Atlikti gluosnio vaistinės augalinės ţaliavos tyrimams pritaikytos ESC metodikos validaciją. 4. Statistiškai įvertinti bei palyginti gluosnio ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą trijuose Lietuvos regionuose (Kelmės, Kauno, Marijampolės).
Gluosnio ţievės analizei pasirinktas metodas – efektyvioji skysčių chromatografija (ESC).
Nustatyta ţaliavos drėgmė (7,98 – 12,61 proc.). Optimizuota, validuota ESC metodika veikliesiems junginiams identifikuoti. Tiesiškumas įrodytas kreivių koreliacijos koeficientais (>0,99). Rezultatų
glaudumas pagrįstas tuo, kad pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis buvo <5 proc., atkuriamumo <10 proc. Palyginta ekstrahentų (etanolio, metanolio) ekstrakcinė galia. Atlikus kokybinius gluosnio ţievės tyrimus, veiklieji junginiai identifikuoti vertinant standartinių tirpalų ir ekstraktuose esančio salicino sulaikymo trukmes bei spektrų atitikimus. Seno (10 metų skaičiuojant pagal metūglius) gluosnio ţievėje salicino nenustatyta. Atlikus gluosnio ţievės kiekybinį tyrimą, nustatyta, kad trijuose Lietuvos regionuose augančių gluosnių ţievėje sukauptas salicino kiekis statistiškai nesiskiria.
SUMMARY
In the world and in Lithuania the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is growing. Mentioned drugs affect the digestive tract and threaten cardiovascular system. Due to the high risk of complications caused by NSAIDs it is aimed to find new sources of plants, whose use in inflammatory conditions potentially causes less side effects. One of the potential options is willow bark extract. Willow is wildspread plant, having anti-inflammatory properties, suitable for use in the treatment of osteoarthritis, low back pain, to prevent platelet aggregation, inhibitting proliferation of colon and lung cancer cells.
Aim of the study. Using high-performance liquid chromatography to determine salicin distribution in the bark of Lithuanian willows.
Objectives of the study:
1. Analyze and summarize the scientific sources of information about the willow genus, the plant application in medicine, applied research methodologies.
2. Determine the most appropriate conditions for the extraction of active compounds of the willow bark and optimize HPLC methodology for the identification of compounds.
3. Perform validation of HPLC method for studies of the willow bark.
4. Statistically evaluate and compare distribution of salicin amount of willow bark in the three regions of Lithuania (Kelmė, Kaunas, Marijampolė).
HPLC was chosen as a method. The raw material moisture was estimated (from 7.98 to 12.61 per cent.). HPLC method was optimized, validated for the identification of active compounds. The linearity of the curves showed correlation coefficients (>0,99). The precision was based by the fact that the repeatability relative standard deviation is <5 per cent, reproducibility <10 per cent. Wet power of extraction solvents (ethanol, methanol) was compared. After qualitative analysis of the willow bark active compounds were identified comparing retention times and spectra matches of standard solutions and salicin from extracts. After examination of the old (10 years) willow bark, there was found that salicin does not accumulate. After willow bark quantitative study there was found that salicin amount in the willow bark in three Lithuanian regions doesn’t have any statistically significant difference.
1. SANTRUMPOS
COX – ciklooksigenazės inhibitoriai ESC – efektyvioji skysčių chromatografija EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ICH – tarptautinė konferencija suderinimo klausimais NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo
UV/Vis – ultravioletinis/regimasis spektras VAS – vizualinė analoginė skalė
SĄVOKOS
Butonas – neišsiskleidęs ţiedas, ţiedpumpuris. Inkstų perfuzija – inkstų aprūpinimas krauju.Intersticinis nefritas – tai ūmus inkstų kanalėlių ir intersticinio audinio (audinys tarp kanalėlių) uţdegimas.
Kolenchima – gyvas, tąsus augalų ramstinis audinys.
Ksilema – augalų apytakinis audinys, kuriuo vanduo ir jame ištirpusios maisto medţiagos iš šaknų patenka į kitus organus.
Obstrukcija – nepraeinamumas.
Osteoartritas – lėtinė degeneracinė sąnarių liga, pasireiškianti ţidinine kremzlės destrukcija. Parenchima – pagrindinis augalų audinys.
Perforacija – prakiurimas, pavyzdţiui, skrandţio opos.
Tėkmės citometrija – metodas, kurio metu nustatomi tam tikrai ligai būdingi ląstelių paviršiaus pakitimai.
WOMAC indeksas – plačiai naudojamas, patentuotas standartinių klausimų rinkinys, naudojamas įvertinti kelio ar klubo sąnarių būklę: skausmą, sustingimą, fizinį funkcionalumą. Taip pat naudojamas įvertinti nugaros skausmą, reumatoidinį artritą, vilkligę, fibromialgiją.
2. ĮVADAS
Pastaruoju metu pasaulyje ir Lietuvoje didėja nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo (NVNU) suvartojimas. Per trejus metus (2005 – 2007 m.) Lietuvoje bendras analgetiškai veikiančių preparatų suvartojimas išaugo 16,55 proc. [4].
Augant šių vaistų suvartojimui, didėja rizika pasireikšti nepageidaujamiems poveikiams. NVNU (tiek COX-1, tiek COX-2 inhibitoriai) kenkia inkstams: atsiranda edema, intersticinis nefritas, padidėjęs kraujospūdis, aritmija, sumaţėja glomerulų filtracijos greitis ir inkstų perfuzija. Maţdaug 2,5 mln. ţmonių Jungtinėse Amerikos Valstijose kasmet patiria nepageidaujamą poveikį inkstams, atsiradusį dėl NVNU vartojimo [31]. Gerai ţinoma, kad ciklooksigenazės 1 (COX-1) inhibitoriai sukelia virškinamojo trakto sutrikimus: kraujavimą, perforaciją, obstrukciją. Galima net mirtis [17]. Apie 25 proc. pacientų, vartojančių NVNU, atsiranda opos. 50 – 60 proc. dėl NVNU susidariusių opų jokių klinikinių simptomų nepasireiškia, tačiau praėjus kuriam laikui, gali atsirasti komplikacijų [20]. Kaip alternatyva COX-1 fermentą blokuojantiems preparatams sukurti selektyvūs COX-2 inhibitoriai. Nepageidaujamo poveikio virškinamajam traktui išvengta, tačiau pastebėta, kad rofekoksibas reikšmingai padidina miokardo infarkto riziką. Vėlesnių tyrimų metu nustatyta, kad COX-2 inhibitoriai kelia grėsmę širdies ir kraujagyslių sistemai [31].
Dėl vis didėjančio analgetikų suvartojimo, nepageidaujamų reiškinių bei išlaidų (NVNU preparatams įsigyti, komplikacijoms gydyti) tikslinga ieškoti būdų, padedančių šiuos procesus sulėtinti ar net jų išvengti, todėl nemaţai mokslininkų dėmesio yra nukreipta į ţaliavų, pasiţyminčių priešuţdegiminiu poveikiu, paiešką bei tyrimus.
Gluosnio ţievės ekstraktas tinkamas vartoti esant osteoartritui, migrenai, apatinės nugaros dalies skausmui bei siekiant išvengti trombocitų agregacijos. Be to, nustatytas supresinis poveikis storosios ţarnos ir plaučių vėţinėms ląstelėms [13; 16]. Moksliniai tyrimai patvirtino, kad gluosnio ţievėje esanti veiklioji medţiaga salicinas pasiţymi priešuţdegiminėmis savybėmis bei sukelia maţiau nepageidaujamų poveikių. Tai tik dar labiau sustiprina gluosnio ţievės reikšmę. Ją tikslinga tirti ne tik dėl poveikio, panašaus į NVNU, bet ir dėl retesnių nepageidaujamų reakcijų.
Norint pasiekti didesnio gluosnio ţievės augalinių preparatų konkurencingumo su rinkoje esančiais sintetiniais priešuţdegiminiais vaistais, reikia atlikti vaistinės augalinės ţaliavos kokybės kontrolės tyrimus.
Išanalizavus mokslinę literatūrą, išsiaiškinta nemaţai tyrimų gluosnio ţievės poveikiui įvertinti, tačiau labai maţai ţaliavos kokybei bei veikliosios medţiagos kiekiui nustatyti. Mūsų tyrimai siekia praplėsti ţinias apie gluosnio ţievę ţvelgiant į ją iš analitinės pusės.
Veikliųjų medţiagų kiekis augalinėse ţaliavose priklauso nuo augalo rūšies, amţiaus, augimvietės, rinkimo laiko ir kitų veiksnių. Norint vaistinės augalinės ţaliavos našesnio panaudojimo, galima atrinkti rūšis, kurios sukaupia daugiausiai salicino, vaistinę augalinę ţaliavą rinkti nustatytu metų laiku ir augimo vietoje. Šiuo tyrimu aiškinamasi, ar gluosnio ţievėje esantis salicino kiekis priklauso nuo vaistinės augalinės ţaliavos rinkimo vietovės. Mūsų duomenimis nėra atlikto mokslinio tyrimo gluosnio ţievėje esančiam salicinui nustatyti skirtingose šalies vietose.
Svarbiausias gluosnio ţievėje kaupiamas junginys – salicinas. Be pastarojo augalinėje ţaliavoje yra salicino darinių: salicilo rūgštis, acilinti dariniai. Salicinas ir jo junginiai absorbuoja šviesą esant tam pačiam bangos ilgiui, todėl gluosnio ţievės ekstraktą tirti spektrofotometru netikslinga, nes gaunamas suminis junginių kiekis. Dėl šios prieţasties pasirinktas skirstymo metodas – efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Tas pats metodas pritaikytas ir kokybiniam gluosnio ţievės tyrimui. Nors Europos farmakopėjoje kaip kokybinio nustatymo būdas pateikiama plonasluoksnė chromatografija, tačiau ESC yra jautresnis, tikslesnis, atrankesnis, greitesnis metodas.
Šio tyrimo tikslas. Pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, nustatyti Lietuvoje augančių gluosnių ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą.
3. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI
Tyrimo tikslas. Pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą nustatyti Lietuvoje augančių gluosnių ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą.
Uţdaviniai:
1. Išanalizuoti ir apibendrinti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie gluosnių gentį, augalo pritaikymą medicinoje, taikytinas tyrimo metodikas.
2. Nustatyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas gluosnio ţievėje esančių veikliųjų junginių ekstrahavimui bei optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką junginių identifikavimui.
3. Atlikti gluosnio vaistinės augalinės ţaliavos tyrimams pritaikytos efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validaciją.
4. Statistiškai įvertinti bei palyginti gluosnio ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą trijuose Lietuvos regionuose (Kelmės, Kauno, Marijampolės).
4. LITERATŪROS APŢVALGA
4.1 Botaninė klasifikacija
Karalystė – Plantae – AugalaiPokaralystė – Tracheobionta – Induočiai augalai Super skyrius – Spermatophyta – Sėkliniai augalai Skyrius – Magnoliophyta – Ţydintys augalai Klasė – Magnoliopsida – Dviskilčiai augalai Poklasė – Dilleniidae
Eilė – Salicales
Šeima – Salicaceae – Gluosninių
Gentis – Salix L. – Gluosnis [26].
4.2 Botaninis gluosnio genties apibūdinimas
Gluosnis – medis, krūmas arba krūmokšnis [1]. Šakos daţnai esti plonos, lanksčios, laibos, gali būti nulinkusios ţemyn ar vertikalios [12]. Šakojimasis yra simpodinis. Laja gali turėti šias formas: rutulišką, kupolo, skėtišką, kūgišką ar kiaušinišką. Tai dvinamiai augalai [1]. Aukštis – iki 25 m, bet skiriasi priklausomai nuo rūšies [29].
Lapai – praţanginiai, su lapkočiais, kraštai lygūs, banguoti, dantyti arba pjūkliški. Forma: lancetiška, elipsiška, linijiška – lancetiška, kiaušiniška, ovali. Lapai paprasti, gali turėti prielapius, daţniausiai apatinė pusė padengta sidabriškais plaukeliais [12; 29]. Pilkšvojoje lapo dalyje esti ţiotelės, bet jos gali išsidėstyti abiejose lapo pusėse, priklausomai nuo drėgmės kiekio aplinkoje [1]. Kaip minėta anksčiau, apatinė lapų pusė paprastai yra plaukuota, tačiau ji gali būti ir apsitraukusi apnašomis [29].
Ţiedai yra smulkūs, neturintys apyţiedţio, susitelkę ţiedynuose, kurie vadinami ţirginiais. Šie daţniausiai yra vertikalūs, gali būti lenkti, kartais prieš praţystant esti plaukuoti. Nustatyta, kad įvairios rūšys turi skirtingą kiekį ţiedų. Jų būna nuo 19 iki 192 [1; 12]. Ţiedai atsiranda lapų susiformavimo metu arba po jo, turi paţiedes. Pavieniai ţiedai nepastebimi. Taurėlapiai pakeisti nektarinėmis. Vyriškuose ţieduose kuokelių būna 1 – 8, daţniausiai 2. Moteriško ţiedo mezginė yra viršutinė [29].
Vaisius – vienalizdė, daugiasėklė dėţutė. Kiekvienoje dėţutėje būna nuo 3 iki 22 sėklų. Jos esti labai smulkios, daţniausiai padengtos plaukeliais (S. alba, S. caprea), turinčios ilgus skristukus, linkusios greitai tapti nedaigiomis [1; 12].
4.3 Paplitimas
Gluosnių genčiai priklauso apie 400 rūšių [3]. Jie labiausiai paplitę Eurazijoje (230 – 250 rūšių) bei Šiaurės Amerikoje (120 rūšių) [1]. Lietuvoje randama 18 rūšių:
S. acutifolia – smailialapis gluosnis, S. alba – baltasis gluosnis, S. aurita – ausytasis gluosnis, S. caprea – paprastoji blindė, S. cinerea – pilkasis gluosnis, S. daphnoides – pajūrinis gluosnis, S. dasyclados – gauruotasis gluosnis, S. fragilis – trapusis gluosnis, S. lapponum – laplandinis gluosnis, S. myrsinifolia – juosvasis gluosnis, S. myrtilloides – mėlynialapis gluosnis, S. pentadra – virbinis gluosnis, S. purpurea – purpurinis gluosnis, S. repens – gulsčias gluosnis, S. rosmarinifolia – pelkinis gluosnis, S. starkeana – ţemasis gluosnis, S. triandra – krantinis gluosnis, S. viminalis – vytinis gluosnis; ţilvitis [5].
4.4 Augalų rūšys ir kilmė
Vaistinė augalinė ţaliava – ţievė, surinkta nuo skirtingų augalo rūšių. Europos farmakopėja pabrėţia šias: S. purpurea, S. daphnoides, S. fragilis [24]. Vokietijos komisijos E monografija kaip ţaliavos šaltinį nurodo S. alba, S. purpurea, S. fragilis rūšių ţievę. Jei ţaliava atitinka jai keliamus reikalavimus (sukauptas salicino kiekis yra nemaţesnis nei 1,5 proc.), galima naudoti ir kitas gluosnių rūšis. Augalo gimtinė yra Europa, Azija, Š. Amerika. Augalinė ţaliava gali būti importuojama iš Bosnijos ir Hercegovinos, Kroatijos, Makedonijos, Juodkalnijos, Serbijos, Slovėnijos, Bulgarijos, Vengrijos, Rumunijos [29].
4.5 Makroskopinis gluosnio ţievės tyrimas
Ţaliavą sudaro 1 – 2 mm storio, 1 – 2 mm ilgio, lankstūs, pailgi, volelių formos arba kreivi gabalėliai, turintys blizgų ţalsvai geltoną (jaunų augalų) ar rusvai pilką (senesnių augalų) išorinį paviršių.
Pastarasis yra lygus, daţnai turi neryškių išilginių ruoţelių. Priklausomai nuo rūšies, vidinis paviršius gali būti beveik baltas, kreminis, bet paprastai yra rudas, lygus arba su smulkiais išilginiais ruoţeliais. Pagal Europos farmakopėją vaistine augaline ţaliava gali būti ir išdţiovintos einamųjų metų šakelės, kurių skersmuo yra ne didesnis kaip 10 mm ir kurių ksilema esti nuo baltos iki kreminės spalvos. Ţaliava savito kvapo, sutraukiančio, kartaus skonio [24]. Ţievė lupama geguţės – birţelio mėnesiais, nes tada gerai atsiskiria nuo medienos. Dţiovinama palėpėje arba gerai vėdinamoje patalpoje [2].
4.6 Mikroskopinis gluosnio ţievės tyrimas
Šviesiai geltonos, ţalsvai geltonos ar šviesiai rudos spalvos milteliai. Pro mikroskopą matomi kaip siaurų skaidulų pluošteliai, storomis sienelėmis, didesni nei 600 μm, apsupti apvalkalu, kuriame yra kalcio oksalato kristalų. Ţievės parenchima su storomis, duobėtomis sienelėmis, turinti didelių kalcio oksalato kristalų. Gali pasitaikyti sumedėjusių pluoštelių bei rudų kolenchimos priemaišų, kurios patenka iš butonų, esančių ant ţievės [24].
4.7 Cheminė gluosnio ţievės sudėtis
≥1,5 – 11 proc. salicilatų, kurie yra salicilo alkoholio dariniai. Jų kokybinė ir kiekybinė sudėtis labai priklauso nuo augalo rūšies [29]. Apie 0,5 proc. salicilatų sukaupia Salix alba, 1 – 10 proc. S.
fragilis, 3 – 9 proc. S. purpurea [8]. Nustatomi šie glikozidai ir jų dariniai: salicinas, salicino 6-O-acil
junginys, fragilinas, populinas, populino 2-O-acetil darinys, salikortinas su jo 2-O-, 3-O-, 4-O-acetil junginiais, salikortino 2-O-benzoil darinys (tremulacinas), 2-O-cinamoil junginys, triandrinas, vimalinas. Taip pat yra fenolinių alkoholių (saligeninas), rūgščių (salicilo, p – hidroksibenzoinė, kofeino, ferulo, p – kumarino rūgštys), flavonoidų (kvercetino, liuteolino, eriodiktiolio, naringenino ir jo darinių, ampelopsino, chalkono, izosalipurpozido, katechino), 8 – 20 proc. taninų. Jaunos šakelės turi tokią pačią kokybinę sudėtį, bet veikliųjų medţiagų kiekis yra maţesnis nei ţievėje (1 lentelė) [29].
1 lentelė. Gluosnio žievės sudėtinės dalys
Fenoliniai junginiai
Fenoliniai glikozidai Flavonoidai Rūgštys Fenoliniai alkoholiai
Rauginės medţiagos Salicinas, salicino 6-O-acil
darinys, fragilinas (2-O-acetilsalicinas), populinas, populino 2-O-acetil darinys, salikortinas, salikortino 2-O-,
3-O-, 4-O- acetil dariniai, salikortino 2-O-benzoil darinys (tremulacinas), salikortino 2-O-cinamoil darinys Katechinas, ampelopsinas, kvercetinas, liuteolinas, eriodiktiolis, naringeninas, chalkonas, izosalipurpozidas Salicilo, p-hidroksibenzoinė, kofeino,ferulo, p-kumarino Saligeninas Taninai
4.8 Panaudojimas
Medicininėje praktikoje gluosnis labiausiai ţinomas kaip salicilo rūgšties šaltinis. Jis vartojamas siekiant sumaţinti kraujospūdį bei trombocitų kiekį, galvos skausmams malšinti [13; 25]. Mokslininkai teigia, kad tokį poveikį gluosnio ţievei suteikia salicinas, tačiau tolimesni tyrimai parodė, jog yra ir kitų komponentų (polifenoliai, flavonoidai), suteikiančių antioksidacinių, karščiavimą maţinančių, antiseptinių, imunitetą stiprinančių savybių [28]. Gluosnio ţievė naudojama ir esant reumatui, artritui, karščiavimui (bendrajam peršalimui, gripui). Prancūzijoje gluosnio ţievės preparatai vartojami kaip analgetikai galvos ir dantų skausmui maţinti, taip pat esant sąnarių skausmui, sausgyslių uţdegimui ir patempimams [3].
Moksliniai šaltiniai nurodo, kad gluosnio ţievės vartojimas sukelia maţiau nepageidaujamų reakcijų virškinamajam traktui negu kiti NVNU, pavyzdţiui, ibuprofenas [28]. Klinikiniai tyrimai patvirtina salicino turinčių preparatų vartojimą esant osteoartritui, reumatoidiniam artritui, apatinės nugaros dalies skausmui, migrenai.
Osteoartritas ir reumatoidinis artritas
Vokietijoje atliktas dvigubai aklas placebu kontroliuojamas klinikinis tyrimas su 78 ţmonėmis, sergančiais osteoartritu. Dvi savaites pacientams skirta po 1360 mg (atitinkančio 240 mg salicino) gluosnio ţievės ekstrakto per dieną. Pagrindinis vertinimo kriterijus buvo WOMAC indeksas. Pacientų grupėje, vartojusių gluosnio ţievės ekstraktą, skausmas sumaţėjo 14 proc., placebo grupėje skausmas padidėjo 2 proc. [9].
Standartizuoto gluosnio ţievės ekstrakto veiksmingumas buvo tirtas dviejuose atsitiktinių imčių dvigubai akluose placebu kontroliuojamuose klinikiniuose tyrimuose. Atrinkti 127 pacientai, sergantys klubo arba kelio sąnario osteoartritu, bei 26 pacientai, sergantys reumatoidiniu artritu. Osteoartrito tyrime atsitiktine tvarka buvo paskirta: 240 mg salicino, 100 mg diklofenako arba atitinkamai placebo. Skausmas buvo vertinamas pagal WOMAC indeksą. WOMAC skausmo balai sumaţėjo 8 mm pacientų grupėje, vartojusių gluosnio ţievę, 23 mm vartojusių diklofenaką, 5 mm vartojusių placebą. Reumatoidinio artrito tyrime pacientai gavo 240 mg salicino per dieną arba placebo. Pacientų skausmas vertintas 100 mm vizualine analogine skale (VAS). Vartojusių gluosnio ţievę grupėje skausmas sumaţėjo 8 mm, placebo grupėje 2 mm [28].
Du mėnesius trukusio dvigubai aklo atsitiktinių imčių kontroliuojamo klinikinio tyrimo metu buvo vertintas gluosnio ţievės ekstrakto, turinčio 17,6 proc. salicino, veiksmingumas. Tyrime dalyvavo pacientai, sergantys lėtiniu artritu. 82 asmenims atsitiktine tvarka paskirta po 240 mg gluosnio ţievės ekstrakto arba placebo. Rezultatai parodė nedidelį, bet statistiškai reikšmingą skausmo simptomų pagerėjimą [28].
Apatinės nugaros dalies skausmas
Atsitiktinių imčių placebu kontroliuojamo klinikinio tyrimo metu atsitiktinai atrinkti 210 ţmonės, besiskundţiantys apatinės nugaros dalies skausmais. Pirmai grupei paskirta 120 mg salicino, antrai – 240 mg, trečiai grupei placebo. Po 4 savaičių gauti tokie duomenys: skausmas išnyko ne trumpiau nei penkioms dienoms 39 proc. pacientų iš grupės, vartojusios 240 mg salicino, 21 proc. pacientų, kurie vartojo 120 mg salicino ir 6 proc. iš placebo grupės [10].
Su 451 pacientu atliktas atviras neatsitiktinių imčių klinikinis tyrimas. Trijose pacientų grupėse buvo vartoti švieţios gluosnio ţaliavos ekstraktai. Pirmoji grupė kasdien gavo po 120 mg salicino, antroji grupė – 240 mg salicino. Trečiai, kontrolinei grupei, paskirtas medikamentinis gydymas. Skausmas vertintas remiantis „Arhus“ ir „Total Pain“ indeksais. Po 4 gydymo savaičių 40 proc. pacientų, kuriems buvo paskirta po 240 mg salicino, 19 proc. pacientų iš grupės, kuriai paskirta 120 mg salicino ir 18 proc. medikamentinį gydymą gavusių pacientų nebejautė skausmo [28].
Migrena
Dvigubai aklo placebu kontroliuojamo tyrimo metu 54 pacientai padalinti į dvi grupes. Pirmoji gydyta placebu, antrajai paskirti vaistai, savo sudėtyje turintys salicino. Vos prasidėjus skausmui, pacientai turėjo vartoti paskirtus vaistus, uţsidėti akis dengiančią kaukę ir atsigulti. Skausmo palengvėjimas vertintas balais nuo nulio iki dešimties. 28 pacientai iš 34 gavusių preparatą su salicinu farmakoterapiją įvertino 7,42 balo, o likusieji placebo grupės pacientai gydymą įvertino vidutiniškai 4,31 balo. Dauguma pacietų iš pirmosios grupės teigė, kad galvos skausmo trukmė gerokai sumaţėjo [28].
Antikoaguliacinis poveikis
Dvigubai aklas placebu kontroliuojamas klinikinis tyrimas atliktas su 51 ţmogumi. 19 pacientų paskirta gluosnio ţievės ekstrakto (240 mg salicino), 16 pacientų placebo, kitiems 16 pacientų paskirta aspirino po 100 mg per dieną. Tyrimo metu nustatyta, jog aspirinas labiausiai sumaţina trombocitų agregaciją, tačiau nustatytas ir reikšmingas skirtumas tarp gluosnio ţievės ekstrakto bei placebo [28].
Priešvėţinis poveikis
Tyrimu buvo siekta išanalizuoti atskirų gluosnio ţievės ekstrakto komponentų (salicilo alkoholio darinių, flavonoidų, proantocianidinų, salicino) įtaką storosios ţarnos ir plaučių vėţio ląstelių proliferacijai bei apoptozei. Ląstelės 72 valandas veiktos nevienodų koncentracijų aukščiau minėtais komponentais ir acetilsalicilo rūgštimi (kontrolinis mėginys). Ląstelių augimo slopinimas ir citotoksiškumas buvo matuojami kolorimetriniu WST-1 metodu. Apoptozinės ląstelės buvo identifikuotos tėkmės citometrijos būdu. Tyrimas parodė, kad ekstraktas ir jo frakcijos priklausomai nuo koncentracijos sulėtina ląstelių augimą ir skatina apoptozę, neatsiţvelgiant į selektyvumą ciklooksigenazėms [16].
4.9 Cheminis aktyvių sudėtinių dalių nustatymas
Europos farmakopėjoje pateikiamas toks kokybinis gluosnio ţievėje esančio salicino nustatymas: Tirpalas A: 1,0 g į miltelius susmulkintos ţaliavos uţpilama 10 ml metanolio R. 10 min kaitinama vandens vonioje esant 50⁰C temperatūrai, purtant. Atšaldoma ir filtruojama.
Tirpalas B: 5,0 ml tirpalo A sumaišoma su 1,0 ml 50 g/l bevandenio natrio hidroksido R tirpalu ir kaitinama 10 min vandens vonioje 60⁰C temperatūroje. Atšaldoma ir filtruojama.
Etaloninis tirpalas. 2 mg salicino R ir 2 mg chlorogeno rūgšties R ištirpinama 1,0 ml metanolio R. Plokštelė. Silikagelio plokštelė R (5-40 μm).
Uţnešimo tūris. 10 μl.
Tirpiklių nueitas kelias: 15 cm. Dţiovinimas. Šilto oro srovėje.
Aptikimas. Apipurškiama sieros rūgšties R ir metanolio R mišiniu (5:95). Kaitinama 100 – 105⁰C temperatūroje 5 min ir analizuojama dienos šviesoje.
Rezultatai. Iš etaloninio tirpalo atsiskiria dvi zonos: apatinė ruda zona – chlorogeno rūgšties, viršutinė rausvai violetinė zona – salicino. Tirpale A atsiskiria dvi zonos: rausvai violetinė (salicinas) ir virš šios zonos esančios kitos rausvai violetinės zonos. Tirpale B atsiskiria viena zona – rausvai violetinė (salicinas) [24].
4.10 Efektyvioji skysčių chromatografija
4.10.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos klasifikacija, taikymas, privalumai, trūkumai
Chromatografija yra plačiausiai naudojamas skirstymo metodas. Apie 1960 metus mokslininkai nustatė, jog labiausiai analizės efektyvumą padidina dalelių dydţio sumaţinimas. Siekiant tirpiklį (-ius) pernešti pro maţesnę, smulkesnėmis dalelėmis uţpildytą kolonėlę, reikėjo didinti slėgį. Pabrėţiant šiuos pokyčius, atsirado pavadinimas efektyvioji skysčių chromatografija (high – performance liquid chromatography). Laboratorijoje ji naudojama kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti, išskirstyti ir išgryninti mišinius. Gali būti atskirtos makromolekulės, maţos molekulinės masės junginiai, jonai, termolabilios, nelakios medţiagos [7; 22; 23].
Pagal atskyrimo mechanizmą ar nejudančios fazės tipą, išskiriamos šios chromatografijos rūšys: a) pasiskirstymo; b) adsorbcijos arba skystis – kieta fazė chromatografija; c) jonų mainų arba jonų chromatografija; d) gelchromatografija arba dydţio išskyrimo; e) afininė; f) chiralinė [23].
Pagrindiniai privalumai, nulėmę platų chromatografijos pritaikymą: metodo jautrumas, automatizavimo paprastumas, lengva pritaikyti tiksliai kiekybinei sudėčiai nustatyti, tinka nelakiems ar termolabiliems dariniams atskirti, galima tirti tokias medţiagas kaip aminorūgštys, baltymai, angliavandeniai, nukleorūgštys, vaistai, terpenoidai, steroidai, antibiotikai, pesticidai, metalo organiniai dariniai, įvairūs neorganiniai junginiai [23].
Nors ESC turi daug privalumų, tačiau yra ir trūkumų. Įranga yra brangi, gali dirbti tik kvalifikuotas personalas [23].
4.10.2 Fosfodiodų matricos detektorius
ESC galimi naudoti detektoriai yra šie: ultravioletinio – regimojo spektro (UV/Vis) absorbcijos, fluorescencinis, refraktometrinis, elektrocheminis, savitojo laidumo, masių spektrometrinis, fotojonizacijos, garinantis šviesos sklaidos ir kt. [19; 22]. Fotodiodų matricos detektorius yra vienas iš prieinamiausių rutininei laboratorinei analizei. Tai ultravioletinės/regimojo spektro šviesos (UV/Vis) spektrofotometras. Jį sudaro skirtingas skaičius fotodiodų. Detektorius dirba 190 – 800 nm šviesos bangos ilgių diapazone. Spektras fiksuojamas sekundės ir net trumpesniais intervalais. Jei matavimai atliekami fiksuotame bangos ilgyje, analitės identifikuojamos tik pagal jų sulaikymo trukmes. Taigi galimas nedidelis sulaikymo laikų nuokrypis. Tokiu atveju junginius galima identifikuoti lyginant jų spektrus [15; 32].
Trūkumai. Galimi dideli triukšmai dėl šviesos srauto dydţio. Šis detektorius yra jautrus įvairiems pokyčiams, pavyzdţiui, lempos padėties kitimams [15; 32].
Privalumai. Idealus jutiklis visame ultravioletiniame ir regimajame spektre. Jeigu UV/Vis detektorius reikalauja pasirinkti tam tikrą bangos ilgį, tai fosfodiodų matricos detektorius matuoja šviesos absorbciją esant įvairiems bangos ilgiams. Per trumpą laiką gaunami spektrai esant skirtingiems bangos ilgiams. Galima pritaikyti tiriant greitai vykstančias chemines reakcijas. Tai gana atsparus bei saugus prietaisas [15; 32].
4.11 Farmakopėjinė ESC metodika salicino kiekiui gluosnio ţievėje nustatyti
Tiriamasis tirpalas. 1,0 g į miltelius susmulkintos ţaliavos uţpilama 40 ml metanoliu R ir 40 ml 4,2 g/l natrio hidroksido tirpalu. Prijungus grįţtamąjį kondensatorių kaitinama 1 val. vandens vonioje 60⁰C temperatūroje maišant. Atvėsinama. Įpilama 4 ml 103 g/l druskos rūgšties tirpalo. Filtruojama popieriaus filtru į 100 ml tūrio kolbą. Nufiltravus kolbos turinys praskiedţiamas metanolio R:vandens 50:50 mišiniu iki ţymės. Filtruojama pro membraninį filtrą (minimalus porų dydis 0,45 μm).Standartinis tirpalas. 5 mg piceino ištirpinama 25 ml mišinyje, sudarytame iš 20 tūrio dalių vandens ir 80 tūrio dalių metanolio R (tirpalas A). 15 mg salicino ištirpinama 25 ml mišinyje, sudarytame iš 20 tūrio dalių vandens ir 80 tūrio dalių metanolio R; pilama 5 ml tirpalo A ir praskiedţiama vandeniu iki 50 ml.
Kolonėlė:
- Dydis: 100 x 4,6 mm
- Nejudančioji fazė: oktadecilsilil silikagelis (3µm) Judančioji fazė
- Judančioji fazė A: tetrahidrofuranas R, 0,5 proc. fosforo rūgšties tirpalas (1,8:98,2 V/V) - Judančioji fazė B: tetrahidrofuranas R
2 lentelė. Gradientinės eliucijos sąlygos
(The European pharmacopoeia, 6th ed., council of Europe, Strasbourg, France 2008)
Laikas (min) Judančioji fazė (proc. V/V) Judančioji fazė (proc. V/V)
0 – 15 100 0 15 – 17 100 → 90 0 → 10 17 – 23 90 10 23 – 25 90 → 100 10 → 0 25 – 40 100 0 Tėkmės greitis: 1,0 ml/min.
Detekcija: spektrofotometras 270 nm bangos ilgyje Injekuojamas tūris: 10 µl
Sulaikymo laikas: salicino apie 6,4 min.; piceino apie 7,7 min. Sistemos stabilumas: standartinis tirpalas
- Skiriamoji geba: minimaliai 1,5 tarp salicino ir piceino smailių Procentinis salicino junginių, išreikštų kaip salicinas, apskaičiavimas:
A1 – salicino smailės plotas chromatogramoje, gautoje tiriant analizuojamąjį salicino tirpalą A2 – salicino smailės plotas chromatogramoje, gautoje tiriant standartinį salicino tirpalą m1 – analizuojamajam tirpalui paruošti sunaudotos ţaliavos masė gramais
m2 – standartiniam tirpalui paruošti sunaudoto salicino masė gramais p – salicino standartiniame tirpale procentinė išraiška
4.12 Gluosnio ţievės tyrimai Lietuvoje
2009 m. publikuotas mokslinis straipsnis „Efektyviosios skysčių chromatografijos taikymas įvairių rūšių gluosnių ţievėje esančiam salicinui identifikuoti“ tema. Tyrimui naudotos Lietuvoje augančių skirtingų gluosnių rūšių ţievės. Gauti rezultatai parodė, kad salicilatų kiekis svyruoja priklausomai nuo augalo rūšies: nuo 0,04 proc. (S. viminalis) iki 12,06 proc. (S. acutifolia). Taip pat nustatyta, jog augalai didţiausią kiekį salicilatų sukaupia rudenį, būdami dvejų metų amţiaus [3].
4.13 Gluosnio ţievės tyrimai kitose šalyse
2012 m. Kanadoje atliktas gluosnio ţievės tyrimas, taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą. Tirtos penkios gluosnių rūšys: S. fragilis, S. amygdaloides, S. tameline, S. bebbiana ir S.
pentandra. Tirpiklių sistemą sudarė toluenas, dietileteris, ledinė acto rūgštis ir metanolis (120:60:18:5).
Chromatografinė plokštelė stebėta ultravioletinėje šviesoje bei apipurškus ryškinimo reagentu – 1 proc. etanoliniu geleţies trichlorido tirpalu. Salicilo rūgštis identifikuota pagal sulaikymo rodiklį (Rf) ir dėmės
intensyvumą. Eksperimentas vykdytas du rudens semestrus. Antraisiais metais rezultatai atkartoti [11]. 2004 m. Vokietijoje atliktas gluosnio ţievės tyrimas, panaudojant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodą. Taip pat atlikti du skirtingi farmakologiniai testai (2,2-azobis (2-amidinopropano) dihidrochlorido reakcija ir ksantino/ksantino oksidazės reakcija). Tyrimo metu daugiausia dėmesio skirta metodikų vystymui. Ekstrakcijoms naudotas išgrynintas vanduo arba skirtingų koncentracijų etanolio bei išgryninto vandens mišiniai. Salicino kiekis gluosnio ţievės ekstraktuose svyravo nuo 6,7 proc. iki 30,7 proc. [30].
2007 m. publikuotas straipsnis apie Turkijoje atliktą gluosnio ţievės tyrimą, panaudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Buvo tirtos devynios skirtingos gluosnių rūšys bei nustatytas salicino kiekis skirtingų lyčių augalų lapuose ir ţievėse. Judančią fazę sudarė distiliuotas vanduo, tetrahidrofuranas, ortofosforo rūgštis (97,7:1,8:0,5). Literatūros duomenimis vyriškos lyties augalai sukaupia maţesnį kiekį salicino nei moteriški. Tyrimo rezultatai parodė, kad Salix pogenčio moteriškų augalų ţievės ir lapai turėjo daugiau salicino, tačiau pogentyje Vetrix salicino daugiau buvo sukaupę vyriški augalai. Salicino kiekis skirtingų rūšių gluosniuose svyravo nuo 0,058 proc. (S. caprea, moteriška lytis, ţievė) iki 2,675 proc. (S. babylonica, moteriška lytis, ţievė) [14].
2007 m. Lenkijoje atliktas tyrimas „Skirtingų rūšių gluosniuose esančių salicilo darinių chromatografinė analizė“ tema. Pritaikyti normalių ir atvirkštinių fazių ESC metodai. Nustatyta, kad pastaruoju metodu atskiriami visi 9 salicilo junginiai. Eliucija – gradientinė. Judančią fazė sudarė acetonitrilas ir 0,05 proc. trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas. Acetonitrilo koncentracija didėjo nuo 3 proc. iki 48 proc. Patvirtinti gluosnio ţievės sudėties skirtumai priklausomai nuo augalo rūšies. Atlikta kiekybinė gluosnio ţievėje esančio salicino analizė. Gauti duomenys: maţiausiai salicino kaupia S. alba (25,4 mg/g), daugiausiai – S. daphnoides (96,47 mg/g) [21].
5. TYRIMO METODIKA
5.1 Tyrimo objektas
Remiantis Europos farmakopėjos rekomendacijomis, tyrimams atlikti buvo naudota 2 – 3 metų amţiaus gluosnių ţievė, surinkta skirtingose Lietuvos vietovėse (Kelmėje, Kaune, Marijampolėje). Iš kiekvienos vietovės vaistinė ţaliava surinkta nuo 10 jaunų medţių ir atitinkamai nuo vieno seno medţio (10 metų). Augalo amţius nustatytas pagal metūglius. Mokslinė literatūra teigia, jog sukauptas salicino kiekis didėja priklausomai nuo medţio ţievės amţiaus [3]. Norint patikrinti teiginį, kad kaupiamas salicino kiekis didėja priklausomai nuo augalo amţiaus, mūsų tyrimuose be jaunos ţievės buvo analizuojama ir seno medţio ţievė, kurios amţius 10 metų. Vaistinė augalinė ţaliava dţiovinta kambario temperatūroje, malūnėliu susmulkinta į miltelius.
5.2 Cheminiai reagentai
Analizės metu naudoti gradientinio švarumo eliuentai: 1. Tetrahidrofuranas – Sigma, Vokietija.
2. Fosforo rūgštis – Merck, Vokietija.
3. Dejonizuotas vanduo – ruošiamas laboratorijoje iš išgryninto vandens išvalymo sistema Millipore.
Chemiškai švarūs reagentai:
1. Metanolis, 99,9 proc. – Sigma, Vokietija. 2. Etanolis 96 proc. – UAB „Stumbras“, Lietuva.
3. Koncentruota druskos rūgštis >37 proc. – Sigma, Vokietija. 4. Natrio hidroksidas – Sigma, Vokietija.
ESC grynumo standartiniai junginiai: 1. Salicinas – Sigma, Vokietija. 2. Piceinas – Sigma, Vokietija.
5.3 Gluosnio ţievės drėgmės kiekio apskaičiavimas
Europos farmakopėjos straipsnyje 04/2008:1583 leidţiamas drėgmės kiekis gluosnio ţievei yra iki 11 proc. Drėgmės kiekis nustatytas drėgnomačiu KERN DBS 60-3 (Vokietija), išreikštas procentais.
5.4 Ekstraktų ir etaloninių tirpalų paruošimas
Gluosnio ţievės ekstraktams paruošti buvo naudotas 96 proc. etanolis. 0,5 g susmulkintos į miltelius ţaliavos uţpilta 20 ml etanolio, įpilta 20 ml 4,2 g/l natrio hidroksido tirpalo. Prijungus grįţtamąjį kondensatorių kaitinta 1 val. vandens vonioje 60⁰C temperatūroje maišant. Atvėsinta. Įpilta 2 ml 103 g/l druskos rūgšties tirpalo. Filtruota pro popieriaus filtrą į 50 ml tūrio kolbą. Nufiltruotas kolbos turinys praskiestas etanolio:vandens (santykiu 50:50) mišiniu iki ţymės. Prieš injekuojant mėginį į ESC sistemą, visi mėginiai buvo filtruoti pro membraninį filtrą (porų dydis 22 μm).
Ruošti skirtingų koncentracijų piceino standartiniai tirpalai siekiant sudaryti gradavimo grafiką. Piceino standarto sverta 5 mg ir ištirpinta 10 ml vandens ir etanolio (santykiu 20:80) mišinyje.
Ruošti skirtingų koncentracijų salicino standartiniai tirpalai siekiant sudaryti gradavimo grafiką. Salicino standarto sverta 1 mg ir ištirpinta 10 ml vandens ir etanolio (santykiu 20:80) mišinyje.
5.5 ESC taikymas Salix L. veikliųjų junginių kokybiniam ir kiekybiniam
įvertinimui
Analizė atlikta su Waters 2695 chromatografu (Waters Corporation, Milford, USA) bei fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA). Detekcija atlikta prie 270 nm bangos ilgio. Veikliesiems junginiams išskirstyti naudota 150x4,6mm 3μm ACE18 kolonėlė (Advanced Chromatography Technologies, Scotland). Duomenims apdoroti bei analizei atlikti naudota programinė įranga: Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV). Mobili fazė sudaryta iš tetrahidrofurano (1,8 ml) ir 0,5 proc. fosforo rūgšties vandeninio tirpalo (98,2 ml). Eliuavimo metodas – izokratinis. Tėkmės greitis 1,0 ml/min. Kolonėlės temperatūra 25⁰C. Injekcijos tūris 10 μl. Analizės trukmė 20 min. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laikų bei absorbcijos spektrų 210 – 400 nm ribose sutapimus.
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1 Drėgmės kiekio įvertinimas
Prieš ruošiant gluosnio ţievės ekstraktus, buvo nustatytas tiriamojoje augalinėje ţaliavoje esantis drėgmės kiekis. Leistinas drėgmės kiekis gluosnio ţievei pagal Europos farmakopėją yra iki 11 proc. Mūsų tyrimo metu vaistinės augalinės ţaliavos drėgmės kiekis kito nuo 7,98 proc. iki 12,61 proc. Ţaliava, kurios drėgmė viršijo 11 proc. taip pat buvo naudota ekstraktams ruošti. Tai galima paaiškinti tuo, kad gluosnio ţievė nebuvo laikoma ilgą laiką, per kurį būtų galėję suskilti glikozidai arba ţaliava būtų supelijusi. Vaistinėje augalinėje ţaliavoje esančio drėgmės kiekio nustatymo rezultatai pateikiami diagramoje (1 pav.).
1 pav. Drėgmės kiekio kitimai Kelmėje, Kaune, Marijampolėje surinktoje gluosnių žievėje
6.2 Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas
Europos farmakopėjos straipsnyje 04/2008:1583 kaip ekstrahentas gluosnio ţievės ekstraktams ruošti nurodytas metanolis R. Nuspręsta palyginti, ar etanolio ekstrakcinė galia prilygsta metanolio ekstrakcinei galiai. Naudota trijų medţių mechaniškai susmulkinta ţaliava ir atlikta ekstrakcija naudojant
0 2 4 6 8 10 12 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Drė gm ės k iek is (p roc.) Medţio numeris Kelmė Kaunas Marijampolė 11
skirtingų koncentracijų ekstrahentus. Ekstrahentai: metanolis (99,9 proc., 90 proc., 80 proc.) ir etanolis (96 proc., 90 proc., 80 proc.).
Skirtingų koncentracijų etanoliniai ir metanoliniai tirpalai buvo ruošti skiedţiant 96 proc. etanolį bei 99,9 proc. metanolį išgrynintu vandeniu. Ruošta po 20 ml (3, 4 lentelės).
3 lentelė. Skirtingų koncentracijų etanolinių tirpalų ruošimas
Etanolinio tirpalo koncentracija (proc.) 96 90 80 Etanolio (96 proc.) kiekis, ml 20 ~19 ~17
4 lentelė. Skirtingų koncentracijų metanolinių tirpalų ruošimas
Metanolinio tirpalo koncentracija (proc.) 99,9 90 80 Metanolio (99,9 proc.) kiekis, ml 20 ~18 ~16
Nustatyta, kad maţėjant tirpiklių koncentracijoms, maţėja ir ekstrakcinė galia. Ekstrakcinė galia įvertinta pagal salicino kiekį ekstrakte (5 lentelė).
5 lentelė. Metanolio ir etanolio ekstrakcinės galios palyginimas pagal išekstrahuoto salicino kiekį (mg/g)
Mėginio numeris
Metanolis (proc.) Etanolis (proc.)
99,9 90 80 96 90 80
1 25,84 17,86 16,88 30,05 28,58 27,42
2 26,60 23,79 17,62 28,88 27,22 24,03
3 26,60 17,56 14,91 27,08 19,04 17,97
Analizės metu nustatyta, kad 96 proc. etanolis kaip ekstrahentas yra efektyvesnis, todėl jis pasirinktas tolimesnei analizei.
6.3 ESC metodikos optimizavimas
Gluosnio ţievės kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta remiantis Europos Farmakopėjos 04/2008:1583 straipsnio rekomendacijomis, pritaikant šias modifikacijas: pasirenkant kolonėlę, kurios ilgis 0,15 m, skersmuo 4,6 mm, dalelių dydis 3 μm; fotodiodų matricos detektorių, pasiţymintį didesniu jautrumu, efektyvumu bei matuojantį šviesos absorbciją esant įvairiems bangos ilgiams. Gradientinis metodas pakeistas izokratiniu, nes tarp šiais metodais gautų chromatogramų nebuvo didelio skirtumo, analitės atsiskyrė abiem atvejais. Tuo remiantis pasirinktas paprastesnis bei trumpesnis eliuavimo metodas – izokratinis.
Analizės laikas sutrumpintas nuo 40 iki 20 minučių. Analizuojamasis biologiškai aktyvus junginys yra salicinas, jo sulaikymo laikų vidurkis 8,7 min. Kai kuriose gluosnių rūšyse kaupiamas piceinas, kurio sulaikymo laikų vidurkis 10,26 min. Kadangi abu junginiai nustatomi iki 11 minutės, analizę vykdyti 40 minučių nėra tikslinga.
6.4 Metodikos validacija
Validacija atlikta pagal šiuos pasirinktus validacijos parametrus: specifiškumas, tiesiškumas, pakartojamumas, atkartojamumas, aptikimo riba, nustatymo riba.
6.4.1 Metodikos specifiškumas (atrankumas)
Metodikos specifiškumas (angl. Specificity) – gebėjimas vienareikšmiškai įvertinti analitės buvimą [6]. Kiekviena chromatografinė smailė parodo atskirą junginį. Specifiškumas pagrindţiamas lyginant analičių ir standartinių tirpalų chromatogramas, t.y. smailių sulaikymo laikus. Kadangi Europos farmakopėjoje nurodytos chromatografavimo sąlygos mūsų tyrimo metu buvo modifikuotos (gradientinis metodas pakeistas izokratiniu, pasirinkta ne 0,1 m, o 0,15 m ilgio kolonėlė), tai analičių sulaikymo trukmės skyrėsi nuo sulaikymo laikų, nurodytų Europos farmakopėjoje. Salicino sulaikymo laikas ne 6,4 min., o vidutiniškai 8,7 min. (2, 3 pav.). Piceino ne 7,7 min, o 10,26 min. (4, 5 pav.). Kadangi gluosnio ekstraktai yra daugiakomponenčiai mišiniai, pateikiamos analičių, standartinių tirpalų bei „tuščio“ mėginio chromatogramos. Taip siekiama įrodyti, kad tiriamo junginio sulaikymo laikas sutampa su standartinio tirpalo sulaikymo laiku ir kad nustatymui tirpiklis nekliudo (6 pav.).
2 pav. Gluosnio žievės ekstrakte esančio salicino chromatograma (λ=270 nm)
4 pav. Gluosnio žievės ekstrakte esančio piceino chromatograma (λ=270 nm)
6 pav. Mėginių tirpiklio chromatograma (λ=270 nm)
Lyginant gluosnio ţievės mėginių ir standartinių tirpalų sulaikymo laikus, aiškiai matyti, jog sulaikymo trukmės sutampa (6 lentelė). Analizuojant tuščią mėginį (etanolis:vanduo santykiu 50:50),
pašalinių medţiagų tapatybę atspindinčių smailių nenustatyta.
6 lentelė. Tiriamųjų mėginių ir standartinių tirpalų sulaikymo trukmių palyginimas Mėginio pavadinimas Sulaikymo trukmė
(min)
Mėginio pavadinimas Sulaikymo trukmė (min) Etaloninis tirpalas (salicinas) 8,690 Etaloninis tirpalas (piceinas) 10,249
Tiriamasis ekstraktas 8,684 Tiriamasis ekstraktas 10,014
6.4.2 Tiesiškumas
Tiesiškumas (angl. Linearity) – tai gebėjimas gauti rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi tiriamo junginio koncentracijai analizuojamame mėginyje [6]. Jam įvertinti sudarytas gradavimo grafikas. Kalibracinę kreivę turi sudaryti maţiausiai penki taškai. Šiuo atveju salicino kreivė sudaryta iš penkių taškų, o piceino kreivė – iš šešių taškų. Visų analizuojamų junginių gradavimo grafikų koreliacijos koeficientai yra artimi 1 (didesni nei 0,99). Tai patvirtina kiekybinio nustatymo būdo tiesiškumą bei stiprią tiesinę priklausomybę (7 lentelė).
7 lentelė. Analičių kalibracinių kreivių charakteristikos. Analizuojamos medţiagos pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Salicinas 8,699 0,9989 Y=1,89e+0,06X-4,50e+0,03 0,006 – 0,1 Piceinas 10,257 0,9998 Y=1,54e+0,07X-3,05e+0,04 0,008 – 0,25
7 pav. Salicino kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y=1,89e+0,06X-4,50e+0,03
6.4.3 Metodo glaudumas (preciziškumas)
Metodo glaudumui (preciziškumui) įvertinti apskaičiuotas rezultatų, gautų analizės metu, pakartojamumas bei atkuriamumas. Pakartojamumas (angl. Repeatability) parodo rezultatų tikslumą analizę atliekant tą pačią dieną tokiomis pačiomis sąlygomis. Pakartojamumo tyrimui šešis kartus injekuotas ir salicinas, ir piceinas. Atkuriamumas (angl. Reproducibility) išreiškia rezultatų tikslumą esant toms pačioms analizės sąlygoms per ilgesnį laiko tarpą, t.y. tris skirtingas dienas. Pakartojamumas ir glaudumas įvertinti pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN). Santykinis standartinis nuokrypis, dar vadinamas variacijos koeficientu (angl. RSD) – tai standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto santykis, išreikštas procentais. SSN vertė nėra tiksliai apibrėţta, tačiau kiekybinio tyrimo atveju turėtų būti ≤5 proc.
Salicino ir piceino analičių sulaikymo laikas pakartojamumo tyrime kito atitinkamai nuo 8,690 min. iki 8,708 min., nuo 10,249 min. iki 10,266 min. Analičių SSN ir sulaikymo laikui, ir smailės plotui neviršijo aukščiau nurodytos 5 proc. normos kiekybiniam tyrimui. Salicino santykinis standartinis nuokrypis sulaikymo laikui ištyrus šešias pavyzdţio injekcijas tą pačią dieną buvo 0,08, smailės plotui – 0,8. Piceino vienos dienos SSN sulaikymo laikui buvo 0,06, smailės plotui 0,4 (8 lentelė, 9 pav.). Remiantis šiais duomenimis, galima teigti, kad metodas yra tinkamas salicino ir piceino kiekybiniam tyrimui.
8 lentelė. Analizuojamų tirpalų pakartojamumo variacijos koeficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė
Santykinis standartinis nuokrypis (proc.) Sulaikymo laikui Smailės plotui
Salicinas 0,08 0,8
9 pav. Salicino ir piceino pakartojamumas
Glaudumo vertė nėra tiksliai apibrėţta, tačiau kiekybiniam tyrimui ji turėtų būti ≤10 proc. Glaudumo rezultatai pateikti 9 lentelėje.
9 lentelė. Analizuojamų tirpalų glaudumo variacijos koeficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė
Santykinis standartinis nuokrypis (proc.) Sulaikymo laikui Smailės plotui
Salicinas 0,34 2,9
Piceinas 1,99 4,5
Analičių SSN ir sulaikymo laikui, ir smailės plotui neviršijo aukščiau nurodytos 10 proc. normos kiekybiniam tyrimui. Remiantis šiais duomenimis, galima teigti, kad metodas yra tinkamas salicino ir piceino kiekybiniam tyrimui.
6.4.4 Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba (angl. LoD – limit of detection) – tai maţiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, tačiau nebūtinai nustatomas kiekybiškai. Remiantis tarptautinės konferencijos suderinimo klausimais (International Conference on Harmonization, kitaip ICH) gairėmis, vertinant aptikimo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 3 arba 2:1 [6; 27].
Nustatymo riba (angl. LoQ – limit of quantification) – tai maţiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai nustatomas tinkamo tikslumo ribose. Vertinant nustatymo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 10:1 (10 lentelė) [6; 27].
10 lentelė. Salicino ir piceino aptikimo bei nustatymo ribos
LoD (µg/ml) LoQ (µg/ml)
Salicinas 26,6 88,7
Piceinas 3,0 11,6
6.5 Kokybinis tyrimas
Eksperimentinių tyrimų metu pagal sulaikymo laikus bei spektrų atitikimus indentifikuoti šie junginiai: salicinas ir piceinas. Salicino standartinių tirpalų sulaikymo laikų vidurkis 8,7 min., piceino – 10,26 min.
Iš visų surinktų ţaliavų, keturi medţiai nekaupė salicino, bet kaupė piceiną. Piceino sulaikymo laikai pateikti 11 lentelėje.
11 lentelė Gluosnio žievės ekstraktuose esančio piceino sulaikymo laikų lentelė
Ekstrakto numeris
Sulaikymo trukmė (min)
1 10,014
2 10,155
3 10,193
4 10,225
Salicino kokybinis tyrimas taip pat atliktas vertinant standartinių tirpalų ir ekstraktuose esančio salicino sulaikymo trukmes. Išanalizuota 30 gluosnio ţievės ekstraktų. Salicino sulaikymo laikas varijavo
nuo 8,301 min. iki 8,888 min.
6.6 Kiekybis tyrimas
6.6.1 Salicino ir piceino tirpalų paruošimas kalibracinėms kreivėms sudaryti
Gluosnio ţievėje esančio salicino kiekiui nustatyti pasirinktas gradavimo grafiko metodas. Atsverta 1 mg salicino miltelių ir ištirpinta 10 ml išgryninto vandens (pradinis tirpalas). Piceino pradinis tirpalas paruoštas atsvėrus 5 mg piceino ir ištirpinus 10 ml išgryninto vandens. Kalibracinei kreivei sudaryti atlikti standartinių tirpalų skiedimai (12 lentelė). Salicino kalibracinė kreivė nubrėţta per penkis, piceino per šešis taškus.
12 lentelė. Standartinių junginių tirpalų ruošimas kalibracinės kreivės sudarymui
Tirpalas A (mg/ml) Tirpalas B (mg/ml) Tirpalas C (mg/ml) Tirpalas D (mg/ml) Tirpalas E (mg/ml) Tirpalas D (mg/ml) Piceinas 0,0078 0,0156 0,0313 0,0625 0,1250 0,2500 Salicinas 0,0063 0,0125 0,0250 0,0500 0,1000 -
6.6.2 Piceino kiekio nustatymas gluosnio ţievės ekstraktuose
Atlikus kokybinį gluosnio ţievės tyrimą nustatyta, kad keturiuose mėginiuose buvo ne salicinas, o piceinas. Nuspręsta, kad galima įvertinti ne tik salicino, bet ir vaistinėje ţaliavoje esančio piceino kiekį. Nustatyta, kad piceino kiekis kito nuo 49,53 mg/g iki 64,59 mg/g.
Išanalizavus literatūrą įsitikinta, kad kai kurios gluosnių rūšys sukaupia labai maţus kiekius salicino, tačiau turi piceino. Viena šių rūšių yra pilkasis gluosnis (S. cinerea). Tikėtina, kad atsitiktinai surinkta būtent ši rūšis. Kadangi piceinas farmakologiniu poveikiu nėra reikšminga medţiaga, atlikti platesnio šio junginio tyrimo nėra tikslinga.
6.6.3. Seno medţio ţievės kiekybinis tyrimas
Ištyrus seno (10 metų skaičiuojant pagal metūglius) gluosnio ţievę, nustatyta, kad salicinas joje nekaupiamas. Tai iliustruoja chromatogramos (10 pav).
10 pav. Seno medžio žievės, surinktos Kelmėje (a), Kaune (b), Marijampolėje (c), ekstraktų chromatogramos
6.6.4. Salicino kiekio nustatymas 2 – 3 metų amţiaus gluosnių ţievėje
Atlikus gluosnio ţievės kiekybinį tyrimą, nustatyta, kad jaunų gluosnių ţievėje esančio salicino kiekis varijuoja nuo 6,54 mg/g iki 64,56 mg/g (14 lentelė). Daugiausia salicino sukaupia Kaune, maţiausiai Marijampolėje augantys gluosniai.
14 lentelė. Salicino kiekio pasiskirstymas skirtingų regionų gluosnio žievėje Kelmė (mg/g) Kaunas (mg/g) Marijampolė (mg/g)
8,68 14,55 6,54 8,74 15,1 12,97 18,37 19,52 14,3 19,52 23,78 14,57 19,88 24,08 14,64 25,82 30,82 15,99 28,88 31,56 17,63 31,5 33,22 22,68 33,51 33,83 27,44 44,91 64,56 47,92
Naudojant SPSS (angl. Statistical Package for the Social Science) programinį statistinį paketą, įvertintas gluosnio ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymas trijuose Lietuvos regionuose (Kauno, Kelmės, Marijampolės). Atlikus Kruskal Wallis testą nustatyta, kad nėra statistiškai reikšmingo salicino kiekio skirtumo medţių ţievėje, surinktoje iš minėtų Lietuvos regionų (p>0,05). Statistinio reikšmingumo nebuvimą iliustruoja stačiakampė diagrama (11 pav.)
11 pav. SPSS vidurkio pasikliautinojo intervalo skaičiavimo rezultatai
Atlikta salicino kiekio klasterinė analizė. Visi 30 mėginių suskirstyti į 5 kategorijas pagal sukauptą panašų salicino kiekį. Rastas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp šių grupių (p<0,05). Tai rodo, kad kiekvieno rajono viduje yra statistiškai reikšmingi skirtumai tarp salicino, sukaupto skirtingų medţių ţievėje. Ateityje būtų tikslinga ieškoti veiksnio, nulėmusio salicino kiekio skirtumus tos pačios vietovės viduje.
IŠVADOS
1. Išsamiai išanalizuota moksinė literatūra apie gluosnių genties botanines savybes, paplitimą, cheminę sudėtį, praktinį ţaliavos panaudojimą, taikytinus analizės metodus gluosnio ţievės kokybiniams bei kiekybiniams tyrimams.
2. Nustatytos tinkamiausios ekstrakcijos sąlygos gluosnio ţievėje esančių veikliųjų junginių (salicino) ekstrahavimui bei optimizuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika junginių identifikavimui.
3. Validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika gluosnio ţievėje esančio salicino
kiekio nustatymui. Visi validaciniai parametrai atitiko jiems keliamus reikalavimus.
4. Statistiškai įvertintas gluosnio ţievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymas tirtuose Lietuvos regionuose. Daugiausia salicino nustatyta Kaune. Maţiausiai – Marijampolėje. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp regionuose augančių medţių sukaupto salicino kiekio nėra (p> 0,05).
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Išvystyta antranki, efektyvi, jautri, tiksli efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kurią ateityje bus galima pritaikyti įvairiuose gluosnių rūšyse esančio salicino kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams.
Tolimesniuose tyrimuose analizuoti veiksnius, nulemiančius salicino kiekio pasiskirstymą, nes statistinės analizės duomenimis, net toje pačioje vietovėje augančių medţių sukauptas salicino kiekis statistiškai reikšmingai skiriasi.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Butkevič J. Gluosnio ţilvičio (Salix viminalis L.) ir kai kurių jo kultivarų bei hibridų klonų morfobiologiniai ir produktyvumo tyrimai lauko kolekcijose. Master thesis. Lithuanian University of Educational Sciences, 2007
2. Kaunienė V, Kaunas E. Vaistiniai augalai. Kaunas: Varpas; 1991.
3. Kenstavičiene P, Nenortienė P, Kiliuvienė G et al. Application of high-performance liquid chromatography for research of salicin in bark of different varieties of Salix. Medicina. 2009;45(8): 644-51.
4. Lasinskas M. Trends in the consumption of analgesic drugs in Lithuania in 2005 – 2007. Master thesis. Lithuanian Health Science University, 2008
5. Lekavičius A. Vadovas augalams paţinti. Vilnius: Mokslas, 1989
6. Skirpstūnaitė R. Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus pritaikymas terpenolaktonų analizei. Master thesis. Kaunas University of Medicine, 2010
7. Maruška, A., Kornyšova, O., Machtejevas, E. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai. Kaunas, 2005
8. Barnes J, Anderson LA, Philipson JD. Herbal Medicines. New Zealand: Pharmaceutical Press; 2007
9. Biegert C, Wagner I, Ludtke R et al. Efficacy and safety of willow bark extract in the treatment of osteoarthritis and rheumatoid arthritis: results of 2 randomized double-blind controlled trials. J Rheumatol 2004, 31:2121-2130
10. Chrubasik S, Eisenburg E, Balan E, et al. Treatment of low back pain exacerbations with willow bark extract: a randomized double blind study. Am J Med. 2000;109:9-14
11. Clay MD, McLeod EJ. Detection of Salicylic Acid in Willow Bark: An Addition to a Classic Series of Experiments in the Introductory Organic Chemistry Laboratory. Journal of Chemical Education, 2012; 89(8), 1068
12. Eisenreich W, Handel A, Zimmer E. Išsamus augalų ir gyvūnų ţinynas. Vilnius: Naujoji Rosma; 2007
13. El-Shemy HA, Aboul-Enein AM, Aboul-Enein KM, et al. Willow Leaves’ Extracts Contain Anti-Tumor Agents Effective against Three Cell Types. PLoS ONE 2007; 2(1): e178. doi:10.1371/journal.pone.0000178
14. Güvenç A, Altun ML, Arihan O et al. Chromatographic determination of salicin in some Salix L. species growing in Turkiye. Журнал аналитической химии, 2007
15. Hitachi High-Tech. Principle and Feature of Various Detection Methods. URL: http://www.hitachi-hitec.com/global/science/lc/lc_basic_7.html. Accessed 14, January 2014 16. Hostanska K, Jürgenliemk G, Abel G et al. Willow bark extract (BNO1455) and its fractions
suppress growth and induce apoptosis in human colon and lung cancer cells. Cancer detection and prevention 2007, 31(2), 129-139
17. Lanas A, Polo-Tomás M, Roncales P, et al. Prescription of and adherence to non-steroidal anti-inflammatory drugs and gastroprotective agents in at-risk gastrointestinal patients. The American journal of gastroenterology 2012; 107(5), 707-714
18. Meyer V. Practical High – Performance Liquid Chromatography. 5th ed., Wiley, John & Sons, Incorporated, 2013
19. Miller James M. Chromatography. Conceps and contrasts. 2nd ed., USA, New Jersey, A John Wiley & Sons, Inc., 2005
20. Naesdal J, Brown K. NSAID-associated adverse effects and acid control aids to prevent them. Drug safety 2006; 29(2), 119-132
21. Pobłocka‐Olech L., van Nederkassel A. M., Vander Heyden Y. et al. Chromatographic analysis of
salicylic compounds in different species of the genus Salix. Journal of separation science 2007; 30(17): 2958-2966.
22. Poole C. Handbook of methods and instrumentation in separation science. Detroit: Academic Press; 2009
23. Skoog DA, Holler FJ, Crouch SR. Principles of instrumental analysis. 6th ed. Belmont (Calif.): Thomson Brooks/Cole; 2007
24. The European pharmacopoeia, 6th ed., council of Europe, Strasbourg, France 2008, 6.1. 04/2008:1583
25. University of Maryland Medicinal Centre. Willow bark. URL: http://www.umm.edu/altmed/articles/willow-bark-000281.htm. Accessed 28, November 2012. 26. USDA. Classification for Kingdom Plantae Down to Genus Salix L. URL:
http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=SALIX. Accessed 19 October, 2012
27. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM). Guidance for industry.
Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology. 2001. 1 – 10. [cited 2014-04-02].
Available from Internet:
<http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/U CM070107.pdf.>
28. WHO monographs on selected medicinal plants volume 4. Available from: URL: http://apps.who.int/medicinedocs/en/m/abstract/Js16713e/. Accessed 21, October 2012.
29. Wichtl M, editor. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals, 3rd ed. Stuttgart: Medpharm scientific; 2004.
30. Wuthold K, Germann I, Ross G, et al. Thin-Layer Chromatography and Multivariate Data Analysis of Willow Bark Extracts. Journal of chromatographic science 2004;42(6):306-9
31. Zhang J, Ding EL, Song Y. Adverse effects of cyclooxygenase 2 inhibitors on renal and arrhythmia events. JAMA: the journal of the American Medical Association 2006; 296(13), 1619-1632
32. 2998 Photodiode Array Detector. Operator‘s Guide. USA: Waters Corporation, 2010
